Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активизация ассоциативной азотфиксации в ризосфере амаранта для повышения его продуктивности и кормовой ценности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дегтярева, Ирина Александровна, Казань

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И.И.УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

На правах рукописи

ДЕГТЯРЕВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА '

АКТИВИЗАЦИЯ АССОЦИАТИВНОЙ АЗОТФИКСАЦИИ В РИЗОСФЕРЕ АМАРАНТА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЕГО ПРОДУКТИВНОСТИ И КОРМОВОЙ

ЦЕННОСТИ.

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент каф. микробиологии Ф.К.Алимова Консультант:

Заслуженный деятель науки РТ, доктор биологических наук, профессор, академик МАН ВШ И.А.Чернов

КАЗАНЬ - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................10

ГЛАВА 1. ВЛИЯНИЕ КОРНЕВОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ НА АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ............................................10

1.1. Корневая зона растений как место обитания азотфиксирующих микроорганизмов..........................................................................10

1.2. Общая характеристика родов АгоЬЬа^ег и АгояршИит..........16

1.3. Метаболиты азотфиксирующих микроорганизмов...................20

1.4. Взаимодействие азотфиксирующих микроорганизмов и небобовых растений.....................................................................23

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА АССОЦИАТИВНУЮ АЗОТФИКСАЦИЮ............................................................................................25

2.1. Продуктивность ассоциативной азотфиксации в ризосферной зоне небобовых растений.............................................................25

2.2. Инокуляция небобовых растений азотфиксирующими

микроорганизммами.....................................................................30

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА АМАЛАЖИШ Ь. КАК ПИЩЕВОЙ И КОРМОВОЙ КУЛЬТУРЫ.............................................................................37

3.1. Перспективы использования растений рода

АтагапЙ1Ш.Е.......................................................................................37

3.2. Консервирование кормовых культур..........................................43

3.2.1. Микробиологические аспекты силосования кормовых культур..........................................................................................43

3.2.2. Консервирование амаранта......................................................46

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...................................................................50

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................................50

1. Видообразцы амаранта из коллекции Ботанического сада при

КГУ...............................................................................................50

2. Характеристика почв......................................................................51

3. Выделение микроорганизмов........................................................51

4. Выделение азотфиксирующих микроорганизмов.........................52

4.1. Выделение несимбиотических азотфиксирующих микроорганизмов по модифицированной методике Л.Ф.Васюк, О.А.Берестецкого и Т.А.Элисашвили (1987).............................. 52

4.2. Выделение ассоциативных диазотрофов из ризопланы амаранта по методике В.Т.Емцева (1994)................................... 53

4.3. Учет общего количества азотфиксирующих ассоциаций микроор-ганизмов по методике Т.А.Калининской с соавторами (1981).............................................................................................53

4.4. Выделение азоспирилл из ризопланы амаранта по методике Л.С.Федоровой с соавторами (1985)........................................... 55

4.5. Выделение азоспирилл по методике О.Н.Шиляевой и З.М.Яковлевой (1988)................................................................... 56

5. Определение нитрогеназной активности выделенных

микроорганизмов........................................................................56

6. Определение физиологически активных веществ

азотфиксирующих микроорганизмов.........................................57

6.1. Определение индолил-3-уксусной кислоты...............................57

6.2. Определение витаминов группы В.............................................57

6.3. Определение антагонистической активности азотфиксаторов. 60

7. Изучение влияния азотфиксирующих микроорганизмов на

всхожесть семян...........................................................................61

8. Определение потенциальной активности азотфиксации

ризосферной почвы......................................................................62

8.1. Определение нитрогеназной активности ризосферной зоны в модельном опыте (Емцев и др., 1985)......................................... 63

8.2. Изучение влияния азотфиксирующих микроорганизмов на рост и развитие растений в вегетационном опыте..............................64

9. Микробиологические аспекты силосования амаранта.................65

9.1. Определение численности естественной микрофлоры растительного сырья в динамике.................................................66

9.2. Идентификация молочнокислых бактерий................................67

9.3. Определение химического состава и питательности

кормов................................................................................................69

9.4. Определение органических кислот.............................................69

10. Статистическая обработка результатов.......................................71

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................................................................72

1. НИТРОГЕНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ РОДА АМЛКАЫТНиЗ I.. В ОНТОГЕНЕЗЕ................................................................72

1.1. Ассоциативная азотфиксирующая активность видообразцов рода АтагапШш Ь. в условиях полевого опыта.........................72

1.2. Динамика численности микроорганизмов ризосферы амаранта82

1.3. Выделение азотфиксирующих микроорганизмов различными методами.......................................................................................90

1.4. Характеристика азотфиксаторов ризосферной зоны видообразцов рода Атагапйшз Ь.................................................91

1.5. Нитрогеназная активность ризосферных азотфиксаторов........93

1.6. Образование физиологически активных веществ азотфиксирующими микроорганизмами родов АгоШЬа^ег и АгозртИиш...................................................................................96

1.7. Фунгистатические свойства азотфиксаторов.............................98

2. ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЗАЦИИ НА АЗОТФИКСИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ РОДА АМАЯАЖНШ Ь. В УСЛОВИЯХ МИКРОЭКОСИСТЕМ...............................................................101

2.1. Влияние бактеризации семян на их прорастание....................101

2.2. Влияние бактеризации на ризосферную азотфиксируюгцую активность растений рода АтагапЙ1ш Ь. в условиях модельного опыта...........................................................................................102

2.3. Влияние бактеризации на ризосферную азотфиксирующуюактивность растений рода АтагапШш Ь. в условиях вегетационного опыта ...............................................104

2.3.1. Биометрические показатели...................................................107

3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СИЛОСОВАНИЯ АМАРАНТА 113

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................................125

ВЫВОДЫ.........................................................................................................139

ЛИТЕРАТУРА..................................................................................................141

ПРИЛОЖЕНИЕ

171

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема повышения урожаев на пахотных землях решается усилиями селекционеров, применением пестицидов, широким использованием органических и минеральных удобрений. Однако экономический и экологический кризис, снижение качества продукции растениеводства, падение естественного плодородия почв вызывает повышенное внимание к биологическому земледелию, суть которого заключается в использовании потенциальных возможностей агроэкосистем и минимализации применения химических средств для повышения урожайности сельскохозяйственных культур (Шерстобоева и др., 1997, Наумова, 1998).

Современное сельскохозяйственное производство характеризуется видовым однообразием, что имеет определенные технологические и селекционные преимущества, однако одновременно приводит к резкому снижению адаптивного потенциала агроэкосистем, в сравнении с естественными, особенно их устойчивости к экологическим стрессам.

В этой связи большой интерес представляет введение в агрофитоценозы растений семейства АтагапШасеае, относящихся к С4 растениям и внедряемых в сельскохозяйственное производство в России в первую очередь с целью устранения дефицита кормового белка. Внедрение в практику сельского хозяйства интенсивных, высокоурожайных сортов растений требует создания в прикорневой зоне высоких концентраций легкодоступных соединений азота. Однако увеличение выпуска и применения азотных удобрений связано с решением широкого круга проблем, наиболее важными из которых являются - энергетическая и экологическая.

В настоящее время наметились два основных способа усиления азотфиксации в агроэкосистемах: активизация деятельности спонтанной популяции азотфиксирующих микроорганизмов в ризосфере и на корнях и инокуляция растений активными и эффективными штаммами азотфиксаторов (Патыка, 1993). Первый путь заключается в оптимизации факторов среды и подборе видов, линий, сортов растений, наиболее способных к активизации азотфиксации. Второй путь предусматривает использование высокоактивных в отношении азотфиксации микроорганизмов. Не менее перспективным направлением является подбор и использование искусственных ассоциаций микроорганизмов, обладающих суммарным положительным эффектом и экологической поливалентностью. Проблема поиска эффективных азотфиксаторов при всей ее сложности чрезвычайно актуальна. Прикорневая зона растений является наиболее благоприятной средой для размножения азотфиксирующих микроорганизмов, а растения с С4 типом фотосинтеза, к которым относятся растения рода АтагапШш Ь., обеспечивающие активное развитие азотфиксаторов, могут служить "поставщиками" перспективных штаммов или ассоциаций азотфиксирующих бактерий.

Без понимания сущности микробиологических процессов почвы, эпифитной микрофлоры растений, используемых в кормопроизводстве, умения анализировать и оценивать эти процессы и микрофлору, ответственную за их течение, немыслимо совершенствование современных технологий выращивания сельскохозяйственных культур.

К началу наших исследований было проведено изучение азотфиксирующих микроорганизмов только для видообразца АтагапШш степШз и выделен из ризосферы один из представителей азотфиксирующего комплекса - Аго1:оЬас1ег скгоососсиш (Ожиганова, 1993).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выявление видообразцов растений рода Атагапйхш Ь. с повышенной

способностью к образованию ассоциации с азотфиксирующими бактериями и поиск путей усиления азотфиксации в корневой зоне этих растений, а также использование амаранта в кормопроизводстве.

В связи с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Оценить коллекцию видообразцов амаранта с точки зрения их способности фиксировать азот в ассоциации с микроорганизмами;

2. Выявить перспективные штаммы азотфиксирующих бактерий по их способности фиксировать азот, продуцировать витамины, гормоны роста и стимулировать прорастание семян амаранта;

3. Исследовать уровень нитрогеназной активности корневой зоны бактеризованных растений рода АтагапШш Ь. в зависимости от стадий онтогенеза, световой и темновой фаз;

4. Исследовать влияние бактеризации растений рода АтагапШш Ь. на биометрические показатели и химический состав;

5. Определить численность естественной микрофлоры в процессе силосования амаранта с кукурузой и соотношение органических кислот по фазам силосования.

Научная новизна работы. Впервые исследована нитрогеназная активность ризосферной зоны коллекции растений рода АтагапЙШБ Ь. в онтогенезе и выявлены видообразцы с повышенной способностью к фиксации молекулярного азота в ассоциации с микроорганизмами. Из ризосферной зоны различных видообразцов амаранта выделены микроорганизмы родов Аго1;оЬас1ег и АгоэршПшп, обладающие высокой активностью ацетиленредукции, ростстимулирующими и фунгистатическими свойствами. Для целей бактеризации амаранта сформирован комплекс штаммов Аго1;оЬас1ег сЬгоососсит и АговртИпт Брр., обладающий полифункциональным положительным действием. Впервые изучены микробиологические аспекты силосования амаранта с кукурузой в динамике.

Установлено, что такое силосование обеспечивает повышение качества продукта по содержанию органических кислот и микроорганизмов по сравнению с кукурузным силосом. Научная новизна разработок защищена двумя патентами РФ ("Штамм бактерий Аго1;оЬас1ег сЬгоососсиш, используемый для получения бактериального удобрения под амарант" N 2074158 от 27.02.97 г. и "Штамм бактерий Аго1;оЬас1ег сИгоососсшп, используемый для получения бактериального удобрения под огурцы" N 2074157 от 27.02.97 г.).

Практическая значимость работы. Использование в сельском хозяйстве видов и сортов небобовых растений с повышенной азотфиксирующей активностью микроорганизмов в ризосферной зоне является энергосберегающим и экологически безопасным способом получения ценного кормового белка для животноводства. Эффективность применения видообразцов амаранта с повышенной нитрогеназной активностью, а также бактеризация их выражается в повышении процентного содержания белка в растении и получении из него силоса высокого качества.

Способ испытан в НПО "Нива Татарстана". В диссертации имеется акт лабораторного испытания, подтверждающий эффективность использования амаранта с повышенной азотфиксирующей активностью в комбинации с кукурузой для получения консервированного корма.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ВЛИЯНИЕ КОРНЕВОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ НА АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

1.1. Корневая зона растений как место обитания азотфиксирующих

микроорганизмов

Со времени открытия Доберейнер нитрогеназной активности в ассоциациях Azotobacter paspalii с корнями Paspalum notatum и Spirillum lipoferum с корнями Digitaria decumbens найдено более 12 тысяч различных видов высших растений, которые могут вступать в ассоциативный симбиоз с азотфиксирующими бактериями (Берестецкий, 1985; Afsharian et al., 1995).

При ассоциативной азотфиксации бактерии и растения не вступают в столь тесный контакт, как при симбиотической (Умаров, 1986). Несмотря на это, она характеризуется теми же экологическими особенностями, что и симбиотическая, а именно: имеет хорошо выраженную сезонную динамику, связанную с онтогенезом растений; достигает максимума в период цветения, снижается ко времени созревания и резко падает после отмирания растительности; имеет суточную периодичность, связанную с циркадными ритмами растений. При этом периоды активного роста растений соответствуют активным физиологическим состояниям бактерий в ризосфере (Звягинцев и др., 1993). В филоплане растений азотфиксация может составлять 1/6 от азотфиксации в ризоплане (Садыков, 1980). Однако до настоящего времени не получено убедительных доказательств наличия видовой специфичности при взаимодействии небобовых растений и азотфиксирующих бактерий.

В ассоциативные отношения с небобовыми растениями вступают представители многих родов почвенных азотфиксирующих микроорганизмов:

не только родов Azospirillum, Azotobacter, но и Beijerinckia, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Derxia, Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Klebsiella, Mycobacteriiim, Pseudomonas, Vibrio и других. Наряду с хорошо известными азотфиксирующими симбиозами внимание ученых привлекают и относительно недавно обнаруженные новые виды эндофитных диазотрофов (Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, Burkholderia vietnamensis, Azoarcus sp. и др.) - симбионтов тропических травянистых растений (Глаголева, 1998).

Для разнообразных азотфиксирующих микроорганизмов характерна одна и та же ферментная система, катализирующая превращение молекулярного азота в аммиак и получившая название нитрогеназы. Нитрогеназа представляет собой чрезвычайно чувствительный к кислороду ферментный комплекс, состоящий из двух компонентов: MoFe-белок с молекулярной массой 220 KD и Fe-белок с молекулярной массой 55 KD (Vincent, 1981). Последний состоит из двух идентичных субъединиц, содержащих один Fe4S4-ueHTp на димер. Эти субъединицы образуют структуру, напоминающую крылья бабочки, которые скрепляет железосодержащий кофактор. Вблизи него идентифицирован сайт прикрепления MoFe-белка, на котором происходит восстановление N2. Функция Fe-белка состоит в передаче активированных электронов с молекул ферредоксинов на MoFe-белок (Moffat, 1990). MoFe-белок организован значительно сложнее: он состоит из четырех субъединиц двух типов 0^2 (ос-су бъединица имеет молекулярную массу 56 KD, ß-субъединица - 59 KD). По разным определениям он содержит 2 атома молибдена, 20-24 атомов железа и столько же кислотлабильной серы. Часть железа и серы организованы в центры типа Fe4S4. Кроме того, молибден, железо и сера входят в состав низкомолекулярного кофактора, локализующегося в активном центре нитрогеназы (Лихтенштейн, 1983; Гусев, Минеева, 1985).

В природных условиях азотфиксация протекает на уровне различных азотфиксирующих систем. Микробные ассоциации представляют собой ассоциативный микробный симбиоз, возникающий на основе многообразных связей, включающих и трофические. Однако эти связи большей частью (за исключением факультативно-симбиотических "пар") носят случайный характер, активность их сравнительно невелика и существенно различается в отдельных биоценозах. Различия определяются резкой неоднородностью природных условий, в которых формируются и функционируют микробные ассоциативные симбиозы, которые отличаются значительной активностью и стабильностью (К