Аэробные спорообразующие бактерии - продуценты внеклеточных ферментов, гидролизующих декстран

Халикова, Эльвира Фагимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аэробные спорообразующие бактерии - продуценты внеклеточных ферментов, гидролизующих декстран
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Аэробные спорообразующие бактерии - продуценты внеклеточных ферментов, гидролизующих декстран"

На правах рукописи

ХАЛИКОВА ЭЛЬВИРА ФАГИМОВНА

АЭРОБНЫЕ СПОРООБРАЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ - ПРОДУЦЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ, ГИДРОЛИЗУЮЩИХ ДЕКСТРАН

Специальность: 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2005

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук и в совместной Финско-Российской лаборатории университета г. Турку, Финляндия.

Научный руководитель - кандидат биологических наук, Усанов Николай Глебович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

доктор технических наук, ведущий доцент

Прищепов Федор Александрович

Ведущая организация - Московский Государственный Университет

Пищевых Производств

Защита состоится «К. ЬЛ> января 2005 г. в 14.00 часов на заседании Регионального Диссертационного Совета КМ 002.124.01. при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала ФГУП «НПО«Микроген» МЗ РФ в г.Уфе, «Иммунопрепарат» по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.

Автореферат разослан декабря 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Доктор медицинских наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Ферменты, расщепляющие декстран, а также синтезирующие их микроорганизмы, уже длительное время служат объектом интенсивных исследований. Это вызвано, прежде всего, интересом к продуктам ферментативного гидролиза нативного декстрана. Данные соединения, представляющие собой декстран с молекулярным массой (Mw) 40-70 кДа, олигодекстраны с Mw 0,9-1,8 кДа обладают высокой биологической активностью широкого спектра [Ulitzsch M. et al., 1988;,Day D.F. et al., 1993; Kim D. et al., 1994, 1995c; Kubic C. et al., 2004]. Непосредственный интерес представляют также сами декстранолитические ферменты. Их используют при решении чисто научных задач, например при теоретических исследованиях структуры полисахаридов, содержащих в своем составе а-1,6-гликозидные связи [Cote G.L. et al., 1999]. Большие потери, которые несет сахарная промышленность из-за осложнений, связанных с присутствием декстрана в процессе производства сахара, делают актуальной разработку ферментативных способов его удаления из производственных потоков [Cuddihy J.A. et al., 1999; Chavan S.M. et al., 2001]. Использование декстраназ в профилактике и лечении кариеса зубов является еще одной важной сферой их применения. Интерес к декстраназам в этом направлении исследований не ослабевает, о чем свидетельствует возрастающее количество публикаций, а также наличие противокариесных препаратов, выпускаемых зарубежной и отечественной промышленностью [Shimada К. et al., 1984; Kim D.W. et al., 2001; Tsuchiya R., 2001, Kim D. et al., 2003].

Декстраны представляют группу бактериальных высокомолекулярных

внеклеточных полисахаридов различного строения, в основном, состоящие из

связанных D-глюкопиранозных единиц. В молекуле данных полисахаридов, могут

присутствовать также 4-глюкозидные связи, образующие

боковые цепи. Основными продуцентами этих полисахаридов являются

микроорганизмы рода Lenconostoc и Streptococcus [Sidebotham R.L., 1974; Hamada

S., Slade H.D., 1980; Monchois V. et al., 1999; МсАм^^^Щ^^^асшеплении

j ь^'.ЛЯСГТвКА

LJiEÊld

декстранов участвует ряд ферментов, различающихся по специфичности и механизму действия. По способу действия на субстрат эти ферменты обычно делят на эндо- и экзо-декстраназы. Однако, более детальное исследование каталитического воздействия этих ферментов позволило разделить их на декстраназу (К.Ф. 3.2.1.11), глюкодекстраназу (К.Ф. 3.2.1.70), глюкан 1,6- а -изомальтозидазу (К.Ф. 3.2.1.94), декстран-1,6- а -изомальтотриозидазу (КФ 3.2.1.95), декстран а - 1,2 разветвляющий фермент (К.Ф. 3.2.1.115) (Enzyme nomenclature, 1992).

Ферменты, расщепляющие декстран, обнаружены у различных групп микроорганизмов, включая бактерии, плесневые грибы, дрожжи, а также у животных [Розенфельд Е.Л., Саенко А.С., 1963; Преображенская М.Е., Розенфельд Е.Л., 1970; Preobrazhenskaya M.E. et al., 1974; Gianfreda L. at al., 1979], человека [Саенко A.C., 1963] и высших растений [Heyn, A.N.J., 1970; 1981]. Есть данные об образовании эндо - декстраназ актиномицетами [Виноградова К.А. и др., 1975]. В настоящее время многие из этих ферментов выделены в чистом виде и их свойства подробно изучены.

Аэробные спорообразующие бактерии являются перспективными продуцентами внеклеточных ферментов, особенно, гидролаз различных биополимеров. Тем не менее, декстранолитические ферменты среди данной группы микроорганизмов встречаются крайне редко и являются малоизученными. В литературе описано около пяти - шести продуцентов декстраназы.

Цель исследования

Выделение новых штаммов аэробных спорообразующих бактерий, синтезирующих декстранолитические ферменты, разработка процедуры очистки наиболее активного штамма, и изучение физико-химических свойств очищенного фермента.

Задачи исследования

1. Создать коллекцию аэробных спорообразующих бактерий - продуцентов внеклеточных ферментов, расщепляющих декстран.

2. Изучить таксономическое положение выделенных культур.

3. Адаптировать процедуру количественного определения декстраназной активности для бациллярных штаммов.

4. Разработать метод очистки декстраназы наиболее активного штамма и исследовать физико-химические свойства очищенного фермента.

Научная новизна

Обнаружено, что почвенные аэробные спорообразующие бактерии, секретирующие декстраназы, формируют фенотипический кластер, близкий по морфолого-биохимическому описанию к группе Bacillus circulans [Beigey D., 1986; Gordon R.E., 1973]. Впервые показано, что штамм ИБ-101Д близок к новому виду Paenibacillus illinoisensis, уровень сходства последовательностей при этом составил 97,83 % [Анализ 16S рРНК]. Проведено подробное исследование физико-химических свойств высокоочищенного препарата декстраназы P. illinoisensis, ИБ-101 Д. Установлена множественность форм секретируемой декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д, одна из которых является доминирующей, а две другие - ее производными. Не выявлено гомологии между N-концевой аминокислотной последовательностью декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д и известными декстраназами, секвенированными к настоящему времени.

Научно-практическая значимость работы

Создана коллекция новых штаммов аэробных спорообразующих бактерий, способных экстрацеллюлярно секретировать ферменты, гидролизущие декстран. Предложена процедура измерения декстраназной (К.Ф. 3.2.1.11) активности, основанная на использовании в качестве субстрата Сефадекса G-200, окрашенного красителем «ремазол ярко-синий» (RBB). Метод может быть рекомендован для исследований по отбору продуцентов и очистке декстранолитических ферментов. Разработана новая схема очистки декстраназы, которая состоит из этапов осаждения фермента сульфатом аммония, фракционирования растворами полиэтиленгликоля, экстракции в условиях двухфазной системы и анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Сефарозе. Данный метод очистки позволяет получать препараты декстраназ с высокой удельной активностью, что имеет значение в разработке технологии высокоочищенных микробных ферментных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Скрининг микроорганизмов, гидролизующих декстран с использованием накопительных селективных сред позволяет вести эффективный поиск новых продуцентов внеклеточных эндо - декстраназ.

2. Процедура измерения декстраназной активности (К.Ф 3.2.1.11), основанная на использовании в качестве субстрата окрашенного Сефадекса G-200, применима для определения активности ферментов, расщепляющих декстран до олигосахаридов средней или высокой степени полимеризации.

3. Разработана схема очистки декстраназы, позволяющая получать препараты декстраназ с высокой удельной активностью.

4. Новый штамм P. illinoisemis ИБ-101Д секретирует декстраназу в виде трех активных изоформ.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на конференции "И. П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины" (Уфа, 1999); XII Юбилейной конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 2001); Международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001); "Japan-Finland Joint Seminar on New Aspects in Microbial Biotechnology", (Japan, 2004).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе две статьи.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 20 рисунков и 6 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (2 главы), заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 220 источников (18 отечественных и 202 зарубежных).

Материалы и методы исследований

Объекты исследований. В работе использовали бактерии из коллекции микроорганизмов ИБ УНЦ РАН на основе культур продуцентов декстраназ, выделенных из природных мест обитания в процессе выполнения данной работы, а также типовые штаммы бактерий рода Bacillus из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) для проведения тестовых исследований. Основным объектом изучения являлся штамм ИБ -101 Д.

Образцы почвы для скрининга. В качестве природных источников новых изолятов бактерий использовали образцы почв, отобранные в лесопарковой зоне г. Уфы. С момента отбора материал хранили при температуре 10 °С.

Питательные среды. Для выделения продуцентов декстраназ использовали жидкие накопительные среды следующего состава, г/л: НД1 (декстран голубой Т-2000 - 3,0); НД2 (декстран (полиглюкин) - 5,0); НС (сефадекс G-75 - 10,0, пептон -2,0). Скрининг и хранение бактерий проводили на твердых питательных средах, г/л: ИД (декстран голубой Т-2000 - 3,0, пептон - 1,0, кукурузный экстракт - 1,0, дрожжевой экстракт - 1,0, агар - 16,0); Д1 (декстран Т-20 - 5,0, пептон - 1,5, кукурузный экстракт - 1,5, дрожжевой экстракт - 1,5, агар - 16,0). Во всех средах в качестве компонентов буферной системы использовали соли, г/л: КН2РО4 - 2,0 и (NH4)2HP04 - 2,0. Для наработки фермента исследуемый штамм высевали на жидкую среду, г/л: Д2 (декстран Т-20 - 5,0, пептон - 1,5, кукурузный экстракт - 1,5, дрожжевой экстракт -1,5, КН2РО4- 0,58, Na2HPO4- 8,9). Выращивание проводили на качалке в течение 3-4 суток, при 37 0С, 160 -180 об./мин.

Определение и измерение декстраназной активности. Приблизительную оценку уровня декстраназной активности в культуральной жидкости осуществляли при помощи теста на чашках Петри. Супернатант культуральной жидкости вносили в лунку агарового геля, содержащего голубой декстран Т-2000, рН 7,0 и инкубировали при 37 0С в течение 24 часов. По величине диаметра ореолов просветления вокруг лунок судили об уровне декстраназной активности.

Для количественного определения декстраназной активности (К.Ф. 3.2.1.11) использовали разработанную нами процедуру измерения (Э.Ф. Халикова, Н. Г.

Усанов, 2002), основанную на использовании в качестве субстрата Сефадекса G-200, связанного с красителем «ремазол ярко-синий» (RBB). В качестве исследуемого образца декстраназы использовали белковый препарат, осажденный штамма ИБ -101Д. Для определения содержания красителя в окрашенном Сефадексе G-200 проводили полный его гидролиз. Спектральные характеристики растворов красителя различных концентраций и продуктов гидролиза окрашенного Сефадекса G-200 измеряли на приборе «Specord UV-VIS» («Carl Zeiss», Германия).

Определение декстраназной активности проводили, инкубируя раствор фермента (0,1 мл) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,8) содержащем 0,4 мг/мл RBB-Сефадекса-О-200, при 50 °С в течение 45 мин при постоянном перемешивании на микрошейкере «Эппендорф-9000». Общий объем реакционной смеси составлял 2 мл. Действие фермента на окрашенные Сефадексы G-15, G-50, G-75 и G-200 изучали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,8) при температуре 50 °С и непрерывном встряхивании. Концентрация субстратов составляла 0,2 %.

Изучение реакционной специфичности декстраназ выделенных штаммов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Характер действия осажденньж сульфатом аммония ферментных препаратов на декстран Т-500 определяли, разделяя продукты реакции на колонке (300x7,5 мм) с сорбентом Toyopearl HW-40" (фракция "Fine"). В качестве элюента использовали 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8, при скорости потока 0,5 мл/мин. Продукты разделения регистрировали с помощью рефрактометра RIDK-101. Ферментативную реакцию гидролиза проводили следующим образом: 6 мл субстрата (0,5 %-ного раствора декстрана Т-500 в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8) смешивали с 0,73 мл раствора декстраназы и инкубировали при 50 °С, отбирая через определенные промежутки времени.

Очистку декстраназы штамма ИБ-101Д проводили следующим образом. Основную фракцию фермента выделяли из супернатанта культу ральной жидкости осаждением сульфатом аммония 68 % (в/о). Выпавший осадок отделяли центрифугированием, и растворяли в дистиллированной воде и использовали для дальнейших стадий очистки.

Фракционирование полиэтиленгликолеч. Была изучена растворимость фермента предыдущей ступени очистки в растворах ПЭГ 400, ПЭГ 4000, ПЭГ 6000 и ПЭГ 8000 при значениях рН 5,0 - 9,0. Испытуемые образцы готовили следующим образом: определенные количества 50 % (в/в) раствора ПЭГ в буфере с определенным значением рН были добавлены к экстракту белка (0,3 г) в микроцентрифужные пробирки. Общий вес (1,5 г) содержимого доводили при помощи соответствующего буфера. После интенсивного перемешивания и центрифугирования, супернатант удаляли при помощи микропипетки и осадок растворяли в 0,5 мл буфера с учетом рН. В супернатанте и в разбавленном осадке определяли декстраназную активность, а также содержание белка.

Экстракция в интерфазе. Двухфазные системы получали путем добавления различных концентраций (в/о) твердого сульфата аммония (10-50 %) к супернатантам, полученным после фракционирования растворами ПЭГ. Растворы подвергали интенсивному перемешиванию и центрифугированию. В образовавшихся после разделения фазах (верхней, нижней и интерфазе) определяли декстраназную активность и концентрацию белка.

В финальной процедуре экстракции, к раствору белка, полученного из КЖ осаждением сульфатом аммония, добавляли 50 %-ный (в/в) раствор ПЭГ 6000 до концентрации 20 % (в/в). После интенсивного перемешивания и последующего центрифугирования осадок удаляли. Для получения двухфазной системы, к 100 мл супернатанта добавляли 20 г сульфата аммония. После 1 мин инверсии смесь центрифугировали и образовавшуюся интерфазу с декстраназной активностью извлекали и растворяли в 10-кратном по объему 50 мМ Tiis-HCl буфере, рН 8,0. Для формирования новой двухфазной системы к разбавленному раствору интерфазы добавляли 20 % (в/о) сульфата аммония и 30 % (в/о) ПЭГа 6000. После перемешивания и центрифугирования, вновь образованную интерфазу растворяли в 50 мМ Tris-HCl буфере (рН 8,0), диализовывали относительно того же буфера и концентрировали при помощи фильтров Centricon YM-30 ("Millipore", США). Далее концентрированный образец фермента подвергали хроматографии на ДЭАЭ-Сефарозе ("Pharmacia", Швеция). Фракции, содержащие значительную декстраназную активность, объединяли и концентрировали при помощи фильтров

Centricon YM-30 ("Millipore", США). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм с учетом коэффициента поправки на другие соединения, имеющие поглощение в ультрафиолетовой области спектра (Р. Досон и др. 1991).

Электрофорез очищенной декстраназы проводили в 8 %-ном ПААГ с 1 % ДДС-Na и в идентичном геле с добавлением 0,4 % декстрана голубого Т-2000 на установке Protein II Mini-Cell (BioRad, USA). Молекулярную массу белков рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по относительной подвижности группы белковых маркеров (Sigma, США). Для визуализации зон белков с декстраназной активностью, голубой гель инкубировали в 20 мМ Трис-НС1 буфере (рН 6,8), содержащим 0,5 % Тритона Х-100 в течение 1 ч при комнатной температуре, с последующим инкубированием в течение 2 ч при 37 °С в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,8.

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) проводили на установке PhastGel System (Pharmacia, Швеция) с использованием готовых акриламидных гелей для ИЭФ с градиентом рН 3-9. Контрольная смесь белков с известными значениями рН 3-10 (Pharmacia, Швеция) была использована для построения калибровочной кривой.

N-терминальный аминокислотный анализ белковых полос с декстраназной активностью проводили, используя газовый секвенатор белка Applied Biosystem Model 470, оснащенный анализатором Applied Biosystem Model 120A PTH.

Статистическую обработку результатов осуществляли на персональном компьютере с помощью программы Origin 6,0, применяя критерий Стьюдента при Р=0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Скрининг микроорганизмов, секретируюших декстраназу. Выделение и отбор декстранолитических бактерий осуществляли методом накопительных культур на основе жидких минимальных сред с декстраном и Сефадексом G-75.

Время инкубации накопительных культур варьировали в зависимости от состава селективной среды. При использовании накопительных сред с декстраном культуры инкубировали 3-4 сут, сред с сефадексом - 7-14 сут. Высев из

накопительной культуры проводили методом разведений на агаризованную среду, содержащую декстран голубой Т-2000. Чашки Петри со средой инкубировали при 37°С в течение 24-48 ч до формирования отдельных колоний. Активные колонии бактерий обнаруживали по зонам просветления на синем фоне, формирующимся вокруг них (рис. 1А), и отбирали в качестве потенциальных продуцентов внеклеточных декстраназ. Отобранные изоляты пересевали повторно для получения чистой культуры Следующим этапом скрининга декстранолитических штаммов являлась сравнительная оценка их продуцирующей способности. Отобранные культуры выращивали в жидкой питательной среде с декстраном Т-20, первоначально принятой в качестве стандартной и определяли внеклеточную декстраназную активность в КЖ с помощью теста полуколичественного определения декстраназной активности на чашках Петри с агаризованным голубым декстраном.

Рис. 1. - Образование ореолов просветления: (А) вокруг колоний штаммов -продуцентов декстраназы в агаризованной среде с 0,3 % голубого декстрана, время инкубации 2 суток; (В) вокруг лунок в агаре с 0,2 % голубого декстрана, в результате внесения бесклеточной КЖ продуцентов декстраназы, рН 6,8, время инкубации 24 ч. Для сравнения дан типовой штамм В акшат ВКМ 1242 (с), не обладающий декстраназной активностью.

Этот метод, основанный на дифф>зии фермента в агаровую пластинку, по нашему мнению, является достаточно чувствительной и простой процедурой, позволяющей довольно быстро провести отбор наиболее активных ферментных препаратов (рис. 1 В).

В результате проведенной схемы скрининга из 38 образцов почвы на основе накопительной среды с декстраном было выделено 13 штаммов-продуцентов декстраназ. При использовании накопительной среды с сефадексом из 90 почвенных образцов способность к деструкции голубого декстрана проявляли всего И штаммов.

Таксономические исследования. Все 24 выделенных штамма являлись аэробными спорообразующими грамположительными бактериями, образующими цепочки клеток, эллиптические эндоспоры которых раздувают спорангий терминально или субтерминально. По физиолого-биохимическим признакам выделенная группа микроорганизмов подпадала под характеристики вида Bacillus circulans [Beigey D, 1986; Gordon R.E., 1973].

В качестве основного объекта дальнейших исследований был отобран штамм ИБ-101Д - наиболее активный продуцент декстраназы, проявляющий стабильность при длительном хранении и частых пересевах.

1 (J69) PuBlbadlln» llllDob«»la

{

4 (369) В. paboll 16S ribotenal RNA 14 (J«9) ParaibMillii» tp. V2 16$ ribOMMl 17 (369) Paenibacillus tp. TB9 16S

6 (369) Paenibacillus amylolyticu*

21 (369) Штамм ИБ-101Д

2 (369) Pacnibacilliijs sp. 172 16S

3 (369) Bacllln» polymyia 16$ rRNA 8 (369) Paanibaciltas jamilae partial

9 (369) Paenibacillus paeriac DNA

10 (369) Paenibaclllut paoria« partial

11 (369) Paetiibaeilln* polyaayxa partial

12 (369) Paenibacillus potymyra 16S

13 (369) Paenibacillus polymyxa 16S 5 (369) B. polymyxa 16S ribosoeal RNA 15 (369) Paenibacillns krfbbensis 16S

16 (369) Paenibacillus taejeaensis 16S

18 (369) Paenibacillus azotolf xans

19 (369) Paenibacillus sp. 16S rRNA 7 (369) Paenibacillus burgondia 16S

20 (369) Paenibacillus polymyxa 16S

Рязмииа 1,71 Bp

Рис. 2. - Дендрограмма, демонстрирующая положение штамма ИБ-101Д среди представителей родов Bacillus и Paenibacillus.

С целью определения филогенетического положения исследуемого штамма, был проведен анализ, выполненный на основе исследования структуры гена 168 рРНК (370 п.н.), который показал, что культура ИБ - 101Д является представителем рода РагтЪасШт и наиболее близка к новому виду РагтЪасШт Што18гт18, уровень сходства последовательностей при этом составил 97, 83 % (рис. 2).

Специфичность действия декстраназ выделенных культур на декстран. Изучение характера действия бациллярных декстраназ на декстран Т-500 (Мш 500 кДа) показало одинаковый механизм гидролиза этого полимера различными ферментными препаратами. Основными продуктами после 24 ч ферментативной реакции являлись глюкоза, изомальтоза и олигодекстраны со степенью полимеризации 1(Н-50.

На рис. 3 представлена кинетика деполимеризации декстрана Т-500 под действием ферментного препарата штамма Р. Штогзгтк ИБ-101Д, близкого по физиолого-биохимическим свойствам к другим выделенным продуцентам декстраназ.

Рис. 3. - Хроматограммы продуктов гидролиза декстрана Т-500 декстраназой Р. Штокгтгз ИБ-101Д. I - декстран Т-500, II - мальтоза, III - глюкоза; 1 - контроль (метки), 2-0 мин, 3 - 30 мин, 4-180 мин, 5 -1320 мин инкубации 50 °С, рН 6,8.

В качестве контрольной показана хроматограмма модельной смеси, включавшей 0,5 % декстрана Т-500,1 % глюкозы и 1 % мальтозы. Деполимеризация субстрата протекала довольно быстро, и в течение первых 30 мин реакции его концентрация снижалась на 30-45 %, однако содержание низкомолекулярных Сахаров (изомальтозы, глюкозы) в реакционной смеси практически не возрастало

Значимые количества глюкозы и изомальтозы обнаруживались только после 1 - 3 ч реакции и лишь при использовании высокоактивных препаратов. Полученные результаты позволяют предположить, что ферментный препарат штамма Р. 1Ш-по1$вт1$ ИБ-101Д расщепляет декстран сообразно эндо-механизму с высокой долей образования длинноцепочных олигодекстранов с Мш ~ 3-5 кДа.

Определение декстраназной активности при использовании нерастворимого окрашенного субстрата. Хроматографический анализ продуктов деполимеризации декстрана являлся единственным, эффективным методом оценки активности бациллярных декстраназ, который, однако, не мог позволить решить наши задачи. В связи с этим мы изучали возможность использования нерастворимых субстратов (типа Сефадексов), ковалентно связанных с каким-либо красителем. Декстраназы хорошо растворяют эти матрицы, изготовленные из декстрана, высвобождая связанный краситель в раствор.

Наиболее подходящим красителем для этих целей, по нашему мнению, являлся краситель «ремазол ярко-синий» (ИВВ), процедура работы с которым была достаточно проста и воспроизводима. Несколько типов Сефадекса 0-15, 0-50, 0-75, 0-200 окрашивали ЯВВ и подвергали гидролитическому воздействию декстраназы штамма Р. Штогзгтк ИБ-101Д в идентичных условиях. Наиболее активно, фермент гидролизовал субстрат, полученный на основе Сефадекса 0-200.

Поскольку ИВВ может менять свои спектральные характеристики, будучи связанным с олигосахаридами, дополнительно проводили спектральное исследование. На рис. 4 показаны небольшие различия спектров поглощения свободного ИВВ (в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8) и связанного с олигодекстранами. Это различие уменьшалось на более глубоких стадиях гидролиза, когда спектры ИВВ и растворимого окрашенного субстрата становились почти конгруэнтными. Учитывая пологий характер спектральных максимумов

свободного и связанного красителей, существующими различиями пренебрегали и проводили все оптические измерения при 595 нм.

Рис. 4. - Спектры поглощения свободного и связанного с олигодекстранами красителя «ремазол ярко-синий R» в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8.

Для определения оптимальной концентрации субстрата (окрашенного Сефадекса G-200) в реакционной смеси изучали кинетику его ферментативного гидролиза с высвобождением растворимого окрашенного продукта. Расчеты проводили с помощью программы Ориджин 6.0, используя усредненные экспериментальные данные.

Данные по начальным скоростям реакции, представляющим собой первую производную скорости изменения экстинции по времени были

сопоставлены с соответствующей концентрацией субстрата (рис. 5). При концентрациях комплекса RBB-Сефадекс G-200 в реакционной смеси > 400-500 мкг/мл кривая изменения оптической плотности с1(ДЕ595)/с1т выходила на плато. В качестве рабочей концентрации субстрата RBB-Сефадекс G-200 было выбрано значение 0,4 мг/мл.

В ходе работы было определено количество красителя, связанного с 1 мг Сефадекса G-200. Для этого проводили полный гидролиз окрашенного субстрата и измеряли поглощение полученного раствора. Из данных калибровочного графика зависимости оптической плотности раствора RBB в фосфатном буфере (0,1 М, рН

6,8) от его концентрации рассчитали, что 1 мкг синтезированного КВВ-Сефадекса G-200 содержит Т = 0,098 мкг чистого красителя.

гл.—.—I-■—1—--1—.—I-.-.-

0,0 0,1 0,2 <и 0,4 0,5

мг/мл

Рис. 5. - Влияние концентрации субстрата (Сефадекса G-200, окрашенного ремазолом ярко-синим) на начальную скорость реакции гидролиза декстраназой Р. Штошвтш ИБ-101Д.

Таким образом, если принять за единицу активности декстраназы такое количество фермента, которое в оптимальных условиях реакции катализирует образование 1 мкг свободных декстринов в течение 1 мин, то формула для расчета активности будет иметь следующий вид: А = АЕ,„ * V, /(У2 * е * т * Т), где:

ДЕ595 - разница оптических плотностей контрольной и реакционной смесей в кювете 1 см.

е - удельный коэффициент экстинции, характеризующий оптическую плотность раствора свободного КЭБ концентрацией 1 мкг/мл в кювете 1 см. В нашем случае е = 0,01144 ед. оптич. плотности * мл/мкг.

Т - коэффициент «окрашенности» субстрата, характеризующий количество мкг КВВ, содержащегося в 1 мкг окрашенного субстрата КВВ-Сефадекс G-200.

V - объем реакционной смеси, мл

У2 - объем фермента используемого в реакции, мл

Очистку декстраназы Р. illinoisensis ИБ-101Д с целью изучения ее физико -химических проводили в соответствии с разработанной нами методикой, основная схема которой, представлена на рис. 7, а ее результаты в таблице 1. Далее

приводится постадийное изучение оптимизации основных показателей очистки фермента.

Осаждение сульфатом аммония. Обнаружено, что наиболее приемлемым вариантом получения стабильного концентрированного препарата декстраназы из КЖ являлось осаждение сульфатом аммония. Максимальный выход декстраназной активности (93 %) при увеличении ее степени очистки в 3 раза был достигнут при концентрации сульфата аммония 68 % (в/о) (табл. 1). В условиях масштабного производства эта стадия выделения и первичной очистки может быть замещена микрофильтрацией и ультрафильтрацией.

Фракционирование ПЭГом. Следующая ступень очистки включала добавление ПЭГ к осажденному сульфатом аммония ферментному препарату для избирательного осаждения побочных белков. В целях оптимизации процедуры очистки фермента в условиях фракционирования растворами ПЭГ были выполнены предварительные исследования факторов и условий, оказывающих влияние на выход и степень очистки белка.

В качестве исследуемых параметров рассматривали рН фракционируемого раствора ПЭГ в области значений от 5 до 9, молекулярный вес ПЭГ (400,4000, 6000 и 8000) и концентрацию растворов ПЭГ в диапазоне 10-70 % (в/в).

В результате было обнаружено, что показатели очистки белка являлись оптимальными при использовании ПЭГ 6000 концентрации 20 % (в/в) и рН 8,0, при этом выход фермента в основной процедуре очистки составил 86 % при степени очистки в 8 раз (табл. 1).

Адсорбция в интерфазе. Добавление сульфата аммония к супернатанту предыдущей ступени очистки приводило к образованию трех фаз: верхней, нижней и интерфазы. В этих условиях экстракции белка в основном исследовали влияние концентрации соли в диапазоне 10-50 % (в/об) на распределение декстраназы в интерфазе, в верхней и нижней фазах. Оптимальной являлась концентрация сульфата аммония 20 % (в/об), при этом было обнаружено, что около 60 % декстраназной активности появлялось в интерфазе, тогда как остаток активности обнаруживался в верхней ПЭГ-содержащей фазе (рис. 6). При последующей

повторной экстракции фермента в интерфазе И, в несколько иных условиях, степень его очистки возрастала в 1,5 раза по сравнению с интерфазой I (табл. 1).

Рис. 6. Влияние сульфата аммония на выход декстраназы (% от общего) и степень очистки в интерфазе в условиях системы фаз 20 % (в/в) ПЭГ 6000-(NH4)2SO4 в Tris - НС1, рН 8,0, при 20 °С.

Таблица 1 - Очистка декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д

Стадия очистки Объем, мл мл Дек-стран аза Белок, мг Степень очистки Выход, %

всего единиц ед/мг белка

КЖ 390 175000 107 1638 1 100

Осаждение, сульфатом 42 163000 270 595 3 93

аммония

Фракционирование 20% (в/в) 62 151000 900 168 8 86

ПЭГ6000

Интерфаза I 3 91000 3600 25 34 52

Интерфаза II 2 57500 5200 11 49 33

Диализ, ультрафильтрация 4 42500 11800 3,6 НО 24

Хроматография на ДЭАЭ- 16 33700 78500 0,43 733 19

Сефарозе

Таким образом, выход фермента после всех стадий осаждения, фракционирования и экстракции из культуральной жидкости составил 33% при 49-кратной степени очистки (табл. 1). Тем самым была показана принципиальная возможность применения разработанной схемы очистки в условиях масштабного технологического процесса для получения технически град) ированных ферментных препаратов.

Удельная активность декстраназы Р. illinoisensis ИБ-101Д возрастала в 733 раза с выходом по активности 19 % после хроматографии на ДЭАЭ-Сефарозе (табл.

1).

В процессе ДЭАЭ-хроматографии нам не удалось разделить изоформы декстраназы Р. illinoisensis ИБ-101Д, несмотря на существенное различие в их изоэлектрических точках (практически на единицу шкалы рН). Попытки провести ионобменную хроматографию при других значениях рН и в градиенте различных концентраций №01 также не позволили осуществить эту задачу.

Физико-химические свойства препарата очищенной декстраназы Р. НК-noisensis ИБ- 101Д.

Электрофоретическое исследование очищенного препарата декстраназы позволило обнаружить в его составе три белка с декстраназной активностью, молекулярная масса которых составляла ~ ПО, 89 и 76 кДа, рассчитанных по относительной подвижности, а их изоэлектрические точки соответствовали значениям 4,0, 4,2, 4,95 (рис. 8). Три белковые полосы обнаруживались и после электрофоретического разделения в неденатурирующих условиях.

кДа А В С

205 "

97.4

66 -45 - ,

Рис. 8. - Электрофорез очищенной декстраназы Р. Штоштй ИБ-101Д в 8 %-ном ДДС-№-ПЛЛГ. А. Маркеры молекулярной массы; В. Образец очищенного белка (20 мкг), окрашенный Кумасси Я-250; С. Образец очищенного белка (2 мкг) в геле, содержащем голубой декстран. Белые полосы на темном фоне представляют собой зоны гидролиза голубого декстрана, образуемые при действии декстраназы.

Анализ К-концевой аминокислотной последовательности трех декстраназ показал, что у всех ферментов первые пять аминокислот являются идентичными и соответствуют последовательности Ла-8ег-ТЪг^1у-Ьу8. Не было обнаружено гомологии между К-концевой аминокислотной последовательностью декстраназы Р. ШтойвтЫ ИБ-101Д и известными декстраназами, секвенированными к настоящему моменту.

Таким образом, полученные результаты показывают, что если у Р. Штоштй ИБ-101Д и имеет место процессинг протеолиза фермента, то он должен протекать

внутри клетки, при этом гидролиз происходит с С - конца пептидной цепи без значительной потери ферментативной активности.

Оптимум рН и температуры. Для исключения сильного влияния компонентов буферных систем на активность фермента, используемых при определении его рН-оптимума, измерения проводили в смеси буферов с добавлением №0.

Рис. 9. - Влияние рН на активность очищенной декстраназы Р. illinoisensis ИБ-101 Д. Определение проводили в смеси буферных компонентов: лимонная кислота, фосфат натрия, трис и глицин (концентрация каждого буфера 100 мМ) с добавлением №0 (100 мМ). Реакцию проводили при 50 "С в течение 15 мин.

Фермент проявлял высокую активность в достаточно широком диапазоне рН 6,0-7,6, сохраняя 35 % и 53 % активности от максимальной при рН 5,5 и при рН 7,8, соответственно (рис. 9).

30 40 50 60

Т(мперат> ра (°С)

Рис. 10. - Влияние температуры на активность (-■-) и стабильность (-0-) очищенной декстраназы Р. НИпоЫвтЫ ИБ-101Д.

Максимальную активность очищенной декстраназы наблюдали при 50 °С, в условиях, принятых для стандартного измерения ее активности (рис. 10). Фермент был стабильным при температурах ниже 50 °С после 1 часа прогревания при рН 6,8. Значительная термоинактивация начиналась при температурах выше 60 °С

ВЫВОДЫ

1. Жидкие накопительные среды на основе декстрана и поперечно сшитого полимера декстрана, Сефадекса G-75, позволяют вести эффективный поиск новых продуцентов внеклеточных эндо - декстраназ среди аэробных спорообразующих бактерий.

2. Выделенные из почвы декстранолитические бактерии формируют фенотипический кластер по морфолого-биохимическому описанию близкий к группе аэробных спорообразующих бактерий Bacillus circulans. Вместе с тем, структурный анализ фрагмента гена 16S рРНК (370 п.н.) штамма ИБ-101Д показал, что данный штамм наиболее близок к новому виду Paenibacillus illinoisensis.

3. Разработана процедура измерения декстраназной активности, основанная на использовании в качестве субстрата Сефадекс G-200, связанного с красителем «ремазол ярко-синий» (RBB).

4. Предложен новый способ очистки декстраназы, позволяющий получать препараты декстраназ с высокой удельной активностью.

5. Штамм P. illinoisensis ИБ-101Д секретирует три активные формы декстраназы, молекулярные массы которых составляют ПО, 89 и 76 кДа, а их изоэлектрические точки соответствуют значениям 4,0,4,2,4,95.

6. Анализ последовательностей N-концевых аминокислот трех декстраназ показал, что первые пять аминокислот являются идентичными и соответствуют А1а-Ser-Thr-Gly-Lys. He выявлено гомологии с другими изученными декстраназами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Халикова Э.Ф. Аэробные спорообразуюшие бактерии рода Bacillus-продуценты декстраназ // И. П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины: Тезисы конференции. - Уфа, 1999. - С. 26.

2. Халикова Э.Ф. Декстраназа Bacillus sp. ИБ-101Д // Ферменты микроорганизмов: Тезисы 12 юбилейной конференции. - Казань, 2001. - С. 85.

3. Халикова Э.Ф. Некоторые перспективы использования бактериальной декстраназы // Биотехнология на рубеже 2-х тысячелетий: Тезисы международной конференции. - Саранск, 12-15 сентября, 2001. - С. 149.

4. Халикова Э. Ф., Усанов Н. Г. Нерастворимый окрашенный субстрат для определения декстраназной активности // Прикладная биохимия и микробиология. -2002. - Т 38, №1.- С. 103-108.

5. Khalikova Е., Susi P., Usanov N, Korpela T. Purification and properties of extracellular dextranase from a Bacillus sp. // Journal of chromatography B. - 2003. № 796.-P. 315-326.

6. Khalikova E., Susi P., Usanov N., Korpela T. Microbial dextran-splitting enzymes // Abstracts of Japan-Finland Joint Seminar on New Aspects in Microbial Biotechnology. - Japan, October 1-4,2004. -P. 5.

№25366

Халикова Эльвира Фагимовна

АЭРОБНЫЕ СПОРООБРАЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ - ПРОДУЦЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ, ГИДРОЛИЗУЮЩИХ ДЕКСТРАН

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия №0177 от 10 06 96 г Подписано в печать 15 12 2004 г Отпечато на ризографе Формат60*84'16 Уст-печл 1.7 Уч-изд л 21 Тираж 100 экз Заказ № 589

450000, г Уфа ул Ленина, 3, Башкирский государственный медицинский университет

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Халикова, Эльвира Фагимовна

Список принятых сокращений и условных обозначений.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1 Декстраны и декстранолитические ферменты.

1.1 Структура и свойства декстранов.

1.2 Классификация декстранолитических ферментов.

1.3 Источники, свойства и механизм действия декстраназ.

1.3.1 Грибные декстраназы.

Таблица 1.1 Номенклатура и характеристика микробных декстран -гидролизующих ферментов.

1.3.2 Дрожжевые продуценты.

1.3.3 Бактериальные источники.

Глава 2 Функция декстраназ в метаболизме микроорганизмов.

Глава 3 Методы измерения декстраназной активности.

Глава 4 Применение декстранолитических ферментов.

4.1 Биомедицинское направление.

4.2 Применение декстраназ в стоматологии.

4.3 Декстраназы в сахарной промышленности.

Собственные исследования.

Глава 5 Объекты и методы исследований.

5.1 Объекты исследований.

5.2 Материалы и реагенты.

5.3 Микробиологические методы.

5.3.1 Накопительные питательные среды для проведения скрининга.

5.3.2 Твердая питательная среда.

5.3.3 Жидкие питательные среды для наработки образцов декстраназ.

5.3.4 Условия инокуляции и хранения продуцентов декстраназ.

5.3.5 Почвенные образцы и их подготовка для выделения новых бактериальных изолятов.

5.4 Методы таксономических исследований.

5.5 Физико-химические и биохимические методы исследований.

5.5.1 Получение ферментных препаратов.

5.5.2 Изучение реакционной специфичности декстраназ выделенных штаммов.

5.5.3 Определение декстраназной активности.

5.5.3.1 Полуколичественный метод определения декстраназной активности.

5.5.3.2 Определение активности с помощью нерастворимого окрашенного субстрата.

5.5.4 Основные этапы выделения и очистки декстраназы

P. illinoisensisWb-XOXR.

5.5.4.1 Изучение аффинной адсорбции.

5.5.5 Определение концентрации белка.

5.5.6 Изучение физико-химических и каталитических свойств очищенной декстраназы.

5.5.6.1 Определение рН-оптимума очищенной декстраназы.

5.5.6.2 Определение температурного оптимума и термостабильности очищенной декстраназы.

5.5.6.3 Гель-электрофорез и изоэлектрическое фокусирование.

5.5.6.4 N-терминальный аминокислотный анализ.

5.6 Обработка экспериментальных данных.

ГЛАВА 6 Результаты и их обсуждение.

6.1 Скрининг микроорганизмов, секретирующих декстраназу.

6.2 Таксономический анализ выделенных изолятов.

Таблица 6.2 Физиолого - биохимические, морфологические и культуральные свойства выделенных изолятов.

Таблица 6.3 Физиолого - биохимические, морфологические и культуральные свойства выделенных изолятов.

6.3 Изучение реакционной специфичности декстраназ выделенных штаммов.

6.4 Разработка процедуры определения декстраназной активности при помощи нерастворимого окрашенного субстрата.

6.5 Очистка и характеристика декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д.

6.5.1 Очистка декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д.

6.5.2 Характеристика физико-химических свойств препарата очищенной декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аэробные спорообразующие бактерии - продуценты внеклеточных ферментов, гидролизующих декстран"

Актуальность проблемы

Ферменты, деполимеризующие декстран, а также продуцирующие их микроорганизмы, уже достаточно длительное время являются объектом интенсивных исследований. Повышенный интерес к декстраназам обусловлен, прежде всего, возможностью их использования для получения продуктов частичного или полного расщепления декстранов, которые находят все большее практическое применение [Day D.F., Kim D., 1993; Kim D., Day D.F., 1994, 1995c, Kubic C. et al., 2004]. Эти ферменты представляют также интерес в теоретическом аспекте, например, при изучении структуры природных полисахаридов [Cote G.L. et al., 1999]. Еще одна причина, которая привлекает внимание к декстраназам, является возможность их использования для удаления декстрана из производственных потоков, поскольку его присутствие затрудняет промышленный процесс получения сахара и анализ продуктов. [Bruijn J.M., 2000; Chavan S.M. et al., 2001]. Важной сферой практического применения декстранолитических ферментов является профилактика и лечение кариеса зубов. Интерес к декстраназам в этом направлении не ослабевает, о чем свидетельствует возрастающее количество публикаций, а также наличие противокариесных препаратов, выпускаемых зарубежной и отечественной промышленностью [Shimada К. et al., 1984; Kim D. et al., 2001; Kim D. et al., 2003, Tsuchiya R., 2001].

Декстраны представляют собой группу высокомолекулярных бактериальных экзополисахаридов, состоящие в основном из а-1,6-связанных D-глюкопиранозных единиц. Основными продуцентами этих полисахаридов являются микроорганизмы рода Leuconostoc и Streptococcus [Sidebotham R.L., 1974; Hamada S., Slade H.D., 1980; Monchois V. et al., 1999; Monsan P. et al., 2001]. В расщеплении декстранов участвует ряд ферментов, различающихся по специфичности и механизму действия. По способу действия на субстрат эти ферменты обычно делят на эндо- и экзо-декстраназы. Однако, более детальное исследование каталитического воздействия различных декстраназ позволило разделить их на декстраназу (К.Ф. 3.2.1.11), экзо-1,6-а-глюкозидазу (К.Ф. 3.2.1.70), глюкан 1,6-а-изомальтозидазу (К.Ф. 3.2.1.94), декстран-1,6-а-изомальтотриозидазу (К.Ф. 3.2.1.95) и декстран а-1,2 разветвляющий фермент (К.Ф. 3.2.1.115) [Enzyme nomenclature, 1992]. В офицальный список ферментов пока не включена циклоизомальтоолигосахарид глюканотрансфераза, обнаруженная у двух представителей рода Bacillus, которая отличается по механизму действия от всех вышеназванных [Oguma Т. et al., 1993].

Ферменты, расщепляющие декстран, обнаружены у различных групп микроорганизмов, включая бактерии, плесневые грибы, дрожжи, а также у животных [Розенфельд E.JL, Саенко А.С., 1963; Преображенская М.Е., Розенфельд E.JL, 1970; Preobrazhenskaya М.Е. et al., 1974; Gianfreda L. at al., 1979], человека [Саенко A.C., 1963] и высших растений [Heyn, A.N.J., 1970; 1981]. Есть данные об образовании эндодекстраназ актиномицетами [Виноградова К.А. и др., 1975]. В настоящее время многие из этих ферментов выделены в чистом виде и их свойства подробно изучены.

Грибные продуценты, как правило, синтезируют внеклеточные декстраназы эндо-типа. Среди дрожжевых культур описаны продуценты как эндо-декстраназ, так и экзо-1,6-а-глюкозидаз. Особенностью бактериальных продуцентов является способность большинства из них к биосинтезу одновременно нескольких глюкозидаз, отличающихся по локализации и субстратной специфичности, что имеет определенный биологический смысл.

Помимо применения традиционных методов отбора и селекции предпринимаются попытки получения бактериальных продуцентов декстраназ с помощью генной инженерии. В данной области значительный интерес представляют работы по клонированию генов экзо- и эндо-декстраназ, получившие распространение последние 10-14 лет [Lawman P., Bleiweis A.S., 1991; Whiting G.C. et al., 1993; Wanda S.-Y., Curtiss R., 1994; Igarashi T. et al., 1995; Oguma T. et al., 1999; Garcia B. et al., 2001; Larsson A.M. et al., 2003]. В настоящее время известно около 11 нуклеотидных последовательностей генов декстраназ родов Streptococcus, Arthrobacter, Penicillium, Paenibacillus [EMBL/GenBank; SWISS-PROT]. Декстран-гидролизующие ферменты представляют собой совершенно разные в генетическом отношении структуры, о чем свидетельствует новая классификационная система ферментов, основанная на сравнении степени сходства их аминокислотной последовательности [Henrissat В., 1991; Henrissat В., Bairoch А., 1993; 1996; Henrissat В., Davies G.J., 2000].

Декстранолитические ферменты аэробных спорообразующих бактерий встречаются крайне редко и являются малоизученными, поскольку в литературе описано около пяти - шести продуцентов декстраназ.

Цель исследования

Выделение новых штаммов аэробных спорообразующих бактерий, синтезирующих декстранолитические ферменты, разработка метода очистки декстраназы наиболее активного штамма и характеристика физико-химических свойств очищенного препарата.

Задачи исследования

1. Создать коллекцию аэробных спорообразующих бактерий-продуцентов внеклеточных ферментов, расщепляющих декстран.

2. Изучить таксономическое положение выделенных культур.

3. Адаптировать процедуру количественного определения декстраназной активности для бациллярных штаммов.

Научная новизна

Проведено подробное исследование физико-химических свойств высокоочищенного препарата декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д. Установлена множественность форм секретируемой декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д, одна из которых является доминирующей, а две другие - ее производными. Не выявлено гомологии между N-концевой аминокислотной последовательностью декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д и известными декстраназами, секвенированными к настоящему времени.

Научно-практическая значимость работы

Создана коллекция новых штаммов аэробных спорообразующих бактерий, способных экстрацеллюлярно секретировать ферменты, гидролизущие декстран. Предложена процедура измерения декстраназной (К.Ф. 3.2.1.11) активности, основанная на использовании в качестве субстрата сефадекса G-200, окрашенного красителем «ремазол ярко-синий» (RBB). Метод может быть рекомендован для исследований по отбору продуцентов и очистке декстранолитических ферментов. Разработана новая эффективная схема очистки декстраназы, которая состоит из этапов осаждения фермента сульфатом аммония, фракционирования растворами полиэтиленгликоля, экстракции в условиях двухфазной системы и анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. Данный метод очистки позволяет получать препараты декстраназ с высокой удельной активностью, что имеет значение в разработке технологии высокоочищенных микробных ферментных препаратов.

Апробация работы

Диссертация апробирована на научном семинаре отдела Биотехнологии Института биологии УНЦ РАН (протокол № 8 от 02.11.2004 г.).

Диссертация апробирована на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол № 15 от 02.12.2004 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе две статьи.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Халикова, Эльвира Фагимовна

Выводы

1. Жидкие накопительные среды на основе декстрана и поперечно сшитого полимера декстрана, сефадекса G-75 позволяют вести поиск новых продуцентов внеклеточных эндо-декстраназ среди аэробных спорообразующих бактерий.

2. Выделенные почвенные бактерии, секретирующие декстраназы, формируют фенотипический кластер, близкий по морфолого-биохимическому описанию к группе аэробных спорообразующих бактерий Bacillus circulans. Вместе с тем структурный анализ фрагмента гена 16S рРНК (370 п.н.) штамма ИБ-101Д показал, что данный штамм наиболее близок к новому виду Paenibacillus illinoisensis.

3. Разработана процедура измерения декстраназной активности, основанная на использовании в качестве субстрата сефадекса G-200, связанного с красителем «ремазол ярко-синий» (RBB).

5. Штамм P. illinoisensis ИБ-101Д, секретирует три активные формы декстраназы, молекулярные массы которых составляют 110, 89 и 76 кДа.

6. Анализ последовательностей N-концевых аминокислот трех декстраназ показал, что первые пять аминокислот являются идентичными и соответствуют Ala-Ser-Thr-Gly-Lys. Не выявлено гомологии с другими изученными декстраназами.

Заключение

Предложенная схема скрининга микроорганизмов, гидролизующих декстран, основанная на использовании метода накопительных культур и тестов с декстраном голубым Т-2000 (ММ=2000 кДа), позволила выделить новые штаммы продуценты внеклеточных декстраназ среди аэробных спорообразующих бактерий. Из 128 почвенных образцов было выделено 24 штамма, обладающих выраженной способностью к деструкции декстрана голубого. По физиолого-биохимическим признакам все выделенные штаммы подпадали под характеристики вида Bacillus circulans (Bergey, 1986; Gordon, 1973). В качестве основного объекта дальнейших исследований был отобран штамм ИБ-101Д, наиболее активный продуцент декстраназы, проявляющий стабильность при частых пересевах и длительном хранении. Результаты анализа структуры фрагмента гена 16S рРНК (370 п.н.) показали, что данный штамм является представителем рода Paenibacillus и наиболее близок к новому виду Paenibacillus illinoisensis при уровне сходства последовательностей 97,83

Изучение действия бациллярных декстраназ на декстран Т-500 (ММ=500 кДа) показало одинаковый механизм гидролиза этого полимера различными ферментными препаратами. Основными продуктами после 24 ч ферментативной реакции являлись глюкоза, изомальтоза и олигодекстраны степени полимеризации 3^-50. Полученные результаты позволяют предположить, что ферментный препарат штамма P. illinoisensis ИБ-101Д расщепляет декстран по эндо-механизму с высокой долей образования длинноцепочных олигодекстранов.

В процессе работы была разработана процедура измерения декстраназной (К.Ф. 3.2.1.11) активности, основанная на использовании в качестве субстрата сефадекса G-200, связанного с красителем «ремазол ярко-синий» (RBB). Измерение включало в себя: инкубацию суспензии окрашенного субстрата в буфере, содержащем исследуемый образец фермента; удаление нерастворившихся остатков субстрата; определение оптической плотности надосадочной жидкости, окрашенной растворимыми продуктами ферментативной реакции при длине волны 595 нм. Таким образом, предлагаемый метод применим для определения декстраназной активности, как количественный аналитический метод. Процедура подобного измерения активности достаточно проста, удобна, и не требует большого количества времени, что имеет значение для исследований по отбору продуцентов и очистке ферментов.

В результате разработанной нами процедуры очистки декстраназы Р. illinoisensis ИБ-101Д, основанной на осаждении фермента из культуральной жидкости сульфатом аммония, дальнейшем фракционировании растворами ПЭГ с последующей экстракцией в условиях двухфазной системы, выход фермента из культуральной жидкости составил 33 % при 49-кратной степени очистки. Удельная активность декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д, возрастала в 733-раза с выходом по активности 19 % после хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. В результате электрофореза очищенного препарата были выявлены три белка с декстраназной активностью, молекулярная масса которых составляла — 110, 89 и 76 кДа, а их изоэлектрические точки соответствовали значениям 4,0, 4,2 и 4,95.

Анализ N-концевых аминокислот трех декстраназ показал, что у всех ферментов первые пять аминокислот являются идентичными и соответствуют последовательности Ala—Ser-Thr-Gly-Lys. Таким образом, полученные результаты показали, что, если у P. illinoisensis ИБ-101Д и имеет место процесс протеолиза фермента, то он должен протекать внутри клетки, при этом гидролиз происходит с С-конца пептидной цепи без значительной потери ферментативной активности

Препарат высокоочищенной декстраназы P. illinoisensis ИБ-101Д, проявлял высокую активность в достаточно широком диапазоне рН 6,0-7,6, сохраняя 35 % и 53 % активности от максимальной при рН 5,5 и при рН 7,8, соответственно. Максимальную активность очищенной декстраназы наблюдали при температуре 50 °С. Фермент был стабильным при температурах ниже 50 °С после 1 часа прогревания при рН 6,8. Значительная термоинактивация начиналась при температурах выше 60 °С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Халикова, Эльвира Фагимовна, Уфа

1. Биосинтез и свойства декстраназы Lipomyces kononenkoae / О.Н. Зинченко, А.Г. Лобанок, З.А. Рожкова, В.И. Шишло // Микробиология 1989. -Т. 58, №4.-С. 571 -575.

2. Грибная и дрожжевая декстраназы: свойства и перспективы использования в сахарной промышленности / О.Н. Зинченко, В.И. Шишло, О.В. Кривошеева, А.Г. Лобанок // Прикл. Биохим. Микроб. 1993. - Т. 29, № 6. - С. 851 - 855.

3. Декстраназа Fusarium solani / Т.Н. Данилова, В.И. Максимов, Г.А. Молодова, Н.Н. Сазонова // Прикл. Биохим. Микроб. 1978. - Т. 14, № 5. - С. 694 - 697.

4. Декстраназная активность почвенных дрожжей липомицетов / О.Н. Зинченко, А.Г. Лобанок, И.П. Бабьева, И.С. Решетова, By Нгуен Тхань // Микробиология. - 1991. - Т. 60, Вып. 5. - С. 833 - 835.

5. Козинер, В.Б. Полисахарид декстран, его биологическое действие и практическое применение / В.Б. Козинер // Усп. Совр. Биол. 1966. - Т. 62, №. 2 (5).-С. 197-214.

6. Лобанок, Л.Г. Влияние условий культивирования и состава питательной среды на синтез декстраназы грибом Aspergillus insuetus Г-116 / Л.Г. Лобанок, О.Н. Зинченко, В.И. Шишло // Прикл. Биохим. Микроб. 1982. -Т. 18, №5.-С. 664-669.

7. Методы общей бактериологии // Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир., 1983. - Т. 1-3.

8. Образование декстраназ мицелиальными грибами и актиномицетами / К.А. Виноградова, Г.В. Черкесова, Л.И. Петрова, Н.С. Мамулина, Г.А. Молодова // Прикл. Биохим. Микроб. 1975. - Т. 11, № 5. - С. 730 - 735.

9. Очистка декстраназы Penicillium funiculosum / В.И. Максимов, Г.А. Молодова, Т.И. Данилова, Н.Н. Бурцева // Прикл. Биохим. Микроб. 1977. - Т. 13, №3.- С. 452-458.

10. Розенфельд Е.Л. Расщепление декстрана а(1,6)декстранглюкозидазой печени in vivo / Е.Л. Розенфельд, А.С. Саенко // Биохимия. 1963. - Т. 28, №3. - Стр. 552 - 557.

11. Саенко А.С. а-1,6-Декстранглюкозидаза в органах человека / А.С. Саенко // Пробл. гематол. и переливания крови. 1963. - Т. 8, № 8. - Стр. 57 - 59.

12. Скворцова, И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus / И.Н. Скворцова. М.: Изд-во Моск. Ун-та., 1984. - 26 с.

13. Справочник биохимика // Под ред. Р. Досона и др. М.: Мир., 1991. - 466 с.

14. Тиунова, Н.А. Хитинолитические ферменты микрорганизмов / Н.А. Тиунова // Успехи биологической химии. 1989. - Т. 30. - С. 199-219.

15. Углеводный компонент декстраназы Penicillium funiculosum / Т.Н. Данилова, В.И. Максимов, А.И. Чухрова, Г.А. Молодова // Прикл. Биохим. Микроб. 1983. - Т. 19, № 1. - Стр. 104 - 109.

16. Халикова, Э.Ф. Нерастворимый окрашенный субстрат для определения декстраназной активности / Э.Ф. Халикова, Н.Г. Усанов // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. - Т. 38, № 1. - С. 103-108.

17. Чопик, О.В. Применение фермента декстраназы на свекловичном заводе в Шибецу / О.В. Чопик // Сах. пром. 1985. - № 4. - С. 52-53.

18. Abbott, D. Studies on Dextran and Dextranases. Part VII. Structures from an a 1—>4 - Branched Dextran / D. Abbott, H. Weigel // J. Chem. Soc. (C) -1966.-P. 821 -827.

20. Action of Endo-{\—»6)-a-D-Glucanases on the Soluble Dextrans Produced by Three Extracellular a-D-Glucosyltransferases of Streptococcus sorbinus / C. Taylor, N.W.H. Cheetham, M.E. Slodki, G.J. Walker // Carbohyd. Polym. 1990. -Vol. 13.-P. 423 -436.

21. Albertsson P. Partition of Cell Particle and Macromolecules / P. Albertsson. Second Edition. - Almqvist and Wiksells, Stockholm, 1971. - 323 p.

22. An Isomalto dextranase Accompanied by Isopullulanase Activity from Arthrobacter globiformis T6 / G. Okada, T. Takayanagi, S. Miyahara, T. Sawai // Agric. Biol. Chem. - 1988b. - Vol. 52, № 3. - P. 829 - 836.

23. An isomaltotriose producing dextranase from Flavobacterium sp. M-73: Purification and properties / M. Kobayashi, S. Tagaki, M. Shiota, Y. Mitsuishi, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. - 1983. - Vol. 47, № 11. - P. 2585 - 2593.

24. An isomaltotriose producing dextranase from Flavobacterium Sp. M-73: action pattern of the enzyme / S. Takagi, M. Shiota, Y. Mitsuishi, M. Kobayashi, K. Matsuda // Carbohyd. Res. - 1984. - Vol. 129. - P. 167 - 177.

25. A new polarimetric method for the analysis of dextran and sucrose / V. Singlenton, J. Horn, С. Виске, M. Adlard // Int. Sugar J. 2001. - Vol. 103, № 1230. -P. 251 -254.

26. Arnold, W.N. Purification and characterization of a dextranase from Sporothrix schenckii / W.N. Arnold, T.B.P. Nguyen, L.C. Mann // Arch. Microbiol. -1998.-Vol. 170.-P. 91-98.

27. Assay method: US Patent Application 20030100041 / С. Виске, M. Adlard, V. Singleton, J. Horn Publ. 29.11.2001.

28. Bailey, R.W. A Bacterial Dextranase / R.W. Bailey, R.T.J. Clarke // Biochem. J. 1959. - Vol. 72. - P. 49 - 54.

29. Bailey, R.W. The action of a Lactobacillus bifidus Dextranase on a Branched Dextran / R.W. Bailey, D.H. Hutson, H. Weigel // Biochem. J. 1961. -Vol. 80.-P. 514-519.

30. Barret, J.F. Renaturation of Dextranase Activity from Culture Supernatant Fluids of Streptococcus sorbinus after Sodium Dodecylsulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis / J.F. Barret, R. Curtiss // Anal. Biochem. 1986. -Vol. 158. - P. 365 -370.

31. Barret, J.F. Purification and partial Characterisation of the Multicomponent Dextranas Complex of Sreptococcus sorbinus and Cloning of the Dextranase Gene / J.F. Barret, T.A. Barret, R. Curtiss // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, № 3. - P. 792 - 802.

32. Enzymic, spectroscopic and calorimetric studies of a recombinant dextranase expressed in Pichia pastoris / A. Beldarrain, N. Acosta, L. Betancourt, J. Gonzales, T. Pons //Biotechnol. Appl. Biochem. 2003. - Vol. 38. - P.211-221.

33. Bergey's Manual of systematic Bacteriology / Baltimore. The Williams & Wilkins Co. Baltimore, 1986. Vol. 2. - P.l 104 - 1141.

34. Bourne, E.J. Studies on dextrans and dextranases. Part XI. The structure of a dextran elaborated by Leuconostoc mesenteroides NRRL В 1299 / E.J. Bourne, R.L. Sidebotham, H. Weigel // Carbohyd. Res. - 1974 - V. 34, № 2. - P. 279 - 288.

35. Bruijn, J.M. Processing of Frost Damaged Beets at CSM and the use of Dextranase / J.M. Bruijn // Zuckerindustrie 2000. - Vol. 125, № 11. - P. 898 - 902.

36. Brown, C.F. Specific Method for Quantitative Measurement of the Total Dextran Content of Raw Sugar / C.F. Brown, P.A. Inkeirnan // J. Agric. Food Chem. 1992.-Vol. 40.-P. 227-233.

37. Characterization of novel carbohydrase from Lipomyces starkeyi KSM 22 for dental application / D. Kim, S.-J. Ryu, S.-J. Heo, D.-W. Kim, H.-S. Kim // J. Microb. Biotech. 1999. - Vol. 9, № 3. - P. 260 - 264.

38. Characterization of polysaccharides synthesized by Gluconobacter oxydans NCIMB 4943 / I.M. Sims, A. Thomson, U. Hubl, N.G. Larasen, R.H. Furneaux // Carbohyd. Polym. 2001. - Vol. 45 - P. 285 - 292.

39. Charles, A.F. Preparation and use of enzymatic material from Penicillium lilacinum to yield clinical dextran / A.F. Charles, L.N. Farrell // Can J. Microbiol. 1957. - Vol. 3. - P. 239 - 247.

40. Chavan, S.M. Enzymatic hydrolysis of starch and dextran during sugar manufacturing process: warana experience / S.M. Chavan, S.D. Borawake, G.D. Patil // Sugar Ind. Abstracts 2001. - Vol. 63, № 4. - P. 113. - Abstract № 848.

41. Cheetham, N.W.H. Structure of Linear, Low Molecular Weight Dextran Synthesized by a D Glycosyltransferase (GTF - S3) of Streptococcus sorbinus / N.W.H. Cheetham, M.E. Slodki, G.J. Walker // Carbohyd. Polym. 1991. - Vol. 16. -P. 341 -353.

42. Clindamycin Effect on Glycocalyx Production in Experimental Viridans Streptococcal Endocarditis / L. Dall, M. Keilhofner, B. Herndon, W. Barnes, J. Lane // J. Infec. Diseas. 1990. - Vol. 161. - P. 1221 - 1224.

43. Cloning and characterisation of a dextranase gene (dex S) from Streptococcus suis / B. Serhir, D. Dugourd, M. Jacques, R. Higgins, J. Harel // Gene -1997.-Vol. 190.-P. 257-261

44. Cloning and sequencing of a dextranase-encoding cDNA from PeniciUium minioluteum / B. Garcia, E. Margolles, H. Roca, D. Mateu, M. Raices, M. Gonzales, L. Herrera, J. Delgado // FEMS Microb. Lett. 1996. - Vol. 143. - P. 175 -183.

45. Colby, S.M. Sugar metabolism by mutans streptococci / S.M. Colby, R.R.B. Russell // J. Appl. Microb. Sym. Suppl. 1997. - Vol. 83. - P. 80S - 88S.

46. Composition for the removal of dental plaque: US Patent 6254856 / R. Tsuchiya Publ. 03.07.2001.

47. Costa, T. Dextran hydrolysis by a Fusobacterium strain isolated from human dental plaque / T. Costa, L.C. Bier, F. Gaida // Archs. Oral Biol. 1974. - Vol. 19.-P. 341 -342.

48. Cote, G.L. The formation of a-(l, 3) branch linkages by an exocellular glucansucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL В 742 / G.L. Cote, J.F. Robyt // Carbohyd. Res. - 1983. - Vol. 119. - P. 141 - 156.

49. Cote, G.L. Some structural features of an insoluble a D - glucan from a mutant strain of Leuconostoc mesenteroides NRRL В - 1355 / G.L Cote, J.A. Ahlgren, M.R. Smith // J. Ind. Microb. Biotech. - 1999. - Vol. 23. - P. 656 - 660.

50. Covacevich, M.T. Purification of intracellular dextranases and D -glucosidases fr6m Pseudomonas UQM 733 / M.T. Covacevich, G.N. Richards // Carbohyd. Res. 1978. - Vol. 64. - P. 169 - 180.

51. Covacevich, M.T. Modes of Action of intracellular dextranase and three oligoglucanases from Pseudomonas UQM 733 / M.T. Covacevich, G.N. Richards // Carbohyd. Res. 1979. - V. 70. - P. 283 - 293.

52. Das, D.K. Purification, Biochemical Characterisation and Mode of Action of an Extracellular Endo dextranase from the Culture Filtrate of Penicillium lilacinum / D.K. Das, S.K. Dutta // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 1996. - Vol. 28, № 1. -P. 107-113.

53. Davis, H.M. Structural elucidation of a water insoluble glucan produced by a cariogenic oral Streptococcus / H.M. Davis, H.B Hines, J.R. Edwards // Carbohyd. Res. - 1986. - Vol. 156. P. 69 - 77.

54. Degradation of dental plaque glucans and prevention of glucan formation using commercial enzymes / M. Marotta, A. Martino, A. De Rosa, E. Farina, M. Carteni, M. De Rosa // Process Biochem. 2002. - Vol. 38, № 1. - P. 101 - 108.

55. Demonstration of two independent dextranase and amylase active sites on a single enzyme elaborated by Lipomyces starkeyi KSM 22 / S.-Y. Lee, J.-H. Lee, J.F. Robyt, E.-S. Seo, H.-J. Park, D. Kim // J. Microbiol. Biotech. 2003. - Vol. 13, №2.-P. 313-316.

56. Dextranase Enhances Antibiotic Efficacy in Experimental Viridans Streptococcal Endocarditis / A.S. Mghir, A.C. Cremieux, R. Jambou, M. Muffat-Joly, J.J. Pocidalo, C. Carbon // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. - Vol. 38, № 5. -P. 953 - 958.

57. Dextranase from Penicillium minioluteum: Reaction Course, Crystal Structure, and Product Complex / A.M. Larsson, R. Andersson, J. Stahlberg, L. Kenne, T.A. Jones // Structure 2003. - Vol. 11. - P. 1111 - 1121.

58. Dextranase treatment of dextran for manufacture of dextran with better pharmaceutical properties: Ger. (East) DD 255,953 (CI. С 12P19/08) / M. Ulitzsch, C. Scholzf Publ. 20 Apr. 1988.

59. Dols, M. Dextransucrase production by Leuconostoc mesenteroides NRRL В 1299. Comparison with L. mesenteroides NRRL В - 512F / M. Dols, M. Remaud-Simeon, P.F Monsan I I Enzyme Microb. Technol. - 1997. - Vol. 20. - P. 523 -530.

60. Dragan-Bularda, M. Kiss S. Dextranase activity in soil / M. Dragan-Bularda, S. Kiss // Soil Biol. Biochem. 1972. - Vol. 4. - P. 413 - 416.

61. Ebeid, H.M. Properties of dextranase isolated from Bacillus sphaericus and Penicillium roqueforti / H.M. Ebeid // Ann. Agric. Sci., Moshtohor 1992. - Vol. 30, № 2. - P. 919 - 934.

62. Edman, P. Treatment of artificially induced storage disease with lysosomotropic microparticles / P. Edman, I. Sjoholm // Life sciences 1982. - Vol. 30, № 4. - P. 327 - 330.

63. Ellis, D.W. Extracellular Dextran Hydrolase from Streptococcus mutans Strain 6715 / D.W. Ellis, C.H. Miller // J. Dent. Res. 1977. - Vol. 56, № 1. - P. 57 -69.

64. Enzyme electrode and method for dextran analysis: US Patent 4552840 / R. Riffer Publ. 02.12.1982.

65. Enzyme capable of hydrolyzing plaque, microorganism producing the same, and a composition comprising the same: WO Patent 01/66570 Al. / D.-W. Kim, S.-J. Heo, S.-J. Ryu. Publ. 13.09.2001.

66. Enzymatic degradation and immunogenic properties of derived dextrans / B. Crepon, J. Jozefonvicz, V. Chytry, B. Rihova, J. Kopecek // Biomaterials 1991. -Vol. 12.-P. 550-554.

67. Evidence for a single active site on isomalto dextranase with hydrolysis activities of a - 1,6 -and a - 1,4- glucosidic linkages / T. Takayanagi, A. Kimura, H. Matsui, G. Okada, S. Chiba // J. Appl. Glycosci. - 2001. - Vol. 48, № 1. - P. 55 - 61.

68. Exopolysaccharide Producing Bacteria from Sugar Beets / A.H. Tallgren, U. Airaksinen, R. Weissenberg, H. Ojamo, J. Kuusisto, M. Leisola // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - Vol. 65, № 2. - P. 862 - 864.

69. Felgenhauer, B. A comparative study of extracellular glucanhydrolase and glucosyltransferase enzyme activities of five different serotypes of oral Streptococcus mutants / B. Felgenhauer, K. Trautner // Arch. Oral Biol. 1982. - Vol. 27.-P. 455-461.

70. Fukimoto, J. Penicillium luteum Dextranase: Its Production and Some Enzymatic Properties / J. Fukimoto, H. Tsuji, D.I. Tsuru // J. Biochem. 1971. - Vol. 69. - P. 1113 - 1121.

71. Gianfreda, L. Comparison of a- and P-Glucanase Activities in Fourteen Species of Marine Molluscs / L. Gianfreda, E. Tosti, V. Scardi // Biochem. System. Ecol. 1979. - Vol. 7. - P. 57 - 59.

72. Gibbons, R.J. Bacterial adherence in oral microbial ecology / R.J. Gibbons, J. Houte // Ann. Rev. Microb. 1975. - Vol. 29 - P. 19 - 44.

73. Goldstein-Lifschitz, B. Comparison of Dextranases for Their Possible Use in Eliminating Dental Plaque / B. Goldstein-Lifschitz, S. Bauer // J. Dent. Res. -1976. Vol. 55, № 5. - P. 886 - 892.

74. Gordon, R. E. The Genus Bacillus. Agricultural Handbook № 427 / R.E. Gordon, W.C. Haynes, C.H. Pang. The US Department of Agriculture, Washington, DC., 1973.-283 p.

75. Guggenheim, B. Enzymatic hydrolysis and Structure of Water -Insoluble Glucan Produced by Glucosyltransferases from a Strain of Streptococcus mutans / B. Guggenheim // Helv. Odont. Acta. 1970. - Vol. 14, № 5. - P. 89 - 108.

76. Hamada, S. Biology, Immunology, and Cariogenicity of Streptococcus mutans t S. Hamada, H.D. Slade // Microbiol. Rev. 1980. - Vol. 44, № 2. - P. 331 -384.

77. Gel Electrophoresis: a Practical Approach / Edited by B.D. Hames, D. Rickwood. London: IRL Press Ltd, 1981.-200 p.

78. Hattori, A. The Purification and Characterisation of the Dextranase of Chaetomium gracile / A. Hattori, K. Ishibashi, S. Minato // Agric. Biol. Chem. -1981.-Vol. 45, № 11.-P. 2409-2416.

79. Henrissat, B.A. classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B.A. Henrissat // Biochem. J. 1991. - Vol. 280. - P. 309 -316.

80. Henrissat, В. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat, A. Bairoch // Biochem. J. -1993.-Vol. 293.-P. 781 -788.

81. Henrissat, B. Updating the sequence based classification of glycosyl hydrolases / B. Henrissat, A. Bairoch // Biochem. J. - 1996. - Vol. 316. - P. 695 - 696.

82. Henrissat, B. Glycoside Hydrolases and Glycosyltransferases. Families, Modules, and Implications for Genomics / B. Henrissat, G.J. Davies // Plant Physiol. -2000.-Vol. 124.-P. 1515-1519.

83. Heyn, A.N.J. Dextranase activity and auxin induced cell elongation in coleoptiles of Avena / A.N.J. Heyn //Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1970. -Vol. 38, №5.-P. 831 - 837.

84. Heyn A.N.J. Molecular basis of auxin-regulated extension growth and role of dextranase / A.N.J. Heyn // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol. 78, № 11.-P. 6608-6612.

85. Hiraoka, N. III. Purification and Some Enzymatic Properties of Aspergillus carneus Dextranase / N. Hiraoka, J. Fukimoto, D. Tsuru // J. Biochem. -1972.-Vol.71 P. 57-64.

86. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria / P., Monsan, S. Bozonnet, C. Albenne, G.Joucla, R.-M. Willemot, M. Remaund-Simeon // Int. Dairy J.-2001.-Vol. 11.-P. 675 -685.

87. Hoster, F. Isolation of a new Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum strain (FH1) producing a termostable dextranase / F. Hoster, R. Daniel, G. Gottschalk // J. Gen. Appl. Microbiol. 2001. - Vol. 47, № 4. - P. 187 -192.

88. Huang, J.S. Sensitive Assay for Cellulase and Dextranase / J.S. Huang, J. Tang // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 73. P. 369 - 377.

89. Hultin, E. Investigation on Dextranase I. On the Occurrence and the Assay of Dextranase / E. Hultin, L. Nordstrom // Acta Chem. Scan. 1949. - Vol. 3. -P. 1405 - 1417.

90. Hutson, D.H. Studies on Dextrans and Dextranases. 4. Mechanism of the actions of intra and extra - cellular mould dextranases / D.H. Hutson, H. Weigel // Biochem J. - 1963. - Vol. 88. - P. 588 - 591.

91. Hydrolysis of dextran by PeniciUium notatum dextranase and indentification of final digestion products / M. Pleszczynska, J. Szczodrak, J. Rogalski, J. Fiedurek // Mycol. Res. 1997. - Vol. 101, № 1. - P. 69 - 72.

92. Identification of mutans streptococcal species by the PCR products of the dex genes / T. Igarashi, K. Ichikawa, A. Yamamoto, N. Goto // J. Microbiol. Methods 2001. - Vol. 46. - P. 99 - 105.

93. Igarashi, T. Purification and characterization dextranase of Bacteroides oralis Ig 4a / T. Igarashi, A. Yamamoto // Showa Shigakkai Zasshi 1988. - Vol. 8, №4.-P. 405 -412.

94. Igarashi, T. Characterization of the dextranase gene (dex) of Streptococcus mutans and its recombinant product in an Escherichia coli host / T. Igarashi, A. Yamamoto, N.Goto // Microbiol. Immunol. 1995. - Vol. 39, № 6. - P. 387-391.

95. Igarashi, T. Detection of dextranase producing gram - negative oral bacteria / T. Igarashi, A. Yamamoto, N.Goto // Oral Microbiol. Immunol. - 1998. -Vol. 13.-P. 382-386.

96. Increasing the plasma half-life of trichosanthin by coupling to dextran / W. Ко, С. Wong, H. Yeung, M. Yung, P. Shaw, S. Tam // Biochem. Pharmacol. -1991. Vol. 42, № 9. - P. 1721 - 1728.

97. Ingelman, B. Enzymatic Breakdown of Dextran / B. Ingelman // Acta Chem. Scan. 1948. - Vol. 2. - P. 803 - 812.

98. Insertional inactivation of the Streptococcus sorbinus dexA (dextranase) gene results in altered adherence and dextran catabolism / S.M. Colby, G.C. Whiting, L. Tao, R.R.B. Russell // Microbiology 1995. - Vol. 141. - P. 2929 - 2936.

99. Isolation and characterization of a thermostable dextranase / C. Wynter, M. Chang, J. De Jersey, B. Patel, P.A. Inkerman, S. Hamilton // Enzyme Microb. Tech. 1997. - Vol. 20. - P. 242 - 247.

100. Isolation of a Pure Dextranase from Penicillium funiculosum / L. Chaiet, щ A. J. Kempf, R. Harman, E. Kaczka, R. Weston, K. Nollstadt, F.J. Wolf // Appl.

101. Microbiol. 1970. - Vol. 20, № 3. - P. 421 - 426.

102. Janson, J.-C. Bacterial Dextranase / J.-C. Janson, J.A Porath // Methods in Enzymology 1966. - Vol. 8. - P. 615 - 621.

103. Jensen, B. Extracellular a Glucosidase with Dextran - Hydrolysing Activity from the Thermophilic Fungus, Thermomyces lanuginosus / B. Jensen, J. Olsen // Curr. Microb. - 1996. - Vol. 33. - P. 152 - 155.

104. Jonson, I.H. Dextranase activity of streptococcal isolates from human dental plaques / I.H. Jonson // Microbios 1991. - Vol. 65, № 264 - 265. - P. 155 -167.

105. Kaster, A.G. Extracellular Dextranase Activity Produced by Human Oral Strains of Genus Bifidobacterium / A.G. Kaster, L.R. Brown // Inf. Immun. 1983. -Vol. 42, №2. -P. 716-720.

106. Kim, D. A new process for the production of clinical dextran by mixed-culture fermentation of Lipomyces starkeyi and Leuconostoc mesenteroides / D. Kim, D.F. Day // Enzyme Microb. Technol. 1994. - Vol. 16. - P. 844 - 848.

107. Kim, D. Production, selection, and characteristics of mutants of Leuconostoc mesenteroides B-742 constitutive for dextransucrases / D. Kim, J.F. Robyt // Enzyme Microb. Technol. 1995a. - Vol. 17 - P. 689 - 695.

108. Kim, D. Dextransucrase constitutive mutans of Leuconostoc mesenteroides В 1299 / D. Kim, J.F. Robyt // Enzyme Microb. Technol. - 1995b. -Vol. 17. - P. 1050- 1056.

109. Kim, D. Isolation of a dextranase constitutive mutant of Lipomyces starkeyi and its use for the production of clinical size dextran / D. Kim, D.F. Day // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - Vol. 20, № 5. - P. 268 - 270.

110. Kim, Y.-K. Enzymatic Preparation of Novel Non-reducing Oligosaccharides Having an Isomaltosyl Residue by Using the Transfer Action of1.omaltodextranase from Arthrobacter globiformis T6 / Y.-K. Kim, Y. Tsumuraya,

111. Y. Sakano // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. - Vol. 59, № 7. - P. 1367 - 1369.

112. Kobayashi, M. Pronounced hydrolysis of highly branched dextrans with a new type of dextranase / M. Kobayashi, Y. Mitsuishi, K. Matsuda // Biochem. Biophys. Research Commun. 1978. - Vol. 80, № 2. - P. 306 - 312.

113. Kobayashi, M. Intensive UV Absorption of Dextrans and its Application to Enzyme Reactions / M. Kobayashi, H. Utsugi, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. -1986. Vol. 50, № 4. . p. Ю51 - 1053.

114. Kobayashi, M. Fluorospectral intensity of high molecular - weight dextrans: application to the enzyme reactions / M. Kobayashi, H. Utsugi, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 51, № 8. - P. 2073 - 2079.

115. Kobayashi, M. Inhibition of detxran and mutan synthesis by cycloisomaltooligosaccharides / M. Kobayashi, K. Funane, T. Oguma // Biosci.

116. Biotechnol. Biochem. 1995. -Vol. 59, № 10. - P. 1861 - 1865.

117. Koenig, D.W. Induction of Lipomyces starkeyi Dextranase / D.W. Koenig, D.F. Day // Appl. Environ. Microbiol. 1989a. - Vol. 55, № 8. - P. 2079 -2081.

118. Koenig, D.W. The purification and characterization of a dextranase from Lipomyces starkeyi / D.W. Koenig, D.F. Day // Eur. J. Biochem. 1989b. -Vol. 183. -P. 161 - 167.

119. Koh, T.Y. Rapid method for the assay of dextranase / T.Y. Koh, B.T. Khouw // Can. J. Biochem. 1970. - Vol. 48, № 3. - P. 225 - 227.

120. Kubic, C. Immobilization of dextransucrase and its use with soluble dextranase for glucooligosaccharides synthesis / C. Kubic, B. Sikora, S. Bieleski // Enzyme, microb. technol. 2004. - Vol. 34. - P. 555 - 560.

121. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / U.K. Laemmli // Nature. -1970. Vol. 227, № 5259. -P. 680 - 685.

122. Lawman, P. Molecular cloning of the Extracellular Endodextranase of Streptococcus salivarius / P. Lawman, A.S. Bleiweis // J. Bacterid. 1991. - Vol.173, №23. -P. 7423 -7428.

123. Lee, J.M. Purification and characterization of Paecilomyces lilacinus dextranase / J.M. Lee, P.F. Fox // Enzyme Microb. Technol. 1985. - Vol. 7. - P. 573 -577.

124. Linder, L. Characterization of Dextran Glucosidase (1, 6-a-D-Glucan Glucohydrolase) of Streptococcus mitis / L. Linder, M.-L. Sund //Caries Res. 1981. -Vol. 15.-P. 436-444.

125. Loesche, W.J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay / W.J. Loesche // Microbiol. Rew. 1986. - V. 50. - P. 353 - 380.

126. Madhu, Studies on dextranase from Penicillium aculeatum / Madhu, K.A. Prabhu // Enzyme Microb. Technol. 1984. - Vol.6 - P. 217 - 220.

127. Madhu, Application of dextranase in the removal of dextran from cane juice / Madhu, G.L. Shukla, K.A. Prabhu // Int. Sugar J. 1984. - Vol. 86, № Ю25. -P. 136- 138.

128. Makinen, K.K. Exploitation of Blue dextran as a Dextranase Substrate / K.K. Makinen, I.K. Paunio // Anal. Biochem. 1971. - Vol. 39. - P. 202 - 207.

129. Measurement of Carboxymethylcellulase Activity / G.L. Miller, R. Blum, W.E. Glennon, A.L. Burton // Anal. Chem. 1960. - Vol. 1. - P. 127 - 132.

130. Mehvar, R. Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agents / R. Mehvar // J. Control. Release. 2000. - Vol. 69. - P. 1 - 25.

131. Method for antibody targeting of therapeutic agents: US Patent 5851527 / H.J. Hansen Publ. 22.12.1998.

132. Method for producing clinical dextran: US Patent 2841578 / L.J. Novak, G.S. Stoycos Publ. 01.07.1958.

133. Method of producing clinical dextran: US Patent 2972567 / L.J. Novak, G.S. Stoycos Publ. 21.02.1961.

134. Method of producing dextranase: US Patent 3787289 / R.S. Davis, D.L. Isenberg Publ. 22.01.1974.

135. Mitsuishi, Y. Dextran a 1, 2 debranching enzyme from Flavobacterium sp. M-73: its production and purification / Y. Mitsuishi, M. Kobayashi, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. - 1979. - Vol. 43, № 11. - P. 2283 - 2290.

136. Mitsuishi, Y. Dextran a (1—>2) - debranching enzyme from Flavobacterium Sp. M-73 Properties and mode of action / Y. Mitsuishi, M. Kobayashi, K. Matsuda // Carbohyd. Res. - 1980. - Vol. 83. - P. 303 - 313.

137. Molecular Cloning and Expression of an Isomalto-Dextranase Gene from Arthrobacter globiformis T6 / A. Iwai, H. Ito, T. Mizuno, H. Mori, H. Matsui, M. Honma, G. Okada, S. Chiba // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176, № 24. - P. 7730 -7734.

138. Molecular Cloning of an a- Glucosidase like Gene from Penicillium minioluteum and Structure Prediction of Its Gene Product / B. Garcia, A. Castellanos, J. Menendez, T. Pons // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2001. - Vol. 281. - P. 151 - 158.

139. Monchois, V. Glucansucrases: mechanism of action and structure-function relationships / V. Monchois, R.-M. Willemot, P. Monsan // FEMS Microb. Rew. 1999. - Vol. 23. P. 131 - 151.

140. Moriyama, K. Regulated insulin release from biodegradable dextran hydrogels containing poly(ethylene glycol) / K.Moriyama, N. Yui // J. Control. Rel. -1996. Vol. 42. - P. 237 - 248.

141. Mumtaz, S. Enhanced intracellular stability and efficacy of PEG modified dextranase in the treatment of a model storage disorder / S. Mumtaz, B.K. Bachhawat // Biochem. Biophys. Acta 1994. - Vol. 1199. - P 175 - 182.

142. Newbrun, E. Further studies on Extracellular Glucans synthesized by Glucosyltransferases of Oral Streptococci / E. Newbrun, M. Sharma // Caries Res. -1976.-Vol. 10.-P. 255-272.

143. Oguma, T. Novel Cyclic Dextrins, Cycloisomaltooligosaccharides, from Bacillus sp. T -3040 Culture / T. Oguma, T. Horiuchi, M. Kobayashi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. - Vol. 57, № 7. - P. 1225 - 1227.

144. Oguma, Т. Purification and properties of a novel enzyme from Bacillus spp. T-3044, which catalyzes the conversion of dextran to cyclic isomaltooligosaccharides / T. Oguma, K. Tobe, M. Kobayashi // FEBS Lett. 1994. -Vol. 345.-P. 135 - 138.

145. Oguma, T. Production of Cyclodextran and Its Application / T. Oguma, K. Hiroshi // Trends Glycosci. Glycotech. 2003. - Vol. 15, № 82. - P. 91 - 99.

146. Okada, G. Improved Purification and Further Characterization of an Isomaltodextranase from Arthrobacter globiformis T6 / G. Okada, T. Takayanagi, T. Sawai // Agric. Biol. Chem. 1988a. - Vol. 52, № 2. - P. 495 - 502.

147. Okada, G. A Simple Purification for and Further Characterization of a Glucodextranase from Arthrobacter globiformis 142 / G. Okada, T. Unno, T. Sawai // Agric. Biol. Chem. 1988c. - Vol. 52, № 9. - P. 2169 - 2176.

148. Okada, G. Glucodextranase Accompanied by Glucoamylase Activity from Arthrobacter globiformis 142 / G. Okada, T. Unno // Agric. Biol. Chem. 1989. -Vol. 53, № l.-P. 223 -228.

149. Okami, Y. A new Glucanase Produced by a Marine Bacillus / Y. Okami, S. Kurasava, Y. Hirose // Agr. Biol. Chem. 1980. - Vol. 44, № 5. - P. 1191 - 1192.

150. Oral composition containing dextranase and a-1, 3 glucanase and a method for preventing and suppressing oral diseases using the same: US Patent 4438093 / K. Shimada, M. Akiyama, M. Sudo Publ. 20.03.1984.

151. Padmanabhan P.A. Production of insoluble dextran using cell bound dextransucrase of Leuconostoc mesenteroides NRRL - 523 / P.A. Padmanabhan, D.-S. Kim // Carbohyd. Res. - 2002. - Vol. 337. - P. 1529 - 1523.

152. Production of dextran by Rhizopus sp. Immobilized on porous cellulose support / N.V. Sankpal, A.P. Joshi, S.R. Sainkar, B.D. Kulkarni // Process Biochem. -2001.-Vol. 37.-P. 395 -403.

153. Productivity of Four a D - Glucosyltransferases Released by Streptococcus sobrinus under Defined Conditions in Continuous Culture / G.J. Walker, N.W.H. Cheetham, C. Taylor, B.J. Pearce, M.E. Slodki // Carbohyd. Polym. - 1990.-Vol. 13.-P. 399-421.

154. Pulkownik, A. Purification and substrate specificity of an endo -dextranase Streptococcus mutans K1 R / A. Pulkownik, G.J. Walker // Carbohydr. Res. - 1977. - Vol. 54. - P. 237 - 251.

155. Purification and Characterization of an Isomaltotriose producing Endo -dextranase from a Fusarium sp. / E. Shimizu, T. Unno, M. Ohba, G. Okada I I Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1998. - Vol. 62, № 1. - P.l 17 - 122

156. Purification and Immobilization of Dextranase / J. Rogalski, J. Szczodrak, G. Gl'owiak, M. Pleszczynska, Z. Szczodrak, A. Wiater // Acta Biotechnol. 1998. - Vol. 18, № 1. - P. 63 - 75.

157. Purification and Properties of Cyclomaltodextrin Glucanotransferase from an Alkalophilic Bacillus / M. Makela, P. Mattsson, E.M. Schinina, T. Korpela // Biotech. Appl. Biochem. 1988. - Vol. 10. - P. 414 - 427.

158. Purification and some properties of an extracellular dextranase from Penicillium notatum / M. Pleszczynska, J. Szczodrak, J. Rogalski, J. Fiedurek // Mycol. Res. 1996. - Vol. 100, № 6. - P. 681 - 686.

159. Purification and some properties of glucodextranase from Arthrobacter globiformis T-3044 / T. Oguma, T. Kurokawa, K. Tobe, S. Kitao, M. Kobayashi // J. Appl. Glycosci. 1996. - Vol. 43, № 1. - P. 73 - 78.

160. Purification and some properties of the isomaltodextranase of Actinomadura strain R10 and comparison with that of Arthrobacter globiformis T6 / T. Sawai, S. Ohara, Y. Ichimi, S. Okaji, K. Hisada, N. Fukaya // Carbohyd. Res. -1981.-Vol. 89.-P. 289-299.

161. Purification of dextranase from Penicillium funiculosum and its enzymatic properties / M. Sugiura, A. Ito, T. Ogiso, K. Kato, H. Asano // Biochim. Biophis. Acta 1973. - Vol. 309. - P. 357 - 362

162. Ramos, A. Extracellular glucose producing exodextranase of then Lipomyces lipofer / A. Ramos, I. Spencer-Martins // Antonie van Leeuwehoek. 1983. Vol. 49, № 2. - P. 183 - 190.

163. Reva, O.N. Simplified technique for identification of the aerobic spore-forming bacteria by phenotype / O.N. Reva, I.B. Sorokulova, V.V. Smirnov // Int. J. Sys. Evol. Microbiol. 2001. - Vol. 51. - P. 1361 - 1371.

164. Richards, G.N. Studies on dextranases. Part I. Isolation of extracellular, bacterial dextranases / G.N. Richards, M. Streamer // Carbohyd. Res. 1972. - Vol. 25.-P. 323 -332.

165. Richards, G.N. Studies on dextranases. Part IV. Mode of action of dextranase Dj on oligosaccharides / G.N. Richards, M. Streamer // Carbohyd. Res.1974.-Vol. 32.-P. 251 -260.

166. Richards, G.N. Mode of action of dextranase D2 from Pseudomonas UQM 733 on oligosaccharides / G.N. Richards, M. Streamer // Carbohyd. Res. -1978.-Vol. 62.-P. 191 196.

167. Robyt, J.F. Production, purification, and properties of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL В 512F / J.F. Robyt, T.F. Walseth // Carbohyd. Res. - 1979. - Vol. 68. - P. 95 - 111.

168. Russell, R.R.B. Nucleotide sequence of the dextran glucosidase {dex B) gene of Streptococcus mutans / R.R.B. Russell, J.J. Ferretti // J. Gen. Microb. 1990.-Vol. 136.-P. 803 -810.1. V V

169. Safarik, I. Rapid detection of dextranases in liquid samples /1. Safarik // Biomed. Biochim. Acta 1990. - Vol. 49, № 7. - P. 625 - 628.V

170. Safarik, I. A new substrate for the determination of dextranase activity in colored samples / I. Safarik, M. Safarikova // Biotech. Applied Biochem. 1992. -Vol. 16, №3.-P. 263-268.

171. Santos, M. Production of dextransucrase, dextran and fructose from sucrose using Leuconostoc mesenteroides NRRL B512(f) / M. Santos, J. Teixeira, A.

172. Rodrigues // Biochem. Engin. J. 2000. - Vol. 4. - P. 177-188.

173. Sawai, Т. A Bacterial Dextranase Releasing Only Isomaltose from Dextrans / T. Sawai, K. Toriyama, K. Yano // J. Biochem. 1974. - Vol. 75, № 1. - P. 105 - 112.

174. Sawai, T. Transisomaltosylation Activity of a Bacterial Isomalto -dextranase / T. Sawai, Y. Niwa // Agric. Biol. Chem. 1975. - Vol. 39, № 5. - P. 1077- 1083.

175. Sawai, T. Identification of an isomalto dextranase producing bacterium, Arthrobacter globiformis T6 / T. Sawai, Y. Ukigai, A. Nawa // Agric. Biol. Chem. -1976a. - Vol. 40, № 6. - P. 1246 - 1250.

176. Sawai, T. Purification and Some Properties of Arthrobacter globiformis Exo 1, 6 -a glucosidase / T. Sawai, T. Yamaki, T Ohya. // Agric Biol. Chem. -1976b. - Vol. 40, № 7. - P. 1293 - 1299.

177. Schachtele, C.F. Dextranases from oral bacteria. Inhibition of water -insoluble glucan production and adherence to smooth surfaces by Streptococcus mutans / C.F. Schachtele, R.H. Staat, S.K. Harlander // Infect. Immun. 1975. - Vol. 12,№2.-P. 309-317.

178. Schilling, K.M. Glucans Synthesized In Situ in Experimental Salivary Pellicle Function as Specific Binding Sites for Streptococcus mutans ( K.M. Schilling, W.H. Bowen // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, № l. - p. 284 - 295.

179. Sery, T.W. Degradation of dextranas by enzymes of intestinal bacteria / T.W. Sery, E.J. Hehre // J. Bacteriol. 1956. - Vol. 71, № 3. - P. 373 - 380.

180. Sidebotham, R.L. Dextrans / R.L. Sidebotham // Adv. Carbohyd. Chem. Biochem. 1974. - Vol. 30. - P. 371 - 444.

181. Sinha, V.R. Colonic Drug Delivery: Prodrug Approach / V.R. Sinha, R. Kumria// Pharm. Res. 2001. - Vol. 18, № 5. - P. 557 - 564.

182. Somogyi M. Determination of blood sugar / M. Somogyi // J. Biol. Chem. 1945. - Vol. 160. - P. 69 - 73.

183. Staat, R.H. Analysis of the Dextranase Activity Produced by an Oral Strain of Bacteroides ochraceus / R.H. Staat, C.F. Schachtele // J. Dent. Res. 1976. -Vol. 55, №6.-P. 1103-1110.

184. Staat, R.H. Analysis of the Dextranase Activity Produced by an Oral Strain of Bacteroides ochraceus / R.H. Staat, C.F. Schachtele // J. Dent. Res. 1976. -Vol. 55, №6.-P. 1103 -1110.

185. Structural Insights into Substrate Specificity and Function of Glucodextranase / M. Mizuno, T. Tonozuka, S. Suzuki, R. Uotsu-Tomita, S. Kamitori, A. Nishikawa, Y. Sakano // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, № 11. - P. 10575 - 10583.

186. Sugiura, M. Studies on dextranase II. New exo dextranase from Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum / M. Sugiura, A. Ito, T. Yamaguchi Sugiura M., Ito A., Yamaguchi T. // Biochim. Biophys. Acta - 1974. - Vol. 350. - P. 61 - 70.

187. Takahashi N. Isolation and properties of dextranase from in Bacteroides oralis Ig 4a / N. Takahashi // Microbiol. Immunol. 1982. - Vol. 26, № 5. - P. 375 -386.

188. Takahashi, N. Subcellular localization of D glucanases in Bacteroides oralis Ig 4a / N. Takahashi, Y. Saton, K. Takamori // J. Gen. Microbiol. - 1985. - Vol. 131.-P. 1077- 1082.

189. Tirtaatmadja, V. Rheology of dextran solutions / V. Tirtaatmadja, D. Dunstan, D. Boger // J. Non-Newtonian Fluid Mech. 2001. - Vol. 97. - P. 295-301.

190. Torii, M. Degradation of alpha linked D - gluco - oligosaccharides and dextrans by an isomalto - dextranase preparation from Arthrobacter globiformis T6 /

191. M. Torii, К. Sakakibara, A. Misaki, Т. Sawai // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1976. Vol. 70, № 2. - P. 459 - 464.

192. Tsuru, D. Studies on Mold Dextranases IV. Substrate Specificity of Aspergillus carneus Dextranase / D. Tsuru, N. Hiraoka, J. Fukimoto // J. Biochem. -1972.-Vol. 71.-P. 653 -660.

193. Two Fluorometric Approaches to the Measurement of Dextranase Activity / M. Zhou, C. Zhang, R.H. Upson, R.P. Haugland // Anal. Biochem. 1998. -Vol. 260. - P. 257 - 259.

194. Walker, G.J. Some Properties of a Dextranglucosidase Isolated from Oral Streptococci and its Use in Studies on Dextran Synthesis / Walker G.J. // J. Dent. Res. 1972. - Vol. 51, № 2. - P. 409-414.

195. Walker, G.J. Degradation of dextrans by a 1,6 -glucan glucohydrolase from Streptococcus mitis / G.J. Walker, A. Pulkownik // Carbohyd. Res. - 1973. -Vol. 29. - P. 1 -14.

196. Walker, G.J. Action of a 1, 6 - glucan glucohydrolase on oligosaccharides derived from dextran / G.J. Walker, A. Pulkownik // Carbohyd. Res. - 1974.-V. 36.-P. 53-66.

197. Walker, G.J. The action pattern of Penicillium lilacinum dextranase / G.J. Walker, M.D. Dewar // Carbohyd. Res. 1975. - Vol. 39. - P. 303 - 315.

198. Walker, G.J. Metabolism of the Polysaccharides of Human Dental Plaque: Release of Dextranase in Batch Cultures of Streptococcus mutans / G.J. Walker, A. Pulkownik, J.G. Morrey-Jones // J. Gen. Microb. 1981. - Vol. 127. - P. 201 - 208.

199. Webb, E. Extracellular endodextranase from the yeast Lipomyces starkeyi / E. Webb, I. Spencer-Martins //Can. J. Microbiol. 1983. - Vol. 29. - P. 1092- 1095.

200. Whiting, G.C. Metabolism of polysaccharides by the Streptococcus mutans dexB gene product / G.C. Whiting, I.C. Sutcliffe, R.R.B. Russell // J. Gen. Microb. 1993. - Vol. 139. - P. 2019 - 2026.

201. Wiater, A. Hydrolysis of mutan and prevention of its formation in streptococcal films by fungal a-D-glucanases / J. Szczodrak, J. Rogalski // Process Biochem. 2004. - Vol. 39. - P. 1481 - 1489.

202. Wynter, C. Partial purification of a thermostable dextranase using Sephacryl S-300 adsorption /С. Wynter // Lett. Appl. Microbiol. 1997. - Vol. 25. -P. 321 -324.

203. Yamamoto, K. Effective Dextran production from Starch by Dextrin Dextranase with Debranching Enzyme / K. Yamamoto, K. Yoshikawa, S. Okada // J Fermen. Bioeng. 1993. - Vol. 76, № 5. - P. 411-413.

204. Zevenhuizen, L.P.T.M. Cell bound exodextranase of Bacillus species / L.P.T.M. Zevenhuizen // Carbohyd. Res. - 1968. - Vol. 6. - P. 310 - 318.

Информация о работе

Халикова, Эльвира Фагимовна
кандидата биологических наук
Уфа, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Аэробные спорообразующие бактерии - продуценты внеклеточных ферментов, гидролизующих декстран - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы