Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адренергические и NO-зависимые механизмы регуляции кровотока желудка у крыс и их роль в устойчивости к повреждающему воздействию стресса

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Адренергические и NO-зависимые механизмы регуляции кровотока желудка у крыс и их роль в устойчивости к повреждающему воздействию стресса"

На правах рукописи

Семячкин-Глушковский Игорь Александрович

АДРЕНЕРГИЧЕСКИЕ И1ЧО-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КРОВОТОКА ЖЕЛУДКА У КРЫС И ИХ РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К ПОВРЕЖДАЮЩЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ СТРЕССА

03.03.01 — физиология

19 ДЕК 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Астрахань - 2013 005544133

005544133

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Научный руководитель: Анищенко Татьяна Григорьевна, доктор

биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Горст Виктор Рудольфович, доктор

биологических наук, доцент, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России, профессор кафедры нормальной физиологии

Клочков Виктор Александрович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт кардиологии» Минздрава России, заведующий лабораторией артериальной гипертензии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ставропольский

государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита состоится « 27 » декабря 2013 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» по адрес: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1, а с авторефератом на сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru/

Автореферат разослан « 27 » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент

А.Р. Лозовский

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Стресс рассматривается как ведущая причина нарушения работы желудочно-кишечного тракта и развития пептических язв (Spirit, 2000; Duerksen, 2003; Wachirawal, 2003). Во многих клинических и экспериментальных работах показано, что длительные эмоциональные переживания человека сопровождаются нарушением барьерной функции слизистого слоя гастродуоденальной зоны, что провоцирует развитие язв в желудке и двенадцатиперстной кишке (McKeman, 2009; Brzozowska, 2009; Kato, 2010; Zhang, 2012). К примеру, в Японии в г. Ханшин-Авадзи после сильного землетрясения в 1995 году были зарегистрированы массовые случаи язвенных геморрагий (Aoyama, 1998). Однако, несмотря на интенсивные исследования в этой области, до сих пор остается неясным, каким образом стресс оказывает повреждающие эффекты на стенки ЖКТ и его функционирование в целом.

Микроциркуляция слизистой желудка наиболее подвержена воздействию стресса (Spirt, 2003; Duerksen, 2003; Тимербулатова, 2006). За последние 15 лет в научной литературе появилось достаточно много сведений свидетельствующих о диагностической ценности оценки изменений в микроциркуляции слизистой желудка для прогноза течения язвенной болезни (Klarke, 2002, Тимербулатова, 2006; Павлов, 2011; Pavlov, 2011).

Одной из причин нарушения микроциркуляции слизистого слоя желудка при патологическом воздействии стресса может быть развитие артериальной гипертензии в этих условиях. Известно, что хронические стрессы провоцируют устойчивое повышение уровня артериального давления (АД), что в свою очередь отражается на трофики и кровоснабжении всех тканей организма (Matthews, 2002; Ming, 2004; Dimsdale, 2008). Эпидемиологические исследования свидетельствуют о частой встречаемости язвенной болезни у лиц с высоким уровнем АД (Sonnenberg, 1988; Смирнов, 1990).

Адренергическая система играет ключевую роль в регуляции кровотока различных органов, включая ЖКТ (Покровский, 2004; Каменкин, 2004). При этом, процессы как адаптации к воздействию стресса, так и дезадаптации при чрезмерных негативных влияниях реализуются в значительной степени за счет изменений в активности нейрональных и гуморальных звеньев адренергической регуляции гомеостаза (Якушева, 2002; Семенова, 2005; Игошева, 2009; Семячкина-Глушковская, 2010). Следует отметить, что работ посвященных изучению вклада адренергических механизмов в развитие стресс-индуцированных нарушений работы ЖКТ крайне мало, научные публикации в этой области ограничиваются в основном 80-ми годами (Mine, 1983; Ray, 1987), что делает актуальным проведение детальных исследований, направленных на решение указанной проблемы.

Последние два десятилетия ознаменовались чередой важных открытий в области изучения биологической роли оксида азота (NO) в регуляции тонуса сосудов и микроциркуляции различных тканей организма (Lin, 2006; Levy, 2009; Buerk, 2011; Totzeck, 2012). При этом во многих работах показана функциональная взаимосвязь между адренергическими влияниями на кровоток

различных тканей и активацией системы генерации N0 (Wang 1995; Koumi, 1995; Dawes, 1997; Semyachkina-Glushkovskaya, 2010). Данные о роли NO в регуляции микроциркуляции слизистого слоя желудка неоднозначны. В одних, экспериментах указываегем, что N0 улучшает кровоток в желудке и повышает устойчивость к стрессу и развитию гастродуоденальных язв (Brzozowski, 2000, Ma, 2000; Konturek, 2006). В других работах, напротив, описывается, что высокая продукция NO сопровождает развитие геморрагического стресса (Szabo 1999; Hierholzer, 2002; Collins, 2003, Musser, 2004; Semaychina-Glushkovskaya, 2012). Существуют три изоформы фермента, синтезирующего NO - нейрональная «NOS, преимущественно локализованная в центральной нервной системе, эндотелиальная eNOS, расположенная в эндотелии сосудов и индуцибельная /NOS, которую обозначают как макрофагальную NOS, однако, показана ее топография и в клетках различных тканей, включая ЖКТ (Szabo, 1999). Какая из NO-синтаз принимает участие в регуляции микроциркуляции желудка в норме и, особенно, при стрессе, на сегодняшний день не существует точных данных.

Нерешенность проблемы относительно вопроса о том, как изменяются механизмы регуляции кровотока желудка при повреждающем воздействии стресса, определили цель и задачи наших исследований.

Цель исследования - изучить адренергические и NO-зависимые механизмы регуляции кровотока желудка у крыс и их роль в устойчивости к повреждающему воздействию стресса.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние слизистой желудка и изменения в уровне артериального давления в условиях длительного воздействия социального стресса;

2. Исследовать состояние стенок желудка при сочетанном воздействии хронического и кратковременного острого стрессов;

3. Оценить роль адренергических механизмов вазорелаксации и вазоконстрикции в регуляции микроциркуляции слизистого слоя желудка у крыс при воздействии тяжелого стресса с применением фармакологической модуляции функции неиннервируемых р2-, постсинаптичексих ai-, пресинаптических аг-адренорецепторов и процесса выброса нейромедиатора в синаптическую щель в в адренергических нейронах;

4. Изучить роль оксида азота в регуляции кровотока желудка и его устойчивости к повреждающему действию стресса на основе определения содержания оксида азота в крови и тканях желудка, анализе эффектов блокады eNOS и /NOS на микроциркуляцию слизистого слоя желудка и иммугистохимической идентификации /NOS в тканях органа, а также исследования модулирующих эффектов глюкокортикоидов по отношению к активности системы генерации оксида азота.

Научная новизна. Впервые в опытах на крысах с применением разработанной оригинальной модели социального стресса было показано, что длительное проживание крыс в условиях повышенной популяционной плотности сопровождается нарушениями системного кровотока, что приводит к

устойчивому повышению уровня артериального давления. На фоне стресс-индуцированной артериальной гипертензии развивается нарушение микроциркуляции желудка, что лежит в основе снижения устойчивости к воздействию дополнительных кратковременных егрессов и появлению язв в желудке, а также кровотечения их них при сочетании хронического и острого стрессов. Впервые были выявлены адренергические механизмы регуляции микроциркуляции желудка в норме и при стрессе. Было показано, что сосудистые эффекты адреналина проявляются по-разному в зависимости от исходного состояния организма. В норме адреналин оказывает вазоконстрикторные эффекты, подавляя микроциркуляцшо желудка. В условиях тяжелого стресса, приводящего к развитию язв в данном органе, преобладают вазодилатирующие эффекты адреналина на фоне сохранения активности механизмов его прессорных влияний. Впервые было установлено, что проявление вазодилатирующих эффектов адреналина на сосуды желудка при тяжелом стрессе обусловлены повышением в этих условиях чувствительности р2-адренорецепторов и активности факторов р2-адренозависимой вазорелаксации - N0 и Кдтф-каналов. Впервые были изучены NO-зависимые механизмы регуляции микроциркуляции желудка в условиях нормы и при снижении адаптивных и резервных возможностей организма. В норме NO-зависимые влияния на кровоток желудка реализуется за счет активности eNOS. При тяжелом стрессе, вызывающим язвенные кровотечения, существенно повышается активность /NOS, что сопровождается резким повышением продукции N0 и снижением чувствительности сосудов желудка к вазоконстрикторам. Впервые была выявлена роль глюкокортикоидов в регуляции активности системы генерации N0 на уровне желудка. В опытах с введением преднизолона были обнаружены их стимулирующие эффекты по отношению к продукции N0. В этих экспериментах было доказано, что чрезмерное повышение активности системы генерации N0 глюкокортикоидами лежит в основе проявления их токсического воздействия на организм при длительном воздействии и является одной из причин их ульцерогенных эффектов.

Теоретическая значимость. Результаты исследования, представленные в диссертационной работе, существенно расширяют научные представления о том, как влияют длительные повседневные хронические стрессы на устойчивость к формированию язв желудка и кровотечения из них, а также раскрывают адренергические и NO-зависимые механизмы, лежащие в основе нарушения системного кровотока и микроциркуляции желудка в этих условиях. На модели стресс-индуцированных язвенных геморрагий у крыс было вьивлено, что у здоровых особей адреналин вызывает сужение, а у животных с язвенным кровотечением - расширение сосудов слизистого слоя желудка. Нами было показано, что атипичные эффекты адреналина при стресс-ипдуцированных язвенных геморрагиях связаны с преобладанием его Рг-адренозависимых механизмов вазорелаксации над прессорными эффектами.

Практическая значимость. Адреналин входит в состав препаратов, используемых с целью купирования язвенного кровотечения при гастроскопии. Результаты, указывающие на его дилатирующие эффекты при указанном состоянии, имеют важное практическое значение. Содержание N0 в тканях желудка и крови существенно увеличивается при развитии язвенного кровотечения, что связано с активацией /NOS, отражающей течение воспалительных процессов. Мониторинг содержания N0 в тканях желудка и крови может иметь важное прогностическое значение, указывающее на риск рецидива язвенного кровотечения. Разработанная экспериментальная модель стресс-индуцированного язвообразования и развития язвенного кровотечения расширяет исследовательские возможности, позволяя изучать все этапы формирования указанных состояний и может быть использована для дальнейших более детальных исследований механизмов ульцерогенеза и роли стресса в этих процессах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях хронического стресса устойчивое повышение артериального давления сопровождается нарушениями микроциркуляции желудка, что лежит в основе снижения устойчивости к повреждающему воздействию стресса и приводит к язвообразованию.

2. В основе нарушения микроциркуляции желудка при повреждающем воздействии стресса лежит повышение активности адренергических механизмов вазорелаксации и продукции оксида азота за счет активации /NOS на фоне снижения чувствительности сосудов микроциркуляторного русла органа к вазоконстрикторам;

3. Стимулирующие эффекты глюкокортикоидов в отношении активности системы генерации оксида азота являются одним из механизмов повреждающего воздействия стресса на желудок у крыс.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных европейских конгрессах по гастроэнтерологии (Стокгольм, Швеция, 2011; Амстердам, Нидерланды, 2012); на 3-й международной конференции по защите здоровья (Сингапур, 2012); на международной школе по гастроэнтерологии (Сегед, Венгрия, 2012); на международной конференции по фотонике (Саратов, Россия, 2012); на международной конференции „Молодежь в медицине будущего" (Одесса, Украина, 2012, 2013); на II международной конференции „Свободные радикалы, антиоксиданты и старение" (Астрахань, Россия, 2011); на 6-й международной конференции по фотонике и оптической электронике (Вухан, Китай, 2013). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на открытом заседании кафедры физиологии человека и животных федерального образовательного учреждения высшего профессионального образования „Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского".

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе рекомендованных ВАК РФ - 10, 1 монография, 3 патента РФ на изобретения.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов. Общий объём диссертации 129 страниц с 23 рисунками и 9 таблицами. Список цитированной литературы включает 249 источников, в том числе 38 отечественных и 211 иностранных.

Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично, либо при его непосредственном участии в следующие коллективных работах. Гранты ФЦП: государственный контракт № 11.519.11.2035, программа „Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20077013 годы" (мероприятие 1.9-1 очередь); государственный контракт 1ЧК-1063Р, программа „Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы" мероприятие 1.2 „Проведение научных исследований научными группами под руководством кандидатов наук", направление 1 „Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий"; соглашения 14.В37.21.0216 и 14.В37.21.0853, программа „Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2012-2013 годы", мероприятие 1.2.1., естественные науки, очередь XXXIX и мероприятие 1.5, естественные науки, очередь XIX; грант РФФИ а-11-02-00560. В совместных публикациях вклад автора составил 50-70%.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Материал и методы исследований

Исследования выполнены на 286 самцах белых беспородных крыс. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

2.1.1. Способ экспериментального моделирования стресс-индуцированного язвообразования и развития язвенного кровотечения (Патент РФ 2472231).

Сущность предлагаемого способа экспериментального моделирования стресс-индуцированного развития острого язвенного кровотечения заключается в том, что на протяжении длительного срока - 5 месяцев животное последовательно подвергали воздействию двух разных по силе и продолжительности стрессов. На первом этапе эксперимента здоровых крыс на 4 месяца помещали в условия высокой популяционной плотности. Для соблюдения правил содержания животных небольшими группами (Лабораторные животные. 1993, № 2.) крысы должны проживать в клетке в следующем соотношении (см2/г массы тела=1). В данной модели использовали проживание животных, когда указанное соотношение было (см2/г массы тела=0,3). На протяжении 4 месяцев у части животных проводились контрольное изучение состояния слизистой желудка. Для этого часть животных умерщвляли декапитацией, желудки извлекали, вскрывали по малой кривизне, промывали холодным физиологическим раствором и далее проводили гистологическое исследование. Срезы толщиной в 5 мкм

окрашивали гематоксилин-эозином. По истечении 4 месяцев животных подвергали в течении 1 месяца дополнительному острому иммобилизационному стрессу в течении 4 часов. Наличие язвенного кровотечения оценивали цо положительной реакции на амидоиириновую пробу 2.1.2. Регистрация артериального давления у крыс Регистрацию артериального давления у бодрствующих крыс осуществляли с помощью системы, включающей приборную базу для прямой регистрации кровяного давления у мелких животных оснащенную датчиками (PowerLab/400 ML 401, Ш Instruments, 2002, Австралия) с программно обеспечением Chart 4 (MLT0699, PowerLab, ID Instruments). Предварительно за сутки до начала регистрации животным в аорту вживлялся полиэтиленовый катетер через левую ветвь сонной артерии под общей тиопенталовой анестезией (0,40 мг/кг). В экспериментах использовались полиэтиленовые катетеры производства ClayAdams, Parsippany, NewYersey, маркированные как ВВ31695-РЕ/1 (наружный диаметр - 0,61 мм, внутренний диаметр - 0,28 мм).

2.13. Определение перфузии и скорости кровотока в слизистом слое желудка

При определении перфузии (показателя микроциркуляции, ПМ) использовали метод лазерной допплеровской флоуметрии микроциркуляции крови (Крупаткина В.В., 2005) с помощью специального многофункционального лазерного диагностического комплекса "JIJIAK-M" (Научно-производственное предприятие "Лазма", Россия, 2009). Измерения скорости кровотока и диаметра сосудов производили с помощью оптической когерентной томографии на установке OCS1300SS (США). Исследования проводили на наркотизированных животных (тиопентал натрия, Sigma, 40 мг/кг, ip). Желудок вынимали и вскрывали по малой кривизне, фиксировали на специальной пластинке, подогреваемую до температуры тела, промывали физиологическим раствором, дожидались стабилизации кровотока в течение 30 мин и делали запись.

2.1.4. Модуляция активности адренорецепторов и системы продукции NO Для модуляции активности адренорецепторов и NO-ергической системы применялись следующие препараты, которые вводили с помощью специальной иглы в подслизистый слой желудка:

Изопротеренол (Sigma, 0,05 мкг/кг) - для стимуляции р2-адренорецепторов.

ICI 118551 (3-(isopropylamino)-l-[(7-methyl-4-indanyl)oxy]butan-2-ol, Sigma, 0,05 мкг/кг) - для блокады р2-адренорецепторов

Йохимбин (Solvay Pharma, Германия, 0,15 мг/кг) - для блокады аг-пресинаптических адренорецепторов.

Фенилэфрин (Харьков, Украина, 2,5 мкг/кг) - для стимуляции ai-адренорецепторов;

Тирамин (Лонгви Фарм, Россия 10 мг/кг) - для стимуляции выброса нейромедиатора из синапгических везикул в адренергических нейронах;

L-NIO (LN(5)-(liminoethyl)omitiiine, Sigma, L-NIO, 20 мг/кг) - для блокады активности eNOS;

L-NIL (N6-(iminoethyl)-L-lysine, Sigma, L-NIL, 20 мг/кг) - для блокады активности/NOS.

Преднизалон (Новосибхимфарм, Россия, 15 мг/кг, per os) вводили : .'для оценки влияния глюкокоршкоидов на активность системы хенерации N0 и устойчивость к развитию язвенных геморрагий

2.1.5. Амидопириновая проба

Для определения скрытой крови в испражнениях животных с язвами и язвенными геморрагиями, как следствие гастродуоденальнных кровотечений, использовали амидопириновую пробу. При этом тонкий мазок кала распределяли на предметном стекле и обрабатывали реактивом. При появлении синего окрашивания реактива пробу считали положительной.

2.1.6. Определение содержания оксида азота в плазме крови и тканях желудка

Определение содержания NO в плазме крови и тканях желудка крыс проводили по наличию его ближайшего устойчивого метаболита - нитрита модифицированным методом (Карпюк, 2000). В данном методе использовали гомогенизацию для тканей желудка и двойное центрифугирование для осветления плазмы и сывороток после осаждения белка. Окрашивание производили с применением реактива Грисса-Илосвая. Интенсивность окраски определяли на спектрофотометре (СФ-46 Био, Санкт-Петербург, Россия, 2002) при установленной длине волны 538 нм. Расчет концентрации нитритов в исследуемой пробе производили по формуле:

С= d„-dx drdx

где: d„ - показатель экстинкции в исследуемой пробе; dx - показатель экстинкции в холостой пробе; с!ф - показатель экстинкции фиксанала.

2.1.7. Определение уровня кортизола в плазме крови

Определение уровня кортизола в плазме крови крыс проводили с помощью кортизол-теста (Cortisol, HUMAN GmbH) основанным на конкурентном иммуноферментном методе. Интенсивность окраски измеряли фотометрически. Расчет концентрации кортизола проводили регрессивно - обратно пропорционально концентрации кортизола в пробе.

2.1.8. Иммуно-гистохимическая идентификация индуцибельной нитрооксидсинтазы

Идентификацию /NOS в тканях желудка проводили с использованием пероксидазного иммуногистохимического метода на основе применения специфических поликлональных кроличьих антител к /NOS с последующим контрастированием гематоксилином.

Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью современного пакета анализа Statistica 10 (StatSoft, Inc., Талса, -США). Различия считались достоверными при критерии р<0,05. Данные представлены как среднее±стандартная ошибка средней.

2^.Результаты собственных исследований и их обсуждение.

22.1. Изучение влияния хронического стресса на уровень артериального давления и состояние тканей желудка.

Целью данных исследований явился поиск ответа на вопрос, как влияет хронический психоэмоциональный стресс на состояние тканей желудка на фоне устойчивого повышения уровня АД? Для решения данного вопроса здоровые крысы (п=43) были помещены в условия высокой популяционной плотности на срок 4 месяцев. На протяжении всего срока наблюдения в конце каждого месяца у части животных проводились морфологические, гистологические и биохимические исследования на предмет наличия язв в желудке, а также регистрировался уровень АД. Таким образом, исследования проводились на 4 группах животных: 1 группа (п-12) включала в себя крыс, у которых анализировали состояние тканей желудка через 1 месяц после начала стрессирования; 2 группа (п=10) - через 2 месяца; 3 группа (п=10) через 3 месяца; 4 группа (п=11) - через 4 месяца проведения эксперимента.

Результаты исследования показали, что у всех крыс в конце первого месяца проживания в условиях перенаселения не отмечалось существенных изменений в слизистой желудка, а также в массе тела и органов (табл. 1).

Таблица 1

Оценка степеии стрессированности животных_

Орган Период стрессирования животных

Контроль п=10 1 месяц п=12 2 месяца п=10 3 месяца п=10 4 месяца п=11 5 месяцев и п=12

Надпочечники, мг 37±2 39±3 45±4 50±3 * 53±3 * 57±5 *

Тимус, мг 139±б 133±9 119±7 * 115±5* 111±7 * 109±11*

Селезенка, мг 382±7 377±11 375±8 365±9 361±7* 353±12*

Язвы, шт 0 0 5 17 37 85

Масса тела, г 268±3 263±5 257±3 242±2 * 233±4 * 218±5*

*- р<0,05 относительно контроля

Уровень АД также был в пределах нормы (табл. 2). К концу второго месяца у 3 крыс из 10 отмечалось развитие мелких точечных язв, общее число которых составило 5. При этом наблюдалось снижете массы тимуса и тенденция к изменению массы тела, надпочечников и селезенки. Повышенный уровень АД наблюдался как у 3 крыс с язвами в желудке, так и у 1 одной крысы без каких-либо изменений в слизистом слое органа. На третьем месяце исследования у 4 крыс из 10 были выявлены язвы в количестве 17, из которых 13 - точечные и 4 крупные. У всех животных отмечалось снижение массы тела и тимуса, а также увеличение массы надпочечников. Масса селезенки уменьшалась, но данные изменения были статистически незначимыми. Повышенный уровень АД отмечался у 4-х крыс с язвами и у 2 крыс без язв в желудке. На четвертом месяце стрессирования крыс отмечалось существенное повышение числа животных с язвами - 7 из 11. При этом увеличивалось число язв, которое достигало 37, из которых 24 - точечные язвы и 13 - крупных. У всех животных наблюдалось уменьшение массы тела, тимуса, селезенки и увеличение массы надпочечников. Высокий уровень АД регистрировался у

7 крыс с язвами и у 3 животных без язв в желудке. Таким образом, наиболее яркие результаты по стресс-индуцированному язвообразованию, отраженных в числе животных с язвами, количеству язв в желудке, изменению массы тела, органов и АД были получены на 4-ом мссяцс стрсссирования.

На протяжении всех четырех месяцев у животных проводили пирамидоновую пробу на наличие крови в кале. Во всех исследуемых группах не было обнаружено положительной реакции, что свидетельствует об отсутствии кровотечения из язв.

На следующем этапе наших исследований изучалось, как изменяется устойчивость к дополнительному кратковременному стрессу у хронически стрессированных крыс?

С этой целью 12 крыс, проживающих на протяжении 4 месяцев в условиях высокой популяционной плотности и имеющих хронические язвы, подвергали 4-х часовой иммобилизации в течение 1 месяца. Таким образом, весь период стрессирования в этой группе животных составил 5 месяцев. На протяжении месяца в разные сроки исследования, преимущественно к 3 неделе эксперимента, у всех животных, пребывающих на дневной диете, исключающей животные белки и мясо, была положительная реакция на наличия крови в испражнениях (оценивали по пирамидиновой пробе).

Таблица 2

Индивидуальные значения среднего артериального давления (мм рт.ст.) у крыс на протяжении 5 месяцев стрессирования

Период исследования

Контроль (п=10) I месяц II месяц III месяц IV месяц V месяц

(п=12) (п=10) (п=10) (п= = П) (п= 12)

98 101 ■Н1 Р®

94 99 Щнж рЗй?

95 105 ия ниш

97 96 124 ВЕН

100 109 104 124 и ВЁ

101 99 102 131

98 106 106 106

106 102 98 109 155

103 93 96 102 142 ■ЕБЯ

97 89 98 102 138

101 109

104

Фиолетовым цветом отмечены крысы с высоким уровнем АД и язвами в желудке, красным цветом - крысы с высоким АД без язв в желудке

По данным морфологического исследования было выявлено, что у хронически стрессированных крыс под воздействием дополнительного стресса общее число язв увеличивалось и достигало 85, из которых 55 - точечные и 30 - крупные.

Развитие язвенного кровотечения сопровождалось резким ухудшением состояния животных, которое выражалось в снижении их двигательной активности, аппетита, массы тела, тимуса, селезенки и увеличения массы

11

надпочечников (табл. 1). Высокий уровень АД регистрировался у всех испытуемых крыс. При этом значения АД были выше, чем те, которые наблюдались в предыдущие сроки эксперимента (табл. 2).

В целом, результаты исследования показали, что хронический социальный стресс сопровождался постепенным увеличением числа животных с наличием язв, а также повышением числа крупных изъязвлений. Хроническое стрессирование крыс инициировало также развитие артериальной гипертензии, которая отмечалась у всех крыс с язвами желудка. Дополнительный ежедневный острый стресс провоцировал развитие кровотечения из хронических язв у всех больных животных на фоне прогрессирования артериальной гипертензии.

2.2.2. Изучение эффектов адренергических влияний на микроциркуляцию слизистой желудка в норме и при тяжелом стрессе.

2Л.2.1. Эффекты адреналина на микроциркуляцию слизистой желудка в норме и при тяжелом стрессе

В данной серии экспериментов изучали эффекты адреналина (Sigma, 0,1 мг/кг) на микроциркуляцию слизистой оболочки желудка у интактных крыс (п=12) и крыс (п=15) после тяжелого стресса, приводящего к развитию язвенного кровотечения (глава 2.2.1), а также на диаметр левой желудочной артерии и венечной желудочной вены. Результаты исследования показали, что адреналин подавлял микрогемодинамику слизистого слоя всех отделов желудка у интактных крыс. Так, показатель микроциркуляции после введения адреналина снижался (средние суммарные значения, 12,6±1,6 против 21,5±1,4 р<0,05). Отметим, что данный параметр микроциркуляции в разных отделах желудка существенно не различалась как до, так и после введение препарата. Скорость кровотока в сосудах слизистой оболочки желудка существенно увеличивалась под воздействием адреналина в равной мере в различных отделах органа. Диаметр левой желудочной артерии и венечной желудочной вены уменьшался сразу после инъекции адреналина. Однако, чувствительность к данному препарату у артериального сосуда была выше по сравнению с веной. Так, под воздействием адреналина диаметр артерии уменьшался в 2,2 раза, в то время как диаметр вены - в 1,3 раза (0,12±0,08 мм против 0,27±0,05, мм р<0,05 для артерии; 0,25±0,04 мм против 0,33±0,07 мм, р<0,05 для вены). Инъекции физиологического раствора не оказывали существенных изменений.

У стрессированных крыс эффекты адреналина на микрогемодинамику слизистого слоя желудка были инвертированными (табл. 3). Действительно, в отличие от интактных животных, у стрессированных особей под воздействием адреналина показатель микроциркуляции увеличивался, скорость кровотока снижалась. Отметим, что базальные значения указанных показателей существенно не различались между двумя группами животных. Введение физиологического раствора стрессированным крысам в околоязвенную зону не сопровождалось каким-либо сдвигами в гемодинамических показателях микроциркуляции слизистой оболочки.

Таблица 3

Средние суммарные значения показателя микроциркуляции и скорости'

кровотока в слизистой оболочке желудка у ннтактных и стрессированных крыс

Показатель микроциркуляции, усл.ед. Скорость кровотока, Мм/сек

Базальные значения

В норме 21,5±1,4 5,9±0,7

После тяжелого стресса 22,4±1,9 6,2±0,3

Введения адреналина

В норме 12,6±1,6 * 7,610,6 ♦

После тяжелого стресса 28,4±1,8 3,5±0,5*+

р<0,05: * - относительно базальных значений; ^ - между группами

Реактивность левой желудочной артерии и венечной желудочной вены к адреналину у стрессированных крыс изменялась по сравнению с контролем. Так, введение адреналина стрессированным крысам сопровождалось дилатацией левой желудочной артерии, о чем свидетельствовало увеличение диаметра артериального сосуда (0,39±0,04 мм против 0,2б±0,05 мм, р<0,05). Диаметр венозного сосуда у стрессированных крыс был шире, чем у интактных особей (0,48±0,03 мм против 0,33±0,07 мм, р<0,05). На фоне релаксации венечной желудочной вены чувствительность данного сосуда к адреналину была подавлена. Действительно, диаметр желудочной вены существенно не изменялся до и после введения препарата (0,48±0,03 мм и 0,45±0,08 мм, соответственно).

В целом, результаты исследований показали, что эффекты адреналина на микрогемодинамику слизистой желудка и тонус желудочных сосудов (на примере левой желудочной артерии и левой венечной вены) зависели от состояния организма. В норме, адреналин оказывал вазоконстрикторные эффекты на желудочные сосуды, что сопровождалось повышением скорости кровотока в микроциркуляторном русле и снижением тканевой перфузии. В условиях тяжелого стресса, приводящего к развитию язвенного кровотечения, влияние адреналина на кровоток желудка существенно изменялось. Вместо вазоконстрикторных эффектов, адреналин расширял левую желудочную артерию, что сопровождалась снижением скорости кровотока и повышением показателя микроциркуляции. Эти данные свидетельствукэт о преобладании вазорелаксирующих эффектов адреналина в отношении сосудов желудка при тяжелом стрессе.

22.22. Влияние фармакологической модуляции активности Рг-адренорецепторов на перфузию слизистого слоя желудка у здоровых особей и у крыс после тяжелого стресса

Поскольку вазодилатирующие эффекты адреналина связаны с активацией Рг-Дренорецепторов на следующем этапе исследований изучали влияние фармакологической стимуляции и блокады данной популяции адренорецепторов на микроциркуляцию слизистого слоя желудка в норме и при тяжелом стрессе, приводящего к развитию язвенного кровотечения (глава 2.2.1).

Для стимуляции Р2-адренорецепторов использовали изопротеренол (Sigma, 0,05 мкг/кг), для блокады - ICI 118551 (Sigma, 0,05 мкг/кг), для контрольного сравнения - физиологический раствор. Исследования проводили на следующих ipyimax животных: опыты с изоаротеренолом (10 интакшых и 11 стрессированных крыс), эксперименты с ICI 118551 (10 интактных и 14 стрессированных крыс).

Результаты исследований показали, что введение изопротеренола, стимулирующего рг-адренорецепторы, сопровождалось повышением значений показателя микроциркуляции в слизистой желудка, а инъекция ICI 118551, блокирующего указанные рецепторы - снижением данного показателя у всех испытуемых крыс (табл. 4).

Изменения перфузии слизистой желудка в условиях фармакологической модуляции активности Рг-адренорецепторов были более выраженными у стрессированных крыс по сравнению со здоровыми особями. Действительно, степень снижения перфузии исследуемой зоны под влиянием ICI 118551 была в 2,5 раза (р<0,05) выше у стрессированных крыс по сравнению со интактными животными. Аналогично в опытах с изопротеренолом — перфузия возрастала в 2,0 раза (р<0,05) более значительно у стрессированных крыс, чем у интактными особей.

Таблица 4

Изменения показателя микроциркуляции (усл.ед.) слизистого слоя желудка при

введении изопротеренола и ICI 118551 у интактных и стрессированных крыс

Норма Стресс

Базальные значения 22,1±1,7 21,8±1,3

Физиологический раствор 22,3±1,5 22,0±1,8

Изопротеренол 28,2±1,б * 36,3±1,4 *+

ICI 118551 17,0±1,3 * 11,3±1,4 *f

р<0,05: * - относительно базальных значений; t - между группами

Таким образом, ло результатам исследований влияния агониста и антагониста р2-адренорецепторов на микроциркуляцию слизистого слоя желудка было выявлено, что чувствительность к фармакологической модуляции активности указанных рецепторов по показаниям перфузии была существенно выше у стрессированных крыс по сравнению с интактными особями. Эти данные указывают на тот факт, что тяжелый стресс сочетается с высокой активностью р2-адренорецепторов в желудке.

22.23. Исследование изменений прессорных эффектов адренергических влияний на микроциркуляцию слизистой желудка под влиянием тяжелого стресса

В данной серии экспериментов изучали эффекты следующих препаратов, оказывающих вазопрессорные влияния, на показатель микроциркуляции слизистого слоя желудка в норме и при тяжелом стрессе (глава 2.2.1): введение фенилэфрина (Sigma, 0,1 мг/кг) - агониста ai-адренорецепторов; тирамина (Sigma, 10 мг/кг) — вызывающего увеличение выброса норадреналина в адренергических нейронах; йохимбина (Sigma, 50 мг/кг) — блокатора

пресинаптических а2-адренорецепторов, осуществляющих механизм отрицательной обратной связи. Физиологический раствор вводили в качестве контроля. Эксперименты были поставлены на следующих группах животных: фенилэфрин (10 интакшые и 10 стрессированные крысы), тирамин (8 здоровых и 10 больных крыс) и йохимбин (10 интактные и 10 стрессированные крысы).

Результаты исследовагай показали, что инъекции фенилэфрина, тирамина и йохимбина сопровождались снижением показателя микроциркуляции слизистого слоя желудка у всех крыс (табл. 5). При этом, нами не были обнаружены какие-либо различия в изменениях потока крови слизистой желудка между интактными и стрессированными крысами. Так, амплитуда снижения показателя микроциркуляции была примерно одинаковой у интактных и стрессированных крыс при введении указанных препаратов.

Таблица 5

Изменения показателя микроциркуляции (усл.ед.) слизистого слоя желудка при _введении препаратов у интактных и стрессированных крыс_

Норма Стресс

Базальные значения 21,2±1,2 22,0±1,5

Физиологический раствор 20,8±1,1 21,5±1,3

Фенилэфрин 12,5±1,4 * 11,3±1,2 *

Йохимбин 11,1±1,2* 12,0±1,7 *

Тирамин 10,9±1,6 * 11,2±1,8*

р<0,05: * - относительно базальных значений; t - между группами

Таким образом, результаты данной серии экспериментов свидетельствуют о том, что в условиях тяжелого стресса не изменяется активность адренергических прессорных механизмов регуляции кровотока желудка.

2.2.3. Изучение активности системы генерации оксида азота в норме и в условиях тяжелого стресса

2.23.1. Содержание оксида азота в слизистом слое желудка и в крови при действии тяжелого стресса. Влияние блокады КлтФ-каналов на показатель микроциркуляции в слизистой желудка в этих условиях.

В главе 2.2.2. было показано, что тяжелый стресс сопровождается повышением чувствительности р2-адренорецепторов к их стимуляции. В наших предыдущих исследованиях (Семячкина-Глушковская, 2010; Semyachkina-Glushkovskaya, 2010), а также в ряде других работ (Gardiner, 1991; Wang 1995; Koumi, 1995; Dawes, 1997) выявлено, что механизмы |Згадренозависимой вазорелаксации реализуются за счет активации продукции NO и функции Кдтф-каналов. На основании данных факторов, мы исследовали как влияет тяжелый стресс на активность указанных двух факторов. Продукцию NO в крови и биоптате, полученного из слизистого слоя желудка изучали спекгрофотометрически с применением реактива Грисса. Эксперимент был выполнен на 27 стрессированных крысах и 15 интактных особей. Для изучения функции КдтФ-каналов в сосудах желудка изучали эффекты глибенкламида (Sigma, 10 мг/кг) - специфического блокатора данного типа каналов на микроциркуляцию слизистой органа.

Результаты исследования показали, что продукция N0 возрастала при тяжелом стрессе. Действительно, содержание N0 было значительно выше у стрессированных крыс по сравнению с интактными особями как в крови (0,62±0,05 мкг/кг против 0,27±0,03 мкг/кг, р<0,05), так и в слизистом слое желудка (0,59±0,02 мкг/кг против 0,30±0,04 мкг/кг, р<0,05).

Введение глибенкламида сопровождалось подавлением микроциркуляции слизистой желудка у всех испытуемых крыс (16,7±1,5 против 21,2+1,4, р<0,05 у здоровых крыс; 12,3±1,3 против 20,7±1,5, р<0,05 у больных крыс). При этом, степень снижение показателя микроциркуляции у стрессированных крыс была в 1,3 раза выше, чем у интактных особей.

В целом, результаты исследований выявили высокое содержание N0 в крови и в слизистой оболочке желудка, а также повышенную чувствительность КлтФ-каналов к их фармакологической блокаде у крыс при тяжелом стрессе по сравнению с покоем.

23.32. Эффекты блокады эндотелиальной и индуцибельной NO-синтаз на микроциркуляцию слизистого слоя желудка у крыс в покое и при тяжелом стрессе

С целью ответа на вопрос, какая из NO-синтаз вносит свой вклад в в регуляции микроциркуляторного русла слизистой желудка в норме и при тяжелом стрессе, нами были проведены эксперименты по изучению эффектов специфических блокаторов eNOS и ¿NOS на показатель микроциркуляции желудка у интактных и стрессированных крыс. Для блокады eNOS использовали LN(5)-(liminoethyl)ornithine, (Sigma, L-NIO, 20 мг/кг); для блокады /NOS - N6-(iminoethyl)-L-lysine, (Sigma, L-NIL, 20 мг/кг).

Результаты исследования показали, что введение блокатора eNOS сопровождалось подавлением микроциркуляции слизистого слоя желудка как у интактных, так и у стрессированных крыс (табл. 6). Снижение показателя микроциркуляции слизистой желудка было примерно одинаковым между двумя исследуемыми группами.

Блокада /NOS вызывала изменения в микроциркуляции слизистой желудка у стрессированных крыс, но не у интактных особей (табл. 6). Действительно, если у стрессированных крыс показатель микроциркуляции снижался в 2,1 раза (р<0,05), то в норме он практически не изменялся. В силу этой причины, наблюдалась значительная разница в амплитуде снижения показателя микроциркуляции между двумя группами животных.

Таблица 6

Изменения показателя микроциркуляции (усл.ед.) слизистого слоя желудка при _блокаде eNOS и ¿NOS у интактных н стрессированных крыс_

Здоровые крысы Крысы с язвенными геморрагиями

Базальные значения 22,0±1,7 21,5±1,8

Физиологический раствор 21,6±1,3 21,0±1,2

L-NI0 16,2±1,5 * 17,0±1,6*

L-NIL 19,7±1,3 10,3±1,4 *t

р<0,05: * - относительно базальных значений; f - между группами

Таким образом, у интактных крыс блокада /NOS не оказывала каких-либо эффектов на микроциркуляцию слизистого слоя желудка, свидетельствуя о том, что в норме /NOS не оказывает влияний на кровоток органа. Однако, у стрессированных крыс /NOS стимулировала существенное подавление микроциркуляции слизистого слоя желудка, что дает основание полагать о ее высокой активности при развитии тяжелого стресса и его последствий -язвенного кровотечения.

2.2.33. Идентификация индуцибельной NO-синтазы в тканях желудка в норме и при тяжелом стрессе у крыс

С целью идентификации /NOS в тканях желудка был использован иммуногистохимический метод на основе применения специфических антител к /NOS. Результаты исследований показали, что у /NOS идентифицировалась только у хронически стрессированных крыс с язвами в желудке, но не у интактных животных, что можно видеть на фотографиях гистологических срезов ткани желудка в виде зернистого зеленого окрашивания (рис. 1).

Рисунок 1 - Иммуногистохимическое определение активности /'NOS в тканях желудка интактных (А) и стрессированных крыс (Б). Наличие /'NOS показано точечной маркировкой бурым цветом (увеличение х200)

Отметим, что в других работах /NOS также выявлялась только в тканях желудка у крыс с язвами, но не у здоровых животных (Ma, 2000). Таким образом, в нашей работе показано, что развитие тяжелого стресса у крыс сопровождается повышением активности /'NOS в тканях данного органа, что объясняет наличие в нем высоких концентраций N0 и отражает течение воспалительных процессов.

В целом, в трех сериях экспериментов показано, что тяжелый стресс, приводящий к развитию язв в желудке, сопровождается повышением активности системы генерации N0 за счет /'NOS. При хроническом воздействии стресса одним из факторов, лежащих в основе гиперстимуляции синтеза N0, могут быть токсические эффекты глюкокортикоидов. Для проверки данной гипотезы в следующей серии экспериментов изучалась роль глюкокортикоидов в регуляции продукции N0 при развитии тяжелого стресса.

17

2-2.3.4.Влияние длительного введения преднизолона на состояние тканей желудка, а также продукцию оксида азота в крови и тканях органа

Задачей данных исследований явился поиск ответов на следующие вопросы. 1. Как изменяегся уровень коргизола у крыс при хроническом тяжелом стрессе (глава 2.2.1); 2. Как влияет долговременное (в течение 1 месяца) введение преднизолона на состояние тканей желудка и содержание N0 в крови и тканях органа.

Уровень кортизола в крови у крыс определяли иммуноферментным методов. Результаты исследований показали, что содержание в крови кортизола у хронически стрессированных крыс (п=10) был существенно выше по сравнению с интаткными особями (11=10) - 1031±15 нмоль/Л против 311 ±18 нмоль/Л, р<0,05.

На следующем этапе экспериментов здоровьм крысам (п=39) вводили преднизолон в дозе 25 мг/кг на протяжении 1 месяца. В качестве контроля по истечении каждой недели часть крыс (п=8) умерщвляли и наблюдали за состоянием органов по их массе, проводили морфологические исследования на наличие язв в желудке, применяли амидопириновая пробу на тестирования наличия крови в кале и выполняли биохимический анализ на содержание N0 в крови и тканях органа.

Через неделю после введения преднизолона наблюдали существенное ухудшение состояния всех животных. Масса тела, тимуса, селезенки уменьшалась, надпочечники увеличивались (табл. 7). В желудке появлялись язвы в количестве 8, две из которых были крупными и 6 точечные. Результаты амидопириновая пробы были отрицательными. Уровень N0 как в крови, так и в тканях желудка существенно увеличивался (табл. 7). Так, в крови содержание N0 повышалось в 1,5 раза (р<0,05), в тканях желудка - в 2,0 раза (р<0,05). Данные факты свидетельствуют о развитии стрессорной реакции в организме животных под воздействием преднизолона.

В последующие сроки наблюдения на протяжении 3 недель у всех животных отмечалось постепенное ухудшение состояния, что выражалось в дальнейшем снижении массы тела, тимуса, селезенки и увеличении массы

Таблица 7

Влияние длительного введения преднизолона на массу тела, _органов и продукцию оксида азота у крыс_

Период исследования

Контроль I неделя II неделя III неделя IV неделя

п=10 п=8 п=8 п=8 п=15

Надпочечники, мг 26±3 35±7 * 48±3 * 54±5 * 62±7 *

Тимус, мг 128±4 92±5 * 74±8 * 23±5 * 5±7 *

Селезенка, мг 541±8 473±9* 403±10* 338±12* 224±11*

Язвы, шт 0 8 15 22 41

N0, мкг/мл в крови 0,28±0,05 0,42±0,06 * 0,58±0,05 * 0,63±0,04 * 1,2±0,07 8

N0, мкг/мл в тканях желудка 0,33±0,03 0,67±0,08 * 0,72±0,07 * 0,79±0,04 * 1,9±0,09 *

Масса тела, г 262±6 231±4* 212±7 * 192±9 * 175±5 *

* - р<0.05 относительно контроля

надпочечников (табл. 7). Количество язв в желудке также увеличивалось: через 2 недели - 15, 4 из которых крупные и 11 точечные; через 3 недели - 22, 10 из которых крупные и 12 точечные. Содержание N0 в крови и тканях желудка увеличивалось последовательно в соответствии с периодом исследования. Данные результаты отражают снижение резервных возможностей животных под хроническим влиянием больших доз преднизолона. Однако, ни у одного животного по данным амидопириновой пробы не было выявлено язвенных геморрагий. Наиболее яркие результаты были получены спустя 1 месяц эксперимента (табл. 7). Масса тела и исследуемых органов максимально изменялись: масса тела снижалась в 1,5 раза (р<0,05), тимуса - в 25 раз (р<0,05), селезенки - в 2,4 раза (р<0,05), надпочечники увеличивались в 2,3 раза (р<0,05). Количество язв прогрессивно увеличивалось и достигало 41, из которых 22 были крупными и 19 точечными. Уровень N0 повышался в крови - в 4,2 раза (р<0,05), в тканях желудка - в 5,7 раза (р<0,05). 23% процента (12 крыс) от общего числа животных умирали, остальные имели положительную реакцию на амидопириновую пробу.

Данные результаты указывают на срыв механизмов адаптации и резервных возможностей организма под влиянием длительного воздействия сверфизиологических доз преднизолона, что сочеталось с высоким содержанием N0 в кровь и желудке. При этом развитие язвенных геморрагий на фоне критических изменений в массе тела и органов в этих условиях приходились на максимальное увеличение продукции N0 в исследуемых биологических тканях.

В целом, полученные данные отражают тот факт, что высокие дозы преднизолона оказывают токсическое воздействие на организм, снижая устойчивость к язвообразованию и развитию язвенного кровотечения. Одним из механизмов ульцерогенного влияния препарата являются его стимулирующие эффекты на систему генерации N0.

3. ВЫВОДЫ

1. В условиях хронического стресса (перенаселение в течение 4 месяцев) устойчивое повышение уровня артериального давления сопровождается нарушениями микроциркуляции желудка, что приводит к снижению устойчивости к дополнительному кратковременному эмоциональному стрессу и развитию пептических язв в данном органе.

2. Сосудистые эффекты адренергической системы на микроциркуляцию желудка зависят от исходного состояния органа. В норме адреналин оказывает вазоконстрикторные эффекты и подавляет микроциркуляцию желудка. При тяжелом стрессе, вызывающим развитие язв и кровотечения из них, механизмы прессорных эффектов адреналина не изменяются, однако, в этих условиях он оказывает вазодилатирующие эффекты и повышает тканевую перфузию желудка.

3. Проявление вазодилатирующих эффектов адреналина на сосуды желудка при тяжелом стрессе обусловлены повышением в этих условиях

чувствительности Рг-адренорецепторов и активности факторов Рг-адренозависимой вазорелаксации - N0 и КАтф-каналов.

4. Активность системы генерации N0 играет важную роль в механизмах рехуляции микроциркуляции желудка и его устойчивости к повреждающему действию стресса. В условиях нормы NO-зависимые влияния на кровоток желудка реализуется за счет активности eNOS. При тяжелом стрессе, вызывающим язвенные кровотечения, существенно повышается активность /NOS, что сопровождается резким повышением продукции NO и снижением чувствительности сосудов желудка к вазоконстрикторам.

5. Опыты с введением преднизолона позволяют сделать вывод о том, что глюкокортикоиды оказывают стимулирующее влияние на активность системы генерации N0, приводя к чрезмерной его продукции при длительном их воздействии, что является одним из механизмов токсического воздействия глюкокортикоидов на организм в этих условиях и одной из причин их ульцерогенных эффектов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Semyachkina-Glushkovskaya О., Lychagov V., Bibikova О., Semyachkin-Glushkovskiy I., Sindeev S., Zinchenko E., Kassim M., Braun H., Al-Fatle F. , A1 Hassani L., Tuchin V. The assessment of pathological changes in cerebral blood flow in hypertensive rats with stress-induced intracranial hemorrhage using Doppler OCT: particularities of arterial and venous alterations // Journal of Photonics and Lasers in Medicine. 2013. - Vol.1. - P. 1-8.

2. Семячкина-Глушковская O.B., Бибикова O.A., Семячкина-Глушковская O.B., Анищенко Т.Г., Синдеева С.А., Семячкин-Глушковский И.А, Зинченко Е.М., Кассима М.А., Аль-Фатле Ф., Фльхассани. Сосудистые и хронотропные эффекты стресса у крыс разного возраста // Фундаментальные исследования. 2012. - №10 (2). - С. 389-392.

3. Pavlov A.N., Rodionov М.А, Pavlova O.N., Semyachkina-Glushkovskaya O.V., Berdnikova V.A., Kuznecova Ya.V., Semyachkin-Glushkovskij I.A Wavelet-based analysis of gastric microcirculation in rats with ulcer bleedings // Proc. of SPIE (ed. by V.V. Tuchin ey al.) Vol. 8222, P. 82221A (5). 2012., P. 835-840.

4. Семячкин-Глушковский НА., Семячкина-Глушковская O.B., Бердникова В.А., Кузнецова Я.В., Капралов С.В. Адренергические механизмы развития язвенного кровотечения у крыс // Естественные науки. 2012. - №1(38). - С.200-202.

5. Семячкина-Глушковская О.В., Анищенко Т.Г., Синдякова Т.А, Семячкин-Глушковский И.А., Капралов С.В., Фролов И.А. Роль половых гормонов в регуляции базальной и стрессорной секреции оксида азота у нормотензивных и гипертензивных крыс // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. - 2011. - Т.10. - Вып.2. - С.65-69.

6. Семячкина-Глушковская О.В., Т.Г. Анищенко, В.А Бердникова, Я.В. Кузнецова, И.А. Семячкин-Глушковский, С.С. Синдеева, О.А. Бибикова. Изменение кардиоваскулярной стресс-реактивности в условиях дефицита оксида азота у

нормотензивных и гипертензивных крыс // Астраханский медицинский журнал. -2011 - Т.6, №3. - С.253-256.

7. Павлов А.Н, Родионов М.А., Семячкина-Глушковская О.В., Бердникова В.А., Кузнецова Я.В., Семячкин-Глушковский И.А.. Исследование микроциркуляции желудка при язвенных геморрагиях у крыс с применением блокатора NO-синтазы и вейвлет анализа // Фундаментальные исследования. 2011. - №9(3). - С. 467-468.

8. Семячкина-Глушковская О.В., Аншценко Т.Г., Бердникова В. А., Кузнецова Я.В., Кузнецова А.С., Семячкин-Глушкоский И.А, Капралов С.В. Механизмы нарушения адренозависимой вазорелаксации при развитии артериальной гипертонии // Фундаментальные исследования. - 2010. - №2. - С. 123-129.

9. Семячкина-Глушковская О.В., Анищенко Т.Г., Кузнецова А.С., Кузнецова Я.В. Кардиоваскулярная стресс-реактивность как индикатор развития гипертонии. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2009. - Т.П. -№1(5).-с.1027-1030.

10. Семячкина-Глушковская О.В., Анищенко Т.Г., Семячкин-Глушковский И.А., Бердникова В.А., Кузнецова А.С., Синдеев С.С., Бибикова О.А Изменение кардиоваскулярной стресс-реактивности в условиях дефицита оксида азота у нормотензивных и гипертензивных крыс // Астраханский медицинский журнал. -2011. Т.З.-С.64.

Монография:

Семячкина-Глушковская О.В., Анищенко Т.Г., Семячкин-Глушковский ИА. Роль

стресса в развитии артериальной гипертензии. Lap Lambert Academic Publishing. -

2013.-220 с.

Патенты:

1. Семячкина-Глушковская О.В., Анищенко Т.Г., Бердникова В.А., Кузнецова (Алексеева) Я.В., Купряшина М.А. Способ моделирования стресс-индуцированной гипертонии. Патент на изобретение №2409872 от 07.09.2009, заявка №2009133550. Опубл. 20.01.2011. Бюл.№2.

2. Семячкина-Глушковская О.В., Семячкин-Глушковский И.А, Капралов С.В., Фролов И. А., Синдеев С.С., Анищенко Т.Г., Тучин В.В. Способ прогнозирования рецидива кровотечения из острой гастродуоденальной язвы. Заявл. № 2011121945/15 ot01.06.2011; Опубл. 10.12.2012;Бюл. №34.

3. Семячкина-Глушковская О.В., Семячкин-Глушковский И.А., Капралов СВ., Фролов И.А., Синдеев С.С., Анищенко Т.Г., Тучин В.В. Способ экспериментального моделирования стресс-индуцированного развития язвенного кровотечения. Заявл. № 2011124711/14 от 16.06.2011; Опубл. 10.01.2013; Бюл. №1.

Статьи в сборниках материалов международных и российских научных

конференций

1. Semyachkina-Glushkovskaya O.V., Berdnikova V.A., Kuznetsova A.S., Kuznetsova Ya.V., Anishchenko T.G. Reorganization in peripheral adrenergic activity in rats with early and established stress-induced hypertension. 7th Mediterranean Meeting on Hypertension and Atherosclerosis. - Abstract Book. - 2010. - OP14.

2. Kuznetsova Ya., Semyachkina-Glushkovskaya O.V., Berdnikova V.A. Effect of stress on cardiovascular activity and serum cholesterol in normotensive and hypertensive rats. 20th European Meeting on Hypertension, Oslo (Norway), June 18-21, 2010. - Journal of Hypertension. - 2010. - Vol. 28. - P. e499.

3. Kuznetsova A., Semyachkina-Glushkovskaya O., Sindyakova Т., Kuznetsova Ya. Sex particularities in nitric oxide availability in healthy and hypertensive rats under normal and stress. 20th European Meeting on Hypertension, Oslo (Norway), June 18-21, 2010. - Journal of Hypertension. - 2010. - Vol. 28. - P. e501.

4. Semyachkina-Glushkovskaya O., Kuznecova YA., Kuznecova A., Berdnikova V. Mechanisms of Disorders in Beta2-Adrenomediated Vasorelaxation During Initiation and Progression of Stress-Induced Hypertension. 20th European Meeting on Hypertension, Oslo (Norway), June 18-21, 2010. - Journal of Hypertension. - 2010. -Vol. 28.-P. el93-el94.

5. Кузнецова Я.В., Семячкина-Глушковская O.B., Аншценко Т.Г., Бердникова В.А., Кузнецова А.С. Кардиоваскулярная стресс-реактивность как ключевой механизм в развитии гипертонии. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2010. - Т.9 (6). - Прил.1. - С. 174. ISSN 1728-8800

6. Berdnikova V., Anishchenko Т., Semyachkina-Glushkovskaya О., Semyachkin-Glushkovsky I., Sindyakova Т., Sindeev S., Bibikova O., Sjestnova A. Effect of age and gender on blood pressure values, development of renal hypertension and blood nitric oxide levels in white rats // Hypertension. - 2011.

7. Kuznetsova Ya., Semyachkina-Glushkovskaya O., Anishchenko Т., Semyachkin-Glushkovsky L, Sindeev S., Bibikova O., Sjestnova A. The gender particularities in activity of the NO-ergic system in normotensive and hypertensive rats under normal and stress conditions // Hypertension. - 2011.

8. Semyachkina-Glushkovskaya O., Berdnikova V., Kuznetsova Ya., Semyachkin-Glushkovsky I., Syndeev S., Bibikova O., Sjestnova A, Vinogradov A Activity of vasorelaxation and vasoconstriction mechanisms in rats with early and established stress-induced hypertension // Hypertension. - 2011.

9. Бибикова O.A., Синдеев C.C., Бердникова B.A., Кузнецова Я.В., Семячкин-Глушковский И.А., Съестнова А.А, Фролов И.А. Новый подход в эндоскопической диагностике гастродуоденальных острых геморрагий // Одесса

10. Semyachkina-Glushkovskaya О. Activity of vasorelaxation and vasoconstriction mechanisms in rats with early and established stress-induced hypertension / I. Semyachkin-Glushkovskij, V. Berdnikova//! Hypertens. - 2011. - Vol.29. P. 318.

11. Semyachkina-Glushkovskaya O., Bibikova O., Semyachkin-Glushkovskij I, Sindeev S., Kapralov S.V., Shapkin JG. Mechanisms underlying stress-related mucosal damage // Gut 2011, 60 (Suppl 3) A262. Abstract: P0764

12. Igor Semaychkin-Glushkovskij, Oxana Semaychkina-Glushkovskaya, Sergey Kapralov, Ilya Frolov, Sergey Sindeev Hyperproduction of nitric oxide in epithelium of stomach as effective indicator of hemorrhagic stress // Photonics 4 Life, Saratov Local Cluster Meeting 2011, March 11, 2011

13. Semyachkina-Glushkovskaya O. Essential rolle of glucocorticoids in pftological changes of gastric mucosal blow flowduring development of severe ulcer dleeding: effects on p-adrenireceptors and nitric oxide production / O.Semyachkina-Glushkovskaya, I. Semaychkin-Glushkovskij, S. Sindeev, O. Bibikova, Y. Kuznezova. // Gut 2012; 61 (Suppl 3) A7

14. V. Berdnikova, T. Anishchenko, O. Semyachkina-Glushkovskaya, I. Semyachkin-Glushkovsky, Y. Kuznetsova, O. Bibikova, S. Sindeev. Cardiovascular stress-reactivity in white rats of different gender and age. // Journal of Hypertension. - 2012. - Vol. 30, e-Supplement A - e 308.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 25.11.2013.

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0528_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 » 27-26-93

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семячкин-Глушковский, Игорь Александрович, Саратов

саратовским государственный университет имени н.г. чернышевского

На правах рукописи

¿¿/V

0420Н55340

СЕМЯЧКИН-ГЛУШКОВСКИЙ ИГОРЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ

АДРЕНЕРГИЧЕСКИЕ И Ш-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КРОВОТОКА ЖЕЛУДКА У КРЫС И ИХ РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К ПОВРЕЖДАЮЩЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ СТРЕССА

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Анищенко Татьяна Григорьевна

Саратов - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Перечень сокращений............................................................................... 4

Введение..................................................................................................... 5

Глава I Обзор литературы..................................................................... 15

1.1 Роль стресса в нарушениях работы желудочно-кишечного тракта............................................................................................... 15

1.2 Нейрогуморальные факторы регуляции микроциркуляции органов желудочно-кишечного тракта при разных состояниях организма........................................................................................ 25

1.3 Роль оксида азота в механизмах устойчивости желудочно-кишечного тракта к стрессу.......................................................... 33

Глава II Материалы и методы исследований.................................... 40

Глава III Результаты исследований.................................................... 46

3.1 Изучение влияния хронического стресса на уровень артериального давления и состояние тканей желудка............... 46

3.2 Изучение эффектов адренергических влияний на микроциркуляцию слизистой желудка в норме и при тяжелом стрессе............................................................................................. 56

3.2.1 Эффекты адреналина на микроциркуляцию слизистой желудка в норме и при тяжелом стрессе............................... 57

3.2.2 Влияние фармакологической модуляции активности Рг-адренорецепторов на перфузию слизистого слоя желудка у здоровых и и у крыс после тяжелого стресса..... 65

3.2.3 Исследование изменений прессорных эффектов адренергических влияний на микроциркуляцию слизистой желудка под влиянием тяжелого стресса............ 68

3.3 Изучение активности системы генерации оксида азота в норме и в условиях тяжелого стресса.......................................... 71

3.3.1 Содержание оксида азота в слизистом слое желудка и в крови при действии тяжелого стресса. Влияние блокады КдтФ-каналов на показатель микроциркуляции в слизистой желудка в этих условиях..................................... 71

3.3.2 Эффекты блокады эндотелиальной и индуцибельной ЫО-синтаз на микроциркуляцию слизистого слоя желудка у крыс в покое и при тяжелом стрессе.................. 75

3.3.3 Идентификация индуцибельной №Э-синтазы в тканях желудка в норме и при тяжелом стрессе у крыс................. 79

3.3.4 Влияние длительного введения преднизолона на состояние тканей желудка, а также продукцию оксида азота в крови и тканях органа............................................... 82

Глава IV Обсуждение результатов исследования............................. 87

Выводы...................................................................................................... 99

Список использованных источников.................................................. 101

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

€N08 - эндотелиальная нитрооксидсинтаза

¡N08 - индуцибельная нитрооксидсинтаза

N0 - оксид азота

1С - калиевые каналы

Катф - АТФ-зависимые калиевые каналы

Кса2+ - кальций-зависимые каналы

ВВЕДЕНИЕ

Стресс рассматривается как ведущая причина нарушения работы желудочно-кишечного тракта и развития пептических язв (Spirit, 2000; Schilling, 2000; Duerksen, 2003; Бутов, 2003). Во многих клинических и экспериментальных работах показано, что длительные эмоциональные переживания человека сопровождаются нарушением барьерной функции слизистого слоя гастродуоденальной зоны, что провоцирует развитие язв в желудке и двенадцатиперстной кишке (McKernan, 2009; Brzozowska, 2009; Kato, 2010; Zhang, 2012). К примеру, в Японии в г. Ханшин-Авадзи после сильного землетрясения в 1995 году были зарегистрированы массовые случаи язвенных геморрагий (Аоуаша, 1998). Однако, несмотря на интенсивные исследования в этой области, до сих пор остается неясным, каким образом стресс оказывает повреждающие эффекты на стенки ЖКТ и его функционирование в целом. Однако, несмотря на интенсивные исследования в этой области до сих пор остается неясным, играет ли стресс потенцирующую роль в язвообразовании или только усугубляет уже текущие патологические процессы? Малоизученными остаются механизмы стресс-индуцированного язвообразования и развития язвенного кровотечения.

Микроциркуляция слизистой желудка наиболее подвержена воздействию стресса (Spirt, 2003; Duerksen, 2003; Тимербулатова, 2006). За последние 15 лет в научной литературе появилось достаточно много сведений свидетельствующих о диагностической ценности оценки изменений в микроциркуляции слизистой желудка для прогноза течения язвенной болезни (Klarke, 2002, Тимербулатова, 2006; Павлов, 2011; Pavlov, 2011).

Одной из причин нарушения микроциркуляции слизистого слоя желудка при формировании стресс-индуцированных язв может быть развитие артериальной гипертензии в этих условиях. Известно, что

хронические стрессы провоцируют устойчивое повышение уровня артериального давления (АД), что в свою очередь отражается на трофики и кровоснабжении всех тканей организма (Kaplan, 1993; Bosma, 1998; Theoreil, 1998; Steptoe, 1999; Light, 2000; Matthews, 2002; Ming, 2004; Dimsdale, 2008; Kanel, 2008). Эпидемиологические исследования свидетельствуют о частой встречаемости язвенной болезни у лиц с хронически высоким уровнем АД (Sonnenberg, 1988; Смирнов, 1990). В научных открытиях последних лет показано, что в основе развития различных стресс-индуцированных заболеваний, включая сосудистые болезни и гастродуоденальные язвы, лежат одни и те же молекулярные механизмы дезадаптации, в частности, нарушение синтеза ßl-аррестина (Нага, 2011).

Адренергическая система играет ключевую роль в регуляции кровотока различных органов, включая ЖКТ (Покровский, 2004). При этом, процессы как адаптации к воздействию стресса, так и дезадаптации при чрезмерных негативных влияниях реализуются в значительной степени за счет изменений в активности нейрональных и гуморальных звеньев адренергической регуляции гомеостаза (Семячкина-Глушковская, 2002; Якушева, 2002; Семенова, 2005; Леонтьев, 2005; Игошева, 2009).

Следует отметить, что работ посвященных изучению вклада адренергических механизмов в развитие стресс-индуцированных нарушений работы ЖКТ крайне мало, научные публикации в этой области ограничиваются в основном 80-ми годами (Mine, 1983; Ray, 1987), что делает актуальным проведение детальных исследований, направленных на решение указанной проблемы.

Последние два десятилетия ознаменовались чередой важных

открытий в области изучения биологической роли оксида азота (NO) в

регуляции тонуса сосудов и микроциркуляции различных тканей

организма (Lin, 2006; Levy, 2009; Buerk, 2011; Totzeck, 2012). При этом во

многих работах показана функциональная взаимосвязь между

адренергическими влияниями на кровоток различных тканей и активацией

6

системы генерации N0 (Wang 1995; Koumi, 1995; Dawes, 1997; Semyachkina-Glushkovskaya, 2010). Данные о роли NO в регуляции микроциркуляции слизистого слоя желудка неоднозначны. В одних экспериментах указывается, что N0 улучшает кровоток в желудке и повышает устойчивость к стрессу и развитию гастродуоденальных язв (Brzozowski, 2000, Ma, 2000; Konturek, 2006). В других работах, напротив, описывается, что высокая продукция NO сопровождает развитие геморрагического стресса (Szabo 1999; Hierholzer, 2002; Collins, 2003, Musser, 2004; Semaychina-Glushkovskaya, 2012). Существуют три изоформы фермента, синтезирующего NO - нейрональная «NOS, преимущественно локализованная в центральной нервной системе, эндотелиальная eNOS, расположенная в эндотелии сосудов и индуцибельная /NOS, которую обозначают как макрофагальную NOS, однако, показана ее топография и в клетках различных тканей, включая ЖКТ (Szabo, 1999). Какая из NO-синтаз принимает участие в регуляции микроциркуляции желудка в норме и, особенно, при стрессе, на сегодняшний день не существует точных данных.

Нерешенность проблемы относительно вопроса о том, как изменяются механизмы регуляции кровотока желудка при повреждающем воздействии стресса, определили цель и задачи наших исследований.

Цель исследования - изучить адренергические и NO-зависимые механизмы регуляции кровотока желудка у крыс и их роль в устойчивости к повреждающему воздействию стресса.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние слизистой желудка и изменения в уровне артериального давления в условиях длительного воздействия социального стресса;

2. Исследовать состояние стенок желудка при сочетанном воздействии хронического и кратковременного острого стрессов;

3. Оценить роль адренергических механизмов вазорелаксации и вазоконстрикции в регуляции микроциркуляции слизистого слоя желудка у крыс при воздействии тяжелого стресса с применением фармакологической модуляции функции неиннервируемых (З2-, постсинаптичексих ai-, пресинаптических аг-адренорецепторов и процесса выброса нейромедиатора в синаптическую щель в адренергических нейронах;

4. Изучить роль оксида азота в регуляции кровотока желудка и его устойчивости к повреждающему действию стресса на основе определения содержания оксида азота в крови и тканях желудка, анализе эффектов блокады eNOS и /NOS на микроциркуляцию слизистого слоя желудка и иммугистохимической идентификации /NOS в тканях органа, а также исследования модулирующих эффектов глюкокортикоидов по отношению к активности системы генерации оксида азота.

Научная новизна

Впервые в опытах на крысах с применением разработанной оригинальной модели социального стресса было показано, что длительное проживание крыс в условиях повышенной популяционной плотности сопровождается нарушениями системного кровотока, что приводит к устойчивому повышению уровня артериального давления. На фоне стресс-индуцированной артериальной гипертензии развивается нарушение микроциркуляции желудка, что лежит в основе снижения устойчивости к воздействию дополнительных кратковременных стрессов и появлению язв в желудке, а также кровотечения из них при сочетании хронического и острого стрессов. Впервые были выявлены адренергические механизмы регуляции микроциркуляции желудка в норме и при стрессе. Было показано, что сосудистые эффекты адреналина проявляются по-разному в зависимости от исходного состояния организма. В норме адреналин оказывает вазоконстрикторные эффекты, подавляя микроциркуляцию желудка. В условиях тяжелого стресса, приводящего к развитию язв в данном органе, преобладают вазодилатирующие эффекты адреналина на фоне сохранения активности механизмов его прессорных влияний. Впервые было установлено, что проявление вазодилатирующих эффектов адреналина на сосуды желудка при тяжелом стрессе обусловлены повышением в этих условиях чувствительности [Зг-адренорецепторов и активности факторов Рг-адренозависимой вазорелаксации - NO и КдтФ-каналов. Впервые были изучены NO-зависимые механизмы регуляции микроциркуляции желудка в условиях нормы и при снижении адаптивных и резервных возможностей организма. В норме NO-зависимые влияния на кровоток желудка реализуется за счет активности eNOS. При тяжелом стрессе, вызывающим язвенные кровотечения, существенно повышается активность /NOS, что сопровождается резким повышением продукции N0 и снижением чувствительности сосудов желудка к

вазоконстрикторам. Впервые была выявлена роль глюкокортикоидов в регуляции активности системы генерации N0 на уровне желудка. В опытах с введением преднизолона были обнаружены их стимулирующие эффекты по отношению к продукции N0. В этих экспериментах было доказано, что чрезмерное повышение активности системы генерации N0 глюкокортикоидами лежит в основе проявления их токсического воздействия на организм при длительном воздействии и является одной из причин их ульцерогенных эффектов.

Научно-практическая значимость работы

Результаты исследования, представленные в диссертационной работе, существенно расширяют научные представления о том, как влияют длительные повседневные хронические стрессы на устойчивость к формированию язв желудка и кровотечения из них, а также раскрывают адренергические и NO-зависимые механизмы, лежащие в основе нарушения системного кровотока и микроциркуляции желудка в этих условиях. На модели стресс-индуцированных язвенных геморрагий у крыс было выявлено, что у здоровых особей адреналин вызывает сужение, а у животных с язвенным кровотечением - расширение сосудов слизистого слоя желудка. Нами было показано, что атипичные эффекты адреналина при стресс-индуцированных язвенных геморрагиях связаны с преобладанием его Р2-адренозависимых механизмов вазорелаксации над прессорными эффектами. Поскольку адреналин входит в состав препаратов, используемых с целью купирования язвенного кровотечения при гастроскопии, результаты, указывающие на его дилатирующие эффекты при указанном состоянии, имеют важное практическое значение. Содержание N0 в тканях желудка и крови существенно увеличивается при развитии язвенного кровотечения, что связано с активацией /NOS, отражающей течение воспалительных процессов. Мониторинг содержания NO в тканях желудка и крови может иметь важное прогностическое значение, указывающее на риск рецидива язвенного кровотечения.

Разработанная экспериментальная модель стресс-индуцированного язвообразования и развития язвенного кровотечения расширяет исследовательские возможности, позволяя изучать все этапы формирования указанных состояний и может быть использована для дальнейших более детальных исследований механизмов ульцерогенеза и роли стресса в этих процессах.

Положения, выносимые на защиту

1. В условиях хронического стресса устойчивое повышение артериального давления сопровождается нарушениями микроциркуляции желудка, что лежит в основе снижения устойчивости к повреждающему воздействию стресса и приводит к язвообразованию.

2. В основе нарушения микроциркуляции желудка при повреждающем воздействии стресса лежит повышение активности адренергических механизмов вазорелаксации и продукции оксида азота за счет активации /N08 на фоне снижения чувствительности сосудов микроциркуляторного русла органа к вазоконстрикторам;

3. Стимулирующие эффекты глюкокортикоидов в отношении активности системы генерации оксида азота являются одним из механизмов повреждающего воздействия стресса на желудок у крыс.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены на ежегодных европейских конгрессах по гастроэнтерологии (Швеция, Стокгольм 2011 г.; Амстердам, Нидерланды, 2012 г.); на III международной конференции по защите здоровья (Сингапур, 2012 г.); на международной школе по гастроэнтерологии (Сегед, Венгрия, 2012 г.); на международной конференции по фотонике (Саратов, Россия, 2012 г.); на международной конференции "Молодежь в медицине будущего" (Одесса, Украина, 2012, 2013 гг.), на II международной конференции "Свободные радикалы, антиоксиданты и старение" (Астрахань, Россия, 2011 г.), на 6-й международной конференции по фотонике и оптической электронике (Вухан, Китай, 2013 г.). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на открытом заседании кафедры физиологии человека и животных федерального образовательного учреждения высшего профессионального образования "Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского".

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов. Общий объем диссертации 129 страницы с 23 рисунками и 9 таблицами. Список цитированной литературы включает 249 источников, в том числе 38 отечественных и 211 иностранных.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 28 научных работы, в том числе рекомендованных ВАК РФ - 10, 1 монография, 3 патента РФ на изобретения.

Декларация личного участия автора.

Экспериментальные исследования выполнялись автором лично, либо при его непосредственном участии в коллективных работах. Гранты ФЦП: государственный контракт № 11.519.11.2035, программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы" (мероприятие 1.9-1 очередь); государственный контракт №С-1063Р, программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 годы" мероприятие 1.2 "Проведение научных исследований научными группами под руководством кандидатов наук", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий"; соглашения 14.В37.21.0216 и 14.В37.21.0853, программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2012-2013 годы, мероприятие 1.2.1., естественные науки, очередь XXXIX и мероприятие 1.5, естественные науки, очередь XIX; грант РФФИ а-11-02-00560.

В совместных публикациях вклад автора составил 50-70%.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТ