Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптивное действие хитоолигосахаридов на Apis mellifera L.

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Адаптивное действие хитоолигосахаридов на Apis mellifera L."

\

J

На правах рукописи

РГБ ОД

о /' г;-!"1 рчг)

САЛТЫКОВА Елена Станиславовна

АДАПТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ Х1ТГООЛИГОСАХАРИДОВ НА АРК МЕ1ХШЕ11А Ь.

03.00.09 - энтомология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

А.)

ЪйИМ-1 р1 - лунной! - ^ЛГ.^'

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научные руководители:

кандидат биологических наук,' старший научный сотрудник А.Г.Николенко кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Р.М.Хайруллин

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Н.А.Вилкова кандидат биологических наук, доцент А.Г.Семенова

Ведушая организация: Башкирский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится «./¿_» ЬУ&бЬ^Л.2000 г в /¿7 час. 1 заседании диссертационного совета Д020.01.01 при Всероссийском научш исследовательском институте защиты растений РАСХН по адресу: 189620, Саш Петербург-Пушкин - 6, шоссе Подбельского, 3, ВИЗР.

•

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института зашиты растений. Автореферат разослан а (б » ^/^¿¿/¿^ХЛ 999 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Г.А.Наседкина

Общая характеристика работы Актуальность темы Выявление механизмов адаптации живых организмов неблагоприятным воздействиям окружающей среды является одной из цен-1альчых проблем современной биологии. Изучение молекулярных механизмов щитных реакций насекомых позволит более целенаправленно подойти как к юблеме повышения устойчивости хозяйственно полезных видов насекомых, так к проблеме регуляции численности насекомых-вредителей.

Медоносная пчела обладает хорошо развитой индивидуальной и групповой стемами защиты, которые, однако, полностью реализуются только при благо-мятных условиях. К резкому снижению природной устойчивости пчел в на-ояшее время приводят сокращение кормовой базы, интенсивная межпородная брндизация, повышение загрязненности окружающей среды и другие причины. 1ним из эффективных способов восстановления устойчивости пчел являете; вменение биостимуляторов (Шангараева, 1998). Однако, в современном пчело-дстве преобладает применение минерально-витаминных добавок, которые эф-:ктивны. как правило, только при низком уровне пчеловождения. Такие добавки мпенсируют недостатки искусственного рациона (сахарный сироп), однако они ¡актически бесполезны при полноценном питании пчел.

Перспективным направлением в области биостимуляторов может стать изу-ние биологической активности промежуточных продуктов катаболизма эндо-нных биополимеров (Тарчевский, 1992). Наиболее распространенным у насеко-IX биополимером, как известно, является хитин. Адаптогенная роль производ-гх хитина, в частности, хитоолигосахаридов, показана рядом исследователей еимущественпо на растениях (Ryan, 1991; Максимов, 1997), но практически не следована на насекомых. Это дает основание предположить их активное уча--¡е в регуляции обмена веществ, морфогенеза и иммунной реакция насекомых, гя до последнего времени этот вопрос оставался неисследованным. В то же гмя изучение возможности применения олигомеров хитина в качестве адапто-юв насекомых может положить начало созданию биостимуляторов нового по-

коления, действие которых обусловлено влиянием на биохимические системь адаптации.

Цель и задач» исследований. Цель работы заключалась в выявлении биологической активности хитоалигосахаридов по отношению к Apis mellifera L. и изучении их адаптивного действия на начальном этапе инфекционного процесса ) пчелы. Были поставлены следующие задачи:

1 Провести сравнительный анализ биологической активности хитина, его олиго-меров и мономера М-ацетил-О-глюкозамина (АГА) по отношению к Apis mellifera.

2 Изучить воздействие хитосахаридов иа биохимические показатели, отражающие адаптивные процессы у Apis mellifera.

3. Для детального изучения адаптивных свойств хитоодигосахаридов (ХОС) по строить физиолого-биохимическую модель начальной стадии инфекционногс процесса у медоносной пчелы. 4 Исследовать преадаптивное действие ХОС на начальной стадии инфекционногс процесса у медоносной пчелы на основе построенной модели.

Научная новизна. Впервые показана высокая биологическая активного производных хитина в отношении Apis mellifera. Установлена зависимость ответ ных реакций от размера углеводной молекулы (хитин, ХОС, АГА). Показана ин дукция новых молекулярных форм фенолоксидазной системы у насекомых, вызы ваемая исследуемыми веществами, сопоставимая с таковой при воздействии би г оксибапиллина. Обнаружена способность хитоолигосахаридов и N-апетил-О глюкозамина влиять на скорость морфогенетических процессов. Впервые изучено пре адаптивное действие ХОС на медоносную пчелу, в том числе на защитные биохи мические реакции при развитии инфекционного процесса.

Практическая ценность работы. Полученные результаты могут быть и с пользованы при создании препаратов нового поколения для пчеловодства, осно ванных на регуляции адаптивных биохимических процессов Apis mellifera, npi разработке регламента их применения и апробация в производственных условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов» Уфа. 1989); «Изучение и рациональное использование природных ресурсов» Тфа, 1991); «Экологически 3 императив сельского хозяйства Республики Башкортостан» (Уфа, 1998); «Biologically Active Polysaccharides» (Norway, Oslo, 1998); drd Carbohydrate Bioengineering Meeting» (England, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах ма-цинописного текста, включая 20 таблиц и 15 рисунков, и состоит из введения, б •лав, выводов и списка литературы, включающего 186 источников, в том числе 18 -иностранных.

Содержание работы "лава 1. Биохимические механизмы адаптации насекомых.

Описаны известные физиолого-биохимические механизмы адаптации насе-:омых. Особо отмечены гуморальные факторы иммунитета насекомых. Показано, то формирование природной устойчивости у насекомых обусловлено целым ря-ом систем, которые принимают участие в процессах быстрой и долговременной даптации.

Подробно рассмотрены: ферменты антиоксидантной защиты, регулирующие ровень активированных форм кислорода; агглютинины и антибактериальные ептнды; фско ло к с иддз нз.я систем котордя при hü м ä £ т учеютис в процессах. анизации и склеротизашш покровов насекомых, а также в регуляции метаболи^-а биогенных аминов и иммунных реакциях; комплекс протеиназ, активизирую-шй проферменты. Анализируется роль этих систем в реализации механизмов бы-грой адаптации.

Большое внимание в обзоре уделено олигомерам природных полисахаридов, тмечена способность экзогенных и эндогенных олигосахаридов влиять на провесы метаболизма живых организмов, их регуляторные функции. Рассматривает-

ся их участие в запуске триггерных механизмов выживания при действии небл гоприятных факторов.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

""В качестве объектов исследований были использованы темная лесн; (среднерусская) медоносная пчела Apis mellifera mellifera L., личинки мухи д< машней Musca domestica L. и колорадского жука Leptínotersa decemlineata Sa Трехсуточных личинок домашней мухи содержали в стеклянных садках объемо 250 мл на пшеничных отрубях по 20 особей в каждом. Личинок IV возраста кол< радского жука содержали в чашках Петри диаметром 10 см по 10 особей на лист ях картофеля. Летние рабочие пчелы, собранные на пасеках в июле-августе ci держались в садках из капронового сита 10x10x10 см по 20 особей согласно ripi нятой методике (Еськов, 1990). Пчел собирали с одной пасеки из 5-10 ульев, пр рассаживании в садки брали одинаковое количество пчел из разных ульев. До н; чала эксперимента пчелы выдерживались в садках не менее недели. Каждый эю перимент проводился в дв^/крнткой повторностн на вариант. Общее ксличестг особей в эксперименте в зависимости от числа вариантов составляло 80-200. В( насекомые содержались при'стандартной температуре (+25°С) и 18 часовом cbi товом дне.

В экспериментах с мухой домашней и колорадским жуком использовал строго датированный оиологический материал позтсмг»7 сазвитие дичинок птзи стаз дартньгх условиях содержания было синхронным. В эксперименте с домашней мухе использовали трехсуточных личинок из кладок взятых с разницей во времени отклад* яиц' не более четырех часов. А в эксперименте с колорадским жуком использовали л) чинок отобранных в лабораторных условиях через сутки после линыш на четверть: возраст. В эксперименте фиксировали начало линьки на следующую стадию развит! насекомого.

В качестве биологически активных веществ исследовались: очишеыны порошкообразный хитин (Fluka), смесь ХОС с молекулярной массой от 1500 i

¡ООО Д (5-20 звеньев) и степенью ацетшшрования 70% (Хайруллин, 1992) и АГА Serva). / см» Д

\ "неосн,

В предварительных экспериментах по влиянию различных концентраций :итосахаридов на выживаемость пчел и на изучаемые физиолого-биохимические юказатели установлено, что оптимачьной концентрацией для дальнейших иссле-юваний является 0,001%. Вещества добавляли в сахарный сироп, который давали тчелам в течение трех суток. Контрольные насекомые содержались на обычном ;ахарном сиропе. После этого насекомых 12 часов выдерживали без корма. Искусственное инфицирование насекомых проводили в течение последующих суток, юбавляя в корм препарат битоксибашшлин (БТБ) (продуцент Bacillus thuringiensis /аг. tburigiensis) в концентрации СК50 0,5% для рабочей пчелы (0,01% для личина ,iyx, 0,1% для личинок колорадского жука). Личинкам мух исследуемые вещества юбавляли в отруби, для личинок колорадского жука хитосахариды и БТБ наноси-1И на листья картофеля методом погружения в водную суспензию на 10 сек. При гействии соединений на насекомое выживаемость определяли на пятые сутки. В жсперименте по исследованию воздействия экстремальных температур (+50°С и г2°С) визуально регистрировалась поведенческая реакция пчел и отмечалось на-1ало наступления фазы гиперактивности (повышенная двигательная активность) 1ли холодового оцепенения (полное прекращение локомоции) (Еськов, 1990).

В качестве биохимических показателей адаптивности-использовали: ' активность ферментов антиокислительной защиты организма (каталазы и пе-роксидазы) и, как итоговый результат работы блока, контролирующего уровень свободных радикалов и активных форм кислорода, концентрацию конечных продуктов окисления по содержанию малонового диальдегида (МДА); > активность фенолоксидазного (ФО) комплекса и регулирующих ее сериновых протеиназ и их ингибиторов (ТИТ), принимающего учзстне в меланизадии кл/тн-

кулы, в процессе распознавания и инкапсуляции чужеродных тел и регуляцш уровня биогенных аминов;

• содержание эндогенных гликозоаминогликанов (ГАГ), участвующих в процес сах гликоконъюгаиии - связывании токсичных для организма продуктов, а так же в репаративных процессах;

• активность хитиназьк являющейся одним из ключевых факторов метаболизм; хитина и его производныч;

• активность глюкозо-б-фосфат'дегидрогеназы (Г6ФДГ), как интегрального пока зателя интенсивности процессов углеводного обмена и окислительно восстановительных реакций, заинтересованных в НАДФ Нг, в организме.

Для определения активности Г6ФДГ использовали методик Ю.Б.Филипповича (1978). Активность каталазы определяли по В.М.Мершиев (1983). Содержание малонового диальдегида измеряли по Д.И.Стальной Т.Г.Гаришвили (1977). Содержание гликозоаминогликанов и свободных уроновы кислот определяли но П.Н.Шараеву (1987). Калибровочную прямую строили п гепарину. Активность пероксидазы измеряли по А.Н.Бояркину (1951). ФО акт ность определяли по Ю.Б.Филипповичу (1978). Уровень активности сериновы прогеиназ и их ингибиторов определяли по S.J.Sau! (1989). Концентрацию белк определяли по Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный ал бумин (БСА). Электрофорез множественных молекулярных форм фенолоксидаз: проводили в ПААГ по системе B.J.Devis (1962). Выявление ферментативной ai тивности на электрофореграммах осуществляли по методике описанно Г.Ю.Раушенбах (1997). Для электрофореза использовали общий гомогенат из 1 особей в расчете 100 мг биоматериала на 1 мл экстрагирующего буфера.

Глава 3. Биологическая активность хитина, его олигомеров и мономера N-ацетил-О-глюкозамина для насекомых.

3.1. Влияние, производных хитина на выживание Apis mellifera. IIocj подкормки пчел хитином, ХОС й АГА выживаемость в двух последних вариант:

тачительно превышала контрольный уровень. Особенно наглядно это видно на 16 и 23 сутки после начала эксперимента (рис.1). Традиционные минеральные до-Завки увеличивают выживаемость ггчел в значительно меньшей степени (Шагуг, 1983). Аналогичным образом действие производных хитина повышало долю мух, трошедших полный цикл развития до имаго.

['и гун о ¡с 1 Выживаемость пчел при содержании в садках (* - различие опыта с контролем тостоверно, р>0.95).

3.2. Преадаптивное действие ХОС при действии экстремальных температур (+50"С и +2°С). При действии экстремальных температур на пчел, предварительно содержавшихся на сиропе с добавлением ХОС, наблюдалось сохранение нормальной реакции в течение всех 30 мин эксперимента (рис. 2). Добавление в сироп АГА не давало существенных различий с контрольными насекомыми.

+2С ЮХолодовое оцепенение|;

С------ • ' •

АГА хос

Хитии Контроль

минуты О 5 10 15 20 25 30

Рисунок 2. Физиологическая реакция пчел на экстремальные температуры (+50°С и +2°С)

Использование ХОС и АГА в качестве подкормки повышало выживаемость пчел после температурного воздействия, в то время как добавление в корм хитина приводило к повышенной смертности насекомых.

3.3. Преадаптивное действие хитосахаридов при бактериальном заражении насекомых После заражения БТБ

на 5 сутки в садках выживало только 35%пчел (рис. 3). Предварительное содержание пчел на сиропе с добавками хитосахаридов в различной степени компенсировало последующее негативное воздействие БТБ. При использовании ХОС выживаемость пчел в эксперименте была практически на уровне контроля.

% выживания

юо,- 77

□ Контроль ■ БТБ

□ ХитинШТБ

□ ХОС1БТБ О АГА\БТБ

сутки

Рисунок 3. Процент выживания пчел б садках на 5 сутки после заражения БТБ (вариант с БТБ достоверно отличается от остальных, р>0.95)

3.4. Влияние хитосахаридов на онтогенез насекомых. Добавка хитосахаридов в корм личинок домашней мухи и колорадского жука сокращало время развития насекомых (рис.4.). При этом процент выхода имаго снижался в варианте с хитином и оставался на уровне не ниже контроля в вариантах с ХОС и АГА.

Хитин L

•ЧСЖШЮ *«

L.d. Контроль ( -i?-::.: АГА Г^

хос

ilssa? -saaamMü«'- шш

С

щСтадия личинки □ Начало окукливания

М .с!. Контроль ui

сутки ■

20

Рисунок 4. Влияние хитосахаридов на онтогенез домашней мухи (M.d.) и колорадского жука (L.d.) Сроки развития личинок мух рассчитывались от трехсуточной личинки до куколки, для колорадского жука учитывали продолжительность развития личинок четвертого возраста.

Внесение в среду для развития личинок домашней мухи БТБ (0,01%) на стадии 6 суточных личинок почти в 3 раза снижало выход имаго. Компенсаторное действие обнаружено только в варианте с АГА. В этом варианте выживаемость имаго снизилась только на 20% по сравнению с контролем. При внесении БТБ в

:реду на стадии начала образования пупариев максимальное преимущество полу-тли насекомые в варианте с ХОС, в 2 раза меньше в варианте с хитином, тогда сак вариант без предварительной подкормки (только БТБ) и вариант с АГА оказа-тись полностью безуспешными. ХОС и хитин, по нашим наблюдениям, повышали лшрость морфогенеза.

Аналогичный эксперимент проводили на личинках колорадского жука, 5 суток получавших корм, обработанный хитином, ХОС или АГА (0,001%), а затем -зТБ (0,1%). Развитие патогенного процесса и иммунного ответа, о котором мы су-шли по активности ФО в динамике, начиная с 4-х часов после начала действия >ТБ, сопровождалось и для этого вида изменениями скорости морфогенеза, при-1ем хитин, также как и в экспериментах с синхронизированной культурой комнат-юй мухи, сокращал стадию личиночного развития на 1 сутки, а АГА на 3 суток ускорил и выход имаго. В этом эксперименте явным компенсаторным эффектом )бладал АГА, обеспечивший в 5 раз более высокую выживаемость имаго, чем в сонтролыюй выборке.

Таким образом, нами впервые было показано, что хитин, хитоолигосахари-1ы и Ы-ацетил-Б-глюкозамин обладают выраженной биологической активностью ю отношению к организму насекомых. При этом характер действия хитосахари-юв зависел от размера молекулы и вида насекомого. Также было установлено что, :итин и его производные влияют на морфогенез домашней мухи и колорадского кука.

"лава 4. Действие хитосахаридов на биохимические показатели, отражающие [даптивные процессы у Apis mellifera.

При сравнении действия хитина и его производных на биохимические пока-атели у пчелы было отмечено снижение уровня образования вторичных продук-ов перекисного окисления (МДА), наиболее низкие значения которого наблюда-[и при действии ХОС. Уровень образования эндогенных ГАГ в данном варианте

был наиболее высоким. Отмеченные явления сохранились при последующем дополнительном заражение БТБ (табл. 1.).

Аналогичные результаты были получены при изучении биохимических процессов под действием экстремальных температур на пчел.

Таблица 1.

Биохимические показатели состояния организма после подкормки пчел хитосаха-ридами и/или введения БТБ (биохимические показатели приведены по отношению к контролю)__-____

Вариант Каталаза МДА ФО ГАГ Уроновы е кислоты Г6ФДГ

Ед. измере- мМ/мин/ нМ/г тка- ед.ак.У мг/г мг/г тка- мМ/мин/

ний в экс- мг белка ни мг белка ткани ни мг белка

перименте

Хитин 1.44 0,75 2,38 7,00 0,34 1.42

ХОС 0.95 0,52 1,08 50,50 1,89 0.73

АГА 1,39 0,87 1,60 1,50 0,57 0,57

БТБ 1,99 2,94 1,15 5,50 0,61 0,57

Хитин/Б ТБ 1,66 0,65 1,01 10,00 1,00 . 1,00

ХОС/БТБ 1.88 0.49 1,76 12,50 0,61 1,76

АГА/БТБ 1.79 1,75 1.59 26,50 1,93 1.26

(в светлых клетках различие опыта с контролем достоверно, р>0 95)

Добавление в корм личинок домашней мухи и колорадского жука в начале окукливания препарата БТБ и/или хитосахаридов инициировало индукцию появление новых молекулярных форм ФО. Спектр множественных молекулярные форм, индуцированных применением АГА и ХОС во многом был сходен с тем. что возникал при действии БТБ (рис. 5). Можно предположить, что подобного рода изменения могут быть обусловлены усилением экспрессии гена профенолокси-дазы и/или посттрансляционной модификацией.

Таким образом, выводы предыдущей главы были подтверждены на биохи мическом уровне. Хитин, ХОС и АГА в относительно низкой концентрадш (0,001%) активно воздействовали на биохимические процессы насекомых, llpi этом характер действия хитосахаридов также зависел от размера молекулы. Про изводные хи1ина инициировали появление дополнительных молекулярных форр

фенолоксидаз, идентичных тем, что образовывались при действии на насекомых бактериального препарата. Наибольшая степень адаптивного действия на Apis mellifera из испытанных хитосахаридов установлена для ХОС.

Куколки М. domestica

Личинки IV возр. L. decemlineata

0,1

0.2 '

0.3

0.4

0,5

0.6

0,7

0,8;

0,9 _

к хос ага бтб хос " +бтб

к хос ага бтб хос +бте

Рисунок 5. Индукция дополнительных молекулярных форм фенолоксмдазы при действии БТБ и хитосахаридов на домашнюю муху и колорадского жука.

Глава 5. Биохимическая модель начальной стадии развития инфекционного процесса у медоносной пчелы при заражении БТБ. Детальное изучения биохимических аспектов адаптивного воздействия ХОС на медоносную пчелу требовало четкой модели развития инфекционного процесса. Для этих целей мы подробно проанализировали динамику биохимических процессов и физиологических изменений на начальной стадии (24 часа) развития инфекциоиного процесса у медоносной пчелы при заражении БТБ.

5.1. Биохимическая модель начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы. Ввиду отсутствия культуры специфичного для медоносной пчелы микроорганизма со стабичьным уровнем патогенности для построения

модели мы использовали широко применяемый в практике защиты растений и хорошо изученный бактериальный препараг.битоксибациллин.

Bacillus thuringiensis - спороооразуюшие грамположительные бактерии, обладающие способностью образовывать во время споруляции кристаллическое тело. После поглощения бактерий насекомыми, кристаллы растворяются в средней кишке. Полагают (Kuslmer, Heimpel, 1957), что a-экзотоксин битоксибашшшна (фосфолипаза С) участвует в проникновении бактерии в хозяина, ß-экзогоксин (Faust. 1974) ингибирует нуклеотидазы и ДНК-зависимые РНК-полимеразы, связанные с АТФ, из-за чего снижается синтез РНК (Horska, 1968), 5-эшгатоксин высвобождается при распаде вегетативной клетки в ходе споруляции (Monro, 1961), вызывая паралич кишечника. Через 50-55 минут после поглощения кристалла би-токсибацшшюаа могут возникнуть разрывы в кишечном эпителии хозяина, эпителиальные клетки отшелушеваются и обнажающаяся базальная мембрана становится доступной для нападения вегетативных бактериальных клеток. Развитие вегетативной клетки из споры в организме насекомого происходит в течение нескольких часов. Полный цикл развития бактерий, при наличии благоприятных условий, достигается через 28-48 часов после инокуляции (Dulmage, Rhodes, 1971).

Устойчивость насекомых к действию патогенных микроорганизмов обусловлена целым рядом неспецифических и специфических процессов. Степень устойчивости насекомых к инфекции в значительной степени зависит от скорости развития инфекционного процесса и уровня активности и реактивности защитных ферментативных систем.

В нашем эксперименте на начальной стадии инфекционного процесса при заражении БТБ отмечаюсь снижение активности каталазы (рис. 6). Подобная реакция отмечена у личинок капустной совки и других чешуекрылых (Батурина, 1978).

Снижение активности каталазы сопровождалось двумя всплесками активно-

ЛТ11 Л 1 'О 1 I TT «"»О»» ( nAllTIi Е» ПООО^ Г» г»*-» Г"-» 1 I» 1 П ПОЛО Г» ^ I'l'TO'T" rO-JTl Г7ТТ117 ЦттЛг>»тг»т

i и WI4.< lili 1_1 . _ j.'UJU; "lw|.4J i ±1 U' lUVUU V pcwjjíi i tL/i ÍJiiliLj.'WlVIJ.iri-

онного процесса. Оба пика активности пероксидазы следовали непосредственно

юсле снижения активности каталазы. При сравнении графиков суточной динами-си активности каталазы и уровня образования МДА можно отметить, что значения этих двух показателей находились в противофазе друг к другу. Высокий уровень наивности фермента сопровождался низкими значениями МДА, при резком па-аении активности фермента от 3 до 4 часов уровень образования МДА увеличивался в 2 раза. Снижение активности каталазы (значительно развитой антипере-кисной системы защиты у пчел) на начальном этапе развития инфекционного процесса, вероятно, приводит к увеличению содержания перекисных соединений, что может быть причиной всплесков активности пероксидазы. Таким образом, стабилизация процессов образования вторичных продуктов перекисного окисления липидов (МДА) у пчел осуществляется за счет слаженного взаимодействия

пчелы при заражении БТБ (биохимические показатели приведены относительно контроля).

систем антиперекисной защиты.

Изучение динамики активности ФО комплекса показало, что в течение первых 30 мин после введения пчелам БТБ активность ФО увеличивалась, что свидетельствует о высокой реактивности данной системы в ответ на заражение. После часового спада активности от 1 до 3 часов наблюдали возвращение к контрольному уровню, затем активность вновь понижалась, а к концу суток возрастала. Подобные тенденции в динамике суточной активности ФО комплекса наблюдали на хлопковой совке при заражении различными патогенами (Глупов, 1993). Протеаз-ная и ингибиторная активности также находились в противофазе друг к другу. При резком повышении ингибиторной (ИП) активности к 6 часам отмечалось снижение протеазной. Ранее снижение активности протеиназ и других ферментов было отмечено у представителей отряда чешуекрылых при применении бакпрепа-ратов (Батурин, Батурина, 1978, Глупов, 1993). К концу первых суток активность ингибиторов снижалась почти до нуля, в то время как протеазная возрастала в 6 раз, при этом увеличивалась и активность ФО.

В первые 2 часа после заражения БТБ наблюдалось уменьшение количества ГАГ и уроновых кислот, в последующие 2 часа отмечался их значительный прирост, с последующим снижением после 4 часов. По-видимому, это связано с изменением активности гликоконьюгационных и/или репаративных процессов. Ранее такие процессы были описаны на крысах (Тиунов, 1987).

При заражении пчел бактериальным препаратом первый пик активности хи-тиназы (б ¡,5 раза выше уровня контроля) регистрировался уже через 30 минут, последующий устойчивый рост активности отмечался после 2 часов.

Активность Г6ФДГ в течение первых А часов устойчиво снижалась. Начиная с 10 часов активность начинала увеличиваться, достигая пика (в 1,7 раза выше контрольного уровня) к 24 часам, затем постепенно снижалась к контрольному уровню. Наблюдаемое падение активности, вероятно, связано с повышением значимости основного гликолитического пути (Эмбдена-Мейергофа) для решения энергетических проблем, связанных с развитием инфекционного процесса.

5.2. Сравнительное действие препарата БТБ и культуры бактерий Bacillus thurengiensis на фнзиолого-биохимические показатели медоносной пчелы. Для того, чтобы выяснить чем были вызваны наблюдаемые изменения на начальном этапе инфекционного процесса, только кристаллами токсина, содержащимися в препарате и/или спорами бактерий, одним пчелам давали с сиропом бактериальный препарат, другим - выделенный из него возбудитель. Микробиологический контроль накоапения бацилл в кишечнике проводили через 0,5; 2; 6 и 24 часа от начала заражения путем посева содержимого средней кишки на питательную среду. Также регистрировали скорость освобождения кишечника от патогена, после прекращения поступления его в кишечник через 1; 5; 7 суток. Одновременно отмечали состояние кишечника и величину pH пищеварительного тракта. К концу первых суток развития инфекционного процесса утолщалась и разрыхлялась перитрофическая мембрана средней кишки, к концу вторых суток наблюдалось истончение стенок кишечника и появление небольших изъязвлений, происходило легкое защелачивание содержимого. Погибшие лчелы обладали всеми признаками развившейся септицемии. При сопоставлении роста числа колоний, высеянных из средней кишки, в зависимости от продолжительности питания сиропом, содержащим бактерии, с патологическими нарушениями в кишечнике очевидным становится то, что тяжесть функциональных нарушений зависит не только от вирулентности патогена, но и от количества поступления его в организм. Функциональные нарушения в кишечнике пчел, вызванных БТБ и выделенным из него возбудителем, а также динамика изменений биохимических показателей позволяет отметить значительное их сходство. Однако в варианте с БТБ эти изменения наступали несколько раньше и наблюдали некоторое снижение уровня активности биохимических показателей, вероятно, из-за наличия в препарате токсина. Таким образом, видно, что наблюдаемые физиолого-биохимтеские изменения на начальном этапе инфекционного процесса объясняются наличием прежде всего одного возбудителя. На основании полученных результатов была предложена схема развития инфекционного процесса у медоносной пчелы (табл. 2).

Таблица 2.

Схема развития инфекционного процесса у медоносной пчелы при заражении БТБ.

Оч 1ч 4ч 6ч 24ч_ 48ч

Состояние патогена - Попадание спор в полость кишечника Начало прорастания спор Завершение образования вегетативных клеток, начало выделения токсинов Нарастание количества вегетативных клеток патогена. Увеличение количества выделяемых токсинов

рН кишечника рН слабо- -кислая рН нейтральная рН слабощелочная рН слабощелочная рН слабощелочная рН слабощелочная

Состояние кишечника Кишечник без видимых изменений Средняя кишка разбухает, перит-рофическая мембрана разрыхляется , содержимое темнеет Истончение стенок средней кишки, уменьшение объема толстой кишки Появление изъязвлений стенки средней кишки, размер толстой кишки уменьшаете я в 2 раза стенок средней кишки, развитие септицемии

Состояние биохимических показателей ФО л хитиназа л каталаза 1 пероксидаз) Г6ФДГ 1 протеазы ИП ^ ГАГ ^ МДА 1 протеазы а МДА ] ГАГ ) хитиназа ) пероксид. = ФО Г6ФДГ каталаза ^ хитиназа + каталаза } ИП ) Г6ФДГ ) пероксид. = ФО протеазы ^ МДА' ^ ГАГ хитиназа + протеазы } Г6ФДГ ) МДА ) ФО ) пероксид. ^ ИП ГАГ л, каталаза —1 ФО + чи. 1 1»1дп J ИП ) протеазы ) Г6ФДГ ГАГ ^ хитиназа ^ каталаза пероксид. ^ ФО + ипд ( 1У1.ЦП у ИП ) протеазы^ Г6ФДГ ГАГ ^ хитиназа^! пороке. ^

Периоды инфекцион ного процесса Период неспецифической реакции Латентный период Начало регистрации патологических изменений Нарастание патологических изменений Острое течение болезни ■А определяющий исход болезни

О. Ф.Гробов, 1989 Инкубационный период Предклинический период Клинический период

Оч 1ч 4ч 6ч 24ч 48ч

Примечание: л - пик активности, + - устойчиво высокая активность,) - рост активности; = - активность на уровне контроля, 1 - спад активности, - устойчиво низкая активность.

5.3. Сравнение суточной динамики биохимических показателей у пчелы при заражении БТБ и при действии ХОС. При добавлении в корм ХОС отмечалась тенденция к устойчивому повышению активности каталазы в течение первой половины суток и постепенная стабилизация активности до уровня контроля к концу суток. Профиль суточной активности пероксидазы при действии ХОС и БТБ был похожим, но уровень активности в первом случае был ниже. Профиль . динамики МДА также имел сходный характер, но с опережающей амплитудой колебаний в варианте с ХОС (рис. 7).

Аналогичная опережающая амплитуда всплесков активности протеиназ сопровождалась резким снижением ингибиторной активности. Результирующая активности ФО системы несколько снижалась, но была более стабильной, без резких спадов и подъемов, наблюдаемых при бактериальной инфекции.

Содержание ГАГ и уроновых кислот при действии ХОС было незначительно выше уровня, наблюдавшегося при бактериальной инфекции, но к завершению суток сильно возраст&та. При развитии же инфекционного процесса происходит их значительное снижение. Подобного рода процессы наблюдали при действии ьа теплокровных экзогенными ГАГ в лечебном режиме, отмечая при этом общий положительный эффект (Башкатов, 1997).

Активность Г6ФДГ колебалась в пределах контрольного уровня с небольшим всплеском активности в промежутке от 4 до 10 часов.

Подводя итог, можно отметить, что на начальной стадии заражения медоносной пчелы битоксибациллином происходила активация фенолоксидазного каскада, ингибирование антиокислительных процессов, накопление вторичных продуктов перекисного окисления, угнетение пентозофосфатного пути. Снижение уровня активности большинства наблюдаемых процессов при развитии патогенеза согласуется с теорией снижения уровня метаболических процессов при повреждении клеток (Мелехов, 1983). Действие ХОС носило в'целом сходный характер, однако отмеченные отличия в активации одних процессов и стабилизации других могут отражать установленные ранее адаптивные свойства ХОС.

Рисунок 7. Сравнение динамики сзточяой активности биохимических показателей у медоносной пчелы при инфекционном процессе и при действии ХОС (биохимические показатели приведены относительно контроля)

Экспериментальные данные позволяют выделить несколько критически; точек, в которых происходят значительные изменения в активности регистрируе мых ироиессов; через !. 4, 10 и 24 часа после начала заражения БТБ. Наблюдас

мые физиолого-биохимпчцские изменения позволяют выделить несколько периодов патологического процесса: период неспецифической реакции (до 1ч.); латентный период (1-4 часа); начало регистрации патологических изменений (4-6 часов); нарастание патологических изменений (6-24 часов); острое течение болезни (24-48 часов) и период определяющий исход болезни.

Глава 6. Преадаптивное действие хитоолигосахаидов на развитие инфекционного процесса у медоносной пчелы. На основе построенной модели начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы изучали преадаптивное действие хитоолигосахаридов (длительность содержания на ХОС - 3, 5 и 7 суток). Биохимические показатели регистрировали для критических точек, выявленных в предыдущем эксперименте (табл.3).

При 3-х суточном содержании пчел на ХОС с последующим заражением БТБ происходило снижение количества МДА на фоне активации антиокислительных ферментов (рис. 8). Количество уроновых кислот к концу первых суток уменьшалось в А раза, количество ГАГ в течение суток примерно во столько же повышалось. Активность ФО комплекса к концу 1-х суток возрастало почти в 1,5 раза. Пик активности протеиназ (в 2 раза выше контроля) приходился на 4 часа, при этом наблюдался спад активности ингибиторов почти до нулевого уровня. Максимальная ингибиторная активность (в 23 раза выше контроля) регистрируется к 9 часам вместе с минимальной активностью пвотеиназ и ФО системы. В течение суток происходило снижение активности Г6ФДГ с последующим восстановлением почти до контрольного уровня.

При содержании пчел на ХОС в течение 5-ти и 7-ми суток с последующим заражением БТБ отмечалось определенное сходство с вышеописанным экспериментом в динамике наблюдаемых процессов, заметно, однако, некоторое смещение фаз развития одних процессов вправо по оси абсцисс (уроновых кислот и ингибиторов протеиназ), других влево (ФО, протеиназы, хитиназа). При этом сохраняется профиль динамики активности этих процессов, наблюдаемый в варианте

Таблица 3.

Активность ферментов при заражении пчел Ь>ТН па фоне предварительной подкормки ХОС в течение различных периодов времени (биохимические показатели приведены по отношению к контролю)

Вариант Г6ФДГ Каталаза Перокси лаза Хитина за МДА ФО Протеина зы Ингибиторы протейназ ГАГ Урановые кислоты

Единицы мМ/ми мМ/мин/ ед.ак./мг мг/мг мг/г ед.ак./ ед.ак./мг ед.ак./мг мг/г тка- мг/г ткани

измерений 1]/м1' мг белка белка белка ткани мг белка белка белка и и

в экспери- белка *

менте /

подкормка ХОС 3 суток

1ч 0,52 1,07 0,64 2,19 1,36 0,97 0,48 0,02 4,46 ' , 1,01

4ч 0,29 1,17 0,98 4,25 1,09 1,47 2,33 0,04 0,45 0,35

10ч 0,42 0,32 0,95 4.41 0,86 0,57 0,48 24,70 1,50 1,18

24ч 0,74 0,06 1,14 1,67 0,49 1,83 1,04 16,53 0,85 0,21

подкормка ХОС 5 суток

1ч 0,83 0,48 2,43 0.57 1,19 1,00 1,08 0,20 1,44 1,26

Чч 0,11 1,21 2,46 0,43 0,81 0,44 0,85 94,00 0,79 0,94

Юч 0,61 1,19 3,86 2,43 0,93 0,61 1,00 . 108,73 0,96 0,43

24ч 0,83 1,10 1,46 7,93 1,26 0,88 0,62 15,06 1,24 1,59

подкормка ХОС 7 суток

1ч 0,20 : 0,96 . 1,04 1,21 0,42 1,58 0,40 350,70 0,54 0,68

4ч 4,43 1,06 1,42 0,34 0,43 0,40 0,36 297,60 0,28 0,54

10ч 2,21 0,90 1,49 0,05 0,57 0,50 0,78 1410,70 0,26 0,22

24ч 4,46 0,33 0,46 0,61 0,36 1,05 0,27 917,60 0,54 0,48

(п rnP-rnI.1V |^ПРТТ."ЯУ ПЯ1ПШШР ЛГ1Г.ТТЯ Г. 1тИТПППРЛЛ ПЛГ.'тп^ППП п>0

10 - Каталаза

10 7 ФО

нсунок 8. Преадаптивное действие ХОС на медоносную пчелу при заражении пчел БТБ юдкормка 3 сугок) (биохимические показатели приведены относительно контроля).

ри заражении БТБ без предварительной подкормки. Предварительная подкормка чел ХОС сопровождалась заметными различиями в развитии инфекционного роцесса: разбухание перитрофической мембраны в ответ на действие патогена роисходило только спустя 4 часа после заражения, длительное время не изменя-эсь pH кишечника, а спустя 48 часов не происходили патологические изменения кишечнике, приводящие к развитию септицемии.

Микробиологический контроль за накоплением бактерий в кишечнике и юростью очищения его от патогена после прекращения поступления бацилл о шеварительный тракт, позволяют сделать вывод о том, что у пчел'получавших шее ХОС очищение' кишечника происходило значительно быстрее (рис. 9). Уже 1 шестые сутки кишечник полностью очищался от Bacillus thi'rcngjcnsis, т. то зре-ч как у контрольных наблюдался рост колоний и на 7-е, и на 9-е сутки.

Время с момента введения БТБ пчелам

Концентрация посева на агар

2 часа

0,5% БТБ

2 cvtok

0,05% БТБ

б cyrot

0,005% БТБ

БТБ ХОС/БТБ Дрожжевой агар Агар + ХОС

Посевы из средней кишки пчелы Посев БТБ на питательную среду

Рисунок 9. Предварительное содержание пчел Рисунок' i 0. Добавление хитоолигосахаридов

на корме с добавкой хитоолигосахаридов ус- в культурадьную среду не задерживало разви-

корялс осзобоасденне средней кишки насеко- тие Bacillus thuringiensis на агаре, мого от клеток патогена Bacillus thuringiensis

Добавление ХОС непосредственно в культуральную среду не уменьшало количество колоний бацилл, прораставших на дрожжевом агаре (рис.10). Таким образом можно предположить, что ХОС влияют определенным образом на иммунный статус насекомого, способствуя положительному исходу болезни. Эффективность действия ХОС зависит от продолжительности подкормки пчел. Достаточным сроком подкормки с точки зрения биохимических процессов и обшей реакции организма можно считать трое суток.

Нами было показано преадаптивное действие хитоолигосахаридов на медоносную пчелу, сопровождающееся изменением реактивности ферментативны? систем. Общность этих изменений говорит о влиянии хитоолигосахаридов на ре гуляцию скорости неспецифического ответа на бактериальную инфекцию. Такиь образом, хитооли)" осахариды при действии на медоносную пчелу формируют rai

называемый структурный след адаптации (Меерсон, 1983), изменяя уровень метаболических процессов для более быстрой реализации защитных реакций при инфекционном процессе.

Полученные результаты позволяют выдвинуть гипотезу о том, что эндогенные олигомеры хитина могут выступать в качестве сигнальных молекул (регуляторов) неспецифических систем защиты насекомых и их метаболизма в целом.

Выводы.

1. Впервые показано, что хитин, хитоолигосахариды и И-ацетил-О-глюкозамин обладают биологической активностью по отношению к организму насекомых. При этом характер действия хитосахаридов зависит от размера молекулы и вида насекомого.

2. Сравнительный анализ действия хитина, хитоолигосахаридов и М-адетил-О-глюкозамина на медоносную пчелу показал, что максимальным преадаптивным эффектом при гипо- и гипертермии, а также при инфекционном процессе обладают хитоолигосахариды.

3. Для детального изучения действия хитоолигосахаридов на устойчивость пчелы к патогенам нами была разработана модель развития инфекционного процесса при заражении БГБ и выделены его временные периоды: период неспецифической реакции (до 1ч.), латентный период (1-4 часа), начало регистрации патологических изменений (4-6 часов), нарастание патологических изменений (6-2-» часов), острое течение болезни (24-48 часов) и последующий период, определяющий исход болезни.

4. Выявлено, что на начальной стадии заражения пчелы БТБ происходит активация фенолоксидазного каскада, ингибирование антиокислительных процессов, накопление вторичных продуктов перекисного окисления липидов, угнетение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

5 Хитоолигосахариды вызывают сходный характер изменений перечисленных биохимических показателей метаболизма пчелы, при этом наблюдаются нско-

торые отличия в активации одних процессов и стабилизации других, что, вероятно, способствует оптимизации иммунного ответа.

6 Хитоолигосахариды влияют на иммунный статус пчелы, способствуя быстрому очищению организма от болезнетворных бактерий в кишечнике и восстановлению жизненно важных функций. Характер действия хитоолигосахаридов на гуморальные факторы иммунитета пчелы позволяет предположить, что они имитируют компоненты клеточных стенок Bacillus thurengiensis. В пользу этого предположения свидетелветвуют данные о появлении под влиянием хитоолигосахаридов и Ы-ацетил-О-глюкозамина новых молекулярных форм фенолокси-даз, идентичных формам, индуцируемым при заражении насекомых БТБ.

7. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что хитоолигосахариды в организме медоносной пчелы индуцируют целый спектр изменений в ферментативной системе насекомого, который можно отнести к неспецифическим ответным реакциям, поскольку хитоолигосахариды повышают устойчивость пчелы не только к инфекции, но и к абиотическим стрессовым факторам. Таким образом хитоолигосахариды при действии на пчелу формируют «структурный след адаптации», способствующий быстрой реализации защитных механизмов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Салтыкова Е.С. Индукция неспецифических эстераз у комнатных, мух нермет рином // Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов Уфа, 1989. С.78.

2. Поскряков A.B., Салтыкова Е.С. Ферменты детоксикации инсектицидов в онтогенезе колорадского жука // Изучение и рациональное использование природных ресурсов. Уфа, 1991. С.25.

3. Поскряков A.B., Салтыкова Е.С., Амирханов Д.В. Активность ферментов деток сикации в онтогенезе колорадского жука /У Современное положение с рези

стентностью вредителей, возбудителей болезней растений и сорняков к пестицидам Уфа,1992. С.31-33.

4. Поскряков А.В., Салтыкова Е.С., Амирханов Д.В. Активность инсектицидов и ферменты детоксикации •„ онтогенезе колорадского жука // Агрохимия. 1993. №9. С.94-100.

5. Салтыкова Е.С., Поскряков А.В., Николенко А.Г., Хайруллин P.M. Повышение адаптивности медоносной пчелы при использовании хитоолигосахаридов // Экологический императив сельского хозяйства Республики Башкортостан. Уфа, 1998. С. 67-68.

6. Saltykova E.S, Poskryakov A.V, Benkowskaya G.V., Khayrullin R.M., Nikolenko A.G Adaptive effect of clntooligosaccharides on the honeybee Apis mellifera mellif-era L. // Biologically Active Polysaccharides. Oslo, 1998.

7. Saltykova E.S., Poskryakov A.V, Benkowskaya G.V., Nikolenko A.G. Chitooligo-saccharides reduce a lipid peroxidation level in honeybee Apis mellifera mellifera L. tissues // Biologically Active Polysaccharides. Oslo, 1998.

8. Benkouskaya G.V., Saltykova E.S., Poskryakov A.V., Nikolenko A.G. Phenol oxidase system expression under the chitooligosaccharides action in insects // 3rd Carbohydrate Bioengineering Meeting. England, 1999.

9. Поскряков A.B., Салтыкова E.C., Саттаров B.H. Влияние хитоолигосахаридов на уровень перекисного окисления липидов при бактериальном заражении Apis meiiitera тенпега // Актуальные проОлсмы современной окохимии и ийотехно-логии. Челябинск, 1999.

10. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков А.В. Индукция хитоолигосаха-ридами системы фенолоксидаз у насекомых // Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии. Челябинск, 1999.

11. Салтыкова Е.С., Поскряков А.В., Николенко А.Г., Хайруллин P.M. Иммуномо-дулирующёе действие хитоолигосахаридов на медоносную пчелу Apis mellifeia // Эволюционная биохимия и физиология. 1999 (принято в печать).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Салтыкова, Елена Станиславовна

Введение.

Глава 1. Адаптивные реакции и биохимические системы устойчивости насекомых (обзор литературы).

1.1. Виды адаптивных процессов и механизмы гормональной регуляции при стресс- реакциях у насекомых.

1.2. Факторы гуморального иммунитета насекомых.

1.2.1. Лектины и агглютинирующая активность гемолимфы.

1.2.2. Антибактериальные пептиды.

1.2.3. Реакции гликоконъюгации.

1.2.4. Ферментативные системы дезактивации эндогенных и экзогенных токсинов.

1.2.5. Роль биогенных аминов и фенолоксидазной системы в стресс-реакциях насекомых при действии биотических и абиотических факторов.

1.2.6. Антиокислительные системы и их участие в неспецифической устойчивости насекомых.

1.3. Хитоолигосахариды как биологически активные вещества.

Глава 2 Материалы и методы исследований.

2.1. Характеристика используемых соединений.

2.2. Характеристика биологических объектов исследований.

2.3. Методы изучения биологического действия хитина, хитоолигосахаридов и М-ацетил-О-глюкозамина.

2.4. Методика биохимических экспериментов.

Глава 3. Биологическая активность хитина, его олигомеров и мономера

М-ацетил-О-глюкозамина для насекомых.

3.1 Влияние производных хитина на выживание Apis mellifera L.

3.2. Преадаптивное действие ХОС при действии экстремальных температур (+50°С и +2°С).

3.3. Преадаптивное действие хитосахаридов при действии бактериального препарата БТБ на насекомых.

3.4. Влияние хитосахаридов на онтогенез насекомых

Глава 4. Действие хитосахаридов на биохимические показатели, отражающие адаптивные процессы у Apis mellifera.

4.1. Влияние хитосахаридов на биохимические показатели медоносной пчелы в условиях экстремально высокой и низкой температур.

4.2. Влияние хитосахаридов на биохимические процессы у насекомых при действии БТБ.

Глава 5. Биохимическая модель начальной стадии развития инфекционного процесса у медоносной пчелы при действии БТБ.

5.1. Биохимическая модель начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы.

5.2. Сравнительное действие препарата БТБ и культуры бактерий

Bacillus thurengiensis на физиолого-биохимические показатели медоносной пчелы.

5.3. Сравнение суточной динамики биохимических показателей у пчелы при действии БТБ и при действии ХОС.

Глава 6. Преадаптивное действие хитоолигосахаридов на развитие инфекционного процесса у медоносной пчелы.

6.1. Сравнение суточной и недельной динамики биохимических показателей у медоносной пчелы в норме и при действии ХОС.

6.2. Преадаптивное действие ХОС на начальной стадии развития инфекционного процесса у пчелы.

6.3. Динамика развития инфекционного процесса у медоносной пчелы на фоне преадаптации ХОС.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адаптивное действие хитоолигосахаридов на Apis mellifera L."

Выявление механизмов адаптации живых организмов к неблагоприятным воздействиям окружающей среды является одной из центральных проблем современной биологии. Изучение молекулярных механизмов защитных реакций насекомых позволит более целенаправленно подойти как к проблеме повышения устойчивости хозяйственно полезных видов насекомых, так и к проблеме регуляции численности насекомых-вредителей .

Медоносная пчела обладает хорошо развитой индивидуальной и групповой системами защиты. Однако к резкому снижению природной устойчивости пчел в настоящее время приводят сокращение кормовой базы, интенсивная межпородная гибридизация, повышение загрязненности окружающей среды и другие причины. Одним из эффективных способов восстановления устойчивости пчел является применение биостимуляторов (Шангараева, 1998). Однако в современном пчеловодстве преобладает применение минерально-витаминных добавок, которые эффективны, как правило, только при низком уровне пчеловождения. Такие добавки компенсируют недостатки искусственного рациона (сахарный сироп), однако они практически бесполезны при полноценном питании пчел.

Перспективным направлением в области биостимуляторов может стать изучение биологической активности промежуточных продуктов катаболизма эндогенных биополимеров (Тарчевский, 1992).Одним из наиболее распространенных у насекомых биополимеров, как известно, является хитин. Адаптогенная роль производных хитина, в частности, хитоолигосахаридов, показана рядом исследователей преимущественно на растениях (Ryan, 1991; Максимов, 1997), но практически не исследована на насекомых. Это дает основание предположить их активное участие в регуляции обмена веществ, морфогенеза и иммунной реакции насекомых, хотя до последнего времени этот вопрос оставался неисследованным. В то же время изучение возможности применения хитина и его производных в качестве адаптогенов насекомых может положить начало созданию биостимуляторов нового поколения, действие которых обусловлено влиянием на биохимические системы адаптации.

Цель данной работы заключалась в выявлении биологической активности хи-тоолигосахаридов по отношению к Apis mellifera L. и изучении их адаптивного действия па начальном этапе инфекционного процесса у пчелы. Были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ биологической активности хитина, его оли-гомеров и мономера ТЧ-ацетил-О-глюкозамина (АГА) по отношению к Apis mellifera.

2. Изучить воздействие хитосахаридов на биохимические показатели, отражающие адаптивные процессы у Apis mellifera.

3. Для детального изучения адаптивных свойств хитоолигосахаридов (ХОС) построить физиолого-биохимическую модель начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы.

4. Исследовать преадаптивное действие ХОС на начальной стадии инфекционного процесса у медоносной пчелы на основе построенной модели.

Работа выполнялась в 1996-1999 гг. в Отделе биохимии и цитохимии (с 1999 г. Институт биохимии и генетики) Уфимского научного центра РАН в рамках следующих тем:

• «Генетико-биохимические особенности башкирской популяции среднерусской расы медоносной пчелы» (РАН, № госрегистрации 01.9.60 001037, 1996-1998);

• «Молекулярные механизмы адаптивности южно-уральской популяции Apis mellifera mellifera к современным условиям обитания» (РАН, № госрегистрации 01.99.00 08299, 1999 - 2001);

• «Физиолого-биохимические особенности холодоустойчивости башкирской популяции среднерусской породы медоносной пчелы» (АН Республики Башкортостан, 1996-1998)

• «Изучение экспрессии биохимических механизмов защитных реакций как основа оценки адаптационных возможностей организма насекомых» (АН Республики Башкортостан, 1999-2001).

Заключение Диссертация по теме "Энтомология", Салтыкова, Елена Станиславовна

131 Выводы.

1. Впервые показано, что хитин, хитоолигосахариды и Ы-ацетил-О-глюкозамин обладают биологической активностью по отношению к организму насекомых. При этом характер действия хитосахаридов зависит от вещества и вида насекомого.

2. Сравнительный анализ действия хитина, хитоолигосахаридов и ТчГ-ацетил-О-глюкозамина на медоносную пчелу показал, что максимальным преадаптивным эффектом при гипо- и гипертермии, а также при инфекционном процессе обладают хитоолигосахариды.

3. Для детального изучения действия хитоолигосахаридов на устойчивость пчелы к патогенам нами была разработана модель развития инфекционного процесса при заражении БТБ и выделены его временные периоды: период неспецифической реакции (до 1ч.), латентный период (1-4 часа), начало регистрации патологических изменений (4-6 часов), нарастание патологических изменений (6-24 часов), острое течение болезни (24-48 часов) и последующий период, определяющий исход болезни.

4. Выявлено, что на начальной стадии заражения пчелы БТБ происходит активация фенолоксидазного каскада, ингибирование антиокислительных процессов, накопление вторичных продуктов перекисного окисления липидов, угнетение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

5. Хитоолигосахариды вызывают сходный характер изменений перечисленных биохимических показателей метаболизма пчелы, при этом наблюдаются некоторые отличия в активации одних процессов и стабилизации других, что, вероятно, способствует оптимизации иммунного ответа.

6. Хитоолигосахариды влияют на иммунный статус пчелы, способствуя быстрому очищению организма от болезнетворных бактерий в кишечнике и восстановлению жизненно важных функций. Характер действия хитоолигосахаридов на гуморальные факторы иммунитета пчелы позволяет предположить, что они имитируют компоненты клеточных стенок Bacillus thurengiensis. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о появлении под влиянием хитоолигосахаридов и N-ацет и л - D - г л ю к о з а м и н а новых молекулярных форм фенолоксидаз, идентичных формам, индуцируемым при заражении насекомых БТБ.

7. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что хитоолигосахариды в организме медоносной пчелы индуцируют целый спектр изменений в ферментативной системе насекомого, который можно отнести к неспецифическим ответным реакциям, поскольку хитоолигосахариды повышают устойчивость пчелы не только к инфекции, но и к абиотическим стрессовым факторам. Таким образом хитоолигосахариды при действии на пчелу формируют «структурный след адаптации», способствующий быстрой реализации защитных механизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салтыкова, Елена Станиславовна, Санкт-Петербург-Пушкин

1. Алексахииа Н.В., Бочарникова И.М., Гончарова Н Ю., Королева Е.И., Телепиева В.И. Регуляция активности ферментов // Практикум по биохимии. Под редакцией проф. Н.П.Мешковой и акад. С.Е.Северина. М.: Изд-во Московского университета. 1979. С.296-353.

2. Андриевский A.M., Ногасин К. Протеазно-ингибиторная активность тканей дрозофилы при тепловом шоке на разных фазах индивидуального развития // 6 Всес. совещ. по пробл. биол. и генет. дрозофилы. Тез. докл., Одесса, 1989, с.5-6.

3. Архипенко Ю.В., Газдаров А.К., Каган В.Е. и др. Перекисное окисление липидов в направление транспорта Са2+ через мембраны саркоплазматического ретикулу-ма при Е авитаминозе // Биохимия. 1976. Т.42. №10. С. 1898-1902.

4. Ахметова И.Э., Муллагалиев И.Р., Ахметов P.P., Хайруллин P.M. Получение биологически активных олигомеров хитина // Достижения биологического факультета БГУ. Уфа. 1998. С. 17-21.

5. Батурина Л.И. Механизм действия кристаллофорных бактерий на личинок капустной совки (Barathra brassicae L.) // В сб. Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых. Иркутск. 1978. С.86-93.

6. Батурин В.В. Патология гемолимфы сибирского шелкопряда под воздействием кристаллофорных бацилл //В сб. Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых. Иркутск. 1978. С.93-97.

7. Вольский H.H., Козлов В.А., Лозовой В.П. Влияние гидрокортизона на продукцию супероксидного радикала фагоцитирующими клетками селезенки // Бюлл. экс-перим. биол. и мед. 1987. №6. С.694-696.

8. Галиаскарова Г.Г., Муллагалиев И.Р., Монаков Ю.Б. Применение в медицине хитина и его модифицированных производных // Башкирский химический журнал. 1996. Т.З. Вып. 5-6. С.3-12.

9. Гилмур Д. Метаболизм насекомых. М., изд-во «Мир». 1968. 216с

10. Глупов В.В. Некоторые аспекты иммунитета насекомых // Успехи современной биологии. 1992. Т. 112. вып. 1. С.62-73.

11. Глупов В.В. Фенолоксидазная и агглютинирующая активности гемолимфы хлопковой совки Heliothis armigera // Сибирский биологический журнал. 1993. Январь-февраль. №1. С.3-7.

12. Глупов В.В., Хвощевская М.Ф., Щепеткин И.А., Крюкова H.A. Морфофункциональ-ная структура популяции гемоцитов Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralida) при инфекционном процессе // Известия АН, сер. биол., 1997, №6, с. 645-653.

13. Горизонтов П.Ф., Сиротин И.И. Патологическая физиология экстремальных состояний. М., Медицина, 1973, 383 с.

14. Горизонтов П.Ф., Протасова Т.Н. Роль АКТГ и кортикоидов в патологии. М., Медицина, 1968, 118 с.

15. Грицай О.Б., Дубинин В.А., Ашмарин И.П. Влияние факторов тревожности млекопитающих на насекомых. Действие фрагмента кортиколиберина 2-4 на поведение мучного хрущака Tenebrio molitor // Ж.эволюц. биохимии и физиол. 1996, Т.32, №4, С.440-447.

16. Гробов О.Ф., Лихотин А.К. Болезни и вредители пчел // М. Изд. «Агропромиздат». 1989. 239с.

17. Дворник В.Я. Локализация пероксидазной и каталазной активности в мальпигиевых сосудах личинок и куколок кровососущих мошек (Díptera: Simuliidae) // Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов: Тез. науч. конф., Уфа, 1989, ч.2, с.79.

18. Дворник В.Я. Оксидазные системы насекомых. Автореферат дисс. . к.б.н., Донецк, ун-т, Донецк, 1990, 20с.

19. Еськов Е.К. Экология медоносной пчелы. М.: Изд. Росагропромиздат, 1990, 221с.

20. Жеребкин М.В. Зимовка пчел. //Россельхозиздат. 1979. №14. СЗ-149.

21. Животенко Е.Ю., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Изменение активности монофе-нол-монооксигеназы в онтогенезе комнатных мух и тутового шелкопряда // Онтогенез, 1987, т. 18, №2, с.208-211.

22. Зюман Б.В. Факторы естественного иммунитета// Пчеловодство, 1988, №11, с.21-23.

23. Зюман Б.В. Динамика нуклеиновых кислот в организме медоносной пчелы при виро-зах // Доклады ВАСХНИЛ. 1990. №10. С.56-59.

24. Зюман Б.В. Почему болеют пчелы // Пчеловодство, 1993, №4, с.24-25.

25. Зюман Б.В., Устинова Г.И. Содержание общего белка в гемолимфе и тканях медоносной пчелы в норме и при патологии // Доклады ВАСХНИЛ. 1989. №3. С.32-35.

26. Ильин B.C. Клеточные и молекулярные механизмы центрального регулирования обмена у высших организмов // Проблемы теоретической медицины. Л., Медицина, 1968, С.93.

27. Кандыбин H.B. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М., Агропромиздат, 1989, 173 с.

28. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М., изд- во «Наука», 1985, 304с.

29. Ковалев И.Е., Шипулина Н.В. Иммунохимические механизмы адаптации организма к окружающей химической среде // Изв. АН СССР. 1992. Сер. биол. №1. С. 3141.

30. Коппел X., Мертинс Дж. Биологическое подавление вредных насекомых М. Мир. 1980. 416с.

31. Корчагин В.П., Братковская Л.Б., Шведова A.A. и др. Олигомеризация интегральных мембранных белков при перекисном окислении липидов // Биохимия. 1980. Т.45. №10. С.1767-1772.

32. Кубайчук В.П. Показатели каталазы как возможные тесты для оценки уровня физиологического состояния насекомых // IX съезд Всесоюз. энтомол. о-ва: Тез. докл. Киев, 1984, ч.1, с.260.

33. Кубайчук В.П. Установление температурного интервала для оценки энергии активации ферментов насекомых-вредителей на примере каталазы // С.-х. биол. Сер. биол. раст., 1993, №1, с. 108-112.

34. Кузнецов Н.Я. Основы физиологии насекомых// Л. 1945. Т. 1. С. 124-131.

35. Кулаев И.С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине // Соросовский образовательный журнал. 1997. №3. С.23-31.

36. Лабори Г. Регуляция обменных процессов (теоретический, экспериментальный, фармакологический и терапевтический аспекты) // М. Медицина. 1970. 384с.

37. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., Высшая школа, 1980, 293 с.

38. Лахтин В.М. Лектииы в исследовании белков и углеводов //Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. 1987, М., ВИНИТИ, Т.2, 288 с.

39. Левин A.C., Завезенова Т.В., Левина И.И. Фракционный состав белка эндотоксинов и биохимическая характеристика энтомопатогенных бацилл группы thurengiensis // В сб. Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых. Иркутск. 1978. С.86-92.

40. Лухтанов В.А. Неспецифическая резистентность как показатель состояния популяции насекомых // Тез.докл. «Методика и результаты изучения физиологических состояний насекомых. 1985, Тарту, С.47-49

41. Максимов В.И., Родоман В.Е., Лунцевич В.Г. Фитоактивные хитиновые соединения // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т.33, №4. С. 355-362.

42. Максимов В.И., Смирнова Ю.В. Сернокислотно-ферментативная переработка хитина //Биотехнология. 1993. №3. С.26-30.

43. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Стресс, адаптация и оксид азота // Ж. Биохимия, 1998, т.63, вып. 7, с. 992-1006.

44. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца//М. Медицина. 1984. 272с.

45. Мелехов Е.И. О возможном принципе регуляции повреждения и защитной реакции клетки // Журнал общей биологии. 1983. Т.44. №3. С.386-397.

46. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Шергин С.М. Биохимия окислительного стресса. Ок-сиданты и антиоксиданты. Новосибирск, 1994, 203 с.

47. Мерщиев В.M. Манганометрический метод определения активности каталазы в организме пчел // Рацпредложение НИИП. 1990.

48. Мхитарян В.Г., Агаджанов М.И., Геворкян Д.М. Ферментные механизмы антирадикальной защиты клеток при экстремальных состояниях // Вестн. АМН СССР. 1982. №9. С.80-87.

49. Несмеянов В.А., Хайдуков C.B., Комалева P.JI. Влияние .Ч-ацетилглюкозаминил(31-4)-]Ч-ацетилмурамоил-Г-аланил-0-изоглютаминила на экспрессию 1а-антигенов макрофагами мыши//Биол. мембраны. 1989. Т.6. С.245-251.

50. Неудачина Э.И. Спектр действия ß-экзотоксина бацилл группы thurengiensis // В сб. Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых. Иркутск. 1978. С.86-92

51. Озерецковская O.JI., Ильинская Л.И., Васюкова Н.И. Механизмы индуцирования эли-ситорами системной устойчивости растений к болезням // Физиология растений. 1994. Т.41. №4. С.626-633.

52. Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Роменская И.Г. и др. Фрагменты ксилоглюкана -регуляторы иммунных эффектов в картофеле // Физиология растений. 1995. Т.42. №5. С.773-779.

53. Озерецковская О.Л., Роменская И.Г. Олигосахарины как регуляторные молекулы растений // Физиология растений. 1996. Т.43. №5. С.743-752.

54. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. М., Наука, 1983, 233 с.

55. Панин Л.Е., Маянская H.H. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении.// Новосибирск. 1987. 197с.

56. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. М. Медицина. 1973. 287с.

57. Переверзев А.Е. Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы Л. Наука. 1986. 172с.

58. Полевщиков A.B. Лектины в защитных реакциях беспозвоночных // Журнал общей биологии. 1996. Т.57. №6. С.718-739.

59. Полтев В.П., Нешатаева Е.В. Болезни и вредители пчел. М., Колос. 1977. 160 с.

60. Помонецкий В.Д., Эфендиев A.M., Кубатиев A.A. Ферменты клеточной защиты и методы их исследования. М. 1986. 46с.

61. Поскряков A.B., Салтыкова Е.С., Саттаров В.Н. Влияние хитоолигосахаридов на уровень перекисного окисления липидов при бактериальном заражении Apis mellifera mellifera // Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии. Челябинск, 1999.

62. Проссер Л. Сравнительная физиология животных. М. Изд. «Мир». 1977. Т.2. С.84-141.

63. Раушенбах И.Ю. Стресс-реакция насекомых: механизм, генетический контроль, роль в адаптации//Генетика. 1997. Т.33. № 8. С. 1110-1118.

64. Раушенбах И.Ю., Серова Л.И., Тимохина И.С. и др. Генетический анализ различий в метаболизме дофамина у двух линий D. virilis в норме и при тепловом стрессе // Генетика. 1993. Т.29. № 6. С. 935-949.

65. Раушенбах И.Ю., Серова Л.И., Тимохина И.С. Изменение содержания биогенных аминов у двух линий Drosophila virilis и их гибридов в онтогенезе и при тепловом стрессе // Генетика, 1991, Т.27, №4, с. 657-666.

66. Раушенбах И.Ю., Серова Л.И., Тимохина И.С. Генетический анализ различий в метаболизме дофамина у двух линий Drosophila virilis в норме и при тепловом стрессе // Генетика, 1993, Т.29, №6, с.935-948.

67. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков A.B. Индукция хитоолигосахаридами системы фенолоксидаз у насекомых // Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии. Челябинск, 1999.

68. Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г., Хайруллин P.M. Повышение адаптивности медоносной пчелы при использовании хитоолигосахаридов // Экологический императив сельского хозяйства Республики Башкортостан. Уфа, 1998. С. 67-68.

69. Секиров И.А., Язловецкий И.Г. Изоферменты пероксидазы в онтогенезе златоглазки обыкновенной Chrysopa carnea (Neuroptera: Chrisopidae) // Изв. АН МССР, Сер. Биол. и хим. н., 1988, №2, 29-31.

70. Селье Г. На уровне целого организма. М., Наука, 1972, 122 с.

71. Скворцов В.Ю., Галактионов Б.Г., Мастернак Е.Б. Стимулирующий эффект хитозана на иммунный ответ на эритроциты барана у мышей разных линий // Иммунология. 1984. №4. С.22-25.

72. Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. Л. Медицина. 1969. 376с.

73. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии -продуценты биологически активных веществ // Киев. Наукова думка. 1982. 280с.

74. Смирнова А.H., Мыльников C.B., Опарина Т.И. Факторный анализ интенсивности перекисного окисления липидов у Drosophila melanogaster // 1 Всес. конф. по генет. насек., Москва 19-20 ноября 1991 : Тез. докл., М., 1991, с.97.

75. Смирнова А.Н., Мыльников C.B., Опарина Т.И. К вопросу о связи перекисного окисления липидов и продолжительности жизни у Drosophila melanogaster // Ж. эво-люц. биохимии и физиол., 1994, т.30, №3, с.321-331.

76. Соловьева Л.Ф. Токсикозы пчел и их профилактика // Сб. науч.-исслед. работ по пчеловодству. Рыбное, 1995. С.237-257.

77. Сороковая Г.К., Еремина О.Ю., Рыбакова Н.В. и др. Динамика активности некоторых ферментов биодеградации у имаго Musca domestica разного возраста // Изв. РАН. Сер. Биол., 1992, №1, с. 103-110.

78. Стальная Д.И., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. П/р акад. АМН СССР В.Н. Ореховича. М., Медицина. 1977. С. 66-68.

79. Сундуков О.В., Бауманн Э. Влияние биологически активных веществ и инсектицидов на транспортную функцию ректума насекомых // «Пробл. избирательности действия инсектиидов и акарицидов и ее значение в защите раст.» Л., 1986, с.73-80.

80. Таранов Г.Ф., Шагун Л.А. Добавление минеральных солей к зимней подкормке пчел // Вопросы технологии производства меда и воска./ Сбор. науч. трудов. Рыб-ное.-1985. С. 121-131.

81. Тарчевский И. А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов // Физиология растений. 1992. Т. 39, №6. С. 1215-1223.

82. Усов А.И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул в растениях // Успехи химии. 1993. Т.62. №11. С. 1119-1144.

83. Ушатинская P.C. Колорадский картофельный жук. 1981. М., Наука,

84. Фархутдинов P.P., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. Уфа. 1995. 90с.

85. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификация и физико-химические свойства // Микробиология. 1995. Т.64. №1. С.27-31.

86. Физиолого-биохимические основы действия средств борьбы с вредными членистоногими, под ред. д.б.н. Ю.Б. Филипповича // Итоги науки и техники, серия энтомология. М„ ВИНИТИ, 1988, т.8, с. 118-125.

87. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии.-М.Д986.-С.94-98.

88. Хайруллин P.M., Шакирова Ф.М., Безрукова М.В., Ямалеев A.M. Использование твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа для определения лектина в семенах и проростках пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т.28. вып. 3. С.468-474.

89. Хочачка П., Самеро Д. Стратегия биохимической адаптации. М., Мир, 1977. 384 с.

90. Цитлидзе Б.С. Активность каталазы и зимостойкость грузинских пчел // Пчеловодство, 1979, №3, с. 13.

91. Чалова Л.И., Озерецковская О.Л., Юрганова Л.А. Метаболиты фитопатогенных грибов индукторы защитных реакций растений ( на примере взаимоотношений картофеля и Phytophthora infestans) // Докл. АН СССР. 1976. Т.230. №3. С.722-725.

92. Черныш С.И. Реакция нейроэндокринной системы на повреждающее воздействие //Гормональная регуляция развития насекомых. 1983, Л., Наука, Т.64, С.118-128.

93. Черныш С.И. Неспецифическая резистентность как показатель физиологического состояния насекомых // Тез.докл. «Методика и результаты изучения физиологических состояний насекомых. 1985, Тарту, С. 134-136.

94. Черныш С.И., Лухтанов В.А., Симоненко И.П. Адаптация к повреждению у тутового шелкопряда Bombix mori. III. Адаптогены и устойчивость гусениц к стрессор-ной активации летентной вирусной инфекции // Энтомолог.обозрение. 1985, Т.64, №2, С.267-272.

95. Чиркин A.A., Романовский Р.В., Соловьев Ю.А. Диагностическая ценность определения интенсивности пентозофосфатного пути обмена углеводов в эритроцитах.// Лабораторное дело. 1983. .№11. С35-39.

96. Шагун Л.А. Использование минеральных добавок в зимнем корме пчел // Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. сельскохозяйственных наук. 1983. 23с.

97. Шараев П.Н., Пишков В.Н., Соловева Н.И. и др. Метод определения гликозоаминог-ликанов в биологических жидкостях // Лабораторное дело. 1987. № 5. С. 3301. JJZ.

98. Med. Results Rev. 1984. V.4. P. 11-117. Adelman R., Saul R.L., Ames B.N. Oxidative damage to DNA: Relation to species metabolic rate and life span // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1988, V.85, №8, P.2706-2708.

99. Al-Badry M., Knowles C. Phthalate organophosphate interactions: toxicity, penetration and metabolism studies with house flies // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1980. V.9.№2P. 147-161.

100. Anber H., Oppenooith F. A mutant esterase degrading organophosphate in a resistant strain of the predaceous mite Amblyseius potentillae // Pestic. Biochem. Physiol. 1989. V.33. №3. P.289-297.

101. Arakawa T. Possible involvement of an ensymatic system for superoxide generation in lepi-dopteran larval haemolymph // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1995, V.29, №3, P.281-291.

102. Ashida M. The prophenoloxidase cascade in insect immunity // Res. Immunol. 1990. V.141. N 9. P.908-910.

103. Ashida M. Prophenoloxidase activating system in cuticle of the larvae silkworm, Bombyx mori. // Zool. Sci, 1992, V.9, №6, P. 1135.

104. Ashida M., Koizunu Y. Demonstration of the presence of prophenoloxidase cascade in larval cuticle of the silkworm, Bombyx mori // Zool. Sci., 1993, V. 10, №6, P. 12.

105. Ashida M., Ochiai M., Niki T. Immunolocalization of prophenoloxidase among hemocytes of the silkworm, Bombyx mori // Tissue and Cell, 1988, V.20, №4, P.599-610.

106. Ashida M., Yoshida H. Limited proteolysis of prophenoloxidase during activation by microbial products in insect plasma and effect of phenoloxidase on electrophoretic mobilities of plasma proteins//Insect Biochem. 1988. V.18. N l.P. 11-19.

107. Aucoin R., Guillet G., Murray C. et al. How do insect herbivores cope with the extreme oxidative stress of phototoxic host plants? // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1995, V.29, №2, P.21 1-226.

108. Baines D., Downer R.G.H. Octopamine enhances phagocytosis in cockroach hemocytes: involvement of inositol triphosphate // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1994, V.26, №4, P.249-261.

109. Barrett F.M. Phenoloxidases from larval cuticle of the sheep blowfly, Lucilia cuprina: Characterization, developmental changes, and inhibition by antiphenoloxidase antibodies // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1987, V.5, № 2, P.99-118.

110. Benkowskaya G.V., Saltykova E.S., Poskryakov A.V., Nikolenko A.G. Phenoloxidase system expression under the chitooligosaccharides action in insects // 3rd Carbohydrate Bioengineering Meeting. England, 1999.

111. Benz G., Insect pathology from 1960 to 1993 at the cth-institute of entomology. Some reminiscences and unpublished data. // 4th Eur.Meet. «Microb. Confr. Pests», Zurich, 1994,V. 17, №3, P. 1-8.

112. Bermejo B.P., Rebuelta L.M., Villar del Frenso A.M. Effects of vitamins on antioxidant defenses in Drosophila melanogaster // Meth. and Find. Exp. And Clin. Pharmacol., 1994, V.16, Suppl. .№1, P. 139.

113. Best-Belpomme M., Ropp M. Catalase is induced by ecdysterone and ethanol in Drosophila cells // Eur. J. Biochem., 1982, V. 121, №2, P.349-355.

114. Bodnaiyk R.P. Identificación of specific dopamine- and octopamine-sensitive adenilate cyclases in the brein of Matestra configurata // Insect Biochem., 1979, V.9, №2, P. 155162.

115. Bohn H., Barwig B. Hemolymph clotting in the cockroach Leucophaea maderae. Influence of ions and inhibitors; isolation of the plasma coagulogen // J. Comp. Physiol. 1984. B154. №5. P.457-467.

116. Bohn H., Saks T. Inhibition of crosslincing in clotting of cocroach hemolymph (Leucophaea maderae) //J. Comp. Physiol. 1986. B 156. №5. P.625-633.

117. Bolter C.J., Chefurca W. The effect of phosphine treatment on superoxide dismutase, cata-lase, and peroxidase in the granary weevil, Sitophilus granarius // Pestic. Biochem. and Physiol., 1990, V.36, №1, P.52-60.

118. Brewer K., Keil C. A mixed function oxidase factor contribution to permethrin and dichlor-vos resistance in Lycoriella mali // Pestic. Sci. 1989. V.26. №1. P 29-39.

119. Brogdon W.G. Biochemical resistance detection: an alternative to bioassay // Parasitol. Today. 1989. V.5.№ 2. P.56-60.

120. Brammer E., Stevens D. Mechanisms in opposite modulation of spleen cell and lymph node cell responses to mitigens following muramyl dipeptid treatment in vivo // Ibid. 1985. V.91. P.505-514.

121. Bucher G.E. Potential bacterial pathogens of insects and their characteristics // J. Insect Pathol. 1960. 2. P. 172-195.

122. Busvine J.R. Mechanism of resistance to insecticides in house flies // Nature. 1951. V.95. №168. P.193-195.

123. Carter J.,Green E. Hemocytes of Baculovims-Infected Tipula paludosa Larvae // J. Inverted. Pathol. 1988. V.52. №3. P.393-400.

124. Charalambidis N., Boumazos S., Zervas C. Glycosylation and adhesiviness differentiate larval Ceratitis capitata tyrosinases //Arch. Insect Biochem. and Phisiol., 1994, V.27, №4, P.235-248.

125. Charalambidis N., Foukas L. Covalent association of lipopolisaccharide at the hemocyte surface of insects is an initial step for its internationalization protein-tyrosine phos-phorilation requirement // Eur. J. Biochem., 1996, V.236, №1, P.200-206.

126. Chen F., Torres M. Activation of mitogen activated protein kinase by heat shock treatment in Drosophila // Biochem. J. 1995. 312. №2. P.341-349.

127. Crawford E.C., Schmidt-Nielsen K. Temperature regulation and evaporative cooling in ostrich//Amer. J. Physiol. 1967. 212. P.347-353.

128. Dauterman W.C. Role of hydrolases and glutatione S-transferases in insecticide resistance // Pest Resistance to Pesticides. 1983. New York and London: Plenum Press. P.229-248.

129. Dean R.T., Hunt J.V., Grant A.J. et al. Free radical damage to proteins: The influence of the relative localisation of radical generation, antioxidants, and target proteins // Free Radic. Biol, and Mtd., 1991, V.ll, №2, P.161-168.

130. De Maitinez N.R., Garcia M., Salas M. Proteins with insulinlike activity isolated from Oyster hepatopancreas //Gen. Comp. Endocrinol., 1973, V.20, P.305-311.

131. Desmond J.R., Gilliam M. Peroxisomal enzymes in the honey bee midgut // Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1996. 31. №3. P.87-103.

132. Davis B.J. Preprint «Disc Electrophoresis», Distillation Prod. Div. Eastman Kodak Co., Rochester N.Y., 1962.

133. Dietrich C.P., Sampaio L.O., Toledo O.M. Characteristic distribution of sulfated mucopolysaccharides in different tissuse and their mitochondria // Biochem. and Biophys. Res. Commun., 1977. V.25. №2. P.329-336.

134. Dularay B., Lackie A. Haemocytic encapsulation and the prophenoloxidase-activation pathway in the locust Schistocerca gregaria Forsk // Insect. Biochem., 1985, V. 15, №6, P.827-834.

135. Dulmage H.T., Rhodes R.A. Production of pathogens in artificial media // In: Microbial Control of Insect and Mites, Bulges H.D., Hussey N.W. London-New Yore, Academic Press. 1971. P.507-540.

136. Dunn P. Humoral Immunity in Insects Immune strategy appeart to correspond to life-history characteristics // Biosciense. 1990. V.40. №10. P.738-744.

137. Dunphy H., Webster J. Lipopolysaccharides of Xenorhabdus nematophilus (Efnterobacteriaciae) and their haemocyte toxicity in non immune Galleria mellonella larvae//J. Gen. Microbiol. 1988. V.134. №4. P1017-1028.

138. Dvomik V.Y. Peroxidase and catalase in hemocytes of blackfly, Wilhelmia salopiensis edw., during preimaginal development // 9 Int. Congr. Entomol., Beijing, June 28-July 4, 1992: Beijing, 1992, P.41.

139. Eguchi M., Matsui Y., Matsumoto T. Developmental change and normal control of chymo-tiypsin inhibitors in the haemolymph of the silkworm, Bombyx mori // Comp. Bio-chem. and Physiol., 1986, B84, №3, P.327-332.

140. Elvin C., Vuocolo T., Pearson R. et al. Characterization of a major peritiophic membrane protein, peritrophin-44, from the larvae Lucilia cuprina: cDNA and deduced amino acid sequences // J. Biol. Chem. 1996. 271. №15. P.8925-8935.

141. Evans P.D., Swales L.S., Whim M.D. Second messenger systems in insects: An introduction // Neurotox 88: Mol. Basis Drag and Pestic. Act.:Proc. 3rd Meet. Soc. Chem. Ind., Mottingham, 10-15 Apr., 1988. Amsterdam ect., 1988. P.225-234.

142. Falkmer S., Emdin S., Havu N. Insulin in invertebrates and cyclostomes //Amer.Zool., 1973, V.13, P.625-638.

143. Fanner E., Saxton M., Ryan C. Oligocaccharide Signaling in Plants: Specificity of oligoura-nide-enhancel Plasma Membrane Protein Phosphorilation // J.Biol. Chem. 1991. V. 266. №4P.3140-3145.

144. Faust R.M. Bacterial diseases // In: Insect Diseases, Cantwell G.E. New York, Marcel Dekker. 1974, V.l. P.87-183.

145. Feiton G.W., Duffey S.S. Protective action of midgut catalase in lepidopteran larvae against oxidative plant defehses //1. Chem. Ecol., 1991, V.17, №9, P. 1715-1732.

146. Feiton G.W., Duffey S.S. Ascorbat oxidation reduction in Helicoverpa zea as a scaverging system against dietaiy oxidants // Arch. Insect Biochem. and Phisyol., 1992, V.19, №1, P.27-37.

147. Feiton G.W., Summers C.B. Antioxidant systems in insects // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1995, V.29, №2, P. 187-197.

148. Fernandez A. Haemocyte response as a possible and new parameter in the preliminary safety/toxitcity evaluation of biomaterials // Curr.Sci. (India). 1986. V.55. №15. P.719-720.

149. Fisher C., Brady U. Increased rate of melanization in hemolymph of American cockroaches and house crickets intoxicated by insecticides // Experientia, 1980, V.36, №1, P.93-94.

150. Fukumitsu T., Fujimoto K., Masuda K. Activation of profenoloxidase in Drosophila // Zool. Sei., 1992, V.9, №6, P. 1133.

151. Furukawa S., Taniani K., Yang J. Induktion of gene expression of antibacterial proteins chitinoligomers in the silkworm, Bombix mori // Insect Mol. Biol. 1999. 8. (1). P. 145-148.

152. Gade G., Beenakkers A. Adipokinetic hormone-induced lipid mobilization and cyclic AMP accumulation in the fat body of Locusta migratoria during development // Gen.compar.endocrinol. 1977, V.32, №4, P.481-487.

153. Gao Fuhong, Liu Shuses // Dongwu xuebao = Acta Zool. Sin., 1992, V.38, №4, P.443-445.

154. Glinski Z., Jarocz J. Rola oksydazy polifenolowej w odpomosci przeciwzakaznej owadow // Wed. Wet. 1990. 46. №7. S.238-241.

155. Gole J.W.D., Orr G.L., Downer R.G.H. Octopamine-mediated elevation of cyclic AMP in haemocytes of the American cockroach, Periplaneta americana L. // Can. J. Zool., 1987, V.65, №6, P. 1509-1514.

156. Grecomoro G., Piccione F., Letizia G. Therapeutic synergism between hyaluronic acid and dexamethasone in the intra-articular treatment of osteoarthritis of the knee: a preliminary open study // Cuit. Med. Res. Opin. 1992. V.13. №1. P.49-55.

157. Gregoire Ch. Haemolymph coagulation in insects and taxonomy // Bull. Inst. Roy. Sei. Natur. Belg. Entomol. 1984. V.55. №12 P. 1-48.

158. Gmbor-Lajsic G., Block W. et al. Antioxidant enzymes in larvae of the Antarctic fly, Belgica antarctica // Crio-Lett, 1996, V.17, №1, P.39-42.

159. Grunewald S., Reilander H., Mickel H. In vivo re constitution of dopamine D25 receptor-mediated G-protein activation in baculovims-infected insect cells: prefured coupling to Gü versus Gi2 // Biochemistry, 1996, V.35, №48, P. 15162-15173.

160. Heimpel A.M., Angus T.A. Diseases caused by certain spore-forming bacteria // In: Insect Pathology: An Advanced Treatise, New York, Academic Press. 1963. V.2. P.21-73.

161. Hiripi L., S.-Rozsa K. Octopamine- and dopamine-sensitive adenylate cyclase in the brain of Locusta migratoria during its development // Cell and Mol. Neurobiol., 1984, V.4, №3, P. 199-206.

162. Jamazaki H.J. Activation of laccase-type phenoloxidase in the cuticle of insect: IX Properties of prolaccase in larvae cuticle of silcworm. Bombyx mori // Zool. Sci, 1992, V.9, №6, P. 1134.

163. Jamori T., Natori S. Function of the lipopolysaccharide-binding protein of Periplaneta americana as an opsonin // FEBS Lett. 1992, V.57, №11, P.2109-2113.

164. Jimenez D.R., Gilliam M. Peroxisomal enzymes in the honey bee midgut // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1996, V.31, №1, P.87-103.

165. Kanost M., Dai W.,Dunn P. Peptidoglycan fragments elicit antibacterial protein synthesis in larvae of Manduca sexta // Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1988. V.8. №3. P.147-164.

166. Kato Y., Nacamura T.,Takeuchi T. Haeinagglutination activity of haemolymph of Bombix mori treated with a juvenile hormone analogue // J. Sericult. Sci. Jap. 1994. V.63. №3. P.221-228.

167. Kramer K., Morgan T., Hopkins T. Catecholamines and P-alanine in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Roles in cuticle sclerotization and nielanization // Insect Biochem., 1984, V.14, №3, P.293-298.

168. Z., Shen H.-J., Jiang Q., Ji B. // Kunchong xuebao = Acta entomol. sin., 1994, V.37, №4, P. 399-403.1.wry O.H., Rosenbrough N.J., Fair A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem., 1951, V.193, P.265-275.

169. Marmaras V.J., Charalanbodis N. Certain hemocyte proteins of the medfly, Ceratitis capitata, are responsible for nonself recognition and immobilization of Escherichia coli in vitro// Arch. Insect. Biochem. Physiol. 1992, V.21, N.4, P:281-288.

170. Massie H.R., Williams T.R. Superoxide dismutase activity in two different wild-type stains of Drosophila melanogaster /7 Gerontology (Schweiz), 1981,V.27, №4, P.205-208.

171. Massie H.R., Williams T.R. Influence of anti-inflammatory agents on the survival of Drosophila /7 I. Gerontol., 1985, V.40, №3, P.257-260,

172. Mathieu Y., Kurkaian A., Xia H. et al. Membrane Responses Induced by Oligogalacturon-ides in Suspension-culturel Tobacco Cells // Plant. J. 1991.V.l. №3. P.333-334.

173. Mathews M.C., Summers C.B., Felton G.W. Ascorbate peroxidase: A novel antioxidant enzyme in insects // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1997,V.34, №1, P.57-68.

174. Minnick M., Rupp R., Spence K. A bacterial induced lectin Which. Triggers hemocyte coagulation in Manduca sexta // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1986. V. i 37. №2. P.729-735.

175. Monro R.E. Protein turnover and the formation of protein inclusions during sporulation of Bacillus thurengiensis // Biochem. J. 1961. 2. P.225-359.

176. Murdock L., Omar D. N-acetyldopamine in insect nervous tissue // Insect Biochem. 1981, V.l 1, №2, P.161-166.

177. Ngah W., Smith J. Acidic conjugate of phenols in insects: glucoside phosphate and gluco-side sulphate derivatives // Xenobiotica. 1983. V.13. №6.P.383-389.

178. Noguchi H., Hayakawa Y. Elewation of dopamine levels in parasitized insect larvae // Zool. Sci., 1995, V. 12, №6, P. 14.

179. Orr W.C., Arnold L.A., Solial R.S. Relalionship between catalase activity, life span and some parametrs accociated with antioxidant defenses in Drosophila melanogaster // Mech. Ageing, and Dev., 1992, V. 63, №3, P.287-296.

180. Pardini R.S., Wang J.L. Ancillary antioxidant enzyme activities and insect resistance to plant pro-oxsidants // Proc. 18th Int. Congr. Entomol., Vancouver, July 3rd-9th, 1988: Abstr. and Author Index., P. 130.

181. Pendland J., Boucias D. Hemagglutinin activity in the hemolymf of Anticarsia gemmtalis larvae infected with the fungus Nomuraea rilevi // Dev/ Comp. Immunal. 1985. V.9, №1, P.21-30.

182. Peng Z., Miles P.M. Oxidases in the gut of an aphid Macrosiphum rosae and their relation to dietary phenolics //1. Insect Physiol., 1991, V.37, №10, P.779-787.

183. Pizki T., Pizki R. The cellular defense system of Drosophila melanogaster // Insect Ultra-stract. Vol.2. New York. 1984. P.579-604

184. Ratcliffe N.A., Brookman J.L., Rowley A.F. Activation of the prophenoloxidase cascade and initiation of nodule formation in locusts by bacterial lipopolysaccharides // Dev. AndCompar. Immunol. 1991. V.l5. N1-2. P.33-39.

185. Ross A. Systemic Acguired Resistance Induced by Localized Vims Infections in Plant 77 Virology. 1961. V. 14. №2. P.340-358.

186. Ryan C.A. Oligosaccharide signaling in plants // Annu. Rev. Cell Biol. 1987. №3 P.257-317. .

187. Ryan C.A., Farmer E.E. Oligosacchride signals in plants: a current assesment// Annu. Rev. Plant Phisiol. Mol. Biol. 1991. V.42. P.651-671.

188. Saul S., Sugumaran M. Protease inhibitor controls prophenoloxidase activation in Manduca sexta // Febs Lett., 1986, V.208, №1, P. 113-116.

189. Semsei I., Verzar F. Possible mechanism of alteration in activities of free radical scavenging enzymes, superoxide dismutase and catalase // Age. 1989, V.12, №3, P. 111-112.

190. Seryczynska H. Reakcje obronne u owadow // Kosmos. 1976. F.25.№3P.252-257.

191. Sloley B., Downer R. Dopamine, N-acetyldopamine and dopainine-3-O-sulphate in tissues of newly ecdysed and fully tanned adult cockroaches (Periplaneta americana) // Insect. Biochem., 1987, V.17, №4, P.591-596.

192. Smirle M.J., Winston M.L. Detoxifying enzyme activity in worcer honey bees: an adaptation for foraging in contaminated ecosystems // Can. J. Zool., 1988, V.66, №9, P.1938-1942.

193. Smith W., Gielbert L., Bollenbacher W. Calcium-cyclic AMP interactions in prothoracico-tropic hormone stimulation of ecdysone synthesis // Mol. and Cell. Endocrinol. 1985, V.'39, №1. P.71-78.

194. Spencer E.Y. Comparative amino acid composition of the parasporal inclusions of five en-tomogenous bacteria 11 J. Invert. Pathol. 1968. 10. P.444-445.

195. Stotz H., Powell A., Damon S. et al. Molecular Characterization of Polygalacturonase lngi-bitor from Pyrus communis // Plant Physiol. 1993. V.102. №1. P. 133-138.

196. Stynen D., Peferoen M., DeLoof A. Proteins with haemagglutinin activity in larvae of the Colorado beetle // J. Insect Physiol. 1982. V.28. №5 P.465-470.

197. Stynen D.,Tyteca L., de Loof A. Localisation of gycosaminoglicans in the ovarioles of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata // Ann.Soc.roy. Zool. Belg. 1986. V.116. №2. 131-136.

198. Vaughan P.F.T., Neuhoff V. The metabolism of tyrosine, tyramine and L-3,4-dihydroxyphenylalanine by cerebral and thoracic ganglia of the locust, Schistocerca gregaria // Brain Res., 1976, V.117, №1, P. 175-180.

199. Xue C., Yu G., Hirata T. et al. Antioxidative activities of several marine polisaccharides evaluated in a phosphatidylcholine suspension and organic solvents // Bioscience Biotech, and Bioch. 1998. 6. (2). P.206-209.

200. Wilson R., Ratcliffe N. The role of BDLI, an endogenous mannose-specific lectin, on the phagocytosis of foreign by haemocytes of the cockroach, Blaberus discoidalis. // 20 Int. Congr. Entomol., Firenze, Aug. 25-31, 1996: Proc.- Firenze, 1996, P.223.

201. Xiao-dong W., Qing-sheng J. Inducible antibacterial and lectin activity in hemolymph of Chrysomyia megacephala larvae and pupae // 19 Int. Congr. Entomol. 1992: Proc.:Abstr. P.334.

202. Xue C.H., Yu G.L. Hirata T. Antioxidative activities of several marine polisaccharides evaluated in a phosphatidylcholine suspension and organic solvents // Bioscience Biotechn. And Biochem. 1998. V.62. №2. P.206-209.

203. Yukio I. Host plants and dietary prooxidants affect antioxidant enzymes in onion and seed-corn maggots, Delia antiqua and D. platura // 19 Int. Congr. Entomol., Beijing, Iune 28- Iuly 4, 1992: Proc.Abstr., Beijing, 1992, P.119.

204. Zaman K., MacGill R.S., Johnson J.E. et al. An insect model for assessing oxidative stress related to arsenic toxicity // Arch. Insect Biochem. and Physiol., 1995, V.29, №2, P. 199-209.1. Р OCCMñCRft?.- ос