Адаптивная иммунность к бактериофагам за счет действия CRISPR системы Escherichia coli

Пугач, Ксения Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адаптивная иммунность к бактериофагам за счет действия CRISPR системы Escherichia coli
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Адаптивная иммунность к бактериофагам за счет действия CRISPR системы Escherichia coli"

На правах рукописи

005001237

Пугач Ксения Сергеевна

АДАПТИВНАЯ ИММУННОСТЬ К БАКТЕРИОФАГАМ ЗА СЧЕТ ДЕЙСТВИЯ CRISPR СИСТЕМЫ ESCHERICHIA COLI.

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о НОЯ 2011

Москва-2011

005001237

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН, а также в Лаборатории регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот Отдела молекулярной генетики клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН, Лаборатории К. Северинова в Институте Ваксмана (Пискатавэй, США), Кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

К.В. Северинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук A.B. Кульбачинский

кандидат биологических наук И.И. Артамонова

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук • Институт проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН

Защита диссертации состоится « d,» декабря 2011 года в ]] часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан <££» olo-N 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. фарм. наук

Л.С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Значительная часть эубактериальных и архейных геномов представлена генами, приобретенными за счет горизонтального переноса генов (ГПГ). Основными механизмами, обеспечивающими ГПГ, считаются поглощение ДНК из внешней среды и перенос чужеродного генетического материала мобильными генетическими элементами, такими как плазмиды или бактериофаги. Встраивание чужеродной ДНК в геном может приводить к нарушению функций клеточных генов, поэтому у прокариот существуют защитные механизмы, препятствующие проникновению и/или встраиванию чужеродной ДНК. Одним из таких механизмов являются CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) системы. CRISPR локус (часто называемый «CRISPR-кассета») представляет собой набор коротких палиндромных повторов ДНК, разделенных спенсерами - участками ДНК одинаковой длины, но различающимися по последовательности. В непосредственной близости от большинства CRISPR кассет находятся cas-гены (CRISPR-associated genes; гены, ассоциированные с CRISPR кассетой), продукты которых обеспечивают функционирование CRISPR локусов.

CRISPR системы способны придавать клетке устойчивость к бактериофагам, геномные последовательности которых содержат участки, полностью совпадающие с последовательностями хотя бы одного из спейсеров CRISPR кассеты. Но самым неожиданным свойством CRISPR оказалось то, что иммунитет, который они обеспечивают, адаптивен: клетка получает информацию о том, от какой чужеродной ДНК (бактериофаги, плазмиды) ей необходимо защищаться лишь после проникновения этой ДНК в клетку. Было обнаружено, что в ходе инфекции Streptococcus thermophilus бактериофагом в CRISPR кассеты этого микроорганизма встраиваются новые спейсеры, идентичные участкам генома фага. Клетки, несущие новые вставки, становятся устойчивыми к данному бактериофагу (Barrangou et al, 2007). Однако механизм встраивания новых спейсеров остается совершенно

неизученным, в связи с чем, особенно важной задачей является создание удобной экспериментальной модели для исследования этого процесса.

К сожалению, CRISPR система Е. coli, наиболее изученной бактерии, по-видимому, не обеспечивает иммунитета, несмотря на то, что даже лабораторные штаммы имеют протяженные CRlSPR-кассеты и полный набор cas-генов. В отличие от других бактерий и архей лишь очень малый процент CRISPR спейсеров Е. coli соответствует известным фагам или другим мобильным генетическим элементам. Таким образом, приходится предположить наличие очень большого количества пока еще неизвестных мобильных элементов Е. coli, иммунность к которым могла бы объяснить наблюдаемое разнообразие спейсеров. Однако, такое предположение представляется маловероятным, учитывая степень изученности самой Е. coli и фагов этой бактерии.

Отсутствие наблюдаемой функции CRISPR локуса Е. coli может также объясняться низким уровнем экспрессии в стандартных лабораторных условиях. В единственной работе, где удалось показать возникновение антивирусного иммунитета у Е. coli за счет действия CRISPR системы, авторы гиперэкспрессировали как Cas белки, так и CRISPR кассету (Brouns et al. 2008). Отсутствие видимой функции CRISPR системы у Е. coli в значительной степени ограничивает прогресс в понимании механизмов функционирования CRISPR-систем вообще, т.к. для Е. coli имеется не только большое количество специализированных биохимических, молекулярно-генетических методов и уникальных генетических коллекций, но и набор тщательно изученных бактериофагов. Выяснение транскрипционной организации CRISPR-локуса Е. coli и набора Cas белков, осуществляющих функционирование этого локуса, позволило бы лучше понять причины инертности CRISPR системы Е. coli, а также условия, которые могут повышать уровень экспрессии каждой из транскрипционных единиц локуса.

Цель работы н задачи исследования.

Целью данной работы было изучение транскрипционной активности CR1SPR локусов Escherichia coli К12, а также деталей развития адаптивного иммунитета данного микроорганизма к бактериофагам.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Выявить полноразмерный и процессированные продукты всех CRISPR кассет Е. coli К12.

2. Сравнить количества транскриптов в исходном штамме и штаммах, несущих делеции индивидуальных «и-генов.

3. Подобрать условия для встраивания новых спейсеров в CRISPR кассеты Е. coli К12, охарактеризовать эти спейсеры и соответствующие им протоспейсеры в геномах бактериофагов.

4. Определить ключевые cos-гены, продукты которых задействованы в процессе встраивания новых спейсеров.

Научная новизна работы. Впервые обнаружены и охарактеризованы короткие РНК, соответствующие всем спейсерам CRISPR кассет Е. coli К12. Также впервые детектирован полноразмерный транскрипт (предшественник) CRISPR I кассеты. Показано, что процессинг предшественника в клетках дикого типа идет неэффективно из-за недостаточной экспрессии гена casE, кодирующего нуклеазу. Впервые созданы две оригинальные модельные системы для изучения встраивания новых спейсеров в CRISPR кассеты Е. coli К12. С использованием этих модельных систем удалось получить и охарактеризовать новые CRISPR вставки, а также показать, что встраивание новых спейсеров в процессе фаговой инфекции происходит с высокой эффективностью только в клетках, CRISPR кассеты которых уже содержат спейсер, идентичный участку генома инфицирующего фага. Впервые экспериментально доказано участие белков Casl и Cas2 в процессе встраивания новых спейсеров. Также впервые получено доказательство того, что нуклеаза Cas3 разрезает чужеродную ДНК in vivo.

Науч110-пра1сг11ческая значимость работы. Представленная работа является частью серии работ направленных на изучение CRISPR систем иммунитета бактерий. Предложенный метод получения вставок в CRISPR кассеты может быть использован при создании устойчивых к бактериофагам штаммов-продуцентов антибиотиков и других используемых в биотехнологии штаммов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: Regulatory RNA in prokaryotes, June, З-б,

2009, Berlin, Germany; 2nd, 3rd, 4lh CRISPR research meeting, June-July, 2009,

2010, 2011, Berkley, CA, USA; CRISPR: Mechanisms and Applications, October, 21-22, 2010, Wageningen, The Netherlands; 111th ASM General Meeting, May, 2124, 2011, New Orleans, LA, USA.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работы изложена на Ol страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает в себя УЗисточников. Работа содержит^-) рисунков и таблиц.

СОДЕРЖА НИ Е РА БОТЫ

Детекция коротких РНК, соответствующих кассетам CRISPR I, CRISPR II и III Escherichia coli.

В геноме Escherichia coli К12 закодированы Gas белки CasA. CasB, CasC, Cast). CasE, Casl. Cas2 и Cas3: а также три кассеты — CRISPR I (содержащая 13 спейссров и 14 повторов), CRISPR 11 (6 спенсеров и 7 повторов) и CRISPR III (2 спейсера и 3 повтора). Белки CasA, CasB, CasC, CasD и CasF. образуют комплекс, получивший название Cascade (CRISPR-activated complex for antiviral defence; комплекс защиты от вирусов, активируемый CRISPR).

c&s.A саде casE c&s2 CRISPR I

CRISPR II CRISPR III У9СЕ

~500 ht

13 5 12

ygcF

Рис. 1. Структура CRISPR-локуеов Escherichia coli Kt2 MG1655. еш-гены показаны в виде черных пятиугольников; пятиугольники, изображающие гены, не принадлежащие семейству сах, не закрашены. Черными ромбами отмечены CRISPR-повторы, белыми прямоугольниками спейсеры. Несовершенные (содержащие замены) повторы закрашены серым. Отмечены также последовательности лидеров кассет CRISPR 1 и II.

В 2008 г. Breuns и сотр. детектировали короткую РНК, соответствующую спейсеру №4 CRISPR I кассеты Е. coli К12. Количество этой РНК в клетках дикого типа было чрезвычайно мало, но в изогенных штаммах из КЕЮ-кодлекцин делеционных мутантов Е. coli К12, не содержавших гены casA, casB или casC, возрастало на несколько порядков (Breuns et al., 2008 и Рис. 2).

Нами были получены данные, существенно дополняющие результаты Brauns и сотр. (Рис. 2, Рис. 3). С помощью нозери-блот анализа были выявлены короткие

РНК (длиной около 60 нт), соответствующие каждому спейсеру всех трех СЛКРИ локусов Е. соИ К12 за исключением последнего (№13) спейсера СИ-ВРЯ I.

у •ч

КТ

2 50-

im-i

т О о tO

щ «1 УЗ т э>

щ 4} <0

и о и о о О

«q 43 «а

Рис. 2. Нозерн-блот, демонстрирующий количество короткого транскрипта спейсера №4, СМБРЯ I в штаммах с делениями различных сая-генов. Направление транскрипции от лидера к спейсеру №13 (см. Рис. 1).

CRISPR 1 г спе-йсер

Специфические сигналы гибридизации были получены только для одной из двух возможных ориентации CRISPR транскрипта - от лидерной последовательности к концу кассеты (то есть транскрипция CR1SPR локуса сонаправлена с транскрипцией cas-генов).

Отсутствие короткого транскрипта спейсера №13, CRISPR I может объясняться тем, что последовательность повтора, следующего за этим спейсером (см. Рис. 1) содержит несколько нуклеотидных замен, что, возможно, предотвращает процессинг.

Чтобы оценить количество коротких транскриптов каждого спейсера кассеты CRISPR I, метод нозерн-блот анализа был модифицирован следующим образом. На ПААГ параллельно с тотальной РНК, выделенной из клеток дикого типа или КЕ10-мутанта AcasA, наносились известные количества дезоксиолигонуклеотида, комплементарного радиоактивно-меченому зонду. Количество короткой РНК, соответствующей тому или иному спейсеру, определялось путем сравнения интенсивности гибридизации зонда с тотальной РНК и с олигонуклеотидом, количество которого было известно (Рис. 3). Использованный полуколичественный метод выявил наличие 200-2000 молекул коротких CRJSPR-специфических РНК на

клетку в AcasA штамме, что примерно в 100 раз больше оцененного количества этих РНК в клетках дикого типа.

Для Pyrococcus furiosus был показано, что чем дальше спейсер находится от последовательности лидера, тем меньше в клетке обнаруживается соответствующей короткой РНК. Образование такого градиента, возможно обусловлено терминацией транскрипции на последовательностях повторов, которые могут образовывать протяженные тугоплавкие шпильки. Нами было показано, что в Е. coli К12 такой градиент отсутствует (Рис. 3).

н ач Й. Ч V; Щ н ■ У се о. *z <л Iii <4 Cr. о о ■ «а tx. n, "С ч tr, >-. ■ъ а. _ и О lkw'J ч К а. оз &> ы rq а; о и N « ч* 'Я н ИЗ 02 ü О

Ш Ш - Г т ж ц§ •т ■

1 < 3 1 7 13

Рис. 3. Нозерн-блот с тотальной РНК, выделенной из АсаяА мутанта КЕЮ-коллекции. Представлена гибридизация с радиоактивно мечеными олигонуклеотидами, соответствующими выборочным спейсерам (№1, №4 и т.д.). На параллельные дорожки были нанесены различные количества немеченого олигонуклеотида, соответствующего последовательности спейсера. Тотальная РНК, выделенная из клеток несущих делению кассеты СЫЭРЯ I, выступала в качестве отрицательного контроля.

Увеличение количества коротких РНК в КЕЮ-мутантах связано с повышенной экспрессией белка СавЕ.

В нашей работе было проведено подробное изучение причины наблюдаемого резкого увеличения количества коротких СШвРЯ РНК в некоторых слу-мутантах, показанного в работе Вгоипэ е1 а1., 2008. Были проведены эксперименты по

комплементации, эффекта увеличения количеств коротких CRISPR РНК в делеционных мутантах cosA, cas В и casC из КЕЮ-коллекции. Добавление в клетку экстрахромосомных копий casA, cas В и casC не приводило к уменьшению количества короткой РНК спейеера №?4 кассеты CRISPR I в соответствующих делеционных мутантах (Рис. 6). Нами было сделано предположение о том, что эффект увеличения количества коротких CRISPR РНК обусловлен не собственно отсутствием в клетке белков CasA, CasB и CasC (что предположили Brouns и сотр. в своей работе), а увеличением экспрессии нижележащих генов casD, casE, casi или cas2. Описанное увеличение экспрессии могло происходить за счет дополнительной транскрипции этих генов с промотора гена канамицниовой устойчивости, встроенного на место генов casA, cas В и casC при получении КЕЮ-мутантов.

Рис. 4 Нозерн-блот, демонстрирующий количество короткого гранскриита спейсера №4, CRISPR I в штаммах с делениям» различных шлченов и удаленной кассетой каиамициновой устойчивости.

К. с

«S

0, I

щ ч:1 IX ni

о и

<Я «ч

н. fi н Íí F-

Ь Ь !-> Ь ¡J О

s s S s s s

Ь í? tí5 ^ b> t?1

pr «i m и а ы -n'tM

Y; 01 7í r/; О) Щ Щ tfí

tj O fj (,) O O t) O

я «з -q ч «з

Для проверки этого предположения ген каиамициновой устойчивости и его промотор были удалены из каждого cas-мутанта из КЕЮ-коллекции. Тотальная РНК выделенная из таких штаммов была проанализирована с помощью нозерн-блоттинга. Как оказалось, в полученных нами «чистых» делеционных мутантах увеличения количеств коротких CRISPR РНК не детектировалось (Рис. 4). С помощью ОТ-НЦР в КЕЮ-мутантах AcasA, AcasB и AcasC было выявлено значительное усиление транскрипции генов casD, casE, casi и casi, тогда как в «чистых» делеционных мутантах количество транскриптов этих генов оставалось неизменным (см. Рис.5).

Рис. 5. Электрофореграмма, демонстрирующая количества транскриптов различных cas-генов в делеционных мутантах из КЕЮ-коллекции (KanR) и «чистых» (без гена устойчивости к канамицину) делеционных мутантах. Данные получены методом ОТ-ПЦР со специфическими к каждому гену праймерами. Ген домашнего хозяйства gyrB использован в качестве контроля на одинаковое количество РНК в пробах.

Чтобы выяснить, повышенная экспрессия какого есв-гена ответственна за увеличение количества короткой CRISPR РНК, в клетки дикого типа были введены плазмиды, несущие копии различных cas-генов под контролем индуцируемого промотора Т5-1ас. Оказалось, что увеличенное количество коротких CRISPR РНК обнаруживалось лишь в индуцированных клетках, содержавших плазмиду с геном casE (Рис. 6).

Рис. 6. Нозерн-блот, демонстрирующий количество РНК спейсера №4, CRISPR I в клетках дикого типа и указанных cas-мутантах из КЕЮ-коллекции, в которые были введены плазмиды, экспрессирующие различные cas-гены.

< и '/>

<13 43

0 U К. tJ

¡с <ч ч ю О о и

U 43 43 RJ 1ТЗПЗЧЗ ^tg

01 О U О ООО о 'J

<13 nj -ь -4. -fc ч. 4. > -V

i ^ •Ч ji ¡i jc je lie S js JS

60-

Повышение содержания процессированных СШ5№ РНК в клетках, экспрессирующих большое количество СаэЕ, может быть объяснено: 1) увеличением стабильности коротких РНК; 2) увеличением уровня транскрипции ОЖРЯ кассет (числа молекул предшественника коротких РНК); 3) увеличением эффективности процессинга предшественника и образованием большего числа коротких РНК.

Ингибирование транскрипции антибиотиком рифампицином показало, что как в КЕЮ штамме АсайА, так и в штамме дикого типа короткие транскрипты стабильны в течение не менее 25 мин (Рис. 7). Таким образом, изменение стабильности коротких СЯКРЯ РНК скорее всего не является причиной их накопления в штаммах с повышенной экспрессией гена сдаЕ.

с •Н tN V V Ift (О ^ О г, гч 't v v Csg v v IT) ^ кД о <\ " из

— —. — W 70- so-

Рис. 7. Нозерн-блот, демонстрирующий количества короткой РНК спейсера №4, CRISPR I в клетках дикого типа (справа) и Лет А мутанте из КШО-коллекции (слева). После обработки рифампицином равные объемы культуры отбирались через указанные промежутки времени (О минут, 2 минуты и т.д.) для выделения и анализа РНК.

Нозерн-блот анализ полноразмерных продуктов CRISPR I, CRISPR II-Ш кассет

со специфическим зондом, комплементарным последовательности CRISPR

повтора, выявил наличие в клетках Е. coli Kl 2 дикого типа сигнала,

соответствующего РНК размером около 800 нт. Эта РНК являлась транскриптом

CRISPR локуса, так как соответствующая полоса отсутствовала на дорожке с РНК,

выделенной из Е. coli BL21AI, не содержащих CRISPR-локусов. В

сконструированном нами штамме Е. coli К12 ACRISPRI, несущем делецию кассеты

CRISPR I, интенсивность этой полосы была существенно снижена. Таким образом,

большая часть полученного на нозерн-блоте сигнала соответствует

полноразмерному транскрипту кассеты CRISPR I. Остаточный 800-нуклеотидный 12

продукт, детектируемый в ACRISPRI клетках, возможно, соответствует частично процсссировапному транскрипту объединенного CRISPR 1I-LL1 локуса. Полноразмерный продукт этого локуса по данным ОТ-ПЦР имеет размер не менее 1100 нт и, возможно, перекрывается с полосой 16S рРНК, что препятствует его обнаружению.

Полоса, соответствующая полноразмерному транскрипту CRISPR I, отсутствовала в клетках, гиперэкспрессирующих белок CasE (КЕЮ-мутант AcasA). В этом штамме наблюдались различные продукты процессинга полноразмерного транскрипта длиной от 600-700 нт и меньше.

Резкое уменьшение количества полноразмерного транскрипта происходило также в штамме с делецией гена, кодирующего белок H-NS. Как было показано ранее (Pul et al., 2010) этот белок является негативным регулятором оперона cas-генов, и в Ahns клетках наблюдается увеличение количества всех Cas белков, в том числе и CasE.

к ко

Рис. 8. Нозерн-блот, демонстрирующий размер и количества полноразмерных CRISPR транскриптов (отмечено стрелкой) в диком штамме и штаммах, несущих делении различных генов. В качестве зонда использован меченый олигонуклеотид, комплементарный последовательности CRISPR повтора. Штамм Е. coli BL21AI не имеет геномных CRISPR кассет и выступает в качестве отрицательного контроля.

В клетках, несущих делению гена ст5 субъединицы РНК-полимеразы, необходимой для транскрипции генов на стационарной фазе роста (АгроЗ), не было обнаружено уменьшения количества полноразмерного транскрипта. По-видимому, ст5 не участвует в транскрипции СК1ЭРР кассеты.

В целом, полученные данные указывают на то, что увеличение количества коротких CR1SPR РНК в клетках с повышенной экспрессией casE не связано с увеличением уровня транскрипции CRISPR кассет, а обусловлено увеличенной скоростью процессинга. По-видимому, процессииг полноразмерного CRISPR транскрипта в клетках дикого типа происходит неэффективно, чем и объясняются низкие концентрации коротких CRISPR РНК и высокие концентрации предшественника. В кле тках с повышенной экспрессией гена casE полноразмерная CRISPR РНК подвергается ироцессингу и перестает детектироваться, а количество короткой РНК (продукта процессинга) резко увеличивается.

Полученные нами данные были подтверждены в работе Westra и сотр., которые показали, что введение в клетку экстрахромосомиой копии гена 1еиО (продукт которого является антагонистом H-NS) активирует транскрипцию cas-генов, в том числе и гена casE, что приводит к увеличению в клетке количеств коротких РНК (Westra et al., 2010).

Экспериментальная система для изучения встраивания новых CRISPR спенсеров.

Barrangou и соавторы в 2007 г. получили мутантных S. thermophilus, приобретших устойчивость к бактериофагу в ходе инфекции (Barrangou et al., 2007). Ими было показано, что CRISPR кассеты многих мутантов содержали вставки новых спейсеров, идентичные фрагментам генома фага, к которому приобреталась устойчивость. Удаление этих вставок приводило к возврату исходного чувствительного к фагу фенотипа. Введение спейсера в CRISPR кассету чувствительных клеток генно-инженерными методами также приводило к возникновению устойчивости к фагу. Таким образом, наличие CRISPR спейсера, идентичного фрагменту генома бактериофага, являлось достаточным условием для возникновения устойчивости.

Попытки получить мутантов Е. coli К12, устойчивых к бактериофагу за счет встраивания в CRISPR новых спейсеров, не принесли результата. Нами было сделано предположение, что CRISPR система Е. coli неактивна из-за пониженного уровня экспрессии Cas белков. Для проверки этого предположения и разработки

метода анализа встраивания спсйссров у Е. со//, нами была адаптирована система пшерэкспрессии CRISPR/Cas системы, использованная в работе Brouns et al., 2008. Эта система состоит из трех совместимых индуцируемых плазмид. На двух плазмидах закодирован весь набор Cas белков /;'. coli К12 под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 (casABCDE12 омерон на илазмидпом векторе pCDF (Novagen), и cas3 геи - па pRSF (Novagen)). а на третьей плазмиде, на основе вектора pACYC-Duet (Novagen), - искусственная CRISPR кассета из семи сиейсеров и восьми повторов. В качестве одного из спенсеров нами был введен участок ДНК. идентичный фрагменту гена 8 бактериофага М13 (этот спейсср получил название G8). Клетки Е. coli, содержащие полный набор плазмид {cas-гены и CR1SPR кассета с G8 спсйссром) были высоко устойчивы к фату М13. Замена спенсера G8 па спенсер, последовательность которого не встречается в геноме М13 (NT, non-targeting), приводила к возвращению чувствительного к фагу фенотипа. Клетки, содержащие полный набор сш-генов и CRISPR плазмнду с G8 или NT снейсером, заражались бактериофагом М13. инкубировались в жидкой среде в течение 8 часов, а затем рассевапись на твердую среду. Полученные индивидуальные колонии тестировались с помощью ПЦР с праймерами, специфическими к CRISPR кассетам 1, II и искусственной CRISPR кассете, находящейся на плазмиде. Встраивание нового спейсера (и, соответственно, повтора) должно сопровождаться удлинением кассеты на и 60 пи, что легко детектируется с помощью электрофореза в агарозиом геле. Полученные результаты представлены » Табл. 1.

Тип клеток CRISPR I CRISPR II CRISPR плазмида

NT 0/100 0/100 0/100

G8 4/100 22/100 0/100

Табл. I. Количество новых вставок (на 100 проверенных клонов) в геномные кассеты СЕШРК 1 п СКГвРЯ И, а также искусственную СНКРЯ касссгу, расположенную на шмзмиле. Наличие новых вставок проверялось в клегках С8 (содержащих спейсер, идентичны» участку гена ¿) фага М13) или N1' клетках (содержащих спейсср, последовательность которою не встречается в геноме М13).

Встраивание новых спейсеров с частотой до 25% происходило только в клетках, содержавших плазмиду со спейсером 08 (клетки 08). 85% новых вставок обнаруживалось в СМБРК II кассете, 15% - в СК18РК I кассете; в одном из клонов вставки присутствовали в обеих кассетах. Нам не удалось обнаружить вставки в искусственную СИБРЯ кассету, расположенную на СЯКРЯ плазмиде. Последовательности всех вставок были идентичны участкам генома фага М13 (Рис. 9). Встраивание происходило в ближний к лидерной последовательности конец кассеты. Большинство клонов содержало только один новый спейсер (и соответствующий повтор), хотя в одном случае было показано встраивание сразу трех новых спейсеров (и соответствующего числа повторов).

В результате нескольких повторных экспериментов нами было получено 75 клонов, содержащих новые спейсеры в СИвРЯ кассетах; распределение соответствующих протоспейсеров на карте генома фага М13 представлено на Рис. 9. Последовательности большинства спейсеров происходят из кодирующей цепи.

Чтобы показать, что встраивание нового спейсера приводит к возникновению устойчивости к фагу, несколько клонов, содержащих новые спейсеры, были заражены мутантными фагами М13. Мутантные фаги несут однонуклеотидные замены в протоспейсере 08, что позволяет этим фагам заражать 08 клетки, являющиеся устойчивыми к дикому типу фага М13 (8ешепоуа е1 а!., 2011). Клетки, несущие новые спейсеры, идентичные различным участкам генома М13, как в транскрибируемой, так и в нетранскрибируемой цепях репликативной формы фага, оказались устойчивыми к мутантным фагам.

««А

Рис. 9. Карта генома фага М13 с отмеченными на ней протоспейсерами, идентичными найденным новым спенсерам. Ширина стрелки отражает встречаемость данного спейсера в выборке из 75 клонов. Спейсеры, соответствующие красным протоспейсерам, встроились в СШЗРИ II кассету, зеленым - в ОИБРЯ I, желтым - в обе кассеты. Синим обозначен протоспейсер, соответствующий исходному -С8- спейсеру. Также указано направление транскрипции генома и расположение ориджина (оп) репликации.

Определение последовательности РАМ для Е. соЧ К12.

В работах Н. Оеуеаи и Р. Ного-аЙ! было показано, что встраивание нового

спейсера в СЯКРИ кассету 5. ЛеппорЫ1и$ происходит из участков фагового

генома, прилегающих к последовательности АйЛАШ (Эеуеаи е/ а/., 2008; НошаШ

е/ а!., 2008). Мутантные фаги, имеющие точечные замены в этой

последовательности, способны заражать клетки, СИвРЯ кассеты которых

содержат спейсеры, в точности соответствующие протоспейсеру фага, то есть

клетки устойчивые к дикому типу фага. Последовательности, примыкающие к

протоспейсерам, получили название РАМ (protospacer adjacent motif). Для разных CRISPR систем последовательности РАМ отличаются. На основании биоинформатического анализа было сделано предположение, что РАМ мотивом у Е. coli является последовательность AWG, однако полученные нами данные выявили преобладание (96%) мотива AAG, несмотря на то, что частоты встречаемости тринуклеотидов AAG и ATG в геноме фага М13 примерно одинаковые. Спейсеры, которым предшествуют как AAG так и ATG мотивы одинаково хорошо обеспечивают защиту клетки от фага, и предпочтение AAG на стадии адаптации, говорит о том, что требования к РАМ на стадиях адаптации и интерференции отличаются.

Частота встречаемости тринуклеотида AAG на кодирующей цепи примерно в два раза меньше, чем на некодирующей (1:2). Это значит, что происхождение новых спейсеров преимущественно из кодирующей цепи не может быть объяснено бОльшим по сравнению с некодирующей цепью числом AAG мотивов в кодирующей цепи.

Короткая CRISPR РНК, соответствующая спейсеру G8, комплементарна кодирующей цепи ДНК фага, и, возможно, именно ориентация короткой РНК определяет выбор той цепи, из которой произойдет новый CRISPR спейсер. Чтобы проверить это предположение была создана CRISPR плазмида, в которую спейсер G8 был клонирован в обратной ориентации (то есть короткая РНК G8 в данном случае была комплементарна некодирующей цепи фага М13). Встраивание новых спейсеров, как и в случае прямой ориентации (см. выше), происходило только в клетках G8, и эффективность его была также около 20%. Однако встроенные спейсеры происходили преимущественно из некодирующей цепи.

Определение набора Cas белков, необходимых для встраивания новых спейсеров.

Для определения Cas белков, необходимых для встраивания новых спейсеров в CRISPR кассеты, был создан набор плазмид на основе исходных casABCDE12 и cas3 плазмид, но содержащих мутации со сдвигом рамки в индивидуальных cos-генах. Был также создан штамм с делецией всех геномных копий сж-генов (Acas

штамм), наличие продуктов которых могло бы повлиять на результат эксперимента.

A cas клетки, содержащие набор ои-нлазмнд с мутацией в том или ином cas гене, и плазмиду со спенсером G8 в искусственной CR1SPR кассете, заражались бактериофагом M13 и выжившие в результате инфекции клетки проверялись на наличие новых вставок: в CRISPR II кассету. Выбор кассеты CRISPR II был обусловлен тем, что встраивание спенсеров в нее идет' с большей эффективностью, чем в CRISI'R 1.

Набор саз генов CRISPR II Устойчивость к фагу

casñBCDEl23 (wt) 16/3 00

с а sАБСDE 123 C/lüü -

casABCDE123 0/100 -

саSABCDE123 0/100 -

casABCDE123 O/'lOO

casABCDE123 0/3 00

casABCDE123 0/100 +

casABCDE123 1/100 -

Табл. 2. Количество новых вставок в кассету CRISPR II (па 100 проверенных клопов) в штаммах, содержащих мутации со сдвитом рамки в определенных ту-тенах (мутантныи геп обозначен полужирным шрифтом). Также указано наличие/отсутствие (*/-) у штамма устойчивости к фа1у M13.

В работе Brouns и сотр. было показано, что из всех Cas белков только CasA, CasB, CasC, CasD, CasR и Cas3 необходимы для защиты клеток от фага, что было

также подтверждено в нашей работе. Однако для встраивания новых спейсеров, как показали полученные нами результаты, необходимы все вышеперечисленные Cas белки, а также Casi и Cas2 (см. Табл. 2).

На клетках G8, не несущих ген cas3 (Acas3), был получен только один клон, содержащий новую вставку. Последовательность нового спейсера была идентична гену ехоУ генома Е. coli К12. Таким образом, в отсутствии cas3 произошло встраивание геномного участка в CRISPR кассету, что должно сопровождаться появлением автоимунности. Для проверки этого предположения, мы трансформировали клетки Acas3, содержащие ехоУ спейсер, экспрессионной плазмидой, несущей ген cas3. Как видно из Рис. 10, нам не удалось получить соответствующих трансформантов, не смотря на то, что клетки Acas3, не содержащие спейсера, трансформировались cas3 плазмидой с высокой эффективностью. Таким образом, Cas3 не необходим для встраивания нового спейсера (так как встраивание происходило и в его отсутствии). Однако Cas3, по-видимому, участвует в разрезании чужеродной ДНК в процессе CR1SPR иммунного ответа. Встраивание в CRISPR кассету спейсера, нацеленного на собственную ДНК клетки, при наличии всех Cas белков приводит к «самоубийству» клетки. Однако в отсутствии Cas3 этого не происходит и клетки, несущие такой спейсер, выживают. В подтверждение этого предположения недавно было показано, что Cas3 является нукпеазой in vitro (Sinkunas et al., 2011).

1 10-1

клетки -X, cas3

рЕТ28 JÍ клетки * Jt'AV . »

вставкой

Рис. 10. Результаты трансформации плазмидой, несущий ген сахЗ, клеток дикого типа (wt) и клеток со слейсером, идентичным гену exoV Е. coli К12. В качестве контроля на компетентность клеток был использован «пустой» вектор рЕТ28а+. Цифрами 1 и 10-1 обозначены разведения клеток (неразведенные и разведенные в 10 раз соответственно).

сазЗ

Встраивание новых спенсеров происходит в клетках с делецией гена lins

Чтобы выяснить, не являются ли полученные нами данные по встраиванию новых спейсеров артефактом, вызванным гиперэкспрессией Cas белков и CR1SPR кассеты, был сконструирован штамм, несущий G8 спейсер непосредственно в клеточном геноме - в CRISPR I кассете (см. Рис. 11) В этом штамме был также делетирован ген hns, кодирующий репрессор cai-генов. Клетки G8Ahns были устойчивы к бактериофагу M13, тогда как клетки, содержащие только спейсер G8 в CRISPR I (клетки G8) или клетки несущие только делению гена hns (клетки Ahns), были чувствительны к фагу.

Клетки всех трех типов (G8, Ahns и G8Ahns) заражались бактериофагом M13, инкубировались в жидкой среде в течение 8 часов, а затем рассевались на твердую среду. Полученные индивидуальные колонии тестировались с помощью ПЦР с праймерами, специфическими к CRISPR кассетам I, II. Полученные нами данные представлены в Табл. 4. Встраивание новых спейсеров в геномные CRISPR кассеты происходило только в клетках G8Ahns, хотя эффективность встраивания была существенно ниже, чем для использованной ранее системы, где компоненты CRISPR/Cas системы были закодированы на плазмидах. Все новые спейсеры также происходили из генома фага М13 и встраивались в ближний к лидеру конец кассеты. Последовательность РАМ, как и в случае искусственной системы гиперэкспрессии CRISPR/Cas, представляла собой AAG.

сазЗ casB casD casl

CRISPRI

Рис. 11. Схематическое изображение СМвРК I кассеты. Серым закрашен спейсер 08, искусственно встроенный в кассету со стороны лидерной последовательности (указана утолщённой черной линией).

Штамм CRISPR I CRISPR II

Ahns 0/100 0/100

G8 0/100 0/100

GSühns 1/100 b/100

Табл. 3. Количество новых вставок в геномные кассеты CRISPR I и CRISPR II в штамме, несушем делецшо гена hns (¿ilms); штамме, несущем геномные спейсер G8 (G8); и в штамме, несущем как делению гена hm, так и геномный спейсер (58 (GSJ/hk).

Таким образом, данные по встраиванию новых спенсеров в клетки G%Ahns в целом повторяют результаты, полученные для искусственной системы гнперэкспрессии CRISPR/Cas компонентов, из чего можно заключить, что выявленные нами закономерности являются скорее общим правилом для процесса адаптации в Е. coli. нежели исключением.

ВЫВОДЫ:

1. В клетках Escherichia coli К12 присутствуют короткие 60 нт) РНК, соответствующие каждому спейсеру CRISPR кассет I, II, III (кроме последнего спейсера CRISPR I).

2. Относительное количество коротких CRISPR РНК не зависит от положения соответствующих спейсеров в кассете.

3. Увеличенный уровень экспрессии гена casE необходим и достаточен для накопления коротких CRISPR РНК в клетках Е. coli К12.

4. Созданы две оригинальные модельные системы для изучения процесса встраивания новых спейсеров в CRISPR кассеты Е. coli К12.

5. Встраивание новых спейсеров с высокой эффективностью происходит только в клетках уже несущих CRISPR спейсер, идентичный по последовательности участку генома фага («праймирование» с помощью предсуществующего спейсера).

6. Ориентация вновь встраиваемых спейсеров зависит от ориентации предсуществующего спейсера, идентичного фрагменту геномной ДНК инфицирующего фага.

7. Для встраивания новых спейсеров в CRISPR кассеты Е. coli К12 необходим РАМ мотив AAG.

8. Продукты всех клеточных cas-генов необходимы для встраивания новых спейсеров в CRISPR кассеты Е. coli К12.

9. Cas3, по-видимому, является нуклеазой, разрезающей фаговую ДНК.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи

1. Pougach, К., Severinov, К.. Use of semi-quantitative Northern blot analysis to determine relative quantities of bacterial CRISPR transcripts. Molecular Methods in Microbiology: Bacterial Regulatory RNA. Humana Press. In press.

2. Pougach, K., Semenova, E., Bogdanova, E., Datsenko, K.A., Djordjevic, M., Wanner, B.L., Severinov, K. (2010). Transcription, processing and function of CRISPR cassettes in Escherichia coli. Mol Microbiol, 77(6), p. 1367-1379, 2010

Тезисы конференций

1. Pougach, К., E. Semenova, K. Datsenko, Severinov, K. (2011) Characterization of New CRISPR Spacer Acquisition Process in Escherichia coli. 11 l,b General Meeting American Society for Microbiology, May, 21-24, New Orleans, LA, USA, p.l 14

2. Semenova, E., Pougach, K., Severinov K. (2010) The use of bacteriophage M13 to study CRISPR/Cas function in E. coli. International meeting "3rd CRISPR Research Conference", July, 22-23, Berkley, CA, USA. p.l 1

3. Pougach, K., Severinov, K. (2009). Systematic analysis of CRISPR-cassette transcription and regulation in E. coli. International meeting "Regulatory RNA in prokaryotes", June, 3-6, 2009, Berlin, Germany, p. 147

Заказ №100-р Подписано в печать 24.10.2011 Тираж 70 экз. Усл. пл. 1,1

х ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

! 1 ^ ) / www. cfr.ru; e-mail: info@cfr. ru