Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость свойств синтетического актомиозина от условий его реконструкции

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Зависимость свойств синтетического актомиозина от условий его реконструкции"

- ,:"ч На правах рукописи

С& .с;--'

<г .л *

С1,

.ПЕРМЯКОВА Татьяна Владимировна

ЗАВИСИМОСТЬ СВОЙСТВ СИНТЕТИЧЕСКОГО АКТОМИОЗИНА ОТ УСЛОВИЙ ЕГО РЕКОНСТРУКЦИИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК 1ЯЭ7

Работа выполнена в Лаборатории биофизики клетки Института биологии моря ДВО РАН

Научный руководитель - д.б.н. Н.С.Шелудько

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор В.Ы.Колдаев кандидат биологических наук П.М.Надан

Ведущая организация

Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится "21" к 1997 г. в Ю час. на

заседании диссертационного совета та присуждению ученой степени кандидата биологических на"к К 003.30.03 при Институте автоматики и процессов управления ДВО РАН по адресу: 690041, г.Владивосток, ул.Радко, 6.

.о диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института -автоматики и процессов управления

Автореферат ра: эслан " Сгспл.^л.З^^А 1997 г.

Учений секретарь диссертационного совета

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем. В осново двигательной активности многих, биологических структур лежит взаимодействие сократительных Оожов гаозшш и актина. Механизм, регуляция и структурно-функциональная связь актш-шозинового взаимодействия изучаются при помогла ряда сократите льнах, моделей - остатков мышечных клеток, из которых в той или иной'степени изъяты компоненты, не имеющие непосредственного отношения к процессу сокращения. Наиболее простой моделью является синтетический (реконструированный) актошозпн - суспензионная сократительная модель, получаемая из отдельно выделенных и очищенных актина и миозина. Преимущество этой модели го сравнению о другими заключается в возможности варьирования ее состава и способа реконструкции.

Традиционно актошюзин (АМ) реконструируют смешиванием мономеркого «josiota и полимерного актина в среде с высокой ионной силой с последующим ее поншинием ("традиционный" актомиозш). Согласно данным световой и алектронвдй »шкроскопии "традиционный" актаягозин не содержит' типичных миозшовых нитей, его основу .составляют стреловидные структуры (Strselecka-Golaszewska, 1981). Другой, более слошнй и редко используемый, способ реконструкции актомиозина вклвчает .'предварительное ряздельное формирование миозиновых и актняоЕЫХ нитей о после;/щпм их соединением в среде с низкой конной силой ("шзкоионшй" ахтомиозин). в эт^м случае яктомнозий предстввляет собой комплекс параллельно ориентированных толстых миозшовых и тонких акгпновых нитей (Hayashi et al./ 1983), то есть его структура сходка со структурой актомиозина 1п viro. -Предварительное формирование элементов модели необходимо также при исследования сократительных систем, включающих сложна организованные толстые нити, как, например, в гладких мащах морских беспозвоночных. Однако физико-химические и функциональные свойства "ннзкоионкого" актогиозина практически не изучены, что затрудняет использование этой' модели' при исследовании механизма мышечного сокращения и регуляции актин-миозинового взаимодействия,

Цалп я задачи исследования. Целью работы являлось изучение физико-химических• и функциональных свойств синтетического актомиозина в связи -с условиями его реконструкции. Основными задачами работы были следующие:

I. Исследовать физико-химические свойства препаратов "традиционного" и "низкоионного"' актомиозина разного состава в

различных экспериментальных условиях.

2. Исследовать функцзюиэлыша свойства двух моделей посредством сопоставления изменений оптических параметров суспензия акгокаозипа при ого супарпрэципктащп! (СИЛ) к прссветлеши с соокштствумцгыи изменениями в ьлсал'.Оха актомнозиноша частиц.

Научная ксвнзаа ргбоиз. Впервые. в различных экспериментальных условиях исследованы (¡язшсо-хюичбскиз н функциональные свойства гаштетическог'о шсгсйзгозЕпа, получаемого как традиционно, так и из предсфэрмировашшх ехтиновых и миозпковых филакентов. Показано, что актсыгазлш, образованный разными способа®!, разлетается по физико-химическим свойствам - мутности, волновому экспоненту, среднему размеру октомаозаноаыг частиц и ш распределении по размерам. В условиях регистрации функциональной активности, обычно исгвмьзуемых в исследовательской практике, "традиционный" актомиознн на добавлоme ' MgAT® отвечает немедленной СПП, а "низкояоншй" екклсюзш - спонтанной СПП.

Впервые кинетика ыутностд суспензий синтетического aK'iOt.aiOSï2îa в гсдг его просветления и СПП сопоставлена с нзшнзнпяая среднего размера п распределения частиц еккжяозиыа по размерам. Показано, что ушиьзмш ыутности при просветлении по связано с изтпяшаи разборов частиц. Увэначета мутности при СПП сопровождается у&эньванием размеров частый в случае немедленной СПП и их увэ;аяэтг,1й:4 при сноптанной СПП. Предполагается, что причиной увеличения ыутности в обоих случаях является увеличение показателя гфелоулашш частиц: - пр-д нзыэдлэкной СПП в результате их сокращения, а при спонтанной СПП в результате образования упорядоченного кош; жса толстых и тонких нитей.

Научпо-праг-зачаскоо еиэчзезэ раб -та. Розультатц работ могут буть использованы при изучении ьгхешкма" и регуляции актин-миозинового взагиодэйствня в различных сократительных системах.

Апробщзп работа я пзйшкисяг. основные ' результаты работа были представлена на Всесоюзном бкофазичэском съезде (Москва, 1982), Всесоюзной конференция по морской биологии (Владивосток, 1982), Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии биологической подвижности (Тбилиси, 1987, 1990), Евегодных научных конференциях Иястнтута биология моря (Владивосток, 1992, 1993), Швдународаэм симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пувдно, 1994). Ьо теме диссертации опубликовано семь печатных работ в

соавторство.

Структура и объеи работа. Диссертация состоит из введения, четырех глав - обзор литературы (гл. I), материал и методика (гл. 2), результаты исследования п их. обсуждение (гл. 3 и 4), выводов и сшска литературы из 379 наимоковапий. Работа изложена на 242. страницах, машинописного текста (список литературы занимает 19 стр.). В диссертации 3 таблицы и 2В рисунков.

СОДЕРЗШШЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении приводится общая характеристика работа» изложены цель ь задачи исследования.

Глава I. Обгор .т.ггервтури

Глава I содержит вводный раздел,в котором отражена логика работы, и разделы: I.I. "Сократитечышэ модели", посвященный описанию основных сократительных моделей, реконструкции актомиозина, свойствам тропомнозина, как элемента системы Са2+-регуляции актин-мкозинового взаимодействия, 1.2. "Регистрация функциональной активности суспензионных сократительных моделей", 1.3. "Два типа сударпреципитации актомиозина", содержащий анализ механизмов немедленной и спонтанной супергг. ецишгггцки природного актомиозина. .

Глшвз 2. Иатарпал и штодггка

Получение препаратов. !йсзин, актш и тропоглюзкн выделяли из скелетных мышц кролика одновременно (Еелудько, 1978; Хайтлина, 1978). Модшдаация этого метода подробно описана в диссертации. Миозин получала также по методу Перри (Ferry, 1955), используя рекомендации А.Д.Тартаковского (Тартаковский, 1978). Состав препаратов сократительных белков контролировали с помоэью электрофореза в полигкршгамиднш' геле в присутствии додештсульфата натрия (Laemali, 197Q). Кокц0Нтр"идю белкя измеряли мнкробиуретовим методом (Itzhrilcl and'Gill, 1964).

Суспензии синтетического актомиозина готовил! двумя способами. "Традиционный" актомиозин (AM(ВИС)) - путем смешивания мономерного миозина и фибриллярного актина в среде с высокой ионной силой (0,5 М KCl) с последующим ее понижением до 75 мМ KCl

разбавлением. "Низкоиояный" актомиозин (АЫ(НИС) > - посредством сс эдинеюг предеформированных млозиновых нитей с фибриллярным актином в среде с низкой ионной силой (75 мМ KCl). Ыиозиновые нити готовили либо медленным понижением ионной силы растворов миозина посредством диализа, либо ее быстрым понижением путем разбавления. Отношение по массе шозина к актину в суспензиях актомиозина обычно составляло 2:1, а концентрация актомиозина - 0,25-0,3 мг/мл. При введении тропошззина в комплексы актомиозина соотношение белков по массе составляло - миозин:актин:тропомиозин = 2:1:0,5. Использовалась буферные растворы, содержащие 10-20 мМ трис-НСГши трис-малеат, pH 6,0 - 8,0. Препараты синтетического актомиозина маркировали таким образом: АМ(НИС)-7/£, что означает актомиозин, реконструированный в среде с низкой ионной силой при pH 7,0 и тестируемый при pH 8,0.

Перерастворение синтетического актомиозина в присутствии АТФ проводили следующим образом: повышали конную .силу в ранее приготовленных суспензиях от 75 кМ KCl. до 0,5 М KCl, добавляли I -2 ыМ MgATФ, выдерживали в течение часа при перемешивании, затем вновь поникали конную силу до 75 KCl.

Тестирование физжо-изготомаа свойств актошозина. Оптически характеристики суспензий: светопропускание (?), мутность (т), связанную с оптической плотностью (D) соотношением -х = 2,3 D/Ь (L - длина оптического пути кюветы), и зависимость г от длины волны (А) регистрировали споктрофотометра?л1 Specord М40 (Carl Zelea, ГДР) и Specol-11 (Carl Zeiss, ГДР). Волновой экспонент (п) вычисляли из соотношения п = -л (lgr)/A (IgA.) по наклону прямой зависимости lgD от IgA, (Кленин и др., : 1977). Сьносительная погрешность измерения оптической плотности и, соответственно, r„тностн и волнового экспонента составляет 2-3% (Кленин и Щрголев, 1977). Светорассеяние под углем 90° (1^) измеряли спектрофотометром Specol-11 с .приставками Т1 и Т1М1, мо дифэдированячми для одновременной регнетрацш проходящего и рассеянного света.

Средний размер частиц актомиозина и распределение его частиц по размерам определяли с помощью лазерного дифракционного анализатора размеров частиц 3600 Ее (Malvern, Англия). Прибор позволяет установить относительное распределение частиц по объему, величину, обратную светопролусканию, средний размер частиц, объемную концентрацию и удельную площадь поверхности. Оптический блок ,npi;3opa был модифицирован для дополнительного измерения

светорассаязгая гюд прямим углом. Относительная погрешность определения среднего разкера часищ составляет 4%.

"'сстгтрсзагяю (^етгггокядышж csoftora сгл-ожоснпа. Принято, что процессам мышечного сокращения л расслабления п случае суспензксюшх сокротитолкшх «одолей соответствуют оугирпроцкпЕтация (СПИ) и прссвотлсжэ сктогетозина (Sscnt-Gyorgyi, 1951; Splcer, 195?,). СШ, соглвсио ^ур&гдш.готр;гюскоку гзсту Збаии (Ebashl,.1961), сопровождается уполгченчем «упюстл суспензий, а просвотдошю - оо укеиьпошем. Кинетические крпшэ СПП я просветления позволяют 0т[рздэя!ть скорость и степень изменения мутности к таким образом судать о функциональных свойствах (механической активности) суспонзтошшх моделей.

Скорость и стопень СПП рассчитывали, исходя из соотношений: vcnn = 1/to б' гд0 Б " вРемя порзкодлого процесса, мерой которого явлпотся половина времени выхода кривой измекешш светорассеяния под углем 90° на плато; Scnn = (I0-IK)/IK, где: IQ исходная интенсивность светорассеяния, 1к - конечная интенсивность, соответствующая плато. Относительная погрошость определении скорости к степени СПП составляла 5-7%.

Запуск реакцкй СПП и просветления проводили добавлением к суспензиям а'стокчозииа небольших объемов концентрированных (0,1 М) растворов b'gATu> пр>: бастрог псряиепивании ьа магнитно}* мэавлке.

Глава 3. Оптичоетснэ' свойства и иехагогческая сгяивнос-«.й скюгетнческого акто:люзшгг сфоршфовшшого различии? споссбвт

Огшсешше в литературе кригже СПП актомиозшга мо:шо свостп к трем типам, соотоетствунякм немедленной СШ (быстрое одноступенчатое повышение мутности), спонтанной СПИ .(медленный рост мутности поело завершения фазы просЕэтленкя) и дауступенчатой СПП (рис. I). "Традиционный" ектомиозин в зависимости от условий среды способен как к немедленной, так и к спонтанной СШ.

Оказалось, что в тех условиях среда, когда "традиционный" актомиозин проявляет немедленную СПП, актомиозин ^¿изкоионный" реагирует по типу спонтанной СПП (рис. 2). При этом немедленная СПП "традиционного" Ali сопровождается уменьшением среднего размера частиц, тогда как при "СПП "низкоионного" AM.частицы увеличиваются (рис. 2). Следует отметить, что такие же ргмличия нами были обнаружены ранее для "традиционного" АН в условиях немедленно!! н спонтанной СШ (Шелудько и др., 1993). Таким образом, ь

общепринятых условиях тестирования "традшдонного" актомиозина, когда наблюдается немедленная СПП, актомиозин "низкоионный" проявляет спонтанную СПП и в основе этих реакций леаат разные изманения размера частиц суспензий актомиозина.

Рис. I Типичные кривые изменения мутности успензионных сократительных моделей при трех типах diu: немедленной (а), двуступенчатой (б) и спонтанной (в). Стражами указано время (t) добавления MgAT®.

Мутгэсть, см1

-1

о.» -- — и 0.Г

м ы

о.» 1 и ОД

«6 04

0.4

<0 од

o.t 1V__ до CJt

Л ^-г^ АМ(НИС) 1« «л

0 I. , 1 » А

>0 • to *э Время, мвв

J

Г

Размер частиц, иш

АМ(ВИС)

40 II « Ii Н

Время, мин

Рис. 2 Криие изменения мутности в среднего размера частиц при суперпреципитации "низкоионного". (АМ(НИС)) и " традиционного" (АМ(ВИС)) актомиозина. Концентрация МеАТФ - 0,2 Ш.

То, что вышеприведенные различия связаны именно со способом приготовления препаратов следует из экспериментов по их перерастварени» в среде с высокой ионной силой в присутствии МзАТФ. После такого, горерастворения "низкоионный" Ш превращается в "традиционные" - кривая его СШ меняется и становится типичной кривой немедленной СПП. По-видимому, пврерастворение, при котором происходит диссоциация ектомиозиношх связей и растворение

миозиновых агрегатов, приводит "низкоионный" АМ в состояние, соответствующее стартовому состоянию "традиционного" ш, и, тем самым, снимает различия между этими моделями.

Различное состояние миозина (мономорноэ или полимерное) при формировании актомиознна должно сказываться на образовании экто-миозиновых связей. Это подтверждается экспериментами- по влиянию тропомнозина на СПП "традиционного" и "низкоионного" актомиознна. Нами показано, что в одинаковых экспериментальных условиях присутствие тропоииозина в сохсратитольных моделях приводит к увеличению скорости СЯШ "традиционного" АМ и уменьшению скорости СПИ "пизксконного". Известно, что тропокиозин обеспечивает кооперативкость при взаимодействии молекул актина с головками шгооияа (Вгеаа! et а1., 1973). При этом степень активирования ели ' ингибзрования АТФазы актомяозина зависит от молярного отношения миозина к актину. При высоком отношении происходит активирование АТФазн, при низком - ингибировашю (БоМевгек, 1982). Это наводит но мысль о том, что комплексы "традиционного" и "низкоионного" актомиознна. содержат разное количество актомгсзнковых связей в пределах, функциональных единиц тонких нитей. В случав "кизкокониого" Ш акто-ииозиновых связей меньше и ото, по-вщщкому, является определяющей причиной их функциональных различий-.

Функциональным различиям ковду ""-рздас-октм" и ^тзкоиогаым" актогйозкном соответствуют различия в оптических свойствах данных суспензий-. На рис. 3 показаны значения оптической нло -ности суспензий! этих 'сол-злой, пр^гоговявЕЕНх при двух значениях рН среды (6,0 и 8,0) и затем измеренных при двух таток ке значениях р!1. Видно, что во всех случаях оптическая плотность "низкоионного" Еетомксакяа значительно рже. Поскольку удолькая оптическая плотность суснзнзнй актошозиковых частиц, прежде всего, определяется показателем преломления частиц (5Ие1и<Гко, КгорасЬета, 1996), уу подагзом, что более высокая оптическая плотность суспензий "шшоконного" АМ .обусловлена более плотной упаковкой чзстиц. Такой аэ кехашзм можэт лзяеть в основе зависимости оптической плотности суспензий АМ от рН среда (рис. 3). Известно, что понижение .рН ьпзывзет более тесное прилегание головок ккозина к стволу толстых нитей (НагПщ^оп, Иойзегз, 1984), что может приводить к образованию более плотных актомиозкновнх кошдоксов. Интересно отметить, что оптическая плотность суспензий синтетического актомкозина. в большей степени

определяемся значением рН, при котором вктоуйозш формируется, чем тем значением, при котором происходит измерение (рис. 3). Это указывает на способность . структура актоыиозшш "запоминать" условия своего формирования. В этой связи следует упомянуть о том, что свойства шапочных волокон, рагоризованшх пуи .различных рН» такаа -различштся и зги различия сохраняются при варьировании рН посла ригорязащга (Уе1г а!., 1987).

С данными по оптической плотности согласуются данные по волновому экспоненту „уснэнзиЛ. 'Для "еизкоеошшх" шдэлой ого значение лоиат в продолах 0,5-1,0, а для "трздида'сшшс" -1,0-1,2. Как известно (Е1ю1ис1'Ко, КгорасЗге7а, 1995), чем частица актомгсозина плсшзе, тем шшо волновой экспонент зга суспензии.

Оптическая плотность

рН ирЕГчзтовлэЕав/измервнад

Рис. 3 Оптическая плотность суспенаий "традиционного" (АЩВИС) ) и "шгако'кошого" (AM(ffiïC)) ак*окиоэгая. сформированного при рН 6,0 и 8,0 и измаранного ripa рН 6,0 к 8,0.

Различии между иэдоляке "традиционного'* и "низкоиокного" актошозинз сохраняется пря варьировании отношения миозина к актину в коишиксах (рас. 4). Кроме того, свойства данных моделей обнвруживаат различную зависимость от отношения миозяиа к актину при их оОрззованюа. С возрастанием содержания актина мутность суспензий "традиционного" актошо.зкна возрастает, а "шзкоконного" - падает. При этом в первом случае сродний размер частиц актошозша возрастает, а во втором - уменьшается (рис. 4). Это еще раз говорит о том, что структура данных вктомиозиновых моделей различна.

Глав.1 4. Сопостгвлагаш датауяся csrorssciaa свойств суспопзнй

синтетического актсдоозпт и pasuapimx харшяеристак ого частиц npi их образовании, супорпрещтитяцетг и просватлсшш

Образование актомиозияового комплекс» нутом смешивания прэдсфэршрованпнх нитей приводит к появлению в суспензии новых частиц и сопрововдается сильным возрастанием мутности, которое значительно превшдаот сумлу % суспензий смепгаваемнх миозгаювых и' актинонах нитей (рве. 5). Последующее добавление больших количеств MgAT® для диссоциации образовавшихся связей меяцу нитями лишь частично умоньиает <с (рис. 5). Из этого следуот, что первоначальное возрастание иутиости опрэделяется двумя причина!®: образованием сктомиозиновых связей и формированном собственно ^актомиозинових частиц. Первое согласуется с тем, что ассоциация ШОЭ5ШОЕОГО субфрагглэнта CI я Ф-эктина внзнвеот значительное усиление светорассеяния и мутностя раствора (Teal et 1., 1991). Таким озразом, оптические изменения в суспензиях ахтсмиозииа при его функционировании могут бнть связаны как с изменением во взаимодействии между нитями, так и с изменением самих частиц актомиозина.

Мощность, см

0.6

0.4

0,2

2 : 0.5

миозин : актин

2:0.5 2 : 1 2:2" миезин : октин

О

Рис. 4 ¡¿утность и средний размэр частиц в суспензиях "традиционного" (АМ(ВИС>) "нязкононного" (АМ(ШС)) актомиозина при различных соотношениях масси мг.озина и актина.

Частиы актомиозина, образованного из предеформпроааншп: штей, в рчеокой степега однородны по размерам (рис. Б, кривая

А+М), хотя сами нити этим на отличаются (рис. б, кривые А и М). Последнее согласуется с электронно-микроскопическими данными как для Ф-актина (Каиашга, Матчуата, 1970), так и для миозиновых нитей, полученных медленным разбавлением (Когейз, 1982). Следовательно, процесс образования "низкоионной" модели не сводится только к соединению толстых и тонких нитей посредством замыкания миозиновых мостиков, он включает также реорганизацию структуры частиц.

Мутность, см 0,6

R4

0,2

Г-

Размер

частиц, МШ Отхобигалькый

60

О-^О-гО-

1

Ш

£

во

-»и

О- 20 40__SO__80 100

Бремя, мин

IM —X

М+А ¿-Л-

М-»А»А „sJ V а

Лн/ ч. «

ю ш

№»«(!< кеатиц, иш

Рис. Б образованна ектогжшина в среде с низкой конной силой и его просветленна.

Слева: Изменение мутности и среднего размера частиц в суспензии миозиновых нитей при последовательном добавлении трех порций Ф-ектика до отнонения массы миозина к массе ектана 2:0,6; 2:1 и 2:2 (стрелки). Последующее просветление вызвано добавлением 4 мМ Mgärä ШоМая стрелка). На кривой мутности отаачоны момента времени, для кочорах определялось распределение частиц по размерам (I-G). Прорышстой яшжа указана сумгла скачений мутности препаратов шогшновшс к актшэвых шкей, используа«* для образованна АМ(НКС) (ty+ ад).

Ощзва: Распределения частиц по разызрам в исходных препаратах актша (А) к шюзшга (М), их комплексов (М+А, м+А+А, M+A+A-tA) к в просветленном ттомиозкко (+J,!gAT®). Hjs$pu (1-5) соответствуют нумерации точек на кривой ■ мутности, концентрация суспензии толстых нитей - ОД ur/ш. По условиям образования и тестирования данный актомшзкн соответствует препарату АМ(ШС)-7/7.

Просветление . суспензии аэтшкозина, сопровождающееся уменьшением оптической плотности, соответствует, как принято считать (5р1сег, 1952),' расслаблений мышечного волокна. В случае синтетического. ехлмиозина такое состояние суспензии наступает при

добавлении высоких концентраций MgAT®. В результате диссоциации актомиозиновых связей частицы актомиозина постепенно распадаются, однако скорость . уменьшения их размеров намного меньше, чем скорость изменения т. К тому времени, когда изменения % уже завериены, средний размер частиц изменяется незначительно, а распределение частиц по размерам остается практически прежним (рис. б, кривая +MgAM). Возникает вопрос, каким образом сохраняются частицы при отсутствии "сшивок" между нитями? Мы полагаем, что это .может быть связано либо с "инерционностью" структуры гидратированных частиц, либо с наличием слабосвязанных мостиков (Granzier, Wang, 1993).

Динамика распада частиц "традиционного" и "низкоионного" актомиозина при просветлении различна. В шрвом случае образуется несколько типов однородных по размеру частиц. Во втором случав имеется, в конечном счете, только два типа частиц, которые соответствуют, по-видимому, толстым и тонким нитям. Различия в распаде частиц ш связываем с различиями в структуре комплексов. "Традиционный" актомиознн, ' в отличие от актомиозина "низкоионного", не содержит ыиозиновах нитей (Straelecka-Golaazewaka et al., .1981).' Нити миозина в этом случае образуется в фазе просветления после распада структур типа "нвконачншш стрел" и по маре исчерпания АТФ начинают взаимодействовать с тонкими нитями (Нопошга, Ebashl, 19Т4; ¿Ïgashi-Fujime, 1985). Очевидно, что именно это взаимодействие приводит к обнаруженному нами образованна и росту актошозлнових частиц пря спонтанной СПИ как "традиционного", так и "низкоионного" M (ряс. 2). Тйким образом, механизмы спонтанной СПП обеих моделей одинаковы, различия, касаются лишь фазы просветления: в случвэ. "низхоионного" Ali толстые нити существуют исходно, а в случав "традиционного" АМ они образуются после распада первоначальных частиц. Различия же в условиях среды, Необходимых для развития спонтанной СПП данных моделей,; связаны с более легкой диссоциацией "низкоионного" АН, например, при более низких концентрациях Mg&T®, что определяется, то всей вероятности, меньшим количеством акто-миозиновых, связей.

В присутствии очень низких концентраций MgAT® "низкоионный" АМ все же способен к немедленной СПП, хотя в общепринятых условиях регистрации его СПП, в отличие от "традиционного" Ш, всегда спонтанна, тем не менее, сравнение кинетики мутности суспензий, среднего размера частиц, их объемной концентрации и удельной площади поверхности, а также сравнение распределения частиц по

- и -

размерам в ходе СПП "традиционного" и "шзкшошюро" Л»? при добавлении низких концэнтршшй MgAT® (рис. 6)- показало

о,в 0.6 0,4. 0,2

60 40

го

0.04

:с,оэ

v,v2 0.01

<U

0.С5 О

Мутность, см' ОШСеИТгЛЬИЫЙ ©Ъвй;%. 5

1

о—/

— АМ(НИС)—8/0 АМ(ВИС)-8/8

i Размер частиц,мкм

Объемккощ.,*

р Уе.плац.поЬерх.

/ \

о 24 . _§__»о

; Время, мин

^ AMCBtiqi

I ■ лк.

S , t i , л,

• 1 1 ■ t i -■ i ^

1 to 1М 1 15 100

Pssasp частиц, в

Рис. 6 Измеьэкиа свойств суспензий "традциокного" (/иМ(ВИС)-8/8) и "низкозюнногс" ЦМ(ШС)-8/8) актомиозина в условиях немедленней СПП.

Слеп: Кинетические кривые мутности, среднего размера частиц, объемюй концентрации и удельной площади поверхности. Стрелками указано время добавления 0,05 мМ МдЛТФ. Точками на кривой мутности отмечены моменты времени, для которых определялось распределзние частиц по размерам (1-6).

Справа: Распределения частиц по размерам в препаратах "традиционного" и "низкоионного" актомиозина на различных стадиях спп, соответствующих точкам на кривой мутности.

существование различий в механизме этих процессов. В обоих случаях происходит умо.таенио среднего размера частиц, однако для

"низкоионннх" л моделей это уменьаение менее значительно и набор возникающих частиц меньше. Такке, в случае "низкоионной" модели а?дшштуда изменений всех регистрируемых параметров меньше, и значения этих параметров по завершении СПП возвращаются практически к исходным значениям. Более того, повторное добавление !.'ЗАТФ к суспензии суперпроциштировавшого "низкоионяого" М виснвает просветление с последующей спонтанной СПП. В то твд время-"традиционный" А11 на повторное добавление Мз&ТФ не реагирует. Эти наблюдения наводят на мысль о том, что в основе СПП синтетического актомиозина, собранного нз предсформированннх нитей, лежит пэ сокращение частиц, как в случав "традиционного" актомиозина, а скорее их реорганизация на основа диссоциации, ассоциации и сколыхзния нитей.

• Таким образом, немедленная СПП сравниваемых моделей протекает различным образом, несмотря на одинаковый формальный признак -увеличение мутности суспензий при добавлении' М£ЛТФ. Немедленная. СПП "традиционного" АМ приводит к изотропному сокращению актомиозиновых частиц, что, хотя и не мокет быть связано с Явно выраженным сколыкэнием миозиновых и акттювых нитей, тем пе менее, отражает механическую активность модели. Условия,• в которых "низкоиошшй" АМ был бн сйособен проявлять такую активность, наш не обнаружены. Однако эта модель мояет быть полезной при изучении влияния регуляторных белков на взаимодействие нзтившх или реконструированных'толстых и тонких нитей.

ШВОЛЫ

I. Актомиозиновые годели, полученные понижением ионной силы раствора актомиозина (."традиционный" актомяозип) и собранные из щвдсфориировашшх гягозиновых и- актинонах фаламантоз ("нигкоконный" актомиознн!,' имеют различные физико-химические свойства:

суспензии "низкояонного" актомиозина по сравнении с суспензия?.!!! "градационного" актомиозина обладают большей удельной мутностью и меньшим волновым экспонентом;

частицы "низкоионного" актомиозина в отличие от частиц "традиционного" актомиозина значительно более однородны по размерам, несмотря на готерогешгасть исходных, ггашовых и миозиновых ■ нитей;

зависимость мутности и среднего размера актомиозиновых частиц

от отношения миозина к актину в препаратах "традиционого" и "низкоионного" актомиозина различна: с увеличением содержания актина мутность и' средний размер часткц в первом случае возрастают, а во втором случае - уменьшаются.

Предполагается, что эти различия связаны с большей плотностью частиц "низкоионного" актошюзина, что является следствие его более упорядоченной организация.

2. Функциональные свойства "традиционного" и "низкоионного" актошо'зина таете различаются:

"расслабление" (просветление) обеих моделей сопровозздвется уменьшением мутности суспензий и распадом актомиозиновых частиц. Однако набор образующихся частиц для "традиционного" и "низкоионного рктожозкна различен. Скорость просветления в обоих случаях значительно превышает скорость распада частиц;

"сокращение" (СПП) в общепринятых условиях регистрации происходит в виде немедленной СПП для "традиционно1'о" актомиозика и в виде спонтанной СПП для "низкоионного" актомиозина. В первом случае повышение мутности сопровождается уменьшением среднего размера част;гд, 2 во втором случае - их увеличением.

Таким .образом, в основе СПП синтетического, актомиозина, собранного из предеформированных нитей, лежит не сокращение частиц, как в случае "традиционного" актомиозина, а их реорганизация на основе диссоциации, ассоциации и скольжения нитей.

3. "Низкоконный" актомкозш, в отличие от "традиционного", ке обладает механической активностью, отражающей сокращение мышечных клеток и высокоорганизованных сократительных моделей. Однако он полезен при исследовании взаимодействия нативных к реконструированных толстых к тонких нитей различных сократительных систем.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пермякова, Т.В., Шелудько, Н.С. Зависимость свойств искусственных сохфатителышх моделей от способа их получения //Тез. докл. 2 Всес. конфер. по морской биол., Владивосток, 1982а, Т.2, С.99.

2. Пермякова, Т.В., Шелудько, Н.С. Влияние условий реконструкции актомиозина на его суперпреципитацию //Тез. докл. I Всес. биофиз. сызда, М., 19026, Т.2, С.36.

3. Корчагин, В.П., Промзшгер, Н.К., Пермякова, Т.В., Шелудько, Н.С. Особенности сократительной активности мио£ибрилл и актомиозина из косоисчорченнсЗ части аддуктора устрица Crasoootrea glga3 У/Та п. докл. Я Всас. еимп. оио$пз. и биохкм. биолог, подвтаотости, Тбилиси, 1987, С.73-74.

4. Пермякова, Т.В., Шадудько, Н.С. Зависимость формы' кинетических кривых супэрпрецппитащм синтетического актомиозина о? условий его образования и тестирования //Тез. докл. 9 Все с. СКМП. бИОфНЗ. И бИОХЯМ. биолог, подвтиости, Тбилиси, 19Э0, С.23,

5. Молудьхо, Н.С., Кропачова, II.В., Пармяиоза, Т.В. Изменение ресморэ частиц в суспензиях ектоккозина в процессе суперпрешшитацил // Епохимкя, IS93, Т.58, 11.12, C.I936-I944.

6. Шзлудьио, Н.С., Поргшковб, Т.В., Кропачова, Н.Э., Юдин. Ю.К. Образование я распад актогаогшошх частиц //Тэз. докл. мэяцунар. скзш. "Биолог, подвижность", Пудано, 1С 34, С.68.

7. Шэлудько, U.C., Гикупсв, Б.А., Кропачова, И.В., Пермякова, Г.В., Один, ю.К. Механизм двустадкЯнсй ккпотикн супарпрецяшта'циг актогстозляа //йхфжко. 1994, Т.39, И.З. С.418-422.