Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость мутагенной активности полициклических ароматических соединений от их структуры

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Зависимость мутагенной активности полициклических ароматических соединений от их структуры"

институт общей генетики им. н.и. вавилова российской академии наук

11 На правах рукописи

удк 575.224:579.842.14

ЛЮБИМОВА Ирина Константиновна

ЗАВИСИМОСТЬ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИЦНКЛИЧЕСКЙХ АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ОТ ИХ СТРУКТУРЫ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в секторе зколого-генетических исследований Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленные микроорганизмов

Научный руководитель: кандидат биологических наук С.К. Абилев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.А. Тарасов

кандидат физико-технических наук В.В. Поройш

Ведущая организация: Московский государственный университет иы. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "_" _ 1994 г. в ;_

.часов на еаседании специализированного Ученого Совета ДСЮ2.49.01 пр1 КОГен им. Н.К. Вавилова РАН по адресу: 117809, Москва, ул. Губкина.

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан "_" __ 1994 г.

.. Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Полухина Г.Н.

Актуальность проблемы. Все возрастающее количество ксенобиотиков окружающей среде и их отрицательное воздействие на человека требует шенения краткосрочных тестов для анализа биологической активности. :ты на канцерогенность долгосрочны, дороги и результаты этих тестов шсят от большого числа факторов, влияющих на эксперимент. Существу-ая корреляция между мутагенными и канцерогенными свойствами вещества соло 80% канцерогенов являются мутагенами) создает предпосылку для зтраполяции на канцерогенный потенциал соединения данных, полученных ;пресс-методом Эймса. Такой подход требует детального знания путей этрансформации данного класса соединений в про- и эукариотической этке и влияния структурных особенностей молекулы на мутагенную ак-вность.

■ Наиболее сильные мутагены и канцерогены обнаружены среди нитропо-циклических ароматических соединений (нитро-ПАС), образующихся в ре-льтате неполного сгорания топлива. Хотя для этого класса соединений вестна биологически активная группа, отвечающая за мутагенные и кан-рогенные свойства (N02), остается открытым вопрос о влиянии на нее /гих заместителей в молекуле, а также о метаболизме этих соединений клетке.

Создание и расширение банка данных по взаимосвязи структура-ак-вность в классе ПАС и нитро-ПАС на основе их мутагенных свойств поз-ляет решить задачу внезксперименталъного прогноза мутагенной актив-сти вновь синтезируемых или неисследовавпшхся ранее соединении.

Цель работы. Конечной цель» настоящей работы являлось создание личественной модели структура-активность для внезксперименталъного огноза мутагенной активности ароматических соединений.

Задачи исследования: Изучение влияния на мутагенную активность заместителей различного, типа и их позиции в молекулах производных бифенила (ВФ), флуоренона (Ф), фенантренхииона (<ЕХ), пирена (Л), гетероциклических аналогов пирена (ГАП) и фенантрена (ГАФ).

Изучение влияния на мутагенную активность резонансного и индукционного эффекта заместителей в молекулах с конденсированными ароматическими кольцами.

Оценка вклада в мутагенную активность основного механизма восстановления нитрогруппы ("классической" нитроредуктазой) в молекулах нитро-ПАС.

Изучение влияния плазмидных генов тисАВ, кодирующих гены ошибочной

репарации, на частоту индукции мутаций замены пар оснований и сд! га ранки, считывания молекулами нитро-ПАС. б. Построение количественных моделей для внеэкспериментального проп за мутагенной активности полициклических ароматических соединенм

Новизна и практическая ценность работы. Исследовано влияние г местителей различного типа (нитро-, амино-, карбонильных, слсяшоэф! ных, амвдных, ацетил-, ацетиламино- групп) на мутагенную активное молекул с неконденсированными (производные БФ) и конденсированш ароматическими кольцами (производные Ф, ФХ, П, ГАП, ГАФ). Выдел< структурные фрагменты производных БФ и Ф, коррелирующие с мутагеш активностью и стабилизирующие пленарную конформацию их молекул.

Показано, что пара- положение нигрогруппы ответственно за появ; ние мутагенных свойств у исследованных соединений. Для нитропроизве ных ФХ, <5, ацетилпирена (АиП), ацетиламкнопирена (АцАП) и ГАП устанс лено, что влияние на мутагенную активность заместителей в пара- noj жении молекул с конденсированными кольцами связано с резонансным и i Аукционным эффектом. При этом карбоксильная группа способна bhoci больший вклад, чем нитрогруппа, в индукционное воздействие на дру] пара- нитрогруппу.

Получены штаммы Salmonella typhimurium TA98Nf и TAlOONf, дефе! ные по "классической" нитроредуктазе. С их помощью показано, что ме: низм метаболической активации нитропроизводных Ф, ФХ, ГАП различе: штаммах S. typhimurium ТА98 и ТА100 и зависит от структурных особен» тей молекулы.

Показано, что плазмидные гены mucAB, независимо от строения ci динения, увеличивают частоту индукции мутаций замены пар основан: Влияние шсА8 на индукцию мутаций типа сдвига рамки считывания вави< от структурных особенностей молекулы и может сильно варьирова1 уменьшая или увеличивая частоту индукции мутаций этого типа.

Впервие построены количественные модели зависимости мутаген: активности от структуры с помощью программных комплексов "Эмма" С фективное Моделирование Молекулярной Активности) и "NASA" (Neu: Approach to Structure-Activity), которые могут быть рекомендованы ; внеэкспериментального прогноза мутагенной активности подицикличес ароматических соединений.

Отруктура работы. Диссертация состоит из введения, обзора лите туры, экспериментальной части, обсуждения и выводов. Материал изло

на _ страницах машинописного текста, включает 14 рисунков, 14 таб

Список использованной литературы состоит из 130 наименований.

- з -

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были яоюяены' научной конференции НЖГенетика (1903), на семмкаре отдела генетики ИГенетика (1994), на семинаре лаборатории изменчивости генома ЙОРен . Н.И. Вавилова РАН (1994).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ КСОЕЕДОВАНИЙ.

Бактериальные штаммы. В работе были кспольвовани ilmonella typhlmurium TAI535, ТА100, TA1537, TAS7, ТА1БЗЗ» ?Aß8, юнструкрованкые в .лаборатории Этса (Уккзерскгет Беркли, Калифорния, !А) из исходного штамма S. typfiimur^ym LT-2 дикого ?кпа, и TAS8Nf я ilOONf, полученные з работе. Генотипы кспольвовакных штаиусз кркведе-i в табл. 1. Наличие мутагенного эффекта у ксогэдуешх соединений штывали по индукции ими обратных мутаций (реверсхй) к прототрофяооти j гистидину (his- - hls+)-

Таблица 1. Генотипа тест-птгшоз S. typhinuriira.

Штамм Характеристика Источник

ГAl535 hlsG46, rfa. uvrB Получен от Эймса

ГА100 hisG46, rfa, uvrB, pKMíQl

TAI537 hisC3D76, rfa. uvrB -8-8-

ТА97 hlsD66íO, rfa, uvrB, pKMIOl -й-й-

TAI538 hlsD3052, rfa, uvrB -й-й-

ТА93 hisD3052, rfa, uvrB, pKMIOl -8-8-

TA98Nf hisD3052, rfa, uvrB, nf. pKMIOl Получен з работе

TAlOONf hlsS46f rfa, uvrB, nf» pKMIOl -8-8-

Среды. В качестве полноценной среды для бактерий использовали мдкий или агаризованный мясо-пептонный бульон (производство НИКЕМ им. I.Ф.Гамалеи). Селекцию ревертантов проводили на минимальной среде дамса (Миллер, 1976).

Химические соединения. В работе использованы реактивы отеуествен-юго производства марки "ч.д.а.", "х.ч.", "о.с.ч." и импортные: "Sigma Chemical Со." (США), "Finca" (Швейцария)", "Serva" (Германия)". Исследуемые соединения: производные БФ, Ф, Ш и ГАП были .синтезированы Г.И. Лигачевым. Производные АцП и АцАЛ синтезированы М.. Абдразаковым (ОНД 3АМН).

Программный комплекс. Для построения количественной модели аки ности использовались разработанные на химическом факультете МГУ пр< раммные комплексы "ЭММА" (Эффективное Моделирование Молекулярной i тивности), предназначенный для исследований в рамках линейной регр< сионной модели, и "NASA" (Neural Approach to Structure-Activit) предназначенный для проведения аналогичных исследовании в рамках ме-дологии искусственных нейронных сетей (Баскин Й.И., Палюлин В.A., ai демик Зефиров Н.С., ДАН, 1993, Т.332, N6, С.713-716).

Методы исследования. Учет генных мутаций в клетках S.typhimurii индуцированных исследуемыми химическими соединениями, проводили по i дифицированному методу Эймса, чашечный тест (Ames et al.. 1973).

Построение количественных моделей для предсказания мутагенной i тивности осуществлялось на основе квантовохимических дескрилторс рассчитанных по методу Хюккеля (Польман В., Пвльиан А., 1965), и пс структурных дескрипторов, отобранных в программном комплексе "2*ша" представляющих собой фрагменты структуры, наилучшим образом коррелщ щие с мутагенной активностью, . logP (гидрофобность) рассчитывалась методу Реккера (Rekker R., Mannhold R., 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ЗАВИСИМОСТЬ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИПРОИЗВОДНЫХ БИФЕНИЛА ОТ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ.

Было неучено влияние нитро-, амидной, карбонильной, слолшоэфир? групп на мутагенную активность БФ в бесплазмидных штаммах: ТА1535, f гистрирующем мутации замены пар оснований и TAI538, регистрирующем ь тации сдвига рамки. Соединения этого ряда не индуцировали мутаций г мены пар оснований в TAI535.

Сокращенное назв. Полное название

2-Н-2'-КБФ 2-нитро-2'-карбоксибифенил

2,2'-ДКБФ 2,2'-дикарбоксибифенил

2-К-2'-АдБФ 2-карбокси-2'-амид бифенила

2,2'-ДАдБФ 2,2'-диамид бифенила

6-Н-2,2'-ДКБФ 6-нитро-2,2'-дикарбоксибифенил

6,6'-ДН-2,2'- 6,6'-динитро-2,2'-дикарбоксибифену

ДКБФ

5,5'- ДБ-2,2'- 5,5'-дибром-2,2'-дикарбоксибифенил ДКБФ

4-НБФ 4-нитробифенил

4-Н-2'-КБФ 4-нитро-2*-карбоксибифенил

4,4'-ДН-2'-КБФ 4,4'-динитро-2'-карбоксибифенил

4,4 ' - ДН-2.2 ' - 4,4' - динитро-2,2 ' -дикарбоксибифенил ДКБФ

4,4'-ДН-2,2'- 4,4'-диннтро-2,2,-доальдегид

ДАлВФ бифенила

2,4,4'-ТН- 2,4,4'-тринитро-2'-карбоксибифенил 2'-КБФ

2,4,4'-ТН- 2,4,4'-тринитрс-2',6-дикарбокси-

2',6-ДКЕ5 бифенйл

2,4,2',4'-ТН*~ 2,4,2',4*-тетранитро-б,б'-ди-

6,б'-ДКБ® карбоксибифенил

2,4,2',4'-ТН*- 2,4,2 ', 4 ' - ТН*- 6,6' - диметиювый Ефир

б.б'-ДМЭБФ бифенила

2,2',4'-ТН- 2,2',4'-тринитро-4-амино-6,6'-

4-А-б,6'-ДКБФ дикарбоксибифенил

2,4,2',4'-ТН*~ 2,4,2'»4'-тетранитро-6-карбокси-

б-К-б'-АдБФ б'-ачид бифенила

2,4,2',4'-ТН*- 2,4,2',4'-тетранитро-б,6'-диамид

б,б'-ДАдБФ бифенила

2,4,б-ТН- ,2,4,6-тринитро-2',4',б'-три-

2',4',б'-ТКБФ карбоксибифенил

2,4,б,2'-ТН*~ 2,4,6,2'-тетранитро-4',6'-ди-

4',б*-ДКВФ карбоксибифенил

2-НФ-5-КК 2-нитрофлуоренон-5-карбоновая к-та

2.7-ДНФ-5-КК 2,7-динлтрофлуоренон-5-карбоновая к-та

2.7-ДНФ-5-КА 2,7-динитрофлуоренон-5-амид карбо-новой к-ты

2-НФ-5.7-ДКК 21нитрофяуоренрн-5,7-дикарбоновая к-та

2,4-динитрофлуоренон-5,7-дикарбо-новая к-та

2,4-ДНФ-5,7-ДКК

ФХ 2-НФХ

фенантренхинон 2-нитрофенантренхинон

- 6 -

3-НФХ 3-нитрофенантренхинон

2,7-ДНФХ ■ 2,7-динитрофенантренхинон

2,3,7-ТНФХ 2,3,7-тринитрофенантренхююн

1-Ац-З-НП 1-ацетил-З-нитропирен

1-АЦгб-НП 1-ацегид-б-нитропирен

1-АцА-б-НП 1-ацетил аышю-6-нитропирен

1-АЦ-8-НП 1-ацетил-8-нитропирен

1-АЦА-8-НП 1 - ацетиламино-8-нитропирен

2,7-диШ2-4- 2,7-дкамино-4-карбокси-9-оксо-

СООН-ОА® 10-окси-Ю-азафенантрен

2,7-ДИШ2-4- 2,7-диамино-4-карбойси-9-оксо-

СООН-АФ 10-азафенантрен

2-NH2-5,7-rtM- 2-ашно-5,7-дикарбокси-9-оксо-

СООН-ОАФ 10-окси-10-азафенантрен ■

2-NHO-7-C00H- 2-амино-7-карбокси-9-оксо-10-

ОАЗОд азафенантрен оксид

дтдп

2,7-диОН-ДТДП

2,7-диВг-ДТДП

2,7-диШ2-ДТДП

2,7-ди>1НАц-ДТД11

1,6-диШ2-ДТДП

2-NH2-7-COOH-ДТДП

1,6-диМ02-ДТДП 1,3,6,8-тегра-

NO2-ZTODI

1,3,6,8-тегра-НН2-ДТДП-С. '

5,10-диоксо-4,5,9,Ю-тетрагидро-4,9-диазалирен

2,7-диокси- 5, Ю-диоксо-4,5,9,10-тетрагвдро-4,9-диазапирен 2,7-ДИбром- 5, Ю-диоксо-4,5,9,10-тетрагвдро-4,9-диазапирен 2,7-диамино-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетраг идро-4,9-диазапирен 2,7-диацетил амин 0-5, Ю-диоксо-4, Б 9, Ю- тетрагидро-4,9-диазапирен 1,6-диамино-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен 2-ашно-7-карбокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапире 1,6-динитро-5, Ю-диоксо-4, б, 9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен 1,3,6,8-тетранитро-5,10-диоксо-4,5,9, Ю-тетрагидро-4,9-диазапире 1,3,6,8-тетраамино-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапире

- 7 -

сульфат

1,3,6,8-тетра- 1, и, 6,8-тетраашшо- 5,10-диоксо ШАл -ДТДП ■ 4,5.9,10-тетрагчдро-4,9-диазапирен

4,9-диокси-5,10-ДИ0КС0-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен

2.4.7.9- тетраокси-5,10-диоксо-

4.5.9.10-тетрагидро-4,9-диазапирен 2,7-дииод-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-дказапирен 2. ^гДихлор-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,Ю-тетрагидро-4,9-диазапирен 2,7- диамино- 4,9- диокси-5,10- дйоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен 2,7-диамина-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен диацетат

2,7-динитро-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен 2-адано-7-карбокси-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен

2,7-динитро-5, Ю-диоксо-4,9-диокса-пирен

Рис. 1. Структурные1 формулы и названия исследуемых соединений

Исследуемые БФ были разбиты на две группы (рис.1). I группа включала 7 соединений, не содержащих заместителей в 4,4'положениях. Анализ структурных характеристик соединений 1-ой группы показал, что при отсутствии заместителя в пара- положении заместители в Других положениях не вызывают появления у молекулы БФ мутагенных свойств.

П-я группа производных БФ (рис.1, табл.2) включала в себя 14 замещенных БФ, при этом в пара- положении находились электроно-акцепторные группы N02 или СООН.

ДЦТДП 2,7- дяШ- ДЦТ ДИ 2,7-ди1-ДЦШ 2,7-диС1-ДЯТДИ

ОНО)

2;7-ДИШ2-ддтдп-а

2,7-Дико2-дадп г-Шг-7-соон-

дадп

9 !сЛ

(Р)-(о) 2,7-диШ2-ДЦП

Таблица 2. Количество ревертантов, индуцированных производными бифенила 11-ой группы. ;

Доза, нмоль/чашку

оеще^тви - -0 1,5 3 7,5 15 3(

4-НБФ 12 35 35 17 30 30

4-Н-2'-КБФ 20 16 19 20 14

4,4'-ДН-2'-КБ® 24 28 38 35 58

4,4'-ДН-2,2'-ДКБФ 25 26 21 35 14

4,4'-ДН-2,2'-ДАл1БФ 183 346 880 1672 3250

2,4,4'-ТН-2'-КБ® 826 1290 2559 3782 4460

2,4,4'-ТН-2',6-ДКБФ 112 152 395 634 1156

2,4,2',4'-ТНЙ-6.6'-ДКВФ 302 ' 557 1139 2604 4096

2,4,2',4'-ТН*-6.6'-ДМЭБФ 87 180 485 663 1655

4-А-2,2',4'-ТН-6,6'-ДКБф. 277 509 1040 1995' 3116

2,4.2' ,4'-ТН<г-б-К-6'-АдБФ 2213 2600 4233 4985 8467

2,4,2',4'-ТН*-6,6'-ДАдБФ 270 503 827 1620 2676

2,4,6-ТН-2',4',6'-ТКБФ 50 50 95 160 280

2,4,6,2'-ТН*-4\6'-ДКБФ 410 800 1800 3000 5000

4 соединения из этой • группы не имеют мутагенной активности .4-НБФ; 4-Н-2'-КБФ; 4,4'-ДН-2'-КБФ и 4,4'-ДН-2,2'-ДКБФ. Все они, кро! 4-НБФ, имеют орто- заместителя (в данном случае СООН), который мох усиливать вращение колец вокруг связи С-С и препятствовать взаимодей твию с ДНК и нитроредуктазой. 4-НБФ, не имеющий орто- заместителя неактивный в ТА1538, индуцирует мутации сдвига рамки считывания и з. мены пар оснований в ТА98 и в ТА100, т. е., б присутствии плазмидк генов шисАВ, кодирующих ферменты ошибочной репарации (Н1гауаша Т. а1.. 1986).

Остальные тринитро- и тетранитро- замещенные БФ являются сильны мутагенами в ТА1538, хотя и имеют в орто- положении N02 или СООН. Ц этом, как видно из данных табл.2, резонансный и индукционный эффек электроно-акцепторных (N02, СООН) и электроно-донорных групп (ИНг) пара- ♦положении не влияют на мутагенную активность тетра- и более з мещекных БФ. Сравнение 2,4,2',4'-ТН*-6,6'-ДКБФ и 4-А-2,2*,4 ТН-6,6'-ДКБФ показывает - их мутагенная активность практически один кова, хотя в одной молекуле в 4-ом положении находится электроно-д

- 9 - •

норная Шг группа, а в другой эле ггроно-акцепторная N02 группа. Из сравнения мутагенной активности 2,4,6-ТН-2',4',6'-ТКБФ и 2,4,6,2'-ТН*-4',6'- ДКБФ следует, что при наличии в пара- положении в этих молекулах N02 и С00Н, замена в положении 2' СООН на близкую ей по электроно-акцепторным- свойствам N02 приводит к резкому (на порядок) увеличению мутагенной активности.

Для тетранитро- замещенных БФ более вероятным является другой механизм активации молекул. Возможно, 2,4,2',4'- и 2,4,2',6'-ТН*ЕФ, имею щие непланарную конформацию могут восстанавливаться в пданарный бен-зоСсЗциннолин. При этом, пара- N02 группы в молекуле тетразамещенных БФ являются необходимыми для проявления его мутагенных свойств. К подобному типу активации молекул можно отнести следующие соединения из числа исследованных (табл. 2): 2,4,2',4'-ТН*-6,б'-ДКБФ; 2,4,2',4'-ТН*-6,6'-ДМЭБФ; 4-А-2.2',4'-ТН-6,6'-ДКБФ; 2,4,2',4'-ТН*-6-К-6'-АдБФ; 2,4,2' ,4'-ТН*-6,6'-ДАдБФ; 2,4,6,2'-ТН*-4',б'-ДКБФ.

Эти соединения показали высокий и приблизительно одинаковый уровень мутагенной активности в ГА1538. Косвенным подтверждением сущест-. вования активного метаболита типа нитро-бензо[с]вдннолин-6-оксида служит сравнение мутагенной . активности 2,4,б,2'-ТН*-4,6'-ДКБФ и 2,4,6-ТН-2*,4*,б'-ТКБФ. 2,4,б,2'-?Н*-4,6'- ДКБФ, способный к образованию такого метаболита приблизительно в 20 раз активнее, чем 2,4,б-ТН-2*,4',б'-ТКБФ, неспособный к его образованию. Колебания активности внутри подгруппы этих соединений могут быть связаны со стери-ческими факторами.

2. ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРА-МУТАГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ФЛУОРЕНОНА И ФЕНАНТРЕНХИНОНА.

2.1. Были изучены мутагенные свойства 5 нитропроизводных Ф и 5 нитропроизводных Ф'-' (рис.1). Из 10 исследованных соединений два: ФХ и 3-НФХ - не индуцировали мутаций ни в бесплазмидных штаммах ЭЛурМяияЧит ТА1535 и ТА1538, ни в их плазмидных аналогах ТА1С0, ТА98, в то время как 2-НФХ высокоактивен в ТА98, ТА100. Полученные данные показывают: во-первых, мутагенная активность ФХ коррелирует с наличием нитрогруппы, во-вторых, что механизм связывания с ДНК НФХ сходен с таковым для НФ. В молекуле 2-НФХ нитро- и карбонильная группы находятся по одну сторону молекулы - он является сильным мутагеном, в молекуле же 3-НФХ эти группы разъединены, поэтому, связывание восстановленной нитрогруппы с атомом С-8 гуанина и карбонильной группы с аминогруппой цитозина, (делеция Г-Ц пары из монотонно повторяющейся последовательности) становится невозможной - молекула 3-НФХ неактивна.

Колочоетпю Bete* рсал^иштоа^ *

|«Ю 1Ш «ШС9 «осо

«ИЗ

s-iat

Z4-

ДНФ-дкк

дом s шг/ч; дм 2.7-дофх - о,с fcät/ч;

i там в tatoo

ftio. г. Тка иу»аца8, швдцврувышс пронзводшаи фдуоренова п феаантраямиоЕа.

Капмчзсгаа älve-РФВДРтштос^ч

(«SC 12X0

tîxa coog «CS 4us

m

с

3-HB-S-KK

Í7-ДНФ-

sa

h» 1,4- г-нш

S.T- ДНФ-

дкк S.T.

ДОС

«г/Ч даа 2,7-ДНФХ - 1Д наг/ч

Z3.7-

1не*

ita15m О там вташ; вта»

Fio. 3i, Влшшв шшэшщы pKÜIOI «а иадухшо njïaiai производила фщуоронова я фвяантряштнояа.

- 11 - .

Сравнительный анализ количества ревертангов, индуцированных исследуемыми соединениями в ТА98 и в ТА100 (рис.2) показывает» что исследованные соединения являются в основном фреймшифт-мутагенами. Лишь четыре из них: 2-НФ-5-КК, 2,7-ДНФ-Б-КАД, 2-НФХ и 2,3,7-ТНФХ с высокой частотой вызывают замены пар оснований. При этом, экстремально высокую частоту индукции мутаций этого типа показал 2-НФ-5-КК, слабо индуцирующий мутации сдвига рамки.

2.2. Молекулы производных Ф и ФХ более планарны, чем молекулы производных БФ. Такие соединения способны взаимодействовать с ДНК посредством простой интеркаляции (подобно 9~аминоакридину). Известно, что соединения интеркалирующие мелщу основаниями ДНК вызывают сдвиг рамки считывания в ТА1537 и ТА97, но практически неактивны в ТА1Б38 и ТА98; соединения, индуцирующие сдвиг рамки считывания в результате образования ковалентного аддукта с ДНК, проявляют активность в ТА1538, ТА98 и небольшую часть активности в ТА1537 и ТА97. Как видно ив приведенных на рис. 3 данных, активность производных Ф и ФХ в ТА1538 на порядок выше, чем в ТА1537, т.е., взаимодействие с ДНК осуществляется посредством образования ковалентного аддукга.

Из сравнительного анализа активности нитропроизводных ФХ в штаммах ТА1537 и ГА1538 следует, что наибольпей интеркалирующей способностью из исследованных молекул обладает 2-ВД>Х. Это может быть связано с тем, что молекула 2-НФХ является планаркой, в то время,как нитрог-руппа в 3-ем положении в молекуле 2,3,7-ТНФХ расположена почти перпендикулярно к плоскости ароматических колец (Ри еЬ а1., 1985). Среди производных Ф наибольшей мутагенной активностью в ТА1537 и ТА97 обладал 2,4-ДНФ-5,7-ДКК. Сравнивая его структуру со структурой 2-НФ-5.7-ДКК, показавшего слабую активность в этих штаммах и отличающегося только отсутствием нитрогруппы в положении 4, а также с молекулами других Ф, т^же слабых мутагенов в ТА1537 и ТА97, можно сделать выводы: 1) пара- положение не играет ключевой роли для интеркаляции, так как в 2-НФ-5-КК положение 7 свободно, в 2,7-ДНФ-б-КК - занято нит-рогруппой, в 2-НФ-5.7-ДКК - карбоксильной группой, но интернирующая способность этих соединений мала; 2) вероятно, наличие четырех заместителей в 2,4,5,7 положениях 2,4-ДН$^5,7-ДКК придает молекуле Планерную конформацию, что дает преимущества для взаимодействия с нитроре-дуктазой и ДНК.

НФ могут образовывать аддукты с ДНК подобно нитрофлуоренам. Под воздействием нитроредуктаз восстанавливается одна из пара- нитрогрупп, а электроно-донорные заместители в пара- положении могут резонансно

стабилизировать соответствующую неактивную форму гидроксиламина (хино-нишш) и, тем самым, уменьшать мутагенную активность соединения. И, наоборот, электроно-акцепторные группы (к ниы относятся и СООН, и N02) ' дестабилизируют соответствующий гидроксиламин и, т.о., увеличивают взаимодействие с нуклеофильными сайтами ДНК и, соответственно, мутагенную активность. Влияние заместителей на активный электрофил исследованиих нитропроизводных Ф подтверждают резонансно-индукционные взаимодействия в их молекулах. Логичным выглядит рост мутагенной активности 2.7-ДНФ-5-КК; 2.7-ДНФ-5-КАД; 2-Н^5,7-ДКК; 2.4-ДНФ-5.7-ДКК по отношению к 2-НФ-б-КК, т. к. в этих молекулах в положении 7 есть электроно- акцепторные группы N02 или СООН (рис.3), причем, дестабилизирующее влияние на активный гидроксиламин карбоксильной группы в положении 7 для данного типа молекул оказывается более сильным, чем нитрогруппы (2-НФ-5.7-ДКК более активен, чем 2.7-ДНФ-5-КК). Резкий рост мутагенной активности во всех четырех штаммах вызывает замена карбоксильной группы в положении Б на амидную. Эго может быть связано с неизвестными ферментативными или стерическими факторами.

2.3. Биотрансформация с помощью "классической" нитроредуктазы молекул нитро-ПАС не единственный путь их метаболической активации в клетке". С целью выяснения вклада этого фермента в активацию молекул исследуемых соединений были пoлvчeны штаммы ТА98ИГ и ТАЮОМ, дефектные по "классической" нитроредуктаэе, путем высева бактерий на полноценную среду с 100 мкг/ил фурацшшна (нитрофуразон) и отбора устойчивых к этому антибактериальному препарату клонов.

Таблица 3. Влияние КГ мутации на мутагенную активность нитропроизводных фдуоренона.

Доза Количество 1иэ+ ревертантов на чашку Соединение нмоль/ч --------------------------------------

ТА98 ТА98ИГ ТА100 ТА100МГ

2-НФ-5-КК 0 23 16 163 150

3,8 62 39 1240 186

7.6 82 29 3986 202

15,2 142 18 4844 176

30,4 248 34 9112 254

76,0 985 68 13541 273

2,7-ДНФ-б-КК 3,8 165 44 130 253

7,6 437 81 128 230

15,2 662 118 220 217

30,4 1756 364. 206 198

76,0 ' 3370 ~ 650 309 183

2,7-ДНФ-5-КАд 3,8 3733 1830 944 285

7,6 7453 5139 1741 330

15,2 13146 6802 3378 409

30,4 2638Р 8060 5413 616

76,0 30000 • 21300 8604 898

2-НФ-5.7-ДКК 3,8 1022 312 233 196

7,6 2392 . 535 316 161

15,2 2919 828 424 226

30,4 4720 1406 849 249

76,0 6320 2737 ' 1040 207

2,4-ДНФ-5,7-ДКК 3,8 3954 555 233 187

7,6 5354 624 272 166

15,2 10824 1625 443 144

"30,4 14549 2521 648 133

76,0 10421 6712 1529 48

Данные табл. 3 показывают, что "классическая" нитроредуктаза оказывает наиболее сильное влияние на индукцию 2,4-ДНФ-5,7-ДКК мутаций сдвига рамки. Мутагенный потенциал этого соединения в ТА98 и в ТА98МГ различался в 7 раз. Для 2.7-ДНФ-5-КК, 2,7-ДНФ-5-КАд, 2-НФ-5.7-ДКК уменьшение мутагенной активности в ТА98МГ происходило примерно в 2-5 раз, видимо, молекула 2,4-Д№-5,7-ДКК обладает наибольшим сродством к нитроредуктазе (ср. активность в ТА98 и ТА98№, ТА100 и ТАЮОМ, табл. 3). Однако, частота индукции фреймшифт мутаций 2,7-ДНФ-5-КАд, 2-НФ-5.7-ДКК, 2.4-ДНФ-5.7-ЛКК в штамме ТА98№ достаточно высока даже для 2,4-ДНФ-5,7-ДКК, следовательно, ь метаболической активации этих соединений, кроме "классической" нитроредуктазы, принимают участие другие ферменты. Поскольку 2-НФ-5-КК а 7А98 слабый мутаген, а в 7А98МГ не является мутагеном, видимо, его активация в клетке осуществляется "классической" нитроредуктазой.

При индукции мутаций замены пар оснований производными Ф "классическая" нитроредуктаза играет большую роль (табл.3), т.к. все соединения в этом ряду, кроме 2,7-ДНФ-Б-КАд, не являются мутагенами в ТАКХЖ. Экстремально высокую активность 2-НФ-5-КК в ТА100, полностью зависимую от "классической" нитроредуктазы, можно объяснить тем, что пространственная конфигурация его активного метаболита, образующегося

в результате восстановления, обеспечивает наиболее высокую степень сродства с ферментами, участвующими в замене пар оснований.

В отношении вклада "классической" нитроредуктазы в метаболическую активацию нитропроизводиьк Ш нужно отметить, что при индукции этими соединениями мутаций сдвига рамкм считывания зависимость от этого фермента примерно одинакова, т. е., степень нитрования молекул ФХ не влияла на деятельность нитроредуктазы (табл.4). При индукции замены пар оснований "классическая" нигроредукгаза вносила наибольший вклад в мутагенную активность 2,3,7-ТНФХ.

Таблица Количество ревертантов, индуцированных производными феначтренхиноиа Ь тест-штаммах Б. 1урМтиг1ит.

Вещество Доза

нмоль/ч ТА1537 ТА1538 ТА98 ТА98^ ТА100 ТА100№

0 7 9 28 20 108 110

- 2-НФХ . 9,5 465 1540 768 152 258 150

18,0 640 1896 1326 231 387 167

36,0 933 2484 2014 274 688 237

72,0 800 2512 2306 . 417 730 351

2,7-ДНФХ 0,9 39 584 937 92 116 147

1,8 77 1104 1733-. 370 131 127

3,7 147 ■ 2047 3717 479 158 138

9,4 328 5517 5834 1562 183 132

г.з.'т'-тнФХ 9,5 336 5120 .3320 504 476 144

18,0 572 7553 4773. 1266 634 161

36,0 463 12533 8720 2026 1134 165

72,0 т.з.* т.э. 10022 3220 1970 175

* - токсический эффект

2.4.Было изучено влияние плазмидных генов шсАВ на мутагенную ак-тизность данных молекул.' Все 10 исследованных соединений были неактивны в шташе ТА1535, т.е., для индукции замены пер оснований нитропро-иаводными Ф и нитропроиаводными ФХ необходимо присутствие плазмщк рКМ101. В то же время, по данным рис.3, табл. 4, плазмидные гены ошибочной репарации уменьшают мутагенную активность в ТА1538 и ТА98 1 производных Ф, и производных ФХ. Для производных Ф обычно это сниженж не более, чем в два раза, однако у одного соединения: 2-НФ-Б.7-ДКК оно составляет порядок. Карбоксильная группа в положении 7 меняет ха

рактер активации и . взаимодействия с ДНК (ср. 2,7-ДНФ-б-КК и 2-НФ-5.7-ДКК), вероятно, вследствие стерическмх факторов. Видимо, образуется спектр аддуйтов 2-НФ-5.7-ДКК с ДНК, одни ответственны за сдвиг рамки считывания, а другие - за замену пар оснований; аддукт, ответственный за мутации сдвига рамки считывания, не узнается ферментами ошибочной репарации. Два соединения: 2-НФ-5-КК и 2,7-ДНФХ, индуцировали -1 фреймшфт мутации в присутствии генов шисАВ с большей частотой, чем без них (рис. 3, табл. 4), возможно, аддукты, ответственные за сдвиг рамки считывания для 2-НФ-5-КК и 2,7-ДНФХ, ответственны*также и за замену пар оснований.

Как следует из рис.3, присутствие пдазмиды pKMIOl в штамма- ТА97 почти на порядок повышает чувствительность культуры к мутагенному воздействию производных Ф по сравнений с бесплазмидным ТА1537. Штаммы ТА1537 и TAS7 отличаются друг от друга мутационными сайтами: B-TA1537 это.мутация hisC3076, представляющая собой один добавленный цитозин к ряду из трех цитозинов; в ТА97 в нескольких крдонак от мутации hisD6610 с 3'-стороны имеется горячая точка, сходная с мутацией hisD3G52 штаммов ТА1538 и ТА98. Вероятно, наличие этой горячей точки приводит к тому, что ответы на воздействие производных Ф в ТА98 и ТА97 мало отличаются друг от друга.

3. ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ В МОЛЕКУЛАХ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРЕНА И ЕГО ГЕТЕРОЦИНЛИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ НА ИХ МУТАГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ. .

3.1. Проведено сравнительное изучение зависимости мутагенной активности ацетил- , ацетиламино- , диазафеначтренов, диаза- и диоксапи-ренов от их структуры (рис. 1).

Данные, полученные для Axil и АцАП, представленные в табл.5, показывают влияние электроно-донорных и электроно-акцепторных групп на мутагенную активность 1-НП. В этих производных нитрогруппа находится по отношению к ацетил- или ацетиламиногруппе в положениях: близком к пара- (6), мета- (3), близком к мета- (8).

Таблица 5. Количество his+ ревертантов, индуцированных ацетил- и

ацетиламино- производными нитропирена в TAI538.

Вещество Доза, нмоль/чашку

О 0,03 0,15 0,30 0,75 1,50

1-НП (3-НП)

20 178 1007 1288 1134 т.Э.

1-Ад-З-НП

1-Ац-б-НП

1-АЦА-6-НП

1-АЦ-8-НП

1-АЦА-8-Ш

31 238

32 296

27

68 92

1023 1950

38 113 407 717 33 63

179 167 т.'э. т.э. 258 714

т.э. т.э.

75 109

Электроно-акцепторные группы, к которым относится ацетильна$ посредством индукционного эффекта, могут воздействовать на восстачо] ленную нитрогруппу, усиливая ее взаимодействие с ДНК. Наиболее сильш индукционный эффект наблюдается в пара- положении, при смещении от н< го происходит уменьшение мутагенной активности, что подтверждается п< лученными результатами: наибольшая мутагенная активность наблюдается 1-Ац-6-НП, в ьопекуле которого ацетил- и нитрогруппа находятся в пода жении, близком к пара-. При замене электроно-акцепторной ацетильной ] электроно-донорную ацетиламиногруппу, происходит резкое снижение мут, генной активности (ср. 1-Ац-б-НП и 1-АцА-б-НП; 1-АЦ-8-НП и 1-АцА-8-И в результате резонансного эффекта, стабилизирующего неактивную ими» вую форму гидроксиламина.

3.2. Исследование 2,7 положения заместителей в молекулах 24 ГАП ГАФ показывает, что пара- положение нитро-, амино- групп определяв высокую мутагенЬую активность этих соединений (табл.6).

Таблица 6. Количество ревертактов, индуцированных гетер циклическими аналогами пирена и фенантрена в ТА1538.

Доза, толь/чашку

Вещество

О 1,5 3,0 7,5 15,0 30,0

2,7-ДиНН2-4-С00Н-0Аф 2,7-ДИМ2-4-С00Н-АФ 2-№^-5,7-ДИ-СООН-ОАФ 2-,ЧН2-7-СООН-ОАФОД ДТДП

2,7-диОН-ДТДП

2,7-диВг-ДТДП

2.7-ди1«2:ДТДП

1.б-диЩ2-ЛТДП

2-МН2-7-С00Н-ДТДП

1,6-диЮ2-ДТДП

23 13

13 44 50 135 116 22 108 13 344 36

19

40 60

121 118

41 154

13 840 29

15 24 33

50 40 65

50 65 100

119 189 168

204 153 163

68 72 56

309 340 531

17 18 12

1900 3000 4800

48 132 164

21 28

.,3,6,8- тетраИОг- ДТДП 15 24 41 42 81

, 3,6,8-.тетраШ2-ДТДП-С 19 20 17 17 19

.,3,6,8-тетраЫНАл-ДТДП ' 19 21 25 31 32

:,7-диШАц-ДТДП 16 17 14 19 18

ДДТДП 25 37 53 99 151

!,7-ди0Н-ДЦТДП 24 29 25 21 28

:,7-ди1-ДДТДП 12 13 14 15 27

:,7-диС1-дцтдп 66- 86 201 351 464

:,7-димн2-ДДТДп 414 588 708 1403 1539

!,7-диШ2-ДДТДП-А 44 57 • 102 131 90

!, 7-диШг-ДДТДП 504 710, 5366 . 12543 т.э

:-мн2-7-соон-дцтдп 38 60 118 370 830

:,7-диШ2-ДДП 431 636 т.э. Т.Э. т.э

Наибольший рост мутагенной активности происходит при наличии в !,7 положении нитрогрупп (соединения 2,7-диЖ32-ДДТДП, 2,7-диШ2~ДЦП). !сли нитрогруппы4 находятся в других положениях (1,6-диМОо-ДТДП), то юлекула неактивна, независимо от их количества (1,3,6,8-тет-)аМ0г-ДТДП. Активность молекуле, хотя и в меньшей степени, придают шиногруппы в пара- положении (2,7-диНН2-ДТДП, 2,7-диМН2-ДДТДП), а 'акже амино- и карбоксильная группы (2-ЯН2-7-С00Н-ДТДП)• При изменении >асположения аминогрупп с 2,7 на 1,6 происходит потеря мутагенной активности (1,6-диМН2-ДТДП). Для нитрозамещенных ГАП возможен механизм: юсстановление одной из них и индукционное воздействие другой. Наличие активности у аминопроизводных ГАП в отсутствие экзогенной метаболической активации говорит о.том, что внутри бактериальной клетки существу-)Т способы активации (возможно, гидроксилирования) этих молекул. В ¡том случае действие электроно-акцепторной карбоксильной группы на 'идроксилированную аминогруппу в молекуле 2-МН2-7-СООН-ДТДП тоже может 5ыть связано с индукционным эффектом.

3.3. Более детальное исследование' мутагенной активности :,7-диЖ)2-ДДТДП и 2,7-диМ02-ДДП показывает, что они являются не только [>реймшифт-мутагенами, но и индуцируют мутации замены пар оснований в ГА100, но не в ТА1535. Причем, мутации сдвига рамки считывания с боль-аей частотой индуцирует 2,7-диН02-ДЦТДП, а замены пар оснований ?,7-диЖ)2-ДДП, что указывает на разные механизмы активации этих соеди-шний (табл.7,8).

Таблица 7. Влияние мутации № и генов шисАВ на индукцию фрейм-шифт-мутациий динитропроизводными диаза- и диоксапиренов.

Соединение Доза вмолъ/ч Количество ревертантов на чашку

ТА1538 ТА98 ТА98НГ

2,7-диКОг-ДЦП 0 12 34 26

0,60 1986 2118 443

1,20 4269 3200 933

2,40 2980 4793 1866

4, ВО т.э. 5753 1993

9,60 т.э. 10072 2313

2,7-диГОг-ЖГДП 0 12 34 26

0,60 1546 1541 72

1,20 2969 3200 102

2,40 3840 5333 161

4,80 6746 7133 464

9,60 5873 11243 797

Таблица 8. Влияние мутации НГ и генов шисАВ на индукция мутаця замены пар основании динитропроизводными диаза- и диоксаяирексга

Соединение

Доза НМСШ>/Ч

Количество ревертантов на чаасу ТА1Б35 ТА 100 ТА 100Ш

2,7-д^Юг-ШЛП

2,7-диЮг-Ш

0 16 147 200

9,6 25 45? 242

19,2 10 801 325

38,4 Т.З. 892 729

76,8 т.э. 1001 846

153,6 т.э. т.э. 1351

0 40 147 200

9,6 48 526 413

19,2 38 815 .660

38,4 т.э. 1503 1151

76,8 Т-э. 2075 1366

153,6 • 'т.э. т.э. 2307

Как видно из приведенных данных, мутанты Nf под действием этих ве-[еств ревертируют более слабо, чем исходные птаммы, но вклад "класси-еской" нитроредуктазы' в биотрансформацио этих молекул различен для вдукции сдвига рамки считывания и замены пар оснований. Зависимость ¡утагенной активности 2,7-диШ2-ДЦТДП и 2,7-диШ2-ДДП от мутации Nf в 'AI00 примерно одинакова и очень невелика, г. е., восстановление нит-югруппы осуществляется не "классической" нитроредуктазой или сущест-¡ует другой способ активации этих молекул для индукции замены пар ос-юваний. Мутагенная активность 2,7-диШ2-ДДП в TA98Nf ниже в 3-5 раз, [ем в ТА98, а мутагенная активность 2,7-диН02-ДДТДП ниже на порядок, ¡ледователько, восстановление нитрогруппы в молекуле 2,7-диШ2~ДДТДП ¡ля индукции мутаций сдвига рамки считывания осуществляется "класси-[еской" нитроредуктазой, а в биотрансформации 2,7-ди!Ю2-ДДП участвуют [ругие ферменты.

3.4. Влияние плазмидных генов шисАВ, • кодирующих ферменты ошибоч-[ой репарации, на индукцию мутаций замены пар оснований нитро-ГАП ве-шко. В отсутствие этих генов данные соединения оказываются неспособными вывивать подобные мутации (табл.7,8). Гены mucAB увеличивают и lacTOTy индукции нитро-ГАП мутаций сдвига рамки считывания, в отличие )т большинства исследованных нитропроизводных Ф и ФХ. Зависимость мутагенной активности 2,7-диШ2-ДДТДП от mucAB больше, чем :,7-диМ02-ДЛП. Эти факты подтверждают существование нескольких меха-шзмов активации молекул нитро-ГАП в клетке и наличие не одного, а :пектра аддуктов. Вероятно, ферментами ошибочной репарации узнается >дин из аддуктов, образованный активными метаболитами этих соединений • основной - при замене ,пар оснований, и - реже встречающийся - при шдукции сдвига рамки.

4. ПОСТРОЕНИЕ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ВНЕЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПРОГНОЗА • МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИЦИКЖЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ. '

4.1. На основании полученных экспериментальных данных по мутаген-юй активности производных БФ, Ф, ФХ, ГАП, ГАФ, приведенных в .табл. 2,3,4,5,6 была изучена количественная связь между мутагенной активностью и структурой и построены модели для внеэкспериментального прог-аоза активности подобных соединений в программных комплексах "Эмма" и •NASA".

Для производных БФ удалось найти уравнения для прогноза в рамках шнейнот* модели программного комплекса "Эыма". Исходная выборка заме-

щенных ВФ (21 соединение) была произвольно разбита на обучающую контрольную (соединения 4,4'-ДН-2'-КБЗ> и 2,4,4'-ТН-2'-КБФ). На nepi этапе для каждого из соединений в выборке были рассчитаны дескриптор основанные на атомных электроотрицательностях, потенциалах ионизащ ван-дер-ваальсозых объемах а поверхностях молекул, квантовохимичесь индексы и подструктурные дескрипторы, основанные на количестве разл) ных фрагментов, включающих от 1 до 6 атомов в каждой из молекул. Не лучшие результаты получены при использовании подструктурных (уравне! 1) и квантовохимических дескрипторов (уравнение 2).

ln(Nhis+) - 1,18iYi+Os ?2fГ2-1,03fгз-3,59 (1)

R-0.94, Sv-0.75, F-39.3 где Nhis+ - число his+ ревертантов при дозе 7,5 ныоль/чашку; R-коэфс циент корреляции между экспериментальным и прогнозируемым значена логарифма числа his+ ревертантов; Sv-среднеквадратичная ошибка проп за логарифма числа his+ ревертантов в контрольной выборке; F-значе) критерия Фишера; frj - число фрагментов следующего вида:

О.

СОШ

fri • fr2 fr3

Активирующие и де&актйвярующие фрагменты отличаются по знаку или (+) перед нимй в уравнении 1, следовательно, фрагменты 1 и 2 у. личивают мутагенную активность, а фрагмент 3 уменьшает ее. Исходя изложенного в гл. 1 можно сделать вывод, что активирующие и-дезакти рующие фрагменты были отобраны в программном комплексе "Эмма" лишь самом общем виде. Более корректно было бы выделить в качестве акти рующего фрагмента, аналогичного frg, нигрсгруппу в пара- положении в качестве дезактивирующего, аналогичного fr3, карбоксильную групп орто- положении. Этот недостаток может быть преодолен при увеличе обучающей выборки, т. к. известно, что подструктурные дескрипторы л ше всего работают в больших выборках неродственных соединений (Beni R. et а!., 1989). В то ке время прогноз по уравнению 1 достаточно чен: для соединения 4,4'-ДН-2'-КБФ Nhis+(прогноз)-49, Nhis+(3Kcne мент)-38 (табл. 2); для соединения 2,4,4'-ТН-2'-КБФ Nhis+(np ноз)-661, Nhis+(эксперимент)-2559 (табл. 2). Прогноз такой же степ точности получен и на квантовохимических дескрипторах:

ln(Nhis+)~ Illdi-2,66d2-36,7ci3-10,4d4-f0,967 (2)

R-0,95, Sv-0,69, F-35

где Nhis+ - число his'1' ревертантов при дозе 7,5 ямоль/чашку; di-мини-мальный квадрат коэффициента вклада атомной орбитам углерода в низшую свободную молекулярную 'орбиталь, йг-минимадышй квадрат коэффициента вклада атомной орбитали азота в низшую свободную орбиталь, d3-MaKCH-мальный индекс свободной валентности на атоме углерода, d4-cpeflHee вначение индекса свободной валентности на атомах кислорода. Результаты прогноза по уравнению 2: для соединения 4,4'-ДН-2*-КБФ Nhis+(npor-ноз)-64, для соединения 2,4,4'-ТН-2'-КБФ Nhis*(nporHOs)-889.

4.2. Для построения модели внезкспериментального прогноза мутагенной активности больших молекул с конденсированными кольцами ГАП и РАФ были рассчитаны те же дескрипторы, что и для БФ. Соединения, представленные в табл. 6, были произьольно разбиты на обучающую и контрольную выборки (2,7-диМН2-ДТДП и 2-ННг- 5,7-диОООН-ОАФ). В предварительных исследованиях было показано, что квантовохимические дескрипторы, рассчитанные по методу Хюккедя, лучше всего коррелируют с му гагенной активностью ГАП и ГАФ. С помощью программного комплекса "Эм-«а" были отобраны четцре дескриптора с максимальным индивидуальным коэффициентом корреляции с мутагенной активностью. В результате пошагового регрессионного анализа было получено и отобрано одно уравнение: ln(Nhis+)—45di- 32d2+ 41d3-0.38d4+ 17.7 K-0.927, Sv-0.59, F-23 (3)

■■де Nhls+ - количество his* ревертантов при дозе 3 нмоль/чашку, di-«шдаалъный индекс свободной валентности, максимальный я заряд на иоме азота, d3- средний квадрат коэффициента вклада атомной орбитали сислорода в высшую занятую молекулярную орбиталь, d4- гидрофобность (logP). Прогноз по этому уравнению для 2,7-ди>)К2-ДТДП и 2-NH2-5.7-1ИСООН-ОАФ, не входивших в обучающую выборку, составил: Nhis+(npor-юз)-229, Nhis+(эксперимент)-154 для 2,7-диМН2-ДШ; Nhis+(npor-юз)-37, Nhls+(эксперимент)-40 для 2-NH2-5,7-flnOOOH- ОАФ.

В рамках линейной модели улучшить коэффициент корреляции между ]рогнозируемым и экспериментальным значениями мутагенной активности не ждалось, поэтому отобранные дескрипторы были далее использованы для юстроения нелинейной модели в системе искусственных нейронных сетей, входной псевдослой содержал 4 нейрона, соответствующие di-d4, и один юевдонейрон смещения с постоянной активностью. Скрытый слой содержал ! вычислительных нейрона и 1 псевдонейрон смещения. Выходной слой со-|ержал 5 нейронов, соответствующих логарифмам прогнозируемых значений шсла his1" ревертантов при различных дозах мутагена. Обучение было ¡рервано после 3000 предъявлений выборки.

В табл. 9 приведены результаты работы обученной нейронной сети (St-среднеквадратичная ошибка воспроизведения логарифма числа his+ ре-вертантов при-соответствующей дозе мутагена на обучающей выборке). Таблица 9. Результаты работы обученной нейронной сети.

Параметры корреляции Доза нмоль/чашку

1.5 3,0 7.5 ' 15 30

St 0,437 0,352 0,418 0,466 0,622

R 0,934 ' 0,664 0,661 0,951 0,926

Sv 0,449 0,378 0,335 0,625 0,456

Из сравнения коэффициентов корреляции для доз 3,0; 7,5; 1 нмоль/чашку (табл. 9) к коэффициента корреляции в линейной модед (0,927) видно, что точность прогноза повышается при переходе к метода логии искусственных нейронных сетей, что свидетельствует о нелинейно характере модели. В разках нелинейной модели не удалось улучшить коэф фициенты корреляции для пограничных доз 1,5; 30 нмоль/чашку. Таким об разом, обученная нейронная сеть позволяет наиболее точно предсказывав мутагенную актйвкость соединении, аналогичных ГАИ и РАО, для доз, oi носязцихся к середине линейного участка крйвой доза-эффект.

4.3. На основании данных по мутагенной активности всех 60 соед! нений в программные комплексы "Эмма" и "NASA" была введена объедиие} ная выборка, включающая в себя производные БФ, S, ©X, П, ГАП и ГАС Она была разбита на обучающую (54 соединения) и контрольную (соедин< НИН 2,4,2',4'-ТН*-6,6'-ДКБ$; 4,4'-ДН-2,2'-ДКБ©; ®Х; 1-АЦ-8-Ю 2,7 - ди№3 2~ 4-С00Н-АФ; ДТДП). На первом этапе для каждого соединения ! обучашей выборки были рассчитаны подструктургае и квантовохимичесго дескрипторы. Затем были отобраны дескрипторы с максимальным индивид; альным коэффициентом корреляции с мутагенной активностью (логарифм! числа his+ ревертантов). Начиная с каждого их этих дескрипторов, про: дилась процедура пошагового регрессионного анализа, в результате кот рого была получена серж регрессионных уравнений следующего вида:

In (Nhis^) -0.728f Г4 +1 • 30f Г5+1.68f Гб"0.63f7f P7+163di+15. ld2-8.36;

R-0.863 St-1.24 Sv-1.93 F-22.9; (4)

где Nhis* -количество ревертантов при дозе, соответствующей середи линейного участка кривой доза-эффект, ревертантов/нмоль; di - мин мальная электронная плотность LUMO; dz - минимальная нуклеофильная с перделокализуемость на атомах углерода;

=С° АС Ю. ^

fr4 f Г5 to f Гб fl-^OH

Поскольку ошибка прогноза Sv по отобранным линейно-регрессионным /равнениям велика (от 1.93 до 2.81), с помощью программного комплекса 'NASA" была построена трехслойная нейронная сеть с помощью наиболее iacTO встречающихся в уравнениях дескрипторов. Количество нейронов входного слоя варьировалось в зависимости. от количества отобранных 1ескрипторов, скрытый слой содержал два вычислительных нейрона и псев-цонейрон смещения, выходной слой содержал один нейрон, соответствующий логарифму прогнозируемого значения числа his+ рёвертантов. Последовательно строились нейросети, входной слой которых содержал 9, 11, 16 наиболее часто встречающихся дескрипторов. Саше удачные результаты Зыли получены при использовании 9 следующих дескрипторов во входном злое: минимальная электронная плотность LUMO; минимальная электронная плотность HOMO на атомах С; минимальная нуклеофильная суперделокалиэу-эмость на атомах С; максимальная нуклеофильная суперделокализуемость на атомах О; frs; fr6;

.Н

Нч. ^

.Г^

fra frg frío

St-0.8503; Sv-0.8O32; R-0.9326;'

Таким образом, для выборки из 60 неродственных соединений нелинейные модели, построенные с помощью программного комплекса "NASA", обладают лучшей прогнозирующей способностью, чем линейно-регрессионные, и могут быть использованы в дальнейшем и для априорной оценки мутагенной активности полициклических ароматических соединений и для построения новых моделей на больших выборках неродственных соединений.

- 24 -

въвода

1. Мутагенная активность молекул с нековденсированными (производные бифенила) и конденсированными ароматическими кольцами (производные флуоренона, фенаятренхинона, пирена и его гетероциклических аналогов) коррелирует с пара- положением нитрогруппы.

2. Электроно-донорные группы (NHCOCH3, Щг) в пара- положении пс отношению к нитрогруппе в результате резонансного эффекта уменьшают, г электроно-акцепторные группы (СООН, Шг, СОСНз), юздействуя индукци-онно, увеличивают мутагенную активность производных флуоренона и нит-ропирена. Показано более сильное, чем у нитрогруппы, влияние карбоксильной группы в пара- положении на мутагенную активность производныг нитрофлуоренона.

3. Частотз индукции мутаций замены пар оснований производным; флуоренона и фенантренхинона полностью зависит от действия "классической" нитроредуктазы, для индукции ими мутаций сдвига рамки считывали: необходимо участие других ферментов. Частота индукции замен пар оснований нитрозамещеннкми гетероциклическими аналогами пирена не вависи' от "классической" нитроредуктазы.

4. Производные флуоренона, фёнантренхинона, гетероциклически аналогов пирена, независимо от структурных особенностей, индуцирую' замены пар оснований только в присутствии плазмвдных генов mucAB. Пр: индукции сдвига рамки считывания эффект mucAB определяется структурны ми характеристиками молекулы.

Б. Построенные количественные модели внеэкспериментального прог ноза мутагенной активности могут быть рекомендованы для априорно оценки мутагенной активности полицикличёских ароматических соединений

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абилев С.К., Люб/йкжа И.К., Ыигачев Г.И. Зависимость мутаген ной активности гетероциклических аналогов пирена от их химическо структуры// Генетика, 1992, т. 28, N8, с.52-59

Z. Абилев С.К., Любимова И.К., Мигачев Г.И. Влияние структурны особенностей нитропроизводных флуоренона и бифёнила на фреймшифт-мута генез в тестерньи штаммах Salmonella typhimurlum// Генетика, 1993, т.29, N10, с.1640-1645

3. Баскин И.И., Любимова И.К., Абилев С.К., Пашояин В.А., акаде мик Зефиров Н.С. Исследование . количественной связи между мутагеннс активностью химических соединений й т структурой. Замещенные бифен» т/У ДАН, 1993, т.332, N5, с.587-589

- 25 - '

4. Любимова И.К., Абилев С.К.. Мигачев Г.И. Взаимосвязь структу-L-мутагенная активность в ряду производных бифенила// Генетика, 1994,

0

5. Любимова И.К., Абилев С.К., Ыигачев Г.И. Влияние некоторых ■руктурных особенностей в молекулах производных пирена и его гетеро-кдических аналогов на мутагенную активность// Генетика, 1994, N10

6. Баскин И.И., Любимова И.К., Абилев С.К., Палюлин В.А, академик фиров Н.С. Количественная связь между мутагенной активностью гетеро-ошических аналогов пирена и фенантрена и их структурой// ДАН, 1994,

1 печати)