Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов

Куликова, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов"

На правах рукописи

003448814

Куликова Наталья Александровна

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАСТЕНИЯМ В ВОДНОЙ И ПОЧВЕННОЙ СРЕДАХ В УСЛОВИЯХ АБИОТИЧЕСКИХ СТРЕССОВ

Специальности 03 00 16 - Экология и 03 00 27 - Почвоведение

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2008

1 6 0КТ 2008

003448814

Работа выполнена на факультете почвоведения МГУ имени М В Ломоносова Научный консультант

доктор химических наук, профессор Перминова И В Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, академик РАСХН Спиридонов Ю Я

Доктор химических наук, член-корреспондент РАН Тарасова Н П Доктор биологических наук, профессор Щеглов А И

Ведущая организация Почвенный институт имени В В Докучаева РАСХН

Защита состоится 28 ноября 2008 г в 14-фО на заседании Диссертационного Совета Д501 001 55 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М В Ломоносова, д 1, корпус 12 (биологический факультет), аудитория 389

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Автореферат разослан_ о.ч /о

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

НВ Карташева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальное! ь проблемы

Возрастающая антропогенная нагрузка на окружающую среду обусловила возникновение такой глобальной задачи современности как целенаправленное регулирование нарушенного равновесия в экосистемах Решение этой задачи включает в себя изучение детоксификации загрязняющих веществ и поиск безопасных средств защиты организмов от повреждающего действия токсикантов В качестве таких средств защиты могут выступать природные физиологически активные соединения, к которым относятся гуминовые вещества (ТВ), содержащиеся во всех природных средах, включая природные воды, почвы, торфа, сапропели и угли Образование ГВ представляет собой второй по масштабности после фотосинтеза процесс трансформации органического вещества в пр(гроде, в который вовлекается около 20 Гт углерода в год ГВ выполняют ряд важных экологических функций в биосфере аккумулятивную, транспортную, регуляторную, физиологическую и защитную Особую актуштьность в последнее время приобретает исследование защитной функции ГВ с целью ее дальнейшего практического применения, так как именно она отвечает за поддержание равновесия в экосистемах, подверженных сильной антропогенной нагрузке Следовательно, установление механизма защитного действия ГВ позволит более эффективно использовать существующие гуминовые стимуляторы роста растений в сельском хозяйстве, а также указать пути к созданию нового поколения средств защиты растений на основе ГВ, например, гуминовых детоксикантов и биоактиваторов

В настоящее время общепринятым является положение о том, что защитная функция ГВ в условиях химического стресса обеспечивается их способностью связывать загрязняющие вещества в комптексы, недоступные для живых организмов При таком понимании защитного действия ГВ практически игнорируется роль их физиологической активности в процессах детоксификации загрязненных сред Кроме того, при таком подходе остается нерешенной проблема защитного действия ГВ в условиях других абиотических стрессов, таких неблагоприятная температура, недостаток влаги, засоление и др Причиной этого является отсутствие систематических исследований по роли физиологической активности в защитной функции ГВ Поэтому целью работы было изучить природу защитного действия ГВ по отношению к растениям во взаимосвязи с их физиологической активностью в условиях различных абиотических стрессов в водной и почвенной средах и предложить пути практического использования полученных знаний для создания средств защиты нового поколения на основе ГВ

Цель работы

Цель работы состояла в изучении природы защитного действия ГВ по отношению к растениям в водных и почвенных средах в условиях различных абиотических стрессов и оценке перспективности применения природных и модифицированных гуминовых препаратов в качестве средств защиты растений В работе были поставлены следующие основные задачи

- выделить и охарактеризовать ГВ из различных природных сред,

- изучить защитное действие ГВ и выявить его основные закономерности в условиях различных абиотических стрессов, включая присутствие токсикантов, железодефицитный хлороз, водный, солевой и температурный стрессы,

- изучить взаимодействие ГВ с клетками и растениями и предложить концептуальную модель защитного действия ГВ,

- оценить перспективность применения природных и модифицированных гуминовых препаратов в качестве средств защиты растений (детоксикантов, стимуляторов роста, корректоров хлороза, биоактиваторов)

Научная новизна

На основании количественной оценки детоксифицирующих свойств ГВ в присутствии токсикантов показано, что защитное действие ГВ в почвенных средах обусловлено, прежде всего, образованием нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как в водных средах значительный вклад может вносить собственная биологическая активность ГВ В случае высоких констант связывания (тяжелые металлы), ведущую роль в защитных свойствах ГВ играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как при слабом химическом взаимодействии (гербициды) основную роль играет собственная физиологическая активность ГВ

Установлено, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов более выражено в водных, чем почвенных средах, что связано со снижением доступности ГВ для растений

Впервые показана перспективность использования модифицированных ГВ в качестве средств защиты растений нового поколения, а именно ■шнон-обогащенных гуминовых производных - в качестве детоксикантов почв, загрязненных тяжелыми металлами, гуматов железа - в качестве корректоров хлороза у растений, обогащенных кремнием ГВ - в качестве биоактиваторов

Впервые проведена численная оценка кинетики поглощения ГВ растениями с использованием меченных тритием препаратов Показано, что константы Михаэлиса-Ментен ГВ лежат в диапазоне, характерном для ионов и индивидуальных веществ, поступающих в растения, а максимальная скорость поглощения ГВ - на несколько порядков ниже Установлено, что поступление ГВ в растения происходит по механизму активного транспорта и напрямую связано со скоростью метаболизма

С использованием авторадиографии установлено, что ГВ аккумулируются преимущественно в корнях растений Показано, что повышенное содержание ГВ наблюдается в апикальных участках корней и побегов

Установлено, что ГВ, поступившие в растения, аккумулируются в липидной фракции С использованием метода масс-спекгрометрии ионного циклотронного резонанса с Фурье преобразованием впервые показано, что продукты метаболизма ГВ присутствуют в составе ненасыщенных жирных кислот Предложена концептуальная модель защитного действия ГВ, основанная на их участии в липидном обмене растений

Практическая значимость

Выявленные основные закономерности защитного действия ГВ в условиях абиотических стрессов в водных и почвенных средах могут служить основой для создания нового поколения средств защиты растений на основе ГВ

Установленные зависимости «структура - детоксифицируюгцие свойства ГВ» могут быть использованы при выборе гуминовых препаратов, оптимальных для рекультивации почв, загрязненных гербицидами и тяжелыми металлами

Показана перспективность использования модифицированных ГВ, искусственно обогащенных кислородсодержащими функциональными группами, для детоксификации сред, загрязненных тяжелыми металлами

Продемонстрирована возможность использования гуминовых препаратов, обогащенных железом, для коррекции железодефици 11101 о хлороза

Показана перспективность использования обогащенных кремнием ГВ в качестве биоактиваторов растений в условиях солевого стресса

Полученные значения констант связывания атразииа ГВ могут быть использованы для расчета форм существования атразииа в окружающей среде при построении моделей биогеохимического цикла и оценки степени загрязнения почв

Полученные данные по взаимодействию атразииа с почвами в присутствии лахказы могут быть использованы для разработки биотехнологических подходов к рекультивации почв, загрязненных гербицидами сим-триазинового ряда

На примере ГВ предложен способ исследования поглощения и распределениях в растениях сложных высокомолекулярных соединений природного происхождения с использованием меченных тритием препаратов

Предложен способ обработки данных альгологического тестирования токсичности водных сред, позволяющий учитывать мешающее влияние ГВ

Положения, выносимые на защиту

- различие в эффективности защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов в водных и почвенных средах,

- основные закономерности поглощения ГВ растениями и распределения в них,

- положение о неспецифической природе защитного действия ГВ и его концептуальная модель,

- возможность усиления защитных свойств гуминовых препаратов путем направленного введения функций, способствующих снятию абиотических стрессов

Апробация

Отдельные части работы были представлены на Международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов-96» и «Ломоносов-98» (Москва, 1996, 1998), на 16-ом Всемирном конгрессе по почвоведению (Монпелье, 1998), 9-ой ежегодной конференции ЗЕТАС-Еигорс (Лейпциг, 1999), 10, 11, 12 и 13-ой международных конференциях ШББ в 1997 (Анахейм, США), 2000 (Тулуза, Франция), 2002 (Бостон, США) и 2006 (Карлсруэ, ФРГ), научно-практическом семинаре при поддержке НАТО

«Use of humâtes to remediate polluted environments from theory to practice» (Звенигород, 2002), II Московском международном конгрессе по биотехнологии «Состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), научно-практической конференции «Современные проблемы тканевой терапии и перспективы использования БАВ» (Одесса, 2003), 12-м международном симпозиуме по загрязнению окружающей среды (Анталия, 2003), 4-м съезде Докучаевского общества почвоведов (Новосибирск, 2004), на Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Экспериментальная информация в почвоведении теория и пути стандартизации» (Москва, 2005), международной конференции «Biocatalysis-2005 fundamentals and application» (Санкт-Петербург, 2005), 10 и 11 симпозиумах северного отделения IHSS «Character of natural organic matter and its role in the environment» в 2005 (Рига, Латвия) и 2007 (Ионсуу, Финляндия), 3 и 4 Всероссийских конференциях «Гуминовые вещества в биосфере» в Санкт-Петербурге (2005) и Москве (2007), 5 Российской конференции по радиохимии (Дубна, 2006), научной конференции Ломоносовские чтения (Москва, 2006), VII кошрессе Итальянского отделения IHSS (2007), на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 59 работ, включая 28 статей (из них 10 в журналах, рекомендованных ВАК), 1 патент и 30 тезисов международных и всероссийских конференций

Личный вклад автора

Диссертационная работа является результатом многолетних (1997-2008 гг) исследований автора Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, развитию и проверке экспериментальных подходов, предложенных в работе, а также в обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов Экспериментальная работа выполнена автором самостоятельно и в соавторстве с российскими и зарубежными коллегами В совместных исследованиях личный вклад автора заключался в постановке задачи, в непосредственном участии и руководстве при проведении экспериментальной работы, в интерпретации полученных результатов и оформлении их в виде публикаций

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Выделение и характеристика ГВ различных природных сред

Отличительной особенностью ГВ явтяется стохастический характер, обусловленный особенностями их образования в результате отбора биотермодинамически устойчивых структур Как следствие, к фундаментальным свойствам ГВ относятся нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперсность Поэтому для ГВ неприменимо понятие молекулы, а вероятную схему их строения представляют с

помощью структурной ячейки - минимального по размеру фрагмента молекулы, который содержит все важнейшие структурные единицы Сложность строения ГВ хорошо иллюстрирует гипотетическая структурная фор,мула ГВ почв, опубликованная в 1970 г Кляйнхемпелем (рис 1 1) Указанная формула представляет собой попытку одновременно сохранить детальное описание структуры ГВ и показать ее статистический характер Это достигается за счет чрезмерной громоздкости формулы, в которой автор приводит практически все возможные элементы структуры и способы их сочленения Данная формула наиболее полно отражает набор структурных фрагментов ГВ, хотя она неоднократно подвергалась критике, в частности, в связи с чрезмерно высоким содержанием азота

Thaer-Archiv , 1970, 14(1), рр 3-14 ]

Как видно из приведенной структурной формулы, по своей химической природе ГВ представляют собой нерегулярные сополимеры ароматических оксиполикарбоновых кислот с включениями азотсодержащих и углеводных фрагментов Указанное строение - наличие каркасной части, те ароматического углеродного скелета, замещенного алкильными и функциональными группами, среди которых преобладают карбоксильные, гидроксильные и метоксильные, и периферической части, обогащенной полисахаридными и полипептидными фрагментами, - является общим для ГВ всех источников происхождения

Отсутствие адекватного аналитического обеспечения и методологических подходов к анализу и численному описанию строения ГВ привело к тому, что, определение класса ГВ до сих пор основано на способе их экстракции из природных объектов, а общепринятая классификация - на процедуре фракционирования ГВ подразделяют на гумин (нерастворим во всем диапазоне pH), гуминовые кислоты (ГК, нерастворимы при pH < 2) и фульвокислоты (ФК, растворимы во всем диапазоне pH) Последние два класса объединяют под общим названием гумусовые кислоты Эта схема дополняется иногда также выделением гиматомелановых кислот (ГМК), отделяемых воздействием на сырой осадок ГК этанолом

В связи с тем, что ГВ характеризуются нестехиометричностью состава, нерегулярностью строения и гетерогенностью структурных элементов, для проведения исследований необходимо было создать представительную выборку препаратов ГВ с широким разнообразием состава и свойств, адекватную стохастическому характеру объекта Всего в работе было использовано 66 препаратов ГВ из различных природных источников, включая торфа, почвы, угли, природные воды и донные отложения, а также 36 препаратов модифицированных ГВ ГВ были охарактеризованы методами элементного анализа, ,3С ЯМР-спеюроскопии и эксклюз ионной хроматографии (табл 1 1)

Исследованные препараты значительно отличались по элементному составу и структурным характеристикам Наибольшее содержание углерода и наименьшее кислорода было отмечено для ГК углей и торфов Эти же препараты характеризовались самым высоким содержанием ароматических фрагментов Максимальное содержание кислорода было отмечено для препаратов ГВ природных вод, минимальное - для ГВ торфов Наименьшими молекулярными массами А/Охарактеризовались ГВ природных вод, наибольшими - торфов

Табл. 1 1. Химическая характеристика использованных препаратов ГВ

г, т-т> ,, Распределение углерода, % Препараты ГВ отношения М& _____1

Я/С О/С ст Ссо Саю СЛг сш

Гуминовые вещества торфов

РНР-Т4Н94 0 86 0 40 20 22 2 05 13 4 46 6 39 5

РНР-Т7Н98 0 87 0 48 53 18 36 12 35 5 48 9

РОТ-ТЫН 0 87 051 36 168 1 3 155 46 8 36 4

РОТ-ПЬ 0 83 0 52 24 19 24 17 45 6 35

РНА-Т4Н98 0 92 0 52 28 36 99 37 7 48 8

РНА-Т5Н98 0 93 0 50 27 28 1 23 12 8 38 9 46

РНА-БкЗОО 1 15 0 66 17 1 6 17 5 58 5 22 4

РРА-Т4Н98 0 86 0 57 127 1 1 12 1 26 5 60 3

РРА-Т5Н98 1 02 0 67 28 3 152 32 4 49 4

РРА-Т7Н98 1 00 0 60 75 98 22 118 34 9 51 1

РРА-ТЗЬ98 0 76 0 66 120 27 16 7 37 2 43 5

РРА-БкОО 0 88 0 74 27 26 15 48 6 33 8

РРА-БкЗОО 1 18 0 89 27 3 2 16 8 30 0 50 0

РООМ-ТНН 0 67 1 18 29 67

РООМ-ТТЬ 0 67 127 52 5 5

Гуминовые вещества почв

8НА-Ри/94 0 92 0 46 12 19 1 17 46 36

8НА-Рш96 1 10 0 46 14 19 4 19 34 43

8НА-Р\У98 1 05 0 40 15 25 17 7 33 7 46 1

ЭНА-Р\УК 0 93 041 17 2 15 43 40

8НА-Р§94 1 00 0 45 14 22 1 1 15 2 45 6 38 1

8НА-РЕ96 0 93 0 48 16 2 17 42 39

8НА-Рр94 1 09 0 60 13 21 1 9 156 43 8 38 7

8НА-Рр96 1 11 0 48 и 21 3 17 31 49

8НА-Ор94 1 06 0 63 12 22 2 15 46 37

8НА-Ош94 0 96 0 43 12 21 1 19 48 32

8НА-Ст94 0 66 0 34 14 21 I 5 14 3 56 8 27 4

Препараты ГВ отношения М№ Распределение углерода, %

н/с О/С СУИ Сс-о От См Сан

8НА-аУ94 0 62 0 42 16 15 3 15 54 28

БНА-аШ 0 79 0 35 14 163 33 157 52 0 29 0

SFA-Pg94 0 92 0 58 18 12 6

5РА-Р§96 0 88 061 19 3 1 18 41 3 37 6

БРА-Рр94 1 06 0 57 12 100

8РА-Рр96 0 91 0 54 11 2 23 26 49

8РА-Р™94 0 90 0 60 27 102

БРА-Р^^б 0 94 0 58 17 90 4 195 33 3 43 2

БРА-Р№98 0 84 0 63 40 3 4 198 33 1 43 7

5РА-0\У94 0 98 0 53 15 14

БРА-СЛОО 0 81 0 52 16 22 154 49 1 33 3

80НР ^96 0 67 1 06 146 79

БОНР-Рр96 071 1 14 283 72

80НР-Р\У96 0 90 1 15 167 63

Гумнновые вещества углей

СНА-АвК 0 79 0 32 112 15 6 05 169 57 8 24 8

СНА-АШ 0 81 031 77 94 1 15 56 28

СНА-ЯО 0 78 0 43 55 16 4 29 177 65 9 13 5

CHA-Pow 0 93 041 53 94 3 1 152 57 3 24 4

СНА-СЬ02 0 72 0 25 23 99 28 13 9 59 5 23 8

СРА-СТЛг 0 89 0 37 35 31 0 58 198 42 8 31 5

сни-оьог 0 76 031 26 92 23 12 3 52 4 33

СНМ-Ы,02 0 82 0 50 15 20 5 26 17 1 51 5 28 8

CHM-Pow 0 82 0 49 15 57

СТО-ОШ 0 74 0 30 31 5 2 1 5 49 3 44

СНВ-вШ 0 69 0 21 26 53 15 I 59 20 6

Гумнновые вещества природных вод

АНР-1ШХ2 0 88 0 55 55 73 1 3 176 28 1 53 0

АНА-Ж 0 98 0 59 51 12 9 50 170 28 0 51 0

АРА-ЭЛ 1 08 0 62 88 96 60 150 38 0 36 0

ЛООМ-ЭЯ 0 96 0 61 56 8 2 0 0 30 0 42 0

Гумнновые вещества донных отложений

ВНА-ЭкОО 0 42 1 1 17 17 1 6 11 36 0 55 2

ВРА-ЭкО! 0 73 0 79 19 19

Модифицированные гумнновые вещества

Гидроксилпрованные гумнновые вещества СНР-ОРг 0 81 0 42 53 38 12 8 60 2 23 2

СНР-ЯРг 0 81 0 42 54 67 13 1 58 22 2

СНР-ОЕ1 0 85 0 38 53 92 148 50 3 25 7

СНР-Ш 0 89 0 38 52 84 14 5 53 4 23 7

СНР-ОРе 1 18 0 37 52 6 161 55 3 22 6

СНР-ИГе 0 85 0 38 53 67 161 53 3 23 9

Гндрохиноновые СНР-Н<3100 сополимеры гумнновых веществ 1 18 026 53 16 5 82 11 3 59 5 21

СНР-Н<3250 1 15 0 34 54 14 0 6 1 8 1 56 6 29 2

снр-н<3500 1 20 0 38 55 147 46 83 70 6 165

СИР-НВ(}250-5% 0 85 0 36 53 90

СНР-НВд250-12% 0 89 0 35 54 78

Препараты ГВ

Атомные отношения

Я/С О/С C/N

Распределение углерода, %

Сою Сто См С А11,

8 1 13 1 58 6 20 2

66 132 65 1 15 1

46 10 1 72 5 12 8

10 5 14 5 61 14

107 176 40 0 30 0

75 12 7 62 4 174

17 55 22

13 59 23

11 55 30

Пирокатехиновые сополимеры гуминовых веществ

СНР-РСЮО 0 76 0 43 52 18 5

СНР-РС250 0 80 0 4 0 53 1 9 3

СНР-РС500 0 81 0 41 52 21 1

п-бензохиноновые сополимеры гуминовых веществ CHP-BQ100 1 05 0 37 55 201

CHP-BQ250 0 71 0 37 54 20 6

CHP-BQ500 1 01 0 34 54 18 4

Сополимеры гуминовых веществ с фенолом CHP-PH-N100 0 41 0 77 54 9 6

CHP-PH-N250 0 40 0 80 52 9 4

CHP-PH-HQ250 0 40 0 73 53 7 3

СНР-РН-РС250 0 38 0 77 51 8 2

CHP-PH-HQ250-A 0 85 0 43 53 СНР-РН-РС250-А 0 86 0 45 53 Сополимеры гуминовых веществ с салициловой кислотой CHP-SA250 0 79 0 44 53 10 1

CHP-SA250G 0 80 0 44 53 9 7 5 16

CHP-SA250A 0 79 0 44 55 9 6 6 6 16 2

Сополимеры гуминовых веществ с 2,3-дип1дроксибензойной кислотой CHP-DHBA250 0 77 0 39 52 9 8

CHP-DHBA250G 0 77 0 39 51 9 9 5 9 16 0

CHP-DHBA250A 0 75 0 39 53 10 1_

Разнообразие свойств использованных в работе препаратов проиллюстровано диаграммой ван Кревелена (рис 1 2), отражающей распределение ГВ по степени их ненасыщенности (атомное отношение Я/С) и обогащенности кислородом (атомное отношение О/С)

54 49 9

52 3

25 27 2

25 9

1 5 1

Н/С

О ГВ торфов

□ ГВ почв

А ГВ углей О ™

уо ГВ природных вод Модифицированные ГВ

—,-> О/С

12 14

Рис. 1.2 Диаграмма ван Кревелена для исследованных в работе препаратов ГВ

Как видно из представленных на рис 1 2 данных, ГВ, выделенные из углей и природных вод, характеризуются достаточно узкими диапазонами значений Я/С и О/С и образуют достаточно хорошо обособленные группы ГВ почв и торфов, напротив, образуют смешанную группу с широким разбросом этих показателей В целом можно отметить, что использованные в работе ГВ характеризовались разбросом значений атомных отношений Я/С и О/С 0 62-1 20 и 0 21-127 соответственно, что позволяет сделать вывод о представительности созданной выборки препаратов

Глава 2 Исследование защитного действия ГВ методами бнотестировання-метрологическая характеристика и количественное описание детоксифицирующих свойств

2 1 Метрологическая характеристика использованных методов биотестирования

Несмотря на высокий уровень существующих в настоящее время инструментальных методов, при проведении исследований, связанных с биологическими объектами, неизбежно применение биотестирования, позволяющего получать интегральную оценку воздействия на живые организмы различных факторов окружающей среды При использовании методов биотестирования необходимо принимать во внимание нерешенную проблему достоверности получаемых результатов, связанную с неизбежной погрешностью метода и высокой гетерогенностью свойств, характерных для биологических объектов Получение надежных, научно обоснованных результатов было достигнуто правильным планированием структуры исследования Одним из обязательных этапов является плакирование объема выборки, позволяющего получать данные, отвечающие заданной точности Выбор необходимого размера выборки п проводили как

зМ(1 + 1 2т) Ь

где 5 - стандартное отклонение, 1р - коэффициент Стыодента для вероятности Р и объеме выборки в предварительных экспериментах т, 1Р выбираемая экспериментатором максимальная разница между истинным и выборочным средним, выраженная в процентах Для наших исследований необходимые объемы выборки рассчитывали для 1р = 5 и 10% и Р = 90, 95 и 99% Результаты расчетов для основных методов биотестирования, использованных в работе, приведены в табл 2 1

Табл. 2 1. Необходимые объемы выборки при проведении биотестирования использованными методами при различных значениях максимально допустимого отклонения среднего значения от истинного 1р и вероятности Р

Тест-отклик

1р = 5%_1р = 10%

Р- 99% Я = 95% Р = 90% Р = 99% Р= 95% Р = 90%

Биотестнрование в водных средах

Метод проростков

Побеги 104+58 62+34 44±25 26+14 15+9 11+6

Корни 143±31 85+19 61±13 36+8 21+5 15+3

Альгоюгическое биотестирование

РЛт 12±3 8+2 5±2 2+1 2+1 2+1

Биотестирование в почвенных средах

Лабораторно-вегетационные эксперименты

Длина побегов 88±18 54+15 39±10 50±10 20+3 14±3

Масса побегов 90±12 58+10 40+10 54±9 23±5 17±4

Почевые эксперименты

Масса побегов 1646±125 994+74 713±29 900±51 370+45 251±32

При проведении биотестирования в работе использовали объемы выборок, рассчитанные для 1р = 5% при вероятности Р = 99% Исключение составили полевые эксперименты, для которых рассчитанные необходимые объемы выборки колебались

в пределах от 251 до 900 даже при 1р = 10% Поэтому определение объема выборок при проведении полевых экспериментов осуществляли на основании производственных возможностей

2 2 Копичественное описание детоксифицирующих свойств ГВ

Защитное действие ГВ по отношению к живым организмам в присутствии токсикантов различных классов, те явление детоксификации, ранее отмечалось многими исследователями Тем не менее, большинство работ посвящено исключительно констатации наблюдаемого явления, в то время как проблема его количественной характеристики, направленная на поиск его взаимосвязи со структурными параметрами ГВ, их собственным действием на организмы и связующей способностью по отношению токсикантам практически не проводились

Для количественной оценки защитных свойств ГВ в присутствии токсикантов (обычно в данном саучае используют термин «детоксифицирующих») нами был использован подход, основанный на использовании коэффициента детоксификации D и константы детоксификации Косопределяемых из данных токсикологических экспериментов Достоинством коэффициента детоксификации D является то, что он отражает изменение уровня токсичности Т в присутствии ГВ (Тт+гв) но сравнению с токсичностью Г в их отсутствие (Гг), учитывая при этом возможное изменение тест-отклика под влиянием собственного воздействия ГВ Принимая, что

(22)

ГВ

где R(s - тест-отклик в контроле (без токсиканта и ГВ), Rj - тест-отклик в присутствии Т, Ягв тест-отклик в присутствии ГВ, Rt+гв тест-отклик в присутствии токсиканта и ГВ, получаем

Т -Т Т

Д-. г т + гв_;_ т* гв /9 4)

Т Т

Т ГВ

При условии, что чувствительность тест-организмов к собственному действию ГВ не изменяется в присутствии токсиканта, использование коэффициента D позволяет охарактеризовать детоксифицирующий эффект ГВ, обусловленный только связыванием токсиканта в нетоксичные комплексы, на фоне их стимулирующего воздействия на тест-объект Поэтому, зная зависимость коэффициента D от концентрации ГВ (т н кривую детоксификации), можно рассчитать константу детоксификации KqcD Преимущество данного параметра при оценке детоксификации по сравнению с коэффициентом D состоит в том, что сети последний позволяет получить точечную оценку детоксификации, то K0cD является характеристикой детоксифицирующей способности ГВ во всем диапазоне концентраций При этом его физический смысл аналогичен константам связывания, определяемым в химических экспериментах Для вывода уравнения данной константы запишем уравнение связывания токсиканта ГВ

Т + ГВ<г>Т-ГВ (2 5)

Долю токсиканта, находящегося в свободном состоянии а, можно выразить через соответствующую константу связывания

[гМгГлв]= (2 6)

В условиях, когда токсичность раствора прямо пропорциональна концентрации токсиканта, токсичность в его присутствии будет выражаться следующим образом Гг=£хСг (2 7)

где к - коэффициент пропорциональности

Токсичность токсиканта в присутствии ГВ аналогично можно записать как

Тт.гв=кх[Т] (2 8)

Подставляя (2 7) и (2 8) в уравнение (2 8), получаем

0 = 1-Ш-=1-а (29)

Выражая долю несвязанного токсиканта а через концентрацию ГВ на основании зависимости Кос от а (2 б), получаем

£>= Кос°хСга (2Ш)

1 + Кос°*Сгв

Фигурирующую в данном уравнении константу, определяемую видом зависимости эффекта детоксикации от концентрации ГВ, мы назвали константой детоксификации - К0с° Она будет эквивалентна константе химического связывания в случае, если величина эффекта детоксикации О зависит только от концентрации свободной формы токсиканта На практике Кос° можно рассчитать путем аппроксимации экспериментальных зависимостей Л от концен1раицИ ГВ уравнением (2 10) Поэтому результаты всех токсикологических экспериментов предъявляли в виде соответствующих кривых детоксификации

Глава 3. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса

3 1 Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса в водной среде

В качестве модельного гербицида для создания гербицидного стресса использовали атразин - представитель класса сим-триазиновых гербицидов, ингибиторов фотосинтеза Выбор был обусловлен высокой устойчивостью этого гербицида в окружающей среде

Изучение связывающей способности ГВ по отношению к гербициду показало, что диапазон изменения констант связывания атразина ГВ составил 110-575 л/кг ОС (табл 3 1), что хорошо согласуется результатами предыдущих исследоватетей и свидетельствует о незначительном взаимодействии атразина с ГВ

Табл. 3.1. Константы связывания К0с атразина ГВ различного происхождения

Препарат Кос, л/кг ОС Препарат Кос, л/кг ОС

ОВ водного экстракта торфа ГК дерново-подзолистых почв

РООМ-ТНН 87+5 8НА-Р\у94 380+20

ФК почв БНА-Рр94 400124

8РА-Р\У96 192±12 БНА-Рт*96 281+17

8РА-Рр9б 110±10 8НА-Рр96 181+30

5РА-Р896 275±17 БНА^96 380+23

Сумма ГК и ФК торфов ГК серых лесных почв и черноземов

РНА-НТО " 300+20 8НА-0\У94 575±34

РНР-Т498 377± 8НА-Ст94 404+23

ГК бурого угля 8НА-аУ94 501±31

СНА-АвК 575+35 8НА-Р\УК 444+25

Полученные значения Кос использовали для выявления взаимосвязи между связывающей способностью и структурой ГВ (табл 3 1 и 11) Корреляционный анализ показал наличие связи Кос с САг и СА/СМ - параметрами, характеризующими степень ароматичности ГВ Коэффициенты корреляции г для пар переменных «САг -Кос» и «Са/См - К0с» составили 0 91 и 0 87 Наличие данной взаимосвязи подтверждает важную роль ароматических фрагментов ГВ в процессе взаимодействия с атразином Коэффициент корреляции между препаратов ГВ и Кос составит 0 73 Это может свидетельствовать о преимущественном связывании атразина с высокомолекулярными фракциями ГВ

Для исследования детоксифицирующей способности ГВ по отношению к атразину в водной среде были выбраны препараты ГВ торфов (РНР-ТТЬ, РНР-ТНН) и ОВ водных экстрактов этих же торфов (РООМ-ПЪ, РООМ-ТНН), что было обусловлено максимальными различиями в свойствах данных препаратов При биотестировании в качестве тест-объекта использовали растения мягкой пшеницы Тгшсит аезШит Ь , а в качестве тест-отклика - интенсивность фотосинтеза растений, которую оценивали по отношению Ую/Ул замедленной флуоресценции (ЗФ), характеризующему скорость транспорта эчектронов, где У1т - интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света 100%, У„ - интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света п%

Проведенные эксперименты показали, что внесение ГВ и ОВ водных экстрактов торфов в биотестируемую систему способствовало снижению токсичности атразина во всех исследованных концентрациях Однако наблюдаемые эффекты были невелики значение коэффициента £> варьировалось в пределах 0 2-0 6, т е полного снятия токсичности не наблюдали Значения констант связывания Кос0> рассчитанные на основании полученных данных согласно уравнению (2 10), приведены в табл 3 2

Табл 3.2. Эффективные константы связывания Кос0 атразина ГВ в водной среде

Препарат ГВ Косл/кг ОС

РООМ-ТНН 918+15

РООМ-ТТЬ 957+26

РНР-ТНН 632+31

РНР-ТТЬ 440+19

Как видно из табл 3 2, значения Кос° в 2-10 раз превышали значения Л^с (табл 3 1), причем для препаратов OB водного экстракта торфа это различие было более выражено, чем для препаратов ГВ Кроме того, значения Кос° возрастали при уменьшении Mw препаратов ГВ, в то время как для значений Кос была отмечена обратная тенденция Таким образом, несмотря на близкие значения, константы взаимодействия Кос 11 K0CD по-разному зависели от свойств ГВ, т е детоксификация и связывание атразина определялись различными процессами Подтверждением этому является также установленная взаимосвязь для пар переменных «О/С - К0с°» и «Я/С - Кос°», коэффициент корреляции для которых составил 0 94 и 0 96, соответственно, в то время как для Кос подобной взаимосвязи отмечено не было

На основании полученных данных можно высказать предположение, что связывание атразина ГВ не является основным фактором, определяющим детоксификацию атразина Для установления причины детоксификации атразина ГВ необходимо быто провести дополнительные эксперименты, при этом в качестве тест-обьектов следовало выбрать бочее простую, чем целый организм, систему Поэтому для оценки защитного действия ГВ в качестве тест-объекта была использована одноклеточная водоросль Chlorella pyrenoidosa Тест-откликом служите показатели F/Fm и FJFm кривой индукции флуоресценции, характеризующие фотосинтетическую активность водоросли При этом первый показатель зависит только от концентрации специфических ингибиторов фотосинтеза (те атразина), а изменение отношения FJFm может происходить вследствие широкого ряда причин и характеризует состояние водоросли в целом Так как ГВ обладают собственной флуоресценцией, а их присутствие существенно сказывается на величинах FJFm, предварительно были проведены эксперименты, направленная на оценку мешающего влияния ГВ На основании полученных данных был предложен способ расчета показателей F/Fm и FJF„ кривой индукции флуоресценции с учетом собственной флуоресценции ГВ

Согласно нашим первоначальным предположениям, связывание атразина ГВ должно было привести к снижению концентрации свободного гербицида и, как следствие, уменьшению токсичности атразина Для проверки этой гипотезы первоначально регистрацию токсичности атразина проводили сразу после внесения предварительно приготовленной смеси атразина с ГВ Время взаимодействия ГВ и атразина составляло от 1 ч до 7 с Было установлено, что присутствие ГВ не влияло на показатель F/Fm, т е взаимодействие атразина с ГВ в условиях эксперимента крайне незначительно in и отсутствует

В связи с тем, что детоксификация в присутствии ГВ может быть обусловлена не только связыванием токсиканта, но также их собственным действием на организмы, то необходимо было провести эксперименты с ненулевой экспозицией Проведение таких экспериментов позволило регистрировать «суммарную» детоксификацию атразина в присутствии ГВ, обусловленную вышеупомянутыми причинами В качестве тест-отклика использовали показатель FJFm Было установлено, что внесение ГВ приводило к снижению токсичности атразина (рис 3 I) В большинстве счучаев кривые детоксификации имели S-образную форму с выходом на плато при концентрации ГВ 30 мг/л Исключение составили препараты водных экстрактов из

зависимость О

РЕЮМ-ТНН

РНР-ТГЬ

ЭНА-Рр96

БНА-Ри^

8НА-Р\у94

8НА-Ор94

Рис. 3.1. Кривые детоксификации атразина ГВ различного происхождения.

Рассчитанные значения Кос° атразина ГВ (табл. 3.3) варьировались в пределах 5.0х104-1.9х106 л/кг ОС, превышая на 2 порядка аналогичные величины, полученные в экспериментах с растениями. ГВ водных вытяжек почв обладали наибольшей детоксифицирующей способностью по отношению к атразину. Близкими к ним значениями Кос° характеризовались ГК угля и чернозема. Препараты ФК почв практически не снижали токсичность атразина.

Сравнение Кос и Кос (табл. 3.1) показало, что Кос в среднем на два-три порядка превышали К0с, при этом коэффициент корреляции между ними составлял 0.12. Кроме того, для Кос наиболее тесную корреляцию наблюдали с содержанием САг в ГВ, тогда как для Кос° такая взаимосвязь отсутствовала. Найденная закономерность увеличения защитного действия ГВ при переходе от использования в качестве тест-объекта многоклеточного организма (растения) к одноклеточному (водоросли) позволяет предположить наличие взаимосвязи между защитными свойствами ГВ и их поглощением тест-организмами. Действительно, для Кос° нами была установлена значимая взаимосвязь с содержанием низкомолекулярной фракции <5 КДа - предела проницаемости клеточных мембран (г = 0.93). Установленные закономерности свидетельствует о том, что связывание и детоксификация атразина ГВ в водной среде определяются различными процессами, а ведущую роль в проявлении защитных свойств ГВ по отношению к растениям в данном случае играет собственная физиологическая активность ГВ. Однако, как показали проведенные эксперименты, в выбранных нами условиях ГВ в целом не обладали стимулирующим действием по отношению к культуре водоросли (рис. З.2.).

торфа РЭОМ-ТНН и РООМ-ТТГ, для которых наблюдали л от концентрации ГВ.

Концентрация ГВ, мг/л

Табл. 3.3. Эффективные константы связывания Кос° атразина ГВ в водной среде. Тест-культура Chlorella pyrenoidosa

Препарат Кос", л/кг ОС Препарат Кос", л/кг ОС

Сумма ГК и ФК природных вод ГК почв

AHF-RMX2 2.9x105 ГК дерново-подзолистых почв

PDOM-TH 5.8хЮ5 SHA-Pw94 1.2x105

PDOM-TL 4.5х105 SHA-Pp94 1.4х105

SDHF-Pw96 2.1 х 106 SHA-Pg94 1.0x104

SDHF-Pp96 1.8х106 SHA-Pw96 5.бх105

SDHF-Pg96 1.9x106 SHA-Pp96 5.5х105

ФК почв SHA-Pg96 5.6х 105

SFA-Pg94 1.4x105 ГК серых лесных почв

SFA-Gw94 5.3х105 SHA-Gw94 2.0x10

SFA-Pw96 5.0x104 SHA-Gp94 1.4х105

SFA-Pp96 5.0x10" ГК черноземов

SFA-Pg96 6.0x104 SHA-Cm94 2.9x105

Сумма ГК и ФК торфов SHA-CtV94 3.7x105

PHF-THH 5.7х105 SHA-PwN 7.1х105

PHF-TTL 1.3х106 ГК бурого угля

PHF-T498 8.9x105 CHA-AGK 7.4x10

Погрешность определения Кос составила 15%

Рис. 3.2. Влияние ГВ на фотосинтетическую активность Ск ругепо1(1о$а. Концентрация ГВ 50 мг/л. Время экспозиции 3 ч.

Можно предположить, что стимулирующая активность ГВ проявляется только в стрессовых для организмов условиях. Действительно, в ряде экспериментов нами было отмечено значительное увеличение фотосинтетической активности хлореллы при внесении ГВ. При этом обязательным условием проявления стимулирующего действия ГВ являлось негативное изменение условий культивирования (например, снижение температуры) (рис. 3.3). Наиболее выраженное защитное действие было отмечено для препаратов ГВ, характеризующихся высоким содержанием кремния.

120 п

При оптимальных условиях

БОНТ-Р^б -о- 50НР-Р&96 При неблагоприятных условиях 8ШР-Руу96 БОет-Р^б

0 +

0 10 20 30 40 50 60 Концентрация ГВ, мг/л

Рис. 3.3. Влияние ГВ на фотосинтетическую активность Ск ругепок!оза при оптимальных (37°С) и неблагоприятных (25°С) условиях

Полученные результаты свидетельствуют о зависимости физиологической активности ГВ от внешних условий, описанную ранее другими исследователями Таким образом, наблюдаемую детоксификацию атразина ГВ в водной среде следует объяснять действием ГВ на тест-организмы, а не связыванием атразина в нетоксичные комплексы

3 2 Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса в почвенной среде

Для изучения связывающей способности ГВ по отношению к атразину была создана выборка образцов из 3 почв различных почвенно-географических зон Она включала в себя образцы дерново-подзолистой, серой лесной почвы и чернозема В связи с тем, что на адсорбционно-десорбционное поведение атразина могут оказывать влияние также и почвенные ферменты, часть экспериментов была проведена в присутствии лакказы - широко распространенной в почве оксидоредуктазы, уникальной особенностью которой является широкая субстратная специфичность, высокая термо- и рН-стабильность и высокая активность в почве в течение круглого года Целью проведения экспериментов в присутствии лакказы являлась оценка возможности взаимодействия атразина с ГВ по механизму окислительного связывания, приводящего к необратимому включению гербицида в структуру ГВ с образованием ковалентных связей Возможность детоксификации ксенобиотиков по указанному механизму в настоящее время показана для веществ фенольной и аминной природы, но не изучена для атразина, в отношении которого существуют лишь отдельные противоречивые данные Адсорбционно-десорбционное поведение атразина в присутствии лакказы изучали с использованием фермента из базидиомицета Сопо1ш Ыгшш

На основании полученных данных строили изотермы адсорбции атразина (рис 3 4) и рассчитывали коэффициент распределения Ка, который в данных условиях эквивалентен константе адсорбции При расчете константы связывания атразина с органическим веществом К0с проводили нормирование на содержание ОС в почве (табл 3 4)

Аадс, чМ/кг ♦Дерново-подзолистая Аадс, мМ/кг ♦Дерново-подзолистая

А Б

Рис. 3.4 Изотермы сорбции атразина различными почвами в отсутствие (А) и присутствии лакказы (Б)

Табл 3 4. Коэффициенты распределения А'^ и константы связывания Кос атразина исследованными почвами

Почва К„ Кос, л/кг ОС

Дерново-подзолистая 14 3±0 2 379

Серая лесная 3 2+0 1 159

Чернозем 9 2+0 2 159

Константы распределения атразина в исследованных почвах изменялись от 3 2 до 14 3 л/кг ОС, что хорошо согласуется с данными предыдущих исследователей Максимальное значение этого показателя было зафиксировано для чернозема, что связано с самым высоким содержанием ОС в этой почве Полученные значения констант связывания Кос варьировались в пределах 159-379 т/кг ОС и в целом были близки к ранее полученным константам связывания для ГВ в водной среде (табл 3 1) Существенное различие величин Кос Для дерново-подзолистой и остальных почв указывает на то, что связывание атразина определяется не только содержанием ОС в почве, но также и структурными особенностями почвенных ГВ

Анализ изотерм сорбции в присутствии лакказы (рис 3 4Б) показал, что внесение фермента приводит к выраженным изменениям процесса сорбции Вместо линейных изотерм, полученных при изучении связывания атразина почвами без внесения фермента, в начале наблюдали резкое увеличение количества адсорбированного атразина при росте его равновесной концентрации, которое затем сменялось снижением интенсивности адсорбции Сложный характер адсорбционных изотерм в данном случае свидетельствует о наличии различных механизмов связывания гербицида почвами При этом наблюдали значимое увеличение параметров, характеризующих связывание гербицида почвой (табл 3 5)

Табл. 3.5. Коэффициенты распределения К^ и константы связывания Кос атразина исследованными почвами в присутствии лакказы

Почва А'л л/кг Кос> л/кг ОС

Дерново-подзолистая 25 9+0 3 687

Серая лесная 25 1±0 3 1249

Чернозем 23 8+0 2 411

В присутствии лакказы константы связывания атразина возрастали до 4111249 л/кг ОС, превышая аналогичные значения без фермента в 18-8 раз

Исследование, направленное на изучение взаимодействия атразина с дакказой показало, что сама лакказа не оказывала влияния на деградацию или сорбционное поведение атразина Поэтому на основании полученных результатов можно сделать вывод об увеличении связывающей способности почвенного органического вещества в присутствии этого фермента По аналогии с другими ксенобиотиками можно предположить дополнительное включение атразина по механизму окислительного связывания, являющееся каталитически инициированным ковалентным связыванием ксенобиотиков В связи с тем, что в результате протекания реакции окислительного связывания ксенобиотик должен включаться в структуру органического вещества необратимо, для проверки предположения о связывании атразина по указанному механизму нами были проведены эксперименты по десорбции атразина Для численной описания изотермы аппроксимировали уравнением Фрейндлиха, а описание гистерезиса проводили с использованием коэффициента гистерезиса Н, представляющего собой отношение степенных коэффициентов изотерм адсорбции nF и десорбции nFll в уравнении Фрейндлиха (табл 3 6)

Табл. 3.6. Параметры уравнения Фрейндлиха и коэффициенты гистерезиса адсорбционно-десорбционных изотерм атразина исследованными почвами в присутствии и отсутствие лакказы

Почва Адсорбция Десорбция Я

Ке Пг KF ttFd

В отсутствие изкказы

Дерново-подзолистая 4 50±0 20 0 72±0 03 0 57±0 03 0 27±0 02 2 7±0 1

Серая лесная 0 81±0 04 0 56±0 03 1 68±0 08 0 52±0 03 1 1±0 1

Чернозем 5 55±0 30 0 83±0 04 0 36±0 02 0 23±0 01 3 6±0 2

В присутствии лакказы

Дерново-подзолистая 5 80±0 29 0 60±0 03 0 36±0 02 0 130±0 007 4 6±0 2

Серая лесная 3 13±0 15 0 56±0 03 0 20±0 01 0 029±0 001 19 3±0 9

Чернозем 6 79±0 34 0 66±0 03 0 22±0 01 0 060±0 003 11 0±0 5

Константы адсорбции Фрейндлиха Кр для изученных почв в вариантах без лакказы варьировались в диапазоне 0 81-5 55, что хорошо согласуется с данными других авторов Как и при аппроксимации данных линейной зависимостью (расчет КсГ), внесение лакказы приводило к резкому увеличению адсорбции атразина КР возрастали до 3 13-6 79, значительно превышая аналогичные значения без лакказы

Как показывают данные табл 3 6, связывание атразина почвами характеризовалось значительным гистерезисом Однако внесение лакказы во всех случаях способствовало резкому снижению количества десорбированного атразина Величины гистерезиса для исследованных почв составили 4 6-19 3, что превышало значения Я для адсорбции-десорбции без фермента в 2-18 раз

Основываясь на проведенных экспериментах можно сделать вывод, что внесение лакказы С /»гш/ги способствует увеличению связывающей способности почв по отношению к атразину При этом в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит, вероятно, по механизму окислительного связывания, о чем свидетельствует анализ характера изотерм адсорбции и десорбции, а также увеличение количества необратимо связанного гербицида Высказанную гипотезу подтверждает также тот факт, что в ходе проведения экспериментов нами не было

установлено образование метаболитов атразина, т е отсутствовали процессы разложения гербицида, которые также мопи привести к необратимому выведению атразина из среды Принимая во внимание тот факт, что токсичностью обладает лишь несвязанная форма гербицида, можно сделать вывод о том, что присутствие лакказы в почве способствует детоксификации атразина в окружающей среде Полученные данные могут быть использованы для разработки биотехнологических подходов при детоксификации почв, загрязненных атразином и другими гербицидами сим-триазинового ряда

Как уже говорилось выше, связывающая способность почв по отношению к атразину определяется не только общим содержанием органического вещества, но также и структурными особенностями входящих в его состав ГВ Для исследования зависимости связывания атразина почвами от свойств ГВ были проведены эксперименты с использованием 11 модельных комплексов ГВ с каолинитом Выбор каолинита в качестве минеральной подложки был обусловлен тем, что данный представитель группы глинистых алюмосиликатов широко представлен в илистых и коллоидных фракциях всех почв и представляет собой слоистый ситикат с нерасширяющейся кристаллической решеткой, что позволило минимизировать влияние на процессы адсорбции свойств самого минерала

В связи с низким содержанием ГВ (менее 1%) в полученных комплексах (табт 3 7) для расчета констант связывания использовали подход, позволяющий учитывать взаимодействие с минеральной фазой адсорбента Для этого принимали, что наблюдаемый коэффициент распределения зависит от связывающей способности минерала, ГВ, а также их относительного содержания в комплексе

К> =ГтхКт +/осхКос (3 1)

где Кт - константа связывания с минералом, /ос - доля ГВ в составе комплекса каотинит-ГВ, {т рассчитывали как I-(ос При этом считали, что Кт равна величине К^ исходного каолинита Характеристику обратимости адсорбции проводили аналогично экспериментам по изучению связывания атразина почвами

Результаты проведенных экспериментов приведены в табл 3 7 Там же для сравнения приведены значения констант связывания с ГВ в водной среде

Табл 3.7 Содержание ОС и характеристика адсорбции-десорбции атразина модетьными комплексами каолинита с ГВ различного происхождения

Сорбент ОС, кг/кг Кл л/кг Кос, л/кг ОС йосХраствор), ч/кг ОС Я

колинит - 1 72±0 09 - 1 21

АНА-5Но13 0 229±0 003 2 08±0 09 157 - 9 24

5РА-Р\У96 0 165±0 008 1 93±0 09 128 192+12 5 90

8РА-Ря9б 0 166+0 009 1 94±0 09 137 275+17 8 30

8НА-Р\У94 0 249+0 008 2 20+0 09 194 380+12 7 17

вНА-Ри^б 0 264±0 008 2 09±0 07 143 28Ш7 5 73

5НА-ОУ94 0 245±0 009 2 17±0 08 184 501±31 5 93

5НА-Ст94 0 248±0 006 2 17±0 09 184 404±23 7 76

РНА-НТО 0 274±0 009 2 20±0 07 178 300+10 231

РНА-Н8 0 286+0 009 2 06+0 06 121 - 3 19

СНА-АОК 0 237±0 005 2 28±0 09 238 575+35 7 18

РНА-ЕША 0 240±0 004 2 48+0 09 319 - 5 40

Как показывают данные табл 3 7, несмотря на относительно невысокое содержание ГВ в модельных комплексах, величины коэффициентов распределения в присутствии ГВ возрастали с 1 72 до 1 93-2 48 л/кг При этом значения констант связывания атразина ГВ в составе органоминеральных комплексов были в среднем в полтора-два раза меньше, чем аналогичные величины для ГВ в водной среде Это свидетельствует о меньшей доступности мест связывания дтя атразина в ГВ, адсорбированных на каолините Величины коэффициента гистерезиса Я (табл 3 7) изменялись от 2 31 до 9 24, значительно превышая единицу, что свидетельствует о частичной обратимости адсорбции атразина

При статистическом анализе данных была обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь между Кос и параметрами, характеризующим гидрофобность ГВ 1СЛг!Са1-к 0 и САг.ц с (г = 0 90 и 0 76) Аналогичная взаимосвязь ранее нами была отмечена для пары Кос - Слг.нс (г = 095) при исследовании взаимодействия ГВ с атразином в водной среде Это указывает на гидрофобное взаимодействие как ведущий механизм связывания атразина ГВ в водных и почвенных средах

Исследование детоксифицирующей способности ГВ по отношению к атразину в почве проводили методом лабораторных вегетационных экспериментов на образцах дерново-подзолистых почв Тест-объектом служили растения пшеницы, откликом -сырая надземная биомасса

Концентрация СНА-АОСхЮ5, кг ОС/кг

Рис. 3.5. Детоксифицирующая способность препарата ГК угля СНА-АОК по отношению к атразину в условиях вегетационного эксперимента на различных почвах

Препарат ГК угля СНА-АОК проявил различную детоксифицирующую способность по отношению к атразину на исследованных почвах (рис 3 5), что связано с неодинаковой эффективностью гербицида на почвах Так, внесение атразина в варианте дерново-подзолистой почвы под лесом вызывало 25% снижение биомассы, для пахотной и огородной почв эти величины составили 93% и 80% соответственно При этом на исследованных почвах биомасса пшеницы в варианте с внесением атразина и СНА-АОК в максимальной дозе составляла 150±6% от варианта с внесением атразина Рассчитанные константы К0с° составили 2 1х104,

ОЗхЮ4 и О 7x104 л/кг ОС для дерново-подзолистой почвы под лесом, пашней и огородом соответственно и были близки к полученным при изучении сорбции атразина ГВ, адсорбированными на каолините и почвами Это свидетельствует о том, что в почвенных средах основным фактором, определяющим детоксификацию атразина ГВ, является связывание гербицида, в то время как вклад собственного стимулирующего действия ГВ по отношению к растениям незначителен Принимая во внимание близость констант связывания К0с, найденных для ГВ в водных и почвенных средах, можно сделать вывод о том, что защитное действие ГВ в водных средах значительно превышает таковое в почвенных средах, что связано, по-видимому, с более низкой доступностью ГВ для растений

Глава 4. Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжелыми металлами

4 I Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжелыми металлами, в водной среде

В качестве модельного тяжелого металла (ТМ) использовали медь В связи с тем, что в настоящее время взаимодействие меди с ГВ достаточно хорошо изучено и многочисленными работами показано, что связывание меди ГВ происходит через кислородсодержащие функциональные группы, для проведения исследований использовали препараты модифицированных ГВ с искусственно введенными бензохиноновыми, пирокатехиновыми, гидрохиноновыми и феночьными фрагментами (табл 1 1), которые, как мы ожидали, должны были обладать повышенной связывающей способностью по отношению к меди Исследование защитного действия ГВ проводили с помощью биотестирования по методу проростков с использованием пшеницы

Результаты биотестирования показали, что внесение гуминовых препаратов приводило к снижению токсичности меди уже при концентрации 5 мг/л, а при концентрациях 30 мг/л и выше наблюдали полное снятие негативного действия меди (рис 4 1) Особо следует подчеркнуть, что при концентрациях ГВ 30 мг/л и выше длина корней в присутствии ГВ превышала даже контрольные значения для проростков, проращиваемых на дистиллированной воде без внесения меди

Длина корней, % от контроля

Концентрация ГВ, мг/л

Рис. 4 1В таяние различных ГК угля на длину корней проростков мягкой пшеницы Г ае$Шит в присутствии Си(П)

Защитное действие ГВ, искусственно обогащенных кислородсодержащими функциональными группами, практически во всех случаях было более ярко выражено, чем дня исходного препарата ГК (рис 4 2, табл 4 1) Это свидетельствует об определяющей роли введенных функциональных групп в реализации детоксифицирующей способности ГВ в присутствии к меди

- СНА-Ро\у

О"

-СНР-СТЮО -СНР-СТ250 -СНР-СТ500

0 СНА-Роит " -з£г-СНР-ВР100 - -В— СНР-В(3250 _ -X— СНР-ВС}500

10 20 30 40 Концентрация ГВ, мг/л

А Б

Рис. 4.2 Кривые детоксификации меди ГВ на примере пирокатехин-формальдегидных сополимеров (А) и сополимеров с п-бензохиноном (Б)

Табл 4.1. Эффективные константы связывания Кос меди ГК угля и их производными

Препарат Кос", л/кг ОС Препарат Кос, л/кг ОС

Нативные ГВ Пирокатехиновые сополимеры ГВ

СНА-Роуу 5 2x104 СНР-СТЮО 4 0x10"

СНА-Н80 15x105 СНР-СТ250 6 5х103

СНА-8аЬ 6 0x104 СНР-СТ500 7 ОхЮ4

Гидроксилированные ГВ Сополимеры ГВ с фенолом

СНР-ОРг 3 5x105 СНР-РН-МОО 1 ОхЮ3

СНР-ОЕ1 2 1х СНР-РН-Ы250 1 2x105

СНР-ОРе 2 5x105 СНР-РН-Н(}250 3 5х105

СНР-ЯРг 1 5x105 СНР-РН-Н(}250А 4 1х105

СНР-Ш 2 0x105 СНР-РН-РС250 51х105

СНР-ИРе 3 0x103 СНР-РН-РС250А 6 8х105

Сополимеры с салициловой кислотой п-бензохпионовые сополимеры ГВ

СНР-БА250 6 6x105 СНР-В<3100 7 ОхЮ5

СНР-8А2500 1 9x105 СНР-В<Э250 2 0x10'

СНР-8А250А 1 1х106 снр-в(35оо 2 5хЮ5

Сополимеры с 2,3-днгидрокснбеизойной кислотой Гпдрохиноновые сополимеры ГВ

СНР-ОНВА250 1 4x10' СНР-НОЮО 1 6x10

СНР-ОНВА2500 1 4x10' СНР-НО250 9 5х104

СНР-ОНВА250А 4 3х105 СНР-Н0500 5 9x104

СНР-НВО250-5% 8 ОхЮ5

СНР-НВО250-12% 10 ОхЮ5

Погрешность определения Кос составила 15%

Значения К0(р для природных ГВ варьировались в диапазоне бОхЮ4-I 5x105 ч/кг ОС, что незначительно превышает обычно приводимые в литературе данные по константам связывания меди ГВ (6 3х105-3 2х104 л/кг ОС) Это позволяет утверждать, что в водной среде защитные свойства ГВ по отношению к растениям в присутствии меди обусловлены, павным образом, связыванием металла в недоступные комплексы

4 2 Защитное действие ГВ в условиях стресса вызываемого тяжетыми металлами, в почвенной среде

Защитное действие ГВ в присутствии ТМ в почвенной среде изучали в условиях полевых экспериментов с использованием пшеницы в качестве тест-объекта Исследованные препараты включали ГК угля СНА-Ро\у и их гидрохиноновые сополимеры СНР-НВС?250-5%, и СНР-НВС}250-12%, характеризовавшиеся наибольшей величиной защитного действия в водной среде (табл 4 1) Опыты проводили в Московской обл (среднее количество осадков 650-700 мм, средняя зимняя и летняя температуры -7 и +19°С) на дерново-подзолистой почве (средний сугтинок, рН 5 6, содержание гумуса 3%)

Полученные результаты показали, что, ГВ проявляют выраженное защитное действие в присутствии меди (рис 4 2Б) При этом, как и в случае экспериментов в водной среде, в отсутствие стресса, вызываемого токсикантом, ГВ и их производные не обладали выраженной стимулирующей активностью (рис 4 2А)

Вес растений, % от контроля 120

80 -40

Вес растений, % от контроля 120

гЪ

80 40

^ [Ь й

пЬ

А Б

Рис. 4 2. Влияние ГВ и их производных на рост растений пшеницы в отсутствие (А) и присутствии (Б) меди в условиях полевого эксперимента 1 - контроль, 2- СНА-Ро\у,

3 - СНР-НВд250-5%, 4 - СНР-НВ(}250-12%, 5 - Си504х5Н20

Рассчитанные константы связывания меди в почвенной среде были на порядок меньше аналогичных величин, полученных в экспериментах в водных средах, и составили 9 9x102, 2 7x103, 2 0x104 для препаратов СНА-Ро\у, СНР-НВС>250-5% и СНР-НВС?250-12%, что соответствует химическим константам связывания Высокие константы связывания меди модифицированными ГВ свидетельствуют о перспективности их применения в качестве детоксикантов почв, загрязненных ТМ

Таким образом, защитное действие ГВ по отношению к растениям в присутствии ТМ в почвенной среде, как и в водной, обусловлено связыванием токсиканта При этом, как и в случае гербицидного стресса, наблюдается выраженное снижение защитного действия ГВ при переходе от водных сред к почвенным

Проведенные эксперименты в условиях стрессов, вызываемых токсикантами, показали, что защитное действие ГВ в почвенных средах обусловлено, прежде всего, связывающей способностью ГВ по отношению к токсикантам В водной среде, напротив, защитное действие ГВ обусловлено не только их взаимодействием с токсикантами, но также и собственной биологической активностью В случае высоких констант связывания (ТМ), ведущую роль играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как при слабом химическом взаимодействии (гербициды) на первое место выходит собственная физиологическая активность ГВ Наблюдаемое выраженное уменьшение защитных свойств ГВ при переходе от водных сред к почвенным связано, по-видимому, со снижением их доступности для растений Целью следующего этапа работы было изучение защитного действия ГВ в условиях абиотических стрессов, когда образование нетоксичных комплексов не может объяснить защитное действие ГВ

Глава 5 Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза

В настоящее время хорошо известно, что ГВ способствуют поступлению в растения различных микроэлементов, недостаток которых вызывает заболевания, известные под названием хлороз Однако защитное действие самих ГВ в этих условиях изучено недостаточно, что определило направление дальнейших экспериментов исследование защитного действия ГВ и их комплексов с железом в условиях недостатка железа

У растений существует два основных способа поглощения железа, обычно называемые стратегиями I и II Растения со стратегией I (двудольные и однодольные, кроме мятликовых) способны снижать значение рН в области ризосферы, что способствует восстановлению железа из формы Fe(III) в Fe(II) Поступление в клетку осуществляется путем связывания с железовосстанавливающими белками, ассоциированными с клеточными мембранами Растения со стратегией II (мятликовые) выделяют т н фитосидерофоры, которые хелатируют Fe(III) Так как способ поглощения железа мог сказаться на величине защитного действия ГВ, нами были проведены эксперименты с растениями, обладающими как стратегий I, так и II

5 1 Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в водной среде

Для исследования защитного действия ГВ в условиях железодефицитного хлороза в качестве тест-объектов использовали растения пшеницы (стратегия I) и томатов Lycopersicon esculentum Mil! (стратегия II) Железо вносили в виде сульфата железа FeS04, хелата железа Ре(Ш)-ДТПА (комплекс железа с диэтилентриаминопентауксусной кислотой) или в виде совместного раствора ГК угля CHA-Pow с FeS04 В ходе проведения эксперимента оценивали эффективность фотосинтеза растений, а по окончании - учет длины и биомассы растений и содержание хлорофилла

Как видно из результатов экспериментов (табл 5 1) в выбранных условиях (высокое значение рН) внесение железа в виде простой соли не влияло на состояние растений из-за окисления железа из формы Fe(H) в форму Fe(III) При добавлении железа в доступной для растений форме (хелаты) было отмечено его положительное

влияние При этом томаты оказались более чувствительными к недостатку железа, о чем свидетельствует более выраженное стимулирующее действие использованных хелатов Сходным, но менее выраженным эффектом, обладало и совместное внесение железа с ГК угля, что подтверждает данные предыдущих исследователей о способности ГВ образовывать хелатные комплексы с металлами и свидетельствует о перспективности их использования для коррекции железодефицитного хлороза

Табл 51 Накопление биомассы, эффективность фотосинтеза и содержание хлорофилла в присутствии различных источников железа и ГВ

„ _ Фотосинтез_Хлорофилл_

исс длина ___ ■ 1,1

Вариант ___СЭТ Выход Содержание а/Ь

_% от контроля (среда Хогланда без железа)_

_Томаты (стратегия I)_

Ие504 90+12 97+12 104+11 103+17 142+15 189+14

Ре(П1)-ОТРА 4649±35 282±18 179+13 149±15 856+29 208±24

СНА-Рош 110±П 105+10 200±11 154+21 107±11 156+12

Ре504+СНА-Ро\у 4382+56 265±19 189+15 148+17 819±31 221±16

Пшеница (стратегия II)

РеБСЬ 101+5 105+12 97±7 100+8 101±11 95±10

Ре(Ш)-ОТРА 172±12 146+12 218+15 197±12 200+11 205±5

СНА-Ро\у 121±15 138±12 344±11 329113 154±12 130+13

Ре804+СНА-Ро\у 123+15 125+11 212±15 216±14 179+11 198+14

СЭТ - скорость электронного транспорта, Выход выход фотосинтеза

± - стандартное отклонение

Следует отметить, что при внесении ГК угля без железа наблюдали сравнимую, а в случае с растениями пшеницы - большую эффективность самих ГВ, чем их смеси с железом Так как использованные ГК подвергали предварительному обессоливанию, обеспечивающему удаление обменного Ре, можно предположить, что растения способны использовать эндогенное железо, входящее в состав ГК В пользу этого предположения свидетельствует также повышенное содержание хлорофилла в присутствии ГК в томатах и пшенице (107±11)% и (154±12)% соответственно Более высокая отзывчивость растений со стратегией II (пшеница) объясняется, по-видимому, преимущественным присутствием же теза в ГК в форме Ре(Ш), те в форме, в которой происходит его усвоение растениями со стратегией II, но не I

Проведенные эксперименты продемонстрировали также положительное влияние ГК на фотосинтез растений скорость электронного транспорта в присутствии ГК для растений томатов и пшеницы возрастала до (200+11)% и (344±11)%, а выход фотосинтеза - до (154+12)% и (329±13)%, что значительно превышало наблюдаемый положительный эффект от внесения железосодержащих препаратов Это свидетельствует о наличии дополнительного механизма защитного действия ГК в условиях железодефицитного хлороза, чем непосредственно поглощение растениями эндогенного железа из ГК

Таким образом, нами было показано, что ГК оказывают защитное действие в условиях железодефицитного хлороза по отношению к растениям как со стратегией I, так и II Полученные эксперименты позволяют высказать предположение о наличии другого, чем поглощение эндогенного железа, механизма защитного действия ГВ

5 2 Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в почвенной среде Для изучения защитного действия ГВ в условиях железодефицитного хлороза в почвенных условиях на первом этапе проводили эксперименты с использованием инертного субстрата перлита, что позволило исключить влияние почвенных ГВ В качестве тест-объектов использовали пшеницу и томаты Железо вносили в перлит в виде Ре304, Ре(Ш)-ДТПА или в виде совместного раствора ГВ с Ре804 Как показали проведенные эксперименты (табл 5 2), в целом внесение исследуемых препаратов оказало положительное влияние на растения

Табл 5 2. Накопление биомассы и содержание хлорофилла в растениях томатов и пшеницы присутствии различных источников железа и ГК угля в условиях железодефицитного хлороза на перлите

„ Вес Длина Содержание хлорофилла

Вариант ---=—----—-

_% от контроля (среда Хогланда без железа)_

Томаты (стратегия I)

Ре304 111+6 103±2 113±9

Ре(Ш)-ДТПА 92±5 104+4 79±15

СНА-Рои/ 104±3 107±3 Ю6±2

РеЗСЬ+СНА-Роу/ 114±3 110+3 102±4

Пшеница (стратегия II)

Ре304 101±2 101±2 -

Ре(П1)-ДТПА 117+7 113±4 -

СНА-Ро\у 109±7 106+3 -

Ре804+СНА-Ро\у 110±4 108±4 -

± - стандартное отклонение

Как и в случае проведения экспериментов с водными культурами, растения пшеницы оказались более отзывчивыми к внесению исследованных препаратов с доступным Ре, однако их эффективность на перлите была значительно ниже Положительный эффект от Ре-ДПТА на накопление растениями биомассы в условиях водных культур составил (172±12)%, а на перлите - (117+7)% от контроля В случае ГК аналогичный показатель снизился с (121±15)% до (110+4)% Для растений томатов снижение эффективности использованных препаратов было еще более ярко выражено

Таким образом, на основании проведенных экспериментов можно сделать вывод о том, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях железодефицитного хлороза на водных культурах значительно более выражено, чем на перлите Наблюдаемые эффекты объясняются, по-видимому, меньшим поглощением ГВ и исследованных железосодержащих препаратов в условиях твердого субстрата Так как в экспериментах использовали инертный наполнитель, не обладающий связывающей способностью по отношению к исследованным препаратам, можно предположить, что в почвенных условиях защитное действие ГВ и железосодержащих препаратов будет еще менее выражено

Почвенные эксперименты проводили с использованием серозема - почвы, характеризующейся высоким значением рН и, вследствие этого, незначительным содержанием доступного для растений Ре Полученные результаты (табл 5 3)

продемонстрировали отсутствие статистически значимого защитного действия использованных препаратов в выбранных условиях

Табл. 5 3. Длина, вес и содержание хлорофилла в растениях томатов в присутствии различных источников железа и ГК угля в условиях железодефицитного хлороза на почве

Вариант Вес Длина Содержание хлорофилла

% от контроля (серозём без внесения Ее)

Томаты (стратегия I)

РеБСЬ 89±12 100±3 103±2

Ре(Ш)-ДТПА 104+4 103 ±5 116±3

СНА-Ро\у 105+5 101 ±4 109±5

Ре804+СНА-Ро\у 101+4 105±4 102±2

± - стандартное отклонение

Из всех исследованных препаратов только синтетический хелат железа обладал выраженным положительным действием по отношению к томатам в его присутствии было зафиксировано значимое увеличение содержания хлорофилла на 16% по сравнению с контрольными растениями При этом положительного влияния Ре-ДТПА на накопление растениями биомассы или их рост отмечено не было Отсутствие выраженного положительного втияния вносимых ГВ по отношению к растениям в почвенных условиях можно объяснить присутствием в самой почве значительного количества ГВ Содержание гумуса в исследованной почве составляло 4 5%, поэтому внесение ГК в дозе 40 мг/кг почвы приводило к увеличению содержания ГВ в почве менее чем на 0 1% Можно предположить, что положительный эффект ГК нивелировался на фоне действия ГВ, изначально присутствовавших в почве

Таким образом, эксперименты показали выраженное защитное действие ГВ и их комплексов с железом в условиях железодефицитного хлороза в водных средах В почвенных средах величина положительного действия ГВ снижается, что связано, по-видимому, с меньшим поглощением ГВ в условиях твердого субстрата

Глава 6 Защитное действие ГВ в условиях водного дефицита, солевого стресса и неблагоприятных температур

Эксперименты проводили биотестированием по методу проростков с использованием пшеницы

б 1 Защитное действие ГВ в условиях водного дефицита

Для создания водного стресса использовали раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 Д (ПЭГ 6000) в концентрации 100 г/л, являющегося гиперосмотическим раствором

Длина побегов, % от контроля^— СРА-СЬ02 Длина корней, % от контроляо— СРА-И1)2

120 - 140 !

-О— РРА-Т498 43— РРА-Т498

—А— СНМ-СЬ02 120 ==гД—СНМ-011)2

100 -

_. -■— РНА-Т498 -»-РНА-Т498

100 =8==—в

80 * -А-СНА-Ро\у 1 -¿г- СНА-Ро\у

80 -|

ЭНА-Р\у98 -•— 8НА-Р\\98

60 ---;— РНА-Т598 60 --■— —в—РНА-Т598

О 10 20 30 40 50 о 10 20 30 40 50

. Концентрация ГВ, мг/л

Концентрация ГВ, мг/л г

А Б

Рис. 6.1. Влияние ГВ на длину побегов (А) и корней (Б) проростков мягкой пшеницы Т аезШит в присутствии ПЭГ 6000 в концентрации 100 г/л

Внесение препаратов ГВ способствовало адаптации растений к недостатку воды (рис 6 1А) При концентрациях 5-10 мг/л было отмечено значимое увеличение длины побегов проростков, которое затем снижалось до контрольных величин Максимальное действие было отмечено для ГК и ФК торфа, которые характеризовались как минимальными молекулярными массами, так и наименьшим содержанием карбоксильных и сложноэфирных групп Минимальные эффекты были зарегистрированы для ГК угля При этом следует отметить, что ни для одного из исследованных препаратов не было отмечено полное снятие негативного действия ПЭГ 6000 на растения

В ходе проведения экспериментов было зафиксировано выраженное стимулирующее действие ГВ на корни побегов в присутствии ПЭГ 6000 (рис 6 1Б), хотя в вариантах без его внесения влияния ГВ на корни и побеги отмечено не было Величины максимального наблюдаемого эффекта для всех исследованных препаратов изменялись от (102±3)% до (123+3)% и свидетельствали о способности ГВ стимулировать рост корней пшеницы в условиях водного стресса, вызванного присутствием ПЭГ 6000 Полученные результаты хорошо согласуются с данными других исследователей, наблюдавшими увеличение физиологической активности ГВ в стрессовых условиях Принимая во внимание тот факт, что наблюдаемый положительный эффект от внесения ГВ не может быть обусловлен связыванием препаратов с ПЭГ (все эти вещества представляют собой отрицательно заряженные полиэлектролиты), можно сделать вывод о способности ГВ снижать негативное действие водного стресса благодаря непосредственному влиянию на растения

6 2 Защитное действие ГВ в условиях солевого стресса

Исследование защитного действия ГВ в условиях солевого стресса, создаваемого с помощью 0 15 М ЫаС1, проводили с использованием природных и силилированных (обогащенных кремнием) препаратов, так как ранее нами было показана высокая защитная активность природных ГВ с высоким содержанием кремния (Глава 3 1, рис 3 3) Для этой цели в структуру природных ГК угля вводили алкоксисилильные

фрагменты (-81(ОСН3)з) для получения производных с различным содержанием кремния При внесении в водную среду указанные фрагменты гидролизуются с образованием силанольных групп, что позволяет рассматривать полученные препараты в качестве моделей природных органо-минеральных комплексов Всего было исследовано 5 препаратов модифицированных ГВ с содержанием кремния 211%

Результаты биотестирования показали, что растения пшеницы, пророщенные в растворах ГВ, обладали большей устойчивостью к солевому стрессу, чем контрольные При этом было установлено, что защитное действие ГВ возрастает с увеличением содержания в них кремния до 8%, а затем - снижается (рис 6 2)

Прирост побегов, % от контроля 60

Вес побегов,% от контроля 60

2 4 6 Содержание Si, %

8 10 12

0 2 4 6 8 10 Содержание Б), %

Рис 6.2 Влияние ГВ и их силилированных производных с различным содержанием кремния на прирост корней и сырую биомассу побегов пшеницы

Проведенные эксперименты показали перспективность дальнейшего исследования силилированных препаратов ГВ в качестве биоактиваторов в условиях солевого стресса

б 3 Защитное действие ГВ вусювиях температурного стресса

Для создания температурного стресса чашки семена пшеницы проращивали при температуре 35°С (высокотемпературный стресс) или при 4°С (низкотемпературный стресс) В качестве контрольных использовали проростки, выращенные при 24°С

Длина корней, % от контроля

Длина побегов, % от контроля

150 - —♦— 4С -Ш-35С 150

100 в 100 J

50 55--^ '-5 50 4

0 50 100 150 0 50 100 150

Концентрация ГВ, мг/л Концентрация ГВ, мг/л

А Б

Рис 6 3. Влияние ГК угля CHA-Pow на длину корней (А) и побегов (Б) проростков пшеницы в условиях пониженной и повышенной температуры

Результаты, представленные на рис 6 ЗА, показывают, что в условиях температурных стрессов внесение ГК до концентрации 150 мг/л не оказало значимого влияния на рост корней пшеницы В то же время, при +35°С было отмечено

выраженное положительное влияние ГК на побеги пшеницы (рис. 6.3Б), которое приводило к полному снятию угнетающего действия повышенной температуры. При +4°С защитное действие ГВ было менее выражено.

Наиболее выраженное действие ГВ в условиях температурных стрессов наблюдали при концентрации 100 мг/л, поэтому сравнение защитного действия ГВ различного происхождения проводили при указанной концентрации (рис. 6.4).

Длина, % от контроля 120

г!

90 60 30

¿1

¿1*1

О Корни □ Побеги X,

Длина, % от контроля 120 ■

90 60 -30 -0

□ Корни О Побеги

[Ь

(§1

±1

йь

Без ГВ

СНА-РО\¥

1НиК-ША

РРА-Т798

ВРА-Эк01

Без ГВ СНА-РОИ-

1НиК-иБА

РИА-Г798

ВРА-БкОО

А Б

Рис. 6.4. Защитное действие ГВ различного происхождения по отношению к проросткам пшеницы в условиях высоко-(А) и низкотемпературного (Б) стрессов.

Как видно из рис. 6.4А, при 35°С внесение ГВ приводило к частичному или полному снятию стресса у проростков пшеницы: в случае с ФК сапропеля наблюдали увеличение длины побегов до 125% от контроля. При этом в целом можно сказать, что ФК оказались более эффективны, чем ГК, а корни - более чувствительны, чем побеги.

В условиях пониженных температур (рис. 6.4Б) защитное действие ГВ было менее выражено, а полное снятие угнетающего действия было отмечено только при использовании ГК угля. Возможно, это связано с тем, что в экспериментах с пониженной температурой величина стресса была значительно выше, чем при повышенной температуре (рис. 6.4). Поэтому дополнительно были приведены эксперименты при температуре 38°С, когда наблюдается более выраженный высокотемпературный стресс. В данных условиях было установлено снижение защитного действия ГВ: максимальное увеличение длин корней и побегов проростков составило всего (6±4)% и (7+4)%.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ГВ способны частично или полностью нивелировать высоко- и низкотемпературный стрессы, а величина защитного действия ГВ зависит от величины вызываемого стресса. Следует особо подчеркнуть, что в проведенных исследованиях ГВ способствовали адаптации растений к температурным стрессам, вызывающим разнонаправленные ответные реакции в организмах. Например, белки и липиды, адаптированные к высокой температуре, находятся соответственно в денатурированном состоянии и в состоянии твёрдого геля, т.е. в неадаптированном состоянии по отношению к низким температурам. Поэтому полученные результаты свидетельствуют об участии ГВ не в

специфических реакциях, характерных для того или иного вида стрессового воздействия, а в общих защитно-приспособительных реакциях растительного организма

Глава 7. Природа защитного действия ГВ

Проведенные исследования показали, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов более ярко выражено в водных, чем в почвенных средах, а величина наблюдаемого действия зависит от величины вызываемого стресса На рис 7 1 представлен график, иллюстрирующий полученные результаты по защитному действию ГВ в различных стрессовых условиях в водных средах и показывающий его зависимость от уровня стресса, который рассчитывали как разницу между значением тест-отклика в контрольных (йо= 100%) и стрессовых условиях {Я0-Кт) При таком способе расчета 100% стресс означает гибель организма, а нулевой - состояние контроля Так как действующее начало ГВ неизвестно, для обобщения данных использовали результаты по максимальному наблюдавшемуся эффекту ГВ вне зависимости от концентрации Из рассмотрения исключали результаты экспериментов с медью, где ведущую роль играла связывающая способность ГВ (Глава 4)

Как видно из рис 7 1, величина защитного действия ГВ практически не зависела от вида стресса, а определялась, главным образом, его уровнем Разница между вариантами без внесения ГВ и в их присутствии оказалась практически постоянной величиной, которая составляла (17±4)% при Р = 95%

Тест-отклик, % от контроля . в присутствии ГВ

0 20 40 60 80 100

Стресс, %

Рис. 7.1 Зависимость величины защитного действия ГВ от уровня стресса

Разнообразие стрессовых факторов, при которых регистрируется положительное действие ГВ, а также независимость величины защитного действия ГВ от вида стресса свидетельствует о неспецифической природе защитного действия ГВ В случае ТМ (или других токсикантов, с которыми возможно интенсивное связывание) указанная закономерность не соблюдается так как эффект неспецифического защитного действия ГВ гораздо меньше, чем эффект химического связывания токсикантов

При исследовании реакций организмов на стресс принято выделять несколько стадий, таких как первичная неспецифическая реакция и собственно адаптация Адаптация подразумевает запуск высокоспецифичных реакций, поэтому следует

предполагать участие ГВ именно в каскаде первой группы реакций В стрессовых условиях наиболее чувствительным компонентом клеточных структур, выполняющим роль пускового механизма, вызывающего последующие изменения в обмене веществ, в большинстве случаев выполняют мембранные системы Следовательно, можно предположить, что защитное действие ГВ обусловлено их непосредственным взаимодействием с мембранами и зависит от биодоступности ГВ Поэтому далее нами было проведено исследование, направленное на изучение поступление ГВ в клетки и растения и распределения в них Эксперименты проводили с использованием меченных тритием ГВ

7 I Характеристика меченных тритием ГВ

Препараты меченных тритием ГВ (3Н-ГВ), предоставленных ГА Бадуном (кафедра радиохимии МГУ им Ломоносова), проверяли на идентичность исходным методом эксклюзионной гель-хроматографии с одновременной детекцией по радиоактивности и УФ-поглощению при 254 нм (рис 7 2)

А254 А254 Радиоактивность

Исходные ГВ ■ Меченые ГВ

V, мл

- УФ-детекция

- - Радиоактивность

V, мл

А Б

Рис. 7.2. Гель-хроматограммы исходных и ЗН-ГВ (А) и ЗН-ГВ с детекцией по УФ-поглощению и радиоактивности (Б) На примере СНА-Ро\у

Совпадение УФ-гель-хроматограмм 3Н-ГВ и исходных ГВ (рис 7 2А) свидетельствует о том, что введение метки не приводило к изменению молекулярно-массового распределения ГВ Идентичность гель-хроматограмм 3Н-ГВ с детекцией по радиоактивности и УФ-поглощению (рис 7 2Б) позволяет сделать вывод об отсутствии деструкции ГВ и равномерном введении метки во все структурные

фрагменты ГВ Всего в работе было использовано 10 образцов охарактеризованных по поверхностной активности и гидрофобности

'Н-ГВ,

7 2 Поступление ГВ различного происхождения в живые клетки в оптимальных и стрессовых условиях

В качестве модели живой клетки использовали грамм-отрицательные бактерии кишечной палочки Escherichia coli XL1 Эксперименты проводили в оптимальных и стрессовых условиях Использование стрессовых условий было необходимо для проверки гипотезы о нарушении мембранной проводимости в условиях стресса Эта гипотеза достаточно часто встречается в литературе, однако ее экспериментальных доказательств практически не существует Стресс создавали путем внесения в питательную среду NaCl, получая гиперосмотический раствор (0 15 М) При этом

полагали, что если гипотеза об изменении проницаемости клетки верна, то в условиях гиперосмотического стресса будет наблюдаться усиленное поступление ГВ в клетки

В ходе проведения экспериментов определяли общее количество сорбированных ГВ и количество ГВ, поступивших во внутриклеточное пространство На основании полученных данных строили изотермы сорбции (рис 7 3 ) и рассчитывали фактор бионакопления ГВ (табл 7 1) как тангенс угла наклона зависимости количества поглощенных клетками бактерий ГВ от их равновесной концентрации [ГВ]

ГВ паг ющ^ниые * мг/кг СНА-Ролу

300 -

200 -

100 -

ГВ поглощённые » мг/кг

150

SFA-Pg96

0 20 40 60 0 50 100

гг„, , [ГВ], мг/л

[ГВ], мг/л 1 1

Рис 7 3 Поглощение ГВ клетками бактерий Е coli в оптимальных (сплошная линия) и стрессовых (пунктирная линия) условиях на примере CHA-Pow и SFA-Pg96

Табл. 7.1 Поглощение ГВ клетками бактерий Е coli в оптимальных и стрессовых условиях

ГВ Фактор бионакопления, л/кг ГВ, поступившие в клетку при конц 50 мг/л, мг/кг клеток

Оптимум Стресс Оптимум Стресс

CHA-Pow 3 2+0 9 5 0+0 6 14+3 17+4

PFA-Sk300 1 8±0 7 6 9+0 8 8+1 32+5

PHA-Sk300 13 1±0 5 130+15 62±12 546±40

SFA-CtL00 0 9±0 5 1 5+0 5 1±1 3±1

SFA-Pg96 0 9±0 5 02±0 5 4±] 1+1

SHA-CtLOO 2 3±0 6 5 3+0 3 6+1 11±2

Полученные значения факторов бионакопления ГВ составляли 0 9-13 1 л/кг Наименьшие значения этого показателя были отмечены для ФК, а наибольшие - для ГК торфа Количество ГВ, прошедших через мембрану, лежало в диапазоне 23167 мг/кг клеток, что составляло 20-100% от общего количества поглощенных ГВ в случае ГК и ФК соответственно Особый интерес представляют результаты, свидетельствующие об усиленном поглощении ГВ клетками бактерий в условиях солевого стресса Этот эффект был отмечен для всех препаратов за исключением ФК почв, где не наблюдали значимого усиления поглощения в условиях солевого стресса По всей видимости, установленное отличие в поведении 5РА-Р§96 и БРА-С&ОО обусловлено низким уровнем взаимодействия этих ГВ с бактериями, что привело к высокой ошибке получаемых результатов

Найденное усиление взаимодействия ГВ с бактериями в условиях солевого стресса может быть объяснено, прежде всего, изменением форм существования ГВ в этих условиях Так, при повышении ионной силы раствора происходит частичная

компенсация отрицательного заряда и гидрофобизация макромолекул ГВ, что может приводить к их усиленной сорбции на клеточной поверхности. С другой стороны, известно, что под действием осмотического шока возможно образование «дыр» в мембранах, т.е. отверстий большого диаметра, в которые могут поступать высокомолекулярные соединения, не проникающие в клетку в обычном состоянии. Полученные результаты по усилению поступления ГВ в клетки под воздействием стрессового фактора хорошо согласуются с ранее показанной возрастающей биологической активностью ГВ при неблагоприятных условиях.

Сопоставление свойств ГВ с параметрами их взаимодействия с бактериями показало наличие значимой положительной корреляционной взаимосвязи между количеством ГВ, поступивших в клетку, и поверхностной активностью ГВ. При этом наличие взаимосвязи наблюдали как для оптимальных (г = 0.97), так и для стрессовых условий (г =0.99).

7.3. Поступление ГВ различного происхождения в растения в оптимальных и стрессовых условиях

Поступление ГВ в растения изучали, проращивая семена пшеницы в растворах, содержащих меченные тритием ГВ в концентрации 10-50 мг/л. По окончании экспонирования проводили учёт биомассы растений, а в растворах по радиоактивности определяли равновесную концентрацию ГВ. Распределение меченых ГВ в растениях изучали с помощью авторадиографии. О концентрации ГВ в различных частях растений судили путем определения оптической плотности О на сканированных авторадиограммах.

При исследовании взаимодействия ГВ с растениями пшеницы нами было обнаружено, что их поглощение в целом сходно с процессами поступления в растения ионов и индивидуальных веществ. Было установлено, что поступление ГВ в растения характеризуется стадией обратимого поглощения, при котором ГВ адсорбируются поверхностью корня и могут быть легко десорбированы, сменяющейся стадией стационарного поглощения, в ходе которой наблюдается поступление веществ в сосудистую систему растений (рис. 7.4).

Содержание ГВ в корнях, г/кг 0.6 ■

Десорбция ГВ, % от сорбции 30 п

25 -20 -15 10 -5 -

¿1

й Л

10 20 30 40 Время взаимодействия, ч

5 мин 10 мин 20 мин 60 мин 24 ч Время взаимодействия

А Б

Рис. 7.4. Зависимость поглощения (А) и десорбции (Б) меченных тритием ГК угля ^Н-СНА-Ро\у) растениями пшеницы от времени экспозиции.

Следует подчеркнуть, однако, что поступление ГВ в растение отличалось рядом особенностей Так, полученные данные (рис 7 4А) свидетельствуют, что накопление ГВ в растениях связано не только с их поступлением в растение, но и с адсорбцией на поверхности корней Обращает на себя внимание также большая продолжительность обратимой стадии (рис 7 4Б), которая для ГВ составляла по крайней мере 1 ч, в то время как для аналогичная величина для ионов и индивидуальных веществ обычно не превышает 15 мин Можно предположить, что непосредственно перед поглощением ГВ растениями происходит их частичная трансформация

Количественное описание кинетики поглощения ГВ растениями (рис 7 5) проводили с помощью уравнения Михаэлиса-Ментен, обычно используемым при описании поглощения ионов и веществ растениями

„ у , [С]

к. +[С] * ;

где V- скорость поглощения вещества, [С] - концентрация вещества в растворе, Утах - максимальная скорость поглощения, Км - константа Михаэлиса, отражающая концентрацию вещества, при которой наблюдается половинная от максимальной скорость поглощения Значения параметров уравнения Махаэлиса-Ментен для использованных ГВ приведены в табл 7 2 Высокие значения коэффициентов детерминации Я2 свидетельствуют о том, что наблюдаемая кинетика поглощения ГВ удовлетворительно описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, что позволяет высказать предположение об активном поглощении ГВ растениями

Поглощение ГВ, мг/кг/ч

Поглощгние ГВ, мг/кг/ч

СНА-Роте

РГА-Т598

О 10 20 30 40 50 Равновесная концентрация ГВ, мг/л

0 10 20 30 40 50 Равновесная концентрация ГВ, мг/т

Рис 7 5 Кинетика поглощения ГВ различного происхождения растениями пшеницы Табл. 7 2. Параметры кинетики поглощения ГВ растениями пшеницы

Препарат ГВ

Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен

Кт, мг/л

, мг/кг/ч

Д*

СНА-Ро\У 25±5 17±3 0 96

РРА-Т598 32±6 10±3 0 98

РНА-Т598 28±7 54±8 091

СНМ-Ро\у 40±9 14+5 0 96

СНМ-ОЬ02 14+5 6±2 0 97

АРА-ЭЯ 15±4 8±2 0 90

: - доверительный интервал при Р = 90%

Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен для ГВ (табл. 7.2) свидетельствуют о сравнительно невысокой скорости их поступления в растения. При пересчёте с использованием значений Муг (табл. 1.1) Утах ГВ будет находиться в диапазоне 0.94.2 нмоль/г/ч, тогда как обычно аналогичные величины составляют дестяки-сотни нмоль/г/ч. Диапазон значений Кт составит 2.1-7.0 мкмоль/л, что сопоставимо со значениями этой константы для ионов и индивидуальных веществ (0.02 до 120 мкмоль/л). Наблюдаемая низкая скорость поглощения ГВ обусловлена, по-видимому, поступлением ГВ в растения не в неизменном в виде, а лишь после предварительной частичной трансформации на поверхности корней растений или непосредственно в растворе под действием выделяемых корнями эксудатов.

Сопоставление кинетики поглощения ГВ с их свойствами показало, что скорость поступления ГВ в наибольшей степени определяется гидрофобностью и М,у ГВ (рис. 7.5).

- -2.1

- -2.3

V 60 ! 50 40 -30 -20 10 0

, мг/кг/'ч

ММ. кД

СНМ- АРА-ЭК Р?А- СНМ-СЮ2 Т598 Ро«

СНА-

РО'Л'

РНА-Т598

А Б

Рис. 7.5. Зависимость константы Михаэлиса К„ поглощения растениями пшеницы ГВ различного происхождения от октанольно-водного коэффициента (А) и молекулярной массы (Б) ГВ.

С увеличением М№ ГВ наблюдали рост Кта1. Это кажущееся противоречие можно объяснить тем, что поглощение ГВ в значительной степени обусловлено их адсорбцией на поверхности корней, которое увеличивается с возрастанием М\г ГВ. Другая тенденция (рис. 7.5А) показывает, что К„ находилась в обратной зависимости от гидрофобности ГВ, т.е. при увеличении гидрофобности ГВ концентрация, при которой наблюдали половинную от максимальной скорость поглощения ГВ наступала раньше. Установленные закономерности могут свидетельствовать о преимущественном поступлении в растения гидрофобных фракций ГВ.

Наличие ГВ в побегах растений, показанное с помощью авторадиографии (рис. 7.6), доказывает возможность перемещения поступивших в растения ГВ вместе с ксилемным током. Эксперименты по поглощению ГВ листьями растений, с другой стороны, показали возможность перемещения ГВ таюке и с флоэмным током: метка обнаруживалась не только непосредственно в листе, находившимся в контакте с мечеными ГВ, но также во втором листе и корнях.

авторадиографии. Время экспонирования для корней 4 ч, для побегов 97 сут.

Анализ полученных авторадиограмм показал преимущественную локализацию ГВ в корнях растений, тогда как в побеги поступало значительно меньшее количество ГВ. Отношение оптических плотностей О в корнях и побегах, нормированное на время экспонирования, составило 40.7+0.3 для ГК угля и 10+2 для ФК вод. С учётом массы корней и побегов растений можно рассчитать, что в корнях аккумулируется в 22 раза больше ГК угля, чем в побегах; для ФК аналогичный показатель составляет 5. Это свидетельствует о том, что ФК способны поступать из корней в надземные органы растений в большем количестве, чем ГК.

Распределение поступивших ГВ в корнях и побегах также оказалось неоднородным: было показано локальное увеличение их концентрации в апикальных частях (рис. 7.6). Оптическая плотность в кончиках корней превышала таковую в среднем по корню в 2 раза; аналогичное отношение для побегов составило 8. Следовательно, ГВ накапливаются преимущественно в апикальных частях растений, где происходит наиболее активный клеточный биосинтез.

Сравнительное изучение поглощения ГВ при повышенной (35°С) и пониженной (4°С) температуре, избыточном и недостаточном освещении и при солевом стрессе показало его зависимость от внешних условий (рис. 7.7). Выраженное уменьшение поглощения ГВ наблюдали, когда растения подвергали стрессам, вызывающим снижение скорости метаболических реакций (пониженная температура и отсутствие освещения), а увеличение - при стрессах, активирующих метаболизм (повышенная температура, избыточное освещение и солевой стресс). Таким образом, было установлено, что поглощение ГВ растениями напрямую связано со скоростью метаболических процессов.

Поглощено ГВ, % от контроля 350 1

зоо

250 J

200 -150 100 50 -

о -

Контроль 4С Осутствие 35С Постоянное 0.6М№С1 освещения освещение

Рис. 7.7. Поглощения ГВ растениями пшеницы в различных условиях.

Наименьшее поглощение ГВ наблюдали при понижении температуры до 4°С, когда поглощение веществ растениями обусловлено только их адсорбцией на поверхности корней. На основании температурной зависимости поглощения ГВ и соответствии кинетики их поглощения уравнению Михаэлиса-Ментен можно сделать вывод о поступлении ГВ в растения по механизму активного транспорта.

7.3. Идентификация ГВ в тканях растений

Исследование распределения ГВ в растениях на тканевом уровне показало их преимущественное накопление в липидах (табл. 7.3).

Табл. 7.3. Содержание ГВ в липидной фракции растений

ГВ Содержание ГВ в липидной фракции, % от поглощённых

Корни Побеги Всего

CHA-Pow 82±6 16±2 98±8

AFA-SR 49+10 16±8 64±5

Было установлено, что 98% ГК, поглощённых растениями, обнаруживалось в липидной фракции. Для ФК этот показатель составлял около 64%, что связано, по-видимому, с их меньшей гидрофобностью. Так как в побегах для ГК и ФК наблюдали равное относительное количество поглощённых ГВ (16%), можно сделать вывод, что перед поступлением в надземные органы в корнях происходит предварительная трансформация ГВ, и в побеги поступают преимущественно гидрофобные фрагменты ГВ. Поиск возможных гидрофобных соединений в ГВ, проведённый с помощью гексановой экстракции с последующим определением состава методом газовой хроматографии (ГХ) (табл. 7.4) показал, что во всех исследованных препаратах ГВ обнаруживаются летучие жирные кислоты (ЛЖК) ряда С2-С6 (от уксусной до капроновой кислоты).

Табл 7 4 Содержание ЛЖК в ГВ различного происхождения по данным ГХ

ГВ С2 СЗ 1-С4 С4 1-С5 С5 1-С6 С6 2

мкг/мг

СНА-АвК 0 05 001 0 004 0 008 0 008 0 0042 0 0 03 0 114

РРА-ЭкЗОО 0 043 0 005 0 003 0 002 0 004 0 003 0 0 009 0 069

РРА-ТЬ398 0 021 0 004 0 001 0 007 0 004 0 024 0 0014 0 075

РНМ-БкЗОО 0 037 0 007 0 002 0 008 0 005 0 045 0 001 0 016 0 121

РНА-ЭкЗОО 0 124 0 021 0 007 0012 0 006 0 008 0 0015 0 193

С2 - уксусная, СЗ - пропионовая, С4 - масляная, 1-С4 - изомасляная, С5 - валериановая, 1-С5 - изовалериановая, Сб - капроновая, 1-Сб - изокапроновая

Во всех препаратах наиболее высокое содержание было установлено для уксусной кислоты (в среднем 46% от общего содержания ЛЖК) Наряду с ЛЖК в хлороформ-гексановом экстракте ГК были также обнаружены олеиновая С|81 (2 7%) и пальмитиновая С^о (15%) кислоты Таким образом, полученные результаты доказывают возможность трансформации ГВ до компонентов, способных поступать в липидную фракцию растений

Прямая идентификация ГВ в растениях, проведенная методом масс-спеюрометрии ионно-циклотронного резонанса, показала, что продукты метаболизма ГВ присутствуют в растениях в составе ненасыщенных ЖК С|8Нз202 и С14Н24О2 Первой молекулярной формуле соответствует более 40 соединений, однако большинство из них представляет собой феромоны насекомых или синтетические вещества Поэтому с наибольшей вероятностью соединение С^НзгСЬ является линолевой кислотой С18 2 - ключевым соединением липидного обмена растений -являющейся одной из 4 основных ЖК растительных мембран Линолевая кислота образуется при распаде липидов в растениях, усичивающемся при стрессах Она является активатором различных процессов метаболизма и оказывает влияние на рост и морфогенез растений Отсутствие •»толевой кислоты непосредственно в экстрактах ГВ свидетельствует о том, что она образуется из предшественников непосредственно в растении Общая схема биосинтеза ЖК в растениях и возможная роль в нем ГВ представлена на рис 7 8

Как видно из рис 7 8, в ГВ представлен целый ряд веществ, участвующих в биосинтезе ЖК Однако промежуточных продуктов, которые можно было ожидать исходя из обнаруженных в ГВ соединений - олеиновой и пальмитиновой кислот - в тканях растений обнаружено не было Это свидетельствует о том, что поглощенные из ГВ соединения быстро усваиваются растениями, а определяемая линолевая кислота является продуктом деградации липидов, начинающемся при механическом повреждении листьев при их подготовке к анализу В пользу этого предположения свидетельствует также второе идентифицированное соединение - С14Н24О2 - которое, по всей видимости, является промежуточным продуктом распада линолевой кистоты

Рис. 7.8. Биосинтез ЖК в растениях и возможная роль в нём ГВ. На схеме жирным шрифтом выделены вещества, экспериментально обнаруженные в составе ГВ, а наклонным - в растениях.

Таким образом, проведённые эксперименты показали, что наиболее вероятной схемой поступления ГВ в растения является первоначальная аккумуляция на поверхности корней, прикорневая-корневая трансформация и включение в метаболизм растений на уровне липидного обмена.

7.4. Природа защитного действия гуминовых веществ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов

Проведённые исследования позволили выявить следующие основные закономерности защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов в водных и почвенных средах:

- ГВ способствуют адаптации растений к разнообразным стрессовым факторам, в том числе вызывающим разнонаправленные ответные реакции в организмах;

- в присутствии токсикантов защитное действие ГВ обусловлено образованием нетоксичных комплексов ГВ-токсикант и собственной физиологической активностью ГВ; относительный вклад этих процессов зависит от силы взаимодействия ГВ с токсикантом и биодоступности ГВ;

- в условиях абиотических стрессов, не обусловленных присутствием токсикантов, величина защитного действия ГВ практически не зависит от вида стресса, а определяется, главным образом, его уровнем. Разница между вариантами без внесения ГВ и в их присутствии является практически постоянной величиной и не превышает 20%;

- при переходе от водных сред к почвенным наблюдается выраженное уменьшение защитных свойств ГВ, связанное со снижением их доступности для растений.

Разнообразие стрессовых факторов, при которых регистрируется защитное действие ГВ, а также независимость его величины от вида стресса свидетельствует о неспецифической природе защитного действия ГВ, обусловленного их

непосредственным взаимодействием с мембранами. Установленное в нашей работе включение ГВ в метаболизм ЖК и накопление ГВ в липидной фракции растений свидетельствует о преимущественном влиянии ГВ на липидный обмен, в том числе и липидную составляющую мембран. Повреждение липидной компоненты мембран в стрессовых условиях происходит вследствие процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), вызываемого образованием избыточного количества свободных радикалов, для тушения которых у растений синтезируется целый ряд антиоксидантов. Наши исследования показали, что ГВ также обладают высокой антиоксидантной ёмкостью (АОЕ), сопоставимой с таковой других высокоактивных природных антиоксидантов. Величины АОЕ ГВ изменялись в диапазоне 2.183.56 мкмоль тролоксового эквивалента/мг, что близко к АОЕ дигидрокверцитина (2.67 мкмоль/мг) - природного антиоксиданта растительного происхождения. Принимая во внимание установленные в работе особенности взаимодействия ГВ с клетками и растениями можно предложить следующий концептуальный механизм защитного действия ГВ (рис. 7.9).

Стрессовый фактор

-_п_

ЛТертичная стрессовая реакция

Дето ксификация активных форм кислорода

Синтез сигнальных веществ

Синтез мембран de novo

Связывание токсикантов

ГУМИНОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

Адаптация

Рис. 7.9. Концептуальная модель неспецифического защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов.

Таким образом, выполненные в диссертационной работе исследования показали, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов обусловлено не только образованием комплексов ГВ с токсикантами, но также включением ГВ в липидный метаболизм растений и участием в неспеиифических реакциях растений на стресс, направленных на восстановление повреждений мембранных структур вследствие разрывов в мембране и ПОЛ.

ВЫВОДЫ

металлы), ведущую роль играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, при слабом химическом взаимодействии (гербициды) доминирует собственная физиологическая активность ГВ

2 При переходе от водных сред к почвенным наблюдается выраженное уменьшение защитных свойств ГВ, связанное со снижением их доступности для растений В условиях абиотических стрессов в водных средах величина защитного действия ГВ не зависит от их происхождения или вида стресса Разница между вариантами без внесения ГВ и в их присутствии является практически постоянной величиной и не превышает 20% В случае тяжелых металлов (или других токсикантов, с которыми возможно интенсивное связывание) указанная закономерность не соблюдается вследствие небольших величин действия ГВ по сравнению с эффектами, определяемыми процессами связывания токсикантов

3 ГВ способны сорбироваться на поверхности живых клеток и поступать во внутриклеточное пространство Величины фактора бионакопления ГВ варьируются в диапазоне 0 9-13 1 л/кг Количество ГВ, поступающих в клетки, возрастает при увеличении поверхностной активности ГВ и составляет 20-100% от общего количества поглощенных ГВ В условиях солевого стресса происходит усиление поглощения ГВ клетками, при этом фактор бионакопления ГВ может возрастать в 10 раз по сравнению с оптимальными условиями

4 Поглощение ГВ растениями в целом подчиняется закономерностям, установленным для ионов и индивидуальных веществ Оно характеризуется наличием фазы обратимого малоизбиратетьного поглощения и фазы стационарного поглощения Основной особенностью поступления ГВ в растения является большая продолжительность обратимой стадии, которая составляет не менее 1 ч, что связано с трансформацией ГВ перед их поглощением растениями

5 Кинетика поглощения ГВ описывается уравнением Михаэлиса-Ментен Диапазон значений константы Мпхаэлиса Кт составляет 2 1-7 0 мкмоль/л, что сопоставимо со значениями этой константы для ионов и индивидуальных веществ Максимальная скорость поглощения ГВ возрастает при увеличении их гидрофобности и находится в диапазоне 0 9-4 2 нмоль/г/ч, что на несколько порядков ниже, чем для ионов и индивидуальных веществ

6 ГВ аккумулируются преимущественно в корнях растений Отношение количества ГВ в корнях к количеству в побегах изменяется в диапазоне от 10 до 22 и объясняется высокой адсорбцией ГВ на поверхности корней Поступившие в растения ГВ накапливаются преимущественно в апикальных частях растений

7 Поступление ГВ в растения происходит по механизму активного транспорта и напрямую связано со скоростью метабопизма растений

8 ГВ аккумулируются преимущественно в липидной фракции растений Продукты метаболизма ГВ присутствуют в составе ненасыщенных ЖК Количество ГВ в липидной фракции от общего количества поглощенных ГВ составляет 64-98%

9 Концептуальная модель защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов включает в себя поступление ГВ растения, включение их в липидный метаболизм растений и участие в неспецифических реакциях растений на стресс, направленных на восстановление мембранных структур вследствие разрывов в мембране и перекисного окисления липидов

10 Усиление защитных свойств ГВ с целью их применения в сельском хозяйстве в качестве средств защиты растений может быть достигнуто с помощью соответствующей направленной модификации ГВ, а именно введения хинонных фрагментов в ГВ для получения детоксикантов почв, загрязненных тяжелыми металлами, обогащения железом - для синтеза корректоров хлороза у растений и обогащения кремнием - для получения биоактиваторов

ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность

• д х н , проф И В Перминовой (химический ф-т МГУ) и сотрудникам ее группы за предоставленные препараты природных и модифицированных ГВ и оказанную всестороннюю помощь,

• к б н, доц Г Ф Лебедевой (каф земледелия ф-та почвоведения МГУ) за постоянное внимание к работе и многолетнюю разностороннюю поддержку,

• д б н О В Королевой (Институт биохимии РАН) и сотрудникам ее группы за помощь в организации биологических экспериментов, определении антиоксидантной активности ГВ и обсуждение результатов,

• к х н Г А Бадуну, 3 Я Тясто и к х н М Г Чернышевой (каф радиохимии химического ф-та МГУ) за предоставленные меченные тритием ГВ и оказанную помощь в проведении радиохимических экспериментов,

• О И Филипповой (каф земледелия ф-та почвоведения МГУ) и к б н В А Холодову (Почвенный институт РАСХН) за оказанную помощь в проведении токсикологических экспериментов,

• к х н В И Коробкову (каф радиохимии химического ф-та МГУ) за помощь в проведении авторадиографии,

• д б н Д Н Маторину и д б н ПС Бенедиктову (каф биофизики биологического факультета МГУ) за оказанную помощь в организации токсикологических экспериментов и оказанную всестороннюю поддержку,

• к х н Е А Цветковой (Институт органической химии РАН) за проведение экспериментов по выделению и фракционированию липидной фракции и обсуждение результатов,

• доц Ф Шмитг-Копплину (Helmholtz Zentrum München, ФРГ) и асп Э В Куненкову (химический ф-т МГУ) за проведение анализов методом масс-спекгрометрии ионно-циклотронного резонанса с Фурье преобразованием

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1 Давидчик В Н , Куликова Н.А, Голубева Л И, Степанова Е О, Королева О В 2008 Влияние лакказы Coriolus hirsutus на адсорбцию и десорбцию атразина почвами различных типов Прикладная биохимия и микробиология, 44(6), 1-7

2 Цветкова Е А, Куликова Н А., Карток JIА, Перминова И В 2007 Перспективы использования силикагеля, модифицированного гуминовыми кислотами, для очистки природных сред от липополисахаридов Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел Биологический, том 12, выпуск 1, приложение 1 Биотехнология Экология Охрана окружающей среды, 188-194

3 Королева О В , Куликова Н.А , Алексеева Т Н , Степанова Е В , Давидчик В Н , Беляева Е Ю 2007 Сравнительная характеристика физико-химических свойств и биологической активности грибного меланина из Aspergilus niger и гуминоподных веществ, синтезируемых базидиальными грибами Прикладная биохимия и микробиология, 43(1), 69-76

4 Kulikova N.A., Perminova I V 2007 Sorption-desorption of atrazine on mineral-bound humic substances related to their structure Fresenius Environmental Bulletin, 16, 9a, 1061-1068

5 Холодов В A , Куликова Н.А, Перминова И В , Еремин С А, Лебедева Г Ф 2005 Адсорбция гербицида ацетохлора различными типами почв Почвоведение, 5, с 600-607

6 Куликова Н.А., Перминова И В , Лебедева Г Ф 2003 Связывание атразина гумусовыми кислотами некоторых почв Почвоведение, 10, 1207-1212

7 Perminova I V , Frimmel F Н, Kudryavtsev А V, Kulikova N A., Abbt-Braun G , Hesse S , Petrosyan V S 2003 Molecular weight characteristics of aquatic, soil, and peat humic substances as determined by size exclusion chromatography and their statistical evaluation Environ Sci Technol 37, 2477-2485

8 Kulikova N A and Perminova I V 2002 Binding of atrazine to humic substances from soil, peat, and coal related to their structure Environ Sci Technol, 36(17), 3720-37204

9 Balcke G U , Kulikova N A., Kopinke D , Perminova I V , Hesse S , Frimmel F H 2002 The influence of humic substances structure on their adsorption onto kaolin clay Soil Sci Soc Am J, 66, 1805-1812

10 Куликова H А., Перминова И В , Лебедева Г Ф , Маторин Д Н 1997 Влияние органического вещества водной и щелочной вытяжек торфа на фотосинтез растений Вестник Московского университета, серия 16 (Биология), 2, 36-41

Патент

1 Бадун Г А Позднякова В Ю , Чернышева М Г, Куликова Н А., Перминова И В , Шмит-Копплин Ф Способ получения меченных тритием гуминовых и гуминоподобных веществ Патент РФ на изобретение №2295510 Приоритет изобретения от 19 декабря 2005

Главы в монографиях

1 Kuhkova N А , Davidchik V N , Stepanova Е V , Koroleva О V 2007 Enchanced adsorption of atrazine in different soils in the presence of fungal laccase In Multiple Stressors A Challenge for the Future, Mothersill С , Mosse I, Seymour С (Eds) NATO Science Series IV Science for Peace and Security, Springer, Netherlands, 391-403

2 Permino\ a IV, Kulikova N A., Zhilin D M, Grechischeva N Yu, Kovalevskn D V, Lebedeva G F , Matonn D N, Venediktov P S , Konstantmov AI, Kholodov V A, Petrosyan V S 2006 Mediating effects of humic substances in the contaminated environments Concepts, results, and prospects In Viable Methods of Soil and Water Pollution Monitoring, Protection and Remediation Twardowska I, Allen H E , Haggblom M H , Stefaniak, S (Eds ) NATO Science Series IV Earth and Environmental Sciences, Spnnger, Netherlands, 2006, Vol 69, 249-274

3 Kulikova N.A., Stepanova E V , Koroleva О V 2005 Mitigating activity of humic substances direct influence on biota In Use of humic substances to remediate polluted environments from theory to practice, Perminova IV, Hatfield К, Hertkorn N (Eds ), NATO Science Series IV Earth and Environmental Sciences, Vol 52, Spnnger, Dordrecht, The Netherlands,pp 285-310

4 Лебедева Г Ф, Куликова Н.А., Хо-годов В А 2002 Загрязнение почв гербицидами В кн Деградация и охрана почв, Изд-во МГУ, Москва, 332-358

5 Perminova IV, Grechishcheva N Yu, Petrosyan VS, Amsimova MA, Kulikova N. A., Lebedeva GF, Matonn DN, Venediktov PS 2001 Impact of humic substances on the toxicity of xenobiotic organic compounds In Humic Substances and Chemical Contaminants Hayes M H В , Clapp С E, Senesi N , Bloom P R, Jardine P M (Eds), SSSA, Madison, WI, 275-287.

6 Perminova IV, Kovalevsky DV Yashchenko NYu, Danchenko NN, Kudryavtsev A V, Zhilin D M, Petrosyan V S , Kuhkova N.A., Phihppova ОI, Lebedeva GF 1996 Humic substances as natural detoxicants In Humic substances and organic matter in soil and water environments charactenzation, transformations and interactions Clapp С E, Hayes M H В , Senesi N, Gnffith S M (Eds), St Paul, MN, USA, 399-406

Статьи в журналах и сборниках

1 Kholodov V А, Kulikova N.A., Lebedeva G F, Ilyukhma E A, Perminova IV 2006 Detoxifying ability of the phenol-enriched and cross-linked humic denvatives with respect to copper In Humic substances - linking structure to functions, Frimmel FII, Abbt-Braun G (Eds ), Proceedings of the 13th Meeting of the International Humic Substances Society, July 30 to August 4, 2006, 825-828

2 Kulikova N A , Badun G A , Korobkov VI, Pozdnyakova V Yu , Perminova IV 2006 Uptake of humic acids by wheat plants direct evidence using tritium autoradiography In Humic substances - linking structure to functions, Fnmmel F H , Abbt-Braun G (Eds), Proceedings of the 13th Meeting of the International Humic Substances Society, July 30 to August 4, 2006, 425-428

3 Kulikova N.A., Kholodov V A , Lebedeva G F , Perminova IV 2006 Bioassay with humics a statistical approach to data collection In Humic substances - linking

structure to functions, Frimmel F H , Abbt-Braun G (Eds ), Proceedings of the 13th Meeting of the International Humic Substances Society, July 30 to August 4, 2006, 441-444

4 Kuhkova N.A., Veselovskaya M M, Lebedeva G.F , Perminova I V 2006 Humic substances decrease water deficiency stress of wheat seedlings In Humic substances - linking structure to functions, Frimmel F H , Abbt-Braun G (Eds ), Proceedings of the 13th Meeting of the International Humic Substances Society, July 30 to August 4, 2006, 437-440

5 Маторин Д H , Братковская Jl Б, Осипов В А, Алексеев А А, Куликова Н.А., Ващаиов Г А 2006 Использование флуоресценции хлорофилла водорослей для биотестирования загрязнений водной среды Докл МОИП, т 39 Биотехнология - охране окружающей среды, M изд-во "Графикон", 116-119

6 Маторин Д H, Осипов В А, Куликова Н.А., Алексеев А А 2005 Биотестирование водной среды с использованием люминисценции водорослей В Биотехнология, Экология, Защита Окружающей среды Садчиков А П, КотелевцевСВ (ред ), Москва, 71-75

7 Kulikova N.A., Badun G А, Perminova IV , Pozdnyakova V Yu, Belyaeva E Yu , Kudryavtsev A V 2004 Tritium-labeled humic preparations as a perspective tool for membranotropic studies Proceedings of the XII Int Meetmg of IHSS Humic Substances and Soil and Water Environment Sao-Pedro, Brazil, July 25-30, 2004, 383-385

8 Kholodov V A, Kovalenko A N, Kulikova N.A., Lebedeva G F , Perminova IV 2004 Enhanced detoxifying ability of hydroqumones-enriched humic derivatives with respect to copper Proceedings of the XII Int Meeting of IHSS Humic Substances and Soil and Water Environment Sao-Pedro, Brazil, July 25-30, 2004, 189-191

9 Davidchik V N , Kulikova N.A., Koroleva О V 2004 Laccase stabilization in the presence of coal humic acids 2004 Proceedings of the XII Int Meetmg of IHSS Humic Substances and Soil and Water Environment Sao-Pedro, Brazil, July 25-30, 2004, 545-546

10 Kholodov VA, Kulikova N.A., Perminova IV 2003 Adsorption of herbicide acetochlor onto kaolin-humic acids complexes Bulgarian J of Ecol Sci 2(3-4), 5051

11 Kuhkova N.A, Dashitsyrenova A D, Perminova IV, Lebedeva G F 2003 Auxm-like activity of different fractions of coal humic acids Bulgarian J of Ecol Sci 2(3-4), 55-56

12 Холодов В A, Куликова H.А., Перминова И В , Лебедева Г Ф 2003 Токсичность гербицида ацетохлора в почвах различных типов Плодородие, 5(14), 33-35

Подписано в печать 2008 года Заказ №

Формат 60х90/16 Уел печ л Тираж ¿¿СО экз

Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Куликова, Наталья Александровна

Список сокращений и условных обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Выделение и характеристика ГВ различных природных сред.

1.1. Отбор и характеристика почвенных образцов.

1.2. Выделение препаратов ГВ из природных объектов.

1.3. Модифицированные ГВ.

1.3.1. Гидроксилированные ГВ.

1.3.2. Привитые гуминовые полимеры.

1.3.3. Сополимеры с салициловой и 2,3-Дигидроксибензойной кислотами.

1.3.4. Гуминовые вещества, обогащенные железом.

1.3.5. Гуминовые вещества, обогащенные кремнием.

1.4. Характеристика ГВ.

1.4.1. Характеристика элементного состава.

1.4.2. Определение структурно-группового состава ГВ методом ЯМР-спектроскопии 13С.

1.4.3. Исследование молекулярно-массового распределения ГВ методом эксклюзионной хроматографии.

1.4.4. Определение кислотных групп ГВ титриметрическими методами.

Глава 2. Исследование защитного действия ГВ методами биотестирования: метрологическая характеристика и количественное описание детоксифицирующих свойств.

2.1. Выбор тест-культуры.^.

2.2. Метрологическая характеристика использованных методов биотестирования.

2.2.1. Метрологическая характеристика методов биотестирования в водной среде.

2.2.2. Метрологическая характеристика методов биотестирования в почвенной среде.

2.3. Количественное описание защитного действия ГВ в присутствии токсикантов.

Глава 3. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса.

3.1. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса в водной среде.

3.1.1. Связывающая способность ГВ по отношению к атразину в водной среде.

3.1.2. Детоксифицирующее действие ГВ по отношению к атразину в водной среде.

3.2. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса в почвенной среде.

3.2.1. Связывающая способность ГВ по отношению к атразину в почвенной среде.

3.2.2. Детоксифицирующее действие ГВ по отношению к атразину в почвенной среде.

Глава 4. Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжёлыми металлами.

4.1. Взаимодействие ГВ с тяжёлыми металлами: химические и токсикологические аспекты.

4.1.1. Взаимодействие ГВ с тяжёлыми металлами.

4.1.2. Влияние ГВ на токсичность тяжёлых металлов.

4.2. Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжёлыми металлами, в водной среде.

4.2.1. Защитное действие природных ГВ.

4.2.2. Защитное действие модифицированных ГВ.

4.2.3. Взаимосвязь структурных характеристик и детоксифицирующих свойств ГВ по отношению к тяжёлым металлам.

4.2.4. Физиологическая активность природных и модифицированных ГВ.

4.2.5. Взаимосвязь структурных характеристик и физиологической активности ГВ.

4.3. Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжёлыми металлами, в почвенной среде.

4.3.1. Защитное действие природных и модифицированных ГВ в почве.

4.3.2. Последействие природных и модифицированных ГВ в почве.

Глава 5. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза.

5.1. Влияние ГВ на поступление микроэлементов в растения.

5.2. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в водной среде.

5.3. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в почвенной среде.

5.3.1. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в перлите.

5.3.2. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в почве.

Глава 6. Защитное действие ГВ в условиях водного дефицита, солевого стресса и неблагоприятных температур.

6.1. ГВ как универсальные адаптогены в условиях физико-химических стрессов.

6.2. Природа защитного действия ГВ в условиях физико-химических стрессов.

6.3. Защитное действие ГВ в условиях водного дефицита.

6.3.1. Природа водного дефицита у растений.

6.3.2. Защитное действие ГВ в условиях водного дефицита.

6.3.3. Сопоставление физико-химических характеристик и проявляемого защитного действия ГВ в условиях водного дефицита.

6.4. Защитное действие ГВ в условиях солевого стресса.

6.4.1. Природа солевого стресса у растений.

6.4.2. Защитное действие природных и модифицированных ГВ в условиях солевого стресса.

6.5. Защитное действие ГВ в условиях температурного стресса.

6.5.1. Природа температурного стресса у растений.

6.5.2. Защитное действие природных и модифицированных ГВ в условиях температурного стресса.

Глава 7. Природа защитного действия ГВ по отношению к растениям.

7.1. Возможные механизмы защитного действия ГВ в условиях абиотических стрессов.

7.2. Особенности защитного действия ГВ в условиях абиотических стрессов

7.3. Поступление ГВ в растения в оптимальных и стрессовых условиях.

7.3.1. Использование радиоактивных препаратов для количественной оценки поступления ГВ в растения.

7.3.2. Исследование взаимодействия ГВ с живыми организмами с использованием меченных тритием препаратов.

7.3.3. Исследование взаимодействия ГВ с живыми клетками в оптимальных и стрессовых условиях.

7.3.4. Исследование поступления ГВ в растения в оптимальных и стрессовых условиях.

7.3.5. Исследование распределения ГВ в растениях.

7.3.6. Сравнительная оценка поглощения и распределения ГВ в растениях в оптимальных и стрессовых условиях.

7.3.7. Идентификация ГВ в тканях растений.

7.4. Природа защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов.

7.4.1. Основные закономерности защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов.

7.4.2. Антиоксидантная активность ГВ.

7.4.3. Концептуальный механизм защитного действия ГВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов"

Возрастающая антропогенная нагрузка на окружающую среду обусловила возникновение такой глобальной задачи современности как целенаправленное регулирование нарушенного равновесия в экосистемах. Решение этой задачи включает в себя изучение детоксификации загрязняющих веществ и поиск безопасных средств защиты организмов от повреждающего действия токсикантов. В качестве таких средств защиты могут выступать природные физиологически активные соединения, к которым относятся гуминовые вещества (ГВ), содержащиеся во всех природных средах, включая природные воды, почвы, торфа, сапропели и угли. Образование ГВ представляет собой второй по масштабности после фотосинтеза процесс трансформации органического вещества в природе, в ^ который вовлекается около 20 Гт углерода в год. ГВ выполняют ряд важных экологических функций в биосфере: аккумулятивную, транспортную, регуляторную, физиологическую и защитную. Особую актуальность в последнее время приобретает исследование защитной функции ГВ с целью ее дальнейшего практического применения, так как именно она отвечает за поддержание равновесия в экосистемах, подверженных сильной антропогенной нагрузке. Следовательно, установление механизма защитного действия ГВ позволит более эффективно использовать существующие гуминовые стимуляторы роста растений в сельском хозяйстве, а также указать пути к созданию нового поколения средств защиты растений на основе ГВ, например, гуминовых детоксикантов и биоактиваторов.

В настоящее время общепринятым является положение о том, что защитная функция ГВ в условиях химического стресса обеспечивается их способностью связывать загрязняющие вещества в комплексы, недоступные для живых организмов. При таком понимании защитного действия ГВ практически игнорируется роль их физиологической активности в процессах детоксификации загрязненных сред. Кроме того, при таком подходе остаётся нерешённой проблема защитного действия ГВ в условиях других абиотических стрессов, таких неблагоприятная температура, недостаток влаги, засоление и др. Причиной этого является отсутствие систематических исследований по роли физиологической активности в защитной функции ГВ. Поэтому целью работы было изучить природу защитного действия ГВ по отношению к растениям во взаимосвязи с их физиологической активностью в условиях различных абиотических стрессов в водной и почвенной средах и предложить пути практического использования полученных знаний для создания средств защиты нового поколения на основе ГВ.

Цель работы состояла в изучении природы защитного действия ГВ по отношению к растениям в водных и почвенных средах в условиях различных абиотических стрессов и оценке перспективности применения природных и модифицированных гуминовых препаратов в качестве средств защиты растений. В работе были поставлены следующие основные задачи:

- выделить и охарактеризовать ГВ из различных природных сред;

- изучить взаимодействие ГВ с клетками и растениями и предложить концептуальную модель защитного действия ГВ;

Заключение Диссертация по теме "Экология", Куликова, Наталья Александровна

выводы

1. Защитное действие ГВ в присутствии токсикантов в почвенных средах обусловлено, прежде всего, образованием нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как в водных средах значительный вклад может вносить собственная биологическая активность ГВ. В случае высоких констант связывания (тяжёлые металлы), ведущую роль играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, при слабом химическом взаимодействии (гербициды) доминирует собственная физиологическая активность ГВ.

2. При переходе от водных сред к почвенным наблюдается выраженное уменьшение защитных свойств ГВ, связанное со снижением их доступности для растений. В условиях абиотических стрессов в водных средах величина защитного действия ГВ не зависит от их происхождения или вида стресса. Разница между вариантами без внесения ГВ и в их присутствии является практически постоянной величиной и не превышает 20%. В случае тяжелых металлов (или других токсикантов, с которыми возможно интенсивное связывание) указанная закономерность не соблюдается вследствие небольших величин действия ГВ по сравнению с эффектами, определяемыми процессами связывания токсикантов.

3. ГВ способны сорбироваться на поверхности живых клеток и поступать во внутриклеточное пространство. Величины фактора бионакопления ГВ варьируются в диапазоне 0.9-13.1 л/кг. Количество ГВ, поступающих в клетки, возрастает при увеличении поверхностной активности ГВ и составляет 20-100% от общего количества поглощённых ГВ. В условиях солевого стресса происходит усиление поглощения ГВ клетками, при этом фактор бионакопления ГВ может возрастать в 10 раз по сравнению с оптимальными условиями.

4. Поглощение ГВ растениями в целом подчиняется закономерностям, установленным для ионов и индивидуальных веществ. Оно характеризуется наличием фазы обратимого малоизбирательного поглощения и фазы стационарного поглощения. Основной особенностью поступления ГВ в растения является большая продолжительность обратимой стадии, которая составляет не менее 1 ч, что связано с трансформацией ГВ перед их поглощением растениями.

5. Кинетика поглощения ГВ описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Диапазон значений константы Михаэлиса Кт составляет 2.1-7.0 мкмоль/л, что сопоставимо со значениями этой константы для ионов и индивидуальных веществ. Максимальная скорость поглощения ГВ возрастает при увеличении их гидрофобности и находится в диапазоне 0.9-4.2 нмоль/г/ч, что на несколько порядков ниже, чем для ионов и индивидуальных веществ.

6. ГВ аккумулируются преимущественно в корнях растений. Отношение количества ГВ в корнях к количеству в побегах изменяется в диапазоне от 10 до 22 и объясняется высокой адсорбцией ГВ на поверхности корней. Поступившие в растения ГВ накапливаются преимущественно в апикальных частях растений.

7. Поступление ГВ в растения происходит по механизму активного транспорта и напрямую связано со скоростью метаболизма растений.

8. ГВ аккумулируются преимущественно в липидной фракции растений. Продукты метаболизма ГВ присутствуют в составе ненасыщенных ЖК. Количество ГВ в липидной фракции от общего количества поглощённых ГВ составляет 64-98%.

9. Концептуальная модель защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов включает в себя поступление ГВ растения, включение их в липидный метаболизм растений и участие в неспецифических реакциях растений на стресс, направленных на восстановление мембранных структур вследствие разрывов в мембране и перекисного окисления липидов.

10. Усиление защитных свойств ГВ с целью их применения в сельском хозяйстве в качестве средств защиты растений может быть достигнуто с помощью соответствующей направленной модификации ГВ, а именно: введения хинонных фрагментов в ГВ для получения детоксикантов почв, загрязнённых тяжёлыми металлами; обогащения железом - для синтеза корректоров хлороза у растений и обогащения кремнием - для получения биоактиваторов.

ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность:

• д.х.н., проф. И.В. Перминовой (химический ф-т МГУ) и сотрудникам её группы за предоставленные препараты природных и модифицированных ГВ и оказанную всестороннюю помощь;

• к.б.н., доц. Г.Ф. Лебедевой (каф. земледелия ф-та почвоведения МГУ) за постоянное внимание к работе и многолетнюю разностороннюю поддержку;

• д.б.н. О.В. Королёвой (Институт биохимии РАН) и сотрудникам её группы за помощь в организации биологических экспериментов, определении антиоксидантной активности ГВ и обсуждение результатов;

• к.х.н. Г.А Бадуну, З.Я. Тясто и к.х.н. М.Г. Чернышевой (каф. радиохимии химического ф-та МГУ) за предоставленные меченные тритием ГВ и оказанную помощь в проведении радиохимических экспериментов;

• О.И. Филипповой (каф. земледелия ф-та почвоведения МГУ) и к.б.н. В.А. Холодову (Почвенный институт РАСХН) за оказанную помощь в проведении токсикологических экспериментов;

• к.х.н. В.И Коробкову (каф. радиохимии химического ф-та МГУ) за помощь в проведении авторадиографии;

• д.б.н. Д.Н. Маторину и д.б.н. П.С. Бенедиктову (каф. биофизики биологического факультета МГУ) за оказанную помощь в организации токсикологических экспериментов и оказанную всестороннюю поддержку;

• к.х.н. Е.А. Цветковой (Институт органической химии РАН) за проведение экспериментов по выделению и фракционированию липидной фракции и обсуждение результатов;

• доц. Ф. Шмитт-Копплину (Helmholtz Zentrum München, ФРГ) и асп. Э.В. Куненкову (химический ф-т МГУ) за проведение анализов методом масс-спектрометрии ионно-циклотронного резонанса с Фурье преобразованием.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненные в диссертационной работе исследования показали, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов может быть обусловлено как образованием комплексов ГВ с токсикантами, так и непосредственным действием ГВ на растения, а именно их включением в липидный метаболизм растений и участием в неспецифических реакциях растений на стресс, направленных на восстановление повреждений мембранных структур вследствие разрывов в мембране и ПОЛ.

На основании количественной оценки детоксифицирующих свойств ГВ в присутствии токсикантов показано, что защитное действие ГВ в почвенных средах обусловлено, прежде всего, образованием нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как в водных средах значительный вклад может вносить собственная биологическая активность ГВ. В случае высоких констант связывания (тяжёлые металлы), ведущую роль в защитных свойствах ГВ играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как при слабом химическом взаимодействии (гербициды) основную роль играет собственная физиологическая активность ГВ.

Проведённые в работе исследования показали перспективность использования модифицированных ГВ в качестве средств защиты растений нового поколения, а именно: хинон-обогащеннЫх гуминовых производных - в качестве детоксикантов почв, загрязнённых тяжёлыми металлами, гуматов железа - в качестве корректоров хлороза у растений, обогащенных кремнием ГВ - в качестве биоактиваторов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Куликова, Наталья Александровна, Москва

1. Агрохимия // В.М. Клечковский, A.B. Петербургский (ред.) М.: Колос, 1964-527с.

2. Алиев, С.А. Парамагнетизм органического вещества почв / С.А. Алиев // Новосибирск, 1987-20с.

3. Анисимова, М.А. Детоксицирующая способность почв и выделенных из них гуминовых кислот по отношению к гербицидам / М.А. Анисимова // Дисс. на соиск. уч. степени к.б.н. М., 1997.

4. Битюцкий, Н.П. Необходимые микроэлементы растений / Н.П. Битюцкий // СПб.: Издательство ДЕАН, 2005 -256с.

5. Бутаев, Б.С. Оценка физиологической активности гуминовых веществ окисленных углей / Б.С. Бутаев, Е.В. Золтоев, Н.В. Бодоев, И.П. Быков, А.Д. Дашицыренова // Химия в интересах устойчивого развития 2005 - т. 13 -№4-с. 501-505.

6. Варшал, Г.М. Геохимическая роль гумусовых кислот в миграции элементов / Г.М. Варшал, Т.К. Велюханова, И.Я. Кощеева // В: Гуминовые вещества в биосфере М.: Наука, 1993 - с. 97-116.

7. Васильев, И.Р. Метод биотестирования природных вод по замедленной флуоресценции микроводорослей / И.Р. Васильев, Д.Н. Маторин, П.С. Венедиктов // Методы биотестирования вод Черноголовка, ОИХФ АН СССР, 1988-с. 23-26.

8. Вахмистров, Д.Б. Гуминовые кислоты: связь между поверхностной активностью и стимуляцией роста растений / Д.Б. Вахмистров, O.A. Зверкова, С.Ю. Дебеец, Н.Е. Мишустина // Докл. АН СССР 1987 - т.293 -№5-с. 1277-1280.

9. Ю.Воробьёва, JI.A. Химический анализ почв / Л.А. Воробьёва // М.: Изд-во МГУ, 1998-272с.

10. Гольдфельд, М.Г. Физико-химические основы действия гербицидов / М.Г. Гольдфельд, Н.В. Карапетян // Итоги науки и техники ВИНИТИ, Биол. химия т.ЗО - с. 1-144, 1989.

11. Горовая, А.И. Гуминовые вещества. Строения, функции, механизма действия, протекторные свойства, экологическая роль / А.И. Горовая, Д.С. Орлов, О.В. Щербенко // Киев: Наукова Думка, 1995 302с.

12. Горовая, А.И. Роль физиологически активных гумусовых препаратов в регуляции процессов клеточного цикла / А.И. Горовая, А.Ф. Кулик, И.А. Огинова // В: Регуляция клеточного цикла растений Киев, 1985 - с. 101109.

13. Данченко, H.H. Определение карбоксильной кислотности гумусовых кислот титриметрическими методами / H.H. Данченко, И.В. Перминова, A.B. Гармаш, A.B. Кудрявцев // Вест. Моск. Ун-та, сер. 2 (Химия) 1998 -т.39-№2-с. 127-131.

14. Дмитриев, Е.А. Математическая статистика в почвоведении / Е.А. Дмитриев //М.: МГУ, 1995-320с.

15. Епишина, Л.А Влияние физиологически активных гумусовых веществ на биоэнергетические процессы у растений / Л.А. Епишина, Л.Ф. Бобырь // В: Доклады о гумусе Брно, ЧССР, 1979.

16. Ибрагимов, К.Ш. Поступление в растения водорастворимых фракций гумусоподобных веществ из почв подзолистого типа / К.Ш. Ибрагимов, А.Д. Фокин // Изв. Тимирязев, с.-х. акад. 1985 - т.5 - с. 74-80.

17. Ипатова, В.И. Адаптация водных растений к стрессовым абиотическим факторам среды / В.И. Ипатова // М.: «Графикон-принт», 2005 224с.

18. Келдербенк, А. Распространение и роль связанных почвой остатков пестицидов / А. Келдербенк // В: Проблемы загрязнения окружающей среды и токсикологии М.: Мир, 1986 - с. 84-117.13

19. Ковалевский, Д.В. Выбор условий регистрации количественных С ЯМР спектров гумусовых кислот / Д.В. Ковалевский, А.Б. Пермин, И.В. Перминова, B.C. Петросян // Вест. Моск. Ун-та, сер. 2 (Химия) 2000 -№41 - с. 39-42.

20. Когут, Б.М. Трансформация гумусового состояния черноземов при их сельскохозяйственном использовании / Б.М. Когут // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. доктора с-х наук М., 1996.

21. Козюкина, Т.Ж. Некоторые аспекты положительного действия гумата натрия на устойчивость растений к промышленному загрязнению атмосферы // Т.Ж. Козюкина Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения - 1983 -Т.9.

22. Красил ьникова, J1.A. Биохимия растений / JI.A. Красильникова, O.A. Авксентьева, В.В. Жмурко, Ю.А. Садовниченко // Харьков: Торсинг, 2004-224с.

23. Круглов, В.П. Влияние торфяных физиологически активных веществ на интенсивность течения ростовых процессов / В.П. Круглов // Докл. Всес. Акад. с-х наук им. В.И. Ленина 1985 - №4 - с. 16-18.

24. Кузнецова, И.А. Трансформация гумат-симазинового комплекса в культуре почвенных актиномицетов / И.А. Кузнецова, T.J1. Вожик, В.А. Кончиц // Бюлл. ВНИИ СХН 1987 - №16 - с. 30-32.

25. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М.: Высшая школа, 1990 352с.

26. Ларина, Г.Е. Оценка и прогноз фитотоксичности сульфонилмочевинных и имидазолиноновых гербицидов / Г.Е. Ларина, Ю.Я. Спиридонов Ю.Я., С.А. Захаров, Т.В. Захарова // Агрохимия 2004 - №4 - с. 22-32.

27. Линник, П.Н. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах / П.Н. Линник, Б.И. Набиванец // Л.: Гидрометеоиздат, 1986 268с.

28. Логинов, Л.Ф. Влияние гуминовых препаратов на ростовые процессы растений и животноводство / Л.Ф. Логинов, И.Д. Комиссаров // Науч. тр. Тюменского с.-х. ин-та 1971 - т. 14 - 266с.

29. Майер-Боде, Г. Гербициды и их остатки / Г. Майер-Боде // М.: Мир, 1972 -206с.

30. Минеев, В.Г. Биотест для определения экологических последствий применения химических средств защиты растений / В.Г. Минеев, Е.Х. Ремпе, Л.П. Воронина // Докл. ВАСХНИЛ 1991 - т.7 - с. 5.

31. Наумова, Г.В. Взаимосвязь молекулярной структуры гуминовых кислот и их биологической активности / Г.В. Наумова, В.П. Стригуцкий, H.A. Жмакова, Т.Ф. Овчинникова // Химия твёрдого топлива 2000 - №2 - с. 3-13.

32. Новикова, Л.Н. Структурные особенности и биологическая активность гуминовых кислот угля / Л.Н. Новикова, Т.Е. Чеченина, Ю.Н. Яковлева, P.M. Островская, Д.Ф. Кушнарёв, В.А. Серышев // Почвоведение 2001 -№3 - с. 333-337.

33. Орлов, Д.С. Гуминовые вещества в биосфере / Д.С. Орлов // М.: Наука, 1993- с.16-27.

34. Орлов, Д.С. Практикум по химии гумуса: учеб. пособие / Д.С. Орлов, JI.A. Гришина // М.: Изд-во Моск. ун-та, 1981 272с.

35. Орлов, Д.С. Химия почв // Д.С. Орлов М.: Изд-во МГУ, 1992 - 259с.

36. Островская, JI.K. Железо в растительном мире и карбонатный хлороз / JI.K. Островская // Киев: Наукова думка, 1993 147с.

37. Перминова, И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гуминовых кислот / И.В. Перминова // Дисс. докт. химических наук М., 2000.

38. Петербургский, A.B. Агрохимия и физиология питания растений / A.A. Петербургский // М.: Россельхозиздат, 1981 183с.

39. Полесская, О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода / О.Г. Полесская // М.: КДУ, 2007 140с.

40. Попов, А.И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование / А.И. Попов // СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2004 258с.

41. Прянишников, Д.Н. Агрохимия / Д.Н. Прянишников // М.: Сельхозгиз, 1940- 644с.

42. Сизов, А.П. Проблемы борьбы с загрязнением почв и продукции растениеводства / А.П. Сизов, Д.М. Хомяков, П.М. Хомяков // М., 1990 -51с.

43. Соколов, М.С. Микробиологическое самоочищение почвы от пестицидов / М.С. Соколов, Р.В. Галиулин // М., 1987 215с.

44. Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешённых к применению на территории Российской Федерации // М.: ООО «Издательство Агрорус», 2007 399с.

45. Сюняев, Х.Х. Радиоиндикаторное исследование трансформации и миграции симазина в почвах подзолистого и черноземного типов / Х.Х. Сюняев // Автореферат на соиск. уч. степени к.б.н. М., 1984.

46. Тарчевский, И.А. Процессы деградации у растений / И.А. Тарчевский // Процессы деградации у растений Соросовский образовательный журнал -1996-№6-с. 13-19.

47. Удовенко, Г.В. Механизмы адаптации растений к стрессам / Г.В. Удовенко // Физиология и биохимия культурных растений 1979 — т. 11 — №2.

48. Физиология растений: учебник для студ. вузов / Н.Д. Алёхин, Ю.В. Балнокин, В.Ф. Гавриленко и др. // М.: Издательский центр «Академия», 2005 640с.

49. Филенко, О.Ф. Водная токсикология / О.Ф. Филенко // Черноголовка: МГУ, 1988- 155с.

50. Фляйг, В. Соотношение между дегидразным действием веществ, являющихся моделью исходного строения гуминовых кислот и ростом растений / В. Флайг // РЖ Биология 1958 - №14.

51. Фокин, А.Д. Исследование процессов трансформации, взаимодействия и переноса органических веществ железа и фосфора в подзолистой почве / А.Д. Фокин // Автореф. на соиск. уч. ст. д.б.н. М., 1975.

52. Фокин, А.Д. О проникновении гумусовых веществ в клетки растений / А.Д. Фокин, Л.Ф. Бобырь, Л.Е. Епишина, Л. Кравцова, Л.А. Христева // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения 1975 - т.5 - с. 57-58.

53. Фокин, А.Д. Роль гуминовых соединений в минеральном питании растений / А.Д. Фокин // Гуминовые удобрения: теория и практика их применения -1975-т.5-с. 38-56.

54. Христева, Л.А. Гуминовые кислоты углистых сланцев как новый вид удобрений / Л.А. Христева // Дисс. на соиск. уч. ст. д.б.н. Киев, 1949.

55. Христева, Л.А. Действие физиологически активных гуминовых кислот на растения при неблагоприятных внешних условиях / Л.А. Христева // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения 1973 - т.4 - с. 523.

56. Христева, Л.А. Еще о функции гуминовых кислот в обмене веществ у высших растений / Л.А. Христева // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения 1962 - т.2 - с. 123-129.

57. Христева, Л.А. О природе действия физиологически активных гумусовых веществ на растения в экстремальных условиях / Л.А. Христева // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения 1977 - т.6 - с. 314.

58. Христева, Л.А. Роль гуминовой кислоты в питании растений и гуминовые удобрения / Л.А. Христева // Труды почвенного ин-та им. В.В.Докучаева, АН СССР 1951 -т.38-с. 108-184.

59. Христева, Л.А. Участие гуминовых кислот и других органических веществ в питании высших растений / Л.А. Христева // Почвоведение 1953 - №10 - с. 46-59.

60. Abelmann, K. Sorption of HOC in soils with carbonaceous contamination: Influence of organic-matter composition / K. Abelmann, S. Kleineidam, H. Knicker, P. Grathwohl, I. Kogel-Knabner // J. Plant Nutr. Soil Sci. 2005 -V. 168-pp. 293-306.

61. Agbenin, J.O. Competitive adsorption of copper and zinc by a Bt horizon of a savanna Alfisol as affected by pH and selective removal of hydrous oxides and organic matter / J.O. Agbenin, L.A Olojo // Geoderma 2004- V.l 19 - pp. 85-95.

62. Alonso, R. Interactive effects of ozone and drought stress on pigments and activities of antioxidative enzymes in Pinus halepensis / R. Alonso, S. Elvira, F.J. Castillo, B.S. Gimeno // Plant Cell Environ. 2001 - V.24 - pp. 1331-1341.

63. Aluwihare, L.I. A major biopolymeric component of dissolved organic carbon in surface sea water / L.I. Aluwihare , J. Répéta, R.F. Chen RF // Nature 1997 -V.387 - pp. 166-169.

64. Anisimova, M.A. Detoxifying capacity of humic acids toward the triphluraline herbicide / M.A. Anisimova, I.V. Perminova, G.F. Lebedeva // 1998 Eurasian Soil Sci. - V.31 - №9 - pp. 1079-1084.

65. Azam, F. Effect of humic acids on seedling growth of wheat (Triticum aestivum L.) under different conditions / F. Azam, K.A. Malik, K.A. // Pak. J. Botany -1982-V. 14-pp. 47-48.

66. Badun, G.A. New variant of scintillation phase method / G.A. Badun, V.Yu. Pozdnyakova, Z.A. Tyasto, M.G. Chernysheva // Radiokhimiya 2005 - №47 -pp. 536-540 (in Russian).

67. Bailey, G.W. Soil-pesticide relationships, review of adsorbtion and desorbtion of organic pesticides by soil colloids, with implication concerning pesticidebioactivity / G.W. Bailey, J.L. White // Agric Food Chem. 1964 - V.12 -№4 -pp. 324-332.

68. Bais, H.P. How plants communicate using the underground information superhighway / H.P. Bais, S.-W. Park, T.L. Weir, R.M. Callaway, J.M. Vivanco // Trends Plant Sci. 2004 - V.9 - №1 - pp. 26-32.

69. Balarezo, A.L. Influence of humic acid on 1-aminopyrene ecotoxicity during solar photolysis process / A.L. Balarezo, V.N. Jones, H. Yu, H.-M. Hwang // Int. J. Mol. Sci. 2002 - V.3 - pp. 1133-1144.

70. Baraud, F. Effect of cadmium and humic acids on metal accumulation in plants / F. Baraud, T.W.-M. Fan, R.M. Higashi // In: Environmental Chemistry: Green Chemistry And Pollutants In Ecosystems, Springer Verlag, The Netherlands, 2005 -pp. 205-214.

71. Barriuso E. Incorporating non-extractable atrazine residues into soil size fractions as a function of time /E. Barriuso, W.C. Koskinen // Soil. Sci. Soc. Am. J. 1996- V.60 pp. 150-157.

72. Bender, M.E. Significance of metal complexing agents in secondary sewage effluents / M.E. Bender, W.R. Matson, S.A. Jordan // Environ. Sci. Technol. -1970 V.4 - №6 - pp. 520-521.

73. Biesinger, K.E. Chronic toxicity of NTA (nitrilotriacetate) and metal-NTA complexes to Daphnia magna / K.E. Biesinger, R.W. Andren, J.W. Arthur // J. Fish. Res. Board Can. 1974 -V.31 - №4 - pp.486-490.

74. Black, M.C. Dissolved organic macromolecules reduce the uptake of hydrophobic organic contaminants by the gills of rainbow trout (.Salmo gairdneri) / M.C. Black, J.F. McCarthy // Environ. Toxicol. Chem. 1988 - V.7 - pp. 593-600.

75. Blondeau, R. Biodégradation of natural and synthetic humic acids by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium / R. Blondeau // Appl. Environ. Microbiol.- 1989 V.55 - pp. 1282-1285.

76. Bocanegra, M.P. Iron-humate as a source of iron for plants / M. Bocanegra, J.C. Lobartini, G.A. Orioli // Comm. Soil Sci. Plant Analysis 2004 - V.35 -№17-18-pp. 2567-2576.

77. Bollag, J.-M. Decontaminating soil with enzymes / J.-M. Bollag // Environ. Sci. Technol. 1992 - V.26 - pp. 1876-1881.

78. Bollag, J.-M. Detoxification of aquatic and terrestrial sites through binding of pollutants to humic substances / J.-M. Bollag, K. Mayers // Sci. Total Environ. -1992 V.l 17/118 - pp. 357-366.

79. Borgmann U. Determination of free metal ion concentrations using bioassays / U. Borgmann // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1981 - V.38 - №8 - p. 999-1002.

80. Bottomley, W.B. Some accessory factors in plant growth and nutrition / W.B. Bottomley // Proc. of the Royal Society of London (Biology) 1914a - V.88 -pp. 237-247.

81. Bottomley, W.B. The significance of certain food substances fro plant growth / W.B. Bottomley // Annals of Botany (London) 1914b - V.34 - pp. 353-365.

82. Brack, W. Chlorophyll a fluorescence: a tool for the investigation of toxic effect in the photosynthetic apparatus / W. Brack, H. Frank // Exotoxicol. Environ. Safety -1998 V.40 - pp. 34-41.

83. Bressler, D.C. Oxidation of carbazole, N-ethylcarbazole, fluorene, and dibenzothiophene by the laccase of Coriolopsis gallica / D.C. Bressler, P.M. Fedorak, M.A. Pickard // Biotech. Lett. 2000 - V.22 - pp. 1119-1125.

84. Brooks, M.L. Complexation and time-dependent accumulation of copper by larval fathead minnows (Pimephales promelas): implications for modeling toxicity / M.L. Brooks, C.J. Boese, J.S. Meyer // Aquat. Toxicol. 2006 - V.78 - pp. 4249.

85. Bruchet, A. THM formation potential and organic content: A new analytical approach / A. Bruchet, C. Rousseau, J. Mallevialle // J. Am. Water Works Assoc. 1990-V.82-pp. 66-74.

86. Bubner M. Synthesis of isotopically labeled synthetic humic acids / M. Bubner, S. Pompe, M. Meyer, K.H. Heise, H. Nitsche // Annual report 1998 of Institute of Radiochemistry Forschungszentrum Rossendorf, Jan 1999 - FZR-247.

87. Buchwalter, D.B. Modulation of cupric ion activity by pH and fulvic acid as determinants of toxicity in Xenopus laevis embryos and larvae /D.B. Buchwalter, G. Linder, L. R. Curtis // Environ. Toxicol. Chem. 1996 - V.15 - №4 - pp. 568573.

88. Cabaniss, S.E. A stochastic model for the synthesis and degradation of natural organic matter. Part III: modeling Cu(II) complexation / S.E. Cabaniss, P.A. Maurice, Madey G. // Appl. Geochem. 2007 - V.22 - pp. 1646-1658.

89. Cacco, G. Effect of nitrate and humic substances of different molecular size on kinetic parameters of nitrate uptake in wheat seedlings / G. Cacco, A. Giovanni, G. Emilio, A. Gelsomino, M. Sidari // J. Plant Nutr. Soil Sci. 2000 -V.163-№3-pp. 313-320.

90. Cacco, G. Plant growth regulator activity of soluble humic complex / G. Cacco, G. Dell'Agnola // Can. J. Soil Sci. 1984 - V.62 - pp. 306-310.

91. Capriel, P. Distribution and nature of bound (nonextractable) residues of atrazine in a mineral soil nine years after herbicide application / P. Capriel, A. Haisch, S.U. Khan // J. Agrie. Food Chem. 1985 - V.33 - pp. 567-569.

92. Carlsen, L. Radio-labelling of humic and fulvic materials for use in environmental studies / L. Carlsen, P. Lassen, P., J.V. Christiansen, P. Warwick, A. Hall, A. Randall // Radiochim. Acta 1992 - V.58/59 - pp. 371-376.

93. Celis, R. Sorption of atrazine and simazine by model associations of soil colloids / R. Celis, J. Cornejo, M.C. Hermosin, W.C. Koskinen // Soil Sci. Soc. Am. J. 1998 -V.62 - pp. 165-171.

94. Celis, R. Sorption-desorption of atrazine and simazine by model soil colloidal components / R. Celis, J. Cornejo, M.C. Hermosin, W.C. Koskinen // Soil Sci. Soc. Am. J. 1997-V.61 - pp. 436-443.

95. Chaney, K. The influence of organic matter on aggregate stability in some British soils. / K. Chaney, R.S. Swift // J. Soil Sci. 1984 - V.35 - pp.223-230.

96. Chefetz, B. Sorption-desorption behavior of triazine and phenylurea herbicides in Kishon river sediments / B. Chefetz, Y.I Bilkes, T. Polubesova // Water Res. 2004 - V.38 - pp. 4383-4394.

97. Chen, Y. Mechanisms of plant growth stimulation by humic substances: the role of organo-iron complexes / Y. Chen, C.E. Clapp, H. Magen // Soil Sci. Plant Nutr. 2004 - V.50 - pp. 1089-1095.

98. Chen, Y. Stimulation of plant growth by humic substances: effects on iron availability / Y. Chen, C.E. Clapp, H. Magen, V.W. Cline // R. Soc. Chem. 1999 -V.247-255-263.

99. Chen, Yu. Effect of fulvic acid on ABA, IAA and activity of superoxide dismutase and peroxidase in winter wheat seedling under drought condition / Yu. Chen, M. Cao, Yu. Li, X. Zhou // Zhiwu Shenglixue Tongxun 2000 - V.36 -№4-pp. 311-314.

100. Cheshire, M.V. Humic acid-IE / M.V. Cheshire, P.A. Cranwell, R.D. Haworth//Tetrahedron- 1968-V.24-pp. 5155-5167.

101. Chinnusamy, V. Understanding and improving salt tolerance in plants / V. Chinnusamy, A. Jagendorf, J.-K. Zhu // Crop Sci. 2005 - V.45 - pp. 437-448.

102. Christman, R.F. Chemical nature of organic color in water / R.F. Christman, M. Ghassemi // J. Am. Water Works Assoc. 1966 - V.58 - pp. 723-741.

103. Clapp, C.E. Measurements of sorption-desorption and isotherm analysis / C.E. Clapp, M.B.H. Hayes, U. Mingelgrin // In: Humic substances in transport processes, Anaheim, California, USA, 1997 1997, p. 13.

104. Cole, M.A. Effect of compost addition on pesticide degradation in planted soils / M.A. Cole, X. Liu, L. Zhang // In: Bioremediation of Recalcitrant Organics, R.E. Hinchee, D.B. Anderson, R.E. Hoeppel (Eds.) Battelle Press, Columbus, 1995-pp. 183-190.

105. Cooper, R.J. Influence of humic substances on rooting and nutrient content of creeping bentgrass / R.J. Cooper, C. Liu, D.C. Fisher // Crop Sci. 1998 - V.38 -pp. 1639-1644.

106. Coquet, Y. Sorption of pesticides atrazine, isoproturon, and metamitron in the vadose zone / Y. Coquet // Vadose Zone J. 2003 - V.2 - pp. 40-51.

107. Cozzi, R. Desmutagenic activity of natural humic acids: inhibition of mitomycin C and maleic hydrazide mutagenicity / R. Cozzi, M. Nicolai, P. Perticone, R. De Salvia, F. Spuntarelli // Mutat. Res. 1993 - V.299 - pp. 37-44.

108. Crisostomo, A.G. Generation of superoxide and singlet oxygen from a-tocopherolquinone and analogues / A.G. Crisostomo, R.B. Moreno, S. Navaratnam, J.A. Wilkinson, R.H. Bisby // Free Radic. Res. 2007 - V.41 - №6 -pp. 730-737.

109. Currie, H.A. Silica in plants: biological, biochemical and chemical studies / H.A. Currie, C.C. Perry // Ann. Botany 2007 - V. 100 - pp. 1383-1389.

110. Dakora, F.D. 2003. Defining new roles for plant and rhizobial molecules in sole and mixed plant cultures involving symbiotic legumes /F.D. Dakora // New Phytologist V. 158 - pp. 39-49.

111. Dakora, F.D. Root exudates as mediators of mineral acquisition in low-nutrient environments / F.D. Dakora, D.A. Phillips // Plant Soil 2002 - V.245 -pp. 35-47.

112. Danchenko, N.N. A use of barita method for determination of the total acidity of humic substances: conditions of applicability / N.N. Danchenko, I.V. Perminova, V.S. Petrosyan // Russian J. Ecol. Chem. 1995 - V.4 - №4 - pp. 313-317.

113. David, P.P. A humic acid improves growth of tomato seedlings in solution culture / P.P. David, P.V. Nelson, D.C. Sanders // J. Plant Nutr. 1994 - V. 17 -pp. 173-184.

114. Day, K.E. Effects of dissolved organic carbon on accumulation and acute toxicity of fenvalerate, deltamethrin and cyhalothrin to Daphnia magna (Straus) / K.E. Day // Environ. Toxicol. Chem. 1991 - V.10 - pp. 91-101.

115. Dec, J. Release of substituents from phenolic compounds during oxidative coupling reactions / J. Dec, K. Haider, J.-M. Bollag // Chemosphere 2003 - V.52 -p. 549.

116. Dehorter, B. Extracellular enzyme activities during humic acid degradation by the white rot fungi Phanerochaete chrysosporium and Trametes versicolor / B. Dehorter, R Blondeau, R. // FEMS Microbiol. Lett. 1992 - V.94 - pp. 209216.

117. Dell'Agnola, G. Hormone-like effect of enhanced nitrate uptake induced by depolycondenced humic fractions obtained from Allobophora rosea and A. caliginosa faeces / G. Dell'Agnola, S. Nardi // Biol. Fertil. Soils 1987 - V.4 -pp. 115-118.

118. Dell'Agnola, G. News about biological effect of humic substances / G. Dell'Agnola, S. Nardi // In: Humic Substances Effect on Soil and Plant Italy, Reda, 1986-pp. 78-88.

119. Demir, K. Effects of humic acids on the yield and mineral nutrition of cucumber (Cucumis sativus L.) grown with different salinity levels / K. Demir, A. Giines, A. Inal, M. Alpaslan // Acta Hort. (ISHS) 1999 - V.492 - pp. 95-104.

120. Devevre, O.C. Stabilization of fertilizer nitrogen-15 into humic substances in aerobic vs. waterlogged soil following straw incorporation /O.C. Devevre, W.R. Horwath // Soil Sci. Soc. Am. J. 2001 - V.65 - pp. 499-510.

121. Devitt, E.C. Dialysis investigation of atrazine-organic matter interactions and the role of divalent metal / E.C. Devitt, M.R. Weisner // Environ. Sci. Technol. 1998 - V.32 - pp. 232-237.

122. Dierckx, A. Stability of 125I and 14C labeled boom clay organic matter / A. Dierckx, A. Hall, P. De Canniere, P. Warwick, M. Put // Radiochim. Acta -1998-V.82-pp. 379-384.

123. DiTomaso, J.M. Transport kinetics and metabolism of exogeneously applied putrescine in rots of intact maize seedlings / J.M. DiTomaso, J.J. Hart, L.V. Kochian // Plant Physiol. 1992 - V.98 - pp. 611-620.

124. Doblin, M. Uptake of humic substances by the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella / M. Doblin, C. Legrand, P. Carlsson, C. Hummert, E. Graneli, G. Hallegraeff // Abstracts of the 9th conference on Harmful Algal Blooms Tasmania, 2000.

125. Dudal, Y. Accounting for natural organic matter in aqueous chemical equilibrium models: a review of the theories and applications / Y. Dudal, F. Gerard // Earth Sci. Rev. 2004 - V.66 - pp. 199-216.

126. Dunstone, R.L. Variable responses of stomatal conductance, growth, and yield to fulvic acid applications to wheat / R.L. Dunstone, R.A. Richards, H.M. Rawson // Aust. J. Agric. Res. 1988 - V.39 - pp. 547-553.

127. Environmental Protection Agency. Water Quality Standards; establishment of numeric criteria for priority toxic pollutants for the state of California // Rule, 40 CFR Part 131, Fed. Register. 2000 - V.65 - №97 - pp. 31682-31719.

128. Ermakov, E.I. Effect of humus acids on the mechanical properties of cell walls / E.I. Ermakov, I.N. Khitorova, O.V. Skobeleva // Rus. J. Plant Physiol. -2000-№47-pp. 518-525.

129. Ervin, E.H. Applied physiology of natural and synthetic plant growth regulators on turfgrasses / E.H. Ervin, X. Zhang // In: Handbook of turfgrass management and physiology Pessarakli (ed.) - Taylor and Francis, 2007 - pp. 171-200.

130. Espeland, E.M. Complexation, stabilization and UV photolysis of extracellular and surface-bound glucosidase and alkalinephosphotase: implications for biofilm microbiota / E.M. Espeland, R.G. Wetzel // Vicrobial ecology 2001 -V.42 - pp. 572-585.

131. Evans, E.A. Tritium and its compounds / E.A. Evans // Butterworths, London, 1966-44 lp.

132. Fein, J.B. Experimental study of humic acid adsorption onto bacteria and Al-oxide mineral surfaces / J.B. Fein, J.-F. Boily, K. Guclu, E. Kaulbach // Chem. Geol. 1999 - V. 162 - pp. 33-45.

133. Flaig, W. Nachweis der Bildung von Hydroxy-p-Benzochinon als Zwischenprodukt bei der Autooxydation von Hydrochinon in schwach alkalischer Lösung / W. Flaig, J.C. Salfield // Naturwissenschaften 1960 - V.47 - p. 516.

134. Flaig, W. UV-Spektren und Konstitution von p-Benzochinonen / W. Flaig, J.C. Salfield // Liebigs Ann. Chem. 1958 - V.618 - p. 117.

135. Fong, S.S. Characterization of the coal derived humic acids from Mukah, Sarawak as soil conditioner / S.S. Fong, L. Seng, W.N. Chong, J. Asing, M. Nor, A. Pauzan // J. Braz. Chem. Soc. 2006 - V.17 - №3 - pp. 582-587.

136. Fortun, C. Action of humic acid preparations on leaf development, mineral elements contents and chloroplast ultrastructure of ryegrass plants / C. Fortun, S. Rapsch, C. Ascaso // Photosynthetica 1985 - V. 19 - pp. 294-299.

137. Foyer, C.H. Oxidant and antioxidant signaling in plants: a re-valuation of the concept of oxidative stress in a physiological context / C.H. Foyer, G. Noctor // Plant Cell Environ 2005 - V.28 - pp. 1056-1071.

138. Franke, K. A new technique for radiolabelling of humic substances / K. Franke, J.T. Patt, H. Kupsch, J. Steinbach // Radiochim. Acta 2004 - V.92 -№4-6-pp. 359-362.

139. Frost, P.C. The effect of cadmium on fulvic acid adsorption to Bacillus subtilis / P.C. Frost, P.A. Maurice, J.B. Fein // Chem. Geol. 2003 - V.200 - pp. 217-224.

140. Fu, J. Involvment of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress / J. Fu, B. Huang // Environ. Experiment. Bot. 2001 - V.45 - pp. 105-114.

141. Fukushima, M Functionalities of humic acid for the remedial processes of organic pollutants / M. Fukushima, K. Tatsumi // Analyt. Sci. 2001 - V.17 -pp. Í821-Í823.

142. Gaechter, R. Regulation of copper availability to phytoplankton by macromolecules in lake water / R. Gaechter, J.S. Davis, A. Mares // Environ. Sci. Technol. 1978 - V.12 -№13 -pp.1416-1421.

143. Galston, A.W. Polyamines in plant physiology / A.W. Galston, R.K. Sawhney // Plant Physiol. 1990 - V.94 - pp. 406-410.

144. Gamble, D.S. Atrazine hydrolysis in aqueous suspension of humic acid at 25.0°C / D.S. Gamble, S.U. Khan // Can. J. Chem. 1988 - V.66 - pp. 26052617.

145. García-Mina, J.M. Metal-humic complexes and plant micronutrient uptake: a study based on different plant species cultivated in diverse soil types / J.M. García-Mina, M.C. Antolín, M. Sanchez-Diaz // Plant and Soil 2004 - V.258 -pp.57-68.

146. Gardner, J.L. Interactive effects of aluminum and humic substances on salvinia / J.L. Gardner, S.H. Al-Hamdani // J. Aquat. Plant Manage 1997 - V.35 -pp. 30-34.

147. Gau, R.J. Humic acid suppresses the LPS-induced expression of cell-surface adhesion proteins through the inhibition of NF-kappa B activation / R.J. Gau, H.L. Yang, S.N. Chow, J.L. Suen, F.J. Lu // Toxicol. Appl. Pharmacol. -2000 V. 166 - pp. 59-67.

148. Gerritsen, J. Electrophoretic mobility of natural particles and cultured organisms in fresh water / J. Gerristen, S.W. Bradley // Limnol. Oceanogr. 1987 -V.32-pp. 1049-1058.

149. Gevao, B. Bound residues in soils: a review / B. Gevao, K.T. Semple, K.C. Jones // Environ. Pollution 2000 - V. 180 - pp. 3-14.

150. Gianfreda, L. Effect of soils on the behavior of immobilized enzymes / L. Gianfreda, J.-M. Bollag// Soil Sci. Soc. Am. J. 1994-V.58 - pp. 1672-1681.

151. Giesy, J.P. Copper speciation in soft, acid, humic waters: effects on copper bioaccumulation by and toxicity to Simocephalus serrulatus (Daphnidae) / J.P. Giesy, A. Newell, G.J. Leversee // Sci. Total. Environ. 1983 - V.28 - pp. 23-36.

152. Gilmour, J.T. S-trizines adsorbtion studies: Ca-H-humic acid / J.T. Gilmour, N.T. Coleman // Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 1971 - V.35 - №2 - pp. 256-259.

153. Gjessing, A.M.B. Oxidative coupling during gut passage in marine depositfeeding invertebrates / A.M.B. Gjessing, L.M. Mayer // Limnol. Oceanogr. 2004 -V.49-№3-pp. 716-726.

154. Gjessing, E.T. Physical and chemical characteristics of aquatic humus / E.T. Gjessing // Ann Arbor, MI: Ann Arbor Science, 1976.

155. Gjessing, E.T. The effect of aquatic humus on the biological availability of cadmium / E.T. Gjessing // Arch. Hydrobiol. 1981 - V.91 - №2 - pp.144-149.

156. Goodman, B.A. The occurrence of copper porphyrin complexes in soil humic acids / B.A. Goodman, M.V. Cheshire // J. Soil Sci. 1976 - V.27 - pp. 337-347.

157. Graber, E.R. Hydration-facilitated sorption of specific interacting organic compounds by model soil organic matter / E.R. Graber, M.D. Borisover // Environ. Sci. Technol. 1998 - V.32 - №2 - pp. 258-263.

158. Gramss, G., Degradation of soil humic extract by wood- and soil-associated fungi, bacteria, and commercial enzymes / G. Gramms, D. Ziegenhagen, S. Sorge // Microbial Ecol.- 1999- V.37- pp. 140-151.

159. Gu, C. Complexation of the antibiotic tetracycline with humic acid / C. Gu, K.G. Karthikeyan, S.D. Sibley, J.A. Pedersen // Chemosphere 2006 - V.66 -pp. 1494-1501.

160. Gu, Zh. Effects of fulvic acid on the bioavailability of rare earth elements and GOT enzyme activity in wheat (Triticum aestivum) / Zh. Gu, X. Wang, X. Gu, J. Cheng, W. Jing, D.L. Liansheng, Y. Chen // Chemosphere 2001 - V.44 - №4 -pp. 545-551.

161. Gunasekara, A.S. Sorption and desorption of naphthalene by soil organic matter: importance of aromatic and aliphatic components / A.S. Gunasekara, B. Xing // J. Environ. Qual. 2003 - V.32 - pp. 240-246.

162. Gustafsson, J.P. Modeling the acid-base properties and metal complexation of humic substances with the Stockholm humic model / J.P. Gustafsson // J. Colloid Interface Sci. 2001 - V.244 - pp. 102-112.

163. Haider, K.M. Mineralization of 14C-labelled humic acids and of humic acid bound 14C-xenobiotic by Phanerochaete chrysosporium / K.M. Haider, J.P. Martin // Soil Biol. Biochem. 1988 - V.20 - p. 425.

164. Hallett, F.R. Mechanical properties of vesicles / F.R. Hallet, J. Marsh, B.G. Nickel, J.M. Wood // Biophys. J. 1993 - V.64 - pp. 426^134.

165. Hamman, B. Cell-wall extension as a mode of action of coal-derived humâtes / B. Hamman, G. Koning, H.A. Van De Venter // S. Afr. J. Bot. 1999 -V.65 - №3 - pp. 197-202.

166. Hansch, C. Exploring QSAR hydrophobic, electronic, and steric constants / C. Hansch, A. Leo, D. Hoekman // American Chemical Society, Washington, DC, 1995.

167. Hartmann, T. Metabolic links between the biosynthesis of pyrrolizidine alkaloids and polyamines in root cultures of Senecio vulgaris / T. Hartmann, H. Sander, R. Adolph, G. Toppel // Planta 1988 - V.175 - pp. 82-90.

168. Harvey, G.R. Synthesis of marine humic substances from unsaturated lipids / G.R. Harvey, D.A. Boran, S.R. Piotrowicz, C.P. Weisel // Nature 1984 - V.309 -pp. 244-246.

169. Hayes, M.H.B. Adsorption of triazine herbicides on soil organic matter, including a short review on soil organic matter chemistry / M.B.H. Hayes // Residue Rev. 1970-V.32-pp. 131-174.

170. Hayes, M.H.B. Solvent systems for the isolation of organic components from soils / M.H.B. Hayes // Soil Sci. Soc. Am. J. 2007 - V.70 - pp.986-994.

171. Hernando, F. Semaine d'etiude. Matiere organique et fertilite du Sol / F. Hernando // Ponlifica Aced/ Scient 1968 - p. 805.

172. Higgo, J.J. Colloid transport in a glacial sand aquifer. Laboratory and field studies / J.J. Higgo, G.M. Williams, I. Harrison, P. Warwick, M.P. Gardiner // Colloids Surf. A 1993 - V.73 - pp. 179-200.

173. Hofrichter, D. Degradation of lignite (low-rank coal) by ligninolytic basidiomycetes and their manganese peroxidase system / D. Hofrichter, S. Ziegenhagen, R.U. Sorge, W.F. Bublitz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999 - V.52 - pp. 78-84.

174. Hofrichter, M. Enzymatic combustion of aromatic and aliphatic compounds by manganese peroxidase from Nematoloma frowardii / M. Hofrichter, K. Scheibner, I. Schneegaû, W. Fritsche // Appl. Environ. Microbiol. 1998 - V.64 -pp. 399-404.

175. Imbufe, A.U. Effects of potassium humate on aggregate stability of two soils from Victoria, Australia / A.U. Imbufe, A.F. Patti, D. Burrow, A. Surapaneni, W.R. Jackson, A.D. Milner // Geoderma 2005 - V.125 - pp. 321-330.

176. Inaba, Sh. Effects of dissolved organic matter on toxicity and bioavailability of copper for lettuce sprouts / Sh. Inaba, Ch. Takenaka // Environ. Int. 2005 - V.31 - №4 - pp. 603-608.

177. Ji, R. Transformation and mineralization of synthetic 14C-labeled humic model compounds by soil-feeding termites / R. Ji, A. Kappler, A. Brune // Soil Biol. Biochem. 2000 - V.32 - p. 1281-1290.

178. John, B. Storage of organic carbon in aggregate and density fractions of silty soils under different types of land use / B. John, T. Yamashita, B. Ludwig, H. Flessa // Geoderma 2005 - V.128 - pp. 63-79.

179. Jones, M.N. Colloidal properties of humic substances / M.N. Jones, N.D. Bryan // Adv. Colloid Interface Sci. 1998 - V.78 - pp. 1-48.

180. Kappler, A. Synthesis and characterization of specifically 14C-labeled humic model compounds for feeding trials with soil-feeding termites / A. Kappler, R. Ji, A.L. Brune // Soil Biol. Biochem. 2000 - V.32 - pp. 1271-1280.

181. Karickhoff, S.W. Organic pollutant sorption in aquatic systems / S.W. Karickhoff// J. Hydraul. Eng. Div. Am. Soc. Civ. Eng. 1984 - V.l 10 - pp. 707735.

182. Kaur-Sawhney, R. Polyamine induced DNA synthesis and mitosis in oat leaf protoplasts / R. Kaur-Sawhney, H.E. Flores, A.W. Galston // Plant Physiol. -1980-V.65-pp. 368-371.

183. Khalaf, M. Comparison of sorption domains in molecular weight fractions of a soil humic acid using solid-state 19F NMR / M. Khalaf, S.D. Kohl, E. Klumpp, J. Rice, E. Tombacz // Environ. Sci. Technol. 2003 - V.37 - pp. 2855-2860.

184. Khan, S.U. The interaction of organic matter with pesticides / S.U. Khan // In: Soil organic matter M. Schnitzen, S.U. Khan (Eds.) - Amsterdam Oxford NJ, Elsev. Scien. Pub. Comp., 1978 - Ch. 4. - p. 137-171.

185. Khwaja, A.R. Binding constants of divalent mercury (Hg2+) in soil humic acids and soil organic matter / A.R. Khwaja, P.R. Bloom, P.L. Brezonik // Environ. Sci. Technol. 2006- V.40 -pp. 844-849.

186. Kim, J.I. Complexation of metal ions with humic acid: metal ion charge neutralisation model / J.I. Kim, K.R. Czerwinski // Radiochim. Acta 1996 -V.73 - pp. 5-10.

187. Kirschner, R.A. Humic and fulvic acids stimulate the growth of Mycobacterium avium / R.A. Kirschner, B.C. Parker, J.O Falkinham // FEMS Microbiol. Ecol. 1999 - V.30 - pp. 327-332.

188. Klavins, M. Humic substances as catalysts in condensation reactions / M. Klavins, J. Dipane, K. Babre // Chemosphere 2001 - V.44 - pp. 737-742.

189. Kleinhempel, D. Ein Beitrag zur Theorie des Huminstoffzustandes / D. Kleinhempel // Albrecht-Thaer-Archiv. 1970 - V.14 - №1 - pp. 3-14.

190. Kolbl, A. A comparison of two methods for the isolation of free and occluded particulate organic matter / A. Kolbl, J. Leifeld, I. Kogel-Knabner // J. Plant Nutr. Soil Sci. 2005 - V. 168 - pp.660-667.

191. Koopal, L.K. Ion binding to natural organic matter: general considerations and the NICA-Donnan Model / L.K. Koopal, T. Saito, J.P. Pinheiro, W.H. van Riemsdijk // Ion Colloids Surf., A 2005 - V.265 - pp. 40-54.

192. Koprivnjak, J.F. Coupling reverse osmosis with electrodialysis to isolate natural organic matter from fresh waters / J.F. Koprivnjak, E.M. Perdue, P.H. Pfromm // Water Res. 2006 - V.40 - pp. 3385-3392.

193. Korotkova, E.I. Investigation of antioxidant and catalytic properties of some biologically active substances by voltamperometry / E.I. Korotkova,

194. Y.A. Karbainov, O.A. Avramchik // Annal Bioanal. Chem. 2003 - V.375 -pp. 465-468.

195. Kulikova, N.A. Auxin-like activity of different fractions of coal humic acids / N.A. Kulikova, A.D. Dashitsyrenova, I.V. Perminova, G.F. Lebedeva // Bulgarian J. Ecolog. Sci. 2003 - V.2 - №3-4 - pp. 55-56.

196. Kulikova, N.A. Sorption-desorption of atrazine on mineral-bound humic substances related to their structure / N.A. Kulikova, I.V. Perminova // Fresenius Environ. Bull. 2007 - V.16 - №9a - pp. 1061-1068.

197. Lafond, G.P. Soil temperature and moisture stress effects on kernel water uptake and germination of winter wheat / G.P. Lafond, D.B. Fowler // Agron. J -1989 V.81 - №3 - pp. 447-450.

198. Lange, N. Grundlagenuntersuchungen zu immunologishen Reaktionen an der Laboratoriumstratte unter dem Einflus von Huminsauren / N. Lange, S. Golbs, M. Kuhnert // Arch. Exper. Veter.-Med. 1987 - V.41 - pp. 140-146.

199. Langford, C.H. When should humic substances be treated as dynamic combinatorial systems? / C.H. Langford, J.R. Melton // In: Humic Substances: Molecular Details and Applications in Land and Water Conservation

200. E.A. Ghabbour, G. Davies (Eds.) New York, Taylor & Francis, 2005 - pp. 6578.

201. Latch, D.E. Microheterogeneity of singlet oxygen distributions in irradiated humic acid solutions / D.E. Latch, K. McNeil // Science 2006 - V.311 -pp. 1743-1747.

202. Leenheer, J.A. Molecular resolution and fragmentation of fulvic acid by electrospray ionization/multistage tandem mass spectrometry / J.A. Leenheer,

203. C.E. Rostad, P.M. Gates, E.T. Furlong // Anal. Chem. 2001 - V.73 - pp. 14611471.

204. Leenheer, J.A. Progression from model structures to molecular structures of natural organic matter components / J.A. Leenheer // Annals Environ. Sci. 2007 -V.l - pp. 57-68.

205. Leenheer, J.A. Strong-acid, carboxyl-group structures in fulvic acid from the Suwannee River, Georgia. 2. Major structures / J.A. Leenheer, R.L.Wershaw, M.M. Reddy // Environ. Sci. Technol. 1995 - V.29 - pp. 399-405.

206. D.M. McKnight, K.A. Thorn (Eds.) U.S. Geological Survey Water-Supply Paper 2373, Denver, CO: U.S. Geological Survey, 1994 -pp. 195-211.

207. Leenheer, J.A. Terpenoids as major precursors of dissolved organic matter in landfill leachates, surface water, and groundwater / J.A. Leenheer, M.A. Nanny, C. Mclntyre // Environ. Sci. Technol. 2003 - V.37 - pp. 2323-2331.

208. Leenheer, J.A. Progression from model structures to molecular structures of natural organic matter components / J.A. Leenheer // Annals Environ. Sci. 2007 -V.l - pp. 57-68.

209. Lesage, S. Humic acids enhanced removal of aromatic hydrocarbons from contaminated aquifers: developing a sustainable technology / S. Lesage, K.S. Novakowski, S. Brown, K. Millar // J. Environ. Sci. Health A 2001 - V.36 - №8 - pp. 1515-1533.

210. Lesan, H.M. Evaluation of atrazine binding to surface soils / H.M. Lesan, A. Bhandari // Proceedings of the 2000 Conference on Hazardous Waste Research -2000-pp. 76-89.

211. Li, L. Chemical and molecular heterogeneity of humic acids repetitively extracted from a peat / L. Li, W. Huang, P. Peng, G. Sheng, J. Fu // Soil Sci. Soc. Am. J. 2003 - V.67 - pp. 740-746.

212. Li, M. Physiological effect of a new FA antitranspirant on maize / M. Li, S. Li, Sh. Zhang, B. Chi // Zhongguo Nongye Kexue (Beijing, China) 2003 - V.36 -№11 - pp. 1266-1271.

213. Liang, Y. Mechanisms of siliconmediated alleviation of abiotic stresses in higher plants: a review / Y. Liang, W. Sun, Y.-G. Zhu, P. Christie // Environ. Poll. 2007 - V. 147 - pp.422-428.

214. Lieber, M.R. Dynamics of the holes in human erythrocyte membrane ghost / M.R. Lieber, T.L. Steck // J. Biol. Chem. 1982 - V.257 - pp. 11660-11666.

215. Lippold, H. Effect of humic acid on the pH-dependent adsorption of terbium (III) onto geological materials / H. Lippold, N. Muller, H. Kupsch // Appl. Geochem. 2005 - V.20 - pp. 1209-1217.

216. Loiseau, L. Characterization of the atrazine's bound (nonextractable) residues using fractionation techniques for soil organic matter / L. Loiseau, E. Barriuso // Environ. Sci. Technol. 2002 - V.36 - pp. 683-689.

217. Lorenzo, J.I. Effect of humic acids on speciation and toxicity of copper to Paracentrotus lividus larvae in seawater / J.I. Lorenzo, O. Nieto, R. Beiras // Aquat. Toxicol. 2002 - V.58 - pp. 27-41.

218. Lowe, L.E. Studies on the nature of sulfur in peat humic acids from Froser River Delta, British Columbia / L.E. Lowe // Sci. Total Environ. 1992 - V.l 13 -pp.133-145.

219. Lu, Y. Demonstration of the "Conditioning Effect" in soil organic matter in support of a pore deformation mechanism for sorption hysteresis / Y. Lu, J J. Pignatello // Environ. Sci. Technol. 2002 - V.36 - pp. 4553-4561.

220. Ma, Y.B. Determination of labile Cu in soils and isotopic exchangeability of colloidal Cu complexes / Y.B. Ma, E. Lombi, A.L. Nolan, M.J. McLaughlin // European J. Soil Sci. -2006 V.57 - pp. 147-153.

221. Mackowiak, C.L. Beneficial effects of humic acid on micronutrient availability to wheat / C.L. Mackowiak, P.R. Grossi, B.G. Bugbee // Soil Sci. Soc. Am. J. 2001 - V.65 - pp. 1744-1750.

222. Maggioni, A. Action of soil humic matter on plant roots: stimulation of ion uptake and effects on (Mg2+ + K+) ATPase activity / A. Maggioni, Z. Varanini, S. Nardi, R. Pinton, R. // Sci. Total Environ. 1987 - V.62 - pp. 355-363.

223. Maheswari, M. Transverse relaxation time of leaf water protons and membrane injury in wheat (Triticum aestivum L.) in response to high temperature / M. Maheswari, D.K. Joshi, R. Saha, S. Nagarajan, P.N. Gambhir // Ann. Botany -1999 V.84 - pp. 741-745.

224. Maillard, L.C. Synthese de matie'res humiques par action des acides amine sur les sucres reducteures / L.C. Maillard // Ann. Chim. Phys. 1916 - V.5 - pp. 258-317.

225. Malcom, R.E. Humic substances and phosphatase activities in plant tissues / R.E. Malcom, D. Vaughan // Soil Biol. Biochem. 1979 - V.l 1 - pp. 65-72.

226. Manning, P.G. Equilibrium studies of metal-ion complexes of interest to natural waters — VII. Mixed ligand complexes of Cu(II) involving fulvic acid as primary ligand / P.G. Manning, S. Ramamoorthy // J. Inorg. Nucl. Chem. 1973 -V.35 -№5 - p. 1577.

227. Mantoura, R.F.C. The use of gel filtration in the study of metal binding by humic acids and related compounds / R.F.C Mantoura, J.R. Riley // Anal. Chim. Acta 1975 - V.78 - pp. 193-200.

228. Maqueda, C. Adsorption of chlordimeform by humic substances from different soils / C. Maqueda, E. Morillo, J.L. Perez, A. Justo // Soil Sci. 1990 -V.150 -p. 431.

229. Martin, J.P. Influence of microorganisms on soil aggregation and erosion. II / J.P. Martin, S.A. Waksman // Soil Sci. 1941 - V.52 - pp.381-394.

230. Martin-Neto, L. On the interaction mechanisms of atrazine and hydroxyatrazine with humic substances / L. Martin-Neto, D. Gomes Traghetta, C.M.P. Vaz, S. Crestana, G. Sposito // J. Environ. Qual. 2001 - V.30 - pp. 520525.

231. Masciandaro, G. Assessing soil quality in different agro-ecosystems through biochemical and chemico-structural properties of humic substances / G. Masciandaro, B. Ceccanti // Soil Tillage Res. 1999 - V.51 - pp. 129-137.

232. Mathur, S.P. A chemical and spectroscopic characterization of some synthetic analogues of humic acids / S.P. Mathur, M. Schnitzer // Soil. Sci. Soc. Am. J. 1978 - V.42 - pp. 591-596.

233. Maurice, P.A. Fractionation of an aquatic fulvic acid upon adsorption to the bacterium, Bacillus subtilis / P.A. Maurice, M. Manecki, J.B. Fein, J. Schaefer // Geomicrobiol. J. 2004 - V.21 - pp. 69-78.

234. Mayer, A.M. Laccase: new functions for an old enzyme / A.M. Mayer, R.C. Staples // Phytochemistry 2002 - V.60 - pp. 551-565.

235. McCarthy, J.F. Reduction in bioavailability to bluegills of polycyclic aromatic hydrocarbons bound to dissolved humic material / J.F. McCarthy, B.D. Jimenez // Environ. Toxicol. Chem. 1985 - V.4-pp. 511-521.

236. Merdy, P. Modeling metal-particle interactions with an emphasis on natural organic matter / P. Merdy, S. Huclier, L.K. Koopal // Environ. Sci. Technol. -2006-pp. 7954-7466.

237. Milne, C.J. Generic NICA-Donnan model parameters for metal-ion binding by humic substances / C.J. Milne, D.G. Kinniburgh, E. Tipping // Environ. Sci. Technol.-2003-V.37-pp. 958-971.

238. Misra, V. Effect of humic acid on the bioavailability of y-hexachlorocyclohexane in Marsilea minuta (L.) / V. Misra, S.D. Pandey, P.N. Viswanathan // Environ. Monitor. Assessment 2000 - V.61 - pp. 229-235.

239. Mittler, R. Oxidative stress, antioxidant and stress tolerance / R. Mittler // Trends Plants Sci. 2002 - V.7 - №9 - pp. 405-410.

240. Mougin, C. Fungal laccases: from structure-activity studies to environmental applications / C. Mougin, C. Jolivalt,-P. Briozzo,-C. Madzak // Environ. Chem. Lett. 2003 - V. 1 - pp. 145-148.

241. Muscolo, A. Earthworm humic matter produces auxin-like effects on Daucus carota cell growth and nitrate metabolism / A. Muscolo, F. Bovalo, F. Gionfriddo, S. Nardi // Soil Biol. Biochem. 1999 - V.31 - pp. 1303-1311.

242. Muscolo, A. Effect of earthworm humic substances on esterase and peroxidase activity during growth of leaf explants of Nicotiana plumbaginifolia / A. Muscolo, M. Felici, G. Concheri, S. Nardi, S. // Biol. Fertil. Soils 1993 -V.15 - pp. 127-131.

243. Muscolo, A. IAA detection in humic acids / A. Muscolo, S. Cutrupi, S. Nardi // Soil Biol. Biochem. 1998 - V.30 - pp. 1199-1201.

244. Myasoedov, N.F. Introduction of tritium into organic compounds by isotope exchange reactions / N.F. Myasoedov // J. Labelled Compounds und Radiopharmaceuticuls 1993 - V.33 -№5 -pp. 391-401.

245. Nardi, S. A low molecular weight humic fraction on nitrate uptake and protein synthesis in maize seedlings / S. Nardi, C. Gessa, L. Ferrarese, L. Trainotti, G. Casadoro, D. Pizzeghello // Soil Biol. Biochem. 2000 - V.32 - pp. 415-419.

246. Nardi, S. Physiological effect of humic substances on higher plants / S. Nardi, D. Pizzeghello, A. Muscolo, A. Vianello // Soil Biol. Biochem. 2002 -V.34 - pp. 1527-1536.

247. Nardi, S. Release of hormone-like activities from Allobophora rosea and A. caliginosa faeces II S. Nardi, G. Arnoldi, G. Dell'Agnola, G. // Can. J. Soil Sci. -1988 V.68 - pp. 563-567.

248. Neilsen, G.H. Postbloom humic- and fulvic-based zinc sprays can improve apple zinc nutrition / G.H. Neilsen, E.J. Hogue, D. Neilsen, P. Bowen // Hort. Sci. 2005 - V.40 - №1 - pp. 205-208.

249. Nichols, B.W. Separation of the lipids of photosynthetic tissues: improvements in analysis by thin-layer chromatography / B.W. Nichols // Biochim. Biophys. Acta 1963 -V.70 - pp. 417-422.

250. Nikolic, M. Uptake of iron (59Fe) complexed to water-extractable humic substances by sunflower leaves / M. Nikolic, S. Cesco, V. Roemheld, Z. Varanini, R. Pinton // J. Plant Nutr. 2003 - V.26 - №10-11 - pp. 2243-2252.

251. O'Donnel, RW. The auxin-like activity of humic preparations from leonardite / R.W. O'Donnel // Soil Sci. 1973 - V.116 - pp. 106-112.

252. O'Donnell, P.J. Susceptible to intolerance a range of hormonal actions in a susceptible Arabidopsis pathogen response / P.J. O'Donnel, E.A. Schmelz, P. Moussatche, S.T. Lund, J.B. Jones, H.J. Klee // Plant J. - 2003 - V.33 -№2 -pp. 245-257.

253. Oris, J.T. Humic acids reduce the photo-induced toxicity of anthracene to fish and daphnia / J.T. Oris, A.T Hall, J.D. Tylka // Environ. Toxicol. Chem. -1990-V.9-pp. 575-583.

254. Paszewski, A. Influence of the humus fraction on the growth of oat coleoptiles / A. Paszewski, J. Trojanowski, W. Lobarzewska // Annales Universitatis Marie Curie Sklodowska- 1957 V.12 - pp. 1-13.

255. Perminova, I.V. Quantification and prediction of detoxifying properties of humic substances to polycyclic aromatic hydrocarbons related to chemical binding

256. I.V. Perminova, N.Yu. Grechishcheva, D.V. Kovalevskii, A.V. Kudryavtsev, V.S. Petrosyan, D.N. Matorin // Environ. Sci. Technol. 2001 - V.35 - pp. 38413848.

257. Pflug, W. Inhibition of malate dehydrogenase by humic acids / W. Pflug, W. Ziechmann // Soil Biol. Biochem. 1981 - V. 13 - pp. 293-299.

258. Phuong, H.K. Activity of humus acids from peat as studied by means of some growth regulator bioassays / H.K. Phuong, V. Tichy // Biologia Plantrum (Praha) 1976 - V.18 - №3 - pp 195-199.

259. Piccolo, A. Interaction of atrazine with humic substances of different origins and their hydrolysed products / A. Piccolo, G. Celano, C. De Simone // Sci. Total Environ. 1992 - V.l 17/118 - pp. 403-412.

260. Piccolo, A. Role of hydrophobic components of soil organic matter in soil aggregate stability / A. Piccolo, J.S.C. Mbagwu // Soil Sci. Soc. Am. J. 1999 -V.63 - pp. 1801-1810.

261. Piccolo, A. Structural characteristics of humus and biological activities / A. Piccolo, S. Nardi, G. Concheri // Soil Biol. Biochem. 1992 - V.24 - pp. 273380.

262. Pinto, A.P. Influence of organic matter on the uptake of cadmium, zinc, copper and iron by sorghum plants / A.P. Pinto, A.M. Mota, A. de Varennes, F.C. Pinto // Sci. Total Environ. 2004 - V.326 - №1-3 - 239-247.

263. Pinton, R. Modulation of NO3" uptake by water-extractable humic substances: involvement of root plasma membrane H+ ATPase / R. Pinton, S. Cesco, G. Iacolettig, S. Astolfi, Z. Varanini // Plant Soil 1999 - V.215 - №2 -pp.155-161.

264. Pinton, R. Soil humic substances affect transport properties of tonoplast vesicles isolated from oak roots / R. Pinton, Z. Varanini, G. Vizotto, A. Maggioni // Plant Soil 1992 - №142 - pp. 203-210.

265. Pintón, R. Water- and pyrophosphate-extractable humic substances fractions as a source of iron for Fe-deficient cucumber plants / R. Pintón, S. Cesco, M. De Nobili, S. Santi, Z. Varanini // Biol. Fértil. Soils 1998 - V.26 - pp. 23-27.

266. Piotrowicz, S.R. Cadmium, copper and zinc interactions with marine humus as a function of ligand structure / S.R. Piotrowicz, G.R. Harvey, D.A. Boran // Marine Chem. 1984 - V.14-p.333-346.

267. Poldoski, J.E. Cadmium bioaccumulation assays. Their relationship to various ionic equilibriums in lake superior water / J.E. Poldoski // Environ. Sci. Technol. 1979 - V. 13 - №6 - pp. 701-706.

268. Prat, S. Humic acids with C14 / S. Prat, F. Pospisil // Biol. Plant. (Praha) -1959-V.1-№1- pp. 71-80.

269. Prat, S. Permeability of plant tissues to humic acids / S. Prat // Biol. Plant. (Praha) 1963 - V.5 - N4 - pp. 279-283.

270. Premovic, P.I. Copper and copper(II) porphyrins of the Cretaceous-Tertiary boundary at Stevns Klint (Denmark) / P.I. Premovic, N.D. Nikolic, I.R. Tonsa, M.S. Pavlovic, M.P. Premovic, D.T. Dulanovic // Earth Planet. Sci. Lett. 2000 -V.177- 105-118.

271. Prior, R.L. Standardized methods for the determinations antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements / R.L. Prior, X. Wu, K. Schaich // J. Agrie. Food Chem. 2005 - V.53 - pp. 4290-4302.

272. Prosen, H. Evaluation of photolysis and hydrolysis of atrazine and its first degradation products in the presence of humic acids / H. Prosen, L. Zupancic-Kralj // Environ. Pollution V. 133 - pp. 517-529.

273. Ramalho, J.C. Changes in photosynthetic performance of Ceratonia siliqua in summer / J.C. Ramalho, J.A. Lauriano, M.A. Nunes // Photosynthetica 2000 -V.38 - pp. 393-396.

274. Re, R. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay / R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang, C. Rice-Evans // Free Rad. Biol. Med. 1999 - V.26 -№9-10 - pp. 1231-1237.

275. Ribas, G. Genotoxicity of humic acids in cultured human lymphocytes and its interaction with the herbicides alachlor and maleic hydrazide / G. Ribas, E. Carbonell, A. Creus, N. Xamena, R. Marcos // Environ. Mol. Mutagenesis -1997-V.29-pp. 272-276.

276. Rimmer, D.L. Free radicals, antioxidants, and soil organic matter recalcitrance / D.L. Rimmer // J. Soil Sci. 2006 - V.57 - №2 - pp. 91-94.

277. Rossler, D. Synthesis and chromatographic characterization of Tc-99m.technetium-humic acid species / D. Rossler, K. Franke, R. Suss, E. Becker, H. Kupsch // Radiochim. Acta 2000 - V.88 - p. 95-100.

278. Ruttimann-Johnson, C. Polymerization of pentachlorophenol and ferulic acid by fungal extracellular lignin-degrading enzymes / C. Ruttimann-Johnson, R.T. Lamar // Appl. Environ. Microbiol. 1996 - V.62 - №10 - pp. 3890-3893.

279. Saito, T. Electrostatic interaction models for ion binding to humic substances / T. Saito, Sh. Nagasaki, S. Tanaka, L.K. Koopal // Colloids Surf., A -2005 V.265 - pp. 104-113.

280. Salloum, M.J. Phenanthrene sorption by aliphatic-rich natural organic matter / M.J. Salloum, B. Chefetz, P. Hatcher // Environ. Sci. Technol. 2002 -V.36-pp. 1953-1958.

281. Samson, G. Surface-active effects of humic acids on potato cell membrane properties / G. Samson, S.A. Visser // Soil Biol. Biochem. 1989 - V.21 - pp. 343-347.

282. Sánchez-Sánchez, A. Humic substances and amino acids improve effectiveness of chelate FeEDDHA in lemon trees / A. Sánchez-Sánchez, J. Sánchez-Andreu, M. Juárez, J Jordá, D. Bermúdez // J. Plant Nutr. 2002 - V.25 -pp. 2433-2442.

283. Santi, S. Water-extractable humic substances enhance iron deficiency responses by Fe-deficient cucumber plants / S. Santi, R. Pinton, S. Cesco, F. Agnolon, Z. Varanini // Plant Soil 1999 - V.210 - pp. 145-157.

284. Sato, T. Desmutagenic effect of humic acid // T. Sato, Y. Ose, H. Nagase -Mutat. Res. 1986 -N162 - pp. 173-178.

285. Sato, T. Mechanism of desmutagenic effect of humic acid / T. Sato, Y. Ose,

286. H. Nagase, K. Hayase // Mutat. Res. 1987 - V. 176 - pp. 199-204.

287. Scharpenseel, H.W. Preparation and purification of gray and brown humic acid samples labeled with tritium and of tritium-pupurogallin / H.W. Scharpenseel // Zeitschrift fuer Pflanzenernaehrung, Duengung, Bodenkunde 1960 - V.91 -pp. 131-146.

288. Schnitzer, M. Humic substances: Chemistry and reactions / M. Schnitzer // In: Soil Organic Matter M. Schnitzer, S.U. Khan (Eds.) - New York, Elsevier, 1978-pp. 1-64.

289. Senesi, N. Adsorption mechanisms of s-triazine and bipyridylium herbicides on humic acids from hop field soils / N. Senesi, V.D. D'orazio, T.M. Miano // Geoderma 1995 - V.66 - pp. 273-283.

290. Servos, M.R. The effect of dissolved organic matter on the bioavailability of polychlorinated dibenzo-p-dioxins / M.R. Servos, D.C.G. Muir, G.R.B. Webster // Aquat. Toxicol. 1989 - V.14 - pp. 169-184.

291. Shcherbina, N.S. Reduction of actinides in higher oxidation states by hydroquinone-enriched humic derivatives /N.S. Shcherbina, St.N. Kalmykov,

292. V. Perminova, A.N. Kovalenko // J. Alloys and Compounds 2007 - V.444-445 -pp. 518-521.

293. Silva, E. Combined bioaugmentation and biostimulation to cleanup soil contaminated with high concentrations of atrazine / E. Silva, A. Fialho, I. Sa-Correia, R. Burns, L. Shaw // Environ. Sci. Technol. 2004 - V.38 - pp. 632-637.

294. Simpson, M.J. Noncovalent interactions between aromatic compounds and dissolved humic acid examined by nuclear magnetic resonance spectroscopy / M.J. Simpson, A.J. Simpson, P.G. Hatcher // Environ. Toxicol. Chem. 2004 -V.23-№2-pp. 355-362.

295. Singh, A.K. Influence of fulvic acid on transport of iron in soils and uptake by paddy seedlings / A.K. Singh, P. Dhar, S.B. Pandeya // Plant Soil 1998 -V. 198 - pp. 117-125.

296. Skyllberg, U. Complexation of mercury(II) in soil organic matter: EXAFS evidence for linear two-coordination with reduced sulfur groups / U. Skyllberg, P.R. Bloom, J. Qian, C.-M. Lin, W.F. Bleam // Environ. Sci. Technol. 2006 -V.40-pp. 4174-4180.

297. Sosa, L. Osmotic and specific ion effects on the germination of Prosopis strombulifera / L. Sosa, A. Llanes, H. Reinoso, M. Reginato, V. Luna // Ann. of Botany 2005 - V.96 - №2 - pp. 261-267.

298. Steffen, K.T. Degradation of humic acids by the litter-decomposing Basidiomycete Collybia dryophila / K.T. Steffen, A. Hatakka, M. Hofrichter // Appl. Environ. Microbiol. 2002 - V.68 - p. 3442.

299. Stevenson, F.J. Humus chemistry: Genesis, composition, reactions / F.J. Stevenson // New York, Wiley, 1994 512p.

300. Stevenson, F.J. Organic matter-micronutrient reactions in soil / F.J. Stevenson // In: Micronutrient in agriculture Soil Science J.J. Morevedt,

301. F.R. Cox, L.M. Shuman, and R.M. Welch (Eds.) Soc. of America, Madison, 1991 -pp. 145-186.

302. Stewart, A.J. Interactions between dissolved humic materials and organic toxicants / A.J. Stewart // In: Synthetic fossil fuel technologies K.E. Cowser, K.E. Boston (Eds.) -Butterworth Publ., 1984 - pp. 505-521.

303. Sullivan, J.D. A study of the interaction of s-triazine herbicides with humic acids from three different soils / J.D. Sullivan, G.T. Felbeck // Soil Sci. 1968 -V.106 -№1 - p. 42.

304. Sutton, R. Molecular structure in soil humic substances: The new view / R. Sutton, G. Sposito // Environ. Sci. Technol. 2005 - V.39 - pp. 9009-9015.

305. Swift, R.S. Macromolecular properties of soil humic substances: Fact, fiction, and opinion /R.S. Swift // Soil Sci. 1999 - V.164 - pp. 790-802.

306. Syltie, P.W. Effects of very small amaounts of highly active biological substances on plants growth / P.W. Syltie // Biol. Agricult. Horticult. 1985 - V.2 -pp. 245-269.

307. Tamiya, H. Mode of nuclear division in synchronous cultures of Chlorella: comparison of various methods of synchronization / H. Tamiya, K. Morimura, M. Yokota, R. Kunieda // Plant Cell Physiol. 1961 - V.2 - 383-403.

308. Tao, S. Uptake of copper by neon tetras (Paracheirodon innesi) in the presence and absence of particulate and humic matter / S. Tao, T. Liang, Ch. Liu, Sh. Xu // Ecotoxicol. 1999 - V.8 - pp. 269-275.

309. Tate, R.L. Organic matter and its interaction with inorganic soil constituents / R.L. Tate, B.K.G. Theng // In: Soil with a variable charge G.K.G. Theng (Ed.) - New Zealand Soc. Soil Sci. - Lower Hutt., 1980 - pp.225-249.

310. Taupin, C. Osmotic pressure induced pores in phospholipid vesicles / C. Taupin, M. Dvolaitzky, C. Sauterey // Biochem. 1975 V.14 - pp. 4771- 4775.

311. Tester, M. Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants / M. Tester, R. Davenport // Ann. Bot. (Lond.) 2003 - V.91 - pp. 503-527.

312. Tinnacher, R.M. A new method to radiolabel natural organic matter by chemical reduction with tritiated sodium borohydride / R.M. Tinnacher, B.D. Honeyman // Environ. Sci. Technol. 2007 - V.41 - pp. 6776-6882.

313. Tipping, E. Cation binding by humic substances / E. Tipping // Cambridge Environ. Chem. Series 12 Cambridge University Press, New York, 2002 - 320p.

314. Tipping, E. Humic ion-binding model VI: an improved description of the interactions of protons and metal ions with humic substances / E. Tipping // Aquat. Geochem. 1998 - V.4 - pp. 3^17.

315. Trapmann, S. Progress in herbicide determination with the thylakoid bioassay / S. Trapmann, N. Etxebarria, H. Schnabl, K.H. Grobeker // Environ. Sci. Pollut. Res. 1998 - V.5 -№1 - pp. 17-20.

316. Tsutsumi, Y. Removal of estrogenic activities of bisphenol A and nonylphenol by oxidative enzymes from lignin-degrading basidiomycetes / Y. Tsutsumi, T. Haneda, T. Nishida // Chemosphere 2001 - V.42 - pp. 271-276.

317. Tunçturk, M. Changes in micronutrients, dry weight and plant growth of soybean (Glycine max L. Merrill) cultivars under salt stress / M. Tunçturk, R. Tunçturk, F. Yasar // African J. Biotechnol. 2008 - V.7 - №11 - pp. 1650-1654.

318. Van der Weerd, L. Quantitative NMR spectroscopy of osmotic stress responses in maize and pearl millet / L. Van der Weerd, M.M.A.E. Claessens, T. Ruttink, F.J. Vergeldt, T.J. Schaafsma, H.V. As // J. Exp. Botany 2001 - V.52 -№365-pp. 2333-2343.

319. Vigneault, B. Permeability changes in model and phytoplankton membranes in the presence of aquatic humic substances / B. Vigneault, A. Percot, M. Lafleur, P.G.C. Campbell // Environ. Sci. Technol. 2000 - V.34 - pp. 39073913.

320. Visser, S.A. Physiological action of humic substances on microbial cells / S.A. Visser // Soil Biol. Biochem. 1985 - V. 17 - pp. 457-462.

321. Visser, S.A. Surface active phenomena by humic substances of aquatic origin / S.A. Visser // Rev. Fr. Sci. Eau. 1982 - V.l - pp. 285-296.

322. Vymazal, J. Short-term uptake of heavy metals by periphyton algae / J. Vymazal // Hydrobiologie 1984 - V.l 19 - pp. 171-179.

323. Wang, D. Preparation of tritium-labeled fulvic acid (3H-FA) / D. Wang, S. Guan, X. Xu, D. Yang, H. Zhu, X. Pang, M. Yi // Zhiwu Shenglixue Tongxun -1984 -V.6- pp. 42-44.

324. Wang, W.H. The fate of 14C-labelled humic substances in rice cells in cultures / W.H. Wang, C.M. Bray, M.N. Jones // J. Plant Physiol. 1999 - V.l54 -pp. 203-211.

325. Wang, X.S. Effects of NaCl and silicon on ion distribution in the roots, shoots and leaves of two alfalfa cultivars with different salt tolerance / X.S. Wang, J.G. Han // Soil Sci. Plant Nutr. 2007 - V.53 - №3 - pp. 278-285.

326. Wang, Z.-D. Relationships between structure and binding affinity of humic substances for poly cyclic aromatic hydrocarbons: relevance of molecular descriptors / Z.-D. Wang, D.S. Gamble, C.H. Langford // Anal. Chim. Acta 1990 - V.232 - pp. 181-188.

327. Warwick, P. 14C and 125I labelling of humic materiel for use in environmental studies / P. Warwick, L. Carlsen, A. Randall, R. Zhao, P. Lassen // Chem. Ecol. 1993 - V.8 - №2 - p. 65-80.

328. Warwick, P. The mobility and stability of iodine-humic and iodine-fulvic complexes through sand / P. Warwick, R. Zhao, J.J.W. Higgo, B. Smith, G.M. Williams // Sci. Total Environ. 1993 - V.130/131 -pp. 459-465.

329. Wilson, M.A. NMR techniques and applications in geochemistry and soil chemistry / M.A. Wilson // New York, Pergamon, 1987.

330. Xia, G. Detailed sorption isotherms of polar and apolar compounds in a high-organic soil / G. Xia, J.J. Pignatello // Environ. Sci. Technol. 2001 - V.35 -pp.84-94.

331. Xu, X. The effect of foliar application of fulvic acid on water use, nutrient uptake and yield in wheat / X. Xu // Aust. J. Agric. Res. 1986 - V.37 - pp. 343350.

332. Yamada, P. Plant physiological activities by humic acid and fulvic acid extracted from peat and weathered coal / P. Yamada, K. Asou, Y. Yazawa, T. Yamaguchi // Nippon Dojo Hiryogaku Zasshi 2002 - V.73 - №6 - pp. 777-781.

333. Young, C.C. Polyamines in humic acid and their effect on radical growth of lettuce seedlings / C.C. Young, Y. Chen // Plant Soil 1997 - V.195 - pp. 143149.

334. Young, N.D. Putrescine and acid stress / N.D. Young, A.W. Galston // Plant Physiol. 1983 - V.71 - pp. 767-771.

335. Yu, S. Adsorption-desorption behavior of copper at contaminated levels in red soils from China / S. Yu, Z.L. He, C.Y. Huang, G.C. Chen, D.V. Calvert // J. Environ. Qual. 2002 - V.31 - pp. 1129-1136.

336. Zachariakis, M. Humic substances stimulate plant growth and nutrient accumulation in grapevine rootstocks / M. Zachariakis, E. Tzorakakis, I. Kritsotakis, C. Siminis, V. Manios // Acta Horticulturae 2001 - V.549 -pp. 131-136.

337. Zeng, K. Effect of dissolved humic substances on the photochemical degradation rate of 1-aminopyrene and atrazine / K. Zeng, H.-M. Hwang, H. Yu // Int. J. Mol. Sci. 2002 - V.3 - pp. 1048-1057.

338. Zhang, X. Cytokinin-containing seaweed and humic acid extracts associated with creeping bentgrass leaf cytokinins and drought resistance / X. Zhang, E.H. Ervin // Crop Sci. 2004 - V.44 - pp. 1737-1745.

339. Zhang, X. Plant growth regulators can enhance the recovery of Kentucky bluegrass sod from heat injury / X. Zhang, E.H. Ervin, R.E. Schmidt // Crop Sci. -2003 V.43 - pp. 952-956.

340. Zhang, X. Turfgrass plant growth regulators / X. Zhang // In: Advance in Turfgrass and Ground-Covering Plant Science Z.Z. Chen, H. Zhou (Eds.) -China Forestry Publisher, Beijing, China, 2006 - pp. 74-97.

341. Zhorina, L.V. The content of free amino acids in the tissues of broiler chicks administered sodium humate in the ration / L.V. Zhorina, L.M. Stepchenko // Nauchnye Dokl. Vyss. Shkoly Biol. Nauki 1991 - №10 - pp. 147-150.

342. Zhou, J.L., Mechanism of humic acid colour removal from natural waters by fungal biomass biosorption / J.L. Zhou, C.J. Banks // Chemosphere 1993 -V.27 - pp. 607-620.

343. Zhu, J.-K. Regulation of ion homeostasis under salt stress / J.-K. Zhu // Curr. Opinion Plant Biol. 2003 - V.6 - pp. 441-445.

344. Ziechmann, W. Über Modellreaktionen zur Bildung synthetischer Huminsäuren. 2. Die Synthese von Huminsäuren im neutralen Milieu / W. Ziechmann // Brennstoff-Chem. 1960 - V.41 - pp.334.

Информация о работе

Куликова, Наталья Александровна
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.16

Диссертация

Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы