Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности формирования, особенности экспрессии и передачи андрогенной программы уровня особого эстрогеносвязывающего белка печени крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности формирования, особенности экспрессии и передачи андрогенной программы уровня особого эстрогеносвязывающего белка печени крыс"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. Е ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

УДК 677.17. 02:612.43

КОВГУН Ирина Викторовна

аМОНОМЕРНООТИ сормирозания, особенности ■ экспрессии и передачи андрогешоя программы УРОВНЯ особого эстрогенсвязыеащего БЕЛКА печени крь».

( 03.00.13. - физиологи! человека и животных )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискениз ученой степени кандидата биологических каук

Москва 1992

\

Работа выполнена в лаборатории эндокринологии кафедры физиологии человека и животных ( зав. каф. -академик АШ России, профессор И. Е Апмарин ) биологического факультета ИГУ им. Ii. Я Ломоносова.

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор | R Е P03EHL доктор биологических наук О. а Смирнова

Официальные оппоненты - доктор биологических наук Г. Е. ОНЩЕНКО; кандидат биологических наук Е А. БОРИСОВА

Ведущее учреждение-Московская Медицинская академия им. K.M. СЕЧЕНОВА

Навита состоится "_£8_"_декабрг_1992 г. в_1Б^ис.

на заседании специализированного, совета Д. 053.05.35 в Московской государственном университете им. М. К Ломоносова по адресу : 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ."

Автореферат разослан " с&Г» яслё/ьь 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е А. УМАРОБА

052АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАВЛЫ Актуальность ггооОлемы- Внимание эндокринологоз на современном этап? привлекает пройлет исследования гормональных . механизмов, ложагях в основе Формирования стабильного полового л:аярф:гз;.!а особей. Становление дифференцированного по- ' лоеого ¿¡»катила обеспечивается генетическим! :г гормональными 1ле7.ая-/х!,'Л1й1. Д:'.4^эреп^:'.руйз*.е эффекты гср«спсв, в там числе и анлрогеноз, подрзздедяготс-д на програмглируидие ( детеркинкру»-гае ) и регудяторные. Программа всобпе и гормоналъяая, в частности. характеризуется необратимостью, устойчивостью, раз всзкиетуз, она продолг-Ейт суцесгвозатъ посла отмены действия детермикирузгаго йактора. Еле одной принципиально вагкой характеристикой горизнальной и лрут:с: прогрело.: дкфсерешпхрззки '" згляется способность перелезаться потомству ¡слеток при лрод::-. Фе ранга. •

Известно, что аядрогенпоя детерминации затрагивгет не только репродуктивнуя сфер/ и !,:оэг, но а, как показали исследования последних лет, некдтсрыэ копратзленга сйгакмогвческоа Деятельности печени ( Розен, 1320;. Розен.. Смирнова, 1230; Гозен и яр., 1091 ).

Ряд печеночных признаков подвергается пряакзму кемрат;:-мому действию андрсгэнов, при этом маскух-шгазгся ссупЕСтвлз-ется только на (Ьункциональном уровне., что отличает печень от. • других органов. детержпируешх [.¡угиия полоныша горетнамп. Показана детерлегаирувдая ро.и> андрогенов на.активность некоторых ферментов стероидного метаболизма, продукция ^ 2и глобулина , синтез особого эстрогенсзтаывахиего белка,.

Установлено, что андрогеяиое программирование некоторая функ-' ций печени осуществляется пропубертатно, а половые различия в экспрессии этих признаков появляются у животных, как правило, после периода полового согревания ( Розен и др. ,1991 ). Таким образом, возникая вопрос о необходимости исследования причин вздержки экспрессии андрогенной программы. Представления о стабильности акдрогеяного программирования в печени до настоя щэго времени базировались только на данных об устойчивой экспрессии печеночной функции после удаления гонад и/ или гипо-; физа. Вопрос, является ли авдрогепная детерминация функций печени истинной, оставался открыты).«, поскольку отсутствовали сведения о возможности передачи информации новым поколениям клеток. Важность этой проблемы репродуктивной физиологии . очевидна, ее решение могло приблизить нас к понимании сути гормональной детерминации и дифференциронки вообшр и позволить создать адекватную модель для изучения ее молекулярных и клеточньс: механизмов .

Доказательства в пользу истинности гормональной детерминации функций печени могли быть получены при исслэдовакли возможности передачи андрогенной программы при пролиферации • -дифференцированных клеток после частичной гепвтзктомии.

Цель и задачи исследоьания. В связи с вышеизложенным целью нашей работы явилось, исследование времени возникновения, условий реализации и возможности передачи андрогенной программы в печени. В качестве программируемой андрогенами функции мы выбрали экспрессию особого эстрогенсвязьващего белгса ( ОЭСБ ] ййор бил обусловлен несколькими причинами: во-пераьж., ате-

-з- •

рессия этого белка, а татю его тканевое, распределение, у краг ■ с различным гормональны«. статусам были хорош каучены ; во-вторых, имелись убедительные факты в пользу того, что анд-рогениая детермстциа ОЭСБ. оедаствзяетса непосредстзеинсг в • гелатоцитах и обеспечивает деслтикрзтяупразнпзг в его содержании ыедду ззрослиют. гонэдэктомировавшасг девотшлй разного. • пола. Укаганныэ особенности дедапт СЭСВ удеДда* маркером для: исследования механизмов импринтинга а печени. Ддя дсстиявная цеха реиали. следуш^е,-задача*:

1. Установить временные рашш, в пределах:кагорах лроисхог • даа детерминация ОЗСБ андрогенами в естественных, условиях; а такзге начала экспрессии андрогенной- программы, уровня СЗСЕ а онтогенезе.

2. Изучить особенности передачи естественной генетической.и . андрогенной программ уровня ОЭСВ повоыу поколения дкфферзици- . рованчыг клеток в условиях отсутствия половых стероидов. .

3. Есследовать.роль факторов гкпофжза в передача андрогенной и' базисной генетической программ уровня СЭСН.

4. Исследовать возможность и особенности передачи экспериментально созданной андрогенной програмш экспрессии ОЭСЕ поколению гепатоцитов самок.

Научная новизна. Проведенные исследования впервые доказали возможность передачи, гормональной программы потомству клетск печени -а отсутствие горшнат индуктора. Ш.-агано, что экспериментально созданная аидрогенная программа наравне с естественной андрогенной и базисной генгтачгскеД полностью передается при пролиферации кхетск, однако ее зкспрессил максимально

проявляется только в'ыолодых геяатсцктах. Об11арухено, ото присутствие факторов гипофиза, необходимое для первичной андро-гекхоЛ детерминации, необязательно при передаче сформировап-иой программы. Кроме того, установлены сроки андрогенного программирования уровня ОЭСБ и начала его экспрессии в онтогенезе. Показано, что окончание латентного периода, сущзат-

■ вуквдэго иехду Бременем юзникновения и началом реализации андрогенной программ уровсш ОЭСБ в печени самцов, ке связано Ни с необходимостью формирования тканевой структуры, ш: с пре-

■ пубертатным подЬемо.\; секреции андроге.чов.

На основе полученных дгшкых заключили, что гормональное программирование функций печени удозлетисряет всем общепринятым критериям детермининация

Практическая ценность таботц. Полученные данные расширяют . супесгвупше представления о закономерностях гормональной гетерыияэдга. Выявленные в работе особенности андрогенноЯ де-. терьешашш д печек: необходима учитывать в фармакологии практической медицине в плане цозмозкностп несбратишх последствий действия ряда лекарственных препаратов апдростанового • ряда.

Дррсбашя работы. Результаты работы доложены на заседании кафедры физиологии человека и ливотных биологического факультета МГУ, на Всесоюзной конфзренции " Махщргамы действия ые-диагоров и гормонов на эффекторные клетки " ( Суздаль, 1989 ), на Воесоозном симпозиумеБиохимия рецепторнах систем " ( Таллинн, 1990 ).

Структура и обЪ^м работч,!. Диссертация состоит из введения,

обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использумой литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 152 источника, из которых 43 отечественных и 109 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. .

ИкЕотные. В работе были использованы самцы и самки белых крыс смешанной популяции и крысы.линии Vistan иеонатальныэ ( 1-2 день лизни ), лрепубертатные ( 12-15 ; 37; 45-БО дни жизни ), пубертатныэ ( БС, 75 день жизни ) и постпубертатные ( 120-140 день ) с иитактными семенниками,. а тага» взрослые животные, гонадэктомированные неонатально, лрепубертатно и постпубертатно ( удаление половых жэлез у последних проводили га 21 день до эксперимента ); гонад/гшюфиззктомированюю. с интакгкой печенью и через 14 дней после частичной гепатзк- . томик ( ЧГЭ ); гонад/гепатзктомированные через 2, 4 и 14 дней после ЧГЭ. В серии ошяов гонадэкхокированньы самкам в течение трех дней вводили внутримышечно тестостерон-пропионат. (ТП), растворенный в пропиленгликолэ, в дозе 2 мт/ 100 г массы тела, ЧГЭ у таких яиротных производили через день после окончания инЪекций и брали в эксперимент на 2-й, 4-й и 14-й день регенерации. Содержание О0СЗ в цктозоло печени определяли индивидуально у кадгзго животного.

Определение концентрации 0303. Содержание ОЭСБ в гепатоцк-тах определяли по концентрация его гормонсвязыватдах мест ( Ns) методом " минимальной" добавки ( Смирнова и др.,1983 }

• - б-

эстрадиола или зстриода ( для препуРертатных животных ), ме-* ченных тритием. Цробы цитоволя инкубировали только с меченым гормоном ( общее связывание ) иди в присутствии иабьпка немеченого ( неспецифкческое связывание ) в течение 15 минут при 0-4°С. Для подавления связывания гормонов с рецепторами эстрогенов в пробы добавляли гексастрод, не взаимодействующий с ОЭСБ. Для разделения свободной и связанной с белком фракций гормона пробы инкубировали с 4 Z декстранпокрытым углем, угол! отделяли центрифугированием. Для каждой партии меченых гормонов измеряли константу ассоциации методом Scatchar-d . Пс-лучен-- ную величину использовали для расчета гормонсвявыващих мест ОЗСС.

Идентификация ОЗСБ-экспрессирующих гепатоцитов в образцах печени. Локализацию OQCB-позитивных клеток определяли непрямым имыунопероксидазныы методом ( Щелкунова и др., 1991 ) с. использованием специфических кроличьих антител к ОЭСБ, полученных в лаборатории эндокринологии ( Смирнов и др., 1985 ).

Срезы ткани, заключенной в парапласт, обрабатывали пос-' ледовательно сначала специфическими антителами С первичными ) . а затем антителами к иммуноглобулинам кролика, меченными перо' кекдазей ( вторичными ). В качестве хромогена для выявления пэроксидазы испольаовали раствор диаминобепаидинтетрагидрохло-рида*( ДАБ ). Интенсификацию ДАБ- продукта проводили раствороз OsO//. Для контроля специфической окраски часть срезов в каждом эксперименте инкубировали только со "вторичными антителами, для оценки качества ткани срезы докрашивали гематоксилином и эозином. Окраску оценивали визуально с помощь» светового ми-

кроскопа.

Концентрацию общего белка в цитозоле и гомогенате печени измеряли методом Lovrry и др. ( 1951 ), а содержание ДНК- методом Burton ( 1856 ).

Результаты экспериментов обрабатывались статистически. Достоверность различий величии оценивали'по критерию Стьвдек-та.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ИХ ОВСУЗДЕКИ2.

1. Сормирозаяие и экспрессия андроганной и базисной генетической программ уровня ОЭСВ в ходе онтогенеза.. 1.1. Реальное время детерминации уровня ОЭСВ. Установлено, что детерминации андрогенами высокого уровня ОЭСВ происходит мелду 1-3 и 12 днями жизни ( Табл. 1 J. Удаление семенников после 12 дня жизни никак не сказывается на проявлении программы уровня ОЭСВ у половозрелых самцов.

Таблица 1. Ерега формирования андрогенной программы экспрессии COCK. '

Время удаления семен- Время определения Us ОЭСВ

■ ников ( дни жизни ) ОЭСВ ( дай лизни ) пмоль/ мг ДНК

140 < 0.05 (5)

140 • 89.7 ± 5,65 (5) . 140 73,0 + 16,1 (17)

Р2-3 < 0,01

В естественных условиях погрзммирование ОЗСЕ андрогенами

1. 1 2. 12 3. 120

- в -

происходит только з указанные сроки и не имеет дополнительного чувствительного периода. Так введение самцам, гонадэктоми-рованным на 12 день жизни тестостерон-пролионата ( ТП ) перед периодом пубертации ( на 37 день } не увеличивало содержания ОЗСБ ухе запрограммированного ранее ( Рис. 1. ).

пмоль

мг днк

■оМ.. 4020-

Рис. 1. Содержанке ОЭСВ у гонадзктомировашшх на 12 день жизни самцов баз введения (1), с введением ТП на 37 день (2) и взрослых кастрированных живо?ных(3).

1-. 2. Экспрессия программы уровня ОЭСБ в гепатоцитах в ходе онтогенеза. Радиолигаядкым методом обнаружили, что экспрессия ОЗСЕ у самцов практически отсутствовала до 45-50 дня жизни ( Рис. 2.). Зтот срок является пограничным, т. к. нами б и- * ли обнаружены тщивидуалмшэ различия между животными. У одних в это время ОЭСБ экспрессировалоя, у других^ еще нет. На последую®« сроках онтогенеза наблюдалось увеличение содержания ОЭСБ. На 75 день оно не отличалось от такового в печэ-ии половозрелых кастрированных самцов и соответствовало полностью сформированной программе. Различия в содержании между яизотныш разного возраста могут объясняться тем, что программа начинает экспресеироватьск не в максимально возможном объеме. Таким образом, выявлено наличие латентного периода

5

3

- о -

( 12 - 60 день маня ). Яаоэсв

линь

¡йгдга? _

Рис. 2. Динамика экспрессии ОЭСБ в ходе онтогенеза самцов. Нз- концентрация связывающих мест белка. Заштрихованная область - уровень ОЭСБ у взрослых кастрированных самцов.

№ I»

2 в-

шш

20 40 М "Зв ДНИ

жизни

Анализ результатов иммуногистохимического исследования показал, что причина задержки экспрессии не связана с необходимостью формирования печеночных долек. Так на 16, а также на 37 день жизни, когда дольчатая структура была полностью сформирована, специфическое окрашивание у самцов отсутство-гало. • Принимая во взимание известный факт о прямой зависимости начала функционирования циклического центра гипоталамуса от- пубертатного Выброса эстрогенов, предположили, что . аналогичная закономерность может иметь м^сто и в печени. Однако оказалось, что препубертатньй подЪем секреции андроге-нов не являлся фактором, определяпяим время " вклвчэния " программы, так как у самцов, кастрированных до начала подъема ( на 30 день хягнк ), содорааниэ С6СЗ и характер его распределения в печеночной дольке нэ отличались от имеаяихся у интактньк самцов того жа возраста Табл. 2 ).

■ - 10 -

Таблица 2. Содержание ОЭСБ в интактной печени двух групп • самцов одного возраста ( Ц±т ).

'* • Группа Время определения _ . Не ОЭСБ

самцов ОЭСБ (дни.жизни) пмодь/мг ДНК

1. Ингектные - • 45-50 27,0 ¿3,83 ( 3 )

2. Кастрированные

на 30 Д. Ж. 50 25,7 ±6,85 ( 3 )

Р1-2 > 0,1 •

Мы предположили, что существующий латентный период'необходим клеткам для достижения функциональной зрелости, его длительность межзт регулироваться гормонами общомзтаболического действия, оказывавдими влияние на процессы роста и раавития ( например, СТГ ), поскольку указанный период совпадает со временем интенсификации этих процессов.

У самок до 37 дня жизни количество ОЭСБ было меньше разрешающей способности метода, а на 45-50, 60 к 75 дни выявляемое содержание было аналогично, содержанию взрослых оваризктомиро-•Еанных самок С Рис, 3 ). Специфическая окраска была равномерно распределена внутри печеночной дольки, а ее интенсивность соответствовала уровню, характерному для пери.горталыюй зоны самцов. Более высокое содержание ОЭСБ у неполовозрелых и пубертатных самок по сравнению со взрослыми может обгоняться тем, что система ингибирования ОЭСБ эстрогенами а период пуберть-ции и. сразу после нее еще но -действует.

- и -

КдОЭСБ ПМОПЬ

мГЗнх 20-

V/////

Т22

Рис. 3. Динамика экспрессии ОЭСБ в ходе онтогенеза самок. Мб- концентрация связка авдих мест белка Заштрихованная область- уровень ОЭСБ у взрослых ова-

дни риэктсмирезанных самок, жизни

~г5 ¡о" и г'

2. Исследование возможности передачи естественной базисной и андрогенной программы уровня ОЭСБ поколению дифференцированных . клеток.

2.1. Передача естественной андрогенной программ Для проверки возможности наследования гормональной программа поколения- • ми клеток использовали модель пролиферации гелатоцитов после ЧГЭ. С учетом особенностей пролиферации выбрали ключевые сроки регенерации: 2,4, и 14 дней. Параллельно содержания ОЭСБ у каотркрованных самцов измеряли несколько биосиктэтических параметров: общее содержание белка а печени, содержание ДНК, а тайяз массу органа Данные, представленные з таблице-3 сви- ' дете'льстзуют о том, что к 14 дню регенерации иаблэдается полное восстановление биссинтетических показателей и содержания ОЭСБ до уровня в кнтактксй яечэни.

Анализ динамики изменений в уровне СЗСБ и выбранных показателей в указанные сро;-м регенерации лог-ззал, что падения синтеза ОЗСБ после гепатэктокии кэ происходят, наоборот, • на 4-й день регенерации наблюдаете:: значительное узгличе-ние содержания ОЭСБ, параллельное росту содержания ДНК. Шжду изменениями этих двух параметров суцрсхвует положи- •

•' тельная коррелятивная аёвнсимость ( коэффициент' корреляции равен + 0,882 К Рис. 4).

Таблица 3. Биосинтетическиэ показатели к содеряашю ОЭСЕ в иктактной и регенерировавшей печени кастрированных самцов. .

Исследуемый Масса печени ДНК Белок оэсв

материал г иг/г ткани иг/г ткани гшоль/мт ДНК

1. Интактаая 6,05+0,31 3,12+0,35 219,2+39,7 73.0+16.1

печень ( 19 ) ( 19 ) ( 19 ) ( 17 )

2. Регенериро- • 5,291. 0,56 3,24+0,49 237,0+28,4 76,5+24,2

вавшгя ткань ( 11 ) ( 11 ) ( 11. ) ( и )

Р1-2 >0.1 > 0,1 > 0.1 » 0,1

Результаты количественного измерения хорош совпадали с данными иммуноиероксидазного анализа. Характер распределэниа ОЭСЕ в дольке и интенсивность градиента в регенёрирупщей тка-. ни на 2 и 4 день после ЧГЭ, ч также после окончания процесса восстановления, на 14, не отличались от тачоьых в контрольных •лойастях интактной печени.

Таким образом, в отсутствие эндогенных алдрсгекоз передача ■ . андрогенной программы при пролифзрации.дифференцированных ге-патоцитов происходит параллельно репликации ДНК. и в отличие от раннего онтогенеза самцов, .сопровождается немедленно.* гкс-лрессией поограммы, не требуя латентного периода.

1.

3.

Рил. 4. Изменения содержания ОЭСБ и некоторых Ояофив-тетических показателей а ходе регенерации печени кастрированных самцов (Шда). Содержание в регенерирующей ткани: 1. -ОЭСБ (нмоль); 2. -ДНК (в мг);а -белка (в г,1.4.-масса печени (в г)."0"-уроЕень исследуемых показателей в контрольных лодас-тях печени,заштри-

_ хоааккая область-

"И в интактиой ткани Ч Htm-):.

2.2. Особенности передачи базисной генетической программы . . Как известно, содержание ОЭСП у взрослых гонадэкгэвмровйнных. самок ниже уровня, выявляемого у самцов на порядок ( Smirno-va et al. J9S3 ), n специфически;!. окриска внутри печапочноЛ лоль.-ji соответствует уровк», •asp.-.y.rep^ci.o' для пернпортолы!:« гепатсц^тов csraa ( £г::;:у;юва и др., 133i ). Результат и ради-

4.

-го

дм КГОКМШМ/

олигандаого исследования показали, что у взрослых овариэкто-ыированных самок на всех выбранных стадиях регенерации выявляется низкий уровень ОСОБ с небольшим увеличением на 4-е сутки ( Табх4 }. К концу восстановительного процесса на 14 день содержанке ОЭСБ в регенерировавшей печени приближалось к исходному а интактной. Интенсивность специфического окрашивания также была низка на всех сроках регенерации , аналогично интактной печени.

Таблица 4. Экспрессия базисной генетической программы уровня ОЭСБ в пролиферируюиих гепатсцитах овариэктомированных самок ( Шт). , •

Время после начала ОЭСБ *

■регенерации, сутки пмоль/мг ДНК Р

0 7,85 ±2,05 ( 46 ) •

2 7,60 ± 1,57 С 18 ) > 0,1

4 15,54 + 2,83 С 27 ) < 0,05

14 ' 8,34 ± 3,72 ( 23 ) > 0,1

* Представлен уровень значимости различий по отношение к содержания ОЭСБ в интактной контрольной печени ( графа "О").

I

Представленные результаты свидетельствуют о том, что без предшествующего андрогенного программирования в яоеых клетках экспрессируется генетическая программа низкого уровня синтеза ОЭСБ. Таким образом, дифференцироваиность геаатоци-тов, возникшая в результате воздействия андрогенов в раннем

постнатальном периоде, сохраняется и после полного обновления клеточной популяции.

3.Исследование возмотаого участия факторов гипофиза в передаче андрогенной программы. - ' Многочисленные литературные /"\нные указывали на то, что половые стероиды действуют на функции печени опосредованно, первично определяя характер секреции СТГ ( Б^аТяБоп еЪ а1, 1983 ). Такой тип действия.по-видимому, достаточно распространен в организме. С другой стороны, накоплены факты, свидетель-ствущие о способности андрогеноЕ оказывать прямые эффекты ка печень, СТГ при этом играет роль потенцирующего фактора последних. поймано, в частности, для детерминации ОЭСВ ( Вишнякова, Смирнова, 1989; БтЛ-поч'а et а1, 1990 ). Представлялось вероятным участие фалгоров гипофиза в передаче сформированной андрогенной прграммы новым клеткам. Одна!со, результаты показали, что в группа гонзд/гкпофмзэктоыированних самцов 1сак до, так и после регенерации печени, программа ОЭСБ э.чспресси-руется на уровне взрослых кастрированных сш.аюв.

Рис. 5. Содержание ОЭСБ у гонадзктокировацньк (1), гснад/гипофиазгаомкрован-ных (2) и гокад/гилофизэк-тоыировшшых через 14 дней

после ЧХЭ (3) сакцоя.

пмад!

мгдПк «о-

гЬ

17

гЬ

17

ш

.Характер распределения ОЭСй-позитивных илето:: в печеночной дольке рэгелер::роввзж)Л •легки ив оглэталея от в

интзктной печени.

Удаление гипофиза не окавкваю пляша на акспресскп генетической программы низкого уровня ОЭСБ в новых капках { Табл. 5).

Тпбдити 6. Содержание ОЭСБ в ютакгасА я регенерировавшей печени ряда груш самок ( Щ»).

Группа № ОЭСБ, шыь 1 мг ДНК

Интактная печень На 14 день регенерации

Гонадэктоми- 7,85 + 2,06 (46) 8,34 5,72 (23) рсванные

Гоиая/гипофи- *

Эоктомированные 10,07 ±4,69 (6) 7.Б5 ± 3,38 (7)

а Р > 0,1, представлен уровень значимости различий по отношению к уровню ОЭСБ в интаетной печани соответствующих груш животных.

Специфическая окраска в печени представленных в тоблкце 5 групп самок бкяа на уровне перипортадьной области кастрированных самцов.

Приведенные факты свидетельствуют о том, что присутствие горюнов семейства СТГ, необходимое для первичной индукции • андрогенной программы, необязательно для ее передачи потомству клеток, это может служите еще одним доказательством того, что программирование ОЭСБ происходит на уровне гепатоцитов, а

- 17 -

не на уровне гнпоталамо-гипофиаарной системы.

4. Особенности экспрессии я передачи экспериментально созданной программы уровня ОЭСБ в гепатоцитах самок крыс. Существуют данные о потенциальной возможности индукции ¿экспрессии ОЭСБ экспериментально при введении андрогенов самкам крыс на любой стадии онтогенеза ( Смирнова и др., 1933). При этом созданная программа сохранялась длительное время. Шми было обнаружено, что через 7 месяцев после введения ТП половозрелым овариэктомированным самкам, ОЭСБ у них экспрессиру-ется на уровне , достоверно отличашеикя от контрольных ова-риэктсмированных самок ( 20,1+4,8 и 7,б5±2,05 пмоль/ мг ДНК соответственно, Р< 0,01). Однако уровень экспрессии ОЭСБ у анлрогснизированных самок не достигал имевшегося у самцов, а характер тканевого распределения отличался от картины, наблюдаемой у животных с естественной андрогенной программой. Проведенное исследование показало, что индуцированная а эксперимента андрогенная программа экспрессируется в новых клепка печени на том же уровне, чтс и до гепатэкто:д*.и ( Рис. 6 ).'

В полностью обновленной популяции клеток изучаемый бедок локализовался в первых двух слоях перицентральных гепатоци-тоз, как и в контрольной интактной печени. Полученные результаты свидетельствуют о том, что индуцированная в эксперименте программа, также, как и естественная, целиком передается при пролиферации клеток, что мокзт служить ешз однш/. подтверждением ¡?е стабильности.

Нвоэсс пмал» Мг ДНк

Рис. б. ДИнамика экспрессии исходной генетической (1) и экспериментально созданной андрогенной (2) программ

■ »••

уровня СОСБ в ходе регенерации печет взрослых овариэк-томированных самок. 3.-экспрессия генетической программы в интактной печени самок. 4. -экспрессия естественной андрогенной программы в ин-

• 2 * "дал тактной печени самцов.

гегенЕРлции

Однако, несмотря на то, что содержание ОЭСБ у самок, получавших андрогекы как до, так и после регенерации было досто-

все же значительно отличалось от уровня кастрированных самцов. Выявленные особенности экспрессии андрогенной программы у самок могли быть связаны либо с неполным закреплением программы, либо с ее недостаточной экспрессией при фиксации в полном обЪеме. Анализ динамики экспрессии ОЭСБ'через 2 и 4 суток показал, что причина ааклячается скорее в неполной экспрессии. Оказалось, что на 4-е сутки регенерации наблюдается значительное С в 3,7 раза ) и достоверное ( Р< 0,05 ) увеличение экспрессии экспериментально созданной программы ( Рис, Б.). Наблюдаемый всплеск гораздо выие, чем у овариэктомиро-ванных самок, не обработанных" тестостероном, поэтому не может объясняться усилением экспрессии генетической программы

верно выое ( р < 0,05 ), чем у не обработанных гормоном, оно

при пролифэрации клеток. ■

Уровень ОЭСБ. выявляемый у андрсгениаированных самок на 4-й лень регенерации был сходен с таковым у кастрированных самцов. Воспроизводился также и характер распределения зкс-прессирувдих ОЭСБ гепатоцитов внутри печеночной дольки, аналогичный картине, наблюдаемой у кастрированных самцов. Ка 4-е сутки, как показали результаты иммуногистохимического исследования, происходит значительное увеличение доли ОЭСБ-позитивных гепатоцитов, по сравнению с количеством, выявляемым в начальный период регенерации ( на 2 день ) и после ее завершения. Эти данные делают более реальным представление о недостаточной экспрессии программы в гепатоцитах андрогенизи-ровалных самок. Тот (tara, что у кастрированных самцов не нг?-блкдалось достоверного подъема уровня ОЭСБ на начальных этапах регенерации печени , и его содержание оставалось стабильным в расчете на единицу ДНК, предполагает, что у половозрелых самцов программа и так экспрессируется в максимально возможном обЪеме!

Особенности экспрессии й передачи экспериментально созданной андрогенной программы, выявленные у взрослых овариэкто-».вфованных самок были характерны и для неполовозрелых. Так. в печени самок, гонадэкгошрованяых на 30 день жгани, андро-гениаированных и гепатэкгомированных на 50, наблюдали значительное усиление специфической окраски и увеличение доли экспрессирующих ОЭСБ гепатоцитов на 4-е сутки регенерации но сравнении с интактиой тканью контрольных яивотных. Вероятной причиной, обЪяснявдей неполноценность экспрессии

программы уровня ОЭСВ у андрогециэированньас самок может быть существование системы ингибирезания экспрессии ОЭСБ, также зависимой от пола. Из исключена роль в атом процессе межкла-точных взаимодействий. В свете этой гипотезы увеличение экспрессии ОЭСБ на 4-й день регенерации у самок может быть связано с нарушением взаимодействий между гепатоцитами и негеяаци-тарнкми клеточными элементами, обусловленное запаздыванием пролиферации последних по .сравнению с гепатоцитами.

- Полученные в работе результаты представляют собой материал, являющийся основой для дальнейшего исследования механизмов гормональной детерминации на клеточном и молекулярном уровнях.

ВЫВОДЫ.

1. Формирование андрогенной программы высокого уровня ОЭСБ происходит в онтогенезе самцов до 12 дня та ни, а качало экспрессии приурочено к 45-50 дню и не зависит от присутствия ан-дрогенов и формирования тканевой структуры печени.

2. Сформированная естественная андрогенная программа полностью передается новым поколениям клеток при пролиферации гепатоцитов в ходе регенерации печени.

а Исходная генетическая программа низкого уровня ОЭСБ гепатоцитов оваризктомированных самок полностью передается при их пролиферации и характеризуется временным увеличением экспрессии на начальных этапах регенерации.

4. Отсутствие гипофиза не является препятствием для передачи имеющейся генетической или андрогенной программы экспрессии ОЭСБ. потомству гепатоцитов крыс.

- 21 -

5. Авдрогенпая прогрм.г.а. высокого уровня ОЗСБ формируется в гепатоцитах взрослых овгрнэетошфоваяных самок под действием тестостерона, прочно в них ¿кассируется и передается потомству клеток, однако ее э;сспрессия затруднена по сравндкяя с самцами.

6. У аядрогенгапрованных неполовозрелых и взрослых ова.гн!-эгстс.мировакиых самок экспрессия ОЭСБ «.«аксималыю проявляется только в молодых гепатоцитах v через 4 дня после начала регенерации после ЧГЭ ). После скончания регенерации ее sixnpec-сия существенно снижается.

7. Андрогены осуществляют в гепатоцитах истинную детерья-кадаю.

СПИСОК РАБОТ, ОГО'БЛШЮВАНШХ ГО ТИЯ ДИССЕРТАЦТЯ

1. Смирнова О. В. , lioD-ryir И. Е. , Роосн Б. К. Гёредача гормональной памят:«. по особо;.'!' эстр0геневг.э1:за.'сг;<?!<у Ce.nty при пролиферации клеток печени крыс.з процессе рзгенерашщ. // Пробл. эпдокринол. - 1031.- Т. 37, !! 2.- С. 42-5.

2. 1!озтун И. Б. , Гсфкел Б. ,. Смирнова О. 2. , Розен 3. S. Особенности формирования, экспресс"! и передач:! баатгскоЛ генетической и андрогенной программ уровня особого астрогенспп-зызакдэг ) белка в гепатоцитах г.олоэоэре.и.'Х само:-? крно п эксперименте. У/ Прсбл. зндокрпнол. 1502. - Т. 39, 1! 3. - С. So-оЭ.

3. Smirnova 0. V., VishnisJiova Т. , Dccharov А. V., Itovtun I. V., Rozen V. В. Evidence for direct action of testosterone on rat liver cells: in vivo and in vitro induction of unusual estrocen-hindins protein. // J. Steroid Biochenv i.fol*c. Biol.-1992.-V. iZ, ¡4 2.- P. 2-13-213.

- 22 -

4. Smtrnova О. V., Kovtun.I.V.. Snirnov A.M.. Sohelkunova T. A., Factor V. № , Rozen V. B. Inheritance оГ androgen program of male-specific expression of unusual estrogen-binding protein by daughter hepatocytes at rat liver regeneration.// J. Steroid Biolchem Uol. Biol.- 1993.- V. 44. К 2. ( а печати ).