Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ОГУРЦА И ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ОГУРЦА И ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ"

Ь-зоїзз

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ЧЕРНИЦКИИ Михаил Юрьевич

УДК 577-383.554+581.1.036.1

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИИ ОГУРЦА И ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Специальность 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0

•МОСКВА 1993

¡'/г С С.' с

Работа выполнена в лаборатории биофизики растений Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Л. А. Паничкин.

Официальные оппоненты- доктор биологических наук, профессор Д. Б. Вахмистров; кандидат биологических наук, доцент Л. Г. Я г лова.

Ведущее учреждение — Биологический научно-исследовательский институт Санкт-Петербургского государственного университета.

Защита состоится « » . . .....1993 г.

в «№» час. на заседа «и специализированного совета Д 120 35 07 при Московский сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, ул Тимирячг-1 ^ая, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомитьс

Автореферат разослан *"■> . ' ' г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук Л *

Лс^//» и^ I

'; ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

/. АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ' \

" Исследования биоэлектрической активности имеют важное знамение в ' решении широкого крута теоретических и праклзйных задач физиологии растений. Основой их практического использования должно служить изучение физиологических механизмов биоэлектрогенеза, опирающееся на

современную методическую базу. '' ','■ ■ *>' V.

- Дляприменения электрскризиологических исследований в ; диагностических целях предпочтительна регистрация биоэлектрической

активности на интактных объектах. 8 этом случае методические приемы.' . внутриклеточной регистрации, успешно применяемые на водорослях и животных клетках (методы фиксации тока и потенциала, пэтч-клямп и др.) оказываются мало приемлимыми. в тоже время, методы внеклеточной

■ регистрации и раздражения используются в неизменном" виде уже несколько десятилетий, и нуждаются в пересмотре.

, . . В настоящее время физиологические основы генерации потенциала -покоя и потенциала действия (ПД) у высших растений достаточно хорошо -' . изучены. В то же время.' не выяснена специфичность механизмов -биоэлектрических реакций (БЭР) в зависимости от их типа и действия ' раздражителя. В изучении биоэлектрической активности практически - отсутствует онтогенетический подход: не выяснены закономерности её ! ; изменений в связи с ростом и развитием растений, а также в течение суток. , ] : Недостаточно исследовано и влияние экологических факторов: температуры,' влажности воздуха, и освещенности! на параметры БЭР. ' " ' ■

'' ч .1;' Традиционные метохЫ оценки устойчивости растений к стрессовым ■. факторам не удовлетворяют одновременно требованиям точности. экспрессности, малой трудоемкости, высокой производительности,. \, У " возможности индивидуального отбора, и как правило, приводят к

■ повреждению оиениваемых растений. Электрофизиологические методы могут более полно удовлетворять этим требованиям, поскольку они непосредственно

} регистрируютхарактеристикимембран, наиболее тесно связанные с .. устойчивостью растений к стреаам (Удовенко. 196в). .-. \ ■

У • Д ? ЦЁПИИ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

' Целью исследований являлось ^ формирования местных биоэлектрических реакций растений в зависимости от влияния экологичеошк й онтогенетических факторов, и разработка метода

'V'.: • У-".-":.;..','-5'.-. '.V ■■ '-"-¡..п ■ *■ .•

цимГРАЛЬНАЯ ■-*

НЛУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск" сэль;;гохоз. академии

У^МІШШ

диагностики холодоустойчивости огурца на основании выявленных закономерностей Для достижения этих целей выли поставлены следующие задачи

I.* /совершенствовать методы исследований биоэлектрической активности высших растений

2 Сопоставить закономерности электрогенеза местных и распространяющихся БЭР, и роль отдельных ионов в их формировании

3 Изучить влияние температуры, освещения влажности воздуха, минерального питания, возраста растений, и времени суток на параметры биоэлектрических реакции

4 Выявить связь параметров биоэлектрической активности с генотипическои и фенотипическои холодоустойчивостью растений

1 Обнаружены местные биоэлектрические реакции эпидермапьных клеток листа в ответ на смачивание его поверхности. Определена зависимость параметров этих реакций от функционального состояния растений и влажности воздуха Установлена физиологическая основа дрейфа биопотенциалов листа при использовании жидкостного контакта.

2 Исследованы местные биоэлектрические реакции листа при бесконтактном тепловом раздражении Обнаружено увеличение их амплитуды при снижении температуры ускорение реполяризации под влиянием освещения и зависимость формы БЭР от крутизны нарастания импульаов раздражения

3 Показана общность физиологического механизма местных и распространяющихся БЭР, включающих две составляющие Уточнена роль ионов Саг*. К* и а- в их формировании

4 Исследованы суточные изменения параметров БЭР, и установлено влияние режимов температуры и освещения соответствен!-ю на величины амплитуды и скорости реполяризации реакции. Продемонстрирована связь изменении амплитуды БЭР с возрастом растений с формированием систем активного ионного транспорта, и возбудимых структур клеток

5 Исследована зависимость биоэлектрической активности от влияния параметров стрессового воздействия температуры, освещения влажности воздуха, возраста растении и времени суток. Установлена нелинейная зависимость величины сортовых различии от значений этих факторов, и их сочетании

-3- /.-Я . _ \

6. Выявлена связь холодоустойчивости генотипов огурца со скоростью-реполдризации БЭР в условиях охлаждения, обусловленной степенью поддержания функциональной активности мембран.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ ^ > '

1. Усовершенствована методика внеклеточной регистрации биоэлектрической активности высших растений, учитывающая артефакты, связанные с воздействием на растения в процессе измерений.

2. Разработан метод бесконтактного теплового раздражения растений;' исключающий электрические, механические, и физиологические артефакты. '

3. Разработан способ оценки функционального состояния растений по параметрам биоэлектрической реакции на смачивание (А.с. №. 1606015).

4. Предложен метод блокирования кальциевого тока возбуждения при 4 'замене Са2* на Мд2* во внешней среде.

6. Определены условия для устранения изменений параметров БЭР в течение ДНЯ.' ' .. -^7,.' .у у у.У -'•. . -

" 6. Разработан способ оценки холодоустойчивости растений огурца (А,с. КГ. 1701175). Установлены значения параметров стрессового воздействия. ' оптимальные для проведения диагностики. ' • : , у

7. Определена холодоустойчивость ряда сортов и гибридов ^ огурца с неизвестным и свойствами. Внесены предложения по дальнейшему ' . совершенствованию метода. у''-* г;;" ,Л-'

; ,. 'АПРОБАЦИЯРАБОТЫ:'/~ V ';:у:г ■ •;■>;

у Результаты исследований доложены на Всасоюэной научной - '.' конференции ТСХА памяти И. И. Гунара (Москва! 1986): 16 Всесоюзной школе ^ МГУ по биологическим мембранам (Звенигород. 1988); 5 Всесоюзной школе-семинаре по регуляции минерального питания растений (Чернигов. 1988);4 научно-методическом совещании ВАСХНИЛ по методам оценки устойчивости ■ растения (Ялта, 1990).

ПУБЛИКАЦИИ * - "

Основные результаты исследований опубликованы в 10 печатных работах, включая 2 авторских свидетельства. - •'. <

С : СТРУКТУРА И ОБЬРМ РАБОТЫ , .

.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, экспериментальной части, заключения, выводов, и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста. -содержит. 17 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 220 . наименований, из них 77 на иностранных языках. ••

ОБЬЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ооъект исследования - растения огурца ( Cucumis satvusX.) сортов Марфинский. Клинскии оелошипый CDOP 205/70 Весенним салатный, и гибридов F| ТСХА-442. Сентябрьский Эстафета. Во всех случаях кроме опытов по диагностика использовали растения гибрида F, ТСХА-442 В качестве сортов классификаторов с известными свойствами холодоустойчивости использовали сорта Марфинский (неустойчивый) и Весенний салатный (устойчивый) Растения вырашивали на Я нормы раствора (Снопа, содержащей 3 5 мМ N03, 1 5 мМ К* и Ca2*. 0 5 мМ Mg2* SO,2. Н2Р04 и С). а также Fe CDTA и микроэлементы "A-Z" по Хоглэнду, pH 6 5 Дневная температура - 26" ночная-21° относительная влажность воздуха - 60%. энергетическая освещенность - 60 Вт м 2 при 14-часовом световом дне Опыты проводили на семядольных листьях в возрасте растений 5*21 суток.

Регистрация биоэлектрической актияности

Биоэлектрическую активность регистрировали экстраклеточно с помощью хлорсеребряных электродов ЭВЛ 1МЗ и электрометрического микровольтметра B7-3Q, для записи использовали двухкоординатный самописец Н-307 с полосой пропускания да 2 гц. Электроды соединяли с объектом с помощью агарового (2% "Difco") мостика, приготовленного на основе раствора для выращивания растений Измерительный электрод контактировал с поверхностью нижней стороны семядольного листа через каплю того же раствора электрод сравнения - с раствором, омывающим корни растений При регистрации ПД измерительный электрод контактировал с поверхностью в нижнеи части гипокотиля Для избежания механического воздействия на ткани контакт осуществляли с помощью специального манипулятора с микрометрическим механизмом В качестве нежидкостного контакта использовали гелеобразныи электродный крем фирмы' Siemens", Германия Опыты провопили в климатическом камере М LK !250 ("ILKA", Германия) Регистрацию параметров приведенных в таблицах производили после 20 часовой иыдержки растении в условиях дневного климатического режима

Метопы Разпражвния растение

Бесконтактное раздражение осуществляли наг ревом ткани листа на 7° инфракрасным (ИК) излучением, при пропускании по витку нихромовой проволоки импульса тока длительностью 3 с Проволоку располагали с противоположной стороны листа напротив места контакта с тканью

измерительного электрода, на расстоянии 0.8 мм от поверхности. Установку расстояния приэводили с помощью горизонтального микроскопа МИР-2 с ■ : масштабной шкалой, для регулировки длительности использовали •, электронный таймер СТЦ-1, Величину темпеоатурных импульсов определяли с помощью м икротерм истора МТ-54. располагая его головку в ткани листа. Лазерное раздражение растении осуществляли с помощью ИК лазера' - ■ - ЛТН-101 с длиной волны излучения 1.06 мкм. Для передачи излучения к объекту использовали волоконный световод длиной 3 м. с диаметром шршевины 400 мкм. Фокусировку излучения для ввода в световод осуществляли с помощью оптической системы COK-J. '

; Механическое разхражение осуществляли давлением грузика маоаэи 5 г на лист, прижимая его к контактной поверхности электрода.

• Бесконтактное охлаждение надземной части растений применяли при сортовой диагностике путем помещения растений в охлажденную до заданной * температуры климатическую камеру, где производили регистрацию. Уровень . освещенности при этом оакраняли тот же. что и в нормгшьных условиях. Это же воздействие использовали для генерации ГШ. тем пературный перепад составлял в этом случае 18*. ..'.■■.'"

, ОбгмйУгам ятиест^ .; Обработку растений проводили за 6 ч. до регистрации биоэлектрической , активности.: растворяя опытные вещества в сменяемом питательном растворе. . При смене растворов корни контрольных и опытных растений ополаскивали \ дистиллированной водой. В питательном растворе контрольных растении поддерживали тот же солевой состав, чтои в опытном. за исключением тестируемого катиона или аниона. V -

В качестве блокатора Са2*-каналов использовали I мМ верапамила. ■ блокирование калиевых каналов осуществляли с помощью 5 мМ Ba*> и 12 мМ ' тетраэтипам мония (ТЭА), Блокирование хлорных каналов проводили с , использованием 2 мМ этакриновой кислоты (ЭК), а также 0.25 мМ , . фуросемида. Ингибитор Н'-АТФазы ДЦКД использовали в концентрации 0.2

мМ. Нерастворимые в вода соединения (ЭК. ДЦКД) растворяли в этаноле, ., доводя его конечную концентрацию до 0.4%, контрольные растения : обрабатывали этанолом в той же концентрации. ; 5 - ;

В опытах использовали вераламил фирмы "Orion", Финляндия: ЭК -. Г "Eg¡e". Венгрия; фуросем ид - "Hoechst". Индия; ДЦКД -"BDH". Германия; остальные реактивы - отечественного производства, марки х.ч.

Статистическая обработка данных проводилась на компьютере РС/АТ-286 с использованием стандартных программ "31а1рго" и "Б^гпарЫ".

Опыты по сортовой диагностике проводили в 25-кратной. а остальные • в в-кратйой биологической повторности Представлены результаты усреднения характерного опыта серии из 3-4 повторностей На графиках и в таблицах приведены средние значения и их доверительные интервалы при 5% уровне значимости

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

1.1. Методы регистрации

Для обеспечения надежного контакта электродов с тканью часто используют различные механические зажимы и другие фиксирующие приспособления Их действие тестировали давлением грузика на ткань в процессе регистрации Оно приводило к возникновению местной БЭР из двух составляющих с задержанной релоляризацией (рис.! А) что указывало на альтерированное состояние ткани, и определило необходимость устранения механического воздействия при исследованиях биоэлектрической активности в дальнейшем

Избежать механического раздражения позволяло соединение электрода с тканью через каплю слабого электролита. Было обнаружено что в момент прикосновения контактной капли к поверхности листа, регистрируется импульсное изменение потенциала (рис.1 Б). Устранение этого явления поя действием паров хлороформа при снижении температуры по 12*. или повышении свыше 40*. указывало на то. что оно представляло собой местную БЭР. Непосредственной причиной ее возникновения служило смачивание поверхности листа жидкостью поскольку прикосновение гелеобразного электродного крема к его поверхности не вызывало реакции

На верхней стороне листа, вслед за реакцией на смачивание, развивалась медленная волна негативации в течение 5-8 мин потенциал достигал значений -80+-100 мВ а затем выходил на промежуточный стационарный уровень (рис 1 Б) Этот процесс условно именуемый дрейфом потенциала, отсутствовал у объектов находившихся в рефрактерном состоянии, что свидетельствовало о его физиологической природе Учитывая полярность изменений разности потенциалов (РП) в процессе дрейфа, можно

-а-

сделать вывод о том что он вызывался градуальным раздражением клеток и представлял соОои деполяризацию

С увеличением влажности воздуха амплитуда дрейфа потенциала и БЭР на смачивание линеино уменьшалась хотя амплитуда реакции на действие ПК излучения в этих условиях наоборот, возрастала С верхней стороны листа БЭР на смачивание полностью подавлялись при влажности 60% а с нижнем -80% Оба явления но зависели от состояния устьиц что свидетельствовало о существовании других структур осуществлявших водную связь клеток эпидермиса с окружающей средой и обеспечивавших передачу мембранам внешнего воздействия Такими структурами могли быть дендриты -гидрофильные микроклпилляры пектиновой природы пронизывающие кутикулу (Мирославов 1974 Hoch 1979) Исходя из насыщения водяного пара в микрокапиллярах при влажности воздуха вызывавшей подавление реакций по уравнению Кельвина можно рассчитать их радиус: Р 2 oVm

- = ехр (-),

Ро Гт Н Т

где р - давление насыщенного пара в капиллярах ра- давление насыщенного пара над плоской поверхностью при той же температуре, а -поверхностное натяжение воды. Vm - молярный объем воды R - универсальная газовая постоянная Т - абсолютная температура rm радиус средней кривизны мениска.

Для верхней стороны листа rm~2 10 9 м, для нижнеи стороны rm~10 10-® м Приняв радиус капилляров примерно соответствующим радиусу мениска можно рассчитать величину развивающегося в них натяжения, которое составляло в капиллярах верхней стороны листа "71 9 МПа, нижней стороны -иЭМПа

Это натяжение передающееся в межфибриллярное пространство клеточной стенки влияло на состояние натяжения ллазмалеммы При смачивании поверхности листа по-видимому происходит заполнение гидрофильных структур кутикулы жидкостью и резкое изменение натяжения в капиллярах приводило к раздражению ллазмалеммы что и регистрировалось в виде БЭР Последующая градуальная деполяризация может объясняться увеличением натяжения в капиллярах в процессе испарения 1 2 Методы раздражения растении

Устранить механическое воздействие необходимо было не только при регистрации, но и при раздражении растении Для зтого испопьзовали

. ' -э-

бесконтактное раздражение ИК излучением при пропускании импульса тока по нихромовои проволоке.

Тепловое раздражение приводило к возникновению местных БЭР из двух составляющих (рис.2.А). Аналогичные реакции были зарегистрированы при раздражении ИК излучением лазера, передаваемым к объекту с помощью световода. Это указывало на отсутствие электрических артефактов в формировании двухкомпонентных БЭР. По литературным источникам, реакции такой формы, называемые "вариабельный потенциал", являются ответом на повреждающее воздействие, например ожог пламенем спички (НоЬПп, 1985; Зацепина. 1991). однако многократная воспроизводимость реакций при их регистрации в одной точке свидетельствована о том, что действие раздражителя не было повреждающим.

'"' Увеличение длительности воздействия приводило к росту амплитуды второй составляющей БЭР. связанному со все более стойким невозвращением РП к исходному уровню, сопровождавшимся видимыми признаками повреждения от ожога при максимальной длительности 12 с. Достигаемая при этом амплитуда соответствовала предельной разрядке ионных градиентов, что позволяло по её значению оценивать нативную величину мембранного потенциала клеток. При снижении крутизны нарастания \ воздействия без изменения величины его суммарной энергии, составляющие БЭР спивались, чем вероятно и обьясняется распространенность одновершинных реакций в электрофизиологической литературе.: Следовательно, высокая крутизна импульсов устраняла явления аккомодации ' ткани, и обеспечивала относительную неспецифичность раздражения.

' 2. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ; - . , БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

• 2.1. Роль ионов в формировании БЭР различного типа ■

. Использование параметров двухкомпонентных БЭР в диагностических целях требовало их всестороннего изучения. Для этого исследовали роль ионов Са2*, К* и О- в их формировании.

; .Обработка б локатором кальциевых каналов верапамипом показала, что \ Первая составляющая БЭР связана с переносом ионов кальция (табл.1). Попытки изменить концентрационный градиент для Саг* при замене его на №* непосредственно во время опыта были безрезультатными, что можно _ объяснить наличием значительного резерва кальция в фазе клеточных стенок. Однако, замена кальция на магний приводила к почти полному подавлению

первой составляющей БЭР (рис 2 Б) Это подтверждало участие селективных Саг* каналов и аюрмировании первой составляющей БЭР поскольку магнии является близким к кальцию элементом по строению внешней электронной оболочки степени окисления и ионному радиусу Замена кальция на другой двухвалентный катион - марганец вызыв.ша токоиже эсрсрект но выраженный в меньшей степени В отлах с частичным исключением Саг* из питательной среды в холе нырашивания также наблюдали значительное снижение амплитуды первой а в случае длительного кальциевого голодания - и второй составляющей БЭР

Таблица I

Влияние изменений ионного тока на амплитуду составляющих БЭР

Вариант ДА1 мВ ДАг мВ

Местные БЭР

Верапамил 69 5*6 8 -6 7±6 2

Замена Саг* на Мд2* 66 7±6 7 -6 2±6 2

Замена Саг* на мп2* 39 7±6 0 9 916 9

Без Са2* с 3 суток 74 4*6 4 64 3±6 1

ЭК 67 б±б 7 606*63

Фурооемид 41 7*6 0 38 8*6 6

ТЭА -31 7±76 -4 6*6 1

Ваг- -18 2±6 3 -24 9*6 8

Бе 3 К* с 3 суток -26 7±7 б -15 7*6 4

Потенциал действия

Замена Са*' на мдг* -9 0±4 9 87 6*6 2

ЭК 10 2±4 6 3811:6 8

Ваг* -16 3±61 -123±б 4

Примечании ДА, - разница и величинах амппитуды первой оставляющей БЭР контрольного и опытного вариантов, ДАг - то же второй составляющей Обозначения приведены на рис 2 А

Обработка блокаторами анионных каналов - ЭК и фуросемидом показала что в аюрмировании фазы деполяризации обеих составляющих БЭР участвовал анионный ток (табл 1) Поскольку первая составляющая в большей степени подавлялась при блокировании кальциевых каналов то наиболее вероятным механизмом ее возникновения являлась Са2' активация анионных

к 3 и ' ' .. К ' Л 2 ,

Рис. 2. Изменения кинетики местных БЭР контрольного варианта (А), при замене Са на МЬ в среде (Б), обработке ЭК (Д), ДОКД (Е), ТЭА (Ж), Ва2+ (3), температуре, 16° (И), то же при замене Са2+ на в среде (К), в темноте (Л). ОД'контрольного варианта (В), и при замене Са2+ на в среде (Г). А| -амплитуда первой составляющей, А£-второй составляющей, ¿уг - время снижения амплитуды второй составляющей на половину, ¿ц - то же, на две трети. Вертикальными стрелками отмечено начало, горизонтальными - окончание импульсов, раздражения. '

каналов Возникновение двух составляющих с участием одно! о и того же типа каналов указывает на ю чю они не могут иметь место на одной мемОране, т к по окончании первой составляющей БЗР мембрана будет находи1СЯ в рефраК.ерном сосюянии Это же соображе1 ие по-кюляст отвергнуть и точку зрения согласно которой вторая составляющая реакции типа вариабельного потенциала" возникнет в р тультате взаимодеиствии химичссми о медиатора С мембранными реиешорами (Pickajd 1973 Bohlin 1985)

Исключение CI из среды выращивания не оказывало влияния ни на развитие растении ни на параметры БЭР Учитывая чюаурец относится к хлорчувствигелычым растениям (Гродаинскии 1973) маша сдслать вывод, что ион хлора не малмс гея необходимым элементом ие только минерального питания но и электрогегкгза клеток Возможно замещение CI анионами органических кислот как это установлено например для малата в замыкзкмцичкле>ках устьиц (Schrocder 1989) Таким образом хотя анионный ток и участвует в деполяризации роль О в этом процессе до конца не ясна

Действие блокаторов К* каналов ТЭА и Ва2< приводило к значительному увеличению амплитуды и длительности составляющих БЭР (табл 1). что указывало на участие К* каналов в Формировании фазы реполяризации реакции Независимое подтверждение того же было получено и более мягким способом при создании искусственного калиевого дефицита Однако если исключение К* из среды выращивания приводило к вспрчо гшига амплитуд обеих составляющих БЭР то действие блокаторов по отношению к ним было селективным (рис 2 Ж 3) Известно что оба блокатора эффективно блокируют калиевые каналы со стороны наружного раствора (Homble et al 1991), но ион Ва2* может поступать в клетки через Саг* каналы (Testei 1988), а ион ТЭА* слабо проникает 4epej мембраны (Юрин и др , 1991) Результаты опытов показывают, что на формирование первой составляющей БЭР оказывали влияние оба блокатора а второй - только проникающие ионы Ва2* Вероятным выводом из этого является формирование составляющих соответственно на плазмалемме и тонопласге клеток

Качественно аналогичные результаты о роли ионов в возбуждении были получены при изучении ГЩ (табл 1) Кроме того данные рис2 В показывают что ПД высшего растения так же как и местная БЭР состоял из двух составляющих Однако если у местных БЭР блокирование Са2* каналов подавляло первую составляющую тоуГЩ вюрую Это может объясняться различным характером действия раздражающего фактора При бесконтактном нагреве раздражающий фактор инфракрасное излучение

являлось проникающим воздействием приводящим к деполяризации как плазм ал см мы так и тонопласла клеток поэтому вторая сосг.шпнюиыя связанная у водорослей с возбуждение -л тонопласта (Домеш 1980 Плакс и др 1987) развивалась в неизменном виде При регистрации ПД раздражающим фактором являлись местные тог и деполяризующие плазмапемму что и приводило к сохранению первой составляющей и исчезновению второй В этой связи можно заметить чю реакция на смачивание состояла преимущественно из одной первой составляющей что объясняется вероятно возбуждением в первую очередь плазматических мембран опилермальных клеток

Таким образом механизм формирования местных и распространяющихся двухкомпонентных реакции одинаков и в основном соответствует установленному ранее для водорослей (Берестовскии и др 1987) и высших растении (Опритов и др 1988)

2 2 Изменения биозлек I рической активности под влиянием онтогенет ических факторов

Изучение онтогенетических изменении биоэлектрическои активности начали с дневной динамики, учитывая ее негативное влияние на воспроизводимость результатов последовательно проводимых опытов Биоэлектрическую активность растении характеризовали двумя параметрами амплитудои реакции А, и скоростью регюляризамии V которую представляли как отношение 1/2 или 2/3 величины амплитуды второй составляющей к промежутку времени от ее максимума до снижения на половину или на две трети (рис 2 А)

Перечисленные параметры имели выраженный временной ход амплитуда и скорость реполяризации БЭР в течение почти всего светового дня возрастали и через 14+16 часов выходили на стационарный уровень Отправной точкой для запуска дневных изменений служил переход от ночного режима к дневному, при этом режимы температуры и освещения оказывали независимое влияние соответственно на величины амплитуды и скорости реполяризации БЭР (рис 3)

2.2.1.ТЕРМОИНЛУ11ИРОВАННЫР ИЗМЕНРНИЯ

Влияние изменении температуры на величину амплитуды БЭР было парадоксальным повышение температуры при переходе от ночно! о режима к дневному приводило к подавлению реакции (рис 3 А) а снижение температуры - к их стимуляции (рис 2 И)

10090. 8070

н _ 6050 40-1

i—t

V

-f

¡4

Л

,« •—i-г—«-г—г-—i-1-1-r—»-1-r-

6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 . . Время суток, 4. V'v

1,00,96 0,8 §0,7-]

1-1——г—III i I I

6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 Время суток, Ч. • • J ' ■ ■ -

Рис. 3. Изменения амплитуды БЭР (А) и скорости реполяризации (Б) в течение дня после включения освещения в условиях постоянной ; дневной температуры (I), и после смены температуры в условие* постоянного освещения (2). Время смены режимов - б00;

Непосредственная причина температурной зависимости амплитуды была связана с функционированием участвующих в возбуждении ионных каналов, на что указывало возрастание плотное, и деполяризующего тока в условиях пониженной температуры определенное по увеличению крутизны нарастания переднего фронта БЭР (рис 2 А И) Снижение температуры при блокировании К* и Са2* каналов в обоих случаях принолило к относительному возрастанию амплитуды (табл 2). что исключало их участие в термоинлуиированном увеличении амплитуды Блокирование же анионного тока в этих условиях устраняло явление возрастания амплитуды БЭР и следовательно, оно было обусловлено либо увеличением числа активированных анионных каналов, либо изменением их свойств Для увеличения числа активированных анионных каналов необходимо дополнительное поступление Са2* в цитоплазму (Берестовскии и др 1987) а поскольку наблюдалось возрастание амплитуды БЭР и при блокировании Са2* каналов то эффект скорее всего был обусловлен изменением свойств анионных каналов Отсюда можно сделать вывод, что в течение дня происходило первоначальное уменьшение их активности в связи с ростом температуры с последующим адаптивным ее увеличением Кроме того, различная температурная зависимость деполяризующего и репопяризующего ионных токов указывает на то что действие температурного раздражителя является специфичным в отношении их вклада в формирование БЭР

2.2.2. ФОТОИНДУЦИРО ВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

Включение освещения при переходе от ночного режима к дневному вызывало увеличение скорости реполяризации (рис 3 Б) замедленной в темноте (рис.2 /1) Влияние освещения могло состоять в стимуляции активного ионного транспорта, участвующего в реполяризации реакции возбуждения у растении (ТтеЬасг е! а). 1989 Пятьи ин и др 1990) или в модуляции светом состояния ионных каналов мембран (Денеш и др 1984)

Ингибитор Н* АТФазы ДЦКД вызывал задержку реполяризации на конечном ее этапа (при снижении амплитуды на 2/3 от максимальной табл 2 рис 2 Е) что свидетельствовало об участии активного ионного транспорта в этом процессе но исключало участие И* АТФазы в замедлении реполяризации в темноте имевшем место уже на начальном этапе Это замедление не было связано и с работой калиевых каналом обеспечивающих реполяризующии ионныи ток. т к эффект их блокирования помимо задержки реполяризации состоял также и в увеличении амплитуды БЭР. в то время как

задержка реполяризации в темноте не сопровождалась изменением амплитуды (рис.2.Л).

Таблица 2

Влияние блокаторов ионных каналов и ингибитора Н*-АТФазы ' на параметры БЭР в различных температурных условиях

Вариант 26" 18*

А1.мВ У,/г.мВ/с 4^2/3. мВ/с А1.мВ мВ/с

Контроль 99.2±5.4 1.08610.052 0.850±0.041 132.6+6.9 0.331 ±0.022

Ва2* 117.4±5.9 0.323±0.021 - 141.3±7.1 0.303±0.020

Са2*/Мд2* 32.Б±4.1 0.960±0.045 - 92.6+5.4 0.246±0.019

ЭК 41,7±3.9 0.736±0.035 - 56.8±5.1 0.341 ±0.025

ДЦКД 97.1 ±5.3 1.075±0.052 0.335±0.023 130.3±6.8 0.318±0.023

Лримыга/юп.'Регистрацию параметров при 18" проводили через час после снижения температуры. У1/2 - скорость реполяризации при снижении амплитуды второй составляющей на 1/2; Л/^ - на 2/3: Са2*/ Мд2* - замена Са2* на Мд2* в питательной среда.

Из данных табл. 2 следует, что помимо блокирования К*-тока, замедление реполяризации вызывало также снижение температуры, что может объясняться уменьшением скорости движения ионов через мембраны в этих условиях. Однако, замена Сэ?* на Мд2* в среде в этом случае, приводила к весьма значительной задержке реполяризации, подобно тому, как это имело место в темноте при обычной дневной температуре (рис.2.К.Л). Известно, что . подобный эсрсрект является следствием предотвращения ионами Мд2* инактивации Саг+-активируемых анионных каналов при увеличении отношения концентраций [Мдг+]/[Са2*] в растворе, и не сопровождается изменением . амплитуды реакций (Катаев и др.; 1986). Сходство кинетики развития БЭР в темноте, также не сопровождавшейся изменением амплитуды, позволяет . предположить. что оба эти явления имели обшую причину - отсутствие , • '. ; -инактивации анионного тока. Следовательно, фаза реполяризации БЭР •. , включала в себя процесс инактивации анионного тока кальцием, а дневной ход скорости реполяризации отражал изменение мнактйвационных ;•• ■ •„ ' характеристик этого тока под влиянием освещения.'. ; ' ■ .■ •'

Постепенный характер возрастания скорости реполяризации в течение светового дня предполагал её связь с проиессом фотосинтеза, что могло

достигаться посредством действия какого-либо фотосинтетического интермедиата В этой роли могли выступать, например, НАДФН или АТФ. регуляторная роль которой в активации ионных каналов растительных клеток известна (КаЬзиЬага е! а1, 1390)

Р ? Я. ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ БЭР С ВОЗРАСТОМ РАСТЕНИИ Наши исследования показали, что помимо суточной динамики, параметры БЭР подвержены возрастным изменениям Амплитуды А, и Аг (мВ) увеличивались соответственно от 5 5±2 2 и 22 5±3 5 в возрасте 5 сут . до 132 3±6 9 и 113 0±6 6 в возрасте 21 сут но с различной скоростью до 10-суточного возраста амплитуда второй составляющей была выше, чем первой а затем наоборот

Увеличение силы раздражения в возрасте 7 суток приводило к относительному возрастанию амплитуды второй составляющей БЭР Однако даже в случае видимого повреждения от ожога амплитуда реакции не превышала величины достигавшейся уже в 11-суточном возрасте при неповреждаюшем воздействии Отсутствие способности клеточных мембран к значительной деполяризации указывало на то что на начальных этапах развития растений еще не Сформированы ионные градиенты разрядка которых обеспечивает генерацию БЭР Известно что становление системы активного ионного транспорта и его интенсивность возрастают, начиная с момента достижения клетками определенной степени дифференцировки и вакуолизации (Мазель 1989)

Повышение влажности воздуха до 90-95%, и снижение температуры вплоть до 12°. не приводили к какому-либо возрастанию амплитуды БЭР в 7-суточном возрасте Поскольку эти воздействия активировали ионные потоки при возбуждении клеток, то можно сделать выаод о несформированности возбудимых структур мембран на начальных этапах развития растений Резкое возрастание амплитуды первой составляющей БЭР в возрасте 10 11 суток связанное с трансформацией ее формы в импульсную подтверждает это предположение

Таким образом, изучение закономерностей формирования БЭР позволило выявить зависимость их параметров от действия раздражителя условий минерального питания дневной и ночной температуры интенсивности и продолжительности освещения, влажности воздуха возраста растении, и времени суток

3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ ХОЛОДОУСТОЙЧИВОСТИ

Установленные закономерности предоставляли возможность для использования параметров БЭР в диагностических целях. При этом ; устойчивость рассматривали, как способность поддерживать (функциональную активность мембран в стрессовых условиях (Удовенко, 1976). Для выявления этой способности использовали фиксацию температурной нагрузки, т.е. резкое снижение температуры до заданного уровня, с последующим его сохранением. Такое воздействие приводило не только к разрядке накопленных ионных ' градиентов, но и задавало специфические условия функционирования мембран." ■' ' •

3.1. Биоэлектрическая активность в условиях фиксации ' температурной нагрузки . . ' V

Экспонирование растений при резком снижении температуры воздуха (с 26 до 8°) приводило к возникновению импульсной деполяризации, с последующей замедленной реполяризацией в течение 15-20 мин (рис.4). Фазу деполяризации, т.е. параметр амплитуды, не имело смысла использовать для диагностики, т.к. она относилась к неспецифической части реакции. В связи с : этим исследовали фазу реполяризации. которую характеризовали величиной, обратной её скорости: значением разности потенциалов через 5 мин.'после ' начала охлаждения (Pflg). ,■•.„"

Значения амплитуды БЭР с возрастом увеличивались, а РГЦ -уменьшались, т.е. несмотря на рост деполяризации, скорость реполяризации возрастала. Изменения обоих параметров в течение дня были аналогичными: амплитуда и скорость реполяризации возрастали, а при постоянных внешних условиях сохранялись без изменений.

Анализ значений РГЦ на соответствие теоретическому распределению по

критерию х2 показал, что в течение светового дая они распадались на три . независимые выборки, соответствующие утренним, дневным и вечерним часам. Это свидетельствовало о существовании независимых механизмов, -обеспечивавших процесс реполяризации. Группировка данных пр/рем ; ■ выборкам показала, что их средние значения и коэффициенты вариации были различными: в утренние часы они составляли соответственно 92.1 мВ и 4.1%: в дневные - 71.5 мВ и 10.0%: в вечерние - 55.5 мВ й 5.1% (рис.4). Очевидно, первый механизм, определявший максимальный уровень РГЦ в утренние часы.

был обусловлен уже рассмотренным явлением задержки инактивации > анионных каналов. К середине светового дня реполяризация ускорялась,' й

значения РП5 соответствовали этапу включения в ход реполяризации

активного ионного транспорта Максимальный коэффициент вариации значений РП5 в это время указывал на одновременное действие различных механизмов реполяризации В вечерние часы величины РП5 были минимальными свидетельствуя о быстром прохождении первых двух этапов и выходе РП на стационарный уровень Значение этого уровня определялось очевидно балансом между активным ионным транспортом, и величиной пассивной диффузионной проницаемости мембран те зависело от состояния лилиднои фазы и каналов утечки

Взаимодсиствие этих механизмов определяло функциональную активность мембран в стрессовых условиях, и следовательно отражавший ее параметр РП5 являлся косвенным показателем холодоустойчивости В таком случае, изменения величины РП5 в течение дня отражали дневной ход холодоустойчивости растений Это явление было известно и ранее прямыми методами показано, что наименьшей холодоустойчивостью растения обладают в утренние часы (McMillan et al. 1990), что соответствует и нашим данным

Отклонения индивидуальных значений РГЦ от средней в опыте при повторной записи на одних и тех же растениях успешно воспроизводились средняя разность между парами соответствующих отклонений составила 0 07±0 3 мВ. т е была не существенна Это указывало на то. что способность мембран к реполяризации в стрессовых условиях отражала свойства генотипа 3.2 Диагностика сортовой устойчивости Поскольку параметры БЭР зависели от ряда экологических и онтогенетических факторов, необходимо было выяснить их влияние на воспроизводимость значений РП5 в условиях стрессового воздействия а также на величину разницы между сравниваемыми сортами

Фиксация температуры на уровне 11-13* оказывала недостаточно сильное воздействие на мембраны, в результате чего реполяризация проходила достаточно быстро и у неустойчивых к холоду растений Слишком низкие температуры (3-5°) подавляли реполяризацию реакции у всех растении одинаково и лишь при оптимальной для диагностики температурю 7-9° происходило разделение сортов по их способности к сохранению Функциональной активности мембран Влияние освещения было аналогичным при низкой освещенности (30 вт м-2) скорость реполяризации была настолько снижена что это приводило к сокращению разницы между сортами а при высокой освещенности (66 вт м 2) даже неустойчивые растения

Рис. 4. Кинетике BSP при фиксации температурной нагрузки в различное время суток. Аj - амплитуда реакции, Ag - вторая волна, деполяризации," ОД - потенциал действия, РЛд" - разность потенциалов через 5 мин. после начала охлаждения в утренние (I), дневные (2), и вечерние (3) часы.. 4 - разность потенциалов до воздействия. Стрелкой отмечен момент снижения те»терату£ы14.

30 1 40 50 . 6070 80

JВесенний салатный

Эстафета Сентябрьский

JTCXA-442

Ф0Р-205/70 Кяинский белошипый

^Марфинский

Рис. 5. Шкала:холодоустойчивости сортов и гибридов Рр Значения РП^ приведены-для стандартизированных условий опыта и 13-кратной биологической повторности. .• (

осуществляли регюляриэацию быстрее, при освещенности 4S вт м 2 разница между сравниваемыми сортами была наибольшей Регистрация РП5 в различном возрасте показала что разница межи/ сортами имела максимум в возрасте растений 12 суток Очевидно мощность систем ионного транспорта с возрастом растений увеличивалась о чем свидетельствовал рост амплитуды деполяризации поэтому одно и то же холодовое воздействие подавляло реполяризашио а неодинаковой степени что и приводило к уменьшению сортовых различий в молодом и старшем возрастах Исследовали также влияние влажности воздуха перед охлаждением растении Повышение влажности воздуха до 85% вызывало увеличение значении РП5 с

последующим восстановлением в течение 6-8 час их прежних величин Для устранения неопределенности значений РП5 в дальнейшем влажность

поддерживали равной 60%

Как следурт из приведенных данных зависимость величины регистрируемых сортовых различий от параметров стрессового воздействия была нелинейна и имела минимумы и максимум Значения опытных сракторов. соответствующие зтим максимумам и были установлены в качестве стандартных. Совместное влияние факторов приводило к зависимости величины сортовых различий также и от их конкретных сочетаний Было определено несколько таких сочетании оптимальных для оценки холодоустойчивости данного вида растении

Переходить к диагностике генотипическои холодоустойчивости можно было выяснив минимальный репрезентативный объем выборки Величины РП6 для близких гибридов F, Эстафета и Сентябрьский оказались равными соответственно 41 8±| 7 и 46 8±1 8 мВ и следовательно для сохранения существенных различий между ними допустимо было увеличение доверительных интервалов приблизительно в 1 4 раза откуда минимальныи объем выборки оказался равным тринадцати Точность оценки метода составила 2 2±0 2% Используя в дальнейшем 13-кратную повторность и стандартизированные условия проведения опыта была составлена шкала холодоустойчивости сортов и гибридов Она приведена на рис 5 и включает семь наименований из которых два являлись сортами классификаторами с известными свойствами (Тараканов и др . 1992) При составлении шкалы была определена холодоустойчивость гибридов F, Эстафета ТСХА 442 и Сентябрьский Была уточнена холодоустойчивость сорта ФОР 205/70 считавшегося более устойчивым а также относительная холодоустойчивость сортов Марфинский и Клинскии бслошипыи относимых к одному сортотипу

Определение стандартных условии проведения оценки, а также выяснение характеристик способа позволило считать его разработку практически законченной. Оценка холодоустойчивости сортов и гибридов ^

подтверждена данным и лаборатории овощеводства ТСХА на основании прямых многолетних наблюдений. Для реализации способа необходимо относительно несложное оборудование: высокоомный милливольтметр, , стандартные электроды, и климатические камеры, а обработка результатовне требует сложных математических методов. Затраты времени для диагностики единичного растения оставляют около 6 мин, что значительно меньше, чем требуется в других неповреждающих методах (Воробьев, 1979; Стадник. 1979; Ретивин, 1988), Однако, для получения воспроизводимых результатов ■ требуется полная стандартизация условий подготовки и проведения оценки; кроме того, сами эти условия рассчитаны на растения огурца, и для любой другой культуры должны быть определены заново. ''

Для увеличения производительности метода необходимы ' . ; -дополнительные меры: применение бесконтактной многоканальной .:. регистрации с компьютерным управлением и обработкой результатов измерений. Разработка соответствующей аппаратуры позволит использовать , такую установку для массовой оценки селекционного материала.

1. На проростках огурца установлена двухкомпонентная форма местных и распространяющихся БЭР. Предполагается, что формирование компонент , связано с возбуждением различных мембран - плазмалеммы и тонопласта . клеток. Фаза деполяризации БЭР обеспечивается ионами кальция, при . - •,' участии анионного тока. Фаза реполяризации включает в себя инактивацию . ■ анионного тока кальцием, выходящий ток калия, и активный ионный транспорт на заключительном этапе. "..* 7.'"' •'.' 'г.'.*'.'-,.

2. Повышение температуры приводит к уменьшению величины деполяризующего анионного тока, а снижение - к его стимуляции. Освещение ускоряет реполяризацию. вероятно вследствие влияния на инактиАацию . • анионного тока. Замена Са2* на Мд2* в наружной среде приводит к , . : •• блокированию кальциевого тока при возбуждении.'.- ; ' ' -V -" ' ' •

3/ Установлено, что смачивание поверхности листа вызывает БЭР,: ' зависящую от функционального состояния растения и влажности воздуха. , ' Предполагается, что эта реакция обусловлена раздражением плазмалеммы эпидермальних клеток. Последующий дрейф биопотенциалов представляет.

собой градуальную деполяризацию клеточных мембран связанную с испарением контактной жидкости Возможно использование БЭР на смачивание в качестве тест воздействия

4. Суточная динамика параметров БЭР является следствием смены режимов температуры и освещения влияющих соответственно на величины амплитуды и скорости реполяризаиии Для устранения негативного влияния этого явления на воспроизводимость результатов опытов, необходимо выдерживать растения в течение 16+20 час в неизменных условиях температуры и освещения Установлено увеличение амплитуды БЭР с возрастом растении, по-видимому обусловленное становлением систем ионного транспорта, и формированием возбудимых структур клеток

5 Воспроизводимость абсолютных величин параметров БЭР возможна только для конкретных значении факторов температуры освещенности влажности воздуха возраста растении и условий минерального питания при подготовке и проведении оценки Зависимость величины сортовых различии от этих факторов нелинейна, и характеризуется наличием минимумов и максимумов Взаимовлияние факторов приводит к наличию их определенных сочетаний, оптимальных для диагностики

6 Показателем генотипическои и фенотипическои холодоустойчивости растений может служить параметр характеризующий скорость реполяризаиии БЭР в условиях охлаждения Холодоустойчивость растений в условиях фатопериопа подвержена суточным изменениям с минимальными значениями в утренние часы

7. Установлены разрешающая способность разработанного диагностического метода, минимальным обьем выборки и точность оценки Составлена шкала холоооустоичиаости для семи сортов и гибридов Р, огурца Внесены предложения по дальнейшему совершенствованию метода направленные на проведение массовой оценки

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ пнггрртлчии

1 Паничкин Л А . Черницкий М Ю Биоэлектрические реакции растений при бесконтактном тепловом раздражении II Электрофизио-логические методы в изучении функционального состояния растении Со науч тр ТСХА М 1988 С 82-90

2 Паничкин Л А. Черницкий М Ю Дрейф биопотенциалов эпидерм ал ьных клеток листа при эмгграклеточнои регистрации жидкостным электродом // Дел во ВНИИТЭИагропром КР 552 ВС-89 »989 18 с

■ -24-

3. Паничкин Л Л., Черницкий М.Ю. Биоэлектрические реакции' эпидерм альных клеток листа при контакте с жидкостным электродом II Деп. во

ВНИИТЭИагропром. Г*. 553ВС-89. 1989.13 с. ,

'4. Паничкин Л.А.. Черницкий М.Ю. Влияние блокаторов ионных каналов на формирование биоэлектрической реакции проростков огурца II Отчет о ■ -НИР. Деп. во ВНТИЦ. №. 02.90.0.015788. 1990.14 с. .

в. Паничкин Л.А.. Черницкий М.Ю. Способ оценки функционального состояния растений//А.с. №. 1606015 (СССР), кл. А 01 й 7/00 опубл. 15.11.90. Бюл. N4 42. _ ' -

6. Паничкин Л.А., Черницкий М.Ю. Исследование контактных явлений при внеклеточной регистрации биоэлектрических потенциалов растений II " Ионнный транспорт и усвоение элементов минерального питания растений: 5 Шкопа-семинар, Чернигов. 1988, Киев: 1991. С. 54-58.

7. Паничкин Л-А., Черницкий М.Ю. Биоэлектрическая реакция листа на смачивание//Физиология растении. 1991. Т. 38. Вып. 2. С. 371-380.

8. Паничкин Л.А.. Черницкий М-Ю., Буко О.А. Электрогенная разность , потенциалов как показатель генотипическои специфичности растений II ■ Известия ТСХА. 1991. Вып. 6. С. 81-86. : - : . *

9. Паничкин Л.А., Черницкии М.Ю. Способ оценки холодоустойчивости растений огурца II А.с. М*. 1701175 (СССР), кл. А 01 О7/00. опубл. 30.12.91. Бюл. N•.48. • ' • . .;•/ ''.

10. Черницкий М.Ю., Паничкин Л.А., Купленский О.Ю. Роль Саг* в Формировании биоэлектрической реакции листьев огурца // Физиология растении. 1993. Т. 40. N».2. С. 246-249 * , ; . V

Объем I'/ü п л

Заказ 633

Тираж 100

Типография Московской с х академии имени К. А Тимирязева 127550, Москва И 550, Тимирязезская ул , 44