Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности формирования биоэлектрических реакций огурца и их диагностическое применение

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Закономерности формирования биоэлектрических реакций огурца и их диагностическое применение"

П'й 0я

. МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА - 1 ',*, И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА _____

На правах рукописи

. - -1 ' '' ( , ' 1 ■1

ЧЕРНИЦКИЙ Михаил Юрьевич

УДК 577.352.554+581X036.1

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ОГУРЦА И ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Специальность 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

МОСКВА 1993

Работа выполнена в лаборатории биофизики растений Мо. сковской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Л. А. Паничкин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Д. Б. Вахмистров; кандидат биологических наук, доцент Л. Г. Яглова.

Ведущее учреждение — Биологический научно-исследовательский институт Санкт-Петербургскего государственного университета.

Защита состоится « * > . ...... 1993 г.

в «час. на заседании специализированного совета Д 120.35.07 при Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

" С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан . . . . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических нау" '*■*

Лосева

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТРМЫ

Исследования биоэлектрической активности имеют важное знамение в решении широкого круга теоретических и прикладных задач физиологии растении. Основой их практического использования должно служить изучении физиологических механизмов биоэлектрогенеза, опирающееся на современную методическую базу.

Для применения электрофизиологических исследовании в диагностических целях предпочтительна регистрация биоэлектрической активности на интактных объектах. В этом случав методические приемы внутриклеточной регистрации, успешно применяемые на водорослях и животных клетках (методы фиксации тока и потенциала, пэтч-клямл и др.) оказываются мало прием лимыми. В тоже время, методы внеклеточной регистрации и раздражения используются в неизменном виде уже несколько десятилетий, и нуждаются в пересмотре.

В настоящее время физиологические основы генерации потенциала покоя и потенциала действия (ПД) у высших растений достаточно хорошо изучены. В то же время, не выяснена специфичность механизмов биоэлектрических реакций (БЭР) в зависимости от их типа и действия раздражителя. В изучении биоэлектрической активности практически отсутствует онтогенетический подход: не выяснены закономерности её изменений в связи с ростом и развитием растения, а также в течение суток. Недостаточно исследовано и влияние экологических факторов: температуры, влажности воздуха, и освещенности, на параметры БЭР.

Традиционные методы оценки устойчивости растений к стрессовым факторам не удовлетворяют одновременно требованиям точности, экспрессности, малой трудоемкости, высокой производительности, возможности индивидуального отбора, и как правило, приводят к повреждению оцениваем ыхрастений. Электрофиэиологические методы могут более полно удовлетворять этим требованиям, поскольку они непосредственно регистрйруюткарактеристики мембран, наиболее тесно связанные с устойчивостью растений к стрессам (Удовенко. 1988).

ПЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Цельюисследований являлось изучение закономерностей формирования местных биоэлектрических реакций растений в зависимости от влияния экологических и онтогенетических факторов, и разработка метода

пиагностики холодоустойчивости огурца на основании выявленных закономерностей. Для достижения этихиелей был« поставлены следующие задачи:

1.' Усовершенствовать методы исследований биоэлектрической активности высших растений.

2. Сопоставить закономерности эяоктрогенеза местных и распространяющихся БЭР, и роль отдельных ионов в их формировании.

3. Изумить влияние температуры, освещения, влажности воздуха, минерального питания, возраста растений, и времени суток на параметры биоэлектрических реакций.

4. Выявить связь параметров биоэлектрической активности с генотипической и фенотипической холодоустойчивостью растений.

1. Обнаружены местные биоэлектрические реакции эпидермальных клеток листа в ответ на смачивание его поверхности. Определена зависимость параметров этих реакций от функционального состояния растений и . влажности воздуха Установлена физиологическая основа дрейфа биопотенциалов листа при использовании жидкостного контакта.

2. Исследованы местные биоэлектрические реакции листа при бесконтактном тепловом раздражении. Обнаружено увеличение их амплитуды при снижении температуры, ускорение реполяризаиии под влиянием освещения, и зависимость формы БЭР от крутизны нарастания импулызоа раздражения.

3. Показана общность физиологического механизма местных и распространяющихся БЭР, включающих две составляющие. Уточнена роль ионов Са2\ К*.и а-в Сформировании.

4. Исследованы суточные изменения параметров БЭР, и установлено влияние режимов температуры и освещения соответственно на величины амплитуды и скорости реполярйзации реакции. Продемонстрирована связь изменений амплитуды БЭР с возрастом растений с формированием.систем активного ионного транспорта, и возбудимых структур клеток.

5. Исследована зависимость биоэлектрической активности от влияния параметров стрессового воздействия: температуры, освещения, влажности воздуха, возраста растений, и времени суток. Установлена нелинейная зависимость величины сортовых различии от значений этих факторов, и их сочетании.

-36. Выявлена связь холодоустойчивости генотипов огурца со скоростью реполаризации БЭР в условиях охлаждения, обусловленной степенью поддержания срункциональной активности мембран.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

1. Усовершенствована методика внеклеточной регистрации биоэлектрической активности высших растений, учитывающая артефакты, связанные с воздействием на растения в процессе измерений.

2. Разработан метод бесконтактного теплового раздражения растений, исключающий электрические, механические, и физиологические артефакты.

3. Разработан способ оценки функционального состояния растений по параметрам биоэлектрической реакции на смачивание (А.с. N®. 1606015).

4. Предложен метол блокирования кальциевого тока возбуждения при замене Саг* на Мд2* во внешней среде.

5. Определены условия для устранения изменений параметров БЭР в течение дня.

6. Разработан способ оценки холодоустойчивости растений огурца (А,с ISP. 1701175). Установлены значения параметров стрессового воздействия, оптимальные для проведения диагностики.

7. Определена холодоустойчивость ряда сортов и гибридов Ff огурца! с

неизвестными свойствами. Внесены предложения по дальнейшему совершенствованию метода АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований доложены на Всесоюзной научной конференции ТСХА памяти И.Й. Гунара (Москва, 1986): 18 Всесоюзной школе МГУ по биологическим мембранам (Звенигород 1988); 5 Всесоюзной школе-семинаре по регуляции минерального питания растений (Чернигов. 1988); научно-методическом совещании ВАСХНЙЛ по методам оценки устойчивости растений (Ялта. 1990).

. ПУБЛИКАЦИИ ^А':"; А- ;А:

Основные результаты исследованийопубликсваны в 10 печатных работах, включая 2 авторских свидетельства.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, экспериментальной части, заключения, выводов, и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и в таблиц. Список литературы включает 220 наименований, из них 77 на иностранных языках.

РБЬЕКГ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

<?Оьект исследования - растения огурца ( Cucums satrivsL.) сортов Марфинский, Клинский белошипый, ФОР-205/70, Весенний салатный, и гибридов F, ТСХА-442. Сентябрьский. Эстафета. Во всех случаях, кроме опытов по диагностике, использовали растения гибрида F, ТСХА-442. В качестве сортов-классификаторов с известными свойствами холодоустойчивости использовали сорта Марфинский (неустойчивый), и Весенний салатный (устойчивый). Растения выращивали на 'А нормы раствора Кнопа. содержащей: 3.5 мМ N03-, 1.5 мМ К* и Са*4, о.5 мМ Mg2\ SO«2-. Н2Р04". и С1', а также Fe-EDTA и микроэлементы "A-Z" по Хоглэнду; рН.6.5. Дневная температура - 26", ночная -21°, относительная влажность воздуха - 60%, онергетическая освещенность - 60 Вт-м-2при 14-часовом световом дне. Опыты проводили на семядольных листьях в возрасте растений 5-21 суток.

Регистра 1ия биоэлектрической активности

Биоэлектрическую активность регистрировали экстраклеточно, с помощью хлорсеребряных электродов ЭВЛ-1МЗ и электрометрического микровольтметра В7-30, для записи использовали двухкоординатный самописец Н-307 с полосой пропускания до 2 гц. Электроды соединяли с объектом с помощью агарового (2%,"Diico") мостика, приготовленного на основе раствора для выращинания растений. Измерительный электрод контактировал с поверхностью нижней стороны семядольного листа через каплю того же раствора, электрод сравнения - с раствором, омывающим корни растений. При регистрации ПД измерительный электрод контактировал с поверхностью в нижней части гипокотиля. Для избежания механического воздействия на ткани, контакт осуществляли с помощью специального манипулятора с микрометрическим механизмом. В качестве нежидкостного контакта использовали гелеобразный электродный крем фирмы "Siemens", Германия. Опыты проводили в климатической камере K.TLK-1250 ("ILKA", Германия). Регистрацию параметров, приведенных в таблицах, производили после 20-часовой выдержки растений в условиях дневного климатического режима. '

Методы раздражения растейий

Бесконтактное раздражение осуществляли нагревом ткани листа на 7° инфракрасным (ИК) излучением, при пропускании по витку нихромовой проволоки импульса тока длительностью 3 с. Проволоку располагали с противоположной стороны листа, напротив места контакта с тканью

измерительмого электрода, на расстоянии 0,8 мм от поверхности. Установку расстояния призводили с помощью горизонтального микроскопа МИР-2 с масштабной шкалой, для регулировки длительности использовали электронный таймер СТЦ-1. Величину темпеоатурных импульсов определяли с помощью микротермистора МТ-54, располагая его головку в ткани листа.

Лазерное раздражение растений осуществляли с помощью ИК лазера ЛТН-101 с длиной волны излучения 1.08 мкм. Для передачи излучения к объекту использовали волоконный световод длиной 3 м, с диаметром сердцевины 400 мкм. Фокусировку излучения для ввода в световод осуществляли с помощью оптической системы СОК-1.

Механическое раздражение осуществляли давлением грузика массой 5 г на лист, прижимая его к контактной поверхности электрода.

Бесконтактное охлаждение надземной части растений применяли при сортовой диагностике путем помещения растений в охлажденную до заданной 'температуры климатическую камеру, где производили регистрацию. Уровень . освещенности при этом сохраняли тог же, что и в нормальных условиях. Это же воздействие использовали для генерации ПД. температурный перепад составлял в этом случае 18".

Обработка вещест вами •

Обработку растений проводили за 6 ч. до регистрации биоэлектрической активности, растворяя опытные вещества а сменяемом питательном растворе. При смене растворов корни контрольных и опытных растений ополаскивали дистиллированной водой. В питательном растворе контрольных растений поддерживали тот же солевой состав, что и в опытном, за исключением тестируемого катиона или аниона.

В качестве б локатора Са2*-каналов использовали 1 мМ верапамила. • блокирование калиевых каналов осуществляли с помощью 5 мМ Ва2* и 12 мМ тетраэтиламмония (ТЭА). Блокирование хлорных каналов проводили с использованием 2 мМ этакриновоя кислоты (ЭК), а также 0.25 мМ фуросемида. Ингибитор Н*-АТФазы ДЦКД использовали в концентрации 0.2 мМ, Нерастворимые в воде соединения (ЭК, ДЦКД) растворяли в этаноле, доводя его конечную концентрацию до 0.4%. контрольные растения обрабатывали этанолом в той же концентрации.

В опытах использовали вераламмл фирмы "Orion", Финляндия: ЭК -"Egis". Венгрия; фуросемид - "Hoedisf. Индия: ДЦКД - "BDH". Германия; остальные реактивы - отечественного производства, марки х.ч.

Статистическая пйработка данных проводилась на компьютере РС/АТ-286 с использованием стандартных программ "31а1рго" и "Эдппар1оГ

Опыты по сортовой диагностике проводили в 25-кратной, а остальные - в в-кратной биологической повторности. Представлены результаты усреднения характерного опыта серии из 3-4 повторностей. На графиках и в таблицах приведены средние значо мя и их доверительные интервалы при 5% /ровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

1.1. Методы регистрации

Для обеспечения надежного контакта электродов с тканью часто используют различные механические зажимы и другие фиксирующие приспособления. Их действие тестировали давлением грузика на ткань в процессе регистрации. Оно приводило к возникновению местной БЭР из двух составляющих, с задержанной релоляризацией (рис. 1 .А}, что указывало на альтерированное состояние ткани, и определило необходимость устранения механического воздействия при исследованиях биоэлектрической активности в дальнейшем.

Избежать механического раздражения позволяло соединение электрода с тканью через каплю слабого электролита. Было обнаружена, что в момент прикосновения контактной капли к поверхности листа, регистрируется импульсное изменение потенциала (рис.1.Б), Устранение этого явления под действием паров хлороформа, при снижении температуры до 12°. или повышении свыше 40°, указывало на то, что оно представляло собой местную БЭР. Непосредственной причиной её возникновения служило смачивание поверхности листа жидкостью, поскольку прикосновение гелеобразного электродного крема к его поверхности не вызывало реакции.

На верхней стороне листа, вслед за реакцией на смачивание, развивалась медленная волна негативации: в течение 5-8 мин потенциал достигал значений -80-М00 мВ, а затем выходил на промежуточный стационарный уровень (рис.1.Б). Этот процесс, условно именуемый дрейфом потенциала, отсутствовал у объектов, находившихся в рефрактерном состоянии, что свидетельствовало о его физиологической природе. Учитывая полярность изменений разности потенциалов (РП) в процессе дрейфа, можно

А

Б

Рис. I. Регистрация биоэлектрической активности о использованием электродного крема (А) и-жидкосх- ^ ного контакта (Б) на нижней (н) и верхней (в) стороне листа. Ас - амплитуда реакции на смачивание, Ад - амплитуда дрейфа потенциала. Стрелкой отмечен момент прижима листа грузиком.

сделать выводе том, что он вызывался градуальным раздражением клеток, и представлял собой деполяризацию.

С увеличением влажности воздуха амплитуда дрейфа потенциала и БЭР на смачивание линейно уменьшалась, хотя амплитуда реакций на действие ИК излучения в этих условиях, наоборот, возрастала. С верхней стороны листа БЭР на смачивание полностью подавлялись при влажности 60%, а с нижней -90%. Оба явления не зависели от состояния устьиц; что свидетельствовало о существовании других структур, осуществлявших водную связь клеток эпидермиса с окружающей средой, и обеспечивавших передачу мембранам внешнего воздействия. Такими структурами могли быть дендриты -гидрофильные микрокапилляры пектиновой природы, пронизывающие кутикулу (Мирославов. (974; Hoch, 1979). Исходя из насыщения водяного пара в микрокапиллярах при влажности воздуха, вызывавшей подавление реакций, по уравнению Кельвина можно рассчитать их радиус:

Р 2oVm

- = ехр(----);

Po rmRT

где р - давление насыщенного пара а капиллярах; р0 - давление насыщенного пара над плоской поверхностью при той же температуре; о -поверхностное натяжение воды; Vm - молярный объем воды: R - универсальная газовая постоянная; Т - абсолютная температура; rm- радиус средней кривизны мениска.

Для верхней стороны листагт-2 Ю"9 м, для нижней стороны г^ЧО Ю'9 м. Приняв радиус капилляров примерно соответствующим радиусу мениска, можно рассчитать величину развивающегося в них натяжения, которое составляло в капиллярах верхней стороны листа »71.9 МПа, нижней стороны -14.3 Ша.

Это натяжение, передающееся в межфибриллярное пространство клеточной стенки, влияло на состояние натяжения плазмалеммы. При смачивании поверхности листа, по-видимому, происходило заполнение гидрофильных структур кутикулы жидкостью, и резкое изменение натяжения в капиллярах приводило к раздражению плазмалеммы, что и регистрировалось в виде БЭР. Последующая градуальная деполяризация может объясняться -увеличением натяжения в капиллярах в процессе испарения.

1.2. Методы раздражения растении

Устранить механическое воздействие необходимо было не только при регистрации, но и при раздражении растений. Для этого иаюльзоеали

бесконтактное раздражение ИК излучением при пропускании импульса тока по нихрогаовои проволоке.

Тепловое раздражение приводило к воз11икнопснию местных БЭР из двух составляющих (рис.2.А). Аналогичные реакции были зарегистрированы при раздражении ИК излучением лазера, передаваемым к обг>скту с помощью световода. Это указывало на отсутствие электрических артефактов в формировании двухкомпонентных БЭР. По литературным источникам, реакции такой формы, называемые "вариабельный потенциал", являются ответом на повреждающее воздействие, например ожог пламенем спички (Roblin, 1985; Зацепина. 1991). однако многократная воспроизводимость реакций при их регистрации в одной точке свидетельствовала о том, что действие раздражителя не было повреждающим.

Увеличение длительности воздействия приводило к росту амплитуды второй составляющей БЭР, связанному со все более стойким невозвращением РП к исходному уровню, сопровождавшимся видимыми признаками повреждения от ожога при максимальной длительности 12 с. Достигаемая при этом амплитуда соответствовала продельной разрядке ионных градиентов, что позволяло по её значению оценивать нативную величину мембранного потенциала клеток. При снижении крутизны нарастания воздействия без изменения величины его суммарной энергии, составляющие БЭР сливались, чем вероятно и объясняется распространенность одновершинных реакций в электрофизиологической литературе. Следовательно, высокая крутизна импульсов устраняла явления аккомодации ткани, и обеспечивала относительную неспецифичность раздражения.

2. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

2.1. Роль ионов в формировании БЭР различного типа

Использование параметров двухкомпонентных БЭР в диагностических целях требовало их всестороннего изучения. Для этого исследовали роль ионов СагМС и С|-в их формировании.

Обработка блокатором кальциевых каналов верапамилом показала, что Первая составляющей БЭР связана с переносом ионов кальция (табл.1). Попытки изменить концентрационный градиент для Саг* при замене его на Na* непосредственно во время опыта были безрезультатными, что можно объяснить наличием значительного резерва кальция в фазе клеточных стенок. Однако, замена кальция на магнии приводила к почти полному подавлению

-to-

первой составляющей БЭР (рис.2.Б). Это подтверждало участие селективных Са2*-каналов в формировании первой составляющей БЭР. поскольку мш ний является близким к кальцию элементом по строению внешней электронной оболочки, степени окисления и ионному радиусу. Замена кальция на другой двухвалентный катион - марганец. вызывгита такойже эффект, но выраженный р меньшей степени. В от* tax с частичным исключением Са2* из питательной среды в хода выращивания также наблюдали значительное снижение амплитуды первой, а в случае длительного кальциевого голодания - и второй составляющей БЭР.

Таблица I

Влияние изменений ионного тока на амплитуду составляющих БЭР

Вариант Mv мВ ДАг. мВ

Местные БЭР:

Вераламил Б9.б±б.8 -6.7±6.2

Замена Са2* на Мдг* 66.7 ±57 -Б .216.2

Замена Саг* на Мпг* 39.7±6 0 9.916.9

Без Са2* с 3 суток 74.4i5.4 64.3161

ЭК 67.Б±67 60.6163

Фуросвмид 41.7*6.0 З8.8166

ТЭА -31.7±7б -4.616.1

Ваг* -18.2169 -24 9168

Без К* с 3 суток -26.717.6 -16.716.4

Потенциал действия:

Замена Са** на Мдг* -9.014 9 87.616 2

ЭК 10.2146 38 ii6.8

Ва2» -16.316.1 -12 3i64

Примечании: Ь.А] - разница в величинах амплитуды первой сотавляющей БЭР контрольного и опытного вариантов: ДАг - то же, второй составляющей. Обозначения приведены на рис.2.А.

Обработка б локаторам и анионных каналов - ЭК. и фуросемидом показала, что в сформировании фазы деполяризации обеих составляющих БЭР участвовал анионныи ток (табл.)). Поскольку первая составляющая в большей степени подавлялась при блокировании кальциевых каналов, то наиболее вероятным механизмом ее возникновения являлась Са2>-акгивация анионных

25 мВ 50 с.

J V

д-

•в

К 3 и к л ■

Рис. 2. Изменения кинетики местных БЭР контрольного варианта (А), при замене Са на Щ в среде (Б), обработке Ж (Д), ДЦКД (Е), ТЭА (Ж), Ва2+ (3), температуре 18° (И), то же при замене Са2+ на Щ2+ в среде (К), в темноте (Л). Щ контрольного варианта (В), и при замене Са2+ на в среде (Г). А^ -амплитуда первой составляющей, А£-второй составляющей, время снижения амплитуды второй состав-

ляющей на половину, ¿ц - то же, на две трети. Вертикальными стрелками отмечено, начало, горизонтальными - окончание импульсов, раздражения.

каналов. Возникновение двух составляющих с участием одного и того же типа каналов указывает на то. что они не могут иметь место на одной мембране, т.к. по окончании первой составляющей СЭР мембрана будет находится в рефрактерном состоянии. Это же соображение позцоляет отвергнуть и точку зрения, согласно которой, вторая составляющая реакций типа "вариабельного потенциала" возникает в результате взаимодействия химического медиатора с мембранными рецепторами (Р1скагс1, 1973: ЯоиНп. 1985).

Исключение С1 из среды выращивания не оказывало влияния ни на развитие растений, ни на параметры БЭР. Учитывая, что огурец относится к хлорчувсшительным растениям (Гродзинский, 1973), можно сделать вывод, что ион хлора не является необходимым элементам не только минерального питания, но и электрогенеза клеток. Возможно замещение С1- анионами органических кислот, как это установлено, например для малата в замыкающих клетках устьиц (5сЬгосс1ег, 1989). Таким образом, хотя анионный ток и участвует в деполяризации, роль С1- в атом процессе да конца не ясна.

Действие блока юрой К+-каналов ТЭА и Ва2* приводило к значительному увеличению амплитуды и длительности составляющих БЭР (табл. 1). что указывало на участие К''-каналов в формировании фазы релоляризации реакций. Независимое подтверждение того же было получено и более мягким способом, при создании искусственного калиевого дефицита. Однако, если исключение К* из среды выращивания приводило к возрастанию амплитуд обеих составляющих БЭР, то действие блокаторов по отношению к ним было селективным (рис.2.Ж,3). Известно, что оба блокатора эффективно блокируют калиевые каналы со стороны наружного раствора (НотЫе е1 а!.. 1991), но ион Ва2* может поступать в клетки через Са2*-каналы (Те^ег, 1988)! а ион ТЭА* слабо проникает через мембраны (Юрин и др., 1991). Результаты опытов показывают, что на формирование первой составляющей БЭР оказывали влияние оба блокагора, а второй - только проникающие ионы Ва2*. Вероятным выводом из этого является формирование составляющих соответственно на плазмалемме и тонолласте клеток.

Качественно аналогичные результаты о роли ионов в возбуждении были получены при изучении ПД (табл.1). Кроме того, данные рис.2.В. показывают, что ПД высшего растения, так же. как и местная БЭР. состоял из двух составляющих. Однако, если у местных БЭР блокирование Са2*-каналов подавляло первую составляющую, то у ПД - вюрую. Это может объясняться различным характером действия раздражающего фактора. При бесконтактном нагреве, раздражающий фактор - инфракрасное излучение -

являлось проникающим воздействием, приводящим к деполяризации как плазмалеммы, так и тснопласга плеток, поэтому вторая составляющая, связанная у водорослей с возбуждением тонопласта (Денеш. 1980; Плакс и др., 1987). развивалась в неизменном виде. При регистрации ПД раздражающим фактором являлись местные токи, деполяризующие плазмалемму, что и приводило к сохранению первой составляющей, и исчезновению второй. В этой связи можно заметить, что реакция на смачивание состояла преимущественно из одной первой составляющей, что объясняется, вероятно, возбуждением в первую очередь плазматических мембран эпидермальных клеток.

Таким образом, механизм формирования местных и распространяющихся двухкомпонентных реакций одинаков, и в основном соответствует установленному ранее для водорослей (Берестовский и лр.. 1987) и высших растений (Опритов и др.. 1968).

2.2. Изменения биоэлемрической активности под влиянием

онтогенетических факторов

Изучение онтогенетических изменений биоэлектрической активности начали с дневной динамики, учитывая её негативное влияние на воспроизводимость результатов последовательно проводимых опытов.

Биоэлектрическую активность растений характеризовали двумя параметрами: амплитудой реакции Аъ и скоростью реполяризации V, которую представляли, как отношение 1/2 или 2/3 величины амплитуды второй составляющей к промежутку времени от её максимума, до снижения на половину или на две трети (рис.2. А).

Перечисленные параметры имели выраженный временной ход; амплитуда и скорость реполяризации БЭР в течение почти всего светового дня возрастали, и через 14-5-16 часов выходили на стационарный уровень. Отправной точкой для запуска дневных изменений служил переход от i ючного режима к дневному, при этом режимы температуры и освещения оказывали независимое влияние соответственно на величины амплитуды и скорости реполяризации БЭР (рис.3).

2.2.1 .ТЕРМОИНДУ ЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

Влияние изменения температуры на величину амплитуды 6ЭР было парадоксальным: повышение температуры при переходе от ночного режима к дневному приводило к гюдавле! мю реакций (рис.3.А), а снижение температуры - к их стимуляции (рис.2.И).

10090.

60-

"§ 70

и

605040-

У

л

А-

~~I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г"

8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19

Время суток, ч.

1.00.9. 0.8-

лО.б->

0,5

0.4*1

0.3

0.2 Ч

т-г

б 7

—I-1-1-1-1-1-1 | 11-1" I

8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 Время суток, ч.

Рис. 3. Изменения амплитуды БЭР (А) и скорости реполяризации (Б) в течение дня после включения освещения в условиях постоянной . дневной температуры (I). и после смены температуры в условиях постоянного освещения (2). Время смены режимов - б00.

Непосредственная причина температурной зависимости амплитуды была связана с функционированием участвующих в возбуждении ионных каналов, на что указывало возрастание плотное! и деполяризующего тока в условиях пониженной температуры, определенное по увеличению крутизны нарастания переднего фронта БЭР (рис.2.А,И). Снижение температуры при блокировании К* и Саг* каналов в обоих случаях приводило к относительному возрастанию амплитуды (табл.2). что исключало их участив в термоинлуцированном увеличении амплитуды. Блокиронание же анионного тока в этих условиях устраняло явление возрастания амплитуды БЭР, и следовательно, оно было обусловлено либо увеличением числа активированных анионных каналов, либо изменением их свойств. Для увеличения числа активированных анионных г каналов необходимо дополнительное поступление Са2* в цитоплазму (Берестовский и др., 1987), а поскольку наблюдалось возрастание амплитуды БЭР и при блокировании Са2*-ка| 1алов. то Эффект скорее всего был обусловлен изменением свойств анионных каналов. Отсюда можно сделать вывод, что в течение дня происходило первоначальное уменьшение их активности в связи с ростом температуры, с последующим адаптивным ее увеличением. Кроме того, различная температурная зависимость деполяризующего и ре поляризующего ионных токов указывает на то, что действие температурного раздражителя является специфичным в отношении их вклада в формирование БЭР.

Включение освещения при переходе от ночного режима к дневному вызывало увеличение скорости реполяризации (рис.З.Б), замедленной в темноте (рис.2.Л). Влияние освещения могло состоять в стимуляции активного ионного транспорта, участвующего в реполяризации реакций возбуждения у растений (ТгеЬасг е1 а!.. 1989; Пятыгин и «р., 1990), или а модуляции светом состояния ионных каналов мембран (Денеш и др., 1984).

Ингибитор Н' АТФазы ДЦКД вызывал задержку реполяризации на конечном её этапе (при снижении амплитуды на 2/3 от максимальной, табл.2, рис.2.Е), что свидетельствовало об участии активного ионного транспорта в этом процессе, но исключало участие Н'-АТФазы в замедлении реполяризации в темноте, имевшем место уже на начальном этапе. Это замедление не было связано и с работой калиевых каналов, обеспечивающих ре поляризующий ионный ток, т.к. эффект их блокирования, помимо задержки реполяризации. состоял также и в увеличении амплитуды БЭР. в то время, как

запержка реполяризации в темноте не сопровождалась изменением амплитуды (рис.2.Л).

Таблица 2

Влияние С локаторов ионных каналов и ингибитора Н*-АТФазы на параметры БЭР в различных температурных условиях

Вариант 26" 18°

А-|. мВ У1/2- мВ/с Уг/з- мВ/с Аь мВ мВ/с

Контроль 99.2*5.4 1.086*0.052 0.850*0.041 132.6*6.9 0.331*0.022

Ва2* 117.4*6.9 0.328*0.021 - 141.3*7.1 0.303*0.020

Са2*/Мд2+ 32.5*4.1 0.960*0.045 - 92.6*5.4 0.246*0.019

ЭК 41.7*3.9 0.736*0.035 - 66.8*6.1 0.341*0.025

ДЦКД 97.1*5.3 1.075*0.052 0.335*0.023 130.3*6.8 0.318*0.023

Примс^ашугРсгксярмто параметров при 18° проводили через час после снижения температуры. \/1/2 - скорость реполяризации при снижении амплитуды торой составляющей на 1/2; \/т - на 2/3; Са2*/ Му2+ - замена Са2* на Мд2+ в питательной сроде.

Из данных табл. 2 следует, что помимо блокирования К*-тока, замедление реполяризации вызывало также снижение температуры, что может объясняться уменьшением скорости движения ионов через мембраны в этих условиях. Однако, замена Са2* на Мд2* в среде в этом случае, приводила к весьма значительной задержке реполяризации, подобно тому, как это имело место в темноте при обычной дневной температуре (рис.2.К,Л). Известно, что подобный эффект является следствием предотвращения ионами Мд2+ инактивации Са2+-активируемы:< анионных каналов при увеличении отношения концентраций [Мд2+]/[Саг4] в растворе, и не сопровождается изменением амплитуды реакций (Катаев и др., 1986). Сходство кинетики развития БЭР в темноте, также не сопровождавшейся изменением амплитуды, позволяет предположить, что оба эти явления имели обшую причину - отсутствие инактивации анионного тока. Следовательно, фаза реполяризации БЭР включала в себя процесс инактивации анионного тока кальцием, а дневной ход скорости реполяризации отражал изменение инактивационных характеристик этого тока под влиянием освещения.

Постепенный характер возрастания скорости реполяризации в течение светового дня предполагал её связь с процессом фотосинтеза, что могло

достигаться посредством действия какого-либо фотосинтетического интермедиата. В этой роли могли выступать, например, НАДФН или АТФ, регупяторная роль которой в активации ионных каналов растительных клеток известна (Kateuhara et al., 1990).

Р Р Я ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ БЭР С ВОЗРАСТОМ РАСТЕНИЙ

Наши исследования показали, что помимо суточной динамики, параметры БЭР подвержены возрастным изменениям. Амплитуды А, и А2 (мВ) увеличивались соответственно от 5.5±2.2 и 22.5±3.5 в возрасте 5 сут., до 132.3±6.9 и 113.016.6 в возрасте 21 сут., но с различной скоростью: до 10-суточного возраста амплитуда второй составляющей была выше, чем первой, а затем наоборот.

Увеличение силы раздражения в возрасте 7 суток приводило к относительному возрастанию амплитуды второй составляющей БЭР. Однако, даже в случае видимого повреждения от ожога, амплитуда реакций не превышала величины, достигавшейся уже в 11-суточном возрасте при неповреждаюшем воздействии. Отсутствие способности клеточных мембран к значительной деполяризации указывало на то, что на начальных этапах развития растений еще не сформированы ионные градиенты, разрядка которых обеспечивает генерацию БЭР. Известно, что становление системы активного ионного транспорта и его интенсивность возрастают, начиная с момента достижения клетками определенной степени дисрференцировки и вакуолизации (Мазель. 1989).

Повышение влажности воздуха до 90-95%, и снижение температуры вплоть до 12°. не приводили к какому-лиОо возрастанию амплитуды БЭР в 7-суточном возрасте. Поскольку эти воздействия активировали ионные потоки при возбуждении клеток, то можно сделать вывод о нессрормированности возбудимых структур мембран на начальных этапах развития растений. Резкое возрастание амплитуды первой составляющей БЭР в возрасте 10-11 суток, связанное с трансформацией её формы в импульсную, подтверждает это предположение.

Таким образом, изучение закономерностей формирования БЭР позволило выявить зависимость их параметров от действия раздражителя, условий минерального питания, дневной и ночной температуры, интенсивности и продолжительности освещения, влажности воздуха, возраста растений, и времени суток.

-183. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ ХОЛОДОУСТОЙЧИВОСТИ

Установленные закономерности предоставляли возможность для использования параметров БЭР в диагностических целях. При этом устойчивость рассматривали, как способность поддерживать функциональную активность мембран в стреосовых условиях (Удовенко, 1976). Для выявления этой способности использовали фиксацию температурной нагрузки, т.е. резкое снижение температуры до заданного уровня, с последующим его сохранением. Такое воздействие приводило не только к разрядке накопленных ионных градиентов, но и задавало специфические условия функционирования мембран.

3.1. Биоэлектрическая активность в условиях фиксации

температурной нагрузки

Экспонирование растений при резком снижении температуры воздуха (с 26 до 8°) приводило к возникновению импульсной деполяризации, с последующей замедленной реполяризацией в течение 15-20 мин (рис.4). Фазу деполяризации, т.е. параметр амплитуды, не имело смысла использовать для диагностики, т.к. она относилась к неспецифической части реакции. В связи с этим исследовали фазу реполяризации, которую характеризовали величиной, обратной её скорости: значением разности потенциалов через 5 мин. после начала охлаждения (РП5).

Значения амплитуды БЭР с возрастом увеличивались, а РП5 -уменьшались, т.е. несмотря на рост деполяризации, скорость реполяризации возрастала. Изменения обоих параметров в течение дня были аналогичными: амплитуда и скорость реполяризации возрастали, а при постоянных внешних условиях сохранялись без изменений.

Анализ значений РГЦ на соответствие теоретическому распределению по

критерию х2 показал, что в течение светового дня они распадались на три . независимые выборки, соответствующие утренним, дневным и вечерним часам. Это свидетельствовало о существовании независимых механизмов, обеспечивавших процесс реполяризации. Группировка данных пр ;рем выборкам показала, что их средние значения и коэффициенты вариации были различными: в утренние часы они составляли соответственно 92.1 мВ и 4.1%; в тевные-71.5 мВ и 10.0%; в вечерние - 55,5 мВ и 5.1% (рис.4). Очевидно, первый механизм, определявший максимальный уровень РП5 в утренние часы, был обусловлен уже рассмотренным явлением задержки инактивации анионных каналов. К середине светового дня рсполяризация ускорялась, и

значения РП5 соответствовали этапу включения в ход реполяризации

активного ионного транспорта. Максимальный коэффициент вариации значений РП5 в это время указывал на одновременное действие различных механизмов реполяризации. В вечерние часы величины РП5 были минимальными, свидетельствуя о быстром прохождении первых двух этапов, и выходе РП на стационарный уровень. Значение этого уровня определялось, очевидно, балансом между активным ионным транспортом, и величиной пассивной диффузионной проницаемости мембран, т.е. зависело or состояние липидной фазы и каналов утечки.

Взаимодействие'этих механизмов определяло функциональную активность мембран в стрессовых условиях, и следовательно, отражавший её параметр РП5 являлся косвенным показателем холодоустойчивости. В таком случае, изменения величины РП5 в течение дня отражали дневной ход холодоустойчивости растений. Это явление было известно и ранее: прямыми методами показано, что наименьшей холодоустойчивостью растения обладают в утренние часы (McMillan et al„ 1990), что соответствует и нашим данным.

Отклонения индивидуальных значения РП5 от средней в опыте при повторной записи на одних и тех же растениях успешно воспроизводились: средняя разность между парами соответствующих отклонений составила 0.07±0.3 м В, т.е. была не существенна. Это указывало на то, что способность мембран к реполяризации в стрессовых условиях отражала свойства генотипа.

3.2. Диагностика сортовой устойчивости

Поскольку параметры БЭР зависели от ряда экологических и онтогенетических факторов, необходимо было выяснить их влияние на воспроизводимость значений РП5 в условиях стрессового воздействия, а Также на величину разницы между сравниваемыми сортами.

Фиксация температуры на уровне 11-13* оказывала недостаточно сильное воздействие на мембраны. 8 результате чего реполяризация проходипа достаточно быстро и у неустойчивых к холоду растений. Слишком низкие температуры (3-6°) подавляли реполяризации реакций у всех растений одинаково, и лишь при оптимальной для диагностики температуре 7-9° происходило разделение сортов по их способности к сохранению функциональной активности мембран. Влияние освещения было аналогичным: при низкой освещенности (30 вт-м 2) скорость реполяризации была настолько снижена, что это приводило к сокращению разницы между сортами, а при высокой освещенности (66 вт м-2) даже неустойчивые растения

25 мВ 50 с.

Рис. 4. Кинетика БЭР при фиксации температурной нагрузки в различное время суток. - амплитуда реакции, - вторая волна деполяризации, ДЦ - потенциал действия, РП§ - разность потенциалов через 5 мин. после начала охлаждения в утренние (I), дневные (2), и вечерние (3) часы. 4- разность потенциалов до воздействия. Стрелкой отмечен момент снижения температуры.

$

30 ,

40 ■

50

£ * 60

70

80

^ Весенний салатный

Эстафета Сентябрьский

|Т0А-442

ФОР-205/70 Клинекий белошипый

I

Марфинский

Рис. 5. Шкала холодоустойчивости сортов и гибридов Рр Значения РП^ приведены для стандартизированньтс условий опыта и 13-кратной биологической повторности.

осуществляли реполяризацию быстрее; при освещенности 48 вт м 2 разница между сравниваемыми сортами была наибольшей. Регистрация РП5 в

различном возрасте показала, что разница между сортами имела максимум в возрасте растений 12 суток. Очевидно, мощность систем ионного транспорта с возрастом растений увеличивалась, о чем свидетельствовал рост амплитуды деполяризации, поэтому одно и то же холодовое воздействие подавляло реполяризацию в неодинаковой степени, что и приводило к уменьшению сортовых различий в молодом и старшем возрастах. Исследовали также влияние влажности воздуха перед охлаждением растений. Повышение влажности воздуха до 06% вызывало увеличение значений РП5, с

последующим восстановлением в течение 6-6 час. их прежних величин. Для . устранения неопределенности значений РП5, в дальнейшем влажность

поддерживали равной 60%.

Как следует из приведенных данных, зависимость величины регистрируемых сортовых различии от параметров стрессового воздействия была нелинейна, и имела'минимумы и максимум. Значения опытных факторов, соответствующие этим максимумам и были установлены в качестве стандартных. Совместное влияние факторов приводило к зависимости величины сортовых различий также и от их конкретных сочетаний. Было определено несколько таких сочетаний, оптимальных для оценки холодоустойчивости данного вида растении.

Переходить к диагностике геногипической холодоустойчивости можно было, выяснив минимальный репрезентативный обьем выборки. Величины РП5 для близких гибридов Р, Эстафета и Сентябрьский оказались равными соответственно 41.8±1.7 и 46.811.8 мВ и. следовательно, для сохранения существенных различий между ними допустимо было увеличение доверительных интервалов приблизительно в 1.4 раза, откуда минимальный обьем выборки оказался равным тринадцати. Точность оценки метода составила 2.2±0.2%. Используя в дальнейшем 13-кратную повторность, и стандартизированные условия проведения опыта, была составлена шкала холодоустойчивости сортов и гибридов. Она приведена на рис.5, и включает семь наименований, из которых два являлись соргами-классификаторами с известными свойствами (Тараканов и др., 1992). При составлении шкалы была определена холодоустойчивость гибридов Р, Эстафета, ТСХА-442, и

Сентябрьский. Была уточнена холодоустойчивость сорта ФОР-205/70, считавшегося более устойчивым, а также относительная холодоустойчивость сортов Марфинский и Клинский болошилый, относимых к одному сортотипу.

Определение стандартных условии проведения оценки, а также выяснение характеристик способа позволило считать его разработку практически законченной. Оценка холодоустойчивости сортов и гибридов

подтверждена данными лаборатории овощеводства ТСХА на основании прямых многолетних наблюдений. Для реализации способа необходимо относительно несложное оборудование: высокоомный милливольтметр, стандартные электроды, и климатические камеры, а обработка результатов не требует сложных математических методов. Затраты времени для диагностики единичного растения сотавлякл около 6 мин, что значительно меньше, чем требуется 8 других неповреждающих методах (Воробьев, 1979; Стадник, 1979; Ретивин, 1988). Однако, для получения воспроизводимых результатов требуется полная стандартизация условий подготовки и проведения оценки; кроме того, сами эти условия рассчитаны на растения огурца, и для любой другой культуры должны быть определены заново.

Для увеличения производительности метода необходим ы дополнительные меры: применение бесконтактной многоканальной регистрации с компьютерным управлением и обработкой результатов измерений. Разработка соответствующей аппаратуры позволит использовать такую установку для массовой оценки селекционного материала.

выводы

1. На проростках огурца установлена двухкомпонентная форма местных и распространяющихся БЭР. Предполагается, что формирование компонент связано с возбуждением различных мембран - плазмалеммы и тонопласта клеток. Фаза деполяризации БЭР обеспечивается ионами кальция, при участии анионного тока. Фаза реполяризации включает в себя инактивацию анионного тока кальцием, выходящий ток калия, и активный ионный транспорт на заключительном этапе.

2. Повышение температуры приводит к уменьшению величины деполяризующего анионного тока, а снижение - к его стимуляции. Освещение ускоряет реполяризацию, вероятно вследствие влияния на инактивацию анионного тока. Замена Са2* на Мд2* в наружной среде приводит к блокированию кальциевого тока при возбуждении.

3. Установлено, что смачивание поверхности листа вызывает БЭР, зависящую от функционального состояния растения и влажности воздуха.. Предполагается, что эта реакция обусловлена раздражением плазмалеммы эпидермальных клеток. Последующий дрейф биопотенциалов представляет

собой градуальную деполяризацию клеточных мембран, связанную с испарением контактной жидкости. Возможно использование БЭР на смачивание в качестве тест-воздействия.

4. Суточная динамика параметров БЭР является следствием смены режимов температуры и освещения, влияющих соответственно на величины амплитуды и скорости реполяризации. Для устранения негативного влияния этого явления на воспроизводимость результатов опытов, необходимо выдерживать растения в течение 16+20 час. в неизменных условиях температуры и освещения. Установлено увеличение амплитуды БЭР с возрастом растений, по-видимому обусловленное становлением систем ионного транспорта, и формированием возбудимых структур клеток.

5. Воспроизводимость абсолютных величин параметров БЭР возможна только для конкретных значении факторов температуры, освещенности, влажности воздуха, возраста растений, и условий минерального питания при подготовке и проведении оценки. Зависимость величины сортовых различии от этих факторов нелинейна, и характеризуется наличием минимумов и максимумов. Взаимовлияние факторов приводит к наличию их определенных сочетаний, оптимальных для диагностики.

6. Показателем генотипической и фенотипической холодоустойчивости растений может служить параметр, характеризующий' скорость реполяризации БЭР в условиях охлаждения. Холодоустойчивость растений в условиях фотопериода подвержена суточным изменениям, с минимальными значениями а утренние часы.

7. Установлены разрешающая способность разработанного диагностического метода, минимальный объем выборки, и точность оценки. Составлена шкала холодоустойчивости для семи сортов и гибридов Р, огурца.

Внесены предложения по дальнейшему совершенствованию метода, направленные на проведение массовой оценки.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ЛИССРРТД11ИИ

Паничкин Л.А.. Черницкий М.Ю. Биоэлектрические реакции растений при бесконтактном тепловом раздражении // Электрофизио-логические методы в изучении функционального состояния растений. Сб. науч. тр. ТСХА, М.; 1988. С. 82-90.

2. Паничкин Л.А., Черницкий М.Ю. Дрейф биопотенциалов эпидермальных клеток листа при экстраклеточной регист рации жидкостным электродом // Доп. во ВНИИТЭИагропром. №. 552 ВС-89. 1989. 18 с.

-243. Паничкин Л.А., Черницкий М.Ю. Биоэлектрические реакции опишрмальмых клеток листа при контакте с жидкостным электродом II Деп. во ВНИИТЭИагролром. NF. 553 ВС-89. 1S89.13 с.

4. Паничкин Л.А.. Черницкий М.Ю. Влияние Олокаторов ионных каналов на формирование биоэлектрической реакции проростков огурца И Отчет о НИР. Деп. во ВНТИЦ. №. 02.90.0.015788. 1990. 14 с.

5. Паничкин Л.А., Черницкий М.Ю. Способ оценки функционального состояния растений //А.с. №. 1606015 (СССР), кл. А 01 G 7/00 опубл. 15.11.90. Бюл. №. 42.

6. Паничкин Л.А., Черницкий М.Ю. Исследование контактных явлений при внеклеточной регистрации биоэлектрических потенциалов растений // Ионнный транспорт и усвоение элементов минерального питания растений: 5 Шкопа-семинар, Чернигов, 1988, Киев: 1991. С. 54-58.

7. Паничкин Л.А., Черницкий М.Ю. Биоэлектрическая реакция листа на смачивание//Физиология растений. 199). Т. 38. Вып. 2. С. 371-380.

8. Паничкин Л.А., Черницкий MJO., Буко О.А. Электрогенная разность потенциалов как показатель генотипической специфичности растений // Известия ТСХА. 1S91. Вып. 6. С. 61-80.

9. Паничкин Л.А., Черницкий М.Ю. Способ оценки холодоустойчивости растений огурца И А.с. №. 1701175 (СССР), кл. А 01 G 7/00. опубл. 30.12.91. Бюл. N".48.

10. Черницкий М.Ю.. Паничкин Л.А., Купленский О.Ю. Роль Са2+ в Формировании биоэлектрической реакции листьев огурца II Физиология растении. 1993. Т. 40. №. 2. С. 246-249.