Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК in vitro

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК in vitro"

4856762

ПЕРШИНА АЛЕКСАНДРА ГЕННАДЬЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ФЕРРИТА КОБАЛЬТА И МОЛЕКУЛ ДНК IN VITRO

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

п лмт 7fi11

диссертации на соискание ученой степени- О '

кандидата биологических наук

Новосибирск-2011

4856762

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской

Федерации

Научный руководитель:

д.м.н. Сазонов Алексей Эдуардович

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Загребельный Станислав Николаевич д.х.н., профессор Зарытова Валентина Филипповна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича РАМН

Защита состоится « 2011 года в часов минут

на заседании диссертационного совета Д 003.045.0! при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте \v\vw.niboch.nsc.ru Автореферат разослан « 11г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Бионаногибридные конструкции, содержащие [агнитные наночастицы и молекулы нуклеиновых кислот, представляют огромный нтерес для современной биомедицины, в том числе в области создания ысокочувствительных систем количественного определения и идентификации >рагментов ДНК и РНК-молекул. Это связано с появлением у наночастиц 1 шкальных магнитных свойств, обеспечивающих легкость управления и ффективность детектирования конструкций на их основе, сочетающего омехоустойчивость с возможностью обнаружения диагностически-значимых юлекул в режиме реального времени. Нанометровые размеры конструкций озволяют выявлять единичные молекулы, что значительно увеличивает увствительность анализа. Перспективность использования наночастиц на основе юрритов для создания биомедицинских конструкций обусловлена сочетанием ысоких магнитных свойств, с большей устойчивостью к окислению и иологической инертностью по сравнению с наночастицами металлов. Раскрытие акономерностей взаимодействия нуклеиновых кислот и наночастиц является ервоочередной задачей для развития теоретических и методических подходов к озданию бионанокомпозитных конструкций. Это открывает перспективу правления связями компонентов конструкции, определяют область и границы ее иомедицинского использования. Актуальность исследования взаимодействия (ерримагнитных наночастиц и молекул ДНК продиктована и тем, что лежит в снове воздействия наноматериалов на биосистемы, что напрямую связано с

■ * ■ ' ■ к Г:-

беспечением безопасности и качества жизни человечества в целом. В литературе риводятся данные о высокой адсорбционной активности наночастиц оксидных 1ерримагнетиков относительно молекул ДНК, тем не менее механизмы их заимодействия остаются малоизученными. Заключения о природе формирующихся вязей носят противоречивый характер. Очевидно, что взаимодействие нуклеиновых ислот и магнитных наночастиц может реализовываться за счет нескольких [еханизмов с участием различных групп биомолекулы.

Цель работы изучить взаимодействие суперпарамагнитных наночастиц юррита кобальта, полученных методом механохимического синтеза, и нуклеиновых

кислот, на модели природных и синтетических одноцепочечных и двухцепочечнь молекул ДНК, in vitro.

Задачи исследования:

1. Исследовать закономерности связывания природных и синтетическ1 одноцепочечных и двухцепочечных молекул ДНК и наночастид феррита кобаль-при варьировании рН, ионной силы и химического состава среды;

2. Выявить группы молекул ДНК, участвующие во взаимодействии наночастицами феррита кобальта;

3. Изучить сорбционные свойства и природу активных центров j поверхности частиц нанопорошка феррита кобальта с использованием модельнь молекул;

4. Определить доступность молекулы ДНК, связанной с наночастицаы феррита кобальта, для нуклеазного расщепления;

5. Оценить влияние связывания наночастиц феррита кобальта молекулами ДНК на структуру и функцию биомолекулы;

6. Построить модель взаимодействия компонентов комплекса «ДНК ферримагнитная наночастица».

Научная новизна работы. Впервые показана способность наночасти феррита кобальта, синтезированных методом механохимии, связываться фрагментами природных и синтетических двухцепочечных и одноцепочечных ДН с образованием стабильных комплексов. Определено, что эффективное! связывания и стабильность комплексов при изменении параметров среды (pi ионной силы, химического состава) зависти от нуклеотидного состава биомолекуль Установлено, что связывание молекул ДНК и наночастиц реализуется за счс координации фосфатных групп сахарофосфатного остова и карбонильных груп оснований ДНК атомами переходных металлов на поверхности, и стабилизируете водородными связями. При взаимодействии с одноцепочечными молекулами ДНК связывание с поверхностью наночастицы могут вовлекаться атомы азои гетероциклического кольца. При взаимодействии с природными молекулам двухцепочечных ДНК наночастицы связываются преимущественно с GC-napaMi защищая их от действия рестриктаз. Впервые показано, что в составе комплексов

4

наночастицами феррита кобальта молекулы ДНК не деградированы и могут частично сохранять способность к гибридизации с комплементарными молекулами ДНК. Показана возможность высвобождения молекулы ДНК из комплекса с наночастицами, при этом функция биомолекулы восстанавливается. На основе полученных данных о взаимодействии наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК предложен метод создания и принципиальная схема оригинальной конструкции для выявления диагностически-значимых фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, при наложении внешнего магнитного поля.

Теоретическое н практическое значение работы. В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования суперпарамагнитных наночастиц феррита кобальта, синтезированных методом механохимии, для формирования

магниточувствительных бионанокомпозитных структур. Полученные новые данные о закономерностях взаимодействия наночастиц феррита кобальта и молекул одноцепочечных и двухцепочечных дезоксирибонуклеиновых кислот будут положены в основу реализации подходов к бионаноконструированию при создании новых наноразмерных устройств. Подобные конструкции, созданные на основе суперпарамагнитных наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК, являются перспективными структурами для разработки исследовательских и диагностических инструментов в области молекулярной биологии, медицины и наноэлектроники. Данные, представленные в работе, вносят существенный вклад в понимание механизмов взаимодействия неорганических наночастиц и молекул нуклеиновых кислот, что имеет большое значение для развития представлений о воздействии новых наноразмерных материалов на биологические системы.

Апробация результатов исследования и публикации. По материалам

диссертации опубликовано 8 печатных работ. Материалы, включенные в

диссертацию, докладывались на всероссийских и международных конференциях, в

том числе на 2ой международной конференция «Наноразмерные системы: строение

свойства, технологии» НАНСИС-2007 (Киев, Украина, 2007), 2ой Международной

научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы

биотехнологии» (Казань, Россия, 2008), International Conference on Materials for

5

Advanced Technologies ICMAT 2009 (Сингапур, 2009), Втором Международно конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий в рамках 2\ международного форума по нанотехнологиям «Руснанотех-2009» (Москва, Росси

2009), Third International NanoBio Conference 2010, Zurich (Цюрих, Швейцари

2010).

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литератур] описания материалов и методов исследования, изложения результатов и i обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на И страницах, иллюстрирована 40 рисунками и 6 таблицами. Библиография содеряа 271 литературный источник.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наночастицы феррита кобальта, синтезированные методо механохимии, связываются с молекулами природных и синтетически двухцепочечных и одноцепочечных ДНК и формируют стабильные комплекс! Эффективность связывания и стабильность комплексов при изменении химическо1 состава среды зависит от нуклеотидного состава биомолекулы, и может значителы снижаться в присутствии молекул, конкурирующих за центры координационно1 связывания на поверхности.

2. Взаимодействие молекул ДНК и наночастиц феррита кобальт реализуется за счет координации групп оснований и фосфатных групп остова ДН на поверхности наночастицы и стабилизируется водородными связями. Пр связывании с природными молекулами двухцепочечных ДНК наночастицы феррит кобальта взаимодействуют преимущественно с GC-парами. При взаимодействии одноцепочечными молекулами ДНК в связывание с поверхностью наночастиц наряду с карбонильными группами могут вовлекаться атомы азот гетероциклического кольца.

3. Формирование комплекса с наночастицами феррита кобальт приводит к ограничению доступности ДНК для взаимодействия с другим биомолекулами. Однако взаимодействие не приводит к деградаци полинуклеотидной цепи и при десорбции ДНК с поверхности наночастицы е функция может быть восстановлена.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Связывание фрагментов двухцепочечной природной ДНК и наночастиц феррита кобальта

Для исследования взаимодействия наночастиц феррита кобальта с молекулами ДНК получали седиментационно-устойчивую суспензию наночастиц со средним гидродинамическим диаметром 20 нм в трис-буфере (рН 5,0). По данным спектрофотомерии 1 мг наночастиц феррита кобальта связывался с (0,7+0,02) мкмоль (в расчете на н.о.) фрагментов двухцепочечной ДНК, что приводило к формированию бионанокомпозитного комплекса.

Согласно модели Штерна адсорбция групп биомолекул на поверхности частиц может происходить с формированием внешне- (с участием электростатических взаимодействий) или внутрисферных комплексов, за счет прямой координации с отдельными атомами металла. Характер экспериментально полученной изотермы адсорбции фрагментов двухцепочечной геномной ДНК на наночастицах феррита кобачьта (рис. 1) свидетельствует об очень высоком сродстве ДНК к поверхности частиц, что характерно для образования внутрисферных комплексов.

С целью выяснения природы формирующихся связей между наночастицей и молекулой ДНК исследовали образование комплексов при варьировании параметров среды: ионной силы, рН, химического состава (рис. 2).

Рис. 1 - Изотерма адсорбции Рис. 2 - Влияние химического состава фрагментов геномной ДНК на среды на связывание фрагментов наночастицах феррита кобальта, 10 геномной ДНК и наночастиц феррита мМ трис-буфер (рН 5,0) кобальта; ^-статистическая значимость

отличия от связывания в 10 мМ трис-буфере (рН 5,0)

Повышение ионной силы раствора до 1 М не влияло на количеств связываемой с наночастицами ДНК, что позволяет исключить ведущую рол электростатических взаимодействий в связывании. Снижение количеств; связывающихся с наночастицами молекул при повышении рН среды до 7,4 на 9 °/ указывает на определенную роль процессов протонирования фосфатных групп ДН и/или поверхности наночастиц и, соответственно, водородных связей в взаимодействии. Значительное снижение (на 56 %) количества ДНК, связываемой наночастицами, в присутствий фосфат-анионов свидетельствует о высоком сродств фосфатных групп к поверхности наночастиц. Наблюдаемое концентрационнс зависимое снижение связывания ДНК с наночастицами в присутствии имидазол; блокирующего образование координационных связей, позволяет предполагат преимущественно координационное взаимодействие (рис. 3).

0.7 2 0.6 ^ 0.5

л 0.3 с?

I °'2 I од о

Рис. 3 - Влияние имидазола на связывание фрагментов геномной ДНК с наночастицами феррита кобальта (рН 5,0)

100 200 300 400 500 600 [имидазол], мМ

Исследование стабильности полученного комплекса при варьировани параметров среды, а так же воздействии химических веществ, обладающи потенциальной активностью в направлении разрушения связей его компоненте! показало, что инкубация в растворе хлорида натрия с концентрацией от 0,1 до 1 № трис-буфере со значением рН от 5,0 до 9,0 не приводила к разрушению связи ДНК наночастица. Высокий уровень десорбции ДНК с поверхности наночастт наблюдаемый в натрий-фосфатном буфере (рис. 4), обусловлен конкуренцие фосфатных групп за центры связывания на поверхности наночастиц. Учитывая, чт связывание с наночастицами может приводить к возникновению конформационног напряжения молекулы, анионы, образующиеся при диссоциации фосфата натри* имеющие меньшие размеры и очень высокое сродство к поверхности, способш активно вытеснять функциональные группы ДНК.

0.5 I 0.4

0.3

о г

а §

! 0.1

Рис. 4 - Зависимость десорбции фрагментов геномной ДНК с поверхности наночастиц феррита кобальта от концентрации №2НР04 (рН 7,4)

5 10 15 20 25 [№21!Р04], мМ

Оценка методом гель-электрофореза показала, что при концентрации ЭДТА 50 мМ порядка 50 % ДНК десорбировалось с поверхности наночастиц. Эффективное разрушение связей компонентов бионанокомпозита в результате инкубации в среде с ЭДТА, обладающего высокой склонностью к образованию хелатных комплексов с атомами переходных металлов, свидетельствует в пользу значительной роли координационных взаимодействий между группами ДНК и атомами металла на поверхности наночастиц в связывании.

Данные ИК-спектрометрического исследования комплекса (рис. 5) показали, что при связывании фосфатные группы ДНК координируются на поверхности наночастиц, на что указывает сближение п.п. симметричных и асимметричных колебаний фосфатной группы, относительно п.п. в спектре нативной ДНК (от 1224 к 1218 см'1 и от 1084 к 1086 см4).

ГШ

О.-О

и

1«» 141X1 1200 НХХ1 ™

БЭЛНЭВОГ ЧИСЛО, сы"'

171X1 15 (XI

В0ЛК0В9С числа, см'1

Рис. 5 - Фрагменты ИК-спектров наночастиц феррита кобальта (а), ДНК (Ь, с1), бионанокомпозитного комплекса ДНК-

наночастицы феррита кобальта (с, е) в бидистиллированной (Н20) и

дейтерированной (ОгО) воде

Увеличение интенсивности колебаний при 1665 см"1, свидетельствует о вовлеченности атомов гетероциклических колец оснований во взаимодействие с наночастицами. Дательное исследование изменения положения п.п. колебаний групп оснований в области 1800-1500 см"1 в Э20 (рис. 5, с!, е), показало, что во взаимодействии участвуют карбонильные группы гетероциклов, на что указывает изменение положения п.п. при 1658 (02 цитозина) и 1703 см"1 (Об гуанина). Присутствие в спектре комплекса ДНК-наночастицы п.п. при 1642 см"1, свидетельствует о том, что разрыва АТ-пар не происходит, тогда как в связывание вовлекаются преимущественно СС-пары. Отсутствие изменения положения п.п. при 1528 и 1486 см"1 позволяет исключить участие атомов азота гетероциклов в связывании.

Формирование комплекса ДНК-наночастицы сопровождается исчезновением п.п. координированных на поверхности феррита кобальта карбонатных групп (в области 1500-1300 см"1), что является следствием их вытеснения группами молекулы ДНК.

Отметим, что ДНК, в комплексе с наночастицами, преимущественно сохраняет двуспиральное строение и относится к В-типу, на что указывает положение п.п. фосфата при 1086 см"1 и 1224 см"1, а так же колебаний связей дезоксирибозы в С2'-эндо-анти-конформации (при 1378 и 1422 см"').

Наблюдаемые изменения ИК-спектра ДНК, входящей в состав бионанокомпозита, характерны для нуклеиновых кислот, вступающих в координационное взаимодействие с ионами переходных металлов. По данным литературы Ш-атомы пуринов являются наиболее предпочтительными лигандами для связывания с переходными металлами. Преимущественное участие кислородных атомов в координационном взаимодействии с наночастицами может быть следствием дефектности решетки наночастиц феррита кобальта по кислороду, обусловленной спецификой их синтеза.

2. Связывание синтетических молекул ДНК и наночастиц феррита кобальта

При исследовании взаимодействия наночастиц феррита кобальта с синтетическими олигонуклеотидами различного состава установлено, что эффективность адсорбции молекул на наночастицах, в том числе при изменении рН, ионной силы и химического состава среды, значительно варьирует в зависимости от нуклеотидного состава (рис. 6). Наиболее эффективно в трис-буфере с наночастицами феррита кобальта связывались олиго(<Ю)|8 и олиго^С)!8 - (43,0±0,5) и (39,2±1) нмоль/мг соответственно, тогда как для олиго(с1А)18 наблюдали наиболее низкое связывание (24,3±0,4) нмоль/мг, для олиго(с1Т)18 данный показатель составил 31,0±0,7 нмоль/мг, для гетероолигонуклеотида олиго(с!АбсЮ6с1С4с1Т2) -28,5±0,6 нмоль/мг.

----- Рис. 6 - Связывание наночастиц

феррита кобальта с молекулами 18-мерных синтетических

одноцепочечных олигонуклеотидов при изменении химического состава среды; * - статистическая значимость отличия от связывания

олигонуклеотида в трис-буфере (рН 5,0), @ - статистическая значимость отличия от связывания олиго(ёА)18, $

О 10 мМ трис (5.0) о 10 мМ трис (7,4) . 0ЛИГ0((1С))8, & - OЛИГO(dG),g, # -

Ш0.4ММаС1. 10 мМ трис (5.0)_■ 20 мМ N»,№'0., ГО мМ трис (5,0) 4 4 /Д

олиго(сГГ)18, 0 - олиго(йАг^О60С4аА2).

Отметим, что в отличие от фрагментов природной двухчепочечной ДНК повышение ионной силы приводило к снижению количества связываемых с наночастицами молекул для всех исследуемых групп одноцепочечных олигонуклетидов на 6-36%. Повышение рН трис-буфера до 7,4 влияло только на количество связываемых молекул олиго(с1С)|8.

В присутствии фосфата натрия в инкубационной среде наблюдали значительное снижение количества связываемых с наночастицами молекул всех исследуемых групп одноцепочечных олигонуклетидов: на 86-92 % для олиго(с!А)18, олиго(сГГ)18 и олиго(с!Аб(10бс1С,,с1Т2), в то время как для олиго(сЮ)18 и олиго(с1С)]8 эффективность связывания снижалась лишь на 51 и 54 %, соответственно.

11

□ 10 мМ трис (5,0) о 10 кМ трис (7,4) И 0,4 М N80. 10 мМ трис (5,0)_■ 20 мМ .^а.НЮ,, ГО мМ трис (5.0)

Повышение концентрации имидазола в среде концентрационно-зависим снижало связывание олигонуклеотидов (рис. 7), как и в случае двухцепочечно ДНК, что свидетельствует о координационной природе формирующихся связей.

.о,

^0.4 о

¿0.3

Й0.2 о

¡0.1

50 100 150 200 [имидадол], мМ

Рис. 7 - Влияние имидазола на связывание олиго(с1А7сЮ5сЮ4с1Тз) с наночастицами феррита кобальта (рН 5,0)

Результаты сравнения связывания 18ти и 80ти мерных одноцепочечных ДНК показали, что длина молекулы не влияет на эффективность связывания ДНК с наночастицами (рис. 8).

При исследовании связывания ДНК-дуплексов, полученных в результат гибридизации гомоолигонуклеотидов, установлено, что в расчете на молекулу дл олиго(ёС)18 и олиго(<Ю)18 объединение в пару привело к снижению количеств; связываемых молекул, тогда как при формировании дуплекса олиго(с!А11Т)1. количество связываемых молекул олиго(с!А)|8 возросло, в то время как олиго^Т)^ снизилось (рис. 9). Наблюдаемый эффект свидетельствует о значительной ролг структуры молекулы ДНК при взаимодействии с наночастицами.

Рис. 8 - Связывание наночастиц феррита кобальта с молекулами 18-и 80-мерных одноцепочечных ДНК, трис-буфер (рН 5,0); @ статистическая значимость отличия от связывания поли(ёА80), $ -поли(с1С8о), # - поли(сГГ80)

Рис. 9 - Связывание наночастиц феррита кобальта с молекулами одно-и двухцепоченых ДНК (8 мМ трис, 30 1 шМ ЫаС1, 1шМ На2НР04); *-статистическая значимость отличия от связывания одноцепочечных

олигонуклеотидов, входящих в дуплекс

Отметим, что вС-содержащая ДНК значительно эффективнее связывалась с наночастицами, чем АТ-содержащая.

Анализ изменения ИК-спектров олигонуклеотидов при связывании с наночастицами подтверждает участие атомов оснований во взаимодействии с поверхностью наряду с атомами фосфатных групп (рис. 10). При взаимодействии олиго(ёА)18 в связывании участвует N7 атом (непрямое) и ЫН2 группа основания, олиго((1С)18 - 02 атом и 1ЧН2 группа, олиго(с1Т)18 - карбоксильные кислороды гетероцикла. При образовании комплекса наночастиц с олиго(£Ю),8 во взаимодействие вовлекается Об и N7 атомы (непрямое), при этом одновременное участие фосфатных групп и гетероциклического кольца нуклеотида в связывании приводит к изменению конформации дезоксирибозы с анти- на син (рис. 10).

он г Л, НО

п

ь Д? V 1!

I, 1 ^ ./1 11 •1 1 "мГ

0Л1ГГ0(<1А)18

|11>

к ?

-1« ,./? к и 1! I! щу

11 Я , К

1)0 ; I ^ ^ „т 1Г« 1.-.* 1.40 - - Т'л I 1 И'М ■ | <■■'<

олнго(с1С)|а

во к 1\ ■ИЧ ( \ ИЛ 1 £ л 1 4 - и •

олиго(сЮ)1з

0ЛИГ0(с1Т)!5

Рис. 10 - Фрагменты ИК-спектров олигонуклеотидов (а, с) и их комплексов с наночастицами феррита кобальта (Ь, (1) в бидистиллированной (Н20) и дейтерированной (020) воде

Наблюдаемая специфика взаимодействия олигонуклеотидов различного состава позволяет предположить, что присутствие С=0 и NH2 групп в гетероциклическом кольце цитозина и гуанина способствует формированию более выгодных связей с наночастицами. Однако анализ закономерностей взаимодействия гетероолигонуклеотида с наночастицами, как модели, например, олиго^А)^ последовательности с внесенными основаниями гуанина и цитозина, позволяв-предполагать, что важную роль при взаимодействии играет вторичная структур! молекулы и в формирование координационной сферы металла могут вовлекаться атомы соседних оснований олигонуклеотида. Так, расчет площади посадочной площадки ДНК-молекул показал, что площадь, занимаемая молекулами олиго(сЮ)]8 и олиго(с1С)18 на поверхности наночастицы на 22-28 %, а для nonn(dC)80 на 37°/ меньше площади линейной молекулы. Это можно рассматривать как свидетельство определенной «упаковки» молекулы на поверхности.

3. Исследование сорбционных свойств поверхности частиц нанопрошка феррита кобальта с использованием модельных молекул

Природа активных центров, присутствующих на поверхности наночастиц, будет определять группы молекулы ДНК, преимущественно вовлекаемые вс взаимодействие. На рис. 11 представлены результаты сорбционных измерений н< границе раздела газ - твердое тело методом термопрограммируемой хемосорбции. Наблюдаемая десорбция в области температур до 150 °С может быть отнесена к

физически адсорбированным формам молекул NH3 и С02, в то время как более высокие температуры десорбции наблюдаемые для молекул СО и С02 свидетельствуют о хемосорбированном состоянии. Можно заключить, что молекулы аммиака слабо взаимодействуют с поверхностью ферритг кобальта, в то время как оксиды углерода СО и С02 связываются более прочно.

Рис. 11- Десорбция с поверхности нанопорошка феррита кобальта молекул газов - ЫН3 (а), СО (Ь) и С02 (с)

При исследовании методом ИК-спектрометрии сорбции на нанОчастицах феррита кобальта молекул ДЭФ, наблюдали уменьшение разности между частотами валентных асимметричных и симметричных колебаний фосфатной группы ДЭФ, что юзволяет сделать вывод о ее бидентантной координации на поверхности. Аналогичный сдвиг полос поглощения Р02 группы проявляется в спектре ДНК, при :вязывании с наночастицами феррита кобальта (табл. 1).

Образец vasP02, см"1 vsP02, см"1

ДЭФ (вода) 1198 1077

1ЭФ+СоРег04 1155 1089

ДНК (вода) 1224 1084

3HK+CoFe204 1218 1086

Табл. 1 - Смещение положения п.п. фосфатной группы молекул при взаимодействии с наночастицами феррита кобальта

4. Исследование доступности молекул ДНК, связанных с наночастицами, (ля ферментов (нуклеаз)

Способность нуклеаз гидролизовать связи в молекуле ДНК определяется деступностью определенных групп атомов нуклеиновой кислоты для 1заимодействия с молекулой белка. Связывание ДНК с наночастицами может фепятствовать ферментативному расщеплению молекулы.

При электрофоретическом анализе продуктов ферментативной деградации тблюдали неполный гидролиз ДНК плазмиды pBLSK, связанной с наночастицами феррита кобальта, эндонуклеазой DNase I (рис. 12, дор. 2).

Сравнение эффективности гидролиза нуклеазами (DNase 1 и экзонуклеазой III) VT- и GC-содеражащих дуплексов, связанных с наночастицами, показало, что )лиго(с1Ас1Т)80 молекулы подвергались полному гидролизу (рис. 12, дор. 7, 8), тогда сак олиго(сЮс1С)18 практически не повергались ферментативной деградации при тех ке условиях (рис. 12, дор. 12, 13). В резуш.тате гидролиза плазмиды pBLSK эесгриктазами: Msp 1, Vsp 1, Fau I установлено, что доступность GC- и ДТ-сайтов лолекулы ДНК, связанной с наночастицами, различалась. При ферментативном •идролнзе плазмиды, связанной с наночастицами, ферментом Vsp I, имеющим сайт ,'знавания 5'-АТАТААТ-3\ на электрофореграмме выявляли фрагменты. :оответствующие нативной и рестриктированиой плазмидиой ДНК (рис. 13, дор. 3).

1000

3000

500

100

М 3 4 5 б 7 8

9 Ю II Г2 13

1,5% агарозный гель

1,5% агарозный гель

20% ПААГ

Рис. 12 - Электрофореграммы продуктов гидролиза свободных и связанных с наночастицами феррита кобальта молекул ДНК нуклеазами; М - маркер молекулярного веса, К - pBLSK; 1 - pBLSK + DNase I; 2 - pBLSK-CoFe204 + DNase I (элюция 50 мМ ЭДТА); 3 - олиго(с!Ас1Т)80; 4 - nojiH(dAdT)80) гидролизованная DNase I; 5 - поли(с1Ас1Т)8о, гидролизованная экзонуклеазой III; 6 -поли(ёАёТ)80, отделенная от частиц (50 мМ ЭДТА); 7 - no;iH(dAdT)80-CoFe2O4 + DNase I (элюция 50 мМ ЭДТА); 8 - nonH(dAdT)8o-CoFe204 + экзонуклеаза III (элюция 50 мМ ЭДТА); 9 - олиго(сЮс1С)18 + DNase I; 10 - onHro(dGdC)18 + экзонуклеаза III; 11 - ojuiro(dGdC)ls, отделенная от частиц (50 мМ ЭДТА); 12 - I oлигo(dGdC)]8-CoFe204 + DNase I (элюция 50 мМ ЭДТА); 13 - oлигo(dGdC),8-CoFe204 + экзонуклеаза III (элюция 50 мМ ЭДТА).

Тогда как рестриктазы, имеющие GC-сайт узнавания: Msp I (5'-CACGG-3') i Fau I (5'-CCCGC(N)4A-37-3'-GGGCG(N6)A-5') - ДНК, в комплексе с наночастицами не гидролизовали (рис. 13 дор. 6 и 8). Для проверки возможного ингибирования 1 наночастицами феррита кобальта ферментативной активности Msp I и Fau I, | рестрикцию соответствующими ферментами проводили в реакционной смеси содержащей избыток плазмидной ДНК (200 нг) и наночастицы феррита кобальте (240 нг) или комплекс плазмида-наночастицы. Во всех экспериментах плазмидная ДНК успешно гидролизовалась в данных условиях.

Важно отметить, что в результате обработки плазмиды, высвобожденной иг комплекса с наночастицами PBS-буфером, ферментом Msp 1 наблюдали исчерпывающий гидролиз молекулы ДНК с образованием набора фрагменте! ожидаемой длины (рис. 13 дор. 7). Следовательно, связывание с наночастицами не I приводит к необратимым изменениям субстратных, в первую очередь структурных, свойств молекулы плазмиды и не вызывает деградации молекулы ДНК.

Рис. 13 - Электрофореграммы свободной и связанной с наночастицами ДНК плазмиды pBLSK и продуктов ее гидролиза (1,5 % агарозный гель); M - маркер молекулярного веса, К - pBLSK; 3 - pBLSK-CoFe204 H- Vsp I (элюция 50 мМ ЭДТА); 4 - pBLSK + Vsp l; 5 - pBLSK + Msp 1; 6- pBLSK-CoFe204+ Msp I (элюция 50 мМ ЭДТА); 7 - pBLSK, отделенная от частиц PBS-буфером + Msp I; 8 - pBLSK-CoFe204 + Fau [ (элюция 50 мМ ЭДТА); 9 - pBLSK + Fau I

Наблюдаемое различие в эффективности гидролиза по AT- и GC-сайтам указывает на преимущественное связывание наночастиц с GC-парами молекулы ДНК, что приводит к стерическим затруднениям для работы фермента, тогда как АТ-пары ДНК практически не вовлекаются во взаимодействие с наночастицами. Это хорошо согласуется с данными ИК-спектрометрических исследований комплекса молекул ДНК и наночастиц. Наблюдаемое замедление гидролиза плазмиды, входящей в комплекс с наночастицами, ферментом Vsp 1 по АТ-содержащим сайтам обусловлено, вероятно, зависимостью скорости работы фермента от правильности структуры нуклеотидных пар прилегающих к сайту узнавания.

5. Влияние взаимодействия с наночастицами на целостность и функциональные свойства ДНК

Интегральной характеристикой позволяющей оценить эффекты, оказываемые

I

наночастицами на молекулу ДНК в результате их взаимодействия, может служить проверка функциональных свойств ДНК.

При исследовании способности онДНК, закрепленных на поверхности наночастиц к гибридизации с комплементарной ДНК в растворе установлено, что только комплексы содержащие поли(сГГ)80, эффективно связывали и удерживали

иоли(с1Л)8о, в то время как поли((1С)8о и олиго(сЮ)18, закрепленные на наночастица? не удерживали данные молекулы (рис. 14). Отметим, что полученное соотношени поли(0Т)8о - CoFe204 : поли(ёА)80 в пересчете на молекулу полинуклеотида равно 1:4 указывает, что более 75 % оснований «недоступно». Это может быт обусловлено либо их вовлечением во взаимодействие с поверхностью и/ил стерическими ограничениями.

Рис. 14 - Эффективность связывания поли(0А)80 из раствора с поли(ёТ)80, закрепленном на наночастице феррита кобальта

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 [поли((1А8о)], мкмоль / л

В следующей серии экспериментов влияние связывания с наночастицами н функцию ДНК оценивали по способности плазмиды pBLSK трансформироват прокариотические клетки. Установлено, что ДНК в комплексе с наночастицами н трансформировала клетки Е. coli. Для исключения возможности повреждающи: эффектов на молекулу ДНК, таких как разрывы и деградация, в результат взаимодействия с наночастицами, были проведены эксперименты, в которых качестве вектора трансформации использовали плазмиду, отделенную о наночастиц PBS-буфером после связывания. Отделенная от наночастиц плазмид успешно трансформировала клетки Е. coli. Более того, такой же уровен трансформации достигался при использовании в качестве вектора плазмиды высвобожденной после обработки комплекса рестриктазой Msp I (табл. 2).

Табл. 2 - Эффективность трансформации клеток Е. coli XL 1-blue свободной i

ДНК-вектор Количество колоний

рВЬБК (контроль) 10

рВЬЭК, связанная с наночастицами 0

рВЬ8К, отделенная от наначастиц РВ8-буфером 10 2

рВЬБК, отделенная от наначастиц РВБ-буфером, после инкубации с МБр! 102

18

Снижение количества трансформантов, по сравнению с контролем, связано с тем, что при выдерживании в элюирующем буфере десорбируется не вся ДНК от наночастиц (по данным спектрофотометрических исследований - 58 %).

Неспособность плазмиды связанной с наночастицами трансформировать клетки Е. coli может быть обусловлена следующими альтернативными причинами: либо комплекс не проникал в клетки, либо генетическая информация (устойчивость к антибиотику) не реализовывалась, вследствие недоступности молекулы ДНК для ферментов репликации и транскрипции. Второе предположение хорошо согласуется с данными о значительном снижении доступности ДНК, связанной с наночастицами, для эндонуклеаз. Таким образом, при отделении молекулы ДНК от наночастиц ее функция может быть восстановлена, связывание с наночастицами обратимо и не вызывает деградации молекулы.

6. Модель комплексов ДНК-СоРе204 и схема диагностической конструкции

На основании совокупности полученных данных нами предложена модель комплекса, формирующегося в результате взаимодействия наночастиц феррита кобальта, полученных методом механохимического синтеза, и молекул синтетических и природных ДНК. При взаимодействии атомы переходных металлов, присутствующие на поверхности наночастиц, координируют атомы фосфатных групп и карбонильные кислороды гетероциклических оснований молекулы ДНК с образованием внутрисферных комплексов. Связывание стабилизируется взаимодействиями N-H (МН2) и Р-ОН групп с поверхностью наночастицы. При взаимодействии с одноцепочечными молекулами ДНК в связывание могут вовлекаться так же атомы азота пуринового кольца. Эффективное связывание с поверхностью наночастицы реализуется в области GC-трактов двухцепочечных молекул при одновременном участии атомов оснований и фосфатных групп ДНК во взаимодействии; при связывании с одноцепочечными молекулами в формирование координационной сферы вовлекаются атомы соседних оснований, что обуславливает значительную роль вторичной структуры молекулы.

Результаты проведенных исследований позволили предложить метод создани и принципиальную схему оригинальной магниточувствительной диагностической конструкции (рис. 15), которая может быть использована в система высокоэффективного обнаружения специфических молекул нуклеиновых кислот.

Рис. 15 - Схема метода получения диагностической конструкции на основе наночастиц феррита кобальта;

а- аденин, g - гуанин, с -цитозин, I - тимин, п -любой

дезоксирибонуклеотид

1. Наночастицы феррита кобальта связывают молекулы природных г: синтетических двухцепочечных и одноцепочечных ДНК и формирую магниточувствительные бионанокомпозитные комплексы. Связывание молеку ДНК и наночастиц феррита кобальта реализуется в широком интервале рН (от 5,0 д 9,0) и ионной силы (от 10 мМ до 1 М). Взаимодействие молекулы ДНК с наночастицей и влияние параметров среды на связывание зависит от нуклеотидног состава молекулы; количество связывающихся с наночастицей молеку. уменьшается в ряду олиго(сЮ) > олиго(с!С) > олиго(Т) > олиго(<1А6с1С4сЮбТ2) > олиго((±А).

2. Связывание ДНК и наночастиц феррита кобальта реализуется за сче координации атомами переходных металлов железа и кобальта, присутствующим; на поверхности наночастиц, карбонильных кислородов гетероциклически: оснований и фосфатных групп молекулы ДНК, и стабилизируется водородным)

связями между М-Н (N112) и Р-ОН группами ДНК и поверхностью наночастицы. 1

20

ВЫВОДЫ

двухцепочечных природных молекулах ДНК наночастицы взаимодействуют преимущественно с основаниями GC-nap.

3. На поверхности наночастиц феррита кобальта присутствуют хемосорбционные центры, характеризующиеся температурами десорбции выше 150 °С, для молекул кислотной природы и только физадсорбционные центры, характеризующиеся температурами десорбции ниже 150 °С, для молекул основной природы.

4. Связывание с наночастицами феррита кобальта препятствует взаимодействию рестриктаз с GC-сайтами ДНК, тогда как АТ-сайты могут быть гидролизованы.

5. Молекула ДНК при взаимодействии с наночастицами феррита кобальта сохраняет свою целостность. ДНК плазмиды в комплексе с наночастицами не способна трансформировать клетки прокариот, однако высвобождение из комплекса приводит к восстановлению данной функции.

6. Согласно предложенной модели нанобиокомпозитного комплекса прочное связывание с наночастицей феррита кобальта реализуется в результате одновременного формирования связей типа: Х=0"Ме и Y-H--0-Me (где X = С, Р; Y = О, N; Me = Со, Fe) и достигается в области GC-трактов двухцепочечных молекул при одновременном участии атомов оснований и фосфатных групп ДНК во взаимодействии.

Автор выражает искреннюю благодарность д.м.н., зам.зав. ЦНИЛ СибГМУ Сазонову А.Э., сотрудникам ОСМ ТНЦ СО РАН: к.ф.-м.н., в.н.с. Итину В.И., к.т.н., ученому секретарю Тереховой О.Г., к.х.н., с.н.с. Магаевой A.A., сотрудникам ХФ ТГУ: к.х.н., доценту Изаак Т.Н., к.х.н., зав. лаб. каталитических исследований Князеву A.C., м.н.с. Зарубиной О.Н., студенту Новикову Д.В., а так же м.н.с. ИТ НОЦ ТГУ Полюшко В.А., м.н.с. ТМЦ КП ТГУ Новикову В.А., к.х.н., сотруднику НАД ТПУ Федотовой М.П., к.ф.-м.н., сотруднику НПО «Вирион» Миллеру A.A.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Першина А. Г.. Сазонов А. Э., Мильто И. В. Использование магнитны наночастиц в биомедицине // Бюлл. сиб. мед. -2008. —№ 2. -С. 70-78.

2. Першина А. Г.. Сазонов А. Э., Огородова Л. М. Исследование механизме взаимодействия ДНК и наночастиц феррита кобальта методом ИК-Фурьс спектрометрии // Биоорган, хим. —2009. -Т. 35. -С. 674-680.

3. Магаева А. А., Терехова О. Г., Итин В. И., Радишевская Н. И., Найден Е. П. Егорова Л. А. , Иванчук И. И., Першина А. Г. Механохимический синте наноразмерных порошков на основе диоксида олова // Ж. приклад, хим. —2009. —'Т 82. -С. 220-223.

4. Першина А. Г.. Сазонов А. Э., Огородова Л. М. Исследование устойчивост: ДНК, связанной с ферримагнитными частицами нанопорошка феррита кобальта, нуклеазному расщеплению // Бюлл. эксп. биол. мед. -2010. -Т. 148. -С. 74-77.

5. Першина А. Г.. Ефимова Л. В., Итин В. И., Терехова О. Г., Магаева А. А Серебров В. Ю., Сазонов А. Э. Наноразмерный стабилизатор ферментов на основ частиц феррита кобальта // Нанотехника. -2010. -Т. 2. -С. 81-87.

6. Pershina A. G.. Serebrov V. Yu., Sazonov А. Е. Investigation of Interaction betwee Oligonucleotides and Cobalt Ferrite Nanoparticles // eCells & Materials. -2010. -V. 20. P. 201.

7. Pershina A. G.. Sazonov A. E., Novikov D. V., Knyazev A. S., Izaak T. I., Itin V. I Naiden E. P., Magaeva A. A., Terechova O. G. Study of DNA Interaction with Cobal Ferrite Nanoparticles // J. Nanosci. Nanotech. -2011. -V. 11. -P. 2673-2677.

8. Патент РФ № 2319153 Композиционный наноразмерный материал дл адсорбции и десорбции ДНК/РНК / Итин В. И., Иванчук И. И., Терехова О. Г Магаева А. А., Першина А. Г.. Найден Е. П., Максимов Ю. М. Опубл. 10.03.2008 г.

Подписано в печать 14 сентября 2011 г. Усл. печ. листов 0,75. Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ №282 Тираж 150 экземпляров

22

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Першина, Александра Геннадьевна

Оглавление

Список используемых сокращений

Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Бионанотехнология

1.1.1 Бионаноконструирование

1.1.2 ДНК как основа наноструктур

1.2 Ключевые особенности молекулы ДНК, определяющие 18 ее взаимодействие с наночастицами в водной среде

1.2.1 Структурно-конформационные особенности ДНК

1.2.2 Гидратация ДНК

1.2.3 Протонирование ДНК

1.3 Магнитные наночастицы 24 1.3.1 Размерно-зависимые эффекты магнитных наночастиц 25 1.3.2' Влияние структуры и состава наночастиц на магнитные свойства

1.3.3 Особенности поверхностных свойств наночастиц

1.3.4 Модификация поверхности наночастиц

1.3.5 Функции покрытия'наночастиц 30( 1.3.6- Особенности наночастиц ферритов, полученных методом механохимического синтеза

1.4 Механизмы взаимодействие ДНК с магнитными 33 наночастицами

1.4.1 Закономерности участия отдельных атомов ДНК при ее взаимодействии с другими объектами

1.4.2" Взаимодействие ДНК с ионами металлов

1.4.3 Закономерности адсорбции анионов на* ферросодержащих поверхностях

1.4.4. Взаимодействие ДНК с наночастицами ферритов

1.5 Формирование бионаноструктур ДНК-наночастицы

1.5.1 Стратегии получения бионаноструктур ДНК- 41 наночастицы

1.5.2 Получение гибридных бионаноструктур ДНК- 44 магнитные наночастицы

1.6 Использование магнитных наночастиц и конструкции на 45 их основе

1.6.1 Использование магнитных^ наночастиц для 46 биомедицинских исследований

1.6.2 Целевая доставка нуклеиновых кислот (генотерапия) с 49 использованием магнитных наночастиц

1.6.3 Наночастицы как регуляторы функциональной 51 активности ДНК

1.7 Потенциальные риски от использования наноматериалов

1.7.1 Воздействие наночастиц на биосистемы

1.7.2" Биологические эффекты взаимодействия ДНК и 56 наночастиц in vivo

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК in vitro"

Актуальность работы

В настоящее время интерес к созданию нанобиогибридных конструкций, содержащих магнитные наночастицы и молекулы нуклеиновых кислот крайне велик. Можно выделить два генеральных направления бионаноконструирования: наноэлектроника (нуклеиновая кислота используется в качестве матрицы для размещения наночастиц) и биоинженерия (создание инструментов медико-биологического назначения).

Существует две основные стратегии наноконструирования' - «снизу вверх» (bottom-up nanofabrication) и «сверху вниз» (top-down nanofabrication) [1]. Ввиду того, что создание наноразмерных систем- путем «top-down», например фотолитография, является высоко затратным, более того миниатюризация имеет естественный барьер, реализация стратегии «bottom -up» в настоящее время высоко востребована. Она базируется* на использовании малых молекулярных строительных блоков для создания^ надмолекулярных комплексов методом самосборки [2].

Использование молекул нуклеиновых кислот для конструирования? наноразмерных устройств крайне привлекательно. Такие молекулы, помимо того, что являются носителями информации и обладают механизмом специфичного молекулярного узнавания, проявляют высокую физико-химическую стабильность и механическую прочность [3]. Перспективность использования нуклеиновых кислот обусловлена возможностью манипулировать «блоками», созданными на их основе, с высокой точностью. Возможность манипуляции обеспечена способностью нуклеиновых кислот к гибридизации и наличием ферментов, позволяющих разрезать (рестриктазы), сшивать (лигазы) и достраивать (полимеразы) конструкции на основе нуклеиновых кислот [4].

Наибольшую актуальность конструкции, содержащие магнитные наночастицы и специфические фрагменты нуклеиновых кислот, получили в области создания высокочувствительных систем количественного детектирования и идентификации фрагментов ДНК, РНК-молекул , для повышения эффективности биомедицинской диагностики in vitro [5]. Появление у наночастиц уникальных магнитных свойств обеспечивает не только легкость управления, но и эффективность детектирования конструкций на их основе, сочетающего помехоустойчивость с возможностью выявления диагностически-значимых молекул в режиме реального времени [5-7]. Нанометровые размеры конструкций позволяют выявлять единичные молекулы, что значительно увеличивает чувствительность анализа [8]. Конструкции типа «нуклеиновая кислота — магнитная наночастица» разрабатывают для проведения высокоэффективного обнаружения патогенов, создания экспресс-систем генотипирования и секвенирования, выявления мРНК [9].

Молекула ДНК может непосредственно связываться с наночастицей либо для формирования связи используют связующие субстанции, что требует проведения предварительной модификации поверхности наночастицы и/или молекулы нуклеиновой кислоты [10]. Модификация поверхности усложняет и удорожает технологию производства бионаноконструкции, несмотря на то, что далеко не всегда позволяет полностью исключить неспецифические взаимодействия конъюгируемой нуклеиновой кислоты с наночастицей [10, 11]. Не смотря на разнообразие существующих подходов к связыванию нуклеиновых кислот и наночастиц [12], механизмы их взаимодействия остаются малоизученными.

Перспективность использования наночастиц на основе ферритов для создания биомедицинских конструкций обусловлена сочетанием высоких магнитных свойств [13] с большей устойчивостью к окислению и биоинертностью по сравнению с наночастицами металлов [14-16]. В литературе приводятся данные о высокой адсорбционной активности наночастиц оксидных ферримагнетиков относительно молекул ДНК [17]. Однако исследования механизмов взаимодействия наночастиц ферритов с молекулами ДНК представлены весьма скудно. Заключения о природе формирующихся связей носят противоречивый характер [18-22]. Очевидно, что взаимодействие нуклеиновых кислот и магнитных наночастиц может реализовываться за счет нескольких механизмов с участием различных групп биомолекулы [23-26].

Раскрытие закономерностей взаимодействия нуклеиновых кислот и наночастиц является первоочередной задачей для развития теоретических и г методических подходов к созданию бионанокомпозитных конструкций, определяет область и границы биомедицинского использования разрабатываемых нанорзмерных устройств. Новые данные о фундаментальных механизмах взаимодействия откроют перспективу дизайна поверхности наноматериала с целью реализации высокоспецифичного связывания, либо предотвращения его, а так же управления связями компонентов конструкции типа «нуклеиновая кислота - магнитная? наночастица».

Актуальность исследования взаимодействия ферримагнитных' наночастиц и молекул ДНК продиктована* и тем, что лежит в основе воздействий наноматериалов на биосистемы, что1 напрямую связано с1 обеспечением безопасности и качества жизни человечества в целом.

Цель работы

Изучить взаимодействие суперпарамагнитных наночастиц феррита кобальта, полученных методом механохимического синтеза, и.нуклеиновых кислот, на модели природных и синтетических одноцепочечных и двухцепочечных молекул ДНК, in vitro.

В соответствии с поставленной целью были формулированы следующие задачи:

1. Исследовать закономерности связывания природных и синтетических одноцепочечных и двухцепочечных молекул ДНК и наночастиц феррита кобальта при варьировании рН, ионной силы, и химического состава среды;

2. Выявить группы молекул ДНК, участвующие во взаимодействии с наночастицами феррита кобальта;

3. Изучить сорбционные свойства и природу активных центров на поверхности частиц нанопорошка феррита кобальта с использованием модельных молекул;

4. Определить доступность молекулы ДНК,, связанной- с наночастицами феррита кобальта; для нуклеазного расщепления;

5. Оценить влияние связывания наночастиц феррита кобальта с молекулами ДНК на структуру и функцию биомолекулы;

6. Построить модель.взаимодействия;компонентов комплекса:«ДНК - ферримагнитная наночастица». ' . '

Научная новизна работы I

Впервые показана, способность наночастиц феррита кобальта, синтезированных методом механохимии, связываться с фрагментами природных и синтетических двухцепочечных и одноцепочечных ДНК с образованием стабильных комплексов;. ; •

Определено,, что; эффективность связывания? и стабильность комплексов при: изменении параметров среды (рН, ионной силы;: химического состава); зависти от нуклеотидного состава биомолекулы. Установлено; что связывание молекул ДНК и наночастиц реализуется за счет координации фосфатных групп сахарофосфатного остова; и карбонильных групп оснований ДНК атомами переходных металлов на поверхности, и стабилизируется водородными связями; При взаимодействии с одноцепочечными молекулами ДНК в связывание с поверхностью наночастицы могут вовлекаться^атомы азота гетероциклического^кольца. При взаимодействии с природными^ молекулами двухцепочечных ДНК наночастицы связываются преимущественно с ОС-парами, защищая их от действия рестриктаз.

Впервые показано^ что в составе комплексов с наночастицами феррита кобальта молекулы ДНК не деградированы и могут частично сохранять способность к. гибридизации с комплементарными молекулами ДНК. Показана возможность высвобождения молекулы ДНК из комплекса с наночастицами, при этом функция биомолекулы восстанавливается.

На основе полученных данных о взаимодействии наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК. предложен: новый метод создания- и принципиальная схема оригинальной . конструкции для выявления диагностически-значимых фрагментов: нуклеиновых кислот in vitro, при наложении внешнего магнитного поля.

Теоретическое и практическое значение работы В работе продемонстрирована: принципиальная возможность и перспективность использования суперпарамагнитных наночастиц феррита кобальта, синтезированных " методом механохимии, для формирования магниточувствительных бионанокомпозитных структур;

Полученные / новые - данные о закономерностях взаимодействия-наночастиц: феррита' кобальта и молекул одноцепочечных и двухцепочечиых дезоксирибонуклеиновых кислот будут положены в основу реализации? подходов* к. бионаноконструированию при создании; новых бионаноконструкциш. . Подобные конструкции,- созданные на основе, суперпарамагнитных наночастиц феррита кобальта и молекул ДНК, являются перспективными структурами для* разработки исследовательских и диагностических инструментов в области молекулярной биологии, медицины и наноэлектроники:

Данные, представленные в работе, вносят существенный вклад в понимание: механизмов взаимодействия неорганических наночастиц и молекул нуклеиновых кислот, что имеет большое значение для' развития представлений? о воздействии новых наноразмерных материалов: на биологические системы.

Апробация результатов исследования и публикации f

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 статей в изданиях,: рекомендованных Высшей аттестационной комиссией

13 ;

Министерства образования и науки Российской Федерации, 2 статьи в зарубежных журналах и 1 патент РФ.

Материалы, включенные . в диссертацию^ докладывались ; на всероссийских и международных конференциях, в том числе; на Международной конференции по физической мезомеханике, компьютерному конструированию и разработке новых материалов (Томск, 2006 г.), на 2ой международной конференция «Наноразмерные системы:. строение свойства, технологии» НАНСИС-2007 (Киев, 2007 г.), на 2ой Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы, биотехнологии» (Казань, 2008 г.), на Интернациональной» конференции материалов и передовых технологий ICMAT 2009 (International Conférence on Materials for Advanced Technologies ICMAT 2009)- (Сингапур, 2009 г.), на Втором Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий в рамках 2го международного форума по нанотехнологиям Руснанотех-2009 (Москва, Россия, 2009 г.), на Зей международной НаноБио конференции (Third International- NanoBio Conférence 2010,, Zurich) ' (Цюрих, Швейцария, 2010 г.). ■

Структура работы;

Диссертация состоит из введенияобзора: литературы,, описания материалов и- методов исследования, изложения результатов и! их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 166 страницах, содержит 40 рисунков и 6 таблиц. Библиография; включает 271 литературный источник.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Першина, Александра Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Наночастицы феррита кобальта связывают молекулы природных и синтетических двухцепочечных и одноцепочечных ДНК и формируют магниточувствительные бионанокомпозитные комплексы. Связывание молекул ДНК и наночастиц феррита кобальта реализуется в широком интервале рН (от 5,0 до 9,0) и ионной силы (от 10 мМ до 1 М). Взаимодействие молекулы ДНК с наночастицей и влияние параметров среды на связывание зависит от нуклеотидного состава молекулы; количество связывающихся с наночастицей молекул уменьшается в ряду олиго(сЮ) > олиго(ёС) > олиго(Т) > олиго^АбсК^сЮбТз) > олиго(с!А).

2. Связывание ДНК и наночастиц феррита кобальта реализуется за счет координации атомами переходных металлов железа и кобальта, присутствующими на поверхности наночастиц, карбонильных кислородов гетероциклических оснований и фосфатных групп молекулы ДНК, и стабилизируется водородными связями между N-H (NH2) и Р-ОН группами, ДНК и поверхностью наночастицы. В двухцепочечных природных молекулах ДНК наночастицы взаимодействуют преимущественно с основаниями GG-пар.

3. На поверхности наночастиц феррита кобальта присутствуют хемосорбционные центры, характеризующиеся температурами десорбции выше 150 °С, для молекул кислотной природы и только физадсорбционные центры, характеризующиеся температурами десорбции ниже 150' °С, для молекул основной природы.

4. Связывание с наночастицами феррита кобальта препятствует взаимодействию рестриктаз с GC-сайтами ДНК, тогда как АТ-сайты могут быть гидролизованы.

5. Молекула ДНК при взаимодействии с наночастицами феррита кобальта сохраняет свою целостность. ДНК плазмиды в комплексе с наночастицами не способна трансформировать клетки прокариот, однако высвобождение из комплекса приводит к восстановлению данной функции.

6. Согласно предложенной модели нанобиокомпозитного комплекса прочное связывание с наночастицей феррита кобальта реализуется в результате одновременного формирования связей типа: Х=0**Ме и У-Н - ОМе (где X = С, Р; У = О, >1; Ме = Со, Ре) и достигается в области ОС-трактов двухцепочечных молекул при одновременном участии атомов оснований и фосфатных групп ДНК во взаимодействии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований нами показано, что суперпарамагнитные наночастицы феррита кобальта, полученные методом механохимического синтеза, способны эффективно связывать молекулы одноцепочечных и двуцепочечных природных и синтетических ДНК, формируя бионанокомпозитный комплекс.

Установленные закономерности связывания наночастиц и молекул ДНК при изменении параметров и химического состава среды, а так же зависимость этого процесса от нуклеотидного состава, вносит значительный вклад в понимание механизмов взаимодействия новых наноразмерных материалов и молекул дезоксирибонуклеиновых кислот, играющих ключевую роль в биосистемах.

Связывание с наночастицами феррита кобальта не приводит к деградации молекулы ДНК.

Показанная, зависимость взаимодействия от состава и структуры биомолекулы, определяющая, в том числе, доступность ДНК, в комплексе с наночастицами, для» эндонуклеаз, в сочетании с частичным сохранением способности связанных олигонуклеотидов к гибридизации с комплементарными' молекулами может служить основой для реализации оригинальных подходов к конструированию магниточувствительных бионаноструктур.

Подобные гибридные конструкции, включающие магнитные наночастицы и специфические фрагменты ДНК, являются крайне перспективными для разработки высокоэффективных инструментов современной молекулярной генодиагностики.

Предложенный подход к наноконструированию может представлять определенный интерес и для развития наноэлектронники. г

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Першина, Александра Геннадьевна, Томск

1. Garcia Н. DNA-templated nanomaterials Электронный ресурс., 2007. Режим дотупа: http://contentdm.lib.byu.edu/ETD/image/etdl823.pdf.

2. Lee, Y.S. Self-assembly and nanotechnology: a force balance approach / Y.S. Lee. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, Inc., 2008. - 344 p.

3. Abu-Salah K.M., Ansari A.A., Alrokayan S.A. DNA-based applications in nanobiotechnology Электронный ресурс. // J. Biomed. Biotechnol., 2010. -Article ID 715295. Режим доступа: http://downloads.hindawi.com/journals/jbb/2010/715295.pdf.

4. Primrose, S.B. Principles of Gene Manipulation and Genomics (7th Ed.) /

5. B.Primrose, R.M.Twyman. Hoboken, NJ: Blackwell Publishing, 2006. - 626 p.

6. Haun J.B., Yoon T.J., Lee H., Weissleder R. Magnetic nanoparticle biosensors // Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. NanobiotechnoL, 2010. V. 2 (3). -P. 291-304.

7. Gossuin Y., Gillis P., Hocq A., Vuong Q. L., Roch A. Magnetic resonance relaxation properties of superparamagnetic particles // Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. NanobiotechnoL, 2009. V. 1(3). - P. 299-310.

8. Hybrid nanocomposites for nanotechnology: electronic, optical, magnetic and biomedical applications / Ed. by Merhari L. New York: Springer, 2009. - 8471. P

9. Osaka Т., Matsunaga Т., Nakanishi Т., Arakaki A., Niwa D., Iida H. Synthesis of magnetic nanoparticles and their application in bioassays // Anal. Bioanal. Chem., 2006. V. 384. - P. 593-600.

10. Sun C., Lee J.S., Zhang M. Magnetic nanoparticles in MR imaging and drug delivery // Adv. Drug. Deliv. Rev., 2008. V. 60(11). P. 1252-1265.

11. Schmid G. Nanoparticles: from theory to application (2 Ed.) / G. Schmid. -New York, NY: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2010. 538 p.

12. Lee J.-H., Huh Y.-M., Jun Y., Seo J'.-w., Jang J.-t., Song H.-T., Kim S.J., Cho E.-J., Yoon H.-G., Suh J.-S., Cheon J. Artificially engineered magnetic nanoparticles for ultra-sensitivemolecular imaging // Nat. Med., 2007. V.13. - P. 95-99.

13. Berry C.C.a.C., Adam S.G. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J. Phys. D: Appl. Phys., 2003. V. 36. - P R198-R206.

14. Samanta В., Yan H., Fischer N.O., Shi J., Jerry D. J., Rotello V. M. Proteinpassivated Fe304 nanoparticles: low toxicity and rapid heating for thermal therapy //J.Mater. Chem.,2008. V. 19 (11).-P. 1204-1208.

15. Buzea C., Pacheco I., Robbie K. Nanomaterials and nanoparticles: sources and toxicity // Biointerphases, 2007. V. 2 (4); - P. MR17-71.

16. Taylor J.I., Hurst C.D., Davies M.J., Sachsinger N., Bruce I.J. Application of magnetite and silica-magnetite composites to the isolation of genomic DNA // J. Chromatogr. A, 2000. V. 890 (1). - P. 159-66.

17. Dutta P.M., Manivannan A., Seehra M.S., Shah N., Huffman G.P. Magnetic and structural properties of a DNA-maghemite nanocomposite // J. of Applied Physics, 2006. V. 99 (8). - P. 08H105-08H105-3.

18. Kinsella J.M., Ivanisevic A. Enzymatic clipping of DNA wires coated with magnetic nanoparticles // J. Am. Chem-. Soc., 2005. V. 127 (10). - P. 3276-3277.

19. Kinsella J.M., Ivanisevic A. Fabrication of ordered metallic and magnetic heterostructured DNA-Nanoparticle hybrids // Colloids Surf. В Biointerfaces, 2008.-V. 63(2). P. 296-300.

20. Prodelalova J., Rittich В., Spanova A., Petrova K., Benes M.J. Isolation of genomic DNA using magnetic cobalt ferrite and silica particles // J. Chromatogr. A, 2004. V. 1056 (1-2). - P. 43-48.

21. Byrne S .J., Corr S.A., Gun'ko Y.K., Kelly J.M., Brougham D.F., Ghosh S. Magnetic nanoparticle assemblies on denatured' DNA show unusual magnetic relaxivity and potential applications for MRI // Chem. Commun., 2004. P. 25602561.

22. Kinsella J.M., Shalaev M.Y., Ivanisevic A. Ligation of Nanoparticle Coated DNA Cleaved with Restriction Enzymes // Chem. Mater., 2007. V. 19. - P. 35863588.

23. Wu N., Fu L., Su M., Aslam M., Wong K.C.,.Dravid V.6tP. Interaction of Fatty Acid Monolayers with Cobalt Nanoparticles // Nanoletters, 2004. V. 4 (2). P. 383-386.

24. Li Z., Chen H., Bao H., Gao M. One-Pot Reaction to Synthesize Water-Soluble Magnetite // Nanocrystals. Chem. Mater., 2004. V. 16 (8). - P. 13911393.

25. Culita D.C., Marinescu G., Patron L., Stanica N. Synthesis and Characterization of Cobalt Ferrite Nanoparticles Coated with Dehydrocholate Anions // Revue Roumaine de Chimie, 2006. Y. 51 (6). - P. 503-508.

26. Пул Ч. Нанотехнологии / Ч. Пул, Ф. Оуэне. М.: Техносфера, 2005. -336 с.

27. Muraleedharan H. Nanobiotechnology: Biolnspired Devices and Materials of the future // J. Biosci. Res., 2010. V. 1 (2). P. 108-117.

28. Гусев А.И. Нанокристаллические материалы / А.И. Гусев, А.А. Ремпель. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2001. - 224 с.

29. Суздалев И.П., Нанотехнология: физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов / И.П. Суздалев. М;: КомКнига, 2006. - 592 с.

30. Roduner Е. Nanoscopic materials: size-dependent phenomena / E. Roduner -Cambridge: RSC Pub., 2006. 299 p.142 ,

31. Niemeyer C.M. Nanoparticles, Proteins and Nucleic Acids: Biotechnology Meets Materials Science // Angew. Ghem. Int. Ed., 2001. V. 40 (22). - P. 4128 -4158.

32. Niemeyer C.M. DNA as a Material for Nanotechnology // Angew. Cheni. Int. Ed. Engl., 1997. V. 36 (6). - P. 585-587.

33. Aldaye F.A;., Palmer A.L., Sleiman HlF. Assembling materials with DNA as the guide // Science, 2008.- V. 321(5897). P. 1795-1799.

34. Herdewijn P. Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology) / P. Herdewijn. New Jersey: Humana Press., 2005. - 456 p.

35. Seeman N.C. DNA in a material world//Nature, 2003. V. 421 (6921). - P. 27-31, ■■

36. Seeman N.C. Nucleic acid junctions and lattices //J. of Theoretical Biology, 1982.-V. 99 (2).-P. 237-247. ^

37. Chen J.H., Seeman N.C. Synthesis* from» DNA of a molecule with- the connectivity of a cube // Nature, 1991. V. 350 (6319). P. 631-633.

38. Qi J., Li X., Yang X., Seeman N.C. Ligation of-Triangles Built from Bulged 3-Arm DNA Branched Junctions // J. Am. Ghem; Soc., 1996. V. 118 (26). P. . 6121-6130.

39. Winfree E., Liu F., Wenzler L.A., Seeman N.C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals II Nature, 1998: V. 394 (6693): - P. 539-544.

40. Du S.M., Seeman N.C. The construction: of a trefoil knot from a DNA branched junction motif// Biopolymers, 1994. N. 34(1). -P. 31-37.

41. Biancaniello P.L., Kim A.J., Crocker J.C. Colloidal Interactions and Self-Assembly Using DNA Hybridization // Physical Review Letters, 2005. -V. 94. (5)/ -P. 058302-1-4.

42. Garrett R.H. Biochemistry (4th ed.) / R.H. Garrett, C.M. Grisham. -Australia, United Kingdom: Brooks/Cole; Cengage Learning, 2010. 1059 p.

43. Berg M.A., Coleman R.S., Murphy C.J. Nanoscale structure and dynamics of DNA // Phys. Chem. Chem. Phys., 2008. V. 10 (9). P. 1229-1242.

44. Зенгер, В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот // В: Зенгер. М.: Мир, 1987. - 584 с.

45. Voet D. Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level // D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons Inc., 2008. - 344 P

46. Watson J.D., Crick F.H. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid //Nature, 1953. V. 171 (4356). P. 737-738.

47. Yakovchuk P., Protozanova E., Frank-Kamenetskii M.D. Base-stacking and base-pairing contributions into thermal stability of the DNA double helix // Nucleic Acids Res., 2006. V. 34 (2). - P: 564-574.

48. Ornstein R.L., Rein R., Breen D.L., MacElroy R.D. An' optimised potential! function* for calculation of nucleic acid interaction energies. I. Base stacking. // Biopolymers, 1978. V. 17. P. 2341-2360.

49. Shefter E., Trueblood K.N. The Crystal and Molecular Structure of D(+)-Barium Uridine-5'-Phosphate // Acta Crystallogr., 1965. V. 18. - P. 1067-1077.

50. Shakked Z., Guerstein-guzikevich G., Eisenstein M., Frolow F., Rabinovich D. The conformation of the DNA double helix in the crystal is dependent on its environment // Nature, 1989. V. 342 (6248). - P.456-460.

51. Ghosh A., Bansal M. A glossary of DNA structures from A to Z // Acta Crystallogr. D: Biol. Crystallogr., 2003. V. 59 (Pt 4). - P. 620-626.

52. Basham В., Schroth G.P., Ho P.S. An A-DNA triplet code: thermodynamic rules for predicting A- and B-DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995. V. 92 (14).-P. 6464-6466.

53. Rich A., Nordheim A., Wang A.H. The chemistry and biology of left-handed Z-DNA // Annu. Rev. Biochem, 1984. V. 53. - P. 791-846.

54. Tajrmir-Riahi H.A., Neault J.F., Naoui M. Does DNA acidvfixation produce left-handed^ structure? //FEBS Letters, 1995. V. 370. - P. 105-108.

55. Pohl F.M'. Polymorphism of a synthetic DNA in solution // Nature, 1976. -V. 260 (5549). P. 365-366.

56. Erfurth S.C., Kiser E.J., Peticolas W.L. Determination of the backbone structure of nucleic acids and nucleic acid oligomers by laser Raman scattering // Proc. Natl: Acad. Sei. USA; 1972. V. 69 (4). - P: 938-941. '

57. Ramaswamy N., Bansal M., Gupta G., Sasisekharan V. Structure of D-DNA: 8-fold or 7-fold helix? // Embo J., 1983. V. 2 (9). - P. 1557-1560.

58. Wing R., Drew H., Takano Т., Broka C.„Tanaka S., Itakura K., Dickerson R.E. Crystal structure analysis of a complete turn of B-DNA // Nature, 1980. V. 287 (5784), - P. 755-758.

59. Heinemann U., Alings C. Crystallographic study of one turn of G/C-rich Bt

60. DNA. //J.Mol. Biol., 1989. V. 210 (2). P. 369-381.

61. Peticolas W.L., Wang Y., Thomas G.A. Some rules for predicting the base-sequence dependence of DNA conformation // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1988. -V. 85 (8).-P. 2579-2583.

62. Radhakrishnan I., Patel DJ. DNA triplexes: solution structures, hydration sites, energetics, interactions, and function // Biochemistry, 1994. V. 33 (38). P. 11405-11416.

63. Mitchell P:R:, Sigel H; A proton nuclear-magnetic-resonance study of self-stacking in purine and pyrimidine nucleosides and nucleotides // Eur. J. Biochem., 1978. V. 88(1).- P. 149-154.

64. Hatters D.M., Wilson L., Atcliffe B.W., Mulliern T.D., Guzzo-Pernell N.,. Howlett G.J. Sedimentation analysis of novel DNA structures formed by homo-oligonucleotides // Biophys. J., 2001.- V. 81 (1). P. 371-381.

65. Burge S., Parkinson G.N., Hazel P., Todd A.K., Neidle S. Quadruplex DNA: . sequence, topology and structure // Nucleic Acids Res., 2006. V. 34 (19). - P. 5402-5415. ;

66. Sarma M.H., Gupta G., Sarma R.H. 500-MHz 1PI NMR study of poly(dG).poly(dG) in solution using one-dimensional nuclear Overhauser effect // Biochemistry, 1986. V. 25 (12). - P. 3659-3665.

67. Sukhorukov В .1., Montrel M.M. Infrared and X-ray diffraction < study of the effect of protonation of DNA on its B-to-A transition // Biophys. Chem., 1990; V. 35(1).-P. 47-54.

68. Radhakrishnan Г., Patel D.J. Hydration sites in purine.purine.pyrimidine and. pyrimidine.purine.pyrimidine DNA triplexes in aqueous solution // Structure, 1994.-V. 2 (5).-P. 395-405.

69. Schneider В., Patel K., Berman H:M. Hydration of the phosphate group in double-helical DNA // Biophys. J., 1998. V. 75 (5). - P. 2422-2434.

70. Harmouchi M., Albiser G., Premilat S. Changes of hydration during conformational transitions of DNA // Eur. Biophys. J., 1990. V. 19 (2). - P. 8792.

71. Koseoglu Y., Kavas H. Size and surface effects on magnetic properties of Fe304nanoparticles // J. Nanosci. Nanotechnol., 2008. V. 8 (2). - P. 584-590.

72. Stoner Е.С., Wohlfarth Е.Р. A mechanism of magnetic hysteresis in heterogeneous alloys // Philosophical Transactions of the Royal Society A: Physical, Mathematical and Engineering Sciences, 1948. V. 240. - P. 599-642.

73. Jun Y.W., Seo J.W., Cheon J. Nanoscaling laws of magnetic nanoparticles and their applicabilities in biomedical sciences // Acc. Chem. Res., 2008. V. 41 (2). - P. 179-89.

74. Livingston J.D. A review of coercivity mechanisms // J. of Applied Physics, 1981.-V. 52.-P. 2541-2545.

75. Chen Q., Zhang ZJ. Size-dependent superparamagnetic properties of MgFe204 spinel ferrite nanocrystallite // Appl. Phys. Lett., 1998. V. 73. - P. 31563159.

76. Park J.-I., Kang N.-J., Jun Y., Oh S.J., Ri H.C., Cheon J. Superlattice and magnetism directed by the size and shape of nanocrystals // Chem. Phys. Chem., 2002. V. 3. - P. 543-547.

77. Morales M.P., Veintemillas-Verdaguer S., Montero M.I., Serna С.J. Surface and internal spin canting in y-Fe203 nanoparticles // Chem. Mater., 1999. V. 11.-P. 3058- 3064.

78. Lu A.H., Salabas E.L., Schuth F. Magnetic nanoparticles: synthesis, protection; functionalization, and application // Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2007. V. 46 (8). - P. 1222-1244.V. 15.- P. 7111-7115. ; • \

79. Yee C., Kataby GUlmán A., Prozorov T., White H;, King A;, Rafailovich M:,SokolovJ.,GedankenA.Self-AssembledMonolayersofAlkanesulfonicandi-phosphonic Acids on Amorphous Iron;Oxidé Nanoparticles // Langmuir, 1999; V. 15.-P. 711:1-7115. '

80. Sahoo Y., Pizem H., Fried I'., Golodnitsky D:, Bürstei&L.,. Sukenik Ch:, N¿ Márkovichs Gí Alkylí Phosphonate/Phosphate Coating on ■ Magnetite Nanoparticles A Comparison with'Fatty Acids,// Langmuir, 200 L V. 17 (25); ~PI 7907-7911.

81. Pardoe Hi Chua-Anusorn W., Pierre T., Dobson J. Structural .and magnetic properties of nanoscale iron oxide particles synthesized in the presence of dextran or polyvinyl alcohol // J. of magnetism and magnetic materials, 2001. V. 225 (1-2).-P. 41-46.

82. Zhang Y., Kohler N.3 Zhang M. Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake // Biomaterials, 2002. V. 23 (7).-P. 1553-1561. ;

83. Molday R.S., MacKenzie D. Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells // J. Immunol. Methods, 1982.-V. 52 (3). P. 353-367.

84. Kim D.K., Mikhaylova M., Wang F.H., Kehr J., Bjelke В., Zhang Y., TsakalakosT., Muhammed M. Starch-Coated Superparamagnetic Nanoparticles as MR Contrast Agents // Ghem. Mater., 2003. V. 15 (23). P. 4343-4351.

85. LaConte L., Nitin N., Bao G. Magnetic nanoparticle ■ probes // Materials today, 2005. V. 8 (5). - P. 32-38.

86. Portet D., Denizot B.', Rump E., Lejeune J.J., Jallet P: Nonpolymeric Coatings of Iron- Oxide Colloids for Biological Use as Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents //J. Colloid. Interface Sci., 2001. V. 238'(1). - P. 37-42.

87. Rotello V.M. Nanoparticles: Building Blocks for Nanotechnology / V.M: Rotello. New York: Kluwer Academic Publishers, 2004. - 306 p.

88. Robinson D.B., Persson H.H.J., Zeng H:, Li G., Pourmand N., Sun S., Wang^

89. S.X. DNA-Functionalized MFe204 (M ) Fe, Go, or Mn) Nanoparticles and Their .i

90. Hybridization to DNA-Functionalized Surfaces // Langmuir, 2005. -V. 21'. P. 3096-3103;

91. Tan W., Wang К., He X., Zhao X.J., Drake Т., Wang L., Bagwe R.P. Bionanotechnology based on silica nanoparticles // Med. Res. Rev., 2004. V. 24 (5).-P. 621-638;

92. Патент US5262176 Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids / Palmacci S., Josephson L. Опубл. 16.11.1993.

93. Nyamjav D. Ivanisevic A. Templates for DNA-templated Fe304 nanoparticles // Biomaterials, 2005. V. 26 (15). - P. 2749-2757.

94. Bruce I.J., Sen T. Surface modification of magnetic nanoparticles with alkoxysilanes and their application in magnetic bioseparations // Langmuir, 2005. -21 (15).-P. 7029-7035.

95. Koneracka M.K., Kopcansky P., Antalik M., Timko Ml, Ramchand C.N., Lobo D.; Mehta R.V., Upadhyay R.V. Immobilization of proteins and enzymes to fine magnetic particles // J. of Magnetism and Magnetic Materials, 1999. V. 201. - P. 427-430.

96. Mikhaylova M., Kim D.K., Bobrysheva N., Osmolowsky M., Semenov V., Tsakalakos Т., Muhammed M. Superparamagnetism of magnetite nanoparticles: dependence on surface modification // Langmuir, 2004.- V. 20 (6). P. 2472-2477.

97. Dutta P., Seehra M. S. Effect of DNA Coating on Magnetic Relaxation in Fe203 Nanoparticles // IEEE Trasaction on Magnetics, 2007. V. 43 (6). - P. 24682470.

98. Lang С., Dirk S. Biogenic nanoparticles: production, characterization, and application of bacterial magnetosomes // J. Phys.: Condens. Matter., 2006. -V. 18: P. S2815-S2828.

99. Reimers, G.W. Preparing magneticfluids by a peptizing method // G.W. Reimers, S.E. Khalafalla. Washington, D.C.: U.S. Dept. of the Interior, Bureau of Mines, 1972. - 13 p.

100. Ding J., Miao W.F., McCormick P.G., Street R. Mechanochemical Synthesic of ultrafine Fe powder // Appl. Phys. Lett., 1995. V. 67 (25). - P. 3804-3806.

101. Губин С.П., Кокшаров Ю.Л., Хомутов Г.Б. Магнитные наночастицы: методы получения, строение и свойства // Успехи химии, 2005. Т. 74 (6). - G. 539-574.

102. Hadjiliadis N.E. Metal Complex DNA Interactions / N.E. Hadjiliadis, E.C. Sletten. - Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell, 2009s - 544 p.

103. Deweese J.E., Guengerich F.P., Burgin A.B!, Osheroff N. Metal ion interactions in the DNA cleavage/ligation active site of human topoisomerase II alpha//Biochemistry, 2009. V. 48 (38). P. 8940-8947.

104. Weiner P.K., Langridge R., Blaney J.M., Schaefer R.,. Kollman P.A. Electrostatic potential molecular surfaces // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1982. —V. 79 (12):-P. 3754-3758.

105. Chiu T.K., Dickerson R.E. 1A Crystal Structures of B-DNA Reveal Sequence-specific Binding and Groove-specific Bending of DNA by Magnesium and Calcium // J. Mol. Biol., 2000. V. 301. - P. 915-945.

106. Ouameur A.A., Arakawa H;, Ahmad R., Naoui M;, Tajmir-Riahi H.A. A Comparative study of Fe(ll) and Fe(III) interactions ; with DNA duplex: major and minor grooves bindings // DNA Cell Biol, 2005. V. 24 (6). - P. 394-401.

107. Henle E.S., Han Z., Tang N., Rai P., Luo Y., Linn S. Sequence-specific DNA cleavage by Fe2+-mediated fenton reactions has possible biological implications II J. Biol. Chem., 1999. V. 274. - P. 962-971.

108. Terrona A. X-Ray Structural Studies of Metal-Nucleoside and Metal-Nucleoside Monophosphate Complexes: New Perspectives .// Comments on Inorganic Chemistry, 1993.-V. 14 (2-3). P. 63-88.

109. Hackl E.V., Blagoi Y.P. Effect of ethanol on structural transitions of DNA and polyphosphates under Ca2+ ions action in mixed solutions // Acta Biochim. Pol., 2000. V. 47 (lj. - P. 103-112.

110. Berman H.M. Hydration of DNA // Current Opinion in Structural Biology, 1991. V. 1. - P. 423-427.

111. Arai Y., Sparks D.L. ATR-FTIR Spectroscopic Investigationon Phosphate Adsorption Mechanisms at the Ferrihydrite-Water Interface // J. of Colloid Interface Sci., 2001. V. 241. - P. 317-326.

112. Roonasi P., Holmgren A. AnATR-FTIR study of carbonate sorption onto magnetite // Surf. Interface Anal., 2010. V. 42 - P. 1118-1121.

113. Persson P:, Nilsson N., Sjoberg S. Structure and Bonding of Orthophosphate Ions at the Iron Oxide-Aqueous Interface // J. of Colloid Interface Sci., 1996. V. 177 (l).-P. 263-275.

114. Kurikka S., Ulman A., Yan X., Yang N-L., Estourns C., White H., Rafailovich M. Sonochemical Synthesis of Functionalized Amorphous Iron Oxide Nanoparticles //Langmuir, 2001. V. 17 (16). - P. 5093-5097.

115. Mirkin C.A.; Letsinger R.L., Mucic R.C., Storhoff JJ. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials // Nature, 1996.- V. 382. P. 607-609.

116. Alivisatos A.P., Johnsson K.P., Peng X., Wilson T.E., LowetbCJ., Bruchez Jr M.P., Schultz P.G. Organization,of 'nanocrystal molecules' using DNA // Nature, 1996.-V. 382.-P. 609-611.

117. Seela F., Budow S. pH-dependent assembly of DNA-gold nanoparticles based on the i-motif // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2007. V. 26 (6-7). -P. 755-759.

118. Seela F., Jawalekar AM, Chi L., Zhong D., Fuchs H. Gold DNA-conjugates: ion specific self-assembly of gold nanoparticles via the dG-quartet // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2005. V. 24 (5-7). - P. 843-846/

119. You C.-C., Verma A., Rotello V.M. Engineering the nanoparticle-biomacromolecule interface // Soft Matter., 2006. V. 2. P. 190-204.

120. Патент KR20030011721(A) Metallisation of nucleic acids via metal nanoparticles produced ex-situ / Ford W., Harnack O., Wessels Ju., Yasuda A.; Опубл. 02.11.2003.

121. Torimoto Т., Yamashita М., Kuwabata S., Sakata Т., Mori II., Yoneyama Н. Fabrication of CdS Nanoparticle Chains along DNA Double Strands // J. Phys. Chem. B, 1999. V. 103 (42). - P: 8799-8803.

122. Позмогова Г.Е., Чувилин A.H., Смирнов И.П., Зайцева М.А., Татаринова О.Н., Говорун В.М. Получение и свойства ассоциатов наночастиц никеля с ss-ДНК и белками // Российские нанотехнологии, 2008. Т. 3 (5-6). -С. 148-154. ■■ ■■

123. Cassell A.M., Scrivens W.A., Tour J.M. . Assembly of DNA/Fullerene Hybrid Materials // Angew. Chem; Int: Ed:, 1998. V. 37 (11^. - P: Г528т1531. •

124. Sandhu K.K., Mcintosh C.M:, Simard J.M., Smith S.W., Rotello V.M. Gold nanoparticle-mediated transfection of. mammalian cells // Bioconjug. Chem., 2002. -V. 13(1).-P. 3-6. ;

125. Braun E. DNA-templated assembly and electrode attachment of a conducting silver wire // Nature, 1998. V. 391. - P. 775-778.

126. Kinsella J.M., Ivanisevic A. Magnetotransport of One-Dimensional Chains of CoFe204 Nanoparticles Ordered along DNA // J. Phys. Chem. C, 2008. -V. 112 (9).-P. 3191-3193.

127. Mornet S., Vekris A., Bonnet J., Duguet E., Grasset F., Choy J.-H., Portier J. DNA-magnetite nanocomposite materials // Materials Letters, 2000. V. 42. - P. 183-188.

128. Патент JP2007269770(A) Functional magnetic super-nanoparticle and use thereof / Sedo M., Taira O., Hatanaka Т., Ichiyanagi Y.; Опубл. 18.10:2007. .

129. Rosensweig R.E. Heating magnetic fluid with' alternating magnetic field // J. Magn. Magn. Mater., 2002. V.252. - P. 370-374.

130. Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S:K., Dobson J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine // J: Phys. D:.Appl. Phys., 2003; V. 36. -P. R167-R181.

131. Cartmell S.H., Dobson J., Verschueren S., Hughes S., Eh Haj A.J. Mechanical conditioning of bone cells in vitro using magnetic microparticle technology // European-Cells and Materials, 2002. V. 4 (2); - P: 130-131.

132. Fukuda N., Ishii J., Tanaka Т., Fukuda H:, Ohnishi N., Kondo A. Rapid and efficient selection of yeast displaying a target protein using thermo-responsive magnetic nanoparticles // Biotechnol!. Prog., 2008. V. 24 (2). - P. 352-357.

133. Chiang C.L., Sung C.S., Wu T.F., Chen C.Y., Hsu C.Y. Application of superparamagnetic nanoparticles in- purification of plasmid DNA from bacterial cells // J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci., 2005. V. 822 (1-2). -P. 54-60.

134. Sebastianelli A., Sen Т., Bruce I.J. Extraction of DNA from soil using nanoparticles by magnetic bioseparation // Lett. Appl. Microbiol., 2008. V. 46 (4).-P 488-491.

135. Kaittanis C., Naser S.A., Perez J.M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation // Nano Lett., 2007. V. 7 (2). - P. 380-383.

136. Amagliani G., Omiccioli E., Campo A., Bruce I.J., Brandi G., Magnani M. Development of a magnetic capture hybridization-PCR assay for Listeria monocytogenes direct detection in milk samples // J. Appl. Microbiol., 2006. V. 100 (2).-P. 375-383.

137. Zhao M., Josephson L., Tang Y., Weissleder R. Magnetic sensors for protease assays // Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2003. V. 42 (12). - P. 1375-1378.

138. Perez J.M., Josephson L., O'Loughlin Т., Hogemann D., Weissleder R. Magnetic relaxation switches capable of sensing molecular interactions // Nat Biotechnol, 2002. V. 20 (8). - P. 816-820.

139. Grimm J., Perez J. M., Josephson L., Weissleder R. Novel nanosensors for rapid analysis of telomerase activity // Cancer Res., 2004. V. 64 (2). - P. 639-643.

140. Josephson L., Perez J.M., Weissleder R. Magnetic Nanosensors for the Detection of Oligonucleotide Sequences // Angewandte Chemie International Edition, 2001. V. 40 (17). - P. 3204-3206.

141. Мэнсфилд П. Быстрая магнитно-резонансная томография- // Успехи физических наук, 2005. Т. 175 (10). - С. 1044-1052.

142. Touchefeu Y., Harrington K.J., Galmiche J.P., Vassaux G. Review article: gene therapy, recent developments and future prospects in gastrointestinal oncology//Aliment. Pharmacol. Ther., 2010. V. 32 (8). - P. 953-968.

143. Xu L., Frederik P., Pirollo K.F., Tang W.H., Rait A., Xiang L.M., Huang W., Cruz I., Yin Y., Chang E.H. Self-assembly of a virus-mimicking nanostructure system for efficient tumor-targeted gene delivery // Hum. Gene Ther., 2002. V. 13(3).-P. 469-481.

144. Pap T., Gay R.E., Muller-Ladner U., Gay S. Ex vivo gene transfer in the years to come // Arthritis. Res., 2002. V. 4 (1). - P. 10-12.

145. Widder K.J., Senyel A.E., Scarpelli G.D. Magnetic microspheres: a model system of site specific drug delivery in vivo // Proc. Soc. Exp. Biol; Med., 1978. -V. 158(2).-P. 141-146.

146. Mykhaylyk O., Zelphati O., Rosenecker J., Plank G. siRNA delivery by magnetofection // Curr. Opin. Mol. Ther., 2008. V. 10 (5). - P: 493-505.

147. Kneuer C., Sameti M., Haltner E.G., Schiestel T., Schirra H., Schmidt H., Lehr C.M. Silica nanoparticles modified with aminosilanes as carriers for plasmid DNA // Int. J. Pharm., 2000. V. 196 (2). - P. 257-261.

148. Krotz F., de Wit C., Sohn H.Y., Zahler S., Gloe T., Pohl U., Plank C. Magnetofection—a highly efficient tool for antisense oligonucleotide delivery in vitro and in vivo // Mol. Ther., 2003; V. 7 (5 Pt 1). - P.700-710.

149. Gersting S.W., Schillinger U., Lausier J., Nicklaus P., Rudolph C., Plank C., Reinhardt D., Rosenecker J. Gene delivery to respiratory epithelial cells by magnetofection // J. Gene Med., 2004. V. 6 (8). - P. 913-922.

150. Schillinger U., Brill T., Rudolph C., Huth S., Gersting S., Krotz F., Hirschberger J., Bergemann C., Plank C. Advances in magnetofectionmagnetically guided nucleic acid delivery // J. Magn. Magn. Mater., 2005. V. 293.-P. 501-508.

151. He X.X., Wang K. , Tan W.5 Liu B., Lin X., He C., Li D., Huang S., Li J. Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage // J. Am. Chem. Soc., 2003. V. 125 (24). - P. 7168-7169.

152. Mykhaylyk O.,' Antequera Y.S., Vlaskou D., Plank C. Generation of magnetic nonviral gene transfer agents and magnetofection in vitro // Nat. Protoc., 2007. V. 2 (10). - P. 2391-2411.

153. Dobson J. Gene therapy progress and prospects: magnetic nanoparticle-based gene delivery // Gene Ther., 2006. V. 13 (4). - P. 283-287.

154. You C.-C., Chompoosor A., Rotello V.M: The biomacromolecule-nanoparticle interface // NanoToday, 2007. V. 2 (3). - P. 34-43.

155. Mcintosh C.M., Esposito E.A., Boa! A.K., Simard J.Mi, Martin C.T., Rotello V.M. Inhibition? of DNA Transcription^ Using Cationic Mixed Monolayer Protected Gold Clusters // J. Am. Chem. Soc., 20011 V. 123. P. 7626-7629.

156. Han. G., Chari N.S., Verma A., Hong R., Martin C.T., Rotello V.M. Controlled1 Recovery of the Transcription1 of Nanoparticle-Bound DNA by Intracellular Concentrations of Glutathione // Bioconjugate Chem., 2005. V. 16. -P.-1356-1359.

157. Han G., You C.-C., Kim B.-j., Turingam R.S., Forbes N.S., Martin C.T., Rotello V.M. Light-Regulated Release of DNA and Its Delivery to Nuclei by Means of Photolabile Gold Nanoparticles // Angew. Chem. Int. Ed., 2006. V. 45. -P. 3165-3169.

158. Donaldson K., Tran L., Jimenez L.A., Duffin R., Newby D.E., Mills N., MacNee W., Stone V. Combustion-derived nanoparticles: a review of theirtoxicology following inhalation exposure // Part Fibre Toxicol, 2005. V. 2. - P. 10.

159. Warheit D.B., Laurence B.R., Reed K.L., Roach D.H., Reynolds G.A.,. Webb T.R. Comparative pulmonary toxicity assessment of single-wall carbon nanotubes in rats // Toxicol. Sei., 2004. V. 77 (1). - P. 117-125.

160. Lam C.W., James J.T., McCluskey R., Hunter R.L. Pulmonary toxicity of single-wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation // Toxicol. Sei., 2004. V. 77 (1). - P. 126-134.

161. Karakoti A.Si, HenchvL.L., Seal S. The potential toxicity of nanomateriäls— The role of surfaces // J. of the Minerals, Metals and Materials Society, 2006. V. 58 (7). - P. 77-82.

162. Gurr J.R., Wang A.S., Chen C.H., Jan K.Y. Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photoactivation-can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells // Toxicology, 2005. ,- V. 213 (1-2). P. 66-73;

163. HussaimS.M., Hess K.L., Gearhart J.M., Geiss K.T., Schlager J.J. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells // Toxicol. In Vitro, 2005. V. 19 (7).-P. 975-983. '

164. Goodman C.M., McCusker C.D., Yilmaz T., Rotello V.M. Toxicity of gold nanoparticles functionalized with cationic and anionic side chains // Bioconjug. Chem., 2004. V. 15 (4). - P. 897-900.

165. Schubert D., Dargusch R., Raitano J., Chan S.W. Cerium and yttrium oxide nanoparticles are neuroprotective // Biochem; Biophys. Res. Commun., 2006. V. 342 (1). - P. 86-91.

166. Zhao'X.,. Striolo'A., Cummings P.T. G60 binds to and deforms nucleotides // Biophys. J., 2005. V. 89 (6). - P. 3856-3862.

167. Dybdahl M., Risom L., Bornholdt J., Autrup H., Loft S., Wallin H. Inflammatory and genotoxic effects of diesel particles in vitro and in vivo // Mutat. Res., 2004. V. 562 (1-2). - P. 119-131.

168. Knaapen A.M., Seiler F., Schilderman P.A., Nehls P., Bruch J., Schins R.P., BornrP.J. Neutrophils cause oxidative DNA damage in alveolar epithelial cells // Free Radic. Biol. Med., 1999. V. 27 (1-2). - P. 234-240.

169. Baldwin E.L., Byl J.A., Osheroff N. Cobalt enhances DNA cleavage mediated by human topoisomerase II alpha in vitro and in cultured cells // Biochemistry, 2004. V. 43 (3). - P. 728-735.

170. Van Leeriputten E., Horisberger. M. Immobilization of Enzymes on Magnetic Particles // Biotechnology and Bioengineering, 1974. V. 16. - P. 385396. . ; . .

171. Везер В. Фосфор и его соединения / В. Везер. М: Изд-во иностранной литературы, 1962. - 690 с. ■

172. Cavaluzzi M.J., Bôrer P.N. Revised UV extinction coefficients for nuclëosidë-5'-monophosphates and unpairediDNA and RNA // Nucleic Acids Res.,, 2004. V. 32 (1). - P. el3.

173. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное' клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. М.: Мир, 1984 - 480 с.

174. Золотарев В.М., Лыгин В.И;, Тарасевич Б.Н. Спектры внутреннего отражения поверхностных соединений и адсорбированных молекул // Успехи химии, 1981.- Т. 50 (1). С. 24-53.

175. Tsuboi М. Application of Infrared Spectroscopy to Structure Studies of Nucleic Acids // Applied Spectroscopy Reviews, 1970. V. 3 (1). - P: 45-90.

176. Rivetti C., Guthold M., Bustamante C. Scanning* force-microscopy of DNA deposited onto mica: equilibration versus kinetic trapping studied by statistical polymer chain analysis // J. Mol. Biol., 1996.- V. 264'(5). P. 919-932.

177. Parikh S.J:, Chorover J. ATR-FTIR spectroscopy reveals bond formation during bacterial adhesion to iron oxide // Langmuir, 2006. V. 22 (20). - P. 84928500.

178. Wijnja H., Schulthess C.P. Carbonate Adsorption Mechanism on Goethite Studied with ATR-FTIR, DRIFT, and Proton Coadsorption Measurements // Soil Science Society of America J., 2001. V. 65. - P. 324-330.

179. Bargar J.R., Kubicki J.D., Reitmeyer R., Davis J.A. ATR-FTIR spectroscopic characterization of coexisting carbonate surface complexes on hematite //Geochimica et Cosmochimica Acta, 2005. V. 69 (6). - P. 1527-1542.

180. Джайлс Ч. Адсорбция из растворов на поверхности твердых тел / Ч. Джайлс, Б. Инграм, Дж. Клюни и др. М.: Мир, 1987. - 488 с.

181. Stern O.Z. // Electrochemistry, 1924. V. 30. - P. 508.

182. McBride M.B. A Critique of Diffuse Double Layer Models Applied to Colloid and Surface Chemistry // Clays and Clay Minerals, 1997. V. 45 (4). - P. 598-608.

183. Hayes K.F., Papelis C., Leckie J.O. Modeling ionic strength effects on anion adsorption at hydrous oxide/solution interfaces // J. of Colloid and Interface Sci., 1988. V. 125 (2). - P. 717-726

184. Taillandier E., Liquier J. Infrared spectroscopy of DNA // Methods Enzymol., 1992.-V. 211.-P. 307-335.

185. Tajmir-Riahi H.A. Interaction of La (III) and Tb (III) ions with purine nucleotides: evidence for metal chelation (N-7-М-РОЗ)» and the effect of macrochelate formation on the nucleotide sugar conformation // Biopolymers, 1991.-V. 31 (9).-P. 1065-1075.

186. Lindqvist M., Graslund A. An FTIR and CD study of the structural effects of G-tract length and sequence context on DNA conformation in solution // J; Mol. Biol., 2001. V. 314 (3). - P. 423-432.

187. Dev S.B., Walters L. Fourier transform infrared spectroscopy for the characterization of a model peptide-DNA interaction // Biopolymers, 1990. V. 29 (1).-P. 289-299.

188. Malonga H., Neault J.F., Arakawa H., Tajmir-Riahi H.A. DNA Interaction with Human Serum Albumin Studied by Affinity Capillary Electrophoresis and FTIR Spectroscopy // DNA and Cell Biology, 2006. -V. 25 (1). P. 63-68.

189. Neault J.F., Naoui M., Manfait M., Tajmir-Riahi H.A. Aspirin-DNA interaction studied by FTIR and laser Raman difference spectroscopy // FEBS Lett., 1996. V. 382 (1-2). - P. 26-30.

190. Dagneaux G., Liquier J., Taillandier E. Sugar conformations in DNA and RNA-DNA triple helices determined by FTIR spectroscopy: role of backbone composition // Biochemistry, 1995: V. 34 (51). -P! 16618-16623;

191. Fritzsche HI, Akliebat A., Taillandier E., Rippe K., Joyih T.Mi Structure:and drug interactions of parallel-stranded: DNA studied by infrared spectroscopy and fluorescence•// Nucleic Acids Res., 1993. V 21 (22): - P.6 5085-509V. ,

192. Xu Q.S.,Kucera R.B., Roberts RJ"~Guo H.C. An asymmetric complex of restriction endonuclease Mspl on its palindromic DNA recognition site // Structure, 2004. -V. 12 (9). P; 1741-1747.

193. Jang N.H. The Coordination Chemistry of DNA Nucleosides on Gold Nanoparticles as a Probe by SERS // Bull. Korean Chem. Soc., 2002. V. 23 (12). -P. 1790-1800.