Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие гербицидов группы динитроанилина и их метаболитов с почвенной микрофлорой

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие гербицидов группы динитроанилина и их метаболитов с почвенной микрофлорой"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

АКИМЕНКО Лариса Ивановна

ЭДК 632.954:631.427.22

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЕРБИЦИДОВ ГРУППЫ ДИНИТРОАНИЛИНА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ С ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград — 1990

Работа выполнена в лаборатории физиологии действия гербицидов Института физиологии растений и генетики АН УССР.

Научный руководитель

— кандидат биологических наук Мережинский Ю. Г.

Официальные оппоненты

— доктор биологических наук, профессор Круглое Ю. В.

доктор биологических наук Коваль Э. 3.

Ведущее предприятие

— Институт коллоидной химии и химии воды АН УССР

Защита состоится « 7 »1990 г. в « ' » час. на заседа нии специализированного совета К 025.26.01 по присуждению ученой степеш кандидата биологических наук во Всесоюзном научно-исследовательском ин ституге сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 188620, Ленинград -Пушкин, 6, шоссе Подбельского, д. 3, ВНИИСХМ.

Автореферат разослан « >_ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

А. Н. Зарецка:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях интенсификации и- индустриализации сельскохозяйственного производства широкое применение нашли химические средства защиты растений - пестициды. К 2000 году мировое производство пестицидов должно достигнуть 2,5-2,7 млн. т дей-ствумего вещества. В ассортименте всех видов пестицидов большая роль отводится гербицидам - 42,6-55,6% (Унанянц, 1981).

Довольно эффективно и длительный период в сельском хозяйстве всех стран мира используются гербициды трупа-) динитрранилина. Наиболее широко применяется для борьбы с сорняками на посевах овоанцл, сои, хлопчатника, подсолнечника и других культурах гербицид треф-лан, В настоящее время в нашей стране начато производство отечественного аналога этого гербицида - нитрана.

Долгое время применение пестицидов оценивалось лишь их экономическим эффектом, но многолетнее, широкомасштабное использование показало, что они могут наносить вред окружающей среде. Большое значение в последнее время приобретает контроль за накоплением продуктов разложения ксенобиотиков в природе, определение их токсичности, мутагенности. Для почвенных препаратов необходимо учитывать степень их токсического действия на формирование и функционирование сообществ почвенных микроорганизмов, играющих важную роль в плодородии почв. Знание основных закономерностей поведения гербицидов в природе, путей их превращения, устойчивости и токсичности образующихся в процессе деградации метаболитов необходимо при разработке рекомендаций по рациональному использованию гербицидов, как с экономической точки зрения, так и с точки зрения охраны окружающей среды.

■На необходимость проведения работ по защите окружающей среды от нежелательного воздействия пестицидов указывается в Постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР "С коренной перестройке дела охраны природы в стране" (1968).

Каждое природное соединение и практически все ксенобиотики подвергаются микробиологической трансформации. Микроорганизмы являются основам, определяющим звеном круговорота веществ в природе. Активное участие почвенной микрофлоры в разложении гербицида тре£-лана и его воздействие на микрофлору, по-видимому, не являются исключением из общего правила.

Пробстом (1975) предложена схема разложения трефлана в почве и воде, однако, роль микробиологического фактора в этом процессе отрицается.

Мы полагаем, что исследование взаимодействия трефлана и продуктов его трансформации с почвенной микрофлорой, определение их персистентности и токсичности представляет как теоретический, так и практический интерес.

Цель настоящей работы состоит в изучении роли микробиологического фактора в деструкции трефлана, выявлении и идентификации доминирующих продуктов биодеградации, определении их персистентности, динамики образования, токсичности, а также определении их воздействия на почвенную микрофлору.

Необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать влияние трефлана на численность микроорганизмов основных таксономических групп в почве;

- определить скорость биодеградации и особенности сорбции трефлана микромицетами;

- изучить характер и динамику трансформации трефлана под действием микроорганизмов;

- выявить и идентифицировать доминирующие продукты биотрале-формации препарата в культуральной среде и биомассе микромицетов;

- определить персистентность выявленных метаболитов трефлана;

- установить токсичность основных продуктов деградации для микроорганизмов, растений и животных.

Научная новизна. В работе впервые получены следующие данные:

- установлена роль микроскопических грибов в процессе деградации трефлана;

- определены основные продукты деградации трефлана в почве и кадкой культуре микроорганизмов;

- определена лерснстентность основных продуктов деградации гербицида в почве;

. - показана токсичность продуктов деградации трефлана для животных и растений.

Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования имеют значение для экотоксикологической оценки влияния трефлана (нитрана) на биологические обьекты и научного обоснования рациональных и безопасных приемов применения этого гербицида. Образование в почве продуктов биотрансформации (ТР-3 и ТР-13), более лер-систентвдх и токсичных, чем сам гербицид, свидетельствует о необхо-

димости детального рассмотрения процессов деградации ксенобиотиков и токсикологической оценки образующихся метаболитов,при установлении предельно допустишх концентраций препаратов в почве н сельскохозяйственной продукции.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на У1 сьезде Украинского микробиологического общества (Донецк, 1984), на двух Всесоюзных конференциях "Роль почвенных микроорганизмов в деградации пестицидов и охране окружающей среды" (Ленинград, 1983, 1987).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, шводсв и заключения; изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 24 таблиц и 23 рисунка. Список литбратурц включает 233 наименования, в том числе - 102 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОД! ИССВДОВАШЙ

Объектом исследования служил гербицид трефлан, а также его отечественный аналог - нитран. Действующее вещество этих препаратов - 2,6-динитро-4-трифтсрметил- ц,н -дипропиланилин. Нитран и продукты его трансформации (10 метаболитов) синтезированы в Институте органической химии Ail УССР. Кроме того, для сопоставления скорости деградации различных производных динитроанилина в зависимости от их химической структуры был использован новый препарат ленитран (д.в. - 3,4-диметил-2,6-динитро-Н -пентил-3-анилин) и его химический аналог - 3,4-диметил-2,6-дшштро-н-бутил-анилин. Зти гербицида представлены для исследования БНИТИГ, В работе были также использованы гербицидные смеси: трефдан ■+ эгггам, трефлан + девринол.

Влияние гербицидов на почвенную микрофлору изучали в условиях модельных лабораторных, вегетационных и полевых опытов на двух типах почв - лугово-черноземной и дерново-подзолистой. Вегетационные ошты проводили в Институте физиологии растений и генетики Ail УССР в течение 3-х лет с внесением гербицидов под культуру сои (сорт Нива) и томатов (сорт Киевский ранний). Полеше опыты (3 года) ставили на Винницкой опытной станции Украинского института кормов. Для анализа использовали почву меэдурядий и ризосферы растений.

Микробиологические анализы проводили общепринятыми методами, а также методами рекомендаций Всесоюзного НИИСМ (1981).

При постановке лабораторных опытов почву подсушивали, просеивали, доводили ее влажность до 60? ¡~ в. В навегку почш (600 г)

вносили раствор гербицида, тщательно ее перемешивали и переносили в стеклянный сосуд. Инкубацию проводили при температуре 28°С. В зависимости от целей огитов использовали концентрации гербицидов как на уровне производственных доз, так и превышающие их (I, 5, 10, 25, 50, 100 мкг/г).

Микробиологические анализы проводили на 1, 7, 14, 30, 60, 90-е Чутки после внесения гербицида. Численность аэробных сапрофитных бактерий определяли методом посева почвенных суспензий на почвенный агар (ПА), актиномицетов - на крахмало-аммиачный агар (КАА), грибов ~ на сусло-агар (СА), нитрификаторов - на выщелоченный агар с аммонийной магниевой солью, целлюлоэоразрушающие микроорганизма -на среду Пушкинской со стерильным фильтром (Литвинов, 1959).

Выделение культур, способных развиваться при высоких концентрациях токсиканта проводили модифицированным методом Кокка (цит.по stralka, Campar, 1982). Определение видового состава грибов, сог-1. оно договору о научном сотрудничестве, проведено сотрудниками отдела физиологии грибов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР.

Оценку токсичности трефлана и продуктов его деградации для чистых культур бактерий, грибов и актиномицетов проводили общепринятыми методами диффузии в агар и серийных разведений.

При изучении трансформации трефлана в почве и монокультурах почвенных микроорганизмов использовали разработанные нами методы экстракции и хроматографического анализа (ГЖХ и ТСХ) гербицида и его метаболитов. Экстракцию токсикантов из почвы, водной среды и биомассы микроорганизмов производили органическими растворителями (метанолом, гексаном) в соответствии с подобранными условиями их максимального извлечения. Хроматографическое разделение метаболитов в тонком слое производили на пластинках "Силуфол-254" с использованием 7 различных смесей полярных и неполярных растворителей. Для определения трефлана и его метаболитов использовали газовый хроматограф "Цвет-106",оснащенный детектором постоянной скорости рекомбинации. Разделение осуществляли на колонках с силиконовыми неподвижными фазами (5/6 Е-ЗС и Ь% XE-6G), нанесенными на хроматон H-AW шсз (0,16-0,2 мм). В качестве газа-носителя применяли аргон, расхода которого составляли: на подяувку - 150 мл/мин, через колонку -50 мл/мин. Температура термостата колонок - 180°С, испарителя и термостата детектора - 230°С. Минимально детектируемые количества метаболитов 0,1-0,6 мкг.

Выявленные в почве или биомассе микроорганизмов продукты

трансформации трефлана элюировали с пластинок "Силуфол" с толстым слоем сорбента, получали в достаточном количестве и идентифицировали. Идентификацию метаболитов проводили путем снятия ИК-спектров, гаэохроматографической характеристики - определения времени удерживания (Rt ) на двух типах колонок, характеристики их поведения в тонком слое ( Rf ) и сопоставления всех полученных данных с характеристиками соединений-стандартов.

Для дополнительной идентификации метаболитов применяли такте метод электронных спектров диффузного отражения (ЭСДО). Использовали спектроденситометр КМ-З "Оптон". Нижний предел определения метаболитов этим методом - 0,1 мкг яа пластинке.

При изучении способности микроорганизмов метаболизировать трефлан, их заращивали на жидких питательных средах (Чапека, Даон-сона, Прздгейма), содержащих 20-50 мкг/мл гербицида, при температуре 28°С, на качалке (480 об/мин). Определяли также трансформационную активность 7-10-суточшх клеток грибов, отштых стерильным фосфатном буфером и перенесенных на среду Чапека с трефланом и косуб-стратом. Учитывали убыль гербицида в культур&льной среде и мицелии, качественный и количественный состав метаболитов.Отбор проб для анализа проводили в динамике роста микроорганизмов - на 5, 1С, 15 и ЗС-е сутки.

Основная работа по трансформации трефлана ыикромицетачи проведена на четырех культурах пенициллов, отобранных в качестве активных биодеструкторов (ienicilliim urticae шт. 2850, PenicilHum 1апозшл шт. S64C, ienicillium wortmunnii шт. 12473, Penioilli-um expanaum шт. 134). Определение токсичности метаболитов трефлана для растений проводили общепринятыми методами, Среднесмертельную дозу для животных определяли на шшах, расчеты ЛД^д производили по методу В.Б.Прозоровского (1969). Математическую обработку данных проводили методами вариационной статистики (Молостов, 1955).

ОСНОЫЮЕ СОДЕКШИЕ РАБОТЫ

Влияние производных днннтроанилина на почвепвую микрофлору

Необоснованное применение таких сильнодействуюших факторов сельскохозяйственного производства как пестициды и минеральные удобрения может нарушить пределы устойчивости почш, как поил ой саморегулирующейся системы. В результате этого уже сейчас н&блвдакся отрицательные последствия манипулнро.-- ния некоторыми прис-г.аын об-

1*-0152 5

в

работки почв и внесения химикатов в виде все возраставших потерь ■ПУМуса, накопления нитратов и загрязнения пестицидами. Возникла необходимость всестороннего подхода к изучению влияния антропогенных факторов на жизнедеятельность микроорганизмов, их численность, видовой состав и интенсивность осуществляемых процессов.

Главной задачей исследований, представленных в этом разделе работы, является определение влияния трефлана на основные физиологические и таксономические группы микроорганизмов в лугово-черно-земной и дерново-подзолистой почвах. Изучалась также токсичность для микроорганизмов основных, доминирующих продуктов деградации трефлана. Кроме того, исследовалось действие на почвенную микрофлору комплексов трефлана с другими гербицидами (трефлан+девринол, 10 мкг/г + 10 мкг/г; трефлан+эптам, 10 мкг/г + 10 мкг/г).

Определено влияние трефлана на рост чистых культур - типичных представителей почвенной микрофлоры. Установлено, что наиболее ^ _1ствительшми к действию трефлана являются дрожжи и бактерии (Шюй. гиЪга, Bac.mesenteri.cu3, Бас.виЪиИа И др., 1-10 мкг/мл). Актиномицеты имеют несколько большую устойчивость и способны расти на среде с содержанием 100 мкг/мл гербицида. Наиболее устойчивы к действию трефлана грибы, особенно пеняциллы. В жидкой среде с содержанием гербицида хООО мкг/мл культуры Рвп.шЧ1сае,Лор.п18ег угнетены, но при более низких концентрациях даюгг нормальный рост и спорообразование. Более чувствительны к гербициду, чем пенициллы и аспергиллы, грибы рода Уиваг1ш. Их развитие в водной среде угнетено при концентрации 1СЮ мкг/мл.

Исследована антимикробная активность метаболитов трефлана ТР-2, ТР-3, ТР-4, ТР-8, ТР-13 (по номенклатуре Голаба с соавт., 1975) и сопоставлена с активностью гербицида. Установлено, что фунгистатическая и бактериостатическая активность всех исштаяных метаболитов, за исключением ТР-2 (монодеалкилированного продукта) выше, чем самого гербицида в 10-25 раз.

Изменение видового состава и численности основных таксономических и физиологических групп микроорганизмов под действием трефлана имело общие закономерности как в условиях лабораторных, так и в вегетационных и полевых опытах.

Внесение в почву трефлана (10 мкг/г) в условиях лабораторного огата показало наличие 3 -образной кривой колебания численности микроорганизмов, за исключением микромицетов. Как было ранее уста-

(

новлено, грибы являются наиболее устойчивыми к действию токсиканта. Трефлай в указанной дозе шзывает возрастание численности грибов в 15-19 раз по отношение к контролю как в дерново-подзолистой почве, так и в луговом черноземе на 90-й день после обработки почш гербицидом. Значительное увеличение количества грибов происходит за счет интенсивного развития отдельных видов пенициллов и аспергиллов.

Общее количество микроорганизмов'снижается в первый период после обработки почвы завышенной дозой гербицида (10 мкг/г) на 70% в дерново-подзолистой почве и на 20$ в луговом черноземе. В дальнейшем (на бС-й день) наблвдается возрастание численности микроорганизмов (в 5-6 раз). К концу периода исследований общее количество микроорганизмов приближается к уровню контроля.

Под действием трефлана количество актиномицетов снижается на 20% в дерново-подзолистой и на 40% в лугово-черноземной почвах че- ' рез 30 дней после обработки. Уровень содержания актиномицетов на 60-й день в дерново-подзолистой почве превосходит содержание их в луговом черноземе. Более устойчивой к воздействию гербицидов была и популяция целлшоэоразрушающих микроорганизмов дерново-подзолистой почвы. К концу периода наблюдений после значительного угнетения (60$ на 30-й день и 75% - на 60-й день) количество целлшозоразру-шаюших микроорганизмов составляло 17555 по сравнению с контролем. В то время как в луговом черноземе популяция оставалась в подавленном состоянии на протяжении всего периода исследования: 60$ на 30-й день, 80% - на 60-й день и 75% - на 90-й день.

Наблюдалось различие во влиянии трефлана на нитрификатори в различных типах почв. Устойчивое возрастание количества нитрифицирующих микроорганизмов характерно для дерново-подзолистой почвы (в 7-8 раз на 90-й день). В то время как в луговом черноземе на 30-й день после, обработки количество нитрификаторов оставалось на уровне контроля, на 60-й день составило лишь 40%. Стимуляция развития нитрификаторов отмечена на 9С-Й день и после обработки.

Совместно с сотрудниками Украинского института кормов проведены исследования действия дробных доз трефлана: 0,75 кг/га, 1,0 кг/га, 1,25 кг/га на основные таксономические группы микроорганизмов в условиях двухлетних полевых опытов. По результатам количественного учета микрофлоры мевдурядий установлено, что при внесении трефлана в указанных концентрациях наблюдается стимуляция развития грибов в течение 4-месячного периода наблюдений. Актиноыицеты белее чувствительны к различным дозам токсиканта .3 перше две недели после обра-

ботки. Доза 0,75 кг/га незначительно подавляла развитие актиномице-тов, при внесении 1,25 кг/га трефлана отмечено более сильное угнетающее действие. В дальнейшем различия во влиянии уменьшаются и колебания численности актиномицетов аналогичны в разные сроки отборов.

Бактерии, учитываемые на МПА, угнетались в первые 2 недели после обработки по сравнению с контролем всеми тремя дозами гербицида. К концу вегетационного периода наблюдалось восстановление популяции, а в случае применения дозы 1,25 кг/га - увеличение численности микроорганизмов.

Среди первоочередных задач сельскохозяйственного производства одно из важных мест занимает создание индустриальных -технологий выращивания растений, предусматривающих снижение пестицццной нагрузки. Достаточно эффективным методом в этом направлении является создание смесей и комплексов пестицвдов-синергистов.

В условиях вегетационных опытов с растениями томатов изучено влияние трефлана, девринола, эптама и их комплексов на общее количество микроорганизмов, грибов, актиномицетов (табл. I).

Таблица I

Действие трефлана, девринола, эптама и комплексов этих

гербицидов на почвенную микрофлору (Вегетационный опыт, культура - томаты, сорт Киевский ранний)

Варианты 'Нормы 'Общее коли-епыта :герби-:чество микро-

.цадов,.организмов, 'мкг/г * 10б/г

Количество актиномицетов, Ю6/г

Контроль (без гербицидов)

Трефяал

девринол

Эпт&\5

Трефлал+девринол Трефлан+эптам

195,32*12,91 16,90+1,12 18,37±1,33

10 20

I15,22+3,39 117,98+9,84

169,61+11,59 120,07+11,80

14Г' 81+8,10 96,01+7,07

10+10 82,34+4,56

10+10 42,20+2,12

10 20

10 20

20,65+1,38 ¿4,80+1,31

.22,74+1,38 7,45+0,51

10,34+0,93 21,96^1,02

12,82+0,78

10,67+0,69

12,44+1,07 12,07+0,97

16,01+1,47 10,71^0,91

13,96^1,03 8,71+0,61

8,90+0,54

4,06+0,29

Установлено, что при комплексном применении трефлана с деври-нолсм усиливается угнетающее действие гербицидов на общее количест-

во микроорганизмов по сравнению с действием одного трефлана. Так, при доза 10 мкг/г трефлана общее количество микроорганизмов составляет 115,22 млн/г почш, при дозе девринола i0 мкг/г - 169,6х млн/г, а при комплексном применении (10 мкг/г + 10 мкг/г - 82,34 млн/г), тогда как на трефлане в дозе 20 мкг/г - 117,98 млн/г, а на деври-ноле (20 мкг/г) - 120,07 млн/г. Уменьшается также при обработке почш комплексом гербицидов и количество грибов и актиномицетов. В вариантах с эптамом наблюдается аналогичное усиление угнетающего действия комплексов гербицидов на почвенную микрофлору по сравнению с раздельным применением гербицидов.

Разложение и сорбция трефлана почвенной микрофлорой

Как известно, трефлан относится к группе среднеустойчишх гербицидов и трансформируется в почве от б месяцев до 2-х лет в зависимости от почвенно-климатических условий и других факторов.

В деградации этого гербицида, наряду с физико-химическими факторами, по-видимому, существенную роль играет почвенная микрофлора. Однако, литературные данные о значении микробиологического фактора в инактивации трефлана в почве противоречивы ( Probat, et al., 1975: 3tralka, Camper, 1981).

Нами исследовано разложение трефлана и других производных ди-нитроанилина'микроорганизмами различных таксономических групп. Установлено, что активная роль в этом процессе принадлежит микроскопическим грибам, особенно пенициллам и аспергиллаы, доминирующим в верхнем горизонте почвы (0-10 см). Трефлан слабо мигрирует по профилю почш и аккумулируется, в основном, в этом горизонте.

Изучена способность разрушать трепан у ыикромицетов, выделенных из почв методом накопительных культур (55 изолятов), а также у музейных культур пенициллов, характерных для почв Украшы (12 видов - 16 штаммов) и аспергиллов 14 вида-8 штаммов). Наиболее активные деструкторы трефлана среди выделенных микроыицетов идентифицированы как Penicillium lanoaum; Jeniolllium Urticas; Aspergillus огузае.

Сопоставление скорости разложения трефлана чистыми культурами микромицетов-гДеструкторов показало, что этот гербицид, как в водной культуре, так и в ияокулированной грибами простерилизованной почве, разлагается интенсивней, чем в стерильных условиях. Так, в простерилизованной, ияокулированной грибами PeniciIlium Urtica» и fenioillium lanosum почве с внесением косуботратов

О

(сахароза 0,05%, Иа-молочнокислый 0,01%) остаточные.количества трефлана через 6 недель составили 20,3 и 20,4% от исходного, при 60,4% в контроле (стерильная почва, табл. 2).

Таблица 2

Деградация трефлана в простерилизованной и инокулировонной пенициллами почве (остаточные количества гербицида, мкг/г, %)

{культура микромицетов

Продолжительность культивирования

3 недели

6 недель

мкг/г ' % к ис~ ' МК1/1 : ходному :

мкг/г

: % к ис-: ходному

Контроль, 36,50^0,26

стерильная .среда

Реп.игИсае

шт. 2650

РепДапозига п,- $640

72,2 30,73+0,69

20.7010.25 40,4 И,20±0,17

25.2610.26 50,2 12,43^0,24

60,4

20.3

20.4

Примечание: внесено в почву 50 мкг/г трефлана.

Установлено, что деградационная активность различных пеницил-лов (16 культур) варьировала в зависимости от вида и штамма. При культивировании этих микромицетов в водной среде Чапека с сахарозой (0,05%) и гербицидом (50 мкг/мл) через 14 суток остаточные количества последнего в 1$гльтуральной жидкости составляли 0.5-25% от исходного. Однако, убыль гербицида из среды еде не свидетельствует о его разложении. Значительное количество токсиканта сорбируется биомассой микроорганизмов. Использованные в огытах микромицеты сорбировали от 20 до 60% гербицвда. Из них количество прочно связанного гербицида составляло 20-25%.

Установлена прямая зависимость количества сорбированного гербицида от концентрации его в среде. При определении интенсивности сорбции гербицида мицелием гриба в зависимости от количества биомассы наблюдается обратная зависимость.

Клетки гриба, живые и убгтые, по-разному сорбируют трефлан. Результаты опытов показали, что убитые клетки пенициллов прочно связывают примерно в 1,5-2 раза больше трефлана, чем живые. Разницу между этими величинами составляет количество трансформированного гербицида.

Таким образом, исследование сорбционно-десорбционных взаимодействий трефлана с клетками микромицетов показало, что они обус-

ловлена состояние« клеток, концентрацией гербицида в среде, количеством биомассы и, возможно, морфологическими о$обенностями кикромицетов.

Следует отметить, что для иикробиологической деструкции производных динитроанилина необходимо присутствие в среде специфических источников углерода - косубстратов. Из литературных данных известно, что разложение трефлана происходит в соокислительных условиях (Jacobaon, О'Мага, Alexander, 1980).

Нами была проведена работа по определению зависимости скорости разложения от замены боковых радикалов у некоторых производных динитроанилина (трефлан, пенитран и аналог пенитрана) в почве под соей в условиях вегетационных огитов (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная характеристика скорости разложения производных динитроанилина в лугово-черноземной почве (под культурой сои)

Гербициды

Структурная" Концент--Исходное * формула :рация ¡количество: .токсиканттоксикант •та в поч- мкг/г __: ве. мкг/г:_

Фазы роста и развития растений_

цветения

созревания

Трефлан

Пенитран

Аналог пентрана

.HCffCjH, jC^'yA^A'O,

»■*-CH(c,ns)t

■"OS

сч,

"ОС

с».

1,0 2,5

5,0

i.O 2,5

5,0

1.0 2,5

5,0

0,94*0,02 2,37*0,17 4,20*0,16

0,82*0,01 2,17*0,07 4,32^0,06

0,71+0,01 1,75*0,03 4,12±0,04

0,223+0,090 0,637*0,037 1,213*0,014

0,171*0,050 0,40^0,080 0,552*0, GIG

О,055*0,003 0,157*0,006 0,360*0,006

0,175*0,006 0,454*0,034 0,856*0,023

0,135*0,003 0,316*0,007 0,444*0,015

0,044*0,002 0,085*0,003 0,268^0,001

В результате проведенной работы установлено, что уровни остаточных количеств аналога пенитрана в 4-5 раз ниже чем трефлана и в 2-3 раза, чем пенитрана.

Таким образом, замена пропильных радикалов трефлана (СдИ^ на СЖС^Н^^ у пенитрана приводит к некоторому повышению скорости разложения гербицида. В то же время, замена пентильного радикала пенитрана на С^Нд у его аналога значительно повышает скорость его разложения. Ускоряет разложение, возможно, и замена прочно связанного с молекулой радикала СР- на С!IV.

Микробиологическая трансформация трефлана и токсичность его метаболитов

Схема трансформации трефлана и других гербицидов груши ди-нитроанилнна в аэробных и анаэробных почвенных условиях предложена Пробстом (Probst, 1975).

Целью наших исследований было изучение особенностей метаболи-эации трефлана микроскопическими грибами, определение уровней количественного накопления метаболитов в среде и биомассе микроорганизмов. Литературные данные о количественном накоплении метаболитов в клетках микроорганизмов и почвы нам неизвестны.

Большое внимание в работе было уделено исследованию динамики появления метаболитов в почве при биодеградации гербицида. Сопоставлялись пути и закономерности трансформации трефлана чистыми культурами микроорганизмов с его метаболизмом в простерилиэованной инокулированной микромицетами и естественной нестерильной почве.

Установлено, что трефлан трансформируется в культурах грибов цутеы деалкилирсвания его молекулы, восстановления нитрогрулп, а также образования бициклических структур - производных бензими-дазола. Метаболиты обнаружены в основном в мицелии пенициллов и аспзргиллов, в культуральной среде их содержание незначительно. Процесс трансформации, по-видимому, происходит внутриклеточно, что обусловлено интенсивной аккумуляцией трефлана в мицелии. В клетках грибов в зависимости от вида и штамма, продолжительности и условий шравдвания присутствуют от двух до семи метаболитов гербицида. Наибольшее количество метаболитов выявляли на 15-20-е сутки роста.

При изучении динамики появлений метаболитов трефлана в клетка* микроыицетов и культуральной среде вследствие его трансформации ус-таноЬлено, что первым накапливается продукт неполного деалкилирова-яия молекулы гербицида. Аналитические характеристики выделенных доминирующих метаболитов приведены в табл. 4,

В меньших количествах накапливаются в клетках пенициллов н ас-пергиллов метаболиты ТР-3, ТР-6, ТР-7 и др. Следует отметить, что метаболит ТР-3 (полностью деалкилированная молекула гербицида) ÜJCTpo восстанавливается в культурах грибов до ТР-б (деалкилированная частично восстановленная молекула). Очень нестоек метаболит ТР-7, он окисляется и дает ряд неидентифицированных нами продуктов.

В инокулированной грибами почве при разложении гербицида в основном сохраняется-характер его метаболиэации. В чистых культурах пенициллов, шращенных в водной среде, в отличие от

Таблица 4

Аналитические характеристики трефлана и его доминирующих метаболитов

Тазожид-'Тонкослой-'Максимумы элект-:костная ;ная хрома-:ронных спектров .хромато-.тография, .диффузного отра-• гоафия, • % • жения Д , нм : мин : :

Изучаемое соединение

Е~30,ХЕ-60

ТР-1 - 2,6-динитро-4- 2,8 3,3 0,76 трифторметил- к.н -дипро-пиланилин

ТР-2 - 2,6-динитро-4-три- 2,7 5,3 0,65 фторметил- н -пропиланилин

ТР-4 - 2-нитро-4(трифтор- 3,9 7,1 0,60 метил)-6-амино-Л ,й-дипропиланилия

ТР-13 - 2-этил-7-нитро- 4,6 6,6 о,50 5(трифторметил)-пропил-бензимидазол

Примечание. Значение Яг определено в системе ацетон - гексан (1:2).

238 275 424

242

260 327

206 229 254 345

203 235 331

трансформации трефлана в почве в; значительно больших количествах накапливаются метаболиты ТР-4 и ТР-13, а также шире спектр образующихся продуктов трансформации, В инокулированной пенициллами про-стерилизовашой почве в больших количествах выявлены метаболиты ТР-2, ТР-3, ТР-6, ТР-13 и другие неидентифицированкые соединения. В естественных нестерильных почвах обнаружено значительно меньше метаболитов, доминирующие соединения - ТР-2, ТР-4.

В результате проведенных исследований установлено, что в биомассе микромицетов при разложении трефлана образуются в значительных количествах следующие метаболиты: 2-нитро~4~тр::фторметил-6-амино- н.к_дипропиланилин (ТР-4), 2-этил-7-нитро-5(трнфторметил)-пропилбензимидазол (ТР-13), 2,б-динитро-4-трифторметил- Н-пропил-анилин (ТР-2). Наиболее часто и в наибольшем количестве в клетках микромицетов накапливается метаболит ТР-4 - продукт восстановления одной нитрогруппы до аминогрупш в молекуле. Его содержание « мицелии пенициллов составляет 17-45% от внесенного в среду гербицида. Представляет интерес метаболит ТР-хЗ, структурно более сложный,

чем трефлая. Количество его в мицелии грибов значительно нике - 2-5$ от внесенного гербицида (табл. 5).

Таблица 5

Накопление метаболитов в мицелии микромицетов при трансформации трефлана

Грибы

Мета-'Хроматографическая ха- 'Количество метаболи-боли-грактеристика метаболитов:тов в биомассе грибов

™ :шявленные : стандарты :мкг на:% от :% от

.метаболиты . .1г су-.коли- :внесен-

•-■-:-'хого 'чества .ного в

: ТСХ,: ГЖХ,: ТСХ,: ГКХ, :мице- :трефла-'среду . . Л,. . п. . й«. .лия .на в :треф-: . . х Гмицелии.лана

ТР-4 0,53 6,50 0,56 6,53 4500,0 58,0 45,0

0,50 6,58 0,56 6,53 1900,0 47,0 19,0

0,55 6,50 0,56 6,53 336,0 50,0 17,0

ТР-13 0,40 11,20 0,45 11,28 320,0 8,0 3,2

0,40 11,25 0,45 11,28 216,0 5,4 2,1

0,50 11,12 0,52 11,20 150,0 60,0 4,5

Реп.игНсае шт. 2850 РепДаповит ШТ. 9540 Авр.огувае ШТ. 124

Pen.urti.cae шт. 2Ё50 РепДаповит ШТ. 9640 Авр.огувае шт. 124

Сопоставление особенностей метаболизма трефлана в монокультурах микромицетов на питательных средах и почве с метаболизмом в нестерильных почвах, наличие идентичных метаболитов свидетельствуют о существенной роли микробиологического фактора в процессе деградации этого гербицида.

• Нами установлено, что образующиеся при разложении трефлана метаболиты могут интенсивно поступать в растения. В связи с этим (ыла изучена, токсичность доминирующих интермедиатов для животных и растений.

Данные о токсичности метаболитов трефлана в известной нам литературе отсутствуют.

Определение среднесмертельной доа1 изучаемых соединений на ь«шах показало, что клиническая картина интоксикации для всех препаратов однотипна и проявлялась уже на 1-е сутки. При введении в организм смертельных доз на 3-е сутки наблюдали паралич, гибель наступала в течение 5 суток. Раздражающего действия у всех изучаешь соединений не выявлено. В результате проведенных оштов уста-

г

новлено, что обравуидиеся в процессе трансформации гербицида метаболита - ТР-3 и ТР-13 - более токсичны, чем сам трефлан.

По ГОСТ 12.1.007-76 трефлан и его метаболиты ТР-2, ТР-4 следует отнести к ве«ест»ам 4-го класса опасности по показателям сред-носмертельной дозы при пероральном введении, а метаболиты ТР-3 и ТР-1Э - к 3-му классу опасности.

Исследования фитотоксичности продуктов разложения трефлана производили на устойчивой (соя) и чувствительной (просо) культурах. Проведенные огыты показали, что в результате деалкилирования моле-флы гербицида (ТР-2) препарат теряет активность в 8-10 раз. При восстановлении нигрогрупш до аминогрупгы в молекуле (ТР-4) токсичность падает больше - в 10-20 раз. Образование более сложной бицик-лической структуры (ТР-13) практически приводит к потере гербицид-ной активности.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при биотрансформации в почве образуются соединения, обладающие меньшей фитотоксичностьо, чем сам гербицид. В то же время по токсичности для животных они на уступают ему, а некоторые (ТР-3 и ТР-13) превосходят его.

Учитывая способность трефлана и его метаболитов интенсивно поступать в растения и аккумулироваться в корнях и корнеплодах, этот гербицид следует применять с большой осторожностью, особенно на овощных культурах.

вывода.

1. Трефлан оказывает как активирующее действие, так и ингибг -Чутев, на развитие микроорганизмов различных таксономических и физиологических групп в зависимости от применяемой дозы, почвенно-климаткческих условий и других факторов. Наиболее устойчивы к действию трефлана микроскопические грибы. Гербицид изменяет видовой состав микромицетов, стимулируя развитие некоторых видов грибов рода РвШсИИшв, АярегвШиа. Незначительно угнетаются сразу после внесения в почву произзодственных доз препарата актиномицеты, нитрификаторы, целлюлозоразрушашие микроорганизма и аэробные сапрофитные бактерии. Однако, через 1-2 месяца наблюдается увеличение количества этих микроорганизмов в почве по сравнению с исходным.

2. Применение комплексов гербицидов оказывает неадекватк' ч влияния на почвенную микрофлору по сравнению с обработками одним гербицидом. Так, в случае применения комплексов трефлан + девринол

и трефлан + эптаы ингибирующее действие токсикантов сильнее по сравнению с обработкой трефланом в равных концентрациях.

3. В процессе деградации трефлана в почве существенную роль играет микробиологический фактор. Активно трансформируют гербицид грибы рода Tenlcillium и Aspergillus , доминирующие в верхнем слое почвы. Почвенные микроыицеты-деструкто£и могут инактивировать в течение месяца до 70% трефлана. Важное значение в этом процессе имеет сорбция трефлана клетками микроорганизмов.

4. Впервые изучены динамика и условия метаболизма трефлана в водных и почвенных культурах микромицетов, а также количественное накопление его метаболитов в мицелии. При изучении динамики появления метаболитов показано, что первым накапливается продукт отщепления одной прояильной групги молекулы (метаболит ТР-2 - 2,6-динитро-4( трифторметил)- К-пропиланилин); далее - продукт восстановления

. одной нитрогрупш до амино - (метаболит ТР-4 - 2-нитрс-4(трифтор-метил)-6-амино-К,н-дипропиланилин) и бициклическая структура (TP-I3 - 2-зтил-?-нитро-5-трифторметил-К-пропилбензимидазол). В наибольшем количестве в клетках микроорганизмов образуется метаболит ТР-4 - до 30-40% - от внесенного в среду гербицида.

5. Скорость микробиологической деградации доминирующих продуктов трансформации трефлана различна. Метаболит TP-I3 обладает значительно большей персистентностью, чем гербицид, тогда как ТР-2 и ТР-4 близки к трефлану по скорости разложения.

6. При трансформации трефлана образуются соединения, обладающие меньшей фитотоксичностью, чем сам гербицид, в то же время, по токсичности для кивотных они не уступают ему, а некоторые даже его превосходят.

• 7. Поступление и возможное накопление трефлана и его метаболитов в корневой системе и корнеплодах растений указывает на необходимость строго регламентированного и ограниченного применения гербицида на овощных культурах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Васильченко В.Ф., Малецкая О.С., Акименко Л.И. Изменение почвенных сообществ микроорганизмов под действием некотощх гербицидов // Микробные сообщества и их функционирование в пичве,-Киев: йаукова думка.- IÖÖ-u- С. i.53-157, 2. Васильченко В.4., Дубровская A.A., Ыалецка» С.С., Акименко Л.И. Роль микроскопических грибов в инактивации и трансформации гьр-

бицидов в группы динитроанилина // Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой.- Киев: Наукова думка.- 1962.- С. 222-226.

3. Васильченко В.5., Дубровская A.A., Акименко Л.И., Абрамова К.А. Устойчивость и микробиологическая трансформация нитрана в водной среде // Микробиология очистки воды.- Киев: Наукова думка.-1982.- С. 70-79.

4. Малецкая О.С., Акименко Л.И., Васильченко В.Ф. Роль почвенных микромицетов в сорбции и деструкции персистентвдх гербицидов // Труды Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии.- Т. 52.- Ленинград, 1983.- С. 79-82.

5. Мережинский Ю.Г., Васильченко B.'i., Кофман И.Ш., Дубровская A.A., Акименко Л.И. Метаболизм трефлана в почве и поступление его метаболитов в растения // Механизм действия гербицидов и синтетических регуляторов роста растений.- Уфа, 1984.- С. 55-61.

6. Васильченко В.2., Мережинский Ю.Г., Дубровская A.A., Акименко Л.И. Роль микробиологического фактора в Г'активации и трансформации трефлана в почве // У1 сьезд Украинского микробиологического общества. Тезисы докладов, Донецк, июнь 1984 г.- Часть П, с.7-8.

7. Васильченко В.5., Дубровская A.A., Акименко Л.И., Бондарь В.А., Повякель Л.И- Еиотрансформация трефлала и токсичность его метаболитов // Регуляция физиологических функций растений.- Киев: Наукова думка.- 1986.- С. 227-233.

8. Васильченко B.tf., Акименко Л.И., Дубровская A.A., Мережинский Ю.Г. Персистентность и токсичность метаболитов трефлана // Бюллетень Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии.- 1987,- Т. 46, Ленинград,- С. 25-27.

9. Акименко Л.И., Васильченко B.S., Мережинский Ю.Г. Микробиологическая деструкция нитрана и его метаболитов // Применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве. Тезисы докладов. -Уфа, 1987.- С. 75-76.

10. Малецкая О.С., Дубровская A.A., Акименко Л.И. Микробиологическая деструкция гербицидов при их коыплексировании // УП сьезд Украинского микробиологического общества. Тезисы докладов. Черновцы, сентябрь, 1989 г., ч. I.- С. 216.