Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие альфа-кетоглутаратдегидрогеназы из грудной мышцы голубя с альфа-кетосубстратом и его структурными аналогами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие альфа-кетоглутаратдегидрогеназы из грудной мышцы голубя с альфа-кетосубстратом и его структурными аналогами"

^ ^ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, 'ч> ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ <ч ^ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ^ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.ВЛОМОНОСОВА.

V__

Биологический факультет

На правах рукописи

ПАВЛОВА Ольга Геннадьевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ а-КЕТОГЛУТАРАТДЕГИДРОГЕНАЗЬ1 ИЗ ГРУДНОЙ МЫШЦЫ ГОЛУБЯ С а-КЕТОСУБСТРАТОМ И ЕГО СТРУКТУРНЫМИ АНАЛОГАМИ.

( 03.00.04 - Биологическая химия )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико химической биологии им.А.Н.Белозерскош.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: академик С.Е.Северин кандидат биологических наук В.И.Буник

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук профессор Н.Н.Чернов доктор химических наук В.-Ю.К.Швядас

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт Биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится « » 1996 хода в 15 ч. 30 мин.

заседании Специализированного Совета Д.053.05.32 по присуждению учен степени кандидата наук по адресу: 119899, г.Москва, Воробьевы га; Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «¿Я» 1996 года.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

туальностъ проблемы. Исследования функционирования различных таболических путей показывают, что особую роль в регуляции того или иного ти играют так называемые метаболиты точек разветвления и катализирующие их евращение ферменты. К числу таких метаболитов принадлежит а-кетоглутарат, ляющийся общим интермедиатом путей окисления углеводов, жиров и [инокислот, а также участником малат-аспартатного челночного механизма, цшетвеннуго реакцию его необратимой утилизации в митохондриях катализирует ГД-комплекс. Первый компонент комплекса - КГД - осуществляет скорость-гмитиругощую стадию реакции, и, следовательно, в значительной степени феделяет каталитические и регуляторные свойства комплекса. В связи с этим ¡учение взаимодействия КГД с субстратом и его структурными аналогами эедставляет интерес как для энзимологической характеристики КГД-комплекса, iK и для оценки особенностей его функционирования и регуляции в системе итоховдриалыюго метаболизма. Однако о КГД известно весьма мало. Так, кроме эщих закономерностей тиаминового катализа, сформулированных на основании сследований химических моделей тиамина, практически ничего не известно о еханизме ферментативного превращения а-кетоглутарата, а также о жономерностях связывания субстрата в активном центре КГД. Очевидно, что арактер связывания а-кегоглутарата определяется не только взаимодействием етогруппы субстрата с коферментом. Немаловажную роль в создании еобходимой in vivo узкой субстратной специфичности фермента играют, по-идимому, и другие структурные элементы субстрата. Использование структурных

Принятые сокращения: КГД - а-кетогпутаратдегидрогеназа, ТПФ - тиаминпирофосфат, ДТНБ -1,5'-дитиобис-(2-нитробензойная) кислота.

аналогов субстрата помогает оценить вклад этих элементов во взаимодействш субстрата с ферментом, а также позволяет судить о возможности регуляцш активности фермента. Так, структурное сходство а-кетоглутарата и ряд; митохоцдриальных дикарбоксилатов, позволяет предполагать, что конкурент последних с а-кетотутаратом за субстрат-связывающие участки КГД може-служить одним из факторов регуляции осуществляемого ферментоь окислительного декарбоксилирования а-кетотутарата. Однако данные < взаимодействии дикарбоксилатов с КГД в литературе отсутствуют. С механизмо» превращения фермент-субстратного комплекса, возможно, связано и медленное (п< сравнению с катализом) измените активности КГД в ходе реакции, которое быш отмечено в нашей лаборатории еще в 70-х годах. Действительно, для многш ферментов, функционирующих в точках пересечения нескольких метаболически: путей, такие изменения ферментативной активности являются важным механизме^ регуляции. Тем не менее, медленное изменение ферментативной активности КГД ] ходе реакции до сих пор не исследовалось.

Цель работы состояла в изучении механизмов каталитического действия 1 регуляции КГД. Задачи включали:

- характеристику взаимодействия а-кетосубстрата с активным центром КГД, , также выявление роли отдельных срухтурных элементов а-кетосубстрата в< взаимодействии с ферментом;

- изучение возможности регуляции этого процесса структурными аналогами а кетосубстрата;

- исследование медленных изменений активности фермента в ходе катализа.

Кроме того, часть работы была посвящена разработке методически: подходов для получения стандартных препаратов КГД из грудной мышцы голубя, ; также их характеристике.

аучная новизна работы. Впервые исследованы медленные по сравнению с ггализом изменения активности КГД в ходе ферментативной реакции. Показано, го для ряда мышечных КГД-комплексов наблюдается падение активности в ходе гакции, обусловленное инактивацией первого компонента комплекса - КГД - и зязашюе с трансформацией комплекса фермента с а-кетосубстратом в ходе кислительного декарбоксилирования. Кинетика инактивации КГД в ходе реакции 1ВИСИТ от структуры окисляемого ферментом кетосубстрата: в ходе реакции с а-етоглутаратом КГД инактивируется в две стадии, причем основное падение ктивности происходит в течение первых минут реакции и обратимо; в реакции с аталитически активным аналогом а-кетоглутарата - а-кетоадипатом - фермент нактивируется в одну стадию и необратимо. Исследовано вовлечение )ункциональных групп КГД в медленные обратимые изменения активности зермента при окислении а-кетогаутарата. Полученные данные свидетельствуют о ом, что такие изменения сопровождаются снижением реакционной способности ущественного арганинового остатка фермента. Показано, что модификация 8Н-рупп фермента влияет на его инактивацию в ходе окисления а-кетоглутарата. Сравнение кинетики процесса для нативной и БН-модифицированной КГД видетельствует об устранении обратимого падения активности фермента после юдификации БН-групп. Связывание же с ферментом а-кетотутарата [редотвращает такое действие модификатора. Сравнительный анализ шгабирующего действия ряда структурных аналогов субстрата КГД показывает, ¡то основной вклад в связывание субстрата в активном центре КГД вносит ¡заимодействие его а-кетогруппы с коферментом, но оно эффективно проходит шип. при наличии достаточной длины углеводородной цепи соединения. Остановлено различие механизмов ингибирования фермента содержащими и не юдержащими а-кетогруппу дикарбоксилатами. В отличие от дикарбоновых кислот

с а-кетогруппой, конкурирующих с субстратом за каталитический центр, связывание с ферментом не содержащих а-кетогруппу дикарбоксилатов уменьшает сродство КГД к субстрату, но не исключает образование фермент-субстратного комплекса и катализ.

Практическое значение работы. Усовершенствована методика выделения КГД, что позволило на порядок повысить активность препаратов фермента и получать как гомогенную КГД, так и ее комплексы с белковыми фрагментами, в присутствии которых КГД проявляет значительно более высокую активность. Характеристика медленных изменений активности КГД в ходе катализа определяет возможность корректной постановки кинетичеких экспериментов в дальнейших исследованиях КГД. Кроме того, данные о закономерностях взаимодействия КГД с рядом митоховдриальных дикарбоксилатов могут быть полезны при математическом моделировании функционирования КЩ в митохондриях. Апробаиия работы. Материалы исследования доложены в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского (Москва, 1995), на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ (Москва, 1996) и на 4-ом Международном симпозиуме по тиамин-зависимым ферментам (Блаубойрен (Германия), 1996).

Публикации. Материалы диссертации представлены в 4 статьях. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (в котором приведены известные данные о структуре, кинетических свойствах, субстратной специфичности КГД и механизме катализируемой ею реакции, а также рассмотрены примеры инактивации ферментов в ходе реакции и вытекающие из этого возможности их регуляции), описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, краткого заключения, выводое и списка цитируемой литературы (147 ссылок). Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, включает 13 таблиц и 36 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Методы.

Фермент. КГД-комплексы выделяли из грудной мышцы голубя, сердца быка и ердца свиньи методом Стэнли и Перхама (Stanley & Perham, 1980). Для выделе-ия изолированной КГД использовали ранее опубликованную методику (Стафеева др., 1982) с введением дополнительной стадии очистки на Сефарозе 6В. белковый состав препаратов контролировали методом электрофореза в ластинах полиакриламидного геля в присутствии SDS-Na в системе Лэммли Laemmli, 1970).

активность изолированной КГД определяли спектрофотометрически в модельной истеме с феррицианидом по уменьшению оптической плотности при 420нм Е42о=ЮОО М"'см"'); активность КГД-комплекса определяли по скорости осстановления NAD+ (Ез4о=6220 М^-см"1).

кинетические кривые Pit) обрабатывали согласно модифицированному методу уггенгейма (Березин, Клесов, 1976) с использованием графического (ифференцирования (Ray et al, 1961).

компьютерную обработку данных проводили с использованием программы гроектирования алгоритмов MathCAD. Начальную скорость реакции (Анач) >пределяли экстраполяцией кривой накопления продукта к нулевому моменту ¡ремени, скорость реакции А2 определяли экстраполяцией второй стадии кривой D(t) к нулевому моменту времени. Амплитуду начального всплеска активности гаределяли как (А11ач-А2)/Анач, выраженную в процентах.

Модификацию аргининовых остатков КГД проводили 2,3-бутандионом в 0,05М сшшй-фосфатном буфере рН 7,5 при 30°С.

Модификацию SH-групп КГД проводили ДТНБ в 0,1М калий-фосфатном буфере эН 7,0-7,5 при 25°С.

500 550 Объем эмоции, мл

Кинетические измерения проводили на спектрофотометрах Сагу-219 (Франция), ШшсЫ-557 (Япония), Атшсо Б\У-2000 (США).

Результаты и их обсуждение. 1. Очистка препаратов КГД.

Препараты фермента,

получаемые по ранее использованной методике, обладали различной удельной активностью в зависимости от микроусловий выделения. Введение дополнительной очистки фермента путем хроматографии на Сефарозе 6В преследовало цель получить стандартные препараты КГД. Мы показали, что в ходе хроматографии препарат фермента освобождается от близкого к КГД по молекулярной массе (90+5кДа), но не обладающего КГД-активностыо белка (рис.1, дор.5). В результате отделения этого белка нам удалось в среднем на порядок увеличить удельную активность препаратов КГД. Электрофоре-тический анализ профиля элюции (рис.1-Б) показал, однако, что ник КГД-активности соответствует не чистой КГД (М.м. 100кДа,рис. 1-Б, дор.2),

S3-

я—-to

-39

-24

Рис.1. Хроматография препарата КГД, полученного по методу (Стафеева, 1980), на Сефарозе 6В; А - профиль элюции белка (1) и КГД-активности (2). Б - электрофоре граммы исходного препарата КГД (1) и фракций элюата с Vei 330 мл (2), 375 мл (3), 400 мл (4) и 480 мл (5). Под электрофореграммами указаны значения а-кетоглутарат-феррициаиид-редуктазной активности белка в мкМоль/мин-мг.

а фракциям, где кроме КГД присутствуют белковые фрагменты 39 и 24 кДа. По данным, полученным для ряда ферментных препаратов, молекулярная масса коэлюиругощихся с КГД фрагментов составляет 45+2, 36±4 и 26±4 кДа.

Молекулярная масса и относительная доля каждого из фрагментов может варьировать. Такое непостоянство сопутствующих КГД компонентов наряду с известными из литературы данными и полученными нами результатами о протеолизе КГД-комплехса, позволяет предположить что белковые компоненты, в присутствии которых КГД проявляет максимальную активность, являются продуктами протеолитического расщепления второго компонента КГД-комплекса -липоилтранссукцинилазы.

Характеристика использованных в работе препаратов КГД, а также КГД-комплекса, дана в таблице 1.

Таблица 1.

Сравнение удельной активности и белкового состава препаратов КГД, полученных после хроматографии на Сефарозе 6В.

Препарат фермента Удельная (феррициашщ-редуктазная) активность, мхМоль/мин-мг кдг 100±5кДа ЛТС+ЛДГ 56±4кДа фрагменты 45±2, Зб±4, 26±4 кДа

Изолированная КЩ от ОД до 0,3 + - -

Комплекс КГД с низкомолекулярными фрагментами около 2 + - +

КГД-комплекс от 5 до 8 + + -К-)

Из таблицы видно, что значения удельной активности препаратов одногс белкового состава варьируют в небольших пределах, тогда как получаемые ране< препараты КГД характеризовались разбросом удельной активности от ОД до 1 мкМоль/мин-мг. В соответствии с полученными нами данными, такш вариации в удельной активности можно объяснить различной долей белка < молекулярной массой 90±5кДа в этих препаратах КГД.

2.. Исследование механизма взаимодействия КГД с а-кетосубстратом. ,

2.1.Инактивация КГД при окислительном декарбоксилировании а-кетоглутарата и а-кетоадипата.

Проведенное нами исследование кривых накопления продукта реакций катализируемых КГД-комплексами из грудной мышцы голубя, сердца свиньи I сердца быка показало, что активность этих ферментных систем снижается в хода катализа. Из рис.2 видно, что комплекс, катализирующий окислен» кетосубстратов в присутствии естественного акцептора электронов (графики 1), ) компонент, работающий в модельной системе с феррицианидом (графики 2) инактивируются одинаково, т.е. инактивация не является следствием действия н; фермент искусственных акцепторов электронов. С другой стороны, кинетик; инактивации фермента в среде с разными кетосубстратами (рис.2-А и 2-Б отличается. Все это свидетельствует об определяющей роли первого компонент; комплекса и его кетосубстрата в катализ-индуцируемой инактивации и позволяв' ограничить исследование механизма инактивации полного комплекса изучение» процесса, наблюдаемого в значительно более простой системе с его первьи компонентом. В связи с этим исследование механизма инактивации КГД в ход ферментативной реакции мы проводили с использованием модельной систем! окисления кетосубстрата в присутствии феррицианида.

Б

10

10,

с 2 4 6 8

Время реакции, мин

0

2

4 6

Времяреащы, мм

Рис.2. Инактивация КГД-комплекса (1), изолированной КГД (2) и иммобилизованного на Сефарозе 4В мономера КГД (3) в ходе реакции с а-кето-глутаратом (А) и а-кетоадипатом (Б). Концентрация кетсубстрата 1 мМ.

Сравнение инактивации ферментных препаратов КГД различного состава (табл.1) на примере фермента из грудной мышцы голубя показало, что кинетика инактивации этих препаратов существенно не различается. Более того, аналогичным образом инактивируется и иммобилизованный на Сефарозе 4В мономер КГД (рис.2-А, график 3). Следовательно, снижение активности КГД-комплекса в ходе катализа не определяется изменением белок-белковых взаимодействий между компонентами комплекса в ходе реакции.

Существенное (до 20% исходной) падение активности фермента наблюдается в условиях, когда используется не более 1% субстратов, т.е. исчерпание субстратов не является причиной наблюдаемой инактивации КГД. Преинкубация КГД с каждым из субстратов не приводит к значительному изменению ферментативной активности. Следовательно, наблюдаемая инактивация фермента обусловлена не связыванием каждого из субстратов в отдельности, а каталитическим превращением кетокислоты в присутствии второго субстрата

реакции - акцептора электронов. Снижение активности КГД в ходе катализа могло быть обусловлено также ингабирующим действием накапливающихся в среде продуктов реакции. Однако кинетика инактивации фермента, вновь добавленного в среду, где реакция шла в течение 10 мин, не отличалась от кинетики инактивации первой порции фермента. Таким образом, инактивация КГД не является следствием ингибирующего действия продуктов реакции, накапливающихся в среде определения активности.

Как видно из рис.2-А, инактивация фермента в присутствии насыщающих концентраций а-кетоглутарата двухфазна, тоща как в системе с а-кетоадипатом процесс протекает в одну стадию (рис.2-Б). Первая стадия инактивации в реакции с а-кетогаутаратом характеризуется константой скорости (кп) порядка 2-Змин"1 и приводит к снижению ферментативной активности на 60-80%. В течение второй стадии фермент инактивируется более медленно (kj2=0,()7±0,04мин~1 ). Регенерируя КГД из среды определения активности с использованием быстрой гель-фильтрации при центрифугировании (Andersen et al, 1982), мы исследовали обратимость наблюдаемой в ходе катализа инактивации К1Д. Регенерация после завершения первой стадии инактивации приводит к почти полному восстановлению исходной активности. Если же регенерировать фермент после длительного проведения реакции (35мин), заметной реактивации не наблюдается. Аналогичные эксперименты по регенерации КГД из системы с а-кетоадипатом показали, чтс активность фермента не восстанавливается ни при малом, ни при более длительном времени проведения реации. Таким образом, существенное уменьшение активности КГД в первые минуты реакции с а-кетоглугаратоь обратимо, а медленная стадия инактивации фермента в системе с а-кетоглутарато\ и инактивация КГД в системе с а-кетоадипатом необратимы.

Скорость однофазной инактивации КГД в последнем случае, однако, :ущественно выше скорости необратимой инактивации КГД в реакции с х-кетоглутаратом (0,35±0,10 и 0,07±0,04 мин"1, соответственно).

Обратимость изменения активности КГД в ходе катализа в течение первых минут реакции в среде с естественным субстратом свидетельствует о том, что в ходе катализа возникает форма фермента с измененными свойствами, которые могут быть восстановлены после вывода фермента из реакционной среды. Не предрешая вопрос о причинах такого изменения свойств, мы будем называть возникающее в этом случае состояние КГД не инактивированной, а изомеризованной в ходе реакции формой фермента, имея ввиду, что свойства фермента в этом случае изменены обратимо.

Для выявления вовлеченных в такую изомеризацию функциональных групп КГД мы использовали химическую модификацию белка, исследуя влияние модификации на кинетику инактивации фермента в ходе реакции с ос-кетоглутаратом с одной стороны, и возможное изменение реакционной способности функциональных групп в изомеризованном состоянии с другой стороны. Модификации подвергали существенные остатки аргинина и гистидина, а также БН-группы КГД.

Модифицированный по аргинину или гистидину фермент полностью неактивен (Стафеева и др.,1980; Буник, Гомазкова,1987), и по мере модификации этих остатков изменяется лишь доля активного фермента. В соответствии с этим мы не наблюдали изменения кинетики инактивации КГД в ходе катализа при модификации аргининовых или гистидиновых остатков. Химическая же модификация 8 Н-гругш КГД, вызывающая лишь частотную инактивацию, существенно меняет кинетику инактивации фермента в ходе а-кетоглутарат-дегидрогеназной реакции: амплитуда обратимой инактивации значительно снижается (рис.3, кривая 2). Присутствие а-кетоглутарата в среде модификации

Рис.3. Влияние модификации 5Н-групп КГД на параметры инактивации фермента в ходе реакции с а-кетоглутаратом. 1 -исходная КГД; 2 - КГД, модифицированная 0,2 мМ ДТНБ; 3 ■ КГД, модифицированная ДТНБ в присутствии 1мМ а-кето глутарата.

4 6

Время реакции, мин

фермента ДТНБ способствует сохранению исходной кинетики (рис.3, кривая 3). Таким образом, модификация БН-групп КГД, по-видимому, блокирует изомеризацию КГД в ходе окисления а-кетоглутарата, а связывание с ферментом а-кетоглутарата делает эти 5Н-группы недоступными модификатору.

Известно, что аналогичный изомеризации КГД в ходе окисления а-кетоглутарата процесс наблюдается при преинкубации фермента с сукцинилфосфонатом - фосфоаналогом субстрата, у которого а-карбоксильная группа замещена фосфонатной (Вишк й а1, 1992). Используя комплекс КГД с сукцинилфосфонатом как стабильный аналог изомеризованного в ходе реакции состояния фермента, мы исследовали реакционную способность существенного для активности КГД остатка аргинина в комплексах фермента с сукцинилфосфонатом и рядом его структурных аналогов. Защитное влияние этих соединений в сопоставлении с защитой, оказываемой в тех же условиях а-кетоглутаратом, приведено в табл.2. Из представленных данных видно, что сукцинилфосфонат и его монометиловый эфир практически полностью защищают аргинин от модификации, тогда как защитный эффект а-кетошутарата незначителен. Следует

Таблица 2.

Сила защитного влияния а-кетоглутарата и его фосфоаналогов при модификации КГД 2,3-бутацциопом.

Название и структурная формула лиганда Концентрация лиганда, мМ Отаточная активность на 10ой минуте модификации, %

- - 36

а-кетоглутарат "00С-С(0)-(СН2)2-С00~ 0,5 57

сукцинилфосфонат 0з2"Р-С(0)-(СН2)2-С00" од 92

монометиловый эфир сукцшгалфосфоната СН30зТ-С(0)-(СН2)2-С0СГ 10 80

диметютовый эфир сукцинилфосфоната (СНз)20зР-С(0)-(СН2)2С00- 10 50

гриметиловый эфир сукцинилфосфоната (СНз)2Оз2~Р-С(0)-(СН2)2С00СНз 10 58

подчеркнуть, что используемая при модификации концентрация а-кетоглутарата эыла достаточной для полного насыщения КГД этим лигандом, поскольку эпределяемые для КГД в различных условиях величины Кт по субстрату не превышают ОДмМ и обычно составляют 0,02-0,04мМ. Таким образом, наблюдаемые различия защитного эффекта а-кетоглутарата, сукцинилфосфоната и

его монометилового эфира не могут объясняться различной степенью насыщения КГД этими лигандами, а характеризуют доступность существенного аргининового остатка КГД модификатору в соответствующих комплексах. Сравнение силы защитного влияния субстрата и его фосфоаналогов при модификации аргинина {табл.2) с одной стороны, и способности этих веществ вызывать изомеризацию КГД в среде преинкубации с другой стороны (Вишк е1 а1, 1992), показывает, что наибольший защитный эффект оказывает лигавд, наиболее эффективно вызывающий изомеризацию КГД в среде преинкубации (сукцинилфсофонат). Метилирование фосфонатной группы, приводящее к снижению эффективности изомеризации (Вишк е1 а1, 1992), аналогичным образом влияет и на защиту аргининового остатка: монометиловый эфир сукцинилфосфоната хоть и оказывает защитное действие, но в гораздо больших по сравнению с неметилированным аналогом концентрациях (табл.2). а-Кетоглутарат и ди- и триметиловые эфиры сукцинилфосфоната обладают лишь незначительным защитным эффектом (табл.2) и, как показали эксперименты, не вызывают изомеризации КГД в среде преинкубации. Таким образом, изомеризоваиная под действием сукцинилфосфоната или его монометилового эфира КГД характеризуется пониженной реакционной способностью существенного для активности остатка 1 аргинина. Поскольку эти аналоги индуцируют изомеризацию фермента, подобную происходящей в ходе катализа, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что изомеризация КГД в ходе ферментативной реакции включает снижение реакционной способности существенного аргининового остатка фермента.

2.2.Взаимодействие КГД со структурными аналогами а-кетоглутарата.

Для выявления роли отдельных структурных элементов субстрата были исследованы две группы аналогов а-кетоглутарата: имеющие (оксалоацетат,

кетомалонат) и не имеющие (глутарат, сукцииат, малонат) а-кетогруппу дикарбоксилаты. На рис.4 показана сравшггельная сила ингибирования начальной активности КГД различными аналогами. Можно видеть, что обладающий а-кетогруппой окса-лоацетат значительно сильнее ингибирует КГД по сравнению с сукцинатом. Следовательно, существенную роль в связывании с ферментом субстрата и его аналогов играет а-кетогруппа. Ингибирующий потенциал этой группы, однако, проявляется лишь при наличии дикарбоксилатной структуры, поскольку а-кетовалериат, обладающий в отличие от а-кетоетугарата только одной карбоксильной 1руппой, практически не иншбирует КГД (Буник, Гомазкова, 1987). Кроме того, из рис.4 можно видеть, что в определенной области концентраций аналогов малонат (не имеющее а-кето-группы трехуглеродное соединение) является более сильным ингибитором, чем кетомалонат. Следовательно, ингибирующий потенциал а-кетогруппы не реализуется и при недостаточной длине углеводородной цепи соединения. Таким образом, во взаимодействии КГД с субстратом и его структурными аналогами существенную роль играет наличие а-кетогруппы, дикарбоксилатной структурна также достаточной длины углеводородной цепи лиганда. Анализ зависимостей

Рис.4. Зависимость начальной скорости декарбоксилирования а-кетоглутарата от концентрации аналогов субстрата: глутарата (1), сукцината (2), малоната (3), оксалоацетата (4) и кетомалоната (5) при концентрации а-кетоглутарата 0,02мМ.

Рис.5. Влияние оксалоацетата на зависимость начальной скорости декарбоксилирования а-кетоглутарата от его концентрации прямых (А) и двойных обратных координатах (Б). Концентрация оксалоацетата в среде определения активности О (1), 0,5 мМ (2) и 3,3 мМ (3). Концентрация фермента 0,024 мг/мл (1, 2) и 0,096 мг/мл (3).

100 80 60

§ 40 г

0.0 0.2 0.4 0.6

Концентрация оксалоацеттиг, мМ

Рис.6. Анализ ингибирования а-кетоглутарат-дегидрогеназной реакции оксалоацетатом в координатах Диксона. Концентрации а-кето-глутарата 0,02мМ (1) и 0,2мМ (2).

20 0

1 ____д -

*

1 -#— Ш0С.-С(О)-СН -соон

2 —Д— шосс(0)-соон

о 10 20 30

Время преинкубации, мин

Рис.7. Влияние преинкубации с кетодикарбоксилатами - 1мМ оксалоацетатом (1) и ЮмМ кетомалонатом (2) - на начальную активность КГД.

тачальной скорости КГД-реакции от концентрации ос-кетоглутарата в отсутствие и трисутствии оксалоацетата показал, что при низких концентрациях сетодикарбоксилата наблюдается чисто конкурентный тип ингибирования: значение константы Михаэлиса для субстрата увеличивается, но величина Утах не изменяется (рис.5, график 2). При более высоких концентрациях аналога кроме увеличения значения Кт, происходит существенное снижение значения Утах, и наблюдается смешанный тип ингибирования (рис.5, график 3). Таким образом, при повышении концентрации оксалоацетата происходит усложнение механизма ингибирования. С этими данными хорошо согласуется параболический характер зависимостей, который наблюдается при анализе ингибирования оксалоацетатом и кетомалонатом в координатах Диксона (рис.6): при увеличении концентрации аналога начинает проявляться дополнительное ингабирование, наиболее выраженное при низких концентрациях субстрата (график 1). Вместе с тем, изучение действия кетодикарбоксилатов на фермент в среде преинкубации показало, что степень ингибирования существенно зависит от времени преинкубации (рис.7). Таким образом, возможно, что наблюдаемое пополнительное ингабирование кетодикарбоксилатами обусловлено их медленным (по сравнению с катализом) действием на фермент, которое в большей степени проявляется При высоких концентрациях лиганда. Из рис.7 ввдно также, что оксалоацетат в концентрации 1мМ вызывает больший эффект, чем кетомалонат в концентрации ЮмМ, т.е. ингибирующая сила кетодикарбоксилатов соответствует степени их структурного сходства с субстратом. Эти факты, в сочетании с большей выраженностью дополнительного ингибирования при низких концентрациях субстрата, свидетельствуют о том, что ингабирование данными соединениями обусловлено их конкуренцией с субстратом за аналогичное связывание в активном центре КГД. Таким образом, можно предположить, что кетодикарбоксилаты способны взаимодействовать с каталитическим центром фермента, ТПФ. При этом,

300

5 400

500

200

100

0

п.о 0.5 1.0 1.5 2.0

0 10 20 30 40 50 1 / [ а-кетоадипат]

[ а-кетоадипат], мМ

Рис.8. Влияние малоната на зависимость начальной скоросгт декарбоксилирования а-кетоадипата от его концентрации в прямых (А) и е двойных обратных координатах (Б). Концентрация малоната в среде определение активности О (1), 0,1мМ (2), 1мМ (3) и ЗмМ (4).

по-вицимому, происходит формирование ковалентной связи и образование стабильною аддукта.

Ингибирующая сила дикарбоксилатов, в отличие от кетоаналогов, не соответствует степени их структурного сходства с субстратом (рис.4) Действительно, глугарат является самым слабым ингибитором в ряду малонат-сукцинат-глутараг. Тем не менее, анализ зависимостей начальной скорости реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии дикарбоксилатон показал, что их действие описывается конкурентным механизмом: практически не влияя на значение максимальной скорости реакции, эти аналоги увеличивают значение Кт для субстрата (рис.8). Известно, однако (Диксон,Уэбб, 1982; Рпёеп, 1964), что формально конкурентный тип ингибирования не всегда означает фактическую конкуренцию аналога с субстратом. Действительно, снижение константы Михаэлиса для субстрата может наблюдаться не только вследствие прямой конкуренции за один центр связывания, но и через опосредованное

здействие ингибитора, связавшегося в другом центре, на взаимодействие ;рмента с субстратом. Тем не менее, при определенном соотношении шетических констант, графическое выражение ингибирования может (ответствовать конкурентному механизму. Так, если субстрат связывается не >лько со свободным ферментом Е, но и с фермент-ингибиторным комплексом El хема I), то при равенстве каталитических констант распада комплексов ES и EIS :5=кб), и при условии, что константа диссоциации фермент-ингибиторного змплекса El меньше, чем константа диссоциации тройного комплекса EIS С2<Кз), наблюдается формальная конкуренция (Friden, 1964).

ki k5

Е + S <-ES-» E + P

+ k_i + I I

t t (I) k21 k-2 k3lk_3 i k4 i k6 EI + S <-> EIS-EI + P

k_4

'азличить формальное и фактическое конкурентное ингибирование можно при нализе полноты ингибирования. Так, при фактической конкуренции (кб=0) величение концентрации ингибитора в конце концов приводит к полному юдавлению активности фермента и, кроме того, в данном случае степень труктурного сходства аналога с субстратом соотвествует ингибирующей силе :оединения. При формальной же конкуренции, когда ингибитор влияет на ¡родство субстрата к ферменту, связываясь в другом центре (кб^О), полного шгибирования не наблюдается.

Рис.9. Анализ ингибирования (х-кето-глутарат-дегидрогеназиай реакции малонатом в координатах Диксона

Концентрации а-кетоглутарата 0,02мМ (1) и 0,2мМ (2).

0

6

Концентрация малоната, лМ

Анализ действия дикарбоксилатов в координатах Диксона на примере малоната (рис.9) показывает, что действие дикарбоксилатов характеризуется отсутствием полноты ишибирования, которое особенно выражено при высоких концентрациях субстрата (рис.9, график 2): увеличение концентрации ингибитора не приводит к пропорциональному снижению активности фермента. Следовательно, наблюдаемое уменьшение сродства фермента к субстрату в присутствии дикарбоксилатов происходит не за счет блокирования посадки субстрата в активный центр КГД, а при их опосредованном воздействии путем связывания в другом центре. Таким образом, результаты указывают на то, что связывание дикарбоксилатов ухуцшает сродство КГД к субстрату, но не препятствуют катализу. Исходя из того, что структурное сходство самого сильного из дикарбоксилатов ингибитора, малоната, и а-кетоглутарата ограничивается наличием карбоксильной группы, можно предположить, что дикарбоксклаты блокируют связывание одной из карбоксильных групп субстрата. Таким образом, полученные результаты позволяют предполагать существование "дикарбокснлатного" центра, который, возможно, является частью активного центра КГД. Не исключено, что события, происходящие в "дикарбоксилатном" центре, связаны с индукцией обратимой

{активации фермента в ходе реакции с а-кетоглутаратом, поскольку результаты следования структурных перестроек КГД в ходе этого процесса (разд.2.1) сазывают на вовлечение в пего остатка арпппта, способного взаимодействовать с арбоксильными группами а-кетоглутарата и дикарбоксилатов.

Выводы.

1. Введение дополнительной стадии очистки КГД - хроматографии на Сефарозе 6В - позволило на порядок увеличить удельную активность препаратов фермента.

2. КГД-комплексы из грудной мышцы голубя, сердца свиньи и сердца быка инактивируются в ходе ферментативной реакции, и это обусловлено инактивацией первого компонента комплексов - КГД.

3. Основное снижение активности КГД в системе с а-кетоглутаратом обратимо, тогда как инактивация в ходе реакции с а-кетоадипатом необратима.

4. По результатам химической модификации функциональных групп, в ферменте, претерпевшем обратимое снижение активности, доступность существенного остатка аргинина модификатору снижается; модификация 8Н-групп приводит к значительным изменениям кривой инактивации КГД в ходе катализа.

5. Ингибирование КГД дикарбоксилатами усиливается с уменьшением размера молекулы. Кинетический анализ процесса позволяет заключить, что эти соединения взаимодействуют как со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом, причем тройной фермент-субстрат-дикарбоксилатный комплекс обладает каталитической активностью.

6. Сходные с а-кетоглутаратом по длине углеводородной цепи и имеющие а-кетогруппу аналоги более эффективно взаимодействуют с ферментом по сравнению с соответствующими дикарбоксилатами и способны образовывать прочные комплексы с КГД, скорость диссоциации которых низка по сравнению со скоростью катализа.

Список работ, опубликованиых по теме диссертации.

!. Bunik V.l., Romash O.G., Gomazkova V.S. Inactivation of a-ketoglutarate lehydrogenase during enzyme-catalyzed reaction (1990) Biochem.Int., 22, 6, 967-976. J.Bunik V.l., Romash O.G., Gomazkova V.S. Effect of a-ketoglutarate and its structural analogues on hysteretic properties of a-ketoglutarate dehydrogenase (1991) FEBS Lett., 278, 2, 147-150.

3. Bunik V.l., Pavlova O.G. Inactivation of a-ketoglutarate dehydrogenase during oxidative decarboxylation of a-ketoadipic acid (1993) FEBS Lett., 323, 1/2, 166-170.

4. Bunik V.l., Pavlova O.G. Interaction of 2-oxoglutarate dehydrogenase with 2-oxosubstrates and their structural analogs. Eds.H.Bisswanger, A.Schellenberger (1996) Abstracts of 4th International Meeting on Function and Significance of Thiamine-Diphosphate Enzymes, March 1996, Blaubeuren, Germany.