Выявление почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum in Situ с помощью иммуноферментного анализа

Красов, Александр Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum in Situ с помощью иммуноферментного анализа
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выявление почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum in Situ с помощью иммуноферментного анализа"

[ л На правах рукописи

КРАСОВ Александр Игоревич

ВЫЯВЛЕНИЕ ПОЧВЕННЫХ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM IN SITU С ПОМОЩЬЮ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2009

003486004

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель доктор биологических наук

Л.Ю. Матора

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

профессор Л.В. Карпунина

кандидат биологических наук А.М. Петерсон

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт

биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

им. Г.К. Скрябина (г. Пущино)

Защита состоится 23 декабря 2009 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайте http://ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан 20 ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л _ Никитина В.Е.

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Ассоциативные микроорганизмы рода Azospirillum занимают особое положение в ряду почвенных азотфиксаторов. Впервые эти бактерии были выделены в Нидерландах более 80-ти лет назад (Beijerinck, 1925), однако в сферу интенсивного изучения попали после опубликования работы «Ассоциативный симбиоз у тропических трав...» (Döbereiner and Day, 1976), став одним из наиболее интенсивно исследуемых ассоциативных партнеров растений (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan et al., 2004).

Прогресс в исследовании азоспирилл в качестве экологически безопасных стимуляторов роста растений в значительной степени зависит от развития быстрых и надежных способов определения данных микроорганизмов в почве. Кроме того, значительный интерес при исследовании собственно феномена ассоциативности представляют качественный и количественный состав ассоциативной микрофлоры, их сезонные колебания, а также изменения, вызванные антропогенным воздействием. В целом, развитие подходов, позволяющих осуществлять мониторинг состава и численности ризосферных бактерий, представляется одной из актуальных задач современной экологической микробиологии.

Выявляющие системы на основе специфичных антител (Ат) являются весьма удобным средством мониторинга разнообразных микроорганизмов. В- настоящее время методы иммуноанализа находят широкое применение в микробиологии, в первую очередь, при работе с патогенными бактериями. Эти методы занимают третье место по частоте и интенсивности использования, уступая «золотому» стандарту - методам, основанным на культивировании, и «серебряному» стандарту - молекулярно-генетическим приемам на основе полимеразной цепной реакции (Gracias, McKillip, 2004; Bhunia, 2006), при этом иммуноанализ является, безусловно, самым быстрым по исполнению в сравнении с двумя другими методами.

Кроме того, приходится учитывать, что для анализа представителей почвенной микрофлоры основанные на культивировании методы пригодны весьма ограниченно, поскольку всего небольшая доля от общей популяции бактерий в почве (оцененной микроскопическими методами) поддается культивированию (Skinner et al., 1952; Louw and Webley, 1959; Rovira etal., 1974; Faegri et al, 1977; Lund and Goksoyr, 1980; Olsen and Bakken, 1987; Ogan, 1991; Pedersen and Jacobsen, 1993), а молекулярно-генетические подходы приобретают актуальность в том случае, когда для каждого объекта имеются наборы праймеров на соответствующие генетические локусы, обеспечивающие с высокой разрешающей силой дифференциацию штаммов или групп штаммов.

Одним из наиболее эффективных серологических подходов является иммуноферментный анализ (ИФА) - метод выявления антигенов (или антител), основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки. В настоящее время ничтожно мало количество работ, посвященных иммуноферментному выявлению микробных объектов в почве in situ, которая представляет собой чрезвычайно сложную среду для анализа благодаря присутствию в ней большого числа органических соединений, затрудняющих или в некоторых случаях делающих невозможной интерпретацию результатов. Вместе с тем, использование данного подхода весьма перспективно для

вырабатывания экологически приемлемых агробактериальных технологий.

Целью настоящей работы являлось развитие метода иммуноферментного анализа для in situ выявления ассоциативных бактерий рода Azospirillum в почве.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Оптимизировать условия твердофазного иммуноферментного анализа целых клеток бактерий рода Azospirillum с использованием антител на липополисахариды (ЛПС).

2. Провести идентификацию бактерий A. brasilense в инокулированной

почве.

3. Оценить динамику выявления in situ соматического антигена интродуцированных в почву бактерий A. brasilense Sp245.

4. Провести скрининг коллекционных штаммов Azospirillum, выделенных из почв Саратовской области, методом ИФА с использованием антител на ЛПС модельных штаммов.

5. Оценить распространенность азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.

Научная новизна работы

В работе впервые предложен вариант твердофазного иммуноферментного анализа микроосадков почвенных суспензий с использованием антител на ЛПС азоспирилл, позволяющий проводить выявление соматического бактериального антигена в почве. Впервые на основе оптимизированного варианта ИФА изучена динамика выявления in situ соматического антигена интродуцированных в почву ассоциативных бактерий A. brasilense, а также выявлен значительный вклад азоспирилл серотипа Sp245, в сравнении с таковыми, представляющими серотип Sp7, в микробоценоз почв Саратовской области.

Практическая значимость работы

Разработан способ количественного иммуноферментного анализа бактериальных липополисахаридных антигенов в почве (заявка на патент РФ № 2009 120888 от 1.06.2009 г.), который может быть использован для оценки эффективности применения бактериальных удобрений и мониторинга почвенных микробоценозов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Оптимизированный способ твердофазного иммуноферментного анализа микроосадка почвенных суспензий с использованием антител на соматический антиген азоспирилл позволяет оценивать динамику развития бактериальных популяций.

- Максимальное количество специфического антигена A. brasilense Sp245 в образцах инокулированной этим штаммом почвы без растений и в прикорневой зоне инокулированной пшеницы Triticum aestivum cv. Саратовская 29 выявляется на 7-е и 14-е сутки, соответственно.

- Для аборигенной микрофлоры почв Саратовской области характерно преобладание антигенов азоспирилл, относящихся к серотипу Sp245; чернозем южный отличается также более заметным присутствием антигенов азоспирилл серотипа Sp7.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены в виде устных и

стендовых сообщений на 2-й и 4-й Региональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2004; 2008); 2-м и 3-м Агробиотехнологических Симпозиумах стран Балтии (Гамбург, Германия, 2006; Санкт-Петербург, Россия, 2007); Международной научной конференции молодых ученых «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); Международной конференции «Ризосфера - 2» (Монпелье, Франция, 2007), Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2008» (Саратов, 2008), а также на отчетной научной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, 2009).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН 2 октября 2009 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников, содержащего 154 наименования. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 2 таблицы.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. регистрации 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.) и «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных биотехнологий» в рамках государственного контракта с Роснаукой № 02.445.11.7130 (ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы») (руководитель научной школы д.б.н., профессор Игнатов В.В.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из следующих разделов: 1.1. Общая характеристика подходов, обеспечивающих специфическое выявление бактерий в природной среде;

1.1.1. Молекулярно-генетические подходы к выявлению бактерий;

1.1.2. Современные методы иммунохимического выявления и анализа бактериальных антигенов; 1.2. Антитела как основной инструмент иммуноанализа; 1.2.1. Способы получения антител; 1.3. Бактериальные антигены, используемые в

качестве определяемых объектов в иммуноанализе; 1.4. Иммуноферментный анализ; 1.5. Сложности выявления микроорганизмов в почве; 1.6. Характеристика объекта исследования - почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерии выращивали на синтетической малатной среде (Döbereiner and Day, 1976) при 30°С. В некоторых случаях бактерии выращивали на среде LB (Sambrook et al., 1989).

Для получения антител, специфичных к соматическим антигенам бактерий, использовали методику иммунизации животных целыми бактериальными клетками, предварительно обработанными 2% глутаровым альдегидом (Матора с соавт., 1998).

Для получения Ат на весь пул поверхностных бактериальных антигенов кроликов иммунизировали путем инъекций в подколенные лимфатические узлы 1 мл бактериальной суспензии, смешанной с равным объемом адъюванта Фрейнда, с четырьмя недельными интервалами.

Использовали следующие образцы почв: солонец (Алгайский район), аллювиальная (Лысогорский район), серая лесная (Татищевский район), чернозем типичный (Лысогорский район) и чернозем южный (Саратовский район). В модельных почвенных экспериментах использовали образец почвы чернозема южного, отобранный в левобережном районе Саратовской области. Для внесения штамма А. Ъгasílense Sp245 в почву 18-часовую бульонную культуру отмывали в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР) и осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 30 мин). Ресуспендированные в ЗФР клетки вносили в лабораторные пластиковые сосуды с почвой (1*109 кл/г почвы). Контролем служила почва без внесения бактериальных клеток. Контейнеры с образцами почв находились в помещении с контролируемыми влажностью, освещением, температурой и фиксированной продолжительностью световой и темновой фаз. В экспериментах по инокуляции растений использовали мягкую яровую пшеницу Triticum aestivum cv. Саратовская 29.

ИФА проводили в полистироловых 96-луночных планшетах. Тестируемые соединения иммобилизовали за счет простой адсорбции. В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козьими антикроличьими антителами («Sigma», США). В качестве субстратного реагента использовали ортофенилендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИП, г. Санкт-Петербург).

Люминесцентную и лазерную конфокальную микроскопию почвенных суспензий проводили на микроскопах фирмы Leica (Германия) моделей DMLB и TCS SP 5, соответственно.

Двойную иммунодиффузию проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979).

Конъюгирование пероксидазы хрена с кроличьими антителами проводили перйодатным методом (O'Sullivan and Marks, 1981) с модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация условий проведения твердофазного ИФА с использованием Ат на ЛПС для выявления бактерий рода Azospirillum

Первым этапом реализации цели работы явилась оптимизация условий иммуиоферментного анализа целых клеток бактерий рода Azospirillum. В качестве твердой фазы использовали полистироловые 96-луночные планшеты. В качестве модельного штамма при разработке протокола ИФА для выявления азоспирилл использовали A. brasilense Sp245. Для вьивления бактерий применяли Ат, полученные на обработанные глутаровым альдегидом клетки штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245. Поскольку ранее была продемонстрирована специфичность данных Ат в отношении ЛПС (Матора с соавт., 1998; Матора с соавт., 2005), полученные таким способом антитела в работе обозначали как «Ат на ЛПС».

Были оценены различные факторы, влияющие на эффективность вьивления бактериальных клеток (время иммобилизации антигена, использование различных буферов на этапе адсорбции бактерий, оптимальная концентрация выявляющих кроличьих антител и оптимальное время протекания ферментной реакции), определена специфичность взаимодействия антител с соответствующими бактериальными штаммами и в результате предложена система ИФА для, выявления азоспирилл в микробных суспензиях, имеющая предел достоверного количественного выявления 106 кл/мл или 50000 кл в лунке. Подобная чувствительность является весьма удовлетворительным результатом для иммуноферментного теста с использованием поликлональных антител и колориметрического детектирования (Schloter etal., 1992; Schloter et al, 1995). Однако чувствительность системы можно в дальнейшем существенно увеличить за счет замены процедуры простой адсорбции антигенов процедурой иммуносорбции, которая заключается в использовании «антител захвата» для сенсибилизации лунок планшетов (используемых в качестве твердой фазы).

Перспективность использования процедуры иммуносорбции продемонстрирована в серии специальных экспериментов по выделению из разнородных суспензий клеток бактерий, принадлежащих к различным серологическим группам.

Скрининг методом ИФА коллекционных штаммов Azospirillum, выделенных из почв Саратовской области

С помощью оптимизированного метода ИФА целых клеток азоспирилл был проведен скрининг 20-ти коллекционных штаммов Azospirillum, выделенных из почв Саратовской области, с использованием антител на ЛПС штаммов Sp7 и Sp245 (относящихся к различным серологическим группам согласно специфичности их О-антигена) (Матора с соавт., 2008). Для сравнения использовали 18-ч культуры клеток тестируемых штаммов, выращенных на жидкой синтетической малатной среде.

К серогруппе Sp7, характеризуемой наличием антигенных детерминант, выявляемых Ат на ЛПС Sp7, по результатам ИФА были отнесены два штамма, выделенные в Саратовской области - SR55 и SR14. Для этих штаммов не выявлено

взаимодействие с Ат на ЛПС 8р245.

К серогруппе 8р245, характеризуемой наличием эпитопов, специфически взаимодействующих с Ат на ЛПС Бр245, были отнесены местные штаммы 8Ш5 и 51175. Для данных штаммов не выявлено взаимодействий с Ат на ЛПС 8р7 (рис. 1).

Следовательно, из двух десятков проанализированных местных штаммов одинаковое количество штаммов можно было отнести к каждой из серорупп. Полученные результаты позволили сделать адекватные выводы относительно вклада азоспирилл, относящихся к двум подробно описанным к настоящему времени серологическим группам, в формирование микрофлоры почв Саратовской области.

Выявление специфического антигена интродуцированных в почву бактерий А. ЬгазИепзе вр245

Оптимизированный вариант ИФА почвенных суспензий с использованием антител на ЛПС штаммов А. ЬгааИете Бр7 и Бр245 был применен для выявления антигена интродуцированных в почву бактерий А. ЬгшИете Бр245 в модельных экспериментах, а также для изучения распространенности азоспирилл двух серологических групп в различных типах почв Саратовской области.

0,35 0,25 0,15 -

0,05

п п п

Г- Г*-| О VI М

Т О ^ ~ ей

& - а & и

СП К П [/)

VI ОО

в; ой о; в; о;

слс/эазслислислслслсэ

оо

Ой и

0,35 0,25 0,15 -0,05

1*1 . , Н ш

— д 14 II П

Г- ГО VI ОО ЧО

о VI — а* VI

ей г; ей ей и ей

VI К !Л И ЬП

о^ VI VI ОО С4 М ОО ¿^

Елсйойейсйойойвйойсйойойот

Рис. 1. Скринирование коллекционных штаммов, выделенных из почв Саратовской области, методом ИФА с использованием антител на ЛПС штаммов Бр245 (А) и Бр7 (Б)

В модельных экспериментах по изучению динамики численности интродуцированных в почву бактерий использовали штамм А. brasilense Sp245 и образец почвы чернозема южного, отобранный в левобережном районе Саратовской области. Отмытые от культуральной среды и ресуспендированные в ЗФР бактериальные клетки вносили в лабораторные 1000-мл пластиковые контейнеры, содержащие 850 г почвы (1><109 кл/г). Контролем служила почва без внесения бактериальных клеток. Эксперименты проводили с 3-х кратной повторностью. Увлажнение и рыхление выполняли после очередного отбора проб, который осуществляли через 1 час, 24 часа (1 сутки), ежедневно в течение 7-ми дней, и далее - через 14, 21, 28, 75 и 76 дней после внесения бактериальной суспензии в почву. С 30-го по 75-й день (включительно) почву не обрабатывали.

Для детектирования бактериального антигена образцы почвы (1 г) тщательно ресуспендировали в 10 мл 0.05 М натрий-карбонатного буфера (pH 9.6), полученную суспензию активно встряхивали вручную в течение 30 сек, отбирали 250 мкл взвеси и разводили ее тем же буфером, доводя объем до 1 мл (с содержанием 25 мг почвы). По 50 мкл последовательных двукратных разведений образцов вносили в лунки планшета для иммуноферментного анализа, при этом номер лунки отвечал соответствующему разведению образца. Планшеты с нанесенными образцами выдерживали в течение 30 мин на виброшейкере при комнатной температуре (20-25°С) для обеспечения равномерной сорбции антигена из раствора, а затем стационарно в течение 18 ч (при 4°С). Анализ всех проб проводили в дупликатах. «Нулевым» контролем (определяющим значение оптической плотности, вычитаемое из всех значений, полученных для индивидуального образца) являлись лунки с натрий-карбонатным буфером (не содержащие антигена).

Все приведенные ниже результаты ИФА почвенных суспензий получены при концентрации выявляющих кроличьих антител 50 мкг/мл, концентрации конъюгированных с пероксидазой козьих антикроличьих антител 2 мкг/мл и развитии хромофорной реакции на свету в течение 4 мин.

О количестве бактериальных ЛПС в образцах инокулированной почвы на разных этапах эксперимента судили, сравнивая значения оптической плотности при длине волны 490 нм (А490) опытных и контрольных образцов.

Математическая обработка результатов состояла в определении выраженной в процентах разницы данных значений для каждого разведения: (А49о(опыт) - А490(контроль))/А490(контроль) х 100%. Конечный результат представлял собой среднюю величину (среднее арифметическое) (рис. 2).

Хорошо известно, что зависимость величины регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения при проведении ИФА практически всегда имеет в той или иной степени нелинейный характер (Стэндифер, 1988). Традиционно используемые при анализе результатов приемы математической линеаризации формы кривой не позволяют минимизировать влияние так называемого «матричного эффекта образца», выражающегося в характерном загибе кривой в области высоких концентраций антигена. Кроме того, анализ столь сложного матрикса, как почва, осложняется наличием различных интерферирующих факторов, влияющих на протекание ферментной реакции в каждом конкретном случае. В связи с этим представлялось целесообразным отмечать не абсолютные значения А490, а разницу значений А490 опытных и контрольных образцов в областях

примерной линейной зависимости значений оптической плотности от степени разведения проб.

% 65

55 •

ТТ

1/24

Г*1

пЬ

ци

сутки

14 21

28 75

Рис. 2. Результаты ИФА образцов почвы (чернозем южный) с использованием Ат на ЛТТС$р245 после внесения суспензии клеток А. Ъга$Иете Бр245 (пояснения в тексте)

На рис. 3 приведены графики, отражающие различия значений А490 опытных и контрольных образцов почвы через 1 час (а) и через 7 суток (б) после внесения бактерий А. brasilen.se 8р245. На примере этих графиков показаны области значений, использованные при учете результатов.

Результаты проведенного ИФА почвенных суспензий позволили оценить динамику изменения количества ЛПС азоспирилл в почве, инокулированной штаммом А. ЬгаяИете 5р245. При этом мы учитывали данные работы Широкова (2008) о том, что динамика выявления специфических липополисахаридных детерминант А. ЬгазИете 5р245 (в цитируемой работе — в гомогенатах корней инокулированных растений) коррелировала с увеличением численности бактерий в тестируемых образцах по результатам подсчета КОЕ.

Можно видеть, что максимальное количество тестируемого антигена выявлялось в почвенных суспензиях на седьмые сутки эксперимента (примерно на 60% больше, чем в контрольной почве). При этом наиболее активно количество бактерий (оцениваемое по уровню ЛПС) в почве возрастало за первые сутки с момента инокуляции (почти на 30%), на 14-е сутки существенно снижалось, а к концу третьей недели опускалось ниже уровня контрольной (неинокулированной) почвы.

Наибольший интерес представляли результаты определения специфического антигена в первые семь суток эксперимента. Наблюдаемая динамика, очевидно,

была следствием конкурентных отношений интродуцированных и аборигенных бактерий, поскольку значение ИФА контрольной почвы свидетельствовало о присутствии в почве, использованной в эксперименте, аборигенных штаммов азоспирилл, имеющих серологические перекресты с 5р245. Вместе с тем, как можно видеть на рис. 3, отличное от нуля значение А490 контрольной почвы в наших модельных экспериментах не влияло существенно на оценку динамики численности инокулированного в почву штамма А. ЬгаяНете Бр245.

№ лунки № лунки

А Б

Рис. 3. Различия значений А490 опытных и контрольных образцов почвы через 1 час (А) и через 7 суток (Б) после внесения в почву бактерий А. ЬгазИеме Бр245 (вертикальными стрелками отмечены области значений, использованные при учете результатов). Номер (№) лунки отвечает соответствующему двукратному разведению образца

На рис. 2 хорошо видно, что на вторые сутки эксперимента численность бактерий (оцениваемая по уровню ЛПС) в инокулированной почве снижалась до таковой в неинокулированной почве, что можно объяснить исчерпанием легко усваиваемых лабораторным штаммом субстратов, а затем постепенно увеличивалась, очевидно, благодаря переключению метаболизма интродуцированных бактерий на потребление менее доступных источников питания. Динамика выявления антигена с 7 по 28-е сутки говорит о том, что развитие интродуцированной культуры постепенно замедлялось и прекращалось.

Полученные результаты хорошо согласовались с данными других исследователей Ше Сошпск е1 а1„ 1988; УапскпИоуе е1 а1, 1993; ВазЬап е1 а!., 1995). В частности, в работе (ВаэЬап е1а1., 1995) показано, что в израильских почвах из засушливого, полузасушливого, или горного регионов популяция А. ЬгаяИете исчезала ниже обнаруживаемых порогов в течение 35 дней после инокуляции.

Однако отбор проб и ИФА почвы, проведенные на 75-й день лабораторного эксперимента, выявляли в ней весьма значительное количество антигена, характерного для интродуцированных бактерий (по сравнению с контрольной почвой). Необходимо подчеркнуть, что перед этими измерениями, призванными

оценить остаточную выживаемость интродуцированных бактерий, почва более 30-ти дней не перемешивалась и не подвергалась промыванию.

Объяснением факту обнаружения антигена в почве на 75-й день является способность азоспирилл к выживанию, обусловленная их возможностью в небогатых почвах и в условиях дефицита воды или «старого» возраста культуры формировать цисты или цистоподобные формы (Lamm and Neyra, 1981; Sadasivan andNeyra, 1985, 1987; Bashan etal., 1991; Мулюкин с соавт., 2009). Эти образования, как полагают, имеют большую стойкость, чем вегетативные клетки, и поэтому могут служить формой выживания. К тому же сотрудниками ИБФРМ РАН установлено, что ЛПС в составе поверхности покоящихся форм азоспирилл (в частности, штамма Sp245) сохраняет свою антигенность, т.е. способность взаимодействовать со специфическими Ат.

Увлажнение и перемешивание почвы, произведенное после очередного отбора проб, незамедлительно сказывалось на численности бактерий, оцениваемой по уровню ЛПС (см. значение ИФА, соответствующее 76-му дню экспериментов) - что так же хорошо согласуется с данными других авторов. В упомянутой работе Башана с соавт. (Bashan etal, 1995) приводится утверждение, что «нарушение порядка» почвы (disturbance of the soil) существенным образом сказывается на численности популяции A. brasîlense.

Этот факт можно объяснить с точки зрения современной микробиологии, активно использующей понятия «социальное поведение» и «quorum sensing» («ощущение кворума», термин предложен в 1994 г.) при описании процессов и явлений, обеспечивающих выживание бактерий в неблагоприятных условиях (Олескин с соавт., 2000). К настоящему времени строго доказано, что бактериальные аутоиндукторы (низкомолекулярные сигнальные молекулы), накапливающиеся в среде до необходимого значения, могут «включать» специализированные наборы генов, продукты которых способствуют быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям, их выживанию в природной среде и более эффективному использованию питательных субстратов — особенно в пространственно ограниченных экологических нишах (Хмель и Метлицкая, 2006). В этой связи любое агротехническое воздействие на почву, особенно в упомянутых пространственно ограниченных экологических нишах, в определенный момент может оказаться критичным для адекватного восприятия бактериями кворума и снизить численность бактериальной популяции.

Другим объяснением снижения количества выявляемого специфического антигена в почве в последний (в нашем случае) экспериментальный день может служить преимущественное оживление аборигенных покоящихся форм азоспирилл, имеющих серологические перекресты с модельным штаммом Sp245, или хищничество других представителей микробоценоза.

Вместе с тем, каким бы ни был конкретный механизм воздействия или регулирования динамики численности бактериальной популяции in situ, полученные результаты характеризуют азоспириллы как жизнеспособный инокулянт, существование которого в почве (в переживающей форме) может длиться весьма продолжительное время, а также демонстрируют применимость предложенного протокола ИФА почвенных суспензий для оперативного контроля поведения интродуцированных в почву бактерий.

Выявление антигена бактерий A. brasilense Sp245, интродуцированных в почву с растениями

Для оценки динамики выявления специфического антигена после инокуляции почвы в прикорневой зоне растений использовали сорт мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum cv. Саратовская 29. Почву для ИФА извлекали вместе с растениями (через 1 час, 24 часа, 7, 14, 21 и 28 суток после внесения бактериальной суспензии), используя для этого специальный полый цилиндр; аккуратно отделяли почву от растительных корней и проводили пробоподготовку для иммуноферментного анализа, как описано выше. О количестве бактериальных ЛПС в образцах прикорневой почвы на разных этапах эксперимента судили, сравнивая значения А490 опытных и контрольных (неинокулированных) образцов.

Приведенные на рис. 4 результаты показывают, что максимальное количество тестируемого бактериального антигена выявлялось в окружающей растения почве на 14-й день после инокуляции, а к концу четвертой недели опускалось ниже уровня почвы из прикорневой зоны неинокулированных растений. При этом результаты предшествующих измерений (1 час, 24 часа и 7 суток после инокуляции) указывали на то, что in situ вокруг растений в результате внесения экзогенной культуры, вероятно, возникают конкурентные отношения интродуцированных и аборигенных бактерий - вследствие чего количество специфического антигена в контрольной (неинокулироанной) прикорневой зоне оказывается существенно выше.

Полученные результаты однозначно характеризовали A. brasilense Sp245 как бактерии, развитие которых в почве тесным образом связано с растениями, а также дали основания полагать, что существует некий «лимит» бактериальной массы, поддерживаемой в определенный момент в прикорневой зоне растения.

40 30 20 10

-10

-20 -

-30

1/24

тгг

Рис. 4. Результаты иммуноферментного анализа образцов почвы с растениями, инокулирован-ной штаммом А. ЬгахИете Бр245 (пояснения в тексте)

Иммунофлуоресцентная микроскопия образцов почв, инокулированных А. ЬгазПеме Бр245, и иммунодиффузионный анализ бактериальных колоний

С помощью иммунофлуоресцентной и конфокальной сканирующей микроскопии было продемонстрировано наличие бактерий соответствующего серотипа в микроосадках почвенных суспензий, инокулированных А. ЬгсяИете 8р245. Настоящий раздел работы выполнялся совместно с сотрудниками

лаборатории физиологии растительной клетки и лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН.

Микроосадки формировали на стерильных покровных стеклах, помещенных в пластиковые чашки Петри, заполненные суспензией инокулированной почвы. Стекла осторожно отмывали ЗФР, инкубировали в растворе кроличьих Ат на ЛПС штаммов Sp245 или Sp7, а затем в растворе ослиной анти-кроличьей люминесцирующей сыворотки. Образованные в процессе непрямого мечения комплексы просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMLB (Германия) и сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP 5 (Германия).

На рис. 5 представлены фотографии образцов почвы, выявляющие как свободные бактерии, так и адсорбированные на микрочастицах почвы. Использование Ат на ЛПС Sp245 приводило к выявлению в препаратах ярко светящихся структур на темном поле, что служило свидетельством образования иммунных комплексов. В то время как Ат на ЛПС Sp7 не связывались с клетками из образцов почвы, инокулированных бактериальной культурой А. brasilense Sp245.

1 : - а -: ■ ■ ■ ■< '-"Ш ЩЩ

1А 2 А ЗА 4А

Щ ШЯШ: Вт 'ЩЯНМ; * ¥

1Б 2Б ЗБ 4Б

Рис. 5. Результат иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием Ат на ЛПС Бр245 образцов почвы инокулированной А. brasilen.se 8р245 (1А, 2А, ЗА - светлое поле, 1Б, 2Б, ЗБ - флуоресценция) и вр7 (4 А - светлое поле, 4Б -флуоресценция). Длина масштабной линейки - 100 мкм

Полученные результаты были подтверждены данными независимого метода -иммунодиффузионного анализа (с антителами на ЛПС Эр245 и Бр7) высеянных из инокулированной почвы бактериальных колоний на плотной питательной среде с витальным красителем Конго красным (37.5 мкг/мл).

Исследование распространенности представителей серологических групп азоспирилл в различных типах почв Саратовской области

Для изучения распространенности азоспирилл в различных типах почв был проведен сравнительный ИФА следующих основных типов почв Саратовской области: солонец (Алгайский район), аллювиальная (Лысогорский район), серая лесная (Татищевский район), чернозем типичный (Лысогорский район) и чернозем

южный (Саратовский район). Результаты сравнительного ИФА почв приведены на рис. 6.

Можно видеть, что для всех проанализированных почв характерно преобладание антигенов азоспирилл, относящихся к серотипу 5р245, при этом чернозем южный и серая лесная почва демонстрировали наибольший уровень выявления этих детерминант. В то же время, чернозем южный отличался также более заметным присутствием антигенов серотипа 5р7. I

I %

Рис. 6. Результаты сравнительного ИФА образцов почв Саратовской области с использованием Ат на JITTCsp245 (светлая область) и JmCsP7 (серая область)

Преобладание в почвах антигена серотипа Sp245 согласуется со сведениями о выделении из ризосферы пшеницы Саратовской области штамма A. brasilense SR75 (Позднякова с соавт., 1988), для которого установлена идентичность строения повторяющегося звена О-специфического полисахарида ЛПС и гомология LPS-локусов в плазмидах таковым штамма Sp245 (Федоненко с соавт., 2005). Штамм A. brasilense Sp245 является высокоэффективным колонизатором корней пшеницы (Baldani etal., 1983), и обнаружение в почвах относительно большого количества специфического антигена позволило предположить значительный вклад азоспирилл серотипа Sp245 в плодородие почв Саратовской области.

В настоящей работе также была продемонстрирована возможность использования полученного нами оригинального конъюгата, взаимодействующего с родо/видоспецифичными антигенами азоспирилл, для прямого выявления бактерий в почвенных образцах. ИФА с применением конъюгированных с пероксидазой поликлональных кроличьих Ат на интактые клетки выявлял присутствие антигенных детерминант азоспирилл в тестируемых образцах почвы; при этом конъюгирование выявляющих антител непосредственно с ферментом позволяло сократить этап работы.

чернозем типичный

серая лесная

солонец

500

чернозем южный

аллювиальная

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе нммуноферментный анализ почвенных суспензий с использованием поликлональных антител на ЛПС был впервые применен для in situ выявления соматического антигена интродуцированных в почву бактерий A. brasilense Sp245 в модельных экспериментах, а также для оценки распространенности представителей серологических групп азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.

Первым этапом реализации цели настоящей работы явилась оптимизация условий иммуноферментного анализа целых клеток бактерий рода Azospirillum. Разработанный к настоящему моменту протокол ИФА для выявления азоспирилл в микробных суспензиях имеет предел достоверного количественного выявления 10б кл/мл. При этом меньшее на порядок количество клеток в суспензии также позволяет осуществлять положительную идентификацию бактерий определенного серологического типа методом ИФА, а не на основе культурально-физиологических или молекулярно-генетических характеристик азоспирилл. Кроме того, созданы предпосылки увеличения чувствительности системы за счет замены процедуры простой адсорбции антигенов процедурой иммуносорбции, которая заключается в использовании «антител захвата» для сенсибилизации лунок планшетов (используемых в качестве твердой фазы), и использования конъюгированных с ферментом родоспецифичных антител на поверхностные белковые антигены азоспирилл.

С помощью оптимизированного метода ИФА целых клеток азоспирилл проведен скрининг 20-ти коллекционных штаммов Azospirillum, выделенных из почв Саратовской области, с использованием антител на ЛПС штаммов Sp7 и Sp245 (относящихся к различным серологическим группам согласно специфичности их О-антигена). Одинаковое количество штаммов, отнесенное к каждой из серорупп, позволило сделать адекватные выводы относительно вклада азоспирилл, относящихся к двум подробно описанным к настоящему времени серологическим группам, в формирование микрофлоры почв Саратовской области

Для выявления бактериальных липополисахаридных антигенов непосредственно в почвенных суспензиях (минуя стадии высева бактерий на питательную среду или предобогащения бактериями исследуемых образцов почвы на соответствующих средах перед детектированием) предложен подход, включающий приготовление почвенной суспензии с последующей сорбцией бактериальных клеток и ЛПС в составе микроосадка из полученной суспензии; проведение иммуноферментного анализа сформированного микроосадка с антителами на ЛПС с измерением оптической плотности продуктов иммуноферментной реакции; сравнение измеренных значений оптической плотности с контрольными значениями (при этом о наличии бактериальных липополисахаридных антигенов судят по выраженной в процентах разнице значений оптической плотности продуктов ИФА опытных и контрольных образцов почвы).

выявляется на седьмые сутки эксперимента, в то время как в прикорневой зоне пшеницы Triticum aestivum cv. Саратовская 29 максимальное количество специфического антигена выявляется на 14-е сутки. Полученные результаты однозначно характеризовали A. brasilense Sp245 как бактерии, развитие которых в почве тесным образом связано с растениями.

На основании полученных данных сформулировано предположение о том, что наиболее эффективным приемом обеспечения сельскохозяйственных растений максимальным количеством связанного микроорганизмами атмосферного азота, бактериальных гормонов и прочих необходимых соединений может быть не инокуляция в почву экзогенных или эндогенных бактерий, а разработанные способы управления поведением и стимулирования развития аборигенной почвенной микрофлоры.

Полученные в работе результаты свидетельствуют об эффективности твердофазного иммуноферментного анализа с использованием антител на ЛПС в качестве зонда, для специфического выявления почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum - как в составе бактериальных суспензий, так и в почвенных образцах. Хорошая чувствительность в данном случае сочетается с быстротой анализа, возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию аналита.

Мы полагаем, что настоящий подход может быть использован как для контроля поведения интродуцированных в почву бактерий и оценки эффективности применения бактериальных удобрений и биокомплексов, так и для исследования воздействия различных факторов на почвенный микробоценоз. Следует отметить, что к настоящему моменту метод успешно использован для детектирования и количественной оценки численности штамма-деструктора нефтяных углеводородов Dietzia maris АМЗ, интродуцируемого в загрязненную почву с целью ее ремедиации.

ВЫВОДЫ

1. Впервые на основе оптимизированного варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием антител на липополисахариды азоспирилл, полученных иммунизацией животных обработанными глутаровым альдегидом бактериальными клетками, изучена динамика выявления in situ соматического антигена интродуцированных в почву ассоциативных бактерий A. brasilense Sp245 и распространенность представителей серологических групп азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.

2. Оптимизированы условия проведения иммуноферментного анализа целых интактных клеток и микроосадков почвенных суспензий с использованием антител на ЛПС бактерий рода Azospirillum.

3. Установлено, что максимальное количество специфического антигена в образцах инокулированной почвы, по сравнению с контролем, выявляется на седьмые сутки эксперимента, в то время как в прикорневой зоне пшеницы Triticum aestivum cv. Саратовская 29 максимальное количество специфического антигена выявляется на 14-е сутки.

4. Серологический анализ методом ИФА 20-ти коллекционных штаммов азоспирилл, выделенных из почв Саратовской области, позволил отнести местные

штаммы SRI 5, SR75 и SR55, SRI 4 к серологическим типам Sp245 и Sp7, соответственно.

5. Оценка распространенности азоспирилл в различных почвах впервые выявила значительный вклад серотипа Sp245, в сравнении с серотипом Sp7 среди азоспирилл, представленных в микробоценозе почв Саратовской области.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ * - публикация в издании из перечня ВАК

1. *Красов А.И., Попова И. А., Филипьечева Ю.А., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю. Применение иммуноферментного анализа для выявления азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum в почвенных суспензиях // Микробиология. - 2009. -Т. 78,№5.-С. 662-666.

2. Красов А.И., Матора Л.Ю. Применение иммуноферментного анализа для идентификации азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum в почвенных суспензиях // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Материалы конференции / 2-я региональная конф. молодых ученых. - Саратов: Изд-во «Научная книга», 2004. - С. 20-21.

3. Матора Л.Ю., Широков А.А., Красов А.И., Бурыгин Г.Л., Плешакова Е.В., Никифоров М.В. Детектирование и идентификация бактерий в природной среде // Сб. тр. Междунар. конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». - Саратов: Изд-во «Научная книга», 2005. - С. 145.

4. Burygin G.L., Krasov A.I., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu. Development of an effective immunochemical test-system for monitoring rhizospheric and soil bacterial degraders in a polluted-soil environment // Abstr. 13th International Biodeterioration and Biodégradation Symposium (IBBS-13). - Madrid, Spain, September 4-9, 2005. - P. 271.

5. Matora L.Yu., Burygin G.I., Shirokov A.A., Krasov A.I. Immunochemical detection and enumeration of bacteria in the environment // Abstr. 2nd Symposium of the AgroBiotech Network: Root-Soil Microbe Interaction (AB-RMS Symposium). — Hamburg, Germany, February 25 - March 3, 2006. - P. 38.

6. Chernova Yu.A., Krasov A.I., Burygin G.L., Matora L.Yu. Serological screening of N2-fixing rhizobacterial strains of the genus Azospirillum // Modern Problems of Microbiology and Biotechnology / The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference, 28-31 May 2007. - Odesa, 2007. - P. 63.

7. Buiygin G., Shirokov A., Krasov A., Shchyogolev S., Matora L. Immunochemical revealing of soil and rhizosphere bacteria // Abstr. International Conference «Rhizosphere-2». Montpellier, France, August 26-31,2007. - P. 79.

8. Buiygin G., Shirokov A., Krasov A., Shchyogolev S., Matora L. Immunochemical revealing of rhizosphere bacteria in situ II Abstr. Postgraduate Course «Applied and Fundamental Aspects of Responses, Signaling and Developmental Process in the Root-Microbe Systems», Russia, Saint-Petersburg, June 25-JuIy 2, 2007. - P. 51.

9. Красов А.И., Попова И.А., Чернова Ю.А., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю. Выявление бактерий рода Azospirillum в почве методом иммуноферментного анализа с использованием антител на липополисахариды // 4-я Межрегион, конф. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой»: материалы. Саратов, 14-16 октября 2008. г. - Саратов: «Научная книга», 2008.-С. 15.

10. Красов А.И., Попова И. А., Филипьечева Ю.А., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю. Выявление азотфиксирующих бактерий рода АгояртИит в почвенных суспензиях с помощью иммуноферментного анализа // «Вавиловские чтения -2008»: Материалы Межд. науч.-практ. конф. - Саратов: ИЦ «Наука», 2008. -С. 27-28.

11. Красов А.И., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Способ определения бактериальных липополисахаридных антигенов в почве // Заявка на патент РФ №2009 120888 от 1.06.2009 г.

Подписано в печать 11.11.2009.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Красов, Александр Игоревич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общая характеристика подходов, обеспечивающих специфическое выявление бактерий в природной среде.

1.1.1. Молекулярно-генетические подходы к выявлению бактерий.

1.1.2. Современные методы иммунохимического выявления и анализа бактериальных антигенов.

1.2. Антитела как основной инструмент иммуноанализа.

1.2.1. Способы получения антител.

1.3. Бактериальные антигены, используемые в качестве определяемых объектов в иммуноанализе.

1.4. Иммуноферментный анализ.

1.5. Сложности выявления микроорганизмов в почве.

1.6. Характеристика объекта исследования — почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Бактериальные штаммы и условия выращивания бактерий.

2.2. Иммунизация животных и получение антител.

2.3. Образцы почв, использованных для иммуноанализа.

2.4. Инокуляция почвы бактериями A. brasilense Sp245.

2.5. Инокуляция растений бактериями.

2.6. Иммуноферментный анализ (вариант ELISA).

2.7. Иммунолюминесцентная и лазерная конфокальная микроскопия почвенных суспензий.::.:..:

2.8. Получение препаратов наружных мембран.

2.9. Двойная иммунодиффузия.

2.10. Конъюгирование пероксидазы хрена с кроличьими антителами.

2.11. Иммунодот-анализ бактериальных суспензий.

Глава 3. Полученные результаты и обсуждение.

3.1. Оптимизация условий проведения твердофазного ИФА с использованием Ат на ЛПС для выявления бактерий рода Azospirillum.

3.2. Скрининг методом ИФА коллекционных штаммов Azospirillum, выделенных из почв Саратовской области

3.3. Иммуноферментный анализ почвенных суспензий.

3.3.1. Выявление специфического антигена интродуцированных в почву бактерий

A. brasilense Sp245.

3.3.2. Выявление антигена бактерий А. brasilense Sp245, интродуцированных в почву с растениями.

3.4. Иммунофлуоресцентная микроскопия образцов почв, инокулированных A. brasilense Sp245, и иммунодиффузионный анализ бактериальных колоний.

3.5. Исследование распространенности представителей серологических групп азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.

3.6. Прямой ИФА с использованием родоспецифичных антител на бактерии рода Azospirillum.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum in Situ с помощью иммуноферментного анализа"

Ассоциативные микроорганизмы рода Azospirillum занимают особое положение в ряду почвенных азотфиксаторов. Впервые эти бактерии были выделены в Нидерландах более 80-ти лет назад (Beijerinck, 1925), однако в сферу интенсивного изучения попали после опубликования работы «Ассоциативный симбиоз у тропических трав.» (Dobereiner and Day, 1976), став одним из наиболее интенсивно исследуемых ассоциативных партнеров растений (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan et al., 2004).

Выявляющие системы на основе специфичных антител (Ат) являются весьма удобным средством мониторинга разнообразных микроорганизмов. В настоящее время методы иммуноанализа находят весьма широкое применение в микробиологии, в первую очередь, при работе с патогенными бактериями. Эти методы занимают третье место по частоте и интенсивности использования, уступая «золотому» стандарту - методам, основанным на культивировании, и «серебряному» стандарту — молекулярно-генетическим приемам на основе полимеразной цепной реакции (Gracias, McKillip, 2004; Bhunia, 2006), при этом иммуноанализ является, безусловно, самым быстрым по исполнению в сравнении с двумя другими методами.

Кроме того, приходится учитывать, что для анализа представителей почвенной микрофлоры основанные на культивировании методы пригодны весьма ограниченно, поскольку всего небольшая доля от общей популяции бактерий в почве (оцененной микроскопическими методами) поддается культивированию (Skinner et al, 1952; Louw and Webley, 1959; Rovira et al, 1974; Faegri et al, 1977; Lund and Goksoyr, 1980; Olsen and Bakken, 1987; Ogan, 1991; Pedersen and Jacobsen, 1993), а молекулярно-генетические подходы приобретают актуальность в том случае, когда для каждого объекта имеются наборы праймеров на соответствующие генетические локусы, обеспечивающие с высокой разрешающей силой дифференциацию штаммов или групп штаммов.

Одним из наиболее эффективных серологических подходов является иммуноферментный анализ (ИФА) - метод выявления антигенов (или антител), основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки. В настоящее время ничтожно мало количество работ, посвященных иммуноферментному in situ выявлению микробных объектов в почве, которая представляет собой чрезвычайно сложную среду для анализа благодаря присутствию в ней большого числа органических соединений, затрудняющих, или в некоторых случаях делающих невозможной интерпретацию результатов. Вместе с тем, использование данного подхода весьма перспективно для вырабатывания экологически приемлемых агробактериальных технологий.

Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Оптимизировать условия твердофазного иммуноферментного анализа целых клеток бактерий рода Azospirillum с использованием антител на липополисахарид (ЛПС).

2. Провести идентификацию бактерий A. brasilense в инокулированной почве.

3. Оценить динамику выявления in situ соматического антигена интродуцированных в почву бактерий A. brasilense Sp245.

5. Оценить распространенность азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

Оптимизированный способ твердофазного иммуноферментного анализа микроосадка почвенных суспензий с использованием антител на соматический антиген азоспирилл позволяет оценивать динамику развития бактериальных популяций.

Максимальное количество специфического антигена A. brasilense Sp245 в образцах инокулированной этим штаммом почвы без растений и в прикорневой зоне инокулированной пшеницы Triticum aestivum cv. Саратовская 29 выявляется на 7-е и 14-е сутки, соответственно.

Для аборигенной микрофлоры почв Саратовской области характерно преобладание антигенов азоспирилл, относящихся к серотипу Sp245; чернозем южный отличается также более заметным присутствием антигенов азоспирилл серотипа Sp7.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на 2-й и 4-й Региональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2004; 2008); 2-м и 3-м Агробиотехнологических Симпозиумах стран Балтии (Гамбург, Германия, 2006; Санкт-Петербург, Россия, 2007); Международной научной конференции молодых ученых «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); Международной конференции «Ризосфера - 2» (Монпелье, Франция, 2007), Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения — 2008» (Саратов, 2008), а также на отчетной научной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, 2009).

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» гос. регистрации 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.) и «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Выяснение молекулярно-генетических механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных биотехнологий» в рамках государственного контракта с Роснаукой № 02.445.11.7130 (ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы») (руководитель научной школы д.б.н., профессор Игнатов В.В.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ НШ-1529.2003.4 и НШ-6177.2006.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Красов, Александр Игоревич

выводы

4. Серологический анализ методом ИФА 20-ти коллекционных штаммов азоспирилл, выделенных из почв Саратовской области, позволил отнести местные штаммы SR15, SR75 и SR55, SR14 к серологическим типам Sp245 и Sp7, соответственно.

5. Оценка распространенности азоспирилл в различных почвах впервые выявила значительный вклад серотипа Sp245 в сравнении с серотипом Sp7 среди азоспирилл, представленных в микробоценозе почв Саратовской области.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе иммуноферментный анализ почвенных суспензий с использованием поликлональных антител на липополисахариды был впервые применен для in situ выявления соматического антигена интродуцированных в почву бактерий A. brasilense Sp245 в модельных экспериментах, а также для оценки распространенности представителей серологических групп азоспирилл в различных типах почв Саратовской области.

Первым этапом реализации цели настоящей работы явилась оптимизация условий иммуноферментного анализа целых клеток бактерий рода Azospirillum. Разработанный к настоящему моменту протокол ИФА для выявления азоспирилл в микробных суспензиях имеет предел достоверного количественного выявления 106 кл/мл. Подобная чувствительность является весьма удовлетворительным результатом для иммуноферментного теста с использованием поликлональных антител и колориметрического детектирования (Schloter etal., 1992; Schloter etal., 1995). При этом меньшее на порядок количество клеток в суспензии также позволяет осуществлять положительную идентификацию бактерий определенного серологического типа методом ИФА, а не на основе культурально-физиологических или молекулярно-генетических характеристик азоспирилл. Кроме того, созданы предпосылки увеличения чувствительности системы за счет замены процедуры простой адсорбции антигенов процедурой иммуносорбции, которая заключается в использовании «антител захвата» для сенсибилизации лунок планшетов (используемых в качестве твердой фазы), и использования конъюгированных с ферментом родоспецифичных антител на поверхностные белковые антигены азоспирилл.

Sp7 и Sp245 (относящихся к различным серологическим группам согласно специфичности их О-антигена). Одинаковое количество штаммов, отнесенное к каждой из серорупп, позволило сделать адекватные выводы относительно вклада азоспирилл, относящихся к двум подробно описанным к настоящему времени серологическим группам, в формирование микрофлоры почв Саратовской области.

Иммуноферментный анализ почвенных суспензий с использованием антител на ЛПС был применен для in situ выявления соматического антигена интродуцированных в почву бактерий A. brasilense Sp245 в модельных экспериментах. Установлено, что максимальное количество специфического антигена в образцах инокулированной почвы, по сравнению с контролем, выявляется на седьмые сутки эксперимента, в то время как в прикорневой зоне пшеницы Triticum aestivum cv. Саратовская 29 максимальное количество специфического антигена выявляется на 14-е сутки. Полученные результаты однозначно характеризовали A. brasilense Sp245 как бактерии, развитие которых в почве тесным образом связано с растениями, а также дали основания полагать, что существует некий «лимит» бактериальной массы, поддерживаемой в определенный момент в прикорневой зоне растения.

Полученные в работе результаты свидетельствуют об эффективности твердофазного иммуноферментного анализа с использованием антител на ЛПС в качестве зонда, для специфического выявления почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum — как в составе бактериальных суспензий, так и в почвенных образцах. Хорошая чувствительность в данном случае сочетается с быстротой анализа, возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию аналита.

Мы полагаем, что настоящий подход может быть использован как для контроля поведения интродуцированных в почву бактерий и оценки эффективности применения бактериальных удобрений и биокомплексов, так и для исследования воздействия различных факторов на почвенный микробиоценоз. К настоящему моменту метод также успешно использован для детектирования и количественной оценки численности штамма-деструктора нефтяных углеводородов Dietzia maris АМЗ, интродуцируемого в загрязненную почву с целью ее ремедиации.

В заключение автор выражает глубокую признательность за сотрудничество и помощь в работе Марине Константиновне Соколовой, Олегу Игоревичу Соколову, Андрею Вячеславовичу Шелудько, Александру Александровичу Широкову, Геннадию Леонидовичу Бурыгину, Екатерине Владимировне Плешаковой, Николаю Юрьевичу Селиванову, Юлии Анатольевне Филипьечевой, Ирине Анатольевне Поповой и Анне Николаевне Сухининой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Красов, Александр Игоревич, Саратов

1. Васильев Н.В., Луцюк Н.Б., Палий Г.К., Смирнова О.В. Биохимия и иммунохимия микробных полисахаридов. — Томск: Изд-во Томского ун-та, 1984.-303 с.

2. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Щеголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы: Синтез, свойства, биомедицинское применение. М.: Наука, 2008.-319 с.

3. Игнатов В.В. Биологическая фиксация азота и азотфиксаторы // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 9. - С. 28-33.

4. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа — М.: Мир, 1988.-446 с.

5. Каталог коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН: Электронный документ. (http://www.ibppm.saratov.ru/PDF/collect.pdf). Проверено 18.10.2009.

6. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассо-циативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Изд-во Сарат. Ун-та, 2003. - С. 12-15.

7. Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Вирусы, вироиды и микоплазмы растений: К 34 / Учебное пособие. М.: Изд-во РУДН, 2003. - С. 157.

8. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Медицина, 1968. - 684 с.

9. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. — 1998. -Т. 67.-С. 815-820.

10. Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Погорелова А.Ю., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Разнообразие морфотипов покоящихся клеток и условий их образования у Azospirillum brasilense II Микробиология. — 2009. -Т. 78. №1.-С. 42-51.

11. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 3. - С. 309-327.

12. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. — 1988. Т. 57, № 2. - С. 275-278.

13. Стэндифер Д.К. Иммуноферментный анализ гаптенов и антигенов с разделением компонентов (гетерогенный анализ) // Иммуноферментный анализ / Ред. Нго Т.Т., Ленхофф Г. М.: Мир, 1988. - С. 172-192.

14. Хмель И.А., Метлицкая А.З. QUORUM SENSING регуляция экспрессии генов — перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40. №2. - С.195.210.

15. Широков А. А. Иммунохимическая идентификация поверхностных структур Azospirillum brasilense, участвующих в реализации социального поведения бактерий: // Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов: ИБФРМ РАН, 2008. 23 с.

16. Armstrong J.L., Shigeno D.S., Calomiris J.J., Seidler RJ. Antibiotic-resistant bacteria in drinking water // Appl. Environ. Microbiol. 1981. - Vol. 42. -P. 277-283.

17. Bagger Y.Z. Monoclonal antibodies against Yersinia enterocolitica common antigen produced by immunization with immunoprecipitates // APMIS -1991. Vol. 99. - P. 972-976.

18. Bakken L. R. Separation and purification of bacteria from soil // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - Vol. 49. - P. 1482-1487.

19. Baldani J.I., Caruso L., Baldani V.L.D. et al. Recent advances in BNF with non-legume plants // Soil Biol. Biochem. 1997. - Vol. 29. - P. 911-922.

20. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - Vol. 29. - P. 924-929.

21. Banada P.P., Bhunia A.K. Antibodies and Immunoassays for Detection of Bacterial Pathogens // Int. J. Food Microbiol. 2008. - Vol. 21. - P. 567-590.

22. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-iplant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. -1997.-Vol. 43.-P. 103-121.

23. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-iplant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003) // Can. J. Microbiol. 2004. - Vol. 50. - P. 521-577.

24. Bashan Y., Levanony H., Whitmoyer R.E. Root surface colonization of non-cereal crop plants by pleomorphic Azospirillum brasilense Cd // J. Gen. Microbiol.-1991.-Vol. 137.-P. 187-196.

25. Bashan Y., Puente M.E., Rodriguez-Mendoza M.N., Toledo G., Holguin G., Ferrera-Cerrato R., Pedrin S. Survival of Azospirillum brasilense in the bulk soil and rhizosphere of 23 soil types // Appl. Environ. Microbiol. 1995. -Vol. 61.-P. 1938-1945.

26. Becker S., Boger P., Oehlmann R., Ernst A. PCR bias in ecological analysis: case study for quantitative Taq nuclease assay in analysis of microbial communities // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 4945-4953.

27. Beijerinck M.W. Uber ein Spirillum, welches freien Stickstoff binden kann? // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkun. Infektionskr. Hyg. 1925. - B. 63. - S. 353-359.

28. Bhunia A.K. Antibodies to Listeria monocytogenes // Crit. Rev. Microbiol. 1997. - Vol. 23. - P. 77-107.

29. Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K. etal. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the presence of foodborne pathogens // J. Food Prot. 2005. - Vol. 68. - P. 2637-2647.

30. Bohlool В., Schmidt E. The immunofluorecence approach in microbial ecology // Advances in Microbial Ecology / Ed. M. Alexander. — London: Academic press, 1980. P. 203-207.

31. Bone T.L., Balkwill D.L. Improved flotation technique for microscopy of in situ soil and sediment microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - Vol. 51. - P. 462-468.

32. Bottomley P.J., Maggard S.P. Determination of viability withinserotypes of a soil population of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii // Appl Environ Microbiol. 1990. - Vol. 56. - P. 533-540.

33. Cadieux В., Blanchfield В., Smith J.P., Austin J.W. A rapid chemiluminescent slot blot immunoassay for the detection and quantification of Clostridium botulinum neurotoxin type E, in cultures // Int. J Food Microbiol. — 2005.-Vol. 101.-P. 9-16.

34. Carlson R.W., Kalembasa S., Turowski D., Pachori P. Characterization of the lypopolysaccharide from a mutant of Rhizobium phaseoli which is defective in infection thread development // J. Bacterid. 1987. — Vol. 169.-P. 4923-4928.

35. Chapman P.A., Ashton R. An evaluation of rapid methods for detecting Escherichia coli 0157 on beef carcasses // Int. J. Food Microbiol. — 2003. Vol. 87. - P. 279-285.

36. Choma A. Lipopolysaccharides from Mesorhizobium huakuii and Mesorhizobium cicereti: chemical and immunological comparative data // Acta Biochim. Polonica. 2002. - Vol. 49. - P. 1043-1052.

37. Chotte J.-L., Schwartzmann A., Bally R., Monrozier L.J. Changes in bacterial communities and Azospirillum diversity in soil fractions of a tropical soil under 3 or 19 years of natural fallow // Soil Biol, and Biochem. 2002. - Vol. 34. -P. 1083-1092.

38. De Coninck K., Horemans J.S., Randombage S., Vlassak K. Occurrence and survival of Azospiriilum spp. in temperate regions // Plant and Soil. 1988.-Vol. 110.-P. 213-218.

39. De Coninck, K., S. Horemans, S. Randombage, K. Vlassak. Occurrence and survival of Azospirillum spp. in temperate regions // Plant Soil. -1988.-Vol. 110.-P. 213-218.

40. Demezas D.H., Bottomley P.J. Autecology in rhizospheres and nodulating behavior of indigenous Rhizobium trifolii // Appl. Environ. Microbiol. -1986.-Vol. 52.-P. 1014-1019.

41. Dobereiner J., Baldani V.L., Reis V.M. Endophytic occurrence of diazotrophic bacteria in non-leguminous crops // NATO ASI Series G: Ecological Sciences / Germany: Springer verlag, 1995. Vol. 37. - P. 3.

42. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation. Washington. - 1976. - P. 518-537.

43. Donnelly C.W. Detection and isolation of Listeria monocytogenes from food samples: Implications of sub lethal injury // J. AOAC Int. 2002. — Vol. 85.-P. 495-500.

44. Eckert В., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffels M., Hartman A. Azospirillum doebereinerae sp. nov. a diazotrofic bacterium associated with Mis-canthus sinesis 'giganteus'// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - Vol. 51.-P. 17-26.

45. Emanuel P.A., Dang J., Gebhardt J.S. et al. Recombinant antibodies: A new reagent for biological agent detection // Biosens. Bioelectron. 2000.1. Vol. 14.-P. 751-759.

46. Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry // Med Biol. -1971.-Vol. 8.-P. 871-874.

47. Faegri A., Torsvik V.L., Goksoyr J. Bacterial and fungal activities in soil: separation of bacteria and fungi by a rapid fractionated centrifugation technique // Soil Biol. Biochem. 1977. - Vol. 9. - P. 105-112.

48. Falk E.C., Dobereiner J., Johnson J.L., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense Magalhaes et al. 1984 and emendation of the description of the genus Azospirillum II Inter. J. Syst. Bacteriol. — 1985. — Vol. 35.-P. 117-118.

49. Feng P. Rapid methods for detecting foodborne pathogens // Bacteriological Analytical Manual, Ed. 8 (revised: Jan 25, 2001). 2001.

50. Filiatrault M.J., Wagner V.E., Bushnell D., Haidaris C.G., Iglewski B.H., Passador L. Effect of anaerobiosis and nitrate on gene expression in Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 3764-3772.

51. Fillhart R.C., Bachand G.D., Castello J.D. Detection of infectious tobamoviruses in forest soils // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64. - P. 1430-1435.

52. Gasanov U., Hughes D., Hansbro P.M. Methods for the isolation and identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes: A review // FEMS Microbiol. 2005. - Vol. 29. - P. 851-875.

53. Geng Т., Bhunia A.K. Biosensors in foodborne pathogen detection. In: Smart Biosensor Technology / Eds. Knopf G.K., Bassi A.S. Taylor and Francis, Boca Raton, Florida, 2007. P. 503-519.

54. Geng Т., Kim K.P., Gomez R., Sherman D.M., Bashir R., Ladisch

55. M.R., Bhunia A.K. Expression of cellular antigens of Listeria monocytogenes that react with monoclonal antibodies C11E9 and EM-7G1 under acid-, saltor temperature-induced stress environments // J. Appl. Microbiol. 2003. - Vol. 95. — P. 762-772.

56. Gracias K.S., McKillip J.L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food // Can. J. Microbiol. — 2004. -Vol. 50.-P. 883-890.

57. Guliy O.I., Matora L.Yu., Burygin G.L. et al. Electrophysical characteristics of Azospirillum brasilense Sp245 during interaction with antibodies to various cell-surface epitopes // Analytical Biochemistry. — 2007. — Vol. 370. — P. 201-205.

58. Hahm B.K., Bhunia A.K. Effect of environmental stresses on antibody-based detection of Escherichia coli 0157: H7, Salmonella enterica serotype Enteritidis and Listeria monocytogenes II J. Appl. Microbiol. — 2006. — Vol. 100.-P. 1017-1027.

59. Hearty S., Leonard P., Quinn J. et al. Characterisation and potential application of a novel monoclonal antibody for rapid identification of virulent Listeria monocytogenes II J. Microbiol. Methods. 2006. - Vol. 66. - P. 294-312.

60. Hermansson, A., Lindgren P.-E. Quantification of ammoniaoxidizing bacteria in arable soil by real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - Vol. 67.-P. 972-976.

61. Hitchins A.D. Chapter 10, Listeria monocytogenes // FDA Bacteriological Analytical Manual. Maryland: AO AC Int., 1998.

62. Holben, W.E., Jansson J.K., Chelm B.K., Tiedje J.M. DNA probe method for the detection of specific microorganisms in the soil bacterial community // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - Vol. 54. - P. 703-711.

63. Jakeman S., Lee H., Trevors J. Survival, detection and containment of bacteria II Microbial. Releases. 1993. - Vol. 2. - P. 237-252.

64. Jaradat Z.W., Bhunia A.K. Glucose and nutrient concentrations affect the expression of a 104-kilodalton listeria adhesion protein in Listeriamonocytogenes II Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68. - P. 4876-4883.

65. Kabat E.A. Basic principles of antigen-antibody reaction // Meth. Enzymol. Immunochemical Techniques. — New York: Academic Press. — 1980. — Vol. 70.-P. 3-49.

66. Kabir M.M., Faure D., Haurat J., Normand P., Jacoud C., Wadoux P., Bally R. Oligonucleotide probes based on 16S rRNA sequences for the identification of four Azospirillum species // Canad. Journal of Microbial. 1995. — Vol. 41.-P. 1081-1087.

67. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirllum brasiense Sp245 in production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - V.40. - P. 73-83.

68. Kennedy A.C., Wollum A.G. Enumeration of Bradyrhizobium japonicum in soil subjected to high temperature: comparison of plate count, most probable number and fluorescent antibody techniques // Soil Biol. Biochem. -1988.-Vol. 20.-P. 933-937.

69. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Keiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. 1989. - Vol. 140. - P. 679-693.

70. Kim S.-H., Park M.-K., Kim J.-Y. et al. Development of a sandwich ELISA for the detection of Listeria spp. using specific flagella antibodies // J. Vet. Sci. -2005. Vol. 6. - P. 41-46.

71. Kingsley M.T., Bohlool B.B. Release of Rhizobium spp. from tropical soils and recovery for immunofluorescence enumeration // Appl. Environ. Microbiol.- 1981.-Vol. 42.-P. 241-248.

72. Kirchhof G., Schloter M., Assmus В., Hartmann A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes // Soil Boil. Biochem. 1997. - Vol. 29. - P. 853-862.

73. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 5-7.

74. Kolb, S., Knief, C., Stubner, S., Conrad, R. Quantitative Detection of

75. Methanotrophs in Soil by Novel pmoA-Targeted Real-Time PCR Assays // Applied and Environmental Microbiology. 2003. - Vol. 69. - P. 2423-2429.

76. Lamm, R.B., NeyrA C.A. Characterization and cyst production of azospirilla isolated from selected grasses growing in New Jersey and New York // Can. J. Microbiol. 1981. - Vol. 27. - P. 1320-1325.

77. Lemes-Marques E.G., Yano T. Influence of environmental conditions on the expression of virulence factors by Listeria monocytogenes and their use in species identification // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - Vol. 239. - P. 63-70.

78. Lequin R. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Clin. Chem. 2005. - Vol. 51. - P. 2415-2418.

79. Levanony H., Bashan Y., Kahana Z.E. Enzyme-linked immunosorbent assay for specific identification and enumeration of Azospirillum brasilense Cd in cereal roots // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - Vol. 53. - P. 358-364.

80. Liddell E. Antibodies // The Immunoassay Handbook, 3rd / Ed. D. Wild New York: Elsevier Ltd., 2005. - 930 p.

81. Louw H.A., Webley D.M. The bacteriology of the root region of the oat plant grown under controlled pot culture conditions // J. Appl. Bacteriol. -1959.-Vol. 2.-P. 216-226.

82. Lund, V., Goksoyr J. The effects of water fluctuations on microbial mass and activity in soil // Microb. Ecol. 1980. - Vol. 6. - P. 115-123.

83. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Souto S.M. etal. New acid-tolerant Azospirillum species // An. Acad. Bras. Scienc. 1983. - Vol. 55. - P. 417-430.

84. Martin N.J., MacDonald R.M. Separation of non-filamentous microorganisms from soil by density gradient centrifugation in percoll // J. Appl. Bacteriol. 1981. - Vol. 51. - P. 243-251.

85. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: Filamentous phage displaying antibody variable domains // Nature. — 1990. Vol. 348. - P. 552-554.

86. Mehnaz S., Weselowski В., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst.

87. Evol. Microbiol. 2007. - Vol. 57. - P. 620-624.

88. Mehnaz S., Weselowski В., Lazarovits G. Azospirillum zeae sp. nov., a diazotrophic bacterium isolated from rhizosphere soil of Zea mays // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007a. - Vol. 57. - P. 2805-2809.

89. Milenbachs A.A., Brown D.P., Moors M., Youngman P. Carbon-source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes II Molecular Microbiology. 1997. - Vol. 23. - P. 1075-1085.

90. Morgan J.A.W., Winstanley C., Pickup R., Saunders J. Rapid immunocapture of Pseudomonas putida cells from lake water by using bacterial flagella // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57. - P. 503-509.

91. Mygind Т., Birkelund S., Falk E., Christiansen G. Evaluation of realtime quantitative PCR for identification and quantification of Chlamydia pneumoniae by comparison with immunohistochemistry // J. Microbiol. Methods. -2001. Vol. 46.-P. 241.

92. Nanduri V., Bhunia A.K., Tu S.-I., Paoli G.C., Brewster J.D. SPR biosensor for the detection of L. monocytogenes using phage-displayed antibody // Biosens. Bioelectron. 2007. - Vol. 23. - P. 248-252.

93. Nannipieri P., Ciardi C., Badalucco L. A method to determine soil DNA and RNA // Soil Biol. Biochem. 1986. - Vol. 18. - P. 275-281.

94. O'Sullivan M.J., Marks V. Methods for the preparation of enzyme-antibody conjugates for use in enzyme immunoassay // Methods Enzymol. — 1981. -P. 147-166.

95. Obst U., Huebner I., Wecker M., Bitter-Suermann D. Immunological method using monoclonal antibodies to detect Enterobacteriaceae in drinking water // Aqua. 1989. - Vol. 38. - P. 136-142.

96. Ogan M. Studies on the ecology of aquatic bacteria of the lower Niger delta: populations of viable cells and physiological groups // Arch. Hydrobiol. — 1991.-Vol. 124.-P. 235-252.

97. Olive D.M., P.Bean. Principles and application of me-thods for DNA-based typing of microbial organisms // J Clin Microbiol. 1999. - Vol. 37. P. 1661-1669.

98. Olsen, R.A., Bakken L.R. Viability of soil bacteria: optimization of plate-counting technique and comparison between total counts and plate counts within different size groups // Microb. Ecol. 1987. - Vol. 13. - P. 59-74.

99. On S.L.W. Identification methods for Campylobacters, helicobacters, and related organisms // Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 9. - P. 405.

100. Orlandi R., Gussow D.H., Jones P.T., Winter G. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain-reaction //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 3833-3837.

101. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis // Handbook of Experimental Immunology. Vol. 1. Immunochemistry / Ed. D.M. Weiz. Oxford: Alden Press, 1979. - P. 19-33.

102. Paoli G.C., Chen C.Y., Brewster J.D. Single-chain Fv antibody withspecificity for Listeria monocytogenes // J. Immunol. Methods. 2004. - Vol. 289. -P. 147-155.

103. Paul A., Clark F.E. Soil microbiology and biochemistry. — San Diego: Academic Press, 1988. 329 p.

104. Pedersen J.C., Jacobsen C.S. Fate of Enterobacter cloacae JP120 and Alcaligenes eutrophus AEOl 106 in soil during water stress: effects of culturability and viability // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 1560-1564.

105. Peng G., Wang H., Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E.T., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - Vol. 56. - P. 1263-1271.

106. Ray В., Bhunia A.K. Fundamental Food Microbiology // CRC Press, Boca Raton, Florida, 2008. Vol. 41. - 567 p.

107. Rodriguez Caceres E.A. Improved medium for isolation of Azospirillum spp // Applied and Environmental microbiology. 1982. - Vol. 44. -P. 990-991.

108. Rothballer M., Eckert В., Schmid M., Fekete A., Schloter M., Lehner A., Pollmann S., Hartmann A. Endophytic root colonization of gramineous plants by Herbaspirillum frisingense И FEMS Microbiol Ecol. 2008. - Vol. 66. - P. 85

109. Rovira A.D., Newman E.I., Bowen H.J., Campbell R. Quantitative assessment of the rhizosphere microflora by direct microscopy // Soil Biol. Biochem. 1974. - Vol. 6. - P. 211-216.

110. Sadasivan L., Neyra C.A. Cyst production and brown pigment formation in aging cultures of Azospirillum brasilense ATCC 29145 // J. Bacteriol. -1987.-Vol. 169. — P.1670-1677.

111. Sadasivan L., Neyra C.A. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: exopolysaccharides and cyst formation // J. Bacteriol. — 1985.-Vol. 163.-P. 716-723.

112. Schloter M., Asmus В., Hartmann A. The use of immunological methods to detect and identify bacteria in the environment // Biotechnol. Advances. 1995. - Vol. 13. - P. 75-85.

113. Schloter M., Hartmann A. Production and characterization of strain specific monoclonal antibodies against outer membrane components of Azospirillum brasilense Sp245 // Hybridoma. 1996. - Vol. 15. - P. 225-232.

114. Schmidt, E.L. Quantitative autecological study of microorganisms in soil by immunofluorescence // Soil Sci. 1974. - Vol. 118. - P. 141-149.

115. Sensitive chemoluminescencebased immunological quantification of bacteria in soil extracts with monoclonal antibodies / M. Schloter, W. Bode, A. Hartman and F. Beese II Soil Biol, Biochem. 1992. - Vol. 24. - P. 399-403.

116. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. Approved lists of bacterial names // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. - Vol. 30. - P. 225-420.

117. Skinner F.A., Jones P.C.T., Mollison J.E. A comparison of a direct -and a plate-counting technique for the quantitative estimation of soil microorganisms // J. Gen. Microbiol. 1952. - Vol. 6. P. 261-271.

118. Sly L.I., Stackebrandt E. Description of Skermanella parooensis gen. nov. to accommodate Conglomeromonas largomobilis subsp. Largomobilis to the genus Azospirillum II Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - Vol. 49. - P. 541-544.

119. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. 2000. - Vol. 24. - P. 487-506.

120. Stubner, S. Enumeration of 16S rDNA of Desultomaculum lineage 1 in rice field soil by real-time PCR with SybrGreenTM detection // J. Microbiol. Methods. -2002. Vol. 50. - P. 155-164.

121. Sue D., Fink D., Wiedmann M., Boor K.J. SigmaB-dependent gene induction and expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment // Microbiology-UK. 2004. -Vol. 150.-P. 3843-3855.

122. Suzuki M.T., Taylor L.T., DeLong E.F. Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial populations via 5"-nuclease assays // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 4605-4614.

123. Thirumalapura N.R., Morton R.J., Ramachandran A., Malayer J.R. Lipo-polysaccharide microarrays for the detection of antibodies // J. Immunol. Methods. 2005. - Vol. 298. - P. 73-81.

124. Torsvik V.L., J. Goksoyr. Determination of bacterial DNA in soil // Soil Biol. Biochem. 1978. - Vol. 10. - P. 7-12.

125. Van Weemen B.K., Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigenenzyme conjugates // FEBS Letts. 1971. — Vol. 15. — P. 232-236.

126. Vandenhove H., Merckx R., van Steenbergen M., Vlassak K. Microcalorimetric characterization, physiological stages and survival ability of Azospirillum brasilense I I Soil Biol. Biochem. 1993. - Vol. 25. - P. 513-519.

127. Vernozy-Rozand C., Mazuy-Cruchaudet C., Bavai C., Richard Y. Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food // Lett. Appl. Microbiol. 2004. - Vol. 39. - P. 490-494.

128. Warschkau H., Kiderlen A.F. A monoclonal antibody directed against the murine macrophage surface molecule F4/80 modulates natural immune response to Listeria monocytogenes // J. Immunol. 1999. - Vol. 163. - P. 34093416.

129. Williams D.D., Benedek O., Turnbough Jr. C.L. Species-specific peptide ligands for the detection of Bacillus anthracis spores // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69. - P. 6288-6293.

130. Wu M.H., Guina Т., Brittnacher M., Nguyen H., Eng J., Miller S.I. The Pseudomonas aeruginosa proteome during anaerobic growth // J. Bacteriol. — 2005.-Vol. 187.-P. 8185-8190.

131. Xie C.H., Yokota A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oryza sativa // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2005.-Vol. 55.-P. 1435-1438.

132. Yahalom E., Okon Y., Dovrat A. Azospirillum effects on susceptibilityto Rhizobium nodulation and on nitrogen Fixation of several forage legumes // Can. J. Microbiol. 1987. - Vol. 33. - P. 510-514.

133. Yalow R.S., Berson S.A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man // Clin Invest. 1960. - Vol. 39. - P. 1157-1175.

134. Zamora B.M., Hartung M. Chemiluminescent immunoassay as a microtiter system for the detection of Salmonella antibodies in the meat juice of slaughter pigs // J. Vet. Med. 2002. - Vol. 49. - P. 338-345.

135. Zhao Z.J., Liu X.M. Preparation of monoclonal antibody and development of enzyme-linked immunosorbent assay specific for Escherichia coli 0157 in foods // Biomed. Environ. Sci. 2005. - Vol. 18. - P. 254-259.

Информация о работе

Красов, Александр Игоревич
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Выявление почвенных ассоциативных бактерий рода Azospirillum in Situ с помощью иммуноферментного анализа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы