Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, очистка и характеристика глюкана из базидиального гриба Fomes Fomentarius-Я55

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, очистка и характеристика глюкана из базидиального гриба Fomes Fomentarius-Я55"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.152.2:547.917

АБЫЛАЕВА БАКТЫГУЛЬ АКМАТАЛИЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛНЖЛНЛ ИЗ БАЗИДИАЛЫЮГО ГРИЬЛ 10МЕ8 РОМЕЫГАШУ8~Я55

03.00.23 — Биотехнология

А В Г О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата'биологических наук •

Ташкент — 1998

ргз од

Работа выполнена в лаборатории ферментов микроорганизмов Института микробиологии АН РУз и в лаборатории химии углеводов и растительного белка Института химии растительных веществ АН РУз

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор ДАВРАНОВ К.Д.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор РАХИМОВ М.М. Доктор химических наук ИСАЕВ М.И.

Ведущая организация: Институт Биоорганической химии им. Д.С. Садыкова АН РУз.

Защита состоится 1998 г. в

сс

щцц г. в

часов на заседании Специализированного совета Д.015.02.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Инстигуте микробиологии АН РУз но адресу: 70'0128, Ташкент, ул. А. Кадыри, 76.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь .

Специализированного совета,

доктор биологических наук С. М. ХОДЖИБАЕВА.

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Успехи микробиологической промышленности способствовали созданию нового направления в биотехнологии -промышленного синтеза экзополисахаридов, которые все более широко используются в нефтяной, нефтехимической, химической, пищевой, медицинской и других отраслях промышленности. Резко меняя реологические свойства водных систем в концентрациях от десятых до сотых долей процента, полисахариды могут использоваться в качество загустителей, гелеобразователен, эмульгаторов, стабилизаторов суспензий, поверхностно активных веществ, структурирующих и пленкообразующих агентов, материалов для понижения'трения'и ряда других целей. _

Источниками полисахаридов являются растения, водоросли, микроорганизмы различных таксономических групп,, а-также высшс- гриби - какромицети, которые отличаются высокой продуктивностью синтеза этих биологически активных соединений.

Интерес к макромицетам определяется и тем, что они являются активными деструкторами природных полимеров, благодаря активному синтезу и секреции ряда гидролитических и окислительных Фермен -тов. В лаборатории Ферментов микроорганизмов Института микробиологии АН РУз с 1988 г ведутся исследования по изучению метаболитов базидиалышх грибов, являющихся как известно, активными продуцентами целлюлаз, лигниназ и внеклеточных полисахаридов.'

Данная работа является частью проводимых исследований и посвящена изучению углеводов, синтезируемых некоторыми штаммами оа-зидиальных грибов. В этой связи вопросы изучения повышения продуктивности продуцентов биологически активных веществ и, в частности полисахаридов, -являются весьма актуальными. Одним из подходов в решении этих вопросов является-оптимизация биосинтеза биологически активных веществ, ив частности полисахаридов, и основанная на познании физиологических особенностей продуцентов и закономерностей процессов образования ими целевых компонентов.

Цель и задача исследований.' ¡[елью наотояедк исследований явился подбор- условий оптимизации биосинтеза и секреции природа»/, полисахаридов некоторыми видами базидиальных грибов при их глубинном культивировании и изучение биологической активности валенных полисахаридов для их практического пепо.азошш.

В ссотвчтонш с поставленной целы) были одрвдапега следующие задачи:

- -.4 -

- изумить динамику образования вне- и внутриклеточных полисахаридов некоторыми видами базидиальных грибов;

- изучить количественные соотношения полисахаридов и их моно-'сахаридный состав;

- подбор условий выделения и очистки природных полисахаридов;

т.определить некоторые физико-химические характеристики глюкана, выделенного из фильтрата культуральной жидкости Г. ГошепЬаг1-из; •

- разработать лабораторный регламент получения глюкана. Научная новизна результатов. Изучена динамика образования

вне- и внутриклеточных полисахаридов некоторыми местными'штаммами базидиальных грибов: Рапаэ Ч^г1пиз, Р1еиго1;из ов^ваШБ, Рошез (степгаПиэ и РЬапегосЬаеЪа <Лгузозрог1ит в погруженной среде с различными растительными отходами, содержащими"лигноцеллюлозу.

Фракционированием, синтезированных грибами продуктов выделены водорастворимые.полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллю-лозн. Определен качественный и количественный состав вне- и внутриклеточных полисахаридов:

Впервые 'из культуральной жидкости гриба ?. Готе^аПиз выделен в очищенном состоянии глюкан, изучены его некоторые. физико - химические свойства (ММ=47000 Оа, - удельное вращение Са]Ого +20°). Установлено, что молекула глюкана состоит из остатков 291 .молекул глюкозы, которые соединены между собой (М-З и а-1-6 гликозидными связями.',

Практическая значимость работы. Проведенные нами эксперименты показали, что растительные отходы сельского хозяйства, содержащие разные количества лигноцеллюлозы, активно утилизируются де-реворазрушающими базидиальными грибами образуя биологически ценные углеводы и другие вещества,

Высокое содержание белков, углеводов'в культуральной ареде и обогащение использованных субстратов биологически ценными про-, дуктами, а -таювд образование плодовых, тел размерами около 0,2 -4,0 см позволяет /использовать, обработанные, указанным способом растительные отходы для кормления животных. Разработанные схемы Бнделения полисахаридов могут быть использованы для их препаративного вылеления к к'омплекскрП- переработки метаболитов грибов. К?, сспе&е водорастворимых полисахаридов базшшоюшгов могут быть еогеаан гг,-?пэра?к медицинского назначения. Куяьтурзльная жидкость гг;^д Готл- . у.о:-"?'г -попользована р качестве источ-

ншса глюкана;

Разработан лабораторный регламент на производство 'глюкаиа гриба F. fomentarius УзБИ-Я55.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII Международном Конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, ' Израиль. 1996), II Международной Симпозиуме rio химии природных соединений (Ескишехир, Турция. 1996), III- конференции биохимиков Узбекистана-(Ташкент, 1996).' I- конференции молодых ученых, посвященной памяти академика_ С. К). Юнусова (Ташкент, 1997), на международной конференции " Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы в- организме" (Андижан, 1997), I- съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 1997) и Международной конференции "Некоторые проблемы химии и физики полисахаридов (целлюлоза, хитин, пектин)" (Ташкент, 193.7).'

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. *

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения.

Работа изложена на 111 страницах машинописного текста и включает 9 рисунков, 8 таблиц и 2 схемы.

Благодарность. Планирование ' и проведение значительной части экспериментов, а также обсуждение полученных результатов осуществлялось при непосредственном участии и руководстве д.х.н, проф.Рахимова Д. А. и с.н. с. .к. б.н. Ахмедовой З.Р. с которыми автор разделяет полученные совместные результаты и- выражает им благодарность.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОБЪЕКТА Н МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве объектов исследования-были использованы грибы-ба-' зидиомицеты, выделенные из- гниющих растительных отходов и отмерших частей некоторых (яблоня, тополь) деревьев: •Panus tIgrinus - штамм УзБИ-И13, Pleuro'tus ostreatus-штамм УзБИ~И105,; Femes fomentarl-' us-штамм У'зБй - Я55, а также Phanarecliaeta chrysosporiura. полученный из Всесоюзного музея промншленно .важных культур ИБШ РАН (г. Пущнно).

В лабораторных условиях грибы со скошенной твердей .среди (сусло-агара) высевались в предварительно простерндизоьанедй питательную среду, содержащую 3 % пивного оусда и 1.0 Л обедишыо »ома из шрота ссмян хлопчатника (фракция после экстрагирования белков из шрота), стеблей хлопчатника к рисовой лузги, ттльнсн ■ пых до частиц размером .0,i -0,3 мм.на шаровой мельнице.

-.6 - .

Культивирование проводили глубинным способом при температуре 28-30° С в колбах Эрлениейера объемом 500 мл с 200 мл питательной среды, рН 6,5 в течение 21 суток на круговых' качалках со скоростью вращения 250 об/мин. По окончании культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости (К;К) фильтрованием на воронке Бюхнера под вакуумом. Мицелий тщательно промывали дистиллированной водой.- Биомассу растирали квартовым песком до полного разрушения .гиф мицелия. Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин.ирл ВООО об/мин. Отделяли надосадочную жидкость (НОЖ) от гомогената.

Общее содержание углеводов определяли фенол-сернокислым методом .(Dubois,' et al.,1956).

Содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry, et ■ .•¡., 1951).

Выделение полисахаридов. Для изучения компонентного состава полисахаридов, • был использован метод последовательной экстракции вне- и внутриклеточных углеводов, в результате чего были получены полисахаридные фракции: водорастворимый полисахарид (ВРПС), пектиновые вещества (DB) и гемицеллюлозы (Г'МЦ).

Водорастворимые полисахариды получади из концентрированной культуральной жидкости и надосадочной жидкости гомогената мицелия грибов, используя осаждение этанолом.

Пектиновые вещества получали из гомогената мицелия, путем двухкратного экстрагирования в смеси 0,5 %-ных растворов оксалата аммония и щавелевой кислоты (1:1) в течение 3 часов .при 70" с.

Гемицелпюлозы получали экстрагированием осадка гомогената 10 %-ным раствором КОН в течение 24 ч., последующей-нейтрализацией 00 й-ной СН3С00Н и наконец диализом полученного раствора.

Изучение Физико-химических свойств'. Для определения мбноеа-харидного состава полисахаридов фракции гидролизовали и анализировали методом бумажной (БХ) и газожидкостной хроматографии(ГЖ).

Бумажную хроматографию (БХ) проводили на бумаге Flitгак FN-1,3 и 11, использованием системы растворителей бутанол-1-пиридин-вода (6:4:3, по объему). , • / -..•

Газожидкостную'хроматографию *Г)Ш гидролизатов проводили на хроматографе Chrom-5 (Чехия) с переводом углеводов в соответствующие ацетаты альдононнтрилсш. Колонка размером 3 мм х 2,5 м, заполняла«. сорбентом, содержащим 5% ХЕ-60 на хроматоне N-AW-DMCS 0,160-0,200 мм. ГАзом-носителем являлся - азот, скорость тока ко-• торого .составлял^ 60 кл/тн. температура колонок 210° с.

ПК-спектры снимали на Ш-Фурье-спектрометре, модель 8000, Фирмы PERKIU-ELMER. Число сканириваний-100.

.Спектры—-С-ШР снимали1 на приборе "NMR-UNITY +400" (Япония) с 'рабочей частотой по ядрам углерода 15,08 МГц с полным подавлением по протонам. Готовили 1 % нне растворы глюкана в D¡,0. Б качестве внутреннего эталона использовали метанол, химический сдвиг сигнала которого относительно ТМС принимают равным 50,1.5 м. д.

Молекулярную массу глюкана определяли методом седиментации (Степаненко, 1978). • •

Удельное вращение водных растворов полисахаридов измеряли на поляриметре Цейсеа, в трубке длиной 1 дм, объемом 10 мл; при 20-30° С. .

Вязкость полисахаридов определяли вискозиметром Освальда диаметр капилляра которого составлял 0,73 мм.

Полный кислотный-гидролиз полисахаридов проводили с 2 н. H2S04 в течение 7 - 12 ч. при 95° С на кипящей водяной бане.

Содержание азота определяли но методу Дюма (Нидрель, 1949).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Отбор питательных сред для культивирования базидиальных грибов

Анализ исследований Ферментных систем баэидиомицетов свидетельствует о наличии в них ферментов, обладавших способностью разлагать нативнке полисахарида, лито« и другие биополимеры, благодаря чему базидиальные грибы играют.огромную роль в биодеградации различных лигноцеллюлозных отходов в природе и могут быть широко использованы для решения различных биотехнологических задач.

Культивирование активных базидиальных грибов '-.'проводили на средах, содержащих различные растительные отходи. Среда с обедненным жомом из шрота семян хлопчатника оказалась полноценным источником питательных компонентов, необходимых для роста и развития грибов: Р.tlgririus, Р. cstreatus и F. fomentarlus. Гриб Р. ostreatu.s имел активный рост на всех изученных средах, в то время, ■ как рост гриба Р. tlgrinus - проходил эффективнее нй сре;;? с обедненном жомом из семян хлопчатника. И наконец, гриб F. fer,enteritis проявлял активный рост на срелаг с обедненным комом из шрота семян хлопчатника и рксовзК лузгой. Определенный интерес для последующих исследований, предогааляло изучение способности

указанных грибов разлагать нативные лигноцеллюлозные растительные отходы. В таблицеЛ приведен химический состав растительных отходов до и после культивирования грибов. Данные таблицы показывают, что целлюлоза и гемицеллюлоза претерпевают наибольшую деструкцию грибом Р. оз^еаШэ, в то время как лигнин - грибами Р. ЩтШиз и р. озЪгеаШз. Активная деструкция биополимеров наблюдается, в основном.' в течение 10 суток, далее действие грибов замедляется.

Таблица 1

Динамика изменения химического состава растительных отходов в процессе культивирования некоторых базидиальных грибов

Культуры грибов

Содержание биополимеров, %

Среда

---—--,-_1--

Целлюлоза IГемицеллюлоза | Лигнин

___1, ,, _I_

Дни культивирования гриба

-1-)--1--1--1-1--1--г--1---

I 10 | 20 | 30 I 30 I 20 | 30 I 10 | 20 | 30

—Ч-1--1-1--1--1-1-1-1—

I |32,2 27,1 17.2118,3 15,4 9.2 (23,7 18,5 16,4 II 130,4. 23,4 19,1120,5 17,2-12, Ц20,2 17,2 14,3 III 121,7 16,6 14,7|12,2 9,3 8,'7 115. 4 14,3 13,3 I 122,4 17,3 13,8110,4 9.7 -8..0 122,3 18,7 13,4 И 120.3 16,3 14,4120,9 10,2 7,3 ¡19.2 18,7 13,4 III 120,4 13,4 12, 2116,2 10, 7-8,4- 117, 2 16,4 14,7 I |23,5 19,2 16,1120,3'10,9 8,7 125.3 23,2 20,1 II |21,2 15; 3 13, 2) 20, 9 16,3 14,7|22,4 21,6 19.5 III 119.0 17,0 11,811.4,1 10,7 8,3 (20.6 19,7 18,8

I Р. НеП-1 пиэ I

|Р.оз1геа-I

•I

|Г. Готел-I £аг1из

Примечание: Исходный химический состав субстратов в {%); Целлюлоза. гемицеллюлоза и лигнин - I --обедненный жом шрота семян хлопчатника (41,5:26.4:28,0): II . - стебли хлопчатника (38,3:28.9:25.5);.- III - рисовая.лузга (29,0:18.1:22,3).

Изучение степени биоконверсии ли гноцел.® лозных отходов гри-оами поюзйло. что в промессе роста на растительных отходах про-»¡гхзлкт лгстгукяия субстратов в казней степени. Деструкционная сноссС'Иосгь грибов была различней и зависела г>т природа исг.ользу-суОстгагоз. а такте ст ь^емг-й« их кулкшзарг-г'зчая.

Следует отметить, что в процессе культивирования грибов во всех исследованных средах било обнаружено уменьшение эеличнн pH культуральной среды от 5,6-6.0 до 2,3-1,5. По-видимому, это связано с активностью лигниназ, синтезируемых грибами, а также образованием органических кислот, в частности, фенолкарбоновых кислот и феноксиуксусной кислоты в процессе роста и развития грибов.

При выращивании грибов на растительных отходах происходит расщепление полисахаридов до moho-, ди- и олигосахаридов, что приводит, в конце концов, ' к индукции биосинтеза соответствующих ферментов. Таким образом, в результате проведенных исследований показано активное участие изученных грибов в разрушении лигноцел-люлозных отходов.

3.1. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ ВНЕ- И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ УГЛЕВОДОВ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ГРИБОВ

В последние гады особое внимание уделяется микробному биосинтезу полисахаридов и широко изучаются условия биодеградации лигноцеллюлозных отходов с целью получения биологически активных веществ, и в частности углеводов.

Показана сиосинтетическая способность базидиомицетов к образованию углеводов на средах, содержащих различные растительные отходы: в виде обедненного жома из шрота семян хлопчатника (I), стеблей хлопчатника (II) и рисовой лузги (III). '

В результате проведенных исследований было показано, что как в культуральной жидкости, так и в бесклеточном гомогенате грибов общее содержание углеводов составляет от 26,5 до 41,4 мг/мл. По данным БХ и ГЖХ углеводы" состоят из moho-, олиго- и полисахаридов." По способности к биосинтезу углеводов,' грибы, можно расположить следующим образом (в порядке убывания'их Способности к биосинтезу): P. tigrinus > Р.. ostreatus > F. fornentorius > Ph. сПгузозро-rlum. . ■

Изучение динамики образования углеводов показало, что культура гриба P. tigrinus (А) выращенная на среде, содержащей, жом хлопчатника, способна накапливать в культуральной жидкости значительные количества суммарных углеводов на 6-е .(до 21,5 мг/м/;), ■ а во внутриклеточном гомогенате на 12-е сутки (до 27,0 мг/гь Максимальное же накопление углеводов культурой гриба Р. oséame. (Б) било следующим : по внеклеточном гомогенате на' i^-e -глки -26,6 мг/мл, а во внутрдклеточвом гомогенате. на ?.i-è oytau -av.-i

мг/мл. . Иные количественные показатели накопления углеводов были получены при испытании.культуры гриба Р. ■ГотегПаг1иэ (В). В зтом случае наблюдается постепенное увеличение концентрации (до 17,5 мг/мл) углеводов в культуральной жидкости с максимумом накопления на 12-е сутки роста. Наибольшее накопление углеводов во внутриклеточном гомогенате выше названного гриба обнаружено на 9-е (20,0 мг/мл) сутки роста продуцента.

Для известного дереворазрушающего базидиального гриба РЬ. с^гуБоврогШт (Г) способность к образованию углеводов проявляется в более поздние сроки культивирования: во внеклеточном гомогенате - на 15-е и 18-е (12,0 мг/мл) сутки, культивирования, а во внутриклеточном гомогенате - наблюдается постоянная концентрация углеводов с максимумом на 12-е' (26,0 мг/мл) сутки роста (рис.1).

При изучении накопления углёводов исследуемыми ' грибами на среде с хлопковыми стеблями было обнаружено,' что происходит параллельное накопление углеводов' как в культуральной' жидкости, так и в мицелии грибов, однако, при этом происходит смещение времени максимального накопления углеводов. Так. например, максимальное накопление углеводов грибом Р. ЩПпиэ происходит на 12.-е (19,8 мг/мл) сутки культивирования. У грибов Р. оэ^еаШэ и Г. {отегиа-г1из, максимальное накопление углеводов происходит соответственно на 15-е' (41,4 мг/мл) к на 12-е (18,2 мг/мл) сутки культивирования. У гриба РП. сЬгуэозрогШш на этой среде резко увеличивается содержание углеводов в культуральной среде на 9-е сутки (20.0 мг/мл), а во внутриклеточном гомогенате максимальное накопление углеводов наблюдается на 12-е (21.0 мг/мл) сутки культивирования.

Аналогично была изучена и динамика образования углеводов . на среде содержащей рисовую лузгу. У грибов Р. иеПпиви Р11. сЬгу-Бозрог1ит наибольшее накопление углеводов наблюдается в культуральной среде на 12-е (21,0-18,0 мг/мл) сутки, а во внутриклеточном гомогенате на 9-е (22,5-11,7 мг/мл) л 18-е _ сутки соответственно. У грибов Р. оэСгеаШз и Т. Гошеп^аПаз максимальное накопление углеводов в культуральной среде' происходит на 18-е и 15-е сутки (26.5-21,0 мг/мл), а во внутриклеточном гомогенате на 21-е (23,8 мг/мл) и на 12-е (26,0 мг/мл) сутки культивирования.

Таким-образом, растительные отходы сельского хозяйства, содержащие разные',, количества лигноцеллюлозы активно утилизируются • перечисленными выше грйбами, способными синтезировать достаточное количество как. внеклеточных, так,и внутриклеточных углеводов. ■

мг/мл

£ X

к о в

К

с

¡3 »

о

и

л ■

в.

\о

о

я? *

Б

г

5

О 3 6 9 12 15 18 21

Время культивирования, сутки

0 3 6 9 12 15 18 21

Время культивирования, сутки

мг/мл

В

мг/мл

О 3 6 9 12 15 18 21

Время культивирования, сутки

0 3 6 9 12 15 18 21

Время культивирования, сутки

Рис 1. Динамика образования углеводов на среде с жомом шрота из семян хлопчатника: А—Р. идппиг, Б — Р. ОБНеаЦ«, В — И. 1отеп1апи5, Г—РЬ. сЬгу$о5рогшт. I — НКЛ, 1 — ВКЛ.

3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ И ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Углеводные компоненты полисахаридов выделяли по схеме I.

Схема 1

Схема выделения полисахаридов Культура гриба I Фильтрование г-------,

Биомасса

I 1. Промывание | 2. Гомогенизация • I 3. Центрифугирование

Культуральная жидкость '

I Осаждение I этайолом I (1:4) ■

I-:—

Надосадочная жидкость I Осаждение I этанолом ' 1(1:4).

I--

ВРПС-2

Гомогенат Ю.5Я I растворы

|НгСг04 и (Ш4)гСг04

1(1:1). при 70" С |---,

г

ВРШЫ

Маточный раствор

Маточный раствор

"Кислый" раствор

I Осаждение . | этанолом ПВ (1:4)

Осадок |10% КОН

-1

Остаток

Щелочная экстракция

(нейтрализация |СН3СООН

I центрифугирование ГМЦ-А I 1.Диализ

• ( 2.Осаждение

I дтанслом (1:4) ГМЦ-Б

По окончании-роста культуры, мицелий гриба отделяли от куль-туральной жидкости и гомогенизировали в'ступке с кварцевым песком. Для изучения компонентного состава вне- и.внутриклеточных углеводов были выделены полисахариднке Фракции: водорастворимый полисахарид (ВРПС). пектиновые веществ?. (ИВ) и гемицеллюлозы (ГЯЦ.А '

Дпя определения компонвнтнс'г; состава каглся из полученных

фракций полисахаридов подвергалась полному кислотному гидролизу и анализировалась методом бумажной (БХ) и газожидкостной хроматографией (ГНК). • , .

Было установлено, что компонентный состав образуемых углеводов состоит из moho-, олиго- и полисахаридов.,, а также 'уроновых кислот и включает в себя, в основном, глюкозу, ксилозу, галактозу. арабинозу, маннозу, рамнозу и галактуроновую кислоту (рис. 2)

Рис. 2. 'Бумажная хроматография углеводных фракций, накапливаемых грибами F. fomentarlus (а) на среде с жомом, и P.. tlgrlnus (б) •на среде со стеблями хлопчатника. I-ВРПС из KI, П-ЙРПС из гомо-гената мицелия, Ш-ПВ. СВ-свидетели: l-уроновые кислоты, 2-оли-госахаридн, 3-галактоза. 4-глюкоза, 5-арабиноза. 6-ксилоза, 7-рам-. ноза, IV-ГМЦА, V-ГМЦБ.

Количественное содержание этих углеводов, (в .55), а также кх качественный моносахаридный состав приведены в таблице. 2 и 3.

В культуральной жидкости (полученной ка среде с обедненном жомом из шрота семян хлопчатника) содержание ВРПС составляет 0,47-1,67 % ВРПС представляет собой порошки кремсэо-яелгсго use-

- ь: -

та, хорошо растворимые в воле. Основным продуктом гидролиза, полисахаридов, полученным из культуральной жидкости грибов Panus.tig-rliius, Pleurotus ostreatus, Fom.es fomentarlus -является глюкоза.

Таблица 2

Компонентный состав полисахаридов, полученных .культивированием

грибов на среде с жомом шрота семян хлопчатника. (---------1-;--—|-;-■-—-;-—

Источник ■Тип по- Содержание Сахаров, %

Грибы полиса- лисаха-

i i 1 ' i

харидов ридов Rham 1 Ara i Xyl i i Man | г G le I . 1 Gal

Р.tlgri- КЖ * БРПС - / 1.4 1,9 1'. '1 95,0 -

i1us НОЖ . ВРПС 1,9 5,7 5,9 16,7 69,'8

ПВ сл 5,1 8,2 •' 5,6 81,1 сл

f . ГМЦА . - сл. ■ 28.1 • сл 71, 9 -

ГМЦБ 4, i 72,8 3,4 ' ,19|7 . -

P. ostre- КЖ ' ■ БРПС - . 3,0 2.2 .15,2 .79; 6 -

atus * нож . ВРПС • 2,4 ■ 1,7 2.1 5,1 88,7 сл

ПВ сл •1.2 1,8 5,7 91,3 '• -

' ГМЦА 1.9 , 0..8 33,6 8,0 55,7

ГМЦБ сл > сл 10,-4 18,7 60,5 -

F. fomen- . КЖ ВРПС 3,9 4,1 12,3 11,7 68; 0 -

tarlus . нож ВРПС 2,7; 4.9 6,2. 16,0 70,2 -

ПВ , сл • СЛ 11,9 58,4 11,9 17,8

ГМЦА ' 51,0 28.6 сл 20,4 -

ГМЦБ 5,5 10,9' - 83,6 СЛ

Pli. chry- КЖ ВРПС 5,2 '10,4 22,5 37,9 12.0 12,0

sospori- нож ВРПС сл 7,7 7,7 7,2 59,0 . 18,4

um ПВ 3,2 3,2 3.2 . 3,2 87,2 - .

ГМЦА 32,3 СЛ ■54, 1 сл 13,6 -

- ГМЦБ 25, 04,0 42,0 й 4,0 -■ . 25,0

.... й ¡_ I _I__1___I .

Примечание: "сл"-следы; "-"-отсутствует

Галактоза же является преобладающей в полисахаридах грибов Р. оз1гаКиз и Рл. с1)гуео5рог1ит, выращенных на среде со стеблями .хлопчатника. В гидролизэтах НОН. пЪлученных из всех видов грибов, также преобладает гшсоза. .На среде со стеблями хлопчатника в-продуктах- гидролиза полисахарида 'из НОЯ у грибов Г. Иёг1ппз и К. ,

1"ошепиг1из обнаружена в основном глюкоза, Рч оэиеаЦ^ - рамноза и глюкоза. РЬ. сЬгузозрогШп - галактоза и манноза. ■ .

ГШ преобладают по содержанию на среде с жомом хлопчатника. В продуктах гидролиза ПВ методом ГЖХ- обнаружены рамноза. арабиноза, ксилоза, манноза, глюкоза и галактоза в различных соотношениях. Галактуроноаая кислота идентифицирована методом БХ.

...... .Таблица 3

Компонентный состав полисахаридов, полученных культивированием грибов на среде содержащей стебли хлопчатника.

1 I Грибы ■ Источник полисахаридов 1 Тип по-1 лисаха-| о рилов | 1 Содержание Сахаров . п м Ь /о 1

Штат ' 1 1 Ага | I 1 1 Ху1 1 1 1 Мап I 1 ... ... ( С1с | I Са1 -1

|Р. И£г1- ■ ЮК • ВРПС | - 2,7 2,3 95, 0 |

1 пиэ НОЖ ВРПС | 11.6 12.7 1, з 6,8 67,6 - |

ПВ | 17, 1' 11,6 11,6 . 6, 1 18,5 31, 71

ГМЦА | - 15.4 ' 8,1 5,5 71,0 ' - |

ГМЦБ | 1.0 - 97,0 1,0 "1.0 : - |

|Р: об^е- кж ВРПС | 6.1 9.2 15,8 - 24.4 44.5|

I аШэ НОЖ ВРПС 1 .45,6 4.3 8,7 - 31,5 9.9|

ПВ | 6.9 7.5 12,8 - 67, 0 5.81

ГМЦА | - сл 98, 3 - 1.7 - 1

ГМЦБ- | - 1, 0 98,0 - 1.0|

|Г. Гогаеп- кж ВРПС 1 - - - 1,3 .98,7 - |

иаг1из нож ВРПС | - - 8.5 84,4 . 7,1|

ПВ ' ' | 46.8 10, 4 10,4 . 22, 0 10,4}

ГМ1$ ■' | 3.7 48.8. 7.9 39,6

ГМЦБ . .| 1,8 -' ,68,4 1,8 28,0

|РЬ.сИгу- кж ВРПС 14,0 9,3 10.6 ' 4. 1 . 3,0 59,0|

1эозро- нож . ВРПС | 2.7 6, 1 сл 27,8 16,2 47,2|

|г!иш ПВ | сл 10,9 24,3 33,6 26.21

ГМЦА | - 35.1 26,2 36.3 , 2,11

1 ...... ГМЦБ | .. ..1 - - ':- ' 47,6 52, 4 1

Примечание: "сл"-следы; "-"-отсутствует •

гмц представляют ообой порошки темко-коричневсго цвета, хорошо растворимые в щелоки. Водные растворы ГМЦ не дает в йодом

реакции на крахмал. Содержание ГМЦ на среде с жомом хлопчатника также оставалось высоким. Среди моносахаридов ГМЦ-А на среде с жомом хлопчатника преобладающими компонентами являются глюкоза и рамноза. в то время как на среде со стеблями хлопчатника преобладают ксилоза и глюкоза. .

Таким образом, разработана схема получения различных фракций полисахаридов, отдельные фракции получены в очищенном состоянии и изучен их компонентный состав.

4. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ.

4.1. Выделение и очистка глюкана.

При глубинном культивировании гриб Fomes fomentarlus, (штамм УзБИ-Я55) на бреде со стеблями хлопчатника синтезирует и секрети-рует в окружающую среду 'Достаточно большое количество углеводов, основным компонентом синтеза которых является глюкан.

В связи с чем, нами была поставлена задача связанная с получением этого компонента в высокоочищенном состоянии и подробное изучение его физико-химических и биологических свойств. В таблице 4. показаны этапы очистки глюкана. По окончании выращивания, биомассу гриба отделяли от культуральной жидкости фильтрованием и из фильтрата культуральной жидкости углеводы далее отделяли'от белка осаждением используя для этих целей 10%-ный раствор ТХУ. Углеводы же в свою очередь, осаждали четырьмя объемами этанола.

Глюкан, полученный таким образом, представлял собой белый с кремово - желтоватым оттенком аморфный порошок, легко растворимый в воде, оптически активный и не растворим в метиловом и этиловом спиртах.

Гомогенность глюкана доказана методом Е'Х в системе растворителей бутанол-1-пиридин-вода (6:4:3) и результатами ультрацентри-фугированля на приборе MOM 3170,В кислотном гидролизате гомогенного глюкана методами БХ и :Ш обнаружена лишь глюкоза (рис.3).'. .

Молекулярная масса гомогенного глюкана определенная седимен-тационным методом, составляет 47000 Д. Молекула глюкана состоит из 291 рлюкозных моноиерных единиц. Вязкость его раствора ц0Т11 -■1,1 (с 1,0; вода),

Глюкан имеет' нап.ожителыгое значение удельного вращения {аЗсй04 2Ов (1, 0; .вода'), что говорит о преобладании а-связей в мо-

ленуле полимера. Полисахарид дает отрицательную реакцию с йодом, что свидетельствует об отсутствии глюканов типа крахмала.

Таблица 4

ОЧИСТКА а-ГЛЮКАНА ГРИБА Г. ГОМШАЯНК УЗБИ-Я55

Г Этапы очистки 1 1 Суммарный 1 '- 1 (Количество 1 1 |Количес- ь 1 1 1

: белок,мг % I общих угле-1 % | во глю- 1 % 1

1 водов,мг/мл| 1 { |кана, мг 1 1 , 1 I |

11 Исходный КЖ . , 12500 100 26,5 100 8,7 100 I

1 Концентрирование 11600 92.8 23,2 87,5 8,4 96,51

!3 Отделение■от

белка осаждением 9300 74.'4. '3,1 • ' 11.6 1.5 17,21

ТХУ (10%)

14. Осаждение этанолом (1:4) • 0,400 0, 0032 ; 19.5 73,5 7,3 83. 91

15 Хроматография на колонке с сефа-розой 2 В.

Фракция-1 0, 150 0,0012 8.5 32,0 5, 1 58,6|

Фракция;II ■ 0, 12 0,0009 . 6.2 23,3 1,5 17,2!

1 Фракция-1II 0,05 0, 0004 4.6 17, 3 0,5 5,7 |

Примечания: Условия элюции: 0,1 МИа-ацетатный буфер, рН-6,5-7,0, колонка . размером 5x70 см, скорость элюции 24 мл/час, объем фракций 3 мл.

мии.гь 20

15

1С

'Рис.3. Газожидксстная хроматография глюкана" в Форме аце-. татов гльдононктрилоБ. Колонка 3 мм х 2,5 м заполнена сорбентом, содержащим 5 % ХЕ - 60 на хромгтоке -М-АИ-ОМСЗ размером частиц 0,160 - 0ч, 200 мм. Газ носитель - азот, скорость тока газа носителя- 60 мл'мш;; Температура колонок 2,0° с.

Наиболее изученные полисахариды выделенные из бактерий, гри-Сои, животных, водорослей, высших и низших растений и других источников, различаются между собой по физико-химическим свойствам 1! структуре (табл.5).

• Таблица 5

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛКЖАНОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

i ' Источник 1 глюкана • l Мол. | масса | i .....г СП | 1 i [а} град. Тип связи 1 1 1 Биологические | ¡свойства глюкана | 1 I

1Agr¿bacterium 3600 22. -10 Р-1,3, 1,6 противоопухолевый|

I Lurnefaciens (Putnam et al., , |

1 (бактериальный) 1Э61) |

1 Mycobacterium 4, 9X10 + 165 а-1.2 иммуностимулирую-I

1 tuberculosis щий (Slebert et |

1(бактериальный) al., 1949) 1

I Panax ginseng гипогликемическийI

|Панак.сан - A 14000 86 + 187. а-1,6, 1.3 (Tomoda et al., |

!(растительный) 1984) |

I Angelica acutl- 135000 833 - а-1.4. 1.6 иммунологпчески 1

I lota AR-глюкан активный (Yarnada I

! (растительный) et al., 1984) 1

iLentlnus edocies 950000, + 19,9 р-1,3 ингибирует рост I

ll.sntinaii .105000 + 21. 5 мышиной саркомы 1

I(грибной) * ' 180(твердый тип),I

полное рассасыва |

.ние опухоли (Hamul

го et. al., 1970)1

jFomes fomenta- 47000 291 +2.0 Р-1.3, а-1,6 антитоксический, 1

Irius- Я55 (Абылаева. ,и др.. |

!(грибной) u _______________________ • о 1997) | 1

Б ЛК-спекгре глюкана обнаружены полосы поглощения при длине волн 1050. 1100. 1350, 1460. 1650, 2900,-3600 см"1.

Строение глюкана изучали методом 13С-ЯМР спектроскопии, который показал, чго в !ЭС-Я.МР спектре обнаруживаются химические характерны? • для углеродных атомов В-глюкозы, связанные ообои р-\\->-3). а-(1-0) гликозндными связями (рис.4).

. - го -

В лаборатории отдела фармакологии ИХРВ под руководством д.м.н. Вахабова А. А. была изучена фармакологическое действие глю-капа.

Острая токсичность препарата изучена с опытах на белых мышах с целью определения переносимых, токсических и летальных доз и выявления причины гибели животных.

Опыты проводили на 40 белых мни'ах обоего пола, массой 20-23 г, при однократном подкожном и внутрибрюшинном введении в максимально допустимом объеме (1 мл) и -в концентрациях препарата 5-10%, что соответствовало, дозе 2000 и 4000 мг/кг.'

Каждую из' названных ¡выше доз испытывали на 10 белых.мышах. Результаты проведенных опытов показали, что при суточном наблюдении за мышами особых изменений в поведении животных равно как и гибели не было'обнаружено.

Проведенные таким образом, результаты позволяют, считать достаточно обоснованным представление о том, что глюкан относится к малотоксичним соединениям и дальнейшее изучение его биологичесг кой активности представляет собой несомненный интерес. •

выводы

1. Изучена динамика образования вне- и внутриклеточных полисахаридов некоторыми местными штаммами базидиальных грибов: Р. ИЕгтиз. Р. оз^еаШэ. Г.. Готегиаг1из и РЬ. с1чгуаозрог:шт, в погруженной среде с различными растительными отходами, содержащими лигноцеллюлозу. •

2. Определено количественное соотношение синтезируемых и сек-ретируемых полисахаридов: водорастворимых полисахаридов,, пектиновых веществ и .гемпцеллюлозы в динамике роста и развития вышеуказанных грибов. Подобраны условия для их выделения, фракционирования и очистки, .определен их моносахаридный состав. Показано, что основными компонентами полисахаридов являются глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, манноза, арабиноза и галактуроновая кислота.

3. Из культуральной жидкости гриба' Р. ГотегидгШз УзБИ-Я55 выращенного на среде со стеблями хлопчатника, выделен глюкан с молекулярной массой 47000 Л, ' состоящий из 291 остатков глюкозы; соединенных между собой. (Ы1-3)- и а-(1-6) гликозидными связями.

4. Разработан регламент выделения и очистка грибного глюкана из гриба Р. {'ргазпСаПиа УзБ'И'-Я55.

5. Установлено, ч'Го счпценниу' глюкан представляет собой мало-

токсичное соединение и при подкожном и внутрибрюшинном введении

мышам, обладает антитоксической активностью в дозе 4000 иг/кг.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ДИССЕРТАЦИИ РАБОТЫ:

1.Абылаева Б. А., Рахимов Д.А., Ахмедова З.Р, "Биоконверсия растительных отходов базидиальными грибами. Образование углеводов". //Тезисы докладов Первой конференции молодых ученых, посвященной памяти академика С.Ю.Юнусова. Химия природ, соединений. 1997, Спец. выпуск, с. 13-15. •

2. Абылаева Б. А... Рахимов Д. А. .Ахмедова 3. Р., Давранов К.Д. "Углеводный состав препаратов, грибного происхождения"// Химия природ. соединений, 1997, М 3, с. 352-357.

3.Абылаева Б.А.,Ахмедова 3.Г., Рахимов Д.А.,Давранов К.Д. "Изучение углеводных.фракций образуемых некоторыми базидиальными грибами". //Узб. биол. журнал, "1998, N '3, с. . . .

i.Abylaeva В. А.. Akhmedova Z.R., Fakhlmov D. А.. Davranov К. D. "Biosynthesis-of carbohydrates by basldlojnycetes". //8 th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology division 8 th international Congress of'Mycology division,' Jerusalem, Israel, August, 1996.

5.Abylaeva B. A. , Akhmedova Z. R.. Rakhimov D. A.. Davranov K. D. "Biosynthesis of carbohydrates by wood degrading basldiomycetes".// Second international Symposium on the Chemistry of natural compounds (SCNC). Esklshehir-Turkey, Octomber. 1996, p. 173.-.

6. Абылаева Б. A., Ахмедова 3. P.. Рахимов Д. А. /Давранов К. Д.' "Компонентный состав углеводов базидиальных грибов".// Тезисы докладов 3-конференции биохимиков Узбекистана. Ташкент, 1996,•с.146.

7. Ахмедова 3. Р.; Абылаева Б. А. .Давранов К. Д.. "Изучение фракционного состава углеводов базидиальных' грибов",//Тезисы докладов международного форума "Влияние физико-хиимических "факторов на метаболические процессы в организме". Андижан, 19Э7, с. 75.

8.Абылаева Б. А.,Ахмедова 3.Р.,Рахимов Д. А. /Давранов К. Д. "Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств грибного глю-кана из F. fomentarius УзЕИ-Я55".// Тезисы Докладов 1-Сьезд микробиологов Узбекистана, Таодсекг. с. 107. - ■ , '

9. Ахмедова 3. Р.,Абылаева Б.А. "Утилизация рзетитёлькьж отходов базидиальными грибами".// Тезисы докладов Международной конференции "Некоторые проблемы химии и физики полисахаридов (целлюлоза, хитин, пектин)". Ташкент, 1SJ7. с.33.

- 22 -

Абылаева Бактыгул Акматалиевна Котеэ ГотепЬаг1из Я-55 замбуруги глюкашши ажратиб олиш, ва унинг тавсмфи

.Махаллий шароитда ажратиб олинган баъзи бир базидиал замбу-рутларининг яъни: Р. Щгпшз, ' Р. ози-еатэ, Г. Готегиагшз ва РЬ. сЬузоБрогШп нкнг таркибида лигноцеллюдоза тутувчи усимлик црлдвдяари сакдовчи муздатда устирилгаида, >;ужайра ичида *осил бу-лувчи ва хужайра ташкдрисига чщарилувчи ва к^ид моддаси х,амда полисахаридларнинг сифат ва шждор узгаришлари батафсил урганил-гак. Замбуруглар усиш ва ривожланиш даврида х<осил килган канд. сувда эрувчан'полисахаридлар. пектин моддалари ва гемицеллюлоза-нин мик,дорий узгаришлари, уларки бнр-бирларига нисбати урганилдя х,амда уларни ажратиб олиш. тозалаш шароитлари. таркибий. кисмлари ашиушди. Ка'нд ва полисахаридларнинг асосий таркиби глюкоза, ксилоза, галактоза, арабиноза, манноза, рамноза ва галактурон кислоталаридан иборат эканлиги аникланди.

Илк бср Г. Гогае1ПаПиз-Я55 замбуругининг культурал суюклиги-дан соф холда глюкан ажратиб олинди ва унинг баъзи бирфизик-ки-мевий хусусиятлари (молекуляр массаси 47000 Д. 1а]о2О+20°) урга-нилди. Ажратиб олинган глюкан 291 глюкоза молекуласидан таркиб топган булиб, улар узаро ($-(1-3) ва а-(1-С)-глюкозид боглари ор-кали богланганлигн исботланган. Тозаланган гдюканни ок, сичк,онлар-нинг териси остига ва корнига 4000 мг/'кг мивдорида юборилганда антитоксик фаоликка эга эканлиги кузатилди.

Abylaeva Baktygul Akraatalievna Isolation, purification and characterization of glucan from Fomes fomentarius-Ya55 fungi

The dynamics of extra - and Intracellular polysaccharides formation by some of "local basidium fungi in the medium, containing different plants' wastes and 1lgnocellulose was stadled. ■

It was determined the quantitative ratio of synthesized polysaccharides: watersoluble, pectlnic substances, foemicellulose in the dynamics of the growth and development of the culture. The says of polysaccharides purification and isolation as welT'as •heir cci.-.ponents„cofflposit.lon have Deer, elaborated. It was shown that the -malii* components of polysaccharides are glucose, galactose, xylose, af-abinose. aipnnose, rhamnose and galacturonlc

ucld.' '

For the first, time from the liquid culture of fungi entarius -Ya55 - It, was Isolated In purified state - giucan ome of Its chemical and physical properties (mol. t=47000 D, [al D81' +20°) have been studied. The isolated n consist of 291 molecules of glucose linked with each other eans of (5 -(1-3) and a-(1-6) glucosldes bonds. • It was lished that purified giucan is less toxic compound and being ted Into the mice, has revealed its antitoxic activity in ose of 4000. mg/kg.

, fto4nnr»»o, t nevtrit II.i)!3. 59r. K.as }'■ 52 Tup a* 100 sks. Ofitax I*/j,

timw it poT»fipw«T» IB Ali P»eny5.»nicft /KieKHiT** r. Tunic« it