Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика гликопептидазы А из сладкого миндаля. Использование фермента для дегликозилирования гликопротеинов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика гликопептидазы А из сладкого миндаля. Использование фермента для дегликозилирования гликопротеинов"

РОССИЙСКАЯ ЛКЯЕМШ! НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗН.АМГ'ПИ ИНСТИТУТ ШООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ им. Н.М. ЯНШИНА

1!ч правей {.уштаси

Калибсрда Клена Николаевна

УДК 5^7. 122. 038. 3 : 57?. 152. ЗЫ *52

ВЫЛГ.ПЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛИКОПЕИТИДАМИДАРМ А ИЗ СЛАДКОГО МИНДАЛЯ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТА ДЛЯ ДЕРЛИК03ИЛИР00А1ШЯ ГЛИКОПРОТЕШЮВ.

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1992

Работа выполнена ь лаборатории химии нр.теилнтнческпх ферментов I!£Iс*1 нту'1 к йяасрг.'шическс'П химии им.М.Ы.Шемякина Российской Академии ниук

Научный руководитель - чл.-корр. РАН ¡'РТдптоноп!

Офщиалонш: оппонеыи: ликтор химических паук В.Н.Шибаей кандидат химических наук Н.Б.Бошш

Ведущая организация; Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН

Зашита диссертации состоится ИОЬ^*- 1992 г. в 10 часоь на заседании специализированного ученого совета Д 002. 35. 0! по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им.И.Ы.Шемякина РАН по адресу 117871, ГСП - 7, Москва, В-437, уд, Миклухо-Маклая, 16/10. С диссертацией (ложно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.О.М.Шемякина РАН.

Автореферат разослан "¿3" КогА*]^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

■ К '' У ;< Л Ь ¡1 О Г 1 I) II р (I о Л с М 1.! . 1'Л1!К0Пр(1ТС;ти широко распространены и природе. Они входят в состав всех тканей и клеток '"шмгх организмов м выполняют важные функции. Наиболее распространенным типом связи в гликопротеинчх животных является I! глпкозшшая снягЧ), оорозусмщ К - апетилглюкопнмимильннм остатком олигосахаридэ и 3 ямилной группой аспарагинопого остатка белка. При исследовании шруклурч и функции глпкопротеипов моишим инструментом являются гли-копептиламидазы, отщепляющие Пгликаиы. Одним из ферментов этой группы фермии о» является глшшпептидамилаоа'из сладкого миндаля. До наших иссх тдоваиий не бнло предложено эффективного метода очистки того фермента, обеспечивавшего получение препарата,.свободного от примесей шпогликозидаз и .протеаз; не било также хороших гликопепти-пннх субстраток, необходимых для создания чувствительного метода определения активности фермента. Сведения об эффективности действии г./шкопегптшннияазм А на различные глшеопрогетш были неоднозначны.

Цель работы. Цель представленной работы состояла в' получении ннсокоочищенного препарата гликопептяцамидазы А из сладкого миндал! и использовании фермента для яегликозилирования гликопро-.сипов-субстратов с различными И-гликанами. Были поставлены следую-зше задачи: 1) разработка эффективной методики очистки гликопептид-чмидазы А; 2) получение специфических субстратов для тестирования активности фермента и определение кинетических параметров соответст-дапей реакции; 3) использование гликолептидамидазы А для отщепления Ч-гликанс^ от модельных гликонротеипов-субстратов в натп'-чых и дена-гурирукцих условиях.

М а у ч п а я новизна. Предложена модифицированная мв-~''\т!ка вшеленз'.'! гашкошггид.этдазы А с использованием гидрофебнол

- г -

хроматографии на Ви1у 1 Ш 610 3. Разработана методика получение глпкоианопептида и глнкогексаиептида, которые после данпишровант' использовались в качестве субстратов. Установлено, что для деглши зилнрования глшшиоптидамидазои А глшсопротепнов, содержащих лактоз аминовые Н-глпканы, необходимо предвари голыше отщеплите терминал; ной сна^овой кислот. Показано, что гликонепгндамица.¡<1 А не деглики зилирует глнкоиротешш, характеризующиеся высоким сом ржанием гидро фобных ашшокпелот по отношению к гидрофильным (перокепдаац хрена с. овальбумин). Пероксндазу хрепа, однако, можно дегликозилироиап. ¡киле денатурации хаотропной солью в восстанавливающих условиях.

Публикации . По теме диссертации опубликовано статьи, материалы докладывались на' V Международной конференции молодых ученых по биоорганической химии (Пущнно, 1988 г.',.

Объем и структура работы. Диссертант; изложена на 95 страницах машинописного тенета и состоит из введения, обзора литературы, посвященного глшеозидпзам и гликонентид-амидазвм, результатов и обсуждения, экспериментальной части, ьыво дов и списка цитируемой литературы (12? наименовании

РЕЗУЛЬТАТЫ И О В С У Ж Д Е 11 II Е.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЛИКОПЕПТИДАМИДАЗЫ ИЗ СЛАДКОГО ШШДМЯ П ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕЕ Н-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ.

Схема выделения глннопептидамидази А приведена в таблице 1. По . еле измельчения зерен миндаля и их обезжиривания получали препарач • Сокращения: РМЗТ- бензилсульфонилфторид, ЮГА - На--соль этилещш-ашштетрауксусиой кислоты, Ж - Т-амино-^-метилкумарнн, Ипз - дш-сильная группа, РУ1№ ЦигсШоп) - поливишшшенлифтпр чикропорпе тая иеибрвна.

'(эмульсии, стадия 1), который затем зкстрагирошш! 0,05 и трис- НС1 буфером. рН 8,0, содержащим ингибиторы протеина:» ПЯР и ША (стадия '¿). Послс центрифугирования полученной суспензии суперпатант наносили на колонку с ПЕЛЕ Тоуорсэг1 ТЗК 650 9. (стадия 3) и проминали буфером, использогагшшлся для урпвнопешишшия сорбенте. Сорбировавшиеся бел-жн злюироеалн раствором ПаСЭ и условиях градиент концентрации. Принимая но внимание, что определению гликопоптидамидазы А мешает высокая активность сопутствующих зкзогликозидаз (табл.1детекцию гдикопептидамидазы Д, имевшем мол. массу 6В кЛа, проводили методом электрофореза но наличию полосы соответствующей мод. масс».

На рассматриваемо:! стадии основная масса глнкопрнтиламшшы А элюиропалась при промывании колошей исходным буфером, при этом значительная часть экзогликогадаз (табл.|) и протеиназ задерживалась на носителе. Содержание гликопеитидамндазы А в элюате составило 60%. количество же экзоглнкогшлаэ в этой фракции оказалось гшисешшм и 840 раз (табл.1).

Ко,пек, получении!! на стадии 3, высалццали сульфатом аммония (70% наемщения). Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в минимальном объеме 0,0// М трис-НС1 буфера, рН 7,5, и диализовали ?|ротш него же. Лиалияованннй раствор концентрировали ультрафильтра-•шей через мембрану РМ ¡0 и наносили на ЗерЬасп/1 3-200 (стадия 4).

профиле элюцни белков (рис.1а, кршш Л наблюдали три пика: гли-:шиептнламилазп Л находилась по втором пике. В этом же пике обнаружилась примесь ¡З-галактозилпзн с удельной активностью 3х)0~3мкмоль/мш«мг (рис, 1а, .3). В первом и третьем пиках находились 1- маннозидаза и |341 •-ш'етилгекспзвмигилпзп. соответственно (рис. 1а, 2,4). По результатам ггль-Фильтрашш относительная мол. масса глико-

/

' - Таблица 'I .

Выделение гликопептидамииазы ira 300 г зерен сладкого миндаля

Номер стадт Стадия Объем, ил Белик, ыг Активность экзогликозидаз,, ккмоль а (Ь, е ) Лкгиьн. гиикопеп- ГШМИАЛ нмемь S

■ УИН МИН-Mг

а b с

1. Эмульсин миндаля 1500 B20Ü Н66 5965 2515 _

2. Экстракция 0,05 М трнс HCl-буфером -49 31 H 1390 5403 2300

3. DEAf Toyopearl pH 8,0 52 31 6,3 0,74 3,78

4. Sephacryl S-200 . (17-19 фр.) 0,01 M трис-HCl-буфер 27 11 .'fi 0,02 0,1 0,01

5. Butyl TSK 650S <18 фр.) 1 1,35 0.001 0,00! 0,000 203

■Для определения активности экзогликозидаз использовали .соответствующие п-нитрофенилгликозпды: а - п-нитроф'чшл-а-О-маннолиранознд для а-манозидазы; b - п-нитрофенил-р-О-галактопиранозид для ö-галакто зидазы; с - п-нитрофенил-Н-аиетил-^-О-глюкопиранозид длл (З-И-ацетнлгек

соэаминилазы. S - . Ппз-С1и-С1и-(е-Шз)Буз-(0-Ош)Гуг-.4йп(СНО)-1еи-

: (

-Ser-Val.

Да

Рнс.1. Выделение гликонептидомилаэы А: а - хроматографией на БерПа-сгу! 5-200: б - хроматографией па Вл1у1 КК 650 Б. I- Адля оп-. ределтшя а-маннозидазы (2), р-галактозияязн (3) (VII-аиетилгексозаминидазы (4) использованы соответствующие п-_шишЬ.е_Щ1ли!Жкоз|ш^_0Жечегщ_лылеляемне фракции.

Рис.2. Электрофорез в ПААГ с ДЦС-. На при выделении гликопептиламидази А: 1 - экстракт эмульсина миндаля; 2 -- препарат после РЕАЕ-хр'->штографии (стадия 3); 3 - препарат косле Бср1и-сгу] 5-200 - (стаяия 4); 4 - оПйиешшЛ , препарат гликопептидаиилазм А (стад«я5).

- tl -

пентидамидазы A оценивалась около 71 .¡(Да.

Объединенные фракции (рпс.1) диалнзовали против 0,1 U фосфатного буфера с 1,5 M сульфата аммония (pli 7,0} и наносили на колонку с В,. tyl-TSK &:>0 S (стадия Г>, гидрофобная хроматография). Фракции, пол! ченные при промывании колонки исходным буфером, не содержали белкоь. При элюирован'.ш" pars вором vIB^gïQj в условиях нисходящего градиен та концентрации оыли получены три белковых пика (рис.10). Гликонептил-амидаза А находилась в последнем пике. Было получено 1,35 мг белка, гомогенного но данным электрофореза (рис.£, 4). Полученный препарат фермента был полностью лишен протеилитической активности и практически не содержал экзоглнкозидаз. Удельная активность по специфическому субстрату глико-три-ииз-нанипеитиду (см. ниже) составила 203 Высокая эффективность разделения белковой смеси гидрофо-

бной хроматографией позволила в дальнейшем опусгнгь стадию гель-хроматография на Sepliacryl S-2Û0. Выход гликопептидамидазы А увеличился Едвое и составил.2,5 мг, удельная активность 260 j^pj^, .

'С целью изучения структуры гликопептидамидазы было проведено секвенировяние белковой части фермента с H-конца. Для этого было использовано два препарата: белок из раствора, полученный после гидрофобной хроматографии, и белок с мол. массой 68 кДа из второго инка стадии гель-фильтрации, выделенный электрофорезом и перенесенный на PVDF-мембрану. Результаты секвенирования оказались идентичными, определена Н-концевая последовательность гликопеитидамидази А: Ile-Asp-Рго-Arg- Val-Val-Xaa-Ala-Xaa-Leu.

ВЫДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ И ОПРШДКИШ;

КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ИХ ГИДРОЛИЗА ГЛИКОПЯП'ПШЛШЦАЗОИ А.

В качестве источника потенциальных субегра ген для гликиючтщ--

мидазн А - гликопеитидов» бнл' выбран овнльбумкн. которнй имеет одну -олнгосяхаридиув nein,. Сил промелеп пспсиноиии гидроли? овельбуии-¡1, о послодушсй гель- фильтрацией im Bio-Gel Р 4; фракции, содержа -тс углеводн, выявляли фенол-сернокислотным метолом, объединяли и

1Н0'£ИЛ113ПВ,'Ш|, РЫЯСЛВНИГ ГЛПКОПСПТИДОИ из пщюлизпти проводили 'одом ВЭМ п обращенной '!'ззе (ркс.Пп). Установлено, что п пике I со тепенен удержания 18 паи выхолит гликонаиоиептил. Соквпнирояанием шределена его структура: Gl u-G) u -Lys-Tyr-Xöa-Lc'j-Thr-Scr-Vftl. Она .чютветстнует аминокислотной последовательности 290-208 в овЕльбуми-¡с: G]u-iHu-T,y.vTyr-Asn(CHOj-L>::u Thr-Sor Val. Следовательно, не 1дентифип«ро;<анная при ескнинировашш аминокислота является остатком ¡гпарагпна, к которому присоединен гликан. Углеводная часть глнкопе-!тнла охарактеризована составом Mari:GIclIAc - 5,7:1,0, что позволяет внести еО к олигомаииозидному типу М-гликанов. Углеводная последовательность tl-гликапа не била охаракттфигювана.

Sfa следующем этапе работы выделенный гликонапопептид обрабатывали трипсином с тем, чтобы отщепить П-концевой трипептид. После хромато1'рпфии тригхинового гилролизата «а U1 traapbere ODS (рис.36} Пыл получен гликогексяаелтил (заштрихован), аминокислотная последовательность которого была слеяущей Tyr-Xaa-Leu-Ttr-Ser-Val. Выделенные гликонанопептид (ГНИ) к гликогсксапеития (ГГй) после даненли-рошшя Сл.'зя повышения чуетвителыюсти метода) были использованы в качестве субстратов' для определения активности и характеристики кинетических параметров их гидролиза гликопептндамидазой А,

Нссле лмкилпрования ГНП епдерямл три mmmme грулгш: Bis-G1 u- fUtj- (С-ШзИ.уз- (0-Шз) ТУ r-Asn((5IÖ)-I.oi- Tlir-Sfir-Val, ITH - Дйб даясилыше группы: Pnit-(0-D:»)Tyr-A3fi(CH0)-beu-Tl!r--S?r-Val.

—er

Piic.G. Выделение гликонанопептила (а) н уликогокоапчтит (f>) ич UUraspliere Сд(<4,&2Ьймн)ь градиенте конце нтршшн атлинприл-!, in мин: а - в 0.1% трифторуксусиоП кислоте; б - i< иГиИ фс.о|ч чг-ч -у фере (pH 2,0).

При оппелелении Ферменгнтичтт; активности 10 1 нмоль ¡¡¡13 гликонеитида инкубировали с гликопсптияпмилазн"» л (маем репки, спеси 100 нкл, 13У°С, ?. ч). Заг(М реакционную смесь хроматографиро-вали на «инлитичсскоА колонке III u-i:<piiore CDG С)П {I.Bxi'.bO мм). Па рпсЛ приведены типичные хроматогряммы реакционно!) и-рси в исходном состоянии '1 после инкуоацт: с ферментом. Время улерг'ния исходного глико ли П:.:! гсксипгнтида (1^уГютрат)-?,В мин, н ди- Н',.ч -гексаиептнда (¡^продукт > — 33 мин. Колнчостт.чшуп оценку расхода су-'" i para проводили по умгныч.-нию плотили его пика. При тех же условиях время удержания глике-три-Шз-НП (суба рат) составляет 25 мин, а три Ппл ьацопентид (к:ппукт) - ЪО \;,:ин. За единицу ачтииносги принимали активность такого количества фермент», которое расщепляет 1 нмоль глико-три--Ite-naunneimuia в мин. Именно в чтих единицах охарактеризована активность выделенной гликопептиднмпдази А (табл.1).

При пфеделепии кинетических параметров гидролиза гдикопептндов глнкоцетндачпчазоП л концовгряпню глнко-ди-Ргп-гекпнмчп'нда изменяли в диапазоне о, И-О,?,С мМ, глико-трн Опз-намонентидп - в диапазоне 0.33-1,1 ни. Концентрация Фермента 0,72 икМ и 1.83 мкМ, соответственно. ('ггстячслсие константы ферментативной реакции определяли по

графикам Мйнуипера—Верка (pre.5). Гвсчитанные величины ккат и

каж

К /к,, приведены в табл.2. На основании данных, полученных для ктгкам 1

обоих суострагол, гн заключили, что глнко-ли-Ипз-гекгапептид предпочтительнее дня изучения каталитических фушший фермента и тестирования специфической активности в препаратах гликопепти.-ммилаэм А.

В

¡сн3сж.%

___10____ зо 50 10 30 50 ииж

Рис. 4.' Исследование ферме^та^вьш "активности оикопептидамидазн А по реакции расцепления глико-дн-Опз-гексапептнли оьальбумина методом ВЭйдС. : л - исходное состояние; В - реакционная смесь после инкубации с ферментом. Условии эксперимента; колонка ипгаарЬеге С]Г (4,6х250ми)а условиях градиента концентрации ацетонитрила с 0,1»

^рпфторуксу с ной кислотор, 60 К!ЙН. - '

мМ

10 Ц/БЗхТО"3, мН"1

Ряс,5. Определение кинетических констант реакции глчкопеитилашшазы А о глико-ди-йш^-пйнопептилом (1) и- глнко-тсп-ШБ-гексапептпом (2) по методу ЛаГшушзера-верка.

Таблица 2

КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ГЛИК0ПЕПТИДАШ1ДАГШ А.

Субстрит , мН к -1 кат 'пин 1а1каж г К1ШТ/КМ

иМ~.1мшГ1

Опз- (О-Пгкз)Т^ г-Азп!.ОНО.! -

-Ьеи-ТЬг Бег Уа1

0,078 8,6 109,3

а 13-Ии-- 01 и- (е-Опз) Ьу з -Ту г

-АЗП (С:-Ю) - Ьеи-Тйг- Бет-7а 1 0,1 1 3,5 131,8

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕГЛИК03ИЛИР0ВАШШ ГЛИКОПРОТЕШЮВ ГЛИКОПЕПТИДЛМИДАЗОИ Л В качестве молельных соединений при исследовании действия гли-копептидамндазы А было использовано четыре гликолротенна: а) два гликопротеина,- содержащие Н-гликаны лактозаыннового типа -Ду-фрагмент (95 кДа) бычьего фибриногена (биангснний олигосахарид), полученный в результате плазмннового гидролиза фибриногена, и оро-зомукоид (а|-кислый гликопротеин) (он- ,три- и тетраантешше олиго-сахариды); б)'пероксндаза хрена - с Н-гднканом гибридного типа; п) овальбуыин - с гликаном шшнозобогатого типа. Следует отметить, что орозомукоид-и пероксндаза хрена имеют одинаковые мол.массы (43 кДо) и содержание Н-гликанов (около 30% мол.массы), а сдинсгвеннкй й-гликан ¡З-цепи Л^-фрат-ментп фибриногена и овальбумина расислсгаен на С-конце, вблизи петли, образуемой иистеишшн.

Условия дегликозилирования были следующими: П, I - 0,2 н Иа-адетатный буфер (рН 5,1), 3 мМ РМВР. 37°П. Соотношение от 1:1 до 1:10. Об отщеплении гликановой части гликопротеина судили по изменению подвижности при электрофорезе в ЛЛАГ дегликозилированного бедка. '

Было ■ установлено, что гликопсптидамидаза А не отщепляет Нтликаны без предварительной обрпб'лки гликопротеинов. Дегликози-ликование орозомукоида (рис.64) и Д|-Фрагмента фибриногена (рис.СБ) в ьеденатурирующих условиях происходит чолько после обработки гликопротеинов нейраминидазой из У.с1ю1епи, приводящей к удалению терминального остатка опаловой кислоты. Таким образом установлено, что предварительное десиалнлированне гликанов лактозаминового типа является необходимым условием последующего удаления П-гликанов.

Для характеристики П-гликана, отщепляемого гликопептидамидазой А от Д^-фрагмента фибриногена, реакционную смесь после инкубации обрабатывали аминокумаршюм (ЛМК). При этом происходит восстанови тельное аминированне Н-олигосахарида по восстанавливающему пщрокси-лу, высвобождаюшемуся в результате ферментативной реакции. Время выхода полученного АЖ-олигосахарила с колонки (1ШХ на ШпщЛеге 0В5) свидетельствовало об идентичности олигосахарила с тем, который получают методом гилразинолиза десиалилированного Д^-фрагмипа фибриногена. Эти данные свидетельствует о том, что и результате действия гликопептидамидвзы А на десиалшшроЕШШш гликопротеин освобож дается полноразмерный Л-гликан лактоз?««:нпюто тппп.

При исследования ясглпкоэнлпронмьчя перокг.ижязн^-сип было установлено, что отрешение н гликана происходит только поел« предварительной лен»ту)птш белка путем обработки хаотрогшой солью г> йог-

- 1 ь-

кЛа

А

кАа

2 3

1*и..в. Элиирифе и паАГ с лдс-Па продуктов дегликозплирования орозомуконяа (А) и фрагмента фибриногена (Б). 1 -•исходный гли-коиротеин; 2 - гликипротс-пн с гликопептиламидазой А без предварительного деспалплирежания; 3 - лесиалплнровапныц "ликопротеин с гли-коиептпдамилазой А. Условия эксперимента: А - 125» ПААГ, восстанаь-ливаюшне условия; Б - 10% ПААГ, невосстанаьливающие условия.

- 1 4 -

стонавливающих условиях (0,8 М iíaSCH, 0,1 М З-меркаппшанол, 37°с, 1 ч, рис.74). Об этом свидетельствовало появление белка с мол. массой 30 кДа, который составил 15% от исходного. После д^нгтурации в указанных условиях овальбумпн не подвергался дегликозилированпю гликопентидамплазоП Л. Д^-фрашент , фибриногена и орозомукоид де-глнкоэилируготся без денатурации; пешксидаза хрена - только после иредепатуращш, а овальбумпн не д<-г 'Л'кс'плпруется даже после иреде-натурации (рнс.7Е>). Л-|'г,кспдг)за хрена и овальбумпн

существенно отличаются от переоП лчрн глпкопротепнов-еубстрэтов отношением гидрофобных аминокислот к гидрофильным (табл.3). Видно, что у персиссидазы хрша и овальбупина рассматриваемое отношение выше, чем у исрвнх двух гликопротеинов. Можно предположит!,, что "гидрофобный" белок глшсопротеина-субстрата создает препятствия для действия гликонептидакшдазк А.

Эффективность дегликозилированйя гликопротепнов (Д^-фрагмеит фибриногена и пероксидаза хрена) оценивалась по содержанию углеводов в дегликозилированном белке. После диализа реакционной, смеси белковую масть выделяли с помощью ВЭЖХ на колонке 'ISX G Л/JO SW. Затем проводили кислотный гидролиз белка с последующей обработкой гидро-лизата вшшокумарипом для обнаружения к идентификации моносахаридов, возможно оставшихся после деглнкозидирпвакня ферментом. В результате этого эксперимента не обнаружено АПК-моносахаридов в бел-новой"части Д^-фрагиента фибриногена (белок с мол.массой 92 кДа) и пероксидази хрена (белок с пол.массой 30 кДа). Теп самый было показано, что гликопептпламндаза из сладкого миндаля полностью снкспля-ет в гликогфотешшх десналшшровашше лактозомшювые* и гибридные (после денатурации гликопротенна) И-гликанн. Попытки дегликозилиро

А

Ж

67 . 4530.

20.1-

таджа ЦЩШ

20.1 —■

Рис.7. Электрофорез » 12% ИААГ с ДДС Па (восстанавливающие условия) продуктов деглнкозилироьания перокспдазы хрена (А) и овальбушша (Б). 1 - исходный глшсопротенп; 2 - гшсонрогеин без предварительной денатурации .<ПаГ>СН, 0,1 У иеркаптозтанол)с глшсопептидамида-зой А; 3 - предварительно денатурированный гликопротеин с глнконеп-тидамилазой а.

Таблица 3.

Действие гликопептидамидазы на гликоиротеины в зависимости от их белковой части в нативных условиях

Гликопротеин Результат обработки гликопептиламидазой Отношение количества гидрофобных аминокислот к гидрофильным

Д¡^-фрагмент бычьего

фибриногена дегликозилирует 1,13

Орозонукоид _ *> _ 1.СГГ

Нероксидаза хрена не дегликозилирует 1 ,73

Овальбумин _ », _ 1,67 '

вать овзльбуыин. в той числе в условиях денатурации, не дали результата .

- Г7 -В U В О Д н..

I. Разработана модифицированная методика выделения гликопептидамидазы А из сладкого миндаля: на завершающей стадии очистки для уда-,, ления гликозидаз и протеаз успешно применена гидрофобная хроматография на Rutyl-TSK 650 S. Получен гомогенный по данным электорофо-реза в ПААГ белок и определена П-концевая последовательность 10 аминокислот: IJ e-Asp - Pro- Arg -Val -Val -Xaa-Ala-Xaa-Leu - 2. Получены новые субстраты гликопептидамидазы: гликонанонептид, Glu-Glu-Lys-Tyr-Asn(CIIO) -Leu-Tlir-Ser-Val выделенный из пепсинового-*гидролизата овальбумина; гликогексапептид, •

Tyr-Asn(CHO)-Leu-Thr-Ser- Val, полученный из гликонанопептида путем трипсинового гидролиза. Разработана методика тестирования активности гликопептидамидазы A rio гидролизу дансилированных субстратов глико-(три-Опз)-нанопептида (Ппз-Glu-Glu- (е-Ппз)Ьуз- (О-СПз)Туг-

-Asn(CHO)-Leu-Thr-Ser-Val) и глнко-(ди-Ппз)-гексапептида

(Шз(0-№is)Туг-Азп(СНО)-Leu-Thr-Ser-Val)Продукт 1 реакции (дансил-пептид) и непрореагиропавший субстрат разделяли'методом ВЭЖХ.

3. Охарактеризованы кинетические параметры гликопептидамидазы А ^kat' V ,!Р" Г11'ЛР0Л11Я!3 предложенных гликодансллпептилных субстратов.

4. Для дегликозилирования гликопегпидамидазой А гликопротеинов, имеющих лактозаминовые Н-гликаны (Д(| фрагмент фибриногена и орозо-мукоид), необходимо предварительное десиалилирование N-гликана ней-раминидапой.

5. Показано, что гликопептиламилаза А не дегликозилирует пероксида-зу хрена и овальбумин, которые характеризуются высоким отношением гидрофобных аминокислот к пшрофилышм. Пероксидазу хрена можно де

гликозилировать.после обработки хаотропной солью в восстанавливаю щих условиях; овальбумин и в этих условиях не дегликозилируется. ,

Основные результаты диссертации изложены в следуюши

публикациях:

1. Калиберда E.H., Насонов й.В. Дегликозилирование нативны гликопротеинов. Тезисы докладов 5-ой конференции молодых учены соц. стран по биоорганической химии. (Пущино, 1988), стр.78.

2. Калиберда E.H., Шемякин B.Ii., Антонов В.К. Выделение гликопептидазы из сладкого миндаля и определение Н-конпево последовательности еб белковой части. Биоорган.химия, 1990 т.16, Н 6, с.751-758.

3. Калиберда E.H. Ферменты для изучения углеводных структур гликопротеинов. Биоорган.химйя, 1991, т.17, и 5, с.581-595.

4. Калиберда Е.И., Насонов В.В., Антонов В.К. Деглшсознлировани гликопротеинов гликопептиламидазой А. Киоорган.химия, 199Z т.18, И 4, с.531-539.

Подписано к печати г. Ьэк.756^ткр-.7U

11олиград?продп^иятио Hllü