Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Вторичные метаболиты растений и перспективы их использования при защите тепличных культур от вредителей и патогенов

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Вторичные метаболиты растений и перспективы их использования при защите тепличных культур от вредителей и патогенов"

РГБ 01

г 5 ден гт

На правах рукописи

Черменская Таисия Дмитриевна

ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ РАСТЕНИЙ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ ЗАЩИТЕ ТЕПЛИЧНЫХ КУЛЬТУР ОТ ВРЕДИТЕЛЕЙ И ПАТОГЕНОВ

Специальность: 06.01.11 - защита растений от вредителей и болезней

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - Пушкин 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений

Научный руководитель

член-корр. РАСХН,

доктор биологических наук В.Н.Буров

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук Н.А.Вилкова кандидат биологических наук А.Г.Семенова

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится 28 декабря 2000 г. на заседании Диссертационного совета во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений

Адрес: 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3, ВИЗР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЗР Автореферат разослан " № " кллфл^_2000 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Г.А.Наеедкин;

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Характерной особенностью последних лет является стремление к снижению отрицательного влияния хозяйственной деятельности человека на окружающую среду. Именно этим объясняется вновь возросший интерес к поиску новых экологически безопасных средств защиты растений и, в частности к вторичным метаболитам растительного происхождения, регулирующим многие биологические процессы в биоценозах. Результаты работ в этом направлении свидетельствовали о возможности нахождения ряда принципиально новых групп молекул с высокой биологической активностью и создания на их основе высокоэффективных и экологически безопасных пестицидов. Именно биологически активные вещества растительного происхождения послужили прототипами при создании таких групп пестицидов, как пиретроиды и органические карбаматы. В последнее время по тому же пути ведется создание препаратов на основе встречного синтеза терпеноидов, хроменов и азадирахтинов, обнаруженных ранее у представителей тропической и субтропической флоры. Предполагается, что на основе растительных метаболитов могут быть созданы как препараты, характеризующиеся высокой избирательностью действия на целевые объекты, так и средства защиты растений, не только обладающие более широким спектром действия, но и сочетающие в себе несколько типов биологической активности. Особенно широкое применение препараты этого типа могут найти при работе в защищенном грунте, где используются биологические агенты и ограничено применение традиционных пестицидов.

Цель работы: оценка возможности создания эффективных средств защиты тепличных культур от вредных организмов на основе биологически активных веществ (БАВ), продуцируемых растениями местной флоры.

Задачи исследований: 1) первичный скрининг растительных экстрактов на выявление типа биологической активности; 2) лабораторная оценка отобранных экстрактов по спектрам и уровню активности для тест-объектов; 3) характеристика химического состава наиболее перспективных препаратов и разработка лабораторного метода их препаративного получения; 4) оценка эффективности препаратов в условиях вегетационных, мелкоделяночных и производственных испытаний.

Научная новизна работы. Среди 147 испытанных видов растений выявлено 125 видов - продуцентов БАВ, в различной степени подавляющих развитие вредителей и болезней тепличных культур. В том числе: с инсектоакарицидной активностью - 100 видов, с фун-гицидной и бактерицидной активностью - 37 видов, влияющих на поведение насекомых - б видов.

Показано, что экстракты ели европейской Picea excelsa L. обладают комплексной биологической активностью для основных вредителей и возбудителей заболеваний тепличных культур. Методами УФ-, ИК- и масс-спектрометрии установлено, что инсектоакарицид-ная и фунгицидная активность обусловлена присутствием: а- и ß-пиненов, камфена, лимонена, а- и ß- кариофилленов, камфоры, 1,8-цинеола, 1,2,3,4,5,6,7,8-октагидро-1,4-диметил-7-(1-метилэтиледен) азулена. Основным действующим веществом, ответственным за бактерицидную активность является 1-(2-метилпентен-2)-1,9-диметал-5,5-диметил-4,8-дегидронафтален.

Практическое значение работы. Определен список растительных видов, перспективных для выделения и идентификации БАВ -возможных прототипов новых химических средств защиты растений (ХСЗР). Разработаны лабораторные методики препаративного получения биопрепаратов с инсектофунгицидной, бактерицидной активностью и препарата "Комплексный" на основе БАВ из хвои ели европейской для использования в защищенном грунте. На основе результатов проведенных исследований начато составление лабораторного регламента получения биопрепарата "Комплексный".

Получен патент РФ № 2154942 на изобретение: "Способ получения средства защиты растений из хвои Picea excelsa L."

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на совещании "Поиск и использование биологически активных веществ в защите растений: состояние и перспективы" (Санкт-Петербург, ВИЗР, 1998); отчетно-плановой сессии ВИЗР (Санкт-Петербург, ВИЗР, 1999); XlVth Plant Protection Congress (Jerusalem, July 25-30 1999); симпозиуме МОББ "Биологически активные вещества в защите растений" (г.Анапа, 30 августа - 4 сентября 1999 г.); семинаре - презентации "Биотехнология - 2000" (г.Пущино. 26-28 сентября 2000 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 13( страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материалов и методов исследований (глава 2) экспериментальной части (глава 3 и 4), выводов, практических рекомендаций, списка литературы (222 наименования), и приложения Работа иллюстрирована 29 таблицами и 13 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследований.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рассмотрены состояние и перспективы вопроса о применении ботанических пестицидов. Приводятся литературные данные по вторичным метаболитам растений и их роли в биоценозе. Представлены сведения о роли биологически активных веществ растительного происхождения в защите растений. В том числе обобщены данные по вторичным метаболитам высших растений, влияющим на рост, развитие и поведение насекомых; по антивирусной, фунгицидной и бактерицидной активности веществ растительного происхождения. Особое внимание уделено биологически активным веществам хвойных и вечнозеленых растений.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение биологически активных веществ из растительного сырья. Надземные части растений собирали в период цветения и сушили при 1 = 20-25°С. Для приготовления экстрактов (препаратов) высушенные растения на трое суток заливали растворителем (этанол; этанол:вода - 1:1) при среднем весовом соотношении биомасса : экстрагент 1:10. Экстракцию проводили до полного извлечения экстрактивных веществ. Контроль осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах "БПиМ" (ЧССР) в различных системах растворителей. При приготовлении экстрактов с использованием растворителей - гексан, хлороформ, ацетон, метанол - пользовались аппаратом Сокслета.

Сбор летучих соединений из экстрактов проводили в сосудах с продувкой воздуха (500 мл/мин), профильтрованного через картриджи, на сорбент Рогарак <2, который промывали диэтиловым эфиром. Элюат использовали в испытаниях в ольфактометре и для анализа соединений.

При выделении нейтральных веществ к этанольному экстракту ели европейской добавляли гексан и 5% гидроксид натрия. Смесь экстрагировали гексаном, растворитель отгоняли под вакуумом. Разделение нейтральных веществ на фракции осуществляли методом колоночной хроматографии на силикагеле Ь 40/100, элюент - гексан с возрастающей добавкой диэтилового эфира. Контроль за разделением веществ вели с помощью ТСХ в системе растворителей гексан-эфир (4:1).

Газовая хроматография, масс-спектрометрия, электроантенно-графия. Образцы анализировали с помощью газового хроматографе (ГХ) Hewlett-Packard Model 5890 series II, с охлажденным инжектором на колонке и пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Использовали колонки с метилсиликон связанной фазой 50 м х 0.32 мы (НР-1) и 30 м X 0.32 мм (HP-WAX). Газ - водород. Масс-спектры летучих сняты на YG Autospec mass spectrometer, 70 эВ, 230°С, соединенном с ГХ, капиллярная колонка 50 м х 0.32 мм (НР-1) с температурой 30°С - 5 минут, затем 5°С/мин до 180°С. Масс-спектры компонентов препарата Комплексный сняты на приборе Finnigan MAI 8430, энергия ионизации 70 эВ, ускоряющее напряжение 3 кВ;

температура источника ионов 250°С, прямой ввод образца. Идентификация проводилась путем сравнения с аутентичными образцами,

Для получения электроангеннограммы использовали отсеченную голову самки калифорнийского трипса, размещенную на одной из двух Ag-AgCl стеклянных электродов, заполненных солевым раствором. При исследовании компонентов летучих, эффлюент с ГХ колонки разделялся между ПИД ГХ и электрофизиологическии препаратом. Разделение достигалось с помощью AI 93 ГХ, снабженного охлажденным надколоночным инжектором и ПИД. Газ - водород, колонка НР-1 (50 м х 0.32 мм) с температурой 40°С в течение 1

минуты, затем - 5°С/мин до 100°С и затем 10°С/мин до 250°С.

Биологические испытания. Оценку активности проводили нг основных вредителях и возбудителях заболеваний растений защищенного грунта, в том числе на паутинном клеще (Tetranychui urticae Koch.), оранжерейной белокрылке (Trialeurodes vaporariorurr* Westw.), персиковой (Myzodes persicae Sulz.), бахчевой (Aphù gossypii Glov.), большой злаковой (Schizaphis graminum Rond.), гороховой (Acyrthosiphon pisum Kalt.) и бобовой (Aphis fabae Scop.) тлях калифорнийском (Frankliniella occidentalis Perg.) и табачном (Thrip¿ tabaci Lind.) трипсах, грибном комарике (Lycoriella auripila Winn.): возбудителях мягкой гнили овощных (Египта carotovora subsp carotovora Jones Berjey et al.), бактериального рака томате (iClambacter michiganense subsp. michiganense Davis, Giillaspie et al.) черной бактериальной пятнистости томата (Xanthomonas campestrii pv. visicatoria Doidge, Dye), некроза сердцевины стебля томатг (Pseudomonas corrugata Roberts and Scarlett), бактериального увядания томата (Pseudomonas solanacearum Erw. Smith), гнилк картофеля (Bacillus polymyxa Prazmowski, Mace); белой гнилк (Sclerotinia sclerotiorum Lib.), мучнистой росы огурца (Erysipht cichoracearum DC), антракноза тыквенных (Colletotrichum laginariun Pass.), корневой гнили (Fusarium culmorum Sm.), альтернариозг плодов (Alternaria solani Ell et Mart.), серой гнили (Botrytis стегег

solani Ell et Mart.), серой гнили (Botrytis cinerea Pers.), вертициллеза {Verticillium dahliae Kleb.).

При оценке инсектоакарицидной активности в условиях лабораторного эксперимента, обработанные и заселенные вредителем субстраты помещали в чашки Петри с влажной ватой.

Ответные реакции трипса на летучие были исследованы с использованием модифицированного четырехканального ольфактомет-ра Петтерссона (Hare, 1998). Для определения аттрактантной и ре-пеллентной активности экстрактов по отношению к белокрылке на растения фасоли в фазе двух настоящих листьев, обработанные водными эмульсиями экстрактов растений (контроль - вода), выпускали имаго белокрылки и в течение 10 дней вели учеты численности на растениях в условиях свободного выбора.

Тестирование на антагонистическуюактивность проводили методом диффузии изучаемых растворов в агар (метод лунок) (Кра-сильников, 1950). В качестве твердых питательных сред использовали сухой питательный агар (СПА) и мясопептонный агар (МПА) для бактерий и агар Чапека для грибов. Об активности судили по радиусу зоны ингибирования роста тест-культур. Первичную бактерицидную активность изучали на семенах и проростках томата, сорт Волгоградский скороспелый 323. Семена предварительно инфицировали возбудителем мягкой гнили овощных, а затем погружали в растворы препаратов на 30 минут. Проращивали семена в чашках Петри при постоянной температуре 26°С. Анализировали энергию прорастания, всхожесть, пораженность проростков.

Для оценки инсектоакарицидной активности в вегетационных испытаниях, заселенные вредителем растения фасоли и бобов в фазе двух настоящих листьев опрыскивали рядом концентраций исследуемых препаратов. Контроль - обработка водой. Учеты проводили на 1, 3, 7, 10 сутки, при необходимости обработку повторяли. Испытания на фунгицидную активность препаратов по отношению к мучнистой росе проводили на огурцах (гибрид ТСХА-77), на искусственном инфекционном фоне. Расход суспензии патогена 10 мл на 10 растений. Опрыскивание препаратами проводили трижды (фаза двудольных листьев, 2-го и 4-го листа). Учет проводили по 3-х бальной шкале на третьем и четвертом листьях. Бактерицидную активность изучали на растениях томата сорт Волгоградский скороспелый 323, помещенных в вегетационные сосуды, по 5 растений на сосуд, в каждом варианте 4 повторности. Томаты заражали возбудителем бактериального рака томата путем инъекции в стебель в фазе 6 настоящих листьев. Обработки производили 4 раза через каждые 10 дней. Об эффективности препаратов судили по среднему проценту поражения растения по сравнению с незараженным контролем.

Препарат "Комплексный" оценивали в условиях мелкоделя-почного эксперимента в защищенном грунте на растениях огурца

(сорт Кулик) в фазе 5-8 листьев, заселенных имаго паутинного клеща. Расход рабочей жидкости - 1000 л/га. Повторность опыта четырехкратная. Учеты численности проводили по срокам, принятым для Государственных испытаний пестицидов.

При оценке препарата "Комплексный" на бактерицидную и ро-стстимулируюгцую активность в производственных условиях на базе КСП "Тепличное" г.Болгограда использовали культуру томата гибрида Роматос и Верлиоко. Обработки проводили по схеме: замачивание семян в 0.025% эмульсии препарата; опрыскивание растений в фазе 4-х настоящих листьев; повторное опрыскивание растений в рассадный период через 3 недели после предыдущей обработки; опрыскивание растений через 10 дней после высадки в теплицу. Расход рабочей жидкости - 1000 л/га. Общая площадь опыта - 1 га, количество повторностей - 8. Плоды снимали в период с апреля по июнь, учитывая суммарный урожай, количество больных и погибших растений.

Результаты экспериментов проанализировали статистически с использованием ^критерия.

Глава 3. СКРИНИНГ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

В период весенне-летних сезонов 1993-1999 гг. в ряде районов Ленинградской области проводили сбор вегетативной массы растений, отличающихся достаточно широкой распространенностью и слабой поражаемостью вредителями и болезнями в природных условиях. Ряд видов растений был собран в Крыму при содействии сотрудников Никитского Ботанического Сада.

В соответствии с вышеописанной методикой были приготовлены экстракты 147 видов растений из 37 семейств, которые в дальнейшем в лабораторных условиях оценивали на биологическую активность для вредителей и возбудителей заболеваний тепличных культур.

3.1. Воздействие растительных экстрактов на насекомых и клещей - вредителей защищенного грунта

Первичный скрининг всех приготовленных экстрактов проводили на трех видах членистоногих, относящихся к отдаленным таксономическим группам - паутинном клеще и калифорнийском трип-се - постоянных вредителях тепличных культур, и гороховой тле.

Проведенные испытания показали, что, экстракты 100 видов растений обладают заметной токсической, а шести видов - высокой аттрактантной и репеллентной активностью как минимум для одного из указанных видов вредителей. Так экстракты практически всех видов растений, входящих в этот список, вызывали высокую (пре-

вышающую 50%) смертность паутинного клеща при воздействии, как на личинок, так и на имаго вредителя. Близкую к 100% смертность клеща вызывали спиртовые экстракты мать-и-мачехи, пижмы обыкновенной, лебеды копьевидной, молочая лозного, крестовника, вереска, цикория обыкновенного и лопуха войлочного. Ряд экстрактов (пижмы, сныти, норичника, крапивы, одуванчика) обладал сильным токсическим действием для гороховой тли. Однако при этом большинство из них не действовали, или слабо действовали на калифорнийского трипса. Более широким спектром действия характеризовались экстракты лишь 25 видов растений, 15 из которых, достаточно активные для всех трех испытываемых видов, и были взяты для дальнейшей оценки на расширенном круге объектов, дополнительно включающем оранжерейную белокрылку, грибного комарика, бахчевую и злаковую тлю (табл.1).

Проведенные испытания выявили ряд особенностей действия растительных экстрактов, механизмы которых пока остаются не выясненными, но открывают возможности для создания новых средств защиты растений различного типа действия, а именно:

а) наличие существенных межвидовых различий чувствительности к одним и тем же экстрактам даже у насекомых таксономически близкородственных видов. Так высокоактивные для гороховой тли экстракты растений, таких как сныть, одуванчик (смертность выше 90%), амброзия, мать-и-мачеха (смертность выше 50%) и др. проявляют лишь следы активности при действии на злаковую тлю. Дополнительные эксперименты показали слабую чувствительность злаковой тли и к экстрактам чистотела, молочая, орляка и вероники, вызывавших смертность бахчевой тли на уровне более 90%;

б) способность экстрактов ряда видов растений избирательно оказывать отрицательное действие лишь на определенные виды насекомых, не связанные с ними хозяино-паразитарными отношениями. Так экстракты сныти особенно эффективны для калифорнийского трипса и гороховой тли, одуванчика - для гороховой тли и оранжерейной белокрылки, коровяка - для белокрылки, амброзии - для грибного комарика;

в) способность экстрактов некоторых видов растений оказывать примерно одих{аковое отрицательное влияние на широкий круг представителей различных таксономических групп членистоногих.

В частности, наиболее широким спектром инсектоакарицидной активности среди оцениваемых экстрактов обладали экстракты ели европейской, вызывающие достаточно высокий уровень смертности всех тест-объектов. По этому показателю экстракты ели европейской приближаются к экстрактам нима, на основе которых уже создан ряд высокоэффективных препаратов.

Хроматографические анализы позволили связать широкий спектр активности экстрактов ели европейской с наличием ряда токсичных соединений из группы терпенов и сложных эфиров.

Таблица 1. Инсектоакарицидная активность 1% спиртовых экстрактов в отношении вредителей^защищенного грунта

Вид растения клещ паутинный трипе калифорнийский тля бахчевая тля злаковая тля гороховая грибной комарик оранжерейная бело-крылка (личинки)

Ель европейская ++ ++ 4-+ ++ ++ + +-Н-

Сныть обыкновенная ++ +++ ++ + +++ + ++

Одуванчик лекарственный ++ + - + +++ + +++

Полынь обыкновенная +++ ++ - ++ ++ +4- 0

Полынь горькая +++ ++ - + ++ - -

Амброзия полынолистная +++ ++ - + ++ +++ ++

Мать-и-мачеха +++ + ++ + ++ + -

Пижма обыкновенная +++ 0 - ++ +++ ++ -

Крестовник обыкновенный +++ ++ - ++ - - -

Коровяк черный ++ ++ + ++ ++ - +++

Гречишка сахалинская +++ 0 - 0 ++ - +++

Чистотел большой +++ ++ +++ + - - -

Лютик едкий ++ ++ +++ + - - -

Молочай лозный +++ +++ + - - -

Орляк обыкновенный +++ Н-+ +++ + - - -

Примечания: 0 - нет активности, + - следы активности (10-49% смертность), ++■ - смертность выше 50%, +++ - смертность выше 90%, - препарат не испытывался.

3.2. Влия-ние растительных препаратов на поведение насекомых

Скрининг растительных экстрактов на аттрактантную и ре-пеллентную активность проводили в условиях лабораторного эксперимента на имаго оранжерейной белокрылки и калифорнийского трипса.

Среди испытанных экстрактов, проявивших этот тип биологической активности, следует отметить ель европейскую, лабазник вязолистньш, лавр благородный, пижму обыкновенную, шалфей обыкновенный и хризантему.

Так при испытаниях на белокрылке наибольший репеллент-ный эффект вызывали спиртовые экстракты ели европейской. Обработка этим экстрактом листьев кормового растения (фасоли) более чем в 3 раза снижала их заселяемость самками белокрылки при продолжительности сохранения эффекта не менее 10 дней.

Выяснено, что репеллентным действием на трипса в условиях лабораторного скрининга характеризовалось эфирное масло пижмы.

Из числа высокоаттрактивных для имаго калифорнийского трипса экстрактов в порядке убывания их активности следует указать хризантему, лабазник, лавр и шалфей (табл. 2). При этом, как правило, входящие в состав экстрактов летучие соединения характеризовались заметно большей аттрактивной активностью, чем исходные экстракты.

Методом газохроматографического анализа показано, что основным общим компонентом летучих этих экстрактов является эв-калиптол (1,8-цинеол), составляющий от 10.8 до 40.1% их массы (табл.3).

Таблица 2. Сравнительная оценка аттрактивной активности растительных веществ для калифорнийского трипса

Ольфакгометрические показатели,

_% к контролю_

Вариант Время, проведен- Число первич-

ное насекомым в ных реакций на

обработанной зоне стимул

Эталон - бутон хризантемы 69.6 62.5*

Хризантема (гекс. экстракт) 86.1** 83.3"

Лабазник вязолистный (гекс. экстракт) 34.6 62.5*

Лабазник вязолистный (летучие) 68.4 25.0

Лавр благородный (летучие) 65.9* 87.5*

Шалфей обыкновенный (летучие) 47.1 25.0

Эвкалиптол - 1 мкг 38.3 25.0

Примечание: *Р>0.95; **Р>0.99.

В то же время по данным ольфактометрии и электроантенно-графии, чистый эвкалиптол вызывал меньшую ответную реакцию, чем сумма летучих веществ, выделяемых из этих растений. Это свидетельствует о важности наличия в составе летучих и других привлекающих веществ и об их суммарном действии, приводящем к повышению аттрактивности.

Соединение, показавшее наибольший электроантеннографиче-ский ответ, метилсалицилат, отпугивал калифорнийского трипса в дозировке 100 нг.

Таблица 3. Химический состав летучих соединений из растений (%)

Соединение Лабазник вязолистный Лавр благородный Шалфей обыкновенный

р-пинен <1 НГ/рЛ 0.5 0.9

(й)-Р-оцимен 1.5 - 2.2

1,8-цинеол 10.8 40.1 25.0

(эвкалиптол)

салициловый 7.1 - -

альдегид

(+/-)-камфора 9.9 <1 нг/рл 6.1

метилсалицилат 12.8 - -

гераниол <1 кг/рл - 12.3

(-)-а-копаен - 2.7 -

ацетат гераниола 5.0 30.5 -

(-)-Р-кариофиллен - 3.9 1.2

Подводя итог, следует отметить, что вещества с аттрактивными и репеллентными свойствами могут быть использованы для контроля над некоторыми видами насекомых в рамках так называемой "push-pull" стратегии, активно обсуждающейся в последнее время.

3.3. Антибиотическая активность растительных препаратов в отношении фитопатогенных бактерий и грибов Виды растений, экстракты которых проявили активность в отношение вредителей защищенного грунта, а также подобранные по литературным данным в качестве потенциальных источников препаратов против основных заболеваний культивируемых растений, были оценены на 7 видах бактерий и 7 видах грибов, являющихся возбудителями наиболее опасных заболеваний тепличных культур. В общей сложности был проведен скрининг 59 экстрактов 49 видов растений на фунгицидную и бактерицидную активность.

Девятнадцать видов растений проявили заметную антибиотическую активность, однако против таких тест-объектов, как Sclerotinia sclerotiorum и Botrytis cinerea испытанные растительные препараты оказались не эффективны. Большинство растительных экстрактов были эффективны против гриба VerticiUium dahliae и бактерии - Clavibacter rnichiganense (табл. 4). Широкий спектр активности характерен для ели европейской, лабазника вязолистного, полыни горькой, пиретрума щиткового. Некоторые из растительных экстрактов проявили избирательное действие на микробиологические объекты. Так, экстракты лютика едкого, цикория и крестовника обыкновенного проявили активность только в отношении Pseudomonas corrugata. Спиртовый экстракт одуванчика был высоко активен в отношении Bacyllus polymyxa, в отличие от всех испытанных экстрактов других видов растений.

Таблица 4. Биологическая эффективность 1% спиртовых экстрактов растений против возбудителей заболеваний

Зона иягибирования роста, мм

Вид растения Clavibac- Erwinia Verticil- Alternaria Erysiphe

ter rnichi- carotovora lium dah- solani cichorace-

ganense liae arum

Ель европейская 4,0 3,0 6,0 0,0 6,0

Лабазник вязолистный (в.-сп.эк.) 7,0 2,0 5,0 5,0 -

Амброзия полынолистная 6,0 4,0 0,0 0,0 7,0

Пиретрум щитковый 5,0 4,0 4,0 3,0 -

Полынь альпийская 3,0 5,0 2,5 0,0 -

Полынь горькая 3,0 4,0 4,0 3,0 -

Ноготки лекарственные 1,5 3,0 2,0 0,0 3,0

Коровяк черный (в.-сп.эк.) 6,0 0,0 0,0 5,0 3,0

Душевик крупноцветный 3,5 2,0 0,0 0,0 2,0

Ломонос жгучий 3,0 3,0 2,5 0,0 3,0

Примечания: в-сп. эк. - водно-спиртовый экстракт.

Из водно-спиртового экстракта лабазника вязолистного была выделена фракция с высокой активностью в отношение тех лее тест-объектов. Хроматографически было установлено присутствие веществ, идентичных по подвижности с веществами экстракта ели европейской, обуславливающих, предположительно, бактерицидную активность и относящихся к дитерпенам.

Ряд растительных экстрактов оценивали на возбудителях мучнистой росы огурца (садковый эксперимент) и антракноза тыквенных (лабораторный эксперимент). Оба объекта оказались достаточно устойчивы к действию ботанических фунгицидов. Наибольшую активность, определенную в условиях лабораторного и вегетационного экспериментов, по отношению к Erysiphe cichoracearum проявили экстракты ели европейской, хвоща полевого, чистотела большого, амброзии полынолистной и гречишки сахалинской, действуя на уровне эталона (Байлетон). Против Colletotrichum laginarium оказался эффективен только один препарат - 1% раствор спиртового экстракта сныти обыкновенной. На пятый день зона роста колонии гриба была меньше в три раза, чем в варианте с эталоном - Беноми-лом.

Таким образом, проведенный скрининг растительных экстрактов на их биологическую активность для основных вредителей и патогенов тепличных культур позволил определить круг растений, экстракты которых могут быть использованы для борьбы с этими объектами или послужить прототипами для создания на их основе новых средств защиты растений с разной степенью избирательности действия.

В частности, для борьбы с гороховой тлей могут быть созданы препараты на основе экстрактов сныти и одуванчика, против бахчевой тли - на основе чистотела, молочая или вероники, против паутинного клеща - на основе амброзии, мать-и-мачехи, полыни и ряда других экстрактов. Выявлено растение с репеллентной активностью в отношение белокрылки - ель европейская. Выраженная аттрак-тивность для калифорнийского трипса характерна для летучих лавра благородного и лабазника вязолистного. При создании препаратов против возбудителей заболеваний перспективны экстракты лабазника вязолистного, одуванчика (против Bacillus polymyxa), чистотела и хвоща (против мучнистой росы огурца), сныти обыкновенной - против Colletotrichum laginarium.

В то же время выявлены растения, экстракты которых характеризуются достаточно широким спектром биологической активности и могут послужить основой для создания препаратов комплекс-того действия. К числу таких растений в первую очередь относится ?ль европейская, которая и была выбрана для дальнейшей работы, «правленной на создание нового препарата.

Глава 4. ПОИСК И ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ХВОЙНЫХ

4.1. Биологически активные вещества с пестицидной активностью вечнозеленых и хвойных растений

Исследования пестицидной активности вечнозеленых растений, особенно хвойных, уже давно вызывают особый интерес, вследствие их широкой распространенности, доступности отходов лесоперерабатывающих производств, достаточно полной изученности химического состава продуктов переработки хвойной зелени. Вторичные метаболиты хвойных и вечнозеленых растений обуславливают высокую инсектицидную, антифидантную, фунгицидную и бактерицидную активности, что может быть положено в основу создания эффективных препаратов для защиты сельскохозяйственных культур от вредителей и заболеваний.

4.2. Выбор условий для экстракции и выделения активных начал из хвои ели европейской

Хвоя ели европейской была проэкстрагирована четырьмя растворителями с целью выбора экстрагента и режима экстракции дл? наиболее эффективного извлечения БАВ. Определение выхода продуктов и проверка экстрактов на биологическую активность по отношению к гороховой тле показали, что наиболее оптимальным растворителем является этанол. Хотя выход экстрактивных веществ з этом случае и не максимален, но биологическая эффективность экстракта гораздо выше, чем при использовании других растворителей Для выделения активных начал экстракт подвергали щелочном? гидролизу, что позволило разделить его на вещества липофильно] (нейтральная фракция) и гидрофильной природы (фракция кислот] Тестирование на двух видах вредителей (гороховая тля и паутин ный клещ) показало более высокую инсектицидную активность ; фракции нейтральных веществ (НВ), чем у исходного экстракта, чт может объясняться удалением неактивных примесей с фракцие кислот.

4.3. Фракционирование нейтральных веществ и биологическая оценка фракций

Для выявления биологически активных соединений выделе! ные нейтральные вещества фракционировали с помощью колоночной хроматографии в системе гексан-эфир с возрастающей поляры стью. В результате было получено 12 фракций. Упаренные фракцк № 2, 3, 4 с 1^=0.79-0.49 в системе гексан-эфир 4:1 в концентрат 0.1%, вызывающие гибель имаго гороховой тли - 86%, 81%, 94%, с< ответственно, объединяли. Вещества инсектицидной (объединенно; фракции (ИФ) были высоко активны при испытании и на личинк; оранжерейной белокрылки (84%), самках паутинного клеща и гор

ховой тли при действии 0.5% концентрации (100%). Бактерицидный тип активности был установлен для фракции, полученной объединением 6, 8 и 9 фракций (БФ), содержащих одно и то же вещество с Rf = 0.34 в системе гексан-эфир 4:1. Результаты оценки антибактериальных свойств фракции на возбудителях опасных заболеваний сельскохозяйственных культур показали, что наибольший эффект наблюдался против Erwinia carotovora, Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas corrugata и Clavibacter michiganense (зона ингибирова-ния роста - 5-8 мм). Обработка семян бактерицидной фракцией в концентрации 0.025% снижала пораженность проростков Erwinia carotovora в 11 раз, действуя на уровне эталона - ТМТД. Кроме того, бактерицидная фракция оказывала стимулирующее действие на рост и развитие томата в низких концентрациях, что выражалось в увеличении длины проростков.

При объединении инсектоакарицидной и бактерицидной фракций присущие им свойства заметно не изменялись, что предоставляет возможность создания как препаратов с высокой активностью против целого ряда вредителей или возбудителей заболеваний растений, так и препаратов комплексного действия, учитывая возможность одновременного наличия разного вида поражений растений защищенного грунта.

4.4. Разработка условий для получения препаратов с инсектоакарицидной и(или) бактерицидной активностью и биологическая оценка При подборе условий разделения HB варьировали параметры колонки, объем силикагеля, количество HB, наносимых на колонку, полярность системы растворителей в соответствии с теоретическими закономерностями, существующими между параметрами, - соотношение диаметра и высоты колонки (d/h), массы веществ, подвергаемых разделению, и массы адсорбента (Мнв/Мс), полярностью хро-матографической системы, определяющими качество разделения. Наиболее предпочтительным, оптимальным с точки зрения трудоемкости, затрат реактивов и времени, количества исходных веществ и выхода продукта является вариант с соотношением Мнв/Мс - 0.035, d/h - 1.25 и с хроматографической системой - 300 мл гексана; 200 мл 5% эфира в гексане, 400 мл 10% эфира в гексане, 200 мл 20% эфира в гексане, 200 мл 50% эфира в гексане, когда выход продукта составил 40% (ИФ) и 30% (БФ) от нейтральных веществ.

Испытания инсектицидной и бактерицидной фракций, полученных по разработанным методикам, в условиях садковых и вегетационных экспериментов подтвердили высокую биологическую активность препаратов, установленную в лабораторных экспериментах. При действии БАВ инсектицидной фракции (0.5% эмульсия) на паутинного клеща, персиковую тлю и оранжерейную белокрылку

(личинки) биологическая эффективность составила 75.6, 89.6 и 100%. соответственно. Инсектицидная фракция (1%) характеризовалась и высокой фунгицидной активностью в отношении возбудителя мучнистой росы огурца Егуз^ке cichoTa.cea.rum, снижая развитие болезни на 70%. Обработка БФ снижала процент поражения растений томатов бактериальным раком в 1.8 раза по сравнению с контролем, оказывая, кроме того, стимулирующее действие на рост и развитие растений.

4.5. Получение препарата с комплексной активностью и лабораторная оценка его эффективности

Разработка метода получения препарата путем разделения нейтральных веществ на колонках с силикагелем определялась задачей получения комплекса БАВ, обладающего одновременно инсек-тоакарицидной, фунгицидной, бактерицидной и рострегулирующей активностями, единой фракцией, без потери активности. Оптимальными условиями для получения препарата с комплексной активностью можно считать: Мнв/Мс - 0.025, ё/Ь - 1.25:1, хроматографиче-ская система - 300 мл гексана, 600 мл 20% эфира в гексане, когда выход продукта составил 68% от нейтральных веществ. Полная схема получения продукта приведена на рисунке 1. Из полученной смеси БАВ, была приготовлена препаративная форма в виде 0.5$ эмульсии с рН 6.0.

Лабораторные испытания препарата, получившего наименование "Комплексный", показали его высокую эффективность протиг гороховой и злаковой тлей, паутинного клеща и оранжерейной бело-крылки (табл.5). Наиболее эффективной концентрацией препарате "Комплексный" для борьбы с вредителями защищенного грунта является 0.5-процентная.

Таблица 5. Результаты лабораторных испытаний препарата "Комплексный"

Тест-объект Концентрация, % Смертность вредителя, % Биологическая эффективность,%

Гороховая тля (имаго) 0.5 93.8 ± 3.6* 93.8

0.1 38.3 ± 6.0* 38.3

Контроль 0 -

Паутинный клещ (самки) 0.5 85.0 ± 2.5* 80.0

0.1 52.0 + 3.3* 36.0

Контроль 25.0 ± 5.0 -

Большая злаковая тля (имаго) 0.5 87.2 + 12.8* 84.6

Контроль 16.9 ± 9.62 -

Оранжерейная белокрылка 0.5 78.6 ± 1.97* 69.9

(личинки) 0.1 56.64 ± 2.8 39.0

Контроль 28.8 ± 1.47 -

Развитие болезни, %

Егичпш сагаохюта 0.05 12.5 ± 7.22* 66.7

Контроль 37.5 ± 7.22 -

*Р>0.95.

Рис.1. Схема выделения Б AB с комплексной активностью из хвои ели европейской.

Испытания на фунгицидную и бактерицидную активность выявили активность препарата в отношении нескольких тест-объектов, выражающуюся в ингибировании роста патогена в радиусе 3-5 мм, -Botrytis cinerea, Alternaria solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Phamopsis species. Против Erwinia carotovora была эффективна 0.05% концентрация препарата. Стимулирующий эффект выражался в увеличении всхожести семян на 14% по сравнению с зараженным контролем.

4.6. Характеристика физических свойств и химического состава препарата "Комплексный"

Смесь веществ с комплексной активностью представляла собой масло оранжевого цвета с температурой плавления 8°С, температурой кипения 128°С, плотностью 0.53 г/см3, массовой долей органических веществ - 80.6%, определенными по стандартным методикам (Ермаков и др., 1987). С помощью тонкослойной и газовой хроматографии с использованием аутентичных стандартов в системах и на колонках разной полярности было установлено присутствие 6 основных компонентов. Среди них находятся камфора и 1,8-цинеол, в следовых количествах (<5%) идентифицированы а- и 3-пинены. камфен, лимонен, а- и (3- кариофиллены. Методами УФ-, ИК- и масс-спектрометрии установлено присутствие 1,2,3,4,5,6,7,8-октагидро-1,4-диметил-7-(1-метилэтиледен)азулена (А).

А Б

Бактерицидная фракция представлена 1-(2-метилпентен-2)-1,9-диметил-5,5-диметил-4,8-дегидронафталеном (Б).

4.7. Оценка биологической эффективности препарата "Комплексный" е условиях вегетационных, мелкоделяночных и производственных экспериментов

Вегетационные эксперименты подтвердили высокую эффективность препарата (0.5%) против паутинного клеща, личинок оранжерейной белокрылки и возбудителя мучнистой росы огурца. Более низкая активность препарата в отношении гороховой тли объясняется высоким биологическим потенциалом вредителя. Сравнительно низкая эффективность обработок 0.05% концентрацией "Комплексного" против возбудителя бактериального рака томата - 18.7% (16.9% в варианте с эталоном - гамаир) связана с жестким инфекционным фоном, но, несмотря на это, препарат обнаружил защитный эффект больший, чем у эталона (рис.2).

Мелкоделяночные и производственные испытания препарата "Комплексный" проводили на паутинном клеще (0.5%) и возбудителе бактериального рака томатов (0.0?5%).

Эффективность препарата при однократной обработке с уче-

том нарастания численности клещей в контроле хотя и уступала эталонам (Фитоверм и Пегас), но была достаточно высока. Так на 21 день в контроле число вредителей возросло в 18 раз, а в варианте с препаратом - снизилось в 1.75 раза, а в варианте с двукратной обработкой - биологическая эффективность достигала 100% и была сравнима с эталоном.

Распространение бактериального увядания снижалось в вариантах с препаратом и эталоном (Фитолавин) на 43.5%. Стимулирующее действие биопрепарата проявлялось в ускорении роста, массового цветения и плодоношения, увеличении количества сформированных кистей и плодов и, как следствие, в увеличении выхода готовой продукции на 0.6-1.1 кг/м2.

100 -|

£

А 80 -

Ь

X. го 60 -

г.

О •€у" 40 -

О

а * 20 -

3 0 -

о

о

ю

45,2

гороховая тля оранжерейная паутинный клещ бактериальный мучнистая роса белохрылка рак томата огурца

Рис.2. Результаты оценки действия препарата "Комплексный" на основные тест-объекты в условиях вегетационных испытаний

Таким образом, представленные результаты указывают на то, что полученный комплекс веществ из спиртового экстракта хвои ели европейской, на основе которого был создан препарат "Комплексный", обладает одновременно инсектицидной, акарицидной, фунги-цидной, бактерицидной и ростстимулирующей активностью. Вероятна возможность применения препарата против комплекса вредных объектов с целью получения более экологически чистой продукции.

ВЫВОДЫ

1. Способность высших растений продуцировать и накапливать биологически активные продукты вторичного обмена, выработанная в результате межвидовой коэволюции, является одним из механизмов обеспечения их защиты от вредных организмов и может быть использована при создании новых химических средств защиты растений.

2. Скрининг экстрактов 147 видов растений европейской флоры позволил выявить 25 видов - представителей семейств сложноцветных, сосновых, гречишных, зонтичных, норичниковых, маревых, лютиковых и молочайных, продуцирующих вещества из группы биологически активных вторичных метаболитов, на основе которых могут быть разработаны новые средства борьбы с вредителями и возбудителями заболеваний тепличных культур.

3. Испытываемые экстракты существенно различаются как по уровню, так и по спектру биологической активности для вредителей культур защищенного грунта. Наиболее высокой инсектоакарицид-ной активностью, практически для всех использованных тест-объектов, обладали экстракты ели европейской, сныти обыкновенной, коровяка черного и мать-и-мачехи, в то время как экстракты гречишки сахалинской и амброзии полынолистной характеризуются высокой видовой и онтогенетической селективностью действия.

4. Одновременно с веществами, обладающими высокой биологической активностью для насекомых, в составе экстрактов отдельных видов растений могут присутствовать и соединения, ингибирующие развитие патогенов. Показано, что наиболее широким спектром антибиотической активности обладают экстракты ели европейской и лабазника вязолистного, эффективно подавляющие развитие таких патогенов как Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas corrugata, Clavibacter michiganense, Ervrinia с arotovora, Alternaria solani, Verticillium dahliae, Fusarium culmorum, Erysiphe cichoracearum.

5. Инсектоакарицидные и фунгицидные свойства экстрактов хвои ели европейской в значительной степени обусловлены присутствием в их составе а- и ß-пиненов, камфена, лимонена, а- и ß-кариофилленов, 1,2,3,4,5,6,7,8-октагидро-1,4-диметил-7-(1-метил-этиледен) азулена. Основным действующим веществом, ответственным за бактерицидную активность является 1-(2-метилпентен-2)-1,9-диметил-5,5-диметил-4,8-дегидронафтален.

6. Наличие в экстрактах веществ, прямо подавляющих развитие вредных организмов может сопровождаться присутствием сигнальных веществ, влияющих на поведение насекомых и обладающих аттрактантной и репеллентной активностью, примером чему может служить репеллентное действие экстрактов ели европейской для оранжерейной белокрылки и аттрактивное действие экстрактов лабазника вязолистного для калифорнийского трипса.

7. Показано, что из экстрактов хвои ели европейской могут быть получены активные препараты для борьбы с рядом вредителей (ИФ) или возбудителей заболеваний растений (БФ). В то же время экстракты ели могут быть использованы и для получения препаратов комплексного действия.

8. На основе разработанных методик препаративного получения биопрепаратов из хвои ели европейской с инсектофунгицидной ак-

тивностью и с бактерицидной активностью, предложен способ получения препарата "Комплексный", сочетающего в своем составе вещества с инсектоакарицидной, фунгицидной и бактерицидной активностью, подтвержденный патентом РФ № 2154942.

9. Показано, что в условиях мелкоделяночных и производственных тепличных испытаний на овощных культурах препарат "Комплексный" демонстрирует удовлетворительную инсектоакари-цидную, бактерицидную и ростстимулирующуго активность, обладает высокой продолжительностью действия (1.5-2 месяца) и не оказывает фитотоксического действия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведенная работа позволяет сделать ряд обобщений, касающихся методических подходов к оценке биологической активности растительных экстрактов:

- скрининг экстрактов желательно проводить на возможно более широком круге тест-объектов из разных таксономических групп и на разных фазах их развития;

- в связи с разнообразной химической природой веществ растительного происхождения, для получения экстрактов имеет смысл использовать набор экстрагентов, позволяющий извлекать вещества с разной полярностью;

- в связи с многообразием возможных ответных реакций тест-объектов, оценку биологической активности целесообразно осуществлять по комплексу критериев, включающему оценку инсектоакарицидной, репеллентной, антифидантной, рострегулирующей и других видов активности.

2. Препарат из лабазника вязолисгного можно использовать для защиты растений томата от бактериальных заболеваний в закрытом грунте, включающей предпосевную обработку семян концентрацией препарата 0.05-0.1% и обработку растений после высадки в грунт 0.1% концентрацией препарата.

3. Препарат "Комплексный" и препарат инсектицидная фракция (ИФ) рекомендуется использовать в концентрации 0.5%, при данной препаративной форме, против вредителей защищенного грунта (двукратные обработки) и возбудителей мучнистой росы огурца (трехкратные обработки).

4. Для защиты культуры томатов от бактериального рака предлагается использовать препараты "Комплексный" и бактерицидная фракция (БФ) для предпосевной обработки семян томатов с последующими тремя опрыскиваниями растений - в фазе четырех настоящих листьев, в рассадный период через 3 недели после предыдущей обработки и через 10 дней после высадки в теплицу в концентрации 0.025 - 0.05%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сергеева М.Е., Конюхов В.П., Черменская Т.Д., Новикова И.И. Антибактериальная и антигрибная активность веществ растительного происхождения. /Всерос. съезд по защите растений. Тез. докл. -1995. -С.363.

2. Сундуков О.В., Филлипова В.А., Черменская Т.Д., Конюхов В.П. и др. Акарицидное действие экстрактов растений. /Всерос. Съезд по защите растений. Тез. докл. 1995. -С.465.

3. Черменская Т.Д., Быкова Г.А. Действие растительных препаратов лабазника вязолистного на развитие болезней томата. /Бюлл. ВИЗР. 1998. № 78-79. -С.41-44.

4. Черменская Т.Д., Сундуков О.В., Филлипова В.А. Влияние БАВ экстрактов растений избранных родов семейств Сложноцветных, Гречишных, Норичниковых на имаго паутинного клеща Tetranychus urticae Koch. /Материалы совещания "Поиск и использование биологически активных веществ в защите растений: состояние и перспективы". Тез. докл. С.-Петербург. 1998. -С.32.

5. Черменская Т.Д., Буров В.Н. Инсектициды растительного происхождения. /Агрохимия. 1998. № 11. -С.60-65.

6. Stepanycheva Е.А., Chermenskaya T.D., Burov V.N. Action of extracts a Picea excelsa L. on whitefly Trialeurodes vaporariorum Westw. /XlVth Plant Protection Congress, July 25-301999, Jerusalem. Abstract. 1999. -P.32.

7. Мокроусова Е.П., Черменская Т.Д. Ботанические пестициды против вредителей шампиньонов. /Arpo XXI. 1999. № 8. -С.20.

8. Черменская Т.Д. Биологически активные вещества ели европейской и сосны обыкновенной в защите растений. /Агрохимия. 1999. № 6. -С.61-65.

9. Черменская Т.Д. Роль биологически активных веществ растительного происхождения в защите растений. /Материалы симпозиума "Биологически активные вещества в защите растений". 30 августа - 4 сентября 1999 г., Анапа. С.-Петербург. 1999. -С.57-59.

10. Черменская Т.Д. Ботанические пестициды. Состояние и перспективы. Санкт-Петербург. 2000. -21 с.

11. Буров В.Н., Конюхов В.П., Черменская Т.Д., Новикова И.И., Быкова Г.А. Способ получения средства защиты растений из хвои ели европейской (Picea excelsa L.). -Патент РФ № 2154942,27.08.2000.- Бюлл. № 24,- заявл. 23.03.1999,- № 99105898.

12. Черменская Т.Д., Иванова Г.П., Буров В.Н., Сухорученко Г.И. Растительный препарат "Комплексный" для борьбы с вредителями защищенного грунта. /Тез. докл. "Биотехнологии - 2000". Пущино. 2000. -С.67-68.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черменская, Таисия Дмитриевна

Страницы

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. БОТАНИЧЕСКИЕ ПЕСТИЦИДЫ: СОСТОЯНИЕ И ПЕР

СПЕКТИВЫ. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Вторичные метаболиты высших растений и их роль во взаимоотно- 16 шении растение - насекомое.

1.1.1. Растительные метаболиты, влияющие на поведение насеко- 17 мых.

1.1.2. Токсическое и гормональное действие вторичных метаболитов 22 растений.

1.2. Антагонистическое действие вторичных метаболитов растений на микроорганизмы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ.

3.1. Воздействие растительных экстрактов на насекомых и клещей - 53 вредителей защищенного грунта.

3.2. Влияние растительных препаратов на поведение насекомых.

3.3. Антибиотическая активность растительных препаратов в отноше- 55 нии фитопатогенных бактерий и грибов.

ГЛАВА 4. ПОИСК И ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕ

ЩЕСТВ ИЗ ХВОЙНЫХ

4.1. Биологически активные вещества с пестицидной активностью веч- 75 нозеленых и хвойных растений.

4.2. Выбор условий для экстракции и выделения активных начал из хвои 79 ели европейской.

4.3. Фракционирование нейтральных веществ и биологическая оценка фракций.

4.4. Разработка условий для получения препаратов с инсектоакарицид- 85 ной активностью и бактерицидной активностью и биологическая оценка.

4.5. Получение препарата с комплексной активностью и лабораторная 90 оценка его эффективности.

4.6. Характеристика физических свойств и химического состава препа- 96 рата "Комплексный".

4.7. Оценка биологической эффективности препарата "Комплексный" в 101 условиях вегетационных, мелкоделяночных и производственных экспериментов.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Вторичные метаболиты растений и перспективы их использования при защите тепличных культур от вредителей и патогенов"

Характерной особенностью последних лет в области защиты растений является стремление к снижению отрицательного влияния хозяйственной деятельности человека на окружающую среду. Экологическая безопасность становится первоочередным требованием при проведении любых мероприятий, включая и использование химических средств защиты растений (ХСЗР). Именно этим объясняется вновь возросший интерес химиков и биологов, работающих в области создания новых пестицидов, к вторичным метаболитам природного происхождения, регулирующим многие биологические процессы в биоценозах.

Уже первые результаты работ в этом направлении не только свидетельствовали о возможности нахождения ряда принципиально новых групп молекул с высокой биологической активностью, но и показали возможность успешного создания на их основе высокоэффективных и экологически безопасных пестицидов.

Однако в пределах отдельных таксономических групп живых организмов большинство вторичных соединений имеет лишь ограниченное распространение. Они типичны для определенных семейств или даже родов, видов, подвидов (Благовещенский, 1966). Подавляющее большинство известных в настоящее время вторичных соединений было выделено из высших растений и микроорганизмов (Лукнер, 1978).

О существовании биологически активных веществ растительного происхождения, способных оказывать влияние на биологические объекты, человек знал еще с древности. Попытки использовать эти активные вещества для борьбы с вредными организмами, повреждающими сельскохозяйственные растения и хранящуюся продукцию, также предпринимались очень давно. Но только во второй половине нашего века, благодаря стремительному развитию химии природных соединений и биохимии, мир так называемых «вторичных соединений» значительно расширился.

Многие вторичные соединения принимают участие в экологических взаимосвязях между микроорганизмами, растениями и животными и играют важную роль в выработанных в процессе эволюции защитных механизмах растений, направленных на предотвращение их повреждений вредными организмами. Наиболее известные вторичные метаболиты - антибиотики, фитоалексины и патотоксины, растительные токсины, регуляторы роста и поведения, контролирующие внутривидовые и межвидовые связи в биоценозах.

Вторичные метаболиты используются в качестве аллелохимических агентов -веществ, способствующих взаимодействию между видами, и могут обладать активностью аттрактантов, репеллентов, антибиотиков и защитных веществ. Все эти вторичные соединения имеют особенно важное значение для взаимоотношений между организмами, приводящих к образованию характерных сообществ, где сосуществуют различные виды микроорганизмов, высших растений и животных характерным образом стимулируя или угнетая друг друга.

Выделяемые из растений биологически активные вещества (БАВ) могут быть или непосредственно использованы как природное сырье для создания новых химических препаратов, или, после идентификации их действующих веществ, служить основой для встречного синтеза и модификации активных молекул (Balan-drin, 1985; Einhellig, 1985; Strunz, Finlay, 1994). В частности, именно растительные БАВ послужили прототипами при создании таких широко применяемых групп пестицидов, как пиретроиды и органические карбаматы. В последнее время по тому же пути ведется создание препаратов на основе встречного синтеза терпеноидов, хроменов и азадирахтинов, обнаруженных ранее у представителей тропической и субтропической флоры и относящихся к "пестицидам третьей генерации" -регуляторам роста и развития насекомых.

Повышенный интерес к БАВ объясняется, в первую очередь, острой необходимостью найти удовлетворительную в экотоксикологическом отношении замену традиционным пестицидам, применяемым для борьбы с вредными объектами. При этом предполагается, что на основе растительных метаболитов могут быть созданы как препараты, характеризующиеся высокой избирательностью действия на целевые объекты, так и ХСЗР, обладающие не только более широким спектром действия, но и сочетающие в себе несколько типов биологической активности, т.е. одновременно обладающие инсектоакарицидной, фунгицидной, ростстимулирующей и/или другими типами активности (Буров, Сазонов, 1987). Особенно широкое применение препараты этого типа могут найти при работе в защищенном грунте, где интенсивно используются биологические агенты и ограниченно применение традиционных пестицидов.

Цель диссертационной работы - оценка возможности создания эффективных средств защиты тепличных культур от вредных организмов на основе Б AB, продуцируемых растениями местной флоры.

В задачу исследований входило:

- первичный скрининг растительных экстрактов на выявление типа биологической активности;

- лабораторная оценка отобранных экстрактов по спектрам и уровню активности для тест-объектов;

- характеристика химического состава наиболее перспективных препаратов и разработка лабораторного метода их препаративного получения;

- оценка эффективности препаратов в условиях вегетационных, мелкоделяночных и производственных испытаний.

Научная новизна

Среди 147 испытанных растений выявлено 125 видов - продуцентов Б AB, в разной степени подавляющих развитие вредителей и болезней тепличных культур.

В том числе:

- с инсектоакарицидной активностью - 100 видов;

- с фунгицидной и бактерицидной активностью - 37 видов;

- влияющих на поведение насекомых (репеллентная, аттрактантная активности)

- 6 видов.

Показано, что экстракты ели европейской Picea excelsa L. обладают комплексной биологической активностью для основных вредителей и возбудителей заболеваний тепличных культур.

Методами УФ-, ИК- и масс-спектрометрии установлено, что в препарате с инсектоакарицидной и фунгицидной активностью присутствуют: а- и ß-пинены, камфен, лимонен, а- и ß- кариофиллены (в следовых количествах), 1,2,3,4,5,6,7,8-октагидро-1,4-диметил-7-( 1 -метилэтиледен)азулен.

Основным действующим веществом, ответственным за бактерицидную активность является 1 -(2-метилпентен-2)-1,9-диметил-5,5-диметил-4,8дегидронафтален.

Практическая ценность

Определен список растительных видов, перспективных для выделения и идентификации БАВ - возможных прототипов новых ХСЗР.

Разработаны лабораторные методики препаративного получения биопрепаратов с инсектофунгицидной, бактерицидной активностью и препарата "Комплексный" на основе БАВ из хвои ели европейской для использования в защищенном грунте. На основе результатов проведенных исследований начато составление лабораторного регламента получения биопрепарата "Комплексный".

Получен патент РФ № 2154942 на изобретение: "Способ получения средства защиты растений из хвои Picea excelsa L."

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на совещании "Поиск и использование биологически активных веществ в защите растений: состояние и перспективы" (г. Санкт-Петербург, ВИЗР, 1998); отчетно-плановой сессии ВИЗР (г. Санкт-Петербург, ВИЗР, 1999 г.); XIVth Plant Protection Congress (Jerusalem, July 2530, 1999); симпозиуме МОББ "Биологически активные вещества в защите растений" (г. Анапа, 30 августа - 4 сентября 1999 г.); семинаре - презентации "Биотехнология -2000" (г. Пущино, 26-28 сентября 2000 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Черменская, Таисия Дмитриевна

ВЫВОДЫ

1. Скрининг экстрактов 147 видов растений европейской флоры позволил выявить 25 видов - представителей семейств сложноцветных, сосновых, гречишных, зонтичных, норичниковых, маревых, лютиковых и молочайных, продуцирующих вещества из группы биологически активных вторичных метаболитов, на основе которых могут быть разработаны новые средства борьбы с вредителями и возбудителями заболеваний тепличных культур.

2. Испытываемые экстракты существенно различаются как по уровню, так и по спектру биологической активности для вредителей культур защищенного грунта. Наиболее высокой инсектоакарицидной активностью, практически для всех использованных тест-объектов, обладали экстракты ели европейской, сныти обыкновенной, коровяка черного и мать-и-мачехи, в то время как экстракты гречишки сахалинской и амброзии полынолистной характеризуются высокой видовой и онтогенетической селективностью действия.

3. Одновременно с веществами, обладающими высокой биологической активностью для насекомых, в составе экстрактов отдельных видов растений могут присутствовать и соединения, ингибирующие развитие патогенов. Показано, что наиболее широким спектром антагонистической активности обладают экстракты ели европейской и лабазника вязолистного, эффективно подавляющие развитие таких патогенов как Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas- corrugata, Clavibacter michiganense, Erwinia carotovora, Alternaria solani, Verticillium dahliae, Fusarium culmorum, Erysiphe cichoracearum.

4. Инсектоакарицидные и фунгицидные свойства экстрактов хвои ели европейской в значительной степени обусловлены присутствием в их составе: а- и ß-пиненов, камфена, лимонена, а- и ß- кариофилленов, 1,2,3,4,5,6,7,8-октагидро-1,4-диметил-7-(1-метилэтиледен) азулена. Основным действующим веществом, ответственным за бактерицидную активность является 1-(2-метилпентен-2)-1,9-диметил-5,5-диметил-4,8-дегидронафтален.

110

5. Наличие в экстрактах веществ, подавляющих развитие вредных организмов может сопровождаться присутствием сигнальных веществ, влияющих на поведение насекомых и обладающих аттрактантной и репеллентной активностью, примером чему может служить репеллентное действие экстрактов ели европейской для оранжерейной белокрылки и аттрактивное действие экстрактов лабазника вязолист-ного для калифорнийского трипса.

6. Показано, что из экстрактов хвои ели европейской могут быть получены активные препараты в отношение целого ряда вредителей растений (ИФ) или возбудителей их заболеваний (БФ). В то же время экстракты ели могут быть использованы и для получения препаратов комплексного действия.

7. На основе разработанных методик препаративного получения биопрепаратов из хвои ели европейской с инсектофунгицидной активностью и с бактерицидной активностью, предложен способ получения препарата "Комплексный", сочетающего в своем составе вещества с инсектоакарицидной, фунгицидной и бактерицидной активностью, подтвержденный патентом РФ № 2154942.

8. Показано, что в условиях мелкоделяночных и производственных тепличных испытаний на овощных культурах препарат "Комплексный" демонстрирует инсектоакарицидную, бактерицидную и ростстимулирующую активность, обладает высокой продолжительностью действия (1,5-2 месяца) и не оказывает фитотоксиче-ского действия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проведенная работа позволяет сделать ряд обобщений, касающихся методических подходов к оценке биологической активности растительных экстрактов:

- скрининг экстрактов желательно проводить на возможно более широком круге тест-объектов из разных таксономических групп и на разных фазах их развития;

- в связи с разнообразной химической природой веществ растительного происхождения, для получения экстрактов имеет смысл использовать набор экстрагентов, позволяющий извлекать вещества с разной полярностью;

- в связи с многообразием возможных ответных реакций тест-объектов, оценку биологической активности целесообразно осуществлять по комплексу критериев, включающему оценку инсектоакарицидной, репеллент-ной, антифидантной, рострегулирующей и другим видам активности.

2. Препарат из лабазника вязолистного можно использовать для защиты растений томата от бактериальных заболеваний в защищенном грунте, включающей предпосевную обработку семян концентрацией препарата 0,05 - 0,1 % и обработку растений после высадки в грунт 0,1 % концентрацией препарата.

3. Препарат "Комплексный" и препарат инсектицидная фракция (ИФ) рекомендуется использовать в концентрации 0,5 %, при данной препаративной форме, против вредителей защищенного грунта (двукратные обработки) и возбудителей мучнистой росы огурца (трехкратные обработки).

4. Для защиты культуры томатов от бактериального рака предлагается использовать препараты "Комплексный" и бактерицидная фракция (БФ) для предпосевной обработки семян томатов с последующими тремя опрыскиваниями растений - в фазе четырех настоящих листьев, в рассадный период через 3 недели после предыдущей обработки и через 10 дней после высадки в теплицу в концентрации 0,025 - 0,05 %.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Черменская, Таисия Дмитриевна, Санкт-Петербург-Пушкин

1. Анисимова О.С., Линберг Л.Ф., Шейнкер Ю.Н. Масс-спектрометрия в исследовании метаболизма лекарственных препаратов.// М.: Медицина, 1978. 168 с.

2. Благовещенский A.B. Биохимическая эволюция цветковых растений.// М.: Наука, 1966. 328 с.

3. Бонева И., Николов А., Андреев Р., Узунова К. Ефективност на растителни ек-стракти по отношение на тютюневия трипе Thrips tabaci.// Растен. Науки. 1994. Г. 31. №5/6. С. 166-169.

4. Бранд Дж., Эглинтон Г. Инфракрасная спектроскопия.// Применение спектроскопии в органической химии. М.: Мир, 1967. С. 116-129.

5. Будзикевич Г., Джерасси К., Уильяме Д. Интерпретация масс-спектров органических соединений.// М.: Мир, 1966. 324 с.

6. Буров В.Н. Методы испытаний гормональных препаратов (регуляторов роста, развития и размножения насекомых).// Л.,1984. 34 с.

7. Буров В.Н., Сазонов А.П. Биологически активные вещества в защите растений.// М.: ВО "Агропромиздат", 1987. 200 с.

8. Вилкова H.A. Физиологические основы теории устойчивости растений к насекомым.//Автореф. дисс. д. б. н. Л., 1979. 49 с.

9. Ганя А.И., Кинтя П.К., Джугостран Н.Д., Ткаченко Н.П. Способ внекорневой обработки растений сои.// Заявл. 02.09.91. опубл. 15.10.94. Бюлл. № 19.

10. Гешч Г.Я., Лазна Л.Я. Фитсшмична дослщженя гадючника вязолистного шес-типолюскового флори Льв1вськой область// Фарм. журн. 1980. № 1. С. 50-52.

11. Голдовский A.M. Закон множественности представителей отдельных групп веществ в растительном организме.// Успехи совр. биол. 1941. Т. 14. С. 140.

12. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: в 2-х т.// М.: Мир, 1986.

13. Давидюк Л.П., Бескаравайная М.А., Хорт Т.П., Вшивкова Г.Ф. Антифунгаль-ные вещества представителей сем. Лютиковых и новые области их использования.// Сб. научн. тр. Гос. Никит. Ботан. Сада. 1989. № 109. С. 53-62.

14. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. и др. Методы биохимического исследования растений.// Л.: Агропромиздат, 1987.430 с.

15. Зибарева Л.Н., Еремина В.И., Иванова H.A. Новые экдистероидные виды рода Silene L. и динамика содержания в них экдистерона.// Растит, ресурсы. 1997. Т. 33. Вып. 3. С. 73-76.

16. Иванова А.Н., Павлючук М.В. Фитогормоны в защите растений.// Защита раст. от вредителей, болезней и сорной растительности. Ставроп. с.-х. ин-т.: Ставрополь, 1990. С. 49-54.

17. Иванова A.M. Влияние некоторых растений из сем. Губоцветных и норичниковых на грибы рода Fusarium.// Тез. докл. Всес. научн. конф. "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". Пущино, 1992. С. 70-71.

18. Инге-Вечтомов С.Г. Метаболизм стеринов и защита растений.// Соросовский образовательный журнал. 1997. №11. С.16-21.

19. Кадум И., Матвеева А. Изучение биологической активности некоторых экстрактов в отношении личинок колорадского жука.// Научн. труды Висш. селскостоп. инст. Пловдив, 1993. Т. 38. Кн. 3. С. 1Й-120.

20. Казарновский Л.С., Каравай Н.Я., Лазарева К.В. Выделение и изучение действующих веществ из растений лабазника.// Тр. Харьк. фарм. ин-та. 1962. № 2. С. 1214.

21. Красильников H.A. Актиномицеты антагонисты и антибиотические вещества.// Изд-вЪ АН СССР: Москва, 1950. Ленинград. С. 90.

22. Кузнецов А.И., Алейникова Л.И. Средство для борьбы с мучнистой росой роз.// Патент № 1477357. Опубл. 07.05.1989. Бюлл. № 17.

23. Логинова Е., Бозов П., Папанов Г., Малаков П. Биологическая активность растительных продуктов в отношение вредителей культур закрытого грунта.// Научн. тр. Висш. селскостоп. инст. Пловдив. 1993. Т. 38. Кн. 3. С. 125-128.

24. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных.// M.: Мир, 1978. 548 с.

25. Лутова Л.А., Левашина Е.А., Бондаренко Л.В. и др. Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов.// Генетика. 1992. Т. 28. Вып. 2. С. 129-136.

26. Марьина М.С., Пименов К.С., Куркина A.B., Мыцык A.B., Запесочная Г.Г., Куркин В.А. Флавоноиды надземной части Artemisia dranunculus L., культивируемой в Самарской области.// Растительные ресурсы. 1996. Т. 32. Вып. 1-2. С. 88-92.

27. Николов А., Бонева И., Андреев Р., Христова Д. Възможности за използване вещества от растителен произход за борба срещу Myzodes persicae Sultz по тютюна.// Растен. Науки. 1994. Г. 31. № 5/6. С. 162-165.

28. Новожилов К.В., Рощин В.И.,'^Смирнова И.М., Розова В.Н., Федорова С.П. Биопестициды на основе продуктов переработки древесной зелени хвойных пород.// Агрохимия. 1994. № 7-8. С. 68-76.

29. Ошкаев А.Х. Использование БАВ хвойных деревьев для защиты леса от насекомых.// Автореф. дисс. к. б. н. Л., 1979. 20 с.

30. Подчайнов С.Ф., Круглова Т.А., Кирова Л.С., Шалатилова А.Г. и др. Антимольное средство.//Патент № 2028055.

31. Поливанова E.H. Специфика развития Myzus persicae (Homoptera, aphididae) на растениях, синтезирующих ингибиторы ювенильного гормона насекомых прекоце-ны.// Зоол. журн. 1997. Т. 76. Вып. 7. С. 777-784.

32. Попова И.В. Использование растительных экстрактов в защите сахарной свеклы от болезней.- Эффективные меры борьбы с болезнями и вредителями при интенсивных технологиях возделывания сахарной свеклы.// ВНИИ сах. свеклы. Киев, 1990. С. 66-70.

33. Потекушина И.В., Ткаченко К.Г. Антибиотическое действие препаратов борщевиков на бактериальных возбудителей мокрых гнилей.// Тр. 3 молодежной конференции ботаников г. Ленинграда- Ч. 4. БИН АН СССР. Л., 1990. С. 4-9.

34. Рожков A.C., Массель Г.И. Смолистые вещества хвойных и насекомые кси-лофаги.//Новосибирск: Наука, 1982. 148 с.

35. Рощин В.И., Баранова P.A., Белозерских O.A., Соловьев В.А. Состав экстрактивных веществ хвои и побегов ели европейской.// Химия древесины. 1983. № 4. С. 56-61.

36. Рощин В.И., Баранова Р?А., Соловьев В.А. Терпеноиды хвои Picea abies.// Химия прир. соед. 1986. Т. 2. С. 168-176.

37. Рощин В.И., Смирнова И.М., Федорова С.П., Новожилов К.В., Никанорова Е.В., Поверинова О.Ю., Пиннэ В.Я., Гилуча А .Я. Средство защиты растений от вредных насекомых.// Патент № 1687196. Заявл. 17.05.89. Опубл. 30.10.91. Бюлл. № 40.

38. Семаков В.В. Эффективность использования экстарктов хвойной зелени в защите растений от сельскохозяйственных вредителей.// Вестник с.-х. науки. М., 1990. Т. 11.С. 142-144.

39. Смёлянец В.П., Кузнецов Н.В. О токсичности некоторых терпеновых соединений.// Химия в сельском хозяйстве. 1968. Т. 6. Вып. 10. С. 34-35.

40. Смелянец В.П. Экологические закономерности формирования устойчивых к насекомым фитофагам насаждений сосны.// Автореф. дисс. д. б. н. Л., 1987. 38 с.

41. Стадницкий Г.В. Средство для защиты растений от насекомых-вредителей.// Патент № 577714. Опубл. 30.10.78.- Бюлл. № 40.

42. Стадницкий Г.В., Ошкаев А.Х. Природные инсектициды.// Защита растений. 1986. №5. С. 29.

43. Сушин В. Народные средства защиты растений.// Садоводство. 1976. № 11. С.40.41.

44. Тайсе сэйяку К.К. Экстракция эфирных масел из хвои японской и тигровой ели.// Яп. патент N49-6917. заяв. 11.09.70. опуб. 16.02.74.

45. Тарлаковский С.А. Стерины: Из метаболизм, функции и роль во взаимоотношениях растений и вредных организмов.// Тр. Всесоюз. НИИ защиты растений. 1977. Вып. 52. С. 53-65.

46. Токин Б.П. Бактерициды растительного происхождния (фитонциды).// М.: Медгиз, 1942.

47. Тютерев С.Л. Научные основы использования химических активаторов болезнеустойчивости в защите растений от патогенов.// Автореф. дисс. д. б. н. Санкт-Петербург Пушкин, 1999. 54 с.

48. Харборн Дж. Введение в экологическую биохимию.//М.: Мир, 1985. 312 с.

49. Чекуров В.М., Колотыгин А.И., Ралдугин В.А., Шевцов С.А. и др. Способ борьбы с вилтом хлопчатника.// Патент № 2025976. Опубл. 10.01.95. Бюлл. № 1.

50. Чекуров В.М., Козлов В.Е., Сергеева С.И., Титков И.П., Сычев И.П., Ралдугин В.А. Высокоэффективный натуральный биопрепарат Силк.// Научн. прикл. разраб. (Генетика, селекция, биотехнология). Ин-т цитологии и генетики СОР АН. Новосибирск, 1997. С. 78-79.

51. Чхиквишвили И.Д., Гогия Н.Н. Флавоноиды лтходов плодов мандарина и их фунгистатическая активность в отношении Phoma tracheiphila.// Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31. Вып. 3. С. 341-345.

52. Abdel-Muety Е.М. New products from lipids: cyclopentenyl fatty, acids as starting materials.// Grasas aceites. 1989. V. 40. P. 15-21.

53. Abivardi C., Benz G. Effect of bisabolangelone on development of Cydia pomonella larvae and oviposition of the females.// Entomol. exper. appl. 1995. V. 75. № 3. P. 193-201.

54. Achremowicz J. Badania nowych aficydow pochodzenia roslinnego.// Pestycydy. 1995. № 4. P. 27-36.

55. Alkofashi A., Rupprecht J.K., Anderson J.E., McLaughlin J.L. Search for new pesticides from higher plants.// Insecticides of plant origin. American Chemical Society, 1989. P. 25-43.

56. Arnason J.T, Fortier G., Champagne D., Philogene B.J.R. Les substances secondaires des plantes et leur action phototoxique sur les insectes.// Rev. can. biol. exp. 1983. V. 42. № 2. P. 205-208.

57. Ascher K.R.S. Plant-derived insect antifeedants: problems and prospects.// Intern. Pest Control. 1987. V. 29. №6. P. 131-133.

58. Ascher K.R.S., Klein M., Meisner Y. Azatin, a neem formulation, act on nymphs of the Western flower thrips.// Phytoparasitica. 1992. V. 20. № 4. P. 305-306.

59. Balandrin M., Kloke J., Wurtele E.S., Bollinger W.H. Natural plant chemicals: source of industrial and medicinal materials.// Science. 1985. V. 228. P. 1154-1160.

60. Barczak T. Wplyw wyciagow z roslin z rogziny rdestowatych na mszyce burakowa (Aphis fabae Scop.) i jej parazytoidi.// Przyrodnicze i antropogeniczne uwarunkowania pro-dukcyjnosci gleb czarnoziemnych i plowych. Warsawa, 1994. P. 245-252.

61. Baumeler A., Hesse M., Werner C. Benzoxazinoids-cyclic hydroxamic acids, lactams and their corresponding glucosides in the genus Aphelandra (Acanthaceae)// Phyto-chemistry. 2000. V. 53. № 2. P. 213-222.

62. Bentley Reynolds E.K., Leach S., Beck A.B., Murakoshi I. Lupine alkaloids as larval feeding deterrents for spruce budworm Choristoneura fumiferana (Lepidoptera: Torttrici-dae).// Ann. Entomol. Soc. Amer. 1984. V. 77. № 4. P. 398-400.

63. Bentley M.D., Leonard D.E., Bushway R.J. Solanum alkaloids as larval feeding deterrents for spruce budworm Choristoneura fumiferana (Lepidoptera: Torttricidae).// Ann. Entomol. Soc. Amer. 1984. V. 77. № 4. P. 401-403.

64. Berenbaum M.R. Phototoxicity in Rutaceae variations on a theme.// Proc. 18th Int. Congr. Entomol. Vancouver, 1988. P. 102.

65. Berenbaum M. Phototoxicity of plant secondary metabolites: Insect and mammalian perspectives.// Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1995. V. 29. № 2. P. 119-134.

66. Bohlin L., Thorsell W., Tunon H. Mosquito repelling activity of compounds occurring in Achillea millefolium L. (Asteraceae).// Econ. Bot.1994. Vol. 48. № 2. P. 111-120.

67. Boshard E. Effect of ivy (Hedera helix) leaf extract against apple scab and mildew.// Pap. Int. Symp. Integr. Plant Prot. Orchards (ISIPPO). Acta phytopathol. et entomol. Hung. 1992. V. 27. № 1-4. Pt 1. P. 135-140.

68. Bowers W.S. Anti-juvenile hormones from plants: chemistry and biological activity.// Pontif. Acad. Sci. Scr. Varia. 1977. № 41. P. 129-156.

69. Bowers W.S. Phytochemical disruption of insect development and behaviour.// Bioregulators for Pest Control. ACS Symposium Series. Washington: D.C., 1985. P. 225-237.

70. Brunke, E.-J., Hammerschmidt, F.-J., and Schmaus G. Flower scent of some traditional medicinal plants.// ACS Symposium Series. 1993. V. 525. P. 282-296.

71. Catalogue. Eight Peak Index of Mass Spectra. 1983. V. 2. P. 1.

72. Cambier V., Hance T., Hoffman E. Variation of DIMBOA and related compounds content in relation to the age and plant organ in maize// Phytochemistry. 2000. V. 53. № 2. P. 223-229.

73. Ceska O., Chaudhary S.K., Warrington P.J., Ashwood-Smith M.J. Coumarins of chamomila, Chamomila recutita.// Fitoterapia. 1992. V. 63. № 5. P. 387-394.

74. Chakraborty A., Saha C., Podder G., Chowdhury B.K., Bhattacharyy A.P. Carbazole alkaloid with antimicrobial activity from Clausena heptaphylla.// Phytochemistry. 1995. V. 38. №3. P. 787-789.

75. Chen X.H. Studies on the relationship between the different terpenoids contents of pine needles and the development of the pine cafer Dendrolimus punetatus Walker.//19 Int. Congr. Entomol. Beijing. Proc. Abstr. Beijing, 1992. P. 220.

76. Chen C.-C., Chang S.-J., Cheng L.-I., Hou R.F. Deterrent effect of the chinaberry extract on oviposition of the diamondback moth, Plutella xylostella L. (Lepidoptera: Ypo-noneutidae).// J. Appl. Entomol. 1996. V. 120. № 3. P. 165-169.

77. Cunat P., Primo E., Sanz I., Gancera M.D., March M.C., Bowers W.S., Martin E.-P. R. Biocidal activity of some spanish mediterranean plants.// J. Agr. and Food. Chem. 1990. V. 38. №2. P. 497-500.

78. Daayf F., Schmitt A., Belanger R.R. The effects of plant extracts of Reynoutria sa-chalinensis on powdery mildew development and leaf physiology of long English cucumber.// Plant Dis. 1995. V. 79. № 6. P. 577-580.

79. Daido M., Fukamiya N., Okano M., Tagahara K., Hatakoshi M., Yamazaki H. An-tiffedat and insecticidal activity of quassinoids against diamondback moth (Plutella xylostella).// Biosc. Biotechnol. Biochem. 1993. V. 57. № 2. P. 244-246.

80. Dayrit E.M., Trono C.M., Morallo-Rejesus B., Maini M. Anti-pest compounds from the volatile oil of Vitex negundo Linn.//Philipp. J. Sci. 1995. V. 124. № 1. P. 25-27.

81. Delle M.F., Marini B.G.B., Bernays E.A. Isolation of insect antifeedant alkaloids from Maytenus rígida (Celastraceae).// Z. angew. Entomol. 1984. V. 97. № 4. P. 406-414.

82. Dethier V.G., Browne L.B., Smith C.N. The designation of chemicals in terms of the responses they elicit from insects.// J. Econ. Ent. 1960. V. 53. P. 134-136.

83. Dethier V.G. Chemical interactions between plants and insects// Chemical Ecology. New York: Acad. Press, 1972. P. 83-102.

84. Dhadialla T.S., Carlson G.K., Dat P.L. New insecticides with ecdysteroidal and juvenile hormone activity.// Annu. Rev. Entomol. 1998. V. 43. P. 545-569.

85. Diaz P.R., Tun D.J., Pina RJ. Evaluación de infusiones vegetales para el control de virosis transmitidas por mosca blanca// Rep. 4 Taller Latinoamer. Moscas Blancas y Gemi-nivirus Zamorano. Ceiba. 1995. V. 36. № 1. P. 131.

86. Dixii V.K. Insect repellent and juvenile hormone activity of essential oil of Iridax procombens Linn.// Indian Drugs. 1989. V. 27. № 1. P. 72-73.

87. Doederlein T.A., Sites R.W. Host plant preferences of Frankliniella occidentalis and Thrips tabaci (Thysanoptera: Thripidae) for onions and associated weeds on the southern high plains.// J. Econ. Entomol. 1993. V. 86. P. 1706-1713.

88. Edwards M.K. The antiviral effects of Chelidonium majus.// Junge Wiss. 1994. V. 9. №33. P. 50-53.

89. Ehrlich P.R., Raven P.H. Butterflies and plants: a study in co-evolution.// Evolution. 1965. № 18. P. 586-608.

90. Einhellig F.A. Effect of allelopathic chemicals on crop productivity.// ACS Symposium Series. Washington: D.C., 1985. P. 108-121.

91. Eisner T. Catnip: its raison d'etre.// Science. 1964. V. 146. P. 1318-1320.

92. Elmer W.H., Mattina M.J.I., MacÉachern GJ. Sensitivity of plant pathogenic fungi to taxane extracts from ornamental yews.// Phytopathology. 1994. V. 84. № 10. P. 11791185.

93. Ekman R., Peltonen C., Hirvonen P. Distribution and seasonal changes of extractive substances from Norwegian fir.// Acta Acad. Aboemn. 1979. B. 39. № 8. 286. P. 1-26.

94. Escóubas P., Lajide L., Mizutani J. Termite antifeedant activity in Aframomum me-legueta.// Phytochemistry. 1995. V. 40. № 4. P. 1097-1099.

95. Fernandez L., Swain L., Downum K.R. Toxicological mechanism of alpha-terthienyl action on Manduca sexta (L.) (Sphingidae).// Proc. 18th Int. Congr. Entomol. Vancouver, 1988. P. 102.

96. Florkin M. Aspects moléculaires de l'adaptation et de la phylogenie.// Collection GPB. № 2. Masson, Paris, 1966.259 p.

97. Freedman B., Reed D.K., Powell R.G., Madrigal R.V., Smith C.R., Jr. Biological activities of Trewia nudiflora extracts against certain economically important insect pests.// J. Chem. Ecol. 1982. V. 8. № 2. P. 409-418.

98. Frey M., Chomet P., Glawischnig E., Stettner C., Grün S., Winklmair A., Eisenreich W., Bacher A., Meeley R.B., Briggs S.P., Simcox K., Gierl A. Analysis of a chemical plant defense mechanism in grasses.// Science. 1997. V. 277. №. 5326. P. 696-699.

99. Giga D.P., Munetsi M.M. The effectiveness of vegetable and citrus oils as protectans of cowpeas against infestations by Callosobruchus rhodesianus (Pic.).// Plant Protect. Q. 1990. V. 5. №4. P. 148-151.

100. Ginesta E., Primo J., Cunat P. Compuestos con actividad ovicida aislados de Juniperus thurifera L.// Rev. agroquim. y technol. alim. 1986. V. 26. № 2. P. 304-307.

101. Godfrug C.R.A. Agrochemicals from natural products.// New York, Basel, Hong Kong, 1995.418 p.

102. Gonzales-Coloma A., Gutierrez C., Cabrera R., Reina M. Silphinene derivatives: Their effects and modes of action on Colorado potato beetle.// J. Agr. and Food Chem. 1997. V. 45. №3. P. 946-950.

103. Guerin P.M., Stadler E., Buser H.R. Identification of host plant attractants for the carrot fly, Psila rosae.// J. Chem. Ecol. 1983. V. 9. № 7. P. 843-861.

104. Hare J.D. Bioassays methods with terrestrial invertebrates.// Methods in chemical ecology. Bioassays methods. V. 2. Chapman and Hall, 1998. P. 213-270.

105. Herger G., Harvey I., Jenkins T., Alexander R. Control of powdery mildew of grapes with plant extracts// Proc. 42nd N. Z. Weed and Pest Control Conf.1989. P.178-181.

106. Hooper A.M., Bennison J.A., Luszniak M.C., Pickett J.A., Pow E.M., Wadhams L.J. Verbena X hybrida flower volatiles attractive to Western flower thrips, Frankliniella occidentalism/ Pestic Sei. 1999. V. 55. P. 660-662.

107. Hough-Goldstein J.A. Antifeedant effects of common herbs on the Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae).//Environm. Entomol. 1990. V. 19. P. 234-238.

108. Jacobson M. Isolation and identification of toxic agents from plants// Host plant resistance to pests. American Chemical Society, 1977. P. 153-164.

109. Jacobson M. Botanical pesticides. Past, present and future// Insecticides of Plant

110. Origin. Washington: Amer. Chem. Soc., 1989. P. 1-10.

111. Johri J.K., Balasubrahmanyam V.R., Misra G., Nigam S.K. Botanicals for management of betelvine diseases.// Nat. Acad. Sci. Lett. 1994. V. 17. № 1-2. P. 7-8.

112. Kaplan D.T., Keen N.T., Thomason I.J. Association of glyceollin with the incompatible response of soybean roots to Meloidogyne incognita. Physiol. Plant. Pathol. 1980. V. 16. P. 309-318.

113. Karadzhova Y., Mladenov M., Gyaourov E. Effect of higher plants juice on mycelium development and spores germination of some Fusarium genus species and Pseudocer-cosporella herpotrichoides.// Докл. Бълг. АН. 1995. Т. 48. № 1. P. 105-107.

114. Kirk W.D.J. Aggregation and mating of thrips in flowers of Calystegia sepium.// Ecol. Entomol. 1985. V. 10. P. 433-440.

115. Klocke J.A., Kubo I. Citrus limonoid by-products as insect control agents.// Entomol. exp. et appl. 1982. V. 32. № 3. P. 299-301.

116. Kohidai L., Lemberkovics E., Csabe G. Molecule dependent chemotactic responses of Tetrahymena pyriformis elicted by volatile oils.//Acta Protozoologica. 1995. V. 34. P. 181-185.

117. Koul O., Smirle M.J., Isman M.B. Asarones from Acorns calamus L., oil, their effect on feeding behaviour and dietary utilization in Peridroma saucia.// J. Chem. Ecol. 1990. V. 16. №6. P. 1911-1920.

118. Mansingh A., Williams L.A.D. Insecticidally active triterpene from Artocarpus altilis Park.// Philipp. J. Sei. 1997. V. 124. № 4. P. 345-357.

119. McClure M.S., Hare D.J. Foliar terpenoids in Tsuga species and the fecundity of slale insects.// Oecologia. 1984. V. 63. № 3. P. 185-193.

120. Meisner J., Mitchell B.K. Phagodeterrency induced by two cruciferous plants in adults of the flea beetle Phyllotreta striolata (Coleoptera: Chrysomelidae).// Can. Entomol. 1983. V. 115. №9. P. 1209-1214.

121. Merz F. Das Lachein der Blattlaus über biologische Praparate.// Gartnersche Gartenwelt. 1987. V. 87. № 46. P. 1726.

122. Mikolajczak K.L., Zilkowski B.W., Smith C.R., Burkholder W.E. Volatile food at-tractants for Oryzaephilus surinamensis (L.).// J. Chem. Ecol. 1984. V. 10. № 2. P. 301-309.

123. Mikolajczak K.L., McLaughlin J.L., Rupprecht J.K. Control of pests with Annona-ceous acetogenins.// USA secretaty of agriculture. 1987. № 4855319.

124. Mitchell B .K. Adult leaf beetles as models for exploring the chemical basis of hostplant recognition.// Insect Physiol. 1988. V. 34. № 3. P. 213-225.

125. Molisch H. Der Einfluss einer Pflanze auf die andere Allelopathie.// Fischer: Jena,1937.

126. Monson R., Litvak M., Lerdau M. Plant chemical defense: monoterpenes and the growth-differentiation balance hypothesis.// Trends Ecol. and Evol. 1994. V. 9. № 2. P. 5863. '■.

127. Mosch J., Zeller W. Zur Wirkung von Pflanzenextrakten gegen den Feuerbrand (Er-winia amylovora (Burrill) Winslow et al.).// Pap. Wiss. Tag. Uber Feuerbrand. Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin Dahlem, 1992. № 282. P. 48-53.

128. Müller K.O., Borger H. Experimentelle Untersuchungen über die Phytophthora Resistenz der'Kartoffel.// Arb. Biol. Anst. Reichsanst. (Berl.). 1940. № 23. P. 189-231.

129. Muller-Riebau F., Berger B., Yegen O. Chemical composition and fungitoxic properties to phytopathogenic fungi of essential oils of selected aromatic plants growing wild in Turkey. // J. Agric. Food. Chem. 1995. V. 43. P. 2262-2266.

130. Nawrot J., Harmatha J., Novotny L. Insect feeding deterrent activity of bisabolange-lone and of some sesquiterpenes of eremophilae type.// Biochem. Syst. and Ecol. 1984. V. 12. № l.P. 99-101.

131. Nawrot J., Harmata J., Kostova I., Ögnyanov I. Antifeeding activity of Rotenone abd some derivatives towards selected insect storage pests.// Biochem. Syst. and Ecol. 1989. V. 17. № l.P. 55-57.

132. Neal J.W.Jr., Davis J.C., Bentz J.-A., Warthen J.D.Jr., Griesbach R.J., Santamour F.S.Jr. Allelochemical activity in Ardisia species (Myrsinaceae) against selected arthropods.// J. Econ. Entomol. 1998. V. 91. № 3. P. 608-617.

133. Panasiuk O. Response of Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata Say., to volatile components of tansy, Tanacetum vulgare.// J. Chem. Ecol. 1984. V. 10. № 9. P. 1325-1333.

134. Pandey V.N., Dubey N.K. Antifungal potential of leaves and essential oils from higher plants against soil phytopathogens.// Soil Biol. Biochem. 1994. V. 26. № 10. P. 1417-1421.

135. Pascual N., Marco M.-P. Azadirachtin induced imaginal moult deficiencies in Tene-brio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae).// J. Stored Prod. Res. 1990. V. 26. P. 53-57.

136. Pascual-Villalobos M.J. Evaluacion de la actividad insecticide de extractos vegetales de Chrysanthemum coronarium L.// Bol. sanid. veg. Plagas. 1996. V. 22. № 2. P. 411-420.

137. Paster M., Menasherov M., Ravid U. Fungitoxic activity of essential oils applied asthfumigants against mycotoxigenic moulds attacking stored grain// 14 Congr. Isr. Phytopa-thol. Soc. Phytoparasitica. 1993. V. 21. № 2. P. 165.

138. Plummer D.E., Plummer S.A. Insect repellent and method using plant oils. Patent USA №5208029. 1993.

139. Qasem J.R., Al-Abed A.S., Abu-Blan H.A. Antifungal activity of clammy inula (Inula viscosa) on Helmintosporium sativum and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.// Phytopathol. mediterr. 1995. V. 34. № 1. P. 7-14.

140. Robert P.C., Blaisinger P., Bouchery Y. Influence da la bisabolangelone, un anitiap-petant sesquiterpenoide, sur le développement des chemilles de Mythimna (Pseudaletia) unipuncta Haw. (Lepidoptera, Noctuidae).//Agronomie. 1987. V. 7. № 3. P. 167-174.

141. Rodriquez E. Natural dithiocyclohexadienes and sulfur-derivatives as pesticidal agents.// Proc. 18th Int. Congr. Entomol. Vancouver, 1988. P. 102.

142. Saniewska A. The garlic-deerived diallyl disulphide as the inhibitor of mycelium growth of Stagonospora curtisii (Berk.).// Phytopathol. Pol. Poznan, 1995. V. 9. № 21. P. 37-43.

143. Schmutterer H. Properties and potential of natural pesticides from the neem tree, Azadirachta indica.// Annu. Rev. Entomol. Palo Alto (Calif.), 1990. V. 35. P. 271-297.

144. Schreiner O., Reed H.S. The toxic action of certain organic plant constituents.// Bot. Gaz (Chicago). 1908. № 45. P. 73-102.

145. Schuh B.A., Benjamin D.M. The chemical feeding ecology of Neodiprion dubiosus, N. rugifrons and N. lecontei on Pinus banksiane.// J. Chem. Ecol. 1984. V.10. № 7. P.1071-1079.

146. Seaton K.A., Cook D.F., Hardie D.C. The effectiveness of a range of insecticides against western flower thrips (Frankliniella occidentalis) (Thysanoptera: Thripidae) on cut flowers.// Aust.J.Agric.Res. 1997. V. 48. P. 781-787.

147. Seifert K., Unger W. Insecticidal and fungicidal compounds from Isatis tinctoria.// J. Naturforsch. C. 1994. V. 49. № 1-2. P. 44-48.

148. Sela-Buurlaoe M.B., Ponstein A.S., Melchers L.S., Linthorst H.J.M., Cornelsen B.J. Chitinase, DNA coding therefore and plants containing same.// Mogen International N.V. Riiksuniversiteit te lei den. 1995.

149. Sharma N., Verma H.N. Effect of leaf extracts of Clerodendrum spp. on fruit rotting fungi.// Fitoterapia. 1991. V. 62. № 6. P. 517-518.

150. Shinichi M., Mitsuyoshi Y., Tatsuro 0. Acaricidal and antifungal activities of hexan extracts from wood of Cryptomerica japanica sort Yakusugi.// J.Jap.Wood.Res.Soc. 1991.V. 37. №4. P. 352-357.

151. Sighamony S., Anees I., Chandrakala T.S., Osmani Z. Natural products as repellents for Tribolium castaneum Herbst.// Int. Pest Contr. 1984. V. 26. № 6. P. 156-157.

152. Singh R.P. Botanical pesticides: Indian scenario.// Division of Entomology, Indian Agricultural Research Institute: New Dellii. 110012, 1993.36 p.

153. Singh U.P., Pandey V.N., Wagner K.G., Singh K.P. Antifungal activity of ajoene, a constituent of garlic (Allium sativum).// Can. J. Bot. 1990. V. 68. № 6. P. 1354-1356.

154. Slama K. Plants as a source of a materials with insect hormone activity.// Entomol. exp. and appl. 1969. № 12. P. 721-728.

155. Slama K. Insect hormones and antihormones in plants.// Herbivores: Their Interaction with Secondary Plant Metabolites. New York, London: Academic Press, 1979. P. 683700.

156. Smirle M.J., Lowery D.T., Zurowski C.L. Influence of neem oil detoxication enzyme activity in the obliquebanded leafroller, Choristoneura rosaceana.// Pesticide Biochem. Physiol. 1996. V. 56. № 3. P. 220-230.

157. Smith V.L. Supression of Phytophtora cactorum in vitro by volatiles from canola residues// Abstr. APS Annu. Meet. Phytopathology. 1994. V. 84. № 10. P. 1138.

158. Sosamma J. Efficacy of cocnut oil in protecting different pulse grains from the pulse beetle, Callosobruchus chinensis Linn.// Indian Coconut J. 1994. V.25. № 1. P. 14-19.

159. Srivastava S.D., Srivastava S.K. New constituents and biological activity of the roots of Murraya Koenigii.// J. Indian Chem. Soc. 1993. V. 70. № 7. P. 655-659.

160. Stein U., Klingauf F. Insecticidal effect of plant extracts from tropical and subtropical species.// J. Appl. Entomol. 1990. V. 110. № 2. P. 160-166.

161. Strunz G.M., Finlay H. Concise, efficient new synthesis of Pipercide, an insecticidal unsaturated amide from Piper nigrum and related compounds.// Tetrahedron. 1994. V. 50. №38. P. 11113-11122.

162. Subrahmanyam B. Azadirachtin Anaturally occuring insect growth regulator.// Proc. Indian Acad. Sci. Anim. Sci. 1990. V. 99. № 3. P. 277-288.

163. Sur N., Poi R., Bhattacharyya A., Adityachoudhury N. Isolation od aurantiamide acetate from Ageratum conyzoids.// J. Indian Chem. Soc. 1997. V. 74. № 3. P. 249.

164. Tario V.N., Mogec A.C. Effect of volatiles from garlic extract on Fusarium oxyspo-rum.//Mycol. Res. 1990. V. 94. № 5. P. 617-620.

165. Tewari S.N. Ocimum sanctum L.,a botanical fungicide for rice blast control.// Trop. Sci. 1995. V. 35. № 3. P. 263-273.

166. Tucker A.O., Maciarello M.J., Hill M. Litsea glaucescens Humb, Bonpl. & Kunth var. glaucescens (Lauraceae): A Mexican Bay.// Economic Botany. 1992. V. 46. № 1. P. 2124.

167. Tylyabaev Z., Abduvakhabov A.A., Dalimov D.N. Natural compounds of the plant origin regulators of the esterases catalytic activity.// Proc. XVI Mendeleev congress on general and applied chemistry. Life chemistry. V. 4. Moskow, 1998. P. 132.

168. Ushiki J., Hayakawa Y., Tadano T. Medicinal plants for suppressing soil-borne plant diseases.// Soil Sci. and Plant Nutr. 1996. V. 42. № 2. P. 423-426.

169. Valle M.G., Nano G.M., Tira S. The essential oil of Filipéndula ulmaria.// Planta Medica. 1988. V. 2. P. 181-182.

170. Verma A., Singh R.B. Prevention of tobacco mosaic virus (TMV) infection in tomato by a leaf extract.//Nat. Acad. Sci. Leff. 1994. V. 17. № 1-2. P. 1-5.

171. Villani M., Gould F. Screening of crude plant extracts as feeding deterrents of the wireworm, Melanotus communis.//Entomol. exp. et al. 1985. V. 37. № 1. P. 69-75.

172. Visser J.H. Electroantennogramm responses of the colorado beetle, Leptinotarsa de-cemlineata, to plant volátiles.// Entomol. exp. et appl. 1979. V. 25. № 1 . P. 86-97.

173. Weaver D.K., Zettler J.L., Wells C.D., Baker J.E. Toxicity of fractioned and degraded Mexican Marigold floral extract to adult Sitophilus zeamais.// J. Econ. Entomol. 1997. V. 90. № 6. P. 1684-1689.

174. Whittaker R.H. Communities and Ecosystems.// Mac. Millan Press, London, 1970.210 p.

175. Wollenweber E. Exkret flavonoid bei blutenpflanzen und farnen.// Naturwissenschaften. 1989. V. 76. № 10. P. 458-463.

176. Wood M., Schollenberger M., Zamorski C. Effects of extracts of four medicinal plants on growth of selected fungi and bacteria.// Ann. Warsaw Agr. Univ. 1997. № 18. P. 41-52.131

177. Wyrostkiewics К. Wplyw wiciagow wodnych z wybranych gatunkow roslin na larwy L3 bielinka kapustnika (Pieris brassicae L.).// Zesz. nauk. Rol. Akad. techn-rol. By-dgoszczy. 1989. № 29. P. 13-20.

178. Wyrostkiewicz K. Mozliwosci zastosowania wyciagow roslinnych do ochrony Ziemniakow przed stowka Ziemniaczane.// Pestycydy. 1995. № 3. P. 17-21.

179. Yano K., Tanaka N. Antifeedant activity toward larvae of Pieris rapae crucivora of aromatic carbonyl compounds related to capillin isolated from Artemisia capillaris.// Biosci. Biotechnol. andBiochem. 1995. V. 59. №6. P. 1130-1132.

180. Zeller W., Mosch J. Zur Wirkung von Pflanzenextrakten gegenden Feuerbrand (Er-winia amylovora).// Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin Dahlem, 1990. № 266. P. 316.