Возрастные особенности пероксидного окисления липидов в субклеточных фракциях гепатоцитов при регенерации печени в условиях стресса

Лукаш, Вячеслав Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Возрастные особенности пероксидного окисления липидов в субклеточных фракциях гепатоцитов при регенерации печени в условиях стресса
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Возрастные особенности пероксидного окисления липидов в субклеточных фракциях гепатоцитов при регенерации печени в условиях стресса"

0034473Э8

На правах рукописи

Лукаш МШ^

Вячеслав Александрович

Возрастные особенности пероксидного окисления липидов в субклеточных фракциях гепатоцитов при регенерации печени в условиях стресса

03.00.04 -БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о 2 о КГ 2008

Екатеринбург - 2008

003447398

Работа выполнена в Уральской государственной медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Мещанинов Виктор Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Попова Татьяна Николаевна кандидат биологических наук, доцент Тертычная Татьяна Николаевна

Ведущая организация: Всероссийский НИВИ патологии,

фармакологии и терапии РАСХН

Защита состоится «17» октября 2008 года в 16<К1 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете (394006, г. Воронеж, Университетская площадь, 1, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан «16» сентября 2008 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н., проф.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Процессам пероксндного окисления лигтидов (ПОЛ) принадлежит одна из ведущих ролей в биохимии старения, в связи с чем изменение состояния ПОЛ и антиокислительной защиты (АОЗ) с возрастом представляет собой актуальную научную проблему [Harman D., 1995;В. К. Кольтовер, 2002; В. А. Гусев 2002; В. Л. Воейков, 2002; Воейков В. Л., 2003]. Сушествует мнение, что возрастные изменения соотношения прооксидантных и антиоксидантных процессов в организме связаны с нарушениями работы митохондриальной дыхательной цепи, продуцирующей основное количество радикалов кислорода [Гродзинский В. Н., Войтенко В. П., 1987; Мещанинов В. Н., 1999; Гусев В. А., 2000; Ковругина С. В., 2000; Коркушко О. В., Лишневская В. Ю., 2002; Подколзин А. А., Донцов В. И., 2001; Анисимов В. Н., 2004; Cadenas Е., Kelvin J. A. D., 2000; Ueno S., 2006; Chung S, 2007]. Таким образом, представляется целесообразным изучение взаимосвязи ПОЛ и процесса старения на субклеточном уровне, особенно митохондриальном. Однако, формирование целостного представления о этой проблеме далеко от завершения.

Репаративная регенерация, как правило, сопровождается изменением уровня ПОЛ и АОЗ [Е.Б. Бурлакова, 1982; Gorla G.R., 2001]. Кроме того, известна зависимость скорости репаративкой регенерации и процессов старения [Медведева Н. Д., 1985; Цвиренко С. В., 1989; Мозжухина Т. Г., 1992; Yang S., 2004]. В качестве элементарной формы проявления репаративной регенерации на субклеточном уровне можно рассматривать мембраногенез [Романова Ю. А., 1985]. Оценить значение пероксидного окисления липидов для образующихся мембран субклеточных органелл регенерирующего органа невозможно без оценки фосфолипидного обмена в этих мембранах [Cavazzoni М. et al., 1999, Kowaltowski A. J., Vercesi A. E., 1999], что не нашло достаточного освещения в научной литературе.

Основная часть липидов в мембранах представлена фосфолипидами, и их метаболизм влияет на проницаемость и другие формы биологической активности клеточных мембран [Бурлакова Е.Б., 1978, 1982; Антонов В. Ф., 1992; Геннис Р., 1997]. Липолитические ферменты, в том числе фосфолипаза Аг, влияя на метаболизм фосфолипидов, являются одним из инструментов, регулирующих регенераторные процессы, о чем имеются лишь единичные работы [Алесенко А. В., 1987; Пушкарёва М. Ю., 1991].

Процесс регенерации печени животных подробно описан в литературе [Карташова О. Я., 1985; Саркисов Д С., 1983; Мампория Н. М., 1985; Урываева У. В., 1985, Блюгер А. Ф., 1989], как и его гистологические и цитологические особенности, связанные со старением [Сидорова В. Ф., 1976; Ванюшин Б. Ф., 1977; Левицкий Е. Л., 1980; Медведева Н. Д., 1985; Мозжухина Т. Г. , 1992]. Однако взаимное влияние процессов ПОЛ и регенерации в печени животных продолжает интересовать исследователей [Gorla GR, 2001; Andiran F, 2003; Yang S, 2004], а возрастной аспект данного влияния слабо освещен в литературе [Божков А. И., Малеев В. А., 2004].

Вызывает интерес изучение системы ПОЛ - АОЗ в клетках печени у животных разного возраста при стресс-реакции, активирующей процессы ПОЛ [Кольтовер В. К., 1998, 2000; Ковругина С. В., 2000; Коркушко О. В., 2002; Лишневская В. Ю., 2004, Анисимов В. Н., 2004].

Адреналин - стрессорный гормон, его аналог, норадреналин - медиатор адренергических синапсов. Ацетилхолин - во многом их антагонист (по данным о влиянии на процессы обмена веществ и энергетический обмен) [Дбаг М. М., 1990; Долиба Н. М., 1997; Саакян И. Р., 2001; Вишневский Е. Л., 2004; Kondrashova М. N., Doliba N. М., 1988]. При старении непосредственное управление деятельностью органов и систем со стороны симпатического отдела нервной системы и её адаптационно-трофические воздействия заменяется медленным и менее целенаправленным гормональным способом регулирования [Швалев В. Н., 2005; Глыбочко П. В., 2006]. Взаимодействие этих возрастных изменений и процессов ПОЛ, особенно в условиях регенерации, освещены недостаточно.

По нашему мнению, слабая выявляемость в условиях нормы возрастных различий в обсуждаемой проблеме может быть в значительной степени разрешена применением в качестве возмущающего систему стимула сочетания экстремальных и регуляторных воздействий" регенерации, стресса, гормонов.

Цель: Исследование возрастных особенностей воздействия нейромедиаторов на ПОЛ, АОЗ и метаболизм фосфолипидов в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса. Задачи

1. Изучить возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс в условиях иммобилизационного стресса.

2. Оценить возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс в условиях регенерации при частичной гепатэктомии.

3. Выявить возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс при иммобилизационном стрессе в условиях регенерации после частичной гепатэктомии.

4. Изучить возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс при иммобилизационном стрессе в условиях регенерации после частичной гепатэктомии при предварительном воздействии адреналином.

5. Изучить возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс при иммобилизационном стрессе в условиях регенерации после

частичной гепатэктомии при предварительном воздействии ацетилхолином.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Автором впервые изучены изменения ПОЛ и АОЗ регенерирующей печени экспериментальных животных в условиях стресса на субклеточном уровне в возрастном аспекте.

Показано, что процессы ПОЛ в субклеточных фракциях печени в условиях стресса более активны у старых животных в связи с низкой активностью антиокислительных ферментов, а активация ПОЛ в сочетании с низкой активностью антиокислительных ферментов в субклеточных фракциях печени у зрелых животных наблюдалась лишь при регенераторных процессах.

Впервые выявлена существенная роль митохондрий в свободнорадикальных механизмах процесса старения в условиях регенерации на фоне стрессорного воздействия: процессы ПОЛ в клетках печени у старых животных в условиях стресса, а также в условиях стресса на фоне регенераторных процессов, наиболее активны в митохондриальной фракции.

Обнаружено, что изменения активности фосфолипазы А2 при любых применённых автором воздействиях наиболее выражены в митохондриальной фракции клеток печени животных. Впервые показана неоднозначная возрастзависимая роль фосфолипазы А2 при регенерации печени во время стресса и в условиях воздействия нейромедиаторами: в условиях предварительного воздействия адреналином изменения активности фосфолипазы А2 более выражены у старых животных.

Установленные автором впервые возрастные закономерности указывают на митохондрии и фосфолипазу А2 как на первоочередные объекты для дальнейшей разработки корригирующих воздействий в эксперименте, а в последующем - в клинической практике, связанной с лечебными мероприятиями, направленными на ускорение регенерации ран органов и тканей в условиях гиподинамии.

Установлено, что активность фосфолипазы А2 оказывала влияние на процессы ПОЛ в субклеточных фракциях печени. У старых животных, по сравнению со зрелыми, влияние фосфолипазы А2 на процессы ПОЛ значительно возрастало, особенно в условиях предварительного воздействия адреналином. Предварительное воздействие ацетилхолином способствовало снижению ПОЛ в митохондриальной фракции регенерирующей печени в условиях стресса, особенно у зрелых животных.

Выявленный автором диссертации механизм может быть использован для решения экспериментальных и дальнейших клинических задач по целенаправленной коррекции уровня ПОЛ в регенерирующей печени у животных и пациентов зрелого и старого возраста путем регуляции активности фосфолипазы А2 нейромедиаторами.

Автором впервые в литературе показано, что предварительное воздействие ацетилхолином на фосфолипиды в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса имело возрастные особенности: у зрелых животных наблюдалось увеличение, а у старых - уменьшение содержания мембранных фосфолипидов во фракции постмитохондриального супернатанта.

Впервые выявленные в эксперименте на животных возрастные закономерности изменения уровня ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресс-воздействия и измененного уровня нейромедиаторов открывают возможности для использования корригирующих воздействий на установленные автором нарушения метаболизма в эксперименте и дальнейшего дифференцированного применения у пациентов в зависимости от их возраста в клинической практике при предоперационной подготовке, во время проведения оперативных вмешательств и послеоперационной реабилитации, которые в той или иной степени всегда сопровождаются иммобилизацией (гиподинамией, гипокинезией) и стрессом.

Конкретное участие автора в получении научных результатов.

При выполнении настоящей работы автор самостоятельно провел анализ отечественной и зарубежной литературы по теме исследования. Автором производились экспериментальные воздействия на животных, в том числе операции по частичной гепатэктомии, приготовление биологического материала и субклеточных фракций, биохимические исследования, а также анализ и интерпретация полученных результатов.

Степень достоверности результатов проведенных исследований.

Представленная первичная документация по теме диссертации оформлена в хронологической последовательности. Документация включает рабочие журналы биохимических исследований на кафедре биохимии и журналы записей результатов исследований диссертанта с 01.10.2000 по 25.05.2006. Объем выборки, включавший 160 экспериментальных животных, использование общепринятых методов исследования, в том числе лабораторных методов оценки системы ПОЛ-АОА и метаболизма фосфолипидов, а при обработке данных - статистических методов (t-критерий Стьюдента, парный критерий Вилкоксона, критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) и компьютерных программ (пакет Stata 5.0 (Stata Corporation, США)) подтверждают достоверность полученных результатов.

Ценность научных работ соискателя.

Исследования Лукаша В. А. разрабатывают теоретические положения, раскрывающие биохимические особенности процесса регенерации в условиях старения организма. Работа является фундаментальной, результаты работы выявляют влияние нейромедиаторов на ПОЛ, АОЗ и метаболизм фосфолипидов в субклеточных фракциях регенерирующей печени при старении организма

Связь темы с плановыми исследованиями.

Исследования проводились в рамках темы НИР ГОУ ВГТО УГМА Росздрава, кафедры биоорганической и биологической химии, № государственной регистрации 01.2.00107889.

Тема диссертации утверждена Ученым советом ГОУ ВПО УГМА Росздрава от 24.11.2000, протокол №11.

Полнота изложения материалов диссертации в работах, опубликованных соискателем.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работах, в которых отражены основные положения и выводы диссертации, в том числе:

1. Состояние ПОЛ и АОА в субклеточных фракциях печени старых животных при регенерации в условиях стресса [Текст] / В.А. Лукаш, В.К. Кротов, Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов, Д.Л. Щербаков // Биохимия: От исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику. Материалы межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья. - Оренбург, 2003, - С. 7-13.

2. Лукаш В.А. Возрастные особенности нейрометаболической регуляции свободно-радикального окисления липидов при регенерации печени в условиях стресса [Текст] / В.А. Лукаш, В.Н. Мещанинов // Вестник уральской медицинской академической науки - Екатеринбург, 2006. - №4 (14).-С. 66-71.

3. Лукаш В.А. Взаимовлияние ПОЛ и фосфолипидного обмена в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса и при предвоздействии адреналином в возрастном аспекте [Текст] / В.А. Лукаш,

B.Н. Мещанинов // Госпитальный вестник. - Екатеринбург, 2007. - №2(15). -

C. 33-39.

На защиту выносятся следующие положения:

1. ФосфолипазаАэ оказывает влияние на процессы ПОЛ в субклеточных фракциях регенерирующей печени у старых животных в условиях стресса.

2. Предварительное воздействие адреналина способствует снижению ПОЛ в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса через активацию фосфолипазы А2, что более выражено у старых животных.

3. Предварительное воздействие ацетилхолина способствует снижению ПОЛ в митохондриальной субклеточной фракции регенерирующей печени в условиях стресса, что более выражено у зрелых животных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 - в журнале ВАК Минобразования РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах текста, набранного на компьютере, содержит 26 таблиц и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований с их обсуждением, общего заключения, выводов и списка

литературы, содержащего 126 источников на русском, 94 источника на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования выполнены на крысах-самцах линии Вистар зрелого (8-10 месяцев, массой 200 - 250 г) и старого (20 - 22 месяца, массой 400 - 500 г) возрастов. Календарный возраст и масса тела, использованных в эксперименте старых и зрелых крыс, соответствовали аналогичным показателям, приводимым в работах других авторов [Мещанинов В.Н., 1999; Божков А. И., Малеев В. А., 2004; Tsuda T. et all., 1988; Harrison D. E„ 1988, GoriaG. R., 2001].

Для учета суточной и сезонной изменчивости исследуемых нами показателей [Хачатурьян М. Л. с соавт., 1995; Casale G., 1987; Woodhouse P.R. et all., 1993], a также - снижения систематической методической ошибки во всех проведенных нами исследованиях, наряду с опытными животными, в те же дни и часы в эксперименте использовали контрольных животных. Все исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом МЗ СССР № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» от 12.08. 1977 г (по состоянию на 20 октября 2006 г.), и Европейской конвенцией по защите экспериментальных животных, принятой в 1986 г.

Эксперименты проводили в две серии на 70 старых и 70 зрелых белых крысах-самцах.

Для достижения стресс реакции использовалась иммобилизация животных, часто упоминаемая для этих целей в литературных иточниках [Меньшикова Е. Б., 1994; Лшневська В. Ю., 2002; Мещанинов В. Н., 2003; Dellipizzi А., 2000; Giorgadze S., 2005].

В первой серии эксперимент проводился без предварительного воздействия нейромедиаторов. Животные обеих возрастных групп были поделены на четыре подгруппы по 10 животных: контрольную и три опытных. Животные опытных подгрупп подвергались либо иммобилизационному стрессу, либо частичной гепатэктомии по Стоксу с удалением двух третей печени, либо иммобилизационному стрессу после гепатэктомии. В последнем случае животные подвергались стрессорному воздействию спустя 60 часов после проведения гепатэктомии. Через 84 часа после гепатэктомии, либо через 12 часов после стресса животные умерщвлялись декапитацией под эфирным рауш-наркозом.

Во второй серии эксперимента животные обеих возрастных групп также были поделены на контрольную и две опытных подгруппы по 10 животных в каждой. Животные контрольной подгруппы подвергались иммобилизационному стрессу на фоне регенерации после гепатэктомии.

Спустя 12 ч после окончания стрессорного воздействия крыс умерщвляли декапитацией. Животные опытных подгрупп подвергались тем же воздействиям, но перед гепатэктомией в течение трёх дней им проводились инъекции одного из двух нейромедиаторов: адреналина или ацетилхолина. Животным контрольной подгруппы в течение трёх дней перед гепатэктомией производили инъекции физиологического раствора. Инъекции нейромедиаторами проводились в дневное время, подкожно, в следующих дозировках: ацетилхолина хлорида 2 мл 1,25% раствора, адреналин гидрохлорида 0,3мл 0.1% раствора, на килограмм массы животного. Дозы были выбраны опытным путем, учитывая низкую чувствительность животных к препаратам.

Иммобилизация для стрессирования животных проводилось с 8 часов утра до 8 часов вечера помещением крыс в тесные пластиковые трубки не позволяющие двигаться, но не стесняющие дыхание. Размер трубки подбирался индивидуально. Декапитация проводилась в утренние часы с использованием диэтилового эфира для рауш-наркоза.

Гепатэктомия с удалением правой и средней долей печени проводилась в вечерние часы, под эфирным рауш-наркозом, для местной анестезии использовались небольшие (0,1мл) инъекции новокаина.

Для доказательства стресс-реакции у животных, подвергнутых иммобилизации, проводилось исследование лейкоцитарного состава периферической крови [Гаркави Л.Х. и др., 1977; Горизонтов П.Д. с соавт., 1983; Sternberg ЕМ., 1992], изменения массы надпочечников [Г. Селье 1979] и двигательной активности животных в тесте «открытое поле» [Волчегорский И.А. с соавт., 2000].

После умерщвления и вскрытия брюшной полости у крыс выделяли печень. Для удаления крови печень перфузировали холодным (t=+4C°) физиологическим раствором, разрезали на мелкие кусочки и трижды промывали холодным физиологическим раствором. Печень животных гомогенезировали в сахарозном буфере (рН 7,2)[Р. Досон, Д. Элиот, 1991] с разведением массы ткани к массе буфера в отношении 1:10. Гомогенизацию кусочков печени с целью разрушения клеток производили в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма. Все манипуляции с печенью производили на холоду (при температуре от 0 до + 4 градусов С0).

После получения гомогената печени субклеточные фракции гепатоцитов выделяли методом дифференциального центрифугирования. В исследованиях использовались три субклеточные фракции, содержащие ядра - в первой, митохондрии - во второй и содержимое цитоплазмы клетки - в третьей [Дж. Дигли, 1980]. Полученные фракции подвергались трехразовому замораживанию-размораживанию для разрушения мембран субклеточных органелл, и - вторичной гомогенизации. Все манипуляции с исследуемым материалом производили на холоду (при температуре от 0 до +4 градусов С0).

Для определения активности процессов ПОЛ в субклеточных фракциях печени проводили измерение концентрации малонового диальдегида (МДА)

и гидроперекисей липидов [Каган В.Е. с соавт., 1986; Камышников В. С., 2000,2002].

Для оценки антиокислительной защиты (АОЗ) проводилось исследование активности антиокислительных ферментов - каталазы (КФ 1.11.1.7) [Попова Т., 1971] и пероксидазы (КФ 1.11.1.6) [Королюк М. А., 1988].

Для оценки метаболизма фосфолипидов (преобладания анаболических или катаболических процессов в мембранах клеточных органелл) проводили измерение содержания в субклеточных фракциях фосфолипидов [Камышников В. С., 2000] и активности фосфолипазы А2 (КФ 3 1.1.4) [Тужилина С. А., Салуэнья А. И., 1975]. Фотометрию проводили на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, г.Санкт-Петербург).

Во второй серии эксперимента дополнительно проводили измерение индуцированной хемилюминесценции в пробах [Серкиз Я.И. с соавт., 1984; Досон Р. с соавт, 1991]. Исследование хемилюминесценции проводили на хемилюминометре 1420.1 с ФЭУ-140 (ООО «Конструктор», Н. Новгород).

Для комплексной оценки процессов ПОЛ и антиокислительной активности на основе предложенного Нагорневым с соавт. (1996) коэффициента антиокислительной защиты (КАОЗ), во второй серии экспериментов нами были введены подобные коэффициенты: КАОЗ и коэффициент перекисного окисления липидов (КПОЛ).

Для взвешивания надпочечников использовались весы торсионные ВТ-500, для исследования состава периферической крови использовался микроскоп МБИ-6 (ЛОМО, г.Санкт-Петербург)

Результаты подвергали статистической обработке с использованием параметрических и непараметрических критериев. Для оценки достоверности отличий между сравниваемыми группами использовали t-критерий Сгьюдента [Лакин Г Ф., 1980; Гланц С., 1998], а также непараметрические критерии для парного сравнения показателей опытных и контрольных групп животных внутри групп (парный критерий Вилкоксона), и для сравнения независимых выборок (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) [Гублер Е.В. с соавт., 1973; Гланц С., 1998; Воробейчик Е.Л. с соавт., 2004]. Для каждой группы значений вычисляли среднюю арифметическую величину М и ошибку средней величины - m (в соответствии с параметрическими критериями статистики). Статистическая обработка результатов проводилась в ПСП EXCEL и STATISTICA 5.0 [StatSoft, Inc. 2001]. При проверке статистических гипотез использован уровень значимости не более 5% (р<0,05), в работе обсуждались только достоверные данные.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

^Доказательства развития стресс-реакции у животных после 12 часовой иммобилизации

Стереотипная гематологическая реакция на стресс выражается в увеличении количества циркулирующих сегментоядерных нейтрофилов на фоне лимфопении [Гаркави Л.Х. с соавт., 1977; Чирки A.A. с соавт., 1994; Волчегорский И.А. с соавт., 2000]. В среднем и у старых, и у зрелых крыс при иммобилизации уровень сегментоядерных нейгрофилов увеличивался на 84,55% (р<0,05), а лимфоцитарный индекс периферической крови понижался на 56,11% (р<0,05), что соответствует данным, приводимым указанными авторами при описании гематологической картины в условиях стресс-реакции.

Масса надпочечников в среднем увеличилась на 105% (р<0,05), что соответствует классическому представлению о стрессе [Г. Селье, 1979].

Нервная система контролирует состояние вегетативных функций и механизмы эндокринной регуляции животных и человека, позволяя осуществлять поведенческую адаптацию [Буреш Я. И с соавт., 1991; Кокс Т., 1981]. Исследование двигательной активности у животных в тесте «открытое поле», показало, что у обоих возрастных групп после 12-часовой иммобилизации наблюдалось достоверное снижение суммарной двигательной активности (горизонтальной локомоции и вставания на задние конечности). Так, у старых животных двигательная активность, спустя 12 часов после иммобилизации, уменьшилась на 76% (р<0,05), у зрелых животных - на 57% (р<0,05), по сравнению с контролем. Это соответствует данным, полученным Волчегорским И.А. с соавт. (2000). При изучении поведения животных в «открытом поле» после стресс-воздействия во всех случаях он наблюдал депрессию поведения, что, по мнению автора, может служить доказательством наличия стресс-реакции в виде осуществления поведенческой адаптации.

2.Возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс в условиях иммобилизационного стресса

У зрелых животных при стрессе в митохондриальной фракции активность пероксидазы возрастает на 135% (Р<0,05, табл.1).

Этим можно объяснить возрастное отличие в изменении содержания продуктов ПОЛ в митохондриальной печени старых и зрелых животных в условиях стресса. При стрессе содержание МДА в митохондриальной фракции печени старых животных достоверно увеличилось на 20 % (Р<0,05, таб.2).

Таблица 1

Активность пероксидазы (мкКат/мг белка) в субклеточных фракциях клеток печени зрелых и старых животных в условиях иммобилизационного

стресса

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 0,048±0,020 0,113±0,034 * 0,090±0,059 0,082±0,071

Постмитохондриальный супернатант 0,141 ±0,032 0,107±0,055 0,029±0,013 0,018±0,006

Ядра 0,334±0,094 0,277±0,052 0,236±0,067 0,109±0,086

* - различия достоверны при Р<0,05

Все сравнения - с группами контрольных животных соответствующей возрастной категории.

При стрессе активных форм кислорода (АФК) вырабатывалось больше, но у зрелых животных это компенсировалось повышением пероксидазной активности, а у старых животных такой компенсации не происходило, и как результат, накапливались продукты ПОЛ.

Таблица 2

Содержание МДА (мкМоль/л) в субклеточных фракциях клеток печени зрелых и старых животных в условиях иммобилизационного стресса_

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 1,110±0,022 1,109±0,038 1,061 ±0,096 1,273±0,027 *

Постмитохондриальный супернатант 1,059±0,059 1,090±0,05 1,159±0,016 1,184±0,003 *

Ядра 1,089±0,037 1,13 !±0,04 1.164±0,032 1,170±0,032

* - различия достоверны при Р<0,05

Все сравнения - с группами контрольных животных соответствующей возрастной категории

Увеличение содержания МДА при стрессе в митохондриальной фракции печени старых животных 20% (Р<0,05, табл.2) сопровождалось снижением активности фосфолипазы А2 в той же фракции на 11% (Р<0,05) и одновременно увеличением содержания фосфолипидов на 66% (Р<0,05). В то же время наблюдалось повышение на 20% (Р<0,05) содержания гидроперекисей в постмитохондриальном супернатанте и увеличение там же активности фосфолипазы А2 на 10% (Р<0.05), что может быть ответом на усиление процессов ПОЛ, согласно данным литературы о чувствительности фермента к продуктам пероксидации липидов [Таджибаева Э., 1999;

Кармалита Е. Г. с соавт., 2002; Meed J. F„ 1980]. Это соответствовало снижению на 42% (Р<0.05) количества фосфолипидов в данной фракции у старых животных.

Таким образом, имеется связь между активностью фосфолипазы А2, содержанием фосфолипидов и содержанием продуктов ПОЛ в субклеточных фракциях печени. В условиях стресса активность фосфолипазы А2 является одним из факторов регуляции ПОЛ, действие которого особенно заметно у старых животных.

З.Возрастные особенности изменений показателен ПОЛ н метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс в условиях регенерации при частичной гепатэктомии

В условиях регенерации печени увеличение концентрации МДА у зрелых животных наблюдалось только в митохондриальной фракции на 7% (Р<0,05). В то же время, у старых животных процесс регенерации ни в одной из субклеточных фракций достоверных изменений концентрации МДА не вызвал.

Таблица 3

Активность фосфолипазы А2 (мкКат/ мг белка) в субклеточных фракциях клеток печени зрелых и старых животных в условиях регенерации при частичной гепатэктомии___

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 1,854±0,397 2,723±0,324 * 3,026±0,076 2,849±0,089 *

Постмитохондриальный супернатант 2,519±0,277 2,301±0,529 2,894±0,124 3,015±0,104

Ядра 1,804±0,573 2,293±0,584 2,629±0,314 3,040±0,385

* - различия достоверны при Р<0.05

Все сравнения - с группами контрольных животных соответствующего возраста.

Также, в условиях гепатэктомии, достоверные отличия активности фосфолипазы А2 по сравнению с контролем выявлены только в митохондриальной фракции регенерирующей печени животных обеих возрастных групп. Примечательно, что у зрелых животных активность фосфолипазы А2 в условиях регенерации в данной фракции повышается на 46% (Р<0,05, табл.3), а у старых, напротив, снижается на 6% (Р<0,05, табл.3).

4.Возрастные особенности изменений показателен ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов в субклеточных фракциях печени крыс при иммобилизационном стрессе в условиях регенерации после частичной гепатэктомии

Увеличение показателя МДА у зрелых животных наблюдаются в митохондриальной фракции при стрессе на фоне регенерации (на 6%, при Р<0,05, табл.4) аналогично увеличению данного показателя на 7% (Р<0,05) в условиях регенерации печени без стресса.

Таблица 4

Содержание МДА (мкМоль/л) в субклеточных фракциях клеток печени зрелых и старых животных в норме и при регенерации в условиях иммобилизационного стресса__

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 1,11 ±0,022 1,178±0,041 * 1,061 ±0,096 1,225±0,026 *

Постмитохондриальный супернатант 1,059±0,059 1,067±0,024 1,159±0,016 1,198±0,036

Ядра 1,089±0,037 1,148±0,022 1,164±0,032 1,232±0,021 *

* - различия достоверны при Р<0,05

Все сравнения - с группами контрольных животных соответствующей возрастной категории.

В то же время, у старых животных сам процесс регенерации ни в одной из субклеточных фракций достоверных изменений содержания МДА не вызывал, но в условиях иммобилизационного стресса, как на фоне регенераторного процесса, так и без него наблюдалось достоверное повышение содержания МДА. Так, при стрессе на фоне гепатэктомии в митохондриальной фракции содержание МДА увеличилось на 16% (Р<0,05, табл.4) Это может свидетельствовать о повышенной чувствительности старого организма к стрессу и более выраженном ответе ПОЛ на стресс при старении, что соответствует данным литературы, полученным на других моделях [Фролькис В. В., 1988; Фролькис В В., Мурадян Х.К., 1992; Brody J. A., Grant М. D., 2001].

Средний показатель активности пероксидазы в митохондриальной фракции печени у старых крыс при стрессе снижался на 9%, при частичной гепатэктомии - на 29%, при иммобилизационном стрессе в сочетании с частичной гепатэктомией - на 42%. Уменьшение активности пероксидазы у старых животных, возможно, связано с уменьшением её синтеза, как белка не выполняющего структурную функцию, в условиях вызванной регенерации. Однако, возможны и другие причины снижения активности фермента. Тем не менее, снижение способности к синтезу белка в старом организме отмечено

многими авторами [Богацкая Л. Н., 1990; Мозжухина Т. Г., 1992; Литошенко А. Я., Хартвиг М., 1998; Божков А. И., Малеев В. А., 2004].

Таблица 5

Содержание фосфолипидов (мМоль/л) в субклеточных фракциях клеток печени зрелых и старых животных при регенерации в условиях иммобилизационного стресса_

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 0,197±0,043 0,!69±0,029 * 0,08±0,009 0,053±0,016*

Постмитохондриал ьны й супернатант 0,249±0,053 0,217±0,062 0,069±0,016 0,053±0,016

Ядра 0,208±0,042 0,354±0,059 * 0,044±0,010 0,078±0,013 *

* - различия достоверны при Р<0,05

Все сравнения - с группами контрольных животных соответствующего возраста.

Различные клеточные органеллы образуются с разной скоростью. Возможно, клетка регулирует скорость биогенеза митохондрий с помощью изменения активности липаз. Снижение содержания фосфолипидов в митохондриальной фракции при регенерации в условиях стресса у зрелых животных на 14% (Р<0,05, табл.5) сопровождалось усилением процессов ПОЛ. Аналогичная ситуация наблюдалась и у старых животных. Причем, содержание фосфолипидов по сравнению с контролем, в данной фракции у старых животных снижалось на 33% (Р<0,05, табл 5), что превышало снижение содержания фосфолипидов у зрелых животных более чем вдвое. В обоих случаях это сопровождалось достоверным повышением содержания МДА - на 6% (Р<0,05, табл.4) у молодых и на 16% (Р<0,05, табл.4) у старых животных.

Митохондрии являются мишенями разрушительного действия ПОЛ [Владимиров Ю. А., 2000]. Фосфолипиды, содержащиеся в митохондриальной фракции - это фосфолипиды мембран митохондрий, и снижение содержания фосфолипидов в данной фракции может свидетельствовать о снижение темпов мембраногенеза самих митохондрий [Саркисов Д. С., 1983; Романова Ю. А., 1985]. В таком случае у старых животных в условиях стресса при регенерации клеток печени митохондрии образуются менее активно.

5.Возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и метаболизма фосфолипидов субклеточных фракций печени крыс при регенерации в условиях иммобилизационного стресса при предварительном воздействии адреналином

Предварительное воздействие адреналином выявило возрастные различия в показателях КПОЛ субклеточных фракций регенерирующей печени старых и зрелых животных в условиях стресса.

По литературным данным, введение стрессорной дозы адреналина в течение продолжительного времени приводит в митохондриях печени к уменьшению эффективности окислительного фосфорилирования и активации процессов ПОЛ [Терлецкая О. И., 1990; Саакян И. Р., 2001]. Однако, предварительное воздействие адреналина на животных при регенерации в условиях стресса показало другую картину.

Таблица 6

Коэффициент перекисного окисления липидов (КПОЛ) в субклеточных фракциях клеток регенерирующей печени зрелых и старых животных в условиях стресса при предварительном воздействии адреналина_

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 1,064±0,027 1,086±0,018 1,056±0,01 0,954±0,033 **

Постмитохондриальный супернатант 1,018±0,044 1,052±0,038 1,009±0,012 0,973±0,082

Ядра 0,950±0,04 1,052±0,014 * 1,031 ±0,022 0,984±0,032

* - различия достоверны при Р<0,05;

** - различия достоверны при Р<0,01,

*** - различия достоверны при Р<0.001

Все сравнения - с группами контрольных животных соответствующего возраста, подвергнутых частичной гепатэктомии в условиях стресса без предварительного воздействия нейромедиатором.

У зрелых животных наблюдалось повышение на 11% (Р<0,05, табл.6) КПОЛ в ядерной фракции. У старых животных при предварительном воздействии адреналином в ядерной фракции не отмечалось достоверного увеличения КПОЛ, а в митохондриальной фракции наблюдалось снижение показателя КПОЛ на 10% (Р<0,01, табл.6).

При снижении показателя КПОЛ на 10% (Р<0,01, табл.6) в митохондриальной фракции у старых животных при предварительном воздействии адреналином не было обнаружено соответствующего достоверного повышения показателя КАОЗ в той же фракции. Возможно, в регуляции процессов ПОЛ задействованы другие механизмы, помимо АОФ.

Предварительное воздействие адреналина вызывало изменения активности фосфолипазы Аз в регенерирующей печени в условиях стресса у

животных обеих возрастных групп. Однако у старых животных изменения активности фосфолипазы Аз, как и изменения содержания фосфодипидов в субклеточных фракциях, были более выражены, чем у зрелых.

Таблица 7

Активность фосфолипазы А2 (мкКат/ мг белка) в субклеточных фракциях клеток регенерирующей печени зрелых и старых животных в условиях стресса и при предварительном воздействии адреналина_

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 0,574±0,256 1,474±0,288 * 0,542±0,175 1,493±0,135 **

Постмитохондриальный супернатант 1,435±0,193 1,485±0,182 0,820±0,082 1,401±0,236 *

Ядра 1,020±0,095 1,227±0,338 0,821±0,082 1,847±0,055 ***

* - различия достоверны при Р<0,05; ** - различия достоверны при Р<0,01, **•* - различия достоверны при Р<0,001.

Таблица 8

Содержание фосфолипидов (мМоль/л) в субклеточных фракциях клеток регенерирующей печени зрелых и старых животных в условиях стресса и при предварительном воздействии адреналина__

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 0,134±0,015 0,154±0,017 0,146±0,015 0,171±0,007 *

Постмитохондриальный супернатант 0,217±0,018 0,273±0,019 * 0,301 ±0,0 И 0,383±0,026 *

Ядра 0,248±0,017 0,107±0,008 *** 0,127±0,019 0,210±0,019 *

* - различия достоверны при Р<0,05: ** - различия достоверны при Р<0,01, *** - различия достоверны при Р<0,001

Так, у зрелых животных наблюдалось повышение на 156% (Р<0,05, табл.7) активности фосфолипазы А3 только в митохондриальной фракции, в то время как у старых животных активность фосфолипазы А2 повышалась на 175% (Р<0,01, табл.7) в митохондриальной фракции, на 125% (Р<0,001,

табл.7) в ядерной фракции и на 70% (Р<0,05, табл.7) в постмитохондриальном супернатанте.

Повышение активности фосфолипазы А2 отражается на метаболизме фосфолипидов как основного субстрата ПОЛ. Так, понижение на 10% (Р<0,05, табл.6) КПОЛ в митохондриальной фракции у старых животных при предварительном воздействии адреналином по сравнению с контрольной группой животных, вероятно связано с увеличением на 175% (Р<0,01, табл.7) активности фосфолипазы А2. При этом содержание фосфолипидов у старых животных во всех субклеточных фракциях в указанных условиях только увеличивается (табл.8). Фосфолипаза А2, активируясь в условиях ПОЛ, удаляет из мембраны окисленные жирные кислоты, тем самым приостанавливая процессы ПОЛ [Таджибаева Э., 1999; Кармалита Е. Г. с соавт., 2002]. Таким образом, у старых животных в митохондриальной фракции регенерирующей печени в условиях стресса при предварительном воздействии адреналином, фосфолипаза А2 снижает активность процессов ПОЛ.

Предварительное воздействие адреналином по-разному влияло на фосфолипидный обмен в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса у животных разного возраста. У старых животных происходило усиление активности фосфолипазы А2 и снижение уровня ПОЛ, а у зрелых животных подобная метаболическая картина не наблюдалась.

6.Возрастные особенности изменений показателей ПОЛ, АОЗ и фосфолипидного обмена субклеточных фракций печени крыс при регенерации в условиях иммобнлизационного стресса при предварительном воздействии ацетнлхолнном

Предварительное воздействие ацетилхолином в регенерирующей печени в условиях стресса приводило к снижению показателей КПОЛ у зрелых животных на 18% (Р<0,01, табл.9) в митохондриальной фракции и на 11% (Р<0,05, табл.9) в постмитохондриальном супернатанте. У старых животных предварительное воздействие ацетилхолином сказывалось менее выражено и в регенерирующей печени в условиях стресса приводило к достоверному снижению КПОЛ на 12% (Р<0,001, табл.9) только в митохондриальной фракции. Очевидно к предварительному воздействию ацетилхолином печень зрелых животных, регенерирующая в условиях стресса, более чувствительна, чем печень старых х<ивотных

У зрелых животных в регенерирующей печени в условиях стресса при предварительном воздействии ацетилхолином активность фосфолипазы А2 снижалась на 85% (Р<0,01, табл.10) в постмитохондриальном супернатанте и снижалась на 49% (Р<0,01, табл.10) в ядерной фракции. При этом содержание фосфолипидов у зрелых животных увеличивалось только в постмитохондриальном супернатанте на 64% (Р<0,001).

Таблица 9

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 1,064±0,027 0,877±0,03 ** 1,056±0,01 0,929±0,007 ***

Постмитохондриальный супернатант 1,018±0,044 0,903±0,02 * 1,009±0,012 0,958±0,022 *

Ядра 0,950±0,04 0,932±0,018 1,031 ±0,022 1,020±0,045

* - различия достоверны при Р<0,05, ** - различия достоверны при Р<0,01, *** - различия достоверны при Р<0.001.

В отсутствии заметных увеличений КАОЗ в обеих фракциях и при наличии снижения активности фосфолипазы А2 у животных обеих возрастных групп можно объяснить снижение КПОЛ тормозящим действием ацетилхолина на окислительные процессы в митохондриях, уже отмеченным в литературе [Долиба Н. М., 1997; Kondrashova М. N., Dolida N. М., 1988].

Таблица 10

Активности фосфолипазы А2 (мкКат/мг белка) в субклеточных фракциях клеток регенерирующей печени зрелых и старых животных в условиях стресса и при предварительном воздействии ацетилхолином_

Зрелые животные Старые животные

Субклеточные фракции Контроль Опыт Контроль Опыт

Митохондрии 0,574±0,256 0,425±0,12 0,542±0,175 0,053±0,075

Постмитохондриальный супернатант 1,435±0,193 0,208±0Л31 ** 0,820±0,082 0,307±0,237 *

Ядра 1,020±0,095 0,524±0,036 ** 0,821 ±0,082 0,555±0,181

* - различия достоверны при Р<0,05; ** - различия достоверны при Р<0,01; *** - различия достоверны при Р<0,001

Тот факт, что на зрелых животных действие ацетилхолина оказалось более выраженным, можно связать со снижением чувствительности клетки к

регуляторным сигналам с возрастом [Лобанок Л. М., 1994; Швалев В. Н., 2005; Глыбочко П. В., 2006].

У зрелых животных предварительное воздействие ацетилхолином приводило к накоплению фосфолипид-содержащих структур и снижению катаболизма фосфолипидов в постмитохондриальном супернатанте. У старых животных в тех же условиях происходило снижение активности фосфолипазы А2 в постмитохондриальном супернатанте на 63% (Р<0,05, табл.10), что на фоне снижения на 36% (Р<0,001) содержания фосфолипидов в данной фракции может свидетельствовать о произошедшем разрушении (уменьшении) мембранных структур цитозоля.

Таким образом, мы наблюдали перераспределение фосфолипидов между субклеточными фракциями [Зубов В. А., 1985; Пушкарёва М. Ю., 1991], проявляющее четкие возрастные особенности. У зрелых животных предвоздействие ацетилхолином приводило к увеличению содержания фосфолипидов в постмитохондриальном супернатанте, свидетельствующее о процессах синтеза мембран, активации процессов мембраногенеза [Романова Ю. А., 1985], образования новых структур цитозоля, что может быть полезно в условиях стресса. У старых животных наблюдалась противоположенная картина.

Предварительное воздействие ацетилхолина по-разному влияет на ПОЛ и метаболизм фосфолипидов в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса у животных разного возраста. Возрастные отличия в изменениях показателей ПОЛ, вызванные предварительным воздействием ацетилхолина и его действием на окислительные процессы в митохондриях, в большей степени проявляются у молодых животных. Изменения в фосфолипидном обмене субклеточных фракций регенерирующей печени животных в условиях стресса в ответ на предварительное воздействие ацетилхолина также имеют возрастные особенности. У молодых животных происходит увеличение содержания фосфолипидов в постмитохондриальном супернатанте, а у старых, напротив - уменьшение содержания фосфолипидов в данной фракции регенерирующей печени в условиях стресса.

Выводы

1. Процессы ПОЛ в субклеточных фракциях печени в условиях стресса более активны у старых животных Причиной тому являлась низкая активность антиокислительных ферментов у животных данного возраста.

2. Активация ПОЛ и низкая активность антиокислительных ферментов в субклеточных фракциях печени у зрелых животных наблюдалась при регенераторных процессах.

3. Процессы ПОЛ в клетках печени у старых животных в условиях стресса, а также в условиях стресса на фоне регенераторных процессов, наиболее активны в митохондриальной фракции, что указывает на определяющее значение митохондрий в свободнорадикальных механизмах процесса старения в условиях патологии.

4. Изменения активности фосфолипазы Аа при любых применённых воздействиях наиболее выражены в митохондриальной фракции клеток печени животных. В условиях предварительного воздействия адреналином изменения активности фосфолипазы Аг более выражены у старых животных.

5. Активность фосфолипазы А: оказывает влияние на процессы ПОЛ в субклеточных фракциях печени. У старых животных, по сравнению со зрелыми, влияние фосфолипазы Аз на процессы ПОЛ значительно возрастает, особенно в условиях предварительного воздействия адреналином.

6. Предварительное воздействие ацетилхолином способствует снижению ПОЛ в митохондриальной фракции регенерирующей печени в условиях стресса, особенно у зрелых животных.

7. Влияние предварительного воздействия ацетилхолина на содержание фосфолипидов в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса имеет возрастные особенности. При предварительном воздействии ацетилхолином у зрелых животных наблюдается увеличение содержания мембранных фосфолипидов фракции постмитохондриального супернатанта, а у старых животных - уменьшение содержания мембранных фосфолипидов данной фракции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Участие нейрометаболитов в возрастной динамике перекисного окисления липидов при стрессе [Текст] / В В.Емельянов, А А.Нифонтова, В.А.Лукаш, Д.Л.Щербаков // Геронтология и гериатрия. Медицинское обслуживание ветеранов войн. Материалы межобластной научно-практической конференции. - Екатеринбург, 2000. - С.62.

2. Активность фосфолипазы А2, анаболизм диеновых коньюгатов, и антиокислительная активность при стрессе и нейрометаболическом воздействии [Текст] / И.А.Гребнева, В.А.Лукаш, В.Н.Мещанинов, А.К.Устинова, С.Т.Халикова, Д.Л.Щербаков // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 55 научной конференции студентов и молодыхученых. - Екатеринбург, 2000. - С.49-50.

3. Влияние нейрометаболитов на активность каталазы у крыс разного возраста в норме и при иммобилизационном стрессе [Текст] / А.А.Белоусов, В.А.Лукаш, В.Н.Мещанинов, А.А.Нифонтова, Д.Л.Щербаков //Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 55 научной конференции студентов и молодых ученых. -Екатеринбург, 2000. - С.44-45

4. Влияние нейрометаболитов на содержание молонового диальдегида у крыс разного возраста в норме и при иммобилизационном стрессе [Текст] / П.Ю Викторов, В.А.Лукаш, В.Н.Мещанинов,

A.А.Нифонтова, Д.Л.Щербаков // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 55 научной конференции студентов и молодых ученых. - Екатеринбург, 2000. - С.47-48.

5. Влияние нейрометаболитов на содержание фосфолипидов у крыс разного возраста в норме и при иммобилизационном стрессе [Текст] /

B.А.Лукаш, В.Н.Мещанинов, А.А.Нифонтова, А.С.Пирогов, Д.Л.Щербаков //Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 55 научной конференции студентов и молодых ученых. -Екатеринбург, 2000. - С.45-46.

6. Лукаш В.А. Изменения активности антиокислительной системы в регенерирующей печени животных разного возраста при иммобилизации [Текст] / В.А. Лукаш, Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 56 научной конференции студентов и молодых ученых. - Екатеринбург, 2001. - С.136.

7. Лукаш В.А. Возрастные изменения влияния уровня фосфолипидов на перекисное окисление липидов в регенерирующей печени при иммобилизации [Текст] / В.А. Лукаш, A.B. Ваганова, A.A. Гурова //Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Материалы 56 научной конференции студентов и молодых ученых. -Екатеринбург, 2001. - С. 13 7.

8. Фундаментальные аспекты участия системы ПОЛ и АО А в регенерации ткани в геронтологии [Текст] / В.А. Лукаш, Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов, A.B. Ваганова // Геронтология и гериатрия. Материалы межобластной научно-практической конференции. - Екатеринбург, 2002. - С.84-85.

9. Активность каталазы и содержание МДА и фосфолипидов в субклеточных фракциях печени старых животных при регенерации в условиях стресса [Текст] / В.А. Лукаш, Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов, Е.В. Попова //Биохимия - медицине. Тезисы докладов Всеросийской научной конференции. Под редакцией А.И. Карпищенко. - Санкт - Петербург, 2002. -

C.51-52.

10. Состояние ПОЛ и АОА в субклеточных фракциях печени старых животных при регенерации в условиях стресса [Текст] / В.К. Кротов, В.А. Лукаш, Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов, Д.Л. Щербаков // Биохимия: От исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую

практику. Материалы межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья. - Оренбург, 2003. - С.7-13.

11. Лукаш В.А. Возрастные особенности нейрометаболической регуляции свободно-радикального окисления липидов при регенерации печени в условиях стресса [Текст] / В.А. Лукаш, В.Н. Мещанинов // Вестник уральской медицинской академической науки.- Екатеринбург 2006. -№4(14). -С.66-71.

12. Лукаш В.А. Взаимовлияние ПОЛ и фосфолипидного обмена в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса и при предвоздействии адреналином в возрастном аспекте [Текст] / В.А. Лукаш,

B.Н. Мещанинов // Госпитальный вестник. - Екатеринбург, 2007. - №2(15). -

C.33-39.

Работа № 11 опубликована в издании, рекомендованном Перечнем ВАК.

Список используемых в автореферате сокращений

ПОЛ - пероксидное окисление липидов

АОЗ - антиокислительная защита

АО А - антиокислительная активность (неферментативная)

АОФ - антиокислительные ферменты

КПОЛ - коэффициент перекисного окисления липидов

КАОЗ - коэффициент антиокислительной активности

МДА - малоновый диальдегид

Подписано в печать/Г^^Бумага для множительных аппаратов Печать офсетная. Усл. п.л.1,0. Тираж 100 экз. Заказ,^/£.

Отпечатано в типографии ФГУ «Воронежский ЦНТИ» 394730, г.Воронеж, пр.Революции, 30

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лукаш, Вячеслав Александрович

ОСНОВНЫЕ УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Возрастные особенности ПОЛ и АОЗ.

1.2. ПОЛ и патологические состояния.

1.3 Возрастные изменения ПОЛ и АОЗ в печени.20г

1.4 Изменения структуры и функции гепатоцитов при старении.

1.5 Регенерация печени и ПОЛ.

1.6 Регенерация печени и ПОЛ в возрастном аспекте.

1.7 Возрастные особенности функционирования митохондрий и ПОЛ

1.8 Метаболизм фосфолипидов и регенерация.

1.9 Метаболизм фосфолипидов, ПОЛ и регенерация.

1.10 Участие адреналина и ацетилхолина в регуляции регенераторных процессов и адаптации к стрессу.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Возрастные особенности пероксидного окисления липидов в субклеточных фракциях гепатоцитов при регенерации печени в условиях стресса"

Актуальность проблемы. Актуальность проблемы. Процессам пероксидного окисления липидов (ПОЛ) принадлежит одна из ведущих ролей в биохимиии старения, в связи с чем изменение состояния ПОЛ и антиокислительной защиты (АОЗ) с возрастом представляет собой актуальную научную проблему [Harman D., 1995;В. К. Кольтовер, 2002; В. А. Гусев 2002; В. Л. Воейков, 2002; Воейков В. Л., 2003] При этом многие исследователи сходятся во мнении, что возрастные изменения соотношения прооксидантных и антиоксидантных процессов в организме связаны с нарушениями работы митохондриальной дыхательной цепи, продуцирующей основное количество радикалов кислорода [Гродзинский В. Н., Войтенко В. П., 1987; Мещанинов В. Н., 1999; Гусев В. А., 2000; Ковругина С. В., 2000; Коркушко О. В., Лишневская В. Ю., 2002; Подколзин А. А., Донцов В. И., 2001; Анисимов В. Н., 2004; Cadenas Е., Kelvin J. A. D., 2000; Ueno S., 2006; Chung S, 2007]. Таким образом, представляется целесообразным изучать связь ПОЛ и старения на субклеточном уровне, особенно митохондриальном. Однако целостное представление об этой проблеме далеко от завершения.

Репаративная регенерация, как правило, сопровождается изменением уровня ПОЛ и АОЗ [Е.Б Бурлакова, 1982; Gorla G.R., 2001]. Кроме того, известна зависимость скорости репаративной регенерации и процессов старения [Медведева Н. Д., 1985; Цвиренко С. В., 1989; Мозжухина Т. Г., 1992; Yang S., 2004]. В качестве элементарной формы проявления репаративной регенерации на субклеточном уровне, можно рассматривать мембраногенез [Романова Ю. А., 1985]. Оценить значение перекисного окисления липидов для образующихся мембран субклеточных органелл регенерирующего органа невозможно без оценки фосфолипидного обмена в этих мембранах [Cavazzoni М. et al., 1999, Kowaltowski A. J., Vercesi A. E.,

1999], что не нашло достаточного освещения в научной литературе.

Основная часть липидов в мембранах представлена фосфолипидами и их метаболизм (соотношение катаболических и анаболических процессов, активность окислительных процессов) влияет на проницаемость и другие формы биологической активности клеточных мембран [Бурлакова Е.Б., 1978, 1982; Антонов В. Ф., 1992; Геннис Р., 1997]. Липолитические ферменты, в том числе фосфолипаза А2, влияя на метаболизм фосфолипидов, являются одним из инструментов, регулирующих регенераторные процессы, о чем имеются лишь единичные работы [Алесенко А. В., 1987; Пушкарёва М. Ю., 1991].

Процесс регенерации печени животных подробно описан в литературе [Карташова О. Я., 1985; Саркисов Д. С., 1983; Мампория Н. М., 1985; Урываева У. В., 1985, Блюгер А. Ф., 1989], как и его гистологические и цитологические особенности, связанные со старением [Сидорова В. Ф., 1976; Ванюшин Б. Ф., 1977; Левицкий Е. Л., 1980; Медведева Н. Д., 1985; Мозжухина Т. Г. , 1992]. Однако взаимное влияние процессов ПОЛ и регенерации в печени животных продолжает интересовать исследователей [Gorla GR, 2001; Andiran F, 2003; Yang S, 2004], а возрастной аспект данного влияния слабо освещен в литературе [Божков А. И., Малеев В. А., 2004].

Взаимодействие этих возрастных изменений и процессов ПОЛ, особенно в условиях регенерации, освещены слабо.

По нашему мнению, слабая выявляемость в условиях нормы возрастных различий в обсуждаемой нами проблеме может быть в значительной степени разрешена применением в качестве возмущающего систему стимула сочетания экстремальных и регуляторных воздействий: регенерации, стресса, гормонов.

Цель: Выявить возрастные особенности воздействия нейромедиаторов на ПОЛ, АОЗ и метаболизм фосфолипидов в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса. Задачи

Научная новизна

Практическая ценность

Выявленные нами закономерности могут быть использованы для дальнейшего экспериментального исследования процессов ПОЛ и фосфолипидного обмена при экстремальных воздействиях на организм животных различного возраста.

Кроме того, в современной медицинской практике за последние несколько лет наблюдается изменение возрастной структуры пациентов в сторону увеличения числа пожилых и старых. Например, в хирургии, как операция сама по себе, так и подготовка к ней для подобных пациентов является стрессовой ситуацией, которая может повлиять на исход операции и длительность процесса реконвалесценции. Поэтому возникла необходимость изучения влияния стресса на организм человека и связи стрессовых воздействий с возрастным аспектом.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования использованы в подготовке курсовых работ студентов 2-3 курсов по биохимии и патофизиологии, включены в лекционный курс и практикум по биохимии при освещении следующих разделов: «Биохимия старения», «Свободнорадикальное окисление», «Антиоксидантная защита», «Обмен фосфолипидов», «Биохимия печени», «Общий адаптационный синдром» на кафедре биохимии ГОУ ВПО УГМА Росздрава.

Апробация материалов диссертации.

1 .Фундаментальные аспекты участия системы ПОЛ и АОА в регенерации ткани в герантологии [Текст] / В.А. Лукаш, Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов, A.B. Ваганова. [Текст] // Геронтология и гериатрия. Материалы межобластной научно-практической конференции. - Екатеринбург, 2002.-С.84-85.

2.Активность каталазы и содержание МДА и фосфолипидов в субклеточных фракциях печени старых животных при регенерации в условиях стресса. [Текст] / Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов, Е.В. Попова. //Биохимия - медицине. Тезисы докладов Всеросийской научной конференции. Под редакцией А.И. Карпищенко. - Санкт - Петербург 2002. -С.-51 - 52.

3.Состояние ПОЛ и АОА в субклеточных фракциях печени старых животных при регенерации в условиях стресса [Текст] / В.А. Лукаш, Р.Х. Нафиков, С.Ю. Попов, В.К. Кротов, Д.Л. Щербаков // В сборнике: Биохимия: От исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику. Материалы межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья.- Оренбург 2003. - С.-7 -13.

4.Возрастные особенности нейрометаболической регуляции свободно-радикального окисления липидов при регенерации печени в условиях стресса [Текст] / В.А. Лукаш, В.Н. Мещанинов // Вестник уральской медицинской академической науки.- Екатеринбург 2006. - №4 (14).- С.- 66 -71.

5.Взаимовлияние ПОЛ и фосфолипидного обмена в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса и при предварительном воздействии адреналином в возрастном аспекте [Текст] / В.А. Лукаш, В.Н. Мещанинов // Госпитальный вестник Свердловского областного клинического психоневрологического госпиталя для ветеранов войн.- Екатеринбург 2007. - №2(15). - С.ЗЗ - 39.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 - в журнале ВАК Минобразования РФ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Активность фосфолипазы А2 является дополнительным способом регуляции процессов ПОЛ в субклеточных фракциях регенерирующей печени у старых животных в условиях стресса.

2. Предварительное воздействие адреналина способно регулировать процессы ПОЛ в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса через активацию фосфолипазы А2 и данный механизм более выражен у старых животных.

3. Предварительное воздействие ацетилхолином способствует снижению ПОЛ в митохондриальной субклеточной фракции регенерирующей печени в условиях стресса, и данный процесс более выражен у молодых животных.

4. При предварительном воздействии ацетилхолином у молодых животных наблюдается анаболизм мембранных фосфолипидов цитоплазмы, а у старых животных катаболизм мембранных фосфолипидов цитоплазмы и анаболизм мембранных фосфолипидов в ядерной субклеточной фракции регенерирующей печени в условиях стресса.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах текста, набранного на компьютере, содержит 26 таблиц и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований с их обсуждением, общего заключения, выводов и списка литературы, содержащего 132 источника на русском, 91 источник на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лукаш, Вячеслав Александрович

Выводы

1. Процессы ПОЛ в субклеточных фракциях печени в условиях стресса более активны у старых животных. Причиной тому являлась низкая активность антиокислительных ферментов у животных данного возраста.

4. Изменения активности фосфолипазы А2 при любых применённых воздействиях наиболее выражены в митохондриальной фракции клеток печени животных. В условиях предварительного воздействия адреналином изменения активности фосфолипазы А2 более выражены у старых животных.

5. Активность фосфолипазы А2 оказывает влияние на процессы ПОЛ в субклеточных фракциях печени. У старых животных, по сравнению со зрелыми, влияние фосфолипазы А2 на процессы ПОЛ значительно возрастает, особенно в условиях предварительного воздействия адреналином.

Заключение

Возрастные особенности системы ПОЛ - АОЗ и влияние их на процессы старения [Климов M. Е., Крашенинников С. В., 1997; Коркушко О. В., Лишневская В. Ю., 2002; В. К. Кольтовер, 2002; Анисимов В. Н., 2004; Ястребов А. П., Мещанинов В. Н., 2005], как и роль ПОЛ в патологических процессах [Брюсов П. Г. и др., 1992; Малышев В. Д.и др., 1994; Жданов Г. Г., Нодель М. Л., 1995; Briganti S., 2003; Oliveira С. P., 2005; Tikly M., 2006; Vuceljic M., 2006], в литературе освещены подробно. Отмечено участие ПОЛ и метаболизма фосфолипидов в регуляции процессов регенерации [Романова Ю. А., 1985; Пушкарёва М. Ю., 1991; Вартанян Л. С., 1992; Гумерова А. А., 1999; Gorla GR, 2001; Kume H, 2006]. Изучены возрастные особенности регенераторных процессов, в том числе и в печени [Bûcher N. 1963; Anisimov V. N., 1983; Мозжухина Т. Г. , 1992; Божков А. И., Малеев В. А., 2004]. Однако возрастные особенности влияния системы ПОЛ - АОЗ и метаболизма фосфолипидов на регенерацию, особенно на субклеточном уровне, изучены мало.

Не ослабевает интерес к нейромедиаторам, адреналину и ацетилхолину, как регуляторам системы ПОЛ - АОЗ [Терлецкая О. И., 1990; Ватаманюк М. 3., 1993; Лобанок Л. М., 1994; Долиба H. М., 1997; Саакян И. Р., 2001; Вишневский Е. Л., 2004] и процессов регенерации [Карагезян К., 1972; Вундер П. А., Вундер В. П., 1978] . Однако возрастные особенности влияния ацетилхолина и адреналина на процессы пероксидации липидов, особенно при регенераторных процессах, в литературе не освещены.

Объектом для исследований мы выбрали печень животных после гепатэктомии, как наиболее гомогенный и удобный для исследования орган с относительно небольшим разнообразием основных тканей и клеток.

Глава 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика животных использованных для исследования

Экспериментальные исследования выполнены на крысах-самцах линии Вистар зрелого (8-10 месяцев, массой 200 - 250 г) и старого (20 - 22 месяца, массой 400 - 500 г) возрастов. Взвешивание крыс производили на весах ВТЦ -10. Календарный возраст и масса тела, использованных в эксперименте, старых и зрелых крыс соответствовали аналогичным показателям, приводимым в работах ряда авторов [Лидер В.А., 1988; Ржевская В.Н., 1988, Мещанинов В.Н., 1999; Elmadta I. et all., 1987; Sletvold О., 1987; Tsuda Т. et all., 1988; Harrison D. E., 1988]. Использование нами в эксперименте крыс с возрастом в 20 - 22 месяца в качестве старых основывалось на рекомендациях В. Н. Мещанинова (1999), считающего, что исследование процессов старения необходимо сосредоточить в ходе их развития, когда имеется развернутая картина с выраженными процессами повреждения и адаптации, и существует достаточная уверенность в эффективности корригирующих воздействий. При использовании более старых животных в эксперименте может быть затруднена интерпретация результатов по возрастным особенностям коррекции нарушенных процессов ПОЛ с выходом на обсуждение различий механизмов старения. Старых и зрелых крыс (с известной датой рождения) доставляли из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.). Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария, получали пищевой рацион в соответствии с Приказом 1179 от 10.10.83, утвержденном МЗ СССР "Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения". В эксперимент брали здоровых животных, которых выдерживали на карантине не менее двух недель.

Для учета суточной и сезонной изменчивости исследуемых нами показателей [Хачатурьян М. Л. с соавт., 1995; Саэа1е в., 1987; Woodhouse Р.Я. е1 а11., 1993], а также для снижения систематической методической ошибки во всех проведенных нами исследованиях, наряду с опытными животными, в те же дни и часы в эксперименте использовали контрольных животных. Все исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом МЗ СССР № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» от 12.08. 1977 г (по состоянию на 20 октября 2006 г.), и Европейской конвенцией по защите экспериментальных животных, принятой в 1986 г.

2.2. Проводимые на животных воздействия

Эксперименты проводили в две серии на 80 старых и 80 зрелых белых крысах-самцах в каждой из серий. В первой серии эксперимент проводился без предварительного воздействия нейромедиаторов. Животные обоих возрастных категорий были поделены на четыре группы: контрольную и три опытных. Животные опытных групп подвергались либо иммобилизационному стрессу, либо двутретной гепатэктомии по Стоксу, либо иммобилизационному стрессу на фоне регенерации после гепатэктомии. В последнем случае животные подвергались стрессорному воздействию спустя 60 часов после проведения гепатэктомии. Через 84 часа после гепатэктомии, либо через 12 часов после стресса животные умерщвлялись декапитацией.

Во второй серии эксперимента животные обеих возрастных категорий также были поделены на контрольную и три опытных группы. Животные контрольной группы подвергались двутретной гепатэктомии и через 60 часов - иммобилизационному стрессу. Спустя 12 ч после окончания стрессорного воздействия крыс умерщвляли декапитацией. Животные опытных групп подвергались тем же воздействиям, но перед гепатэктомией в течение трёх дней им проводились инъекции одного из двух выбранных нами нейромедиаторов: адреналина или ацетилхолина. Для чистоты эксперимента, животным контрольной группы в течение трёх дней перед гепатэктомией проводили инъекции физиологического раствора. Инъекции нейромедиаторами проводились в дневное время, подкожно, в следующих дозировках: ацетилхолина хлорида 2 мл 1,25% раствора, адреналин гидрохлорида 0,3мл 0.1% раствора, на килограмм массы животного. Дозы были выбраны опытным путём, учитывая низкую чувствительность животных к препаратам.

Для достижения стресс реакции использовалась иммобилизация животных, часто упоминаемая для этих целей в литературных иточниках [Меньшикова Е. Б., 1994; Лннневська В. Ю., 2002; Мещанинов В. Н., 2003; Dellipizzi А., 2000; Giorgadze S., 2005]. Иммобилизация животных проводилось с 8 часов утра до 8 часов вечера помещением крыс в тесные пластиковые трубки не позволяющие двигаться, но не стесняющие дыхание. Диаметр трубок для всех животных был одинаков (70мм) но длина трубки для каждого животного подбиралась индивидуально (старые животные, как правило, крупнее).

Для доказательства стресс реакции у животных, подвергнутых иммобилизации проводилось исследование лейкоцитарного состава периферической крови [Гаркави Л.Х. и др., 1977; Горизонтов П.Д с соавт., 1983; Sternberg Е.М., 1992], изменения массы надпочечников [Г. Селье 1979], и двигательной активности животных в тесте «открытое поле» [Волчегорский И.А. с соавт., 2000].

Декапитация проводилась в утренние часы с использованием диэтилового эфира для анестезии, чтобы не вызывать добавочный болевой стресс.

Гепатэктомия с наложением лигатуры и удалением правой и средней долей печени проводилась в вечерние часы, под эфирным рауш-наркозом, для местной анестезии использовались небольшие (0,1мл) инъекции новокаина.

2.3. Получение субклеточных фракций гепатоцитов печени крыс

После вскрытия брюшной полости у крыс выделяли печень. Для удаления крови печень перфузировали холодным (1=+4С°) физиологическим раствором, разрезали на мелкие кусочки и трижды промывали холодным физиологическим раствором. Печень животных гомогенезировали в сахарозном буфере (рН 7,2)[Р. Досон, Д. Элиот, 1991] с разведением массы ткани к массе буфера в отношение 1:10. Гомогенизацию кусочков печени с целью разрушения клеток производили в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма (стекло-тефлон) с электроприводом при 3000 об/ мин. в течение 2 минут. Все манипуляции с печенью производили на холоду (на льду при температуре от 0 до + 4 градусов С0).

После получения гомогената его дифференцировали на субклеточные фракции центрифугированием в рефрижераторной центрифуге 5 мин. при 3000 об/мин. для получения ядерной фракции, и 20 мин. при 10000 об/мин для получения митохондриальной фракции. В исследованиях также был использован постмитохондриальный супернатант (ПМС). Таким образом в исследованиях использовались три субклеточные фракции, содержащие соответственно ядра в первой, митохондрии во второй и более лёгким содержимым цитоплазмы клетки в третьей (метод описан у Дж. Дигли, 1980). Фракции полученные после центрифугирования в виде осадка разводились тем же сахарным буфером до 5 мл - ядерная и до 3 мл - митохондриальная.

Полученные фракции подвергались трехразовой разморозке для разрушения мембран субклеточных органелл. После фракции дополнительно доразводились до 10 мл сахарозным буфером, чтобы обеспечить все методики материалом, и после того - подвергались вторичной гомогенизации (так же на льду) в течение 1 минуты.

2.4. Оценка уровня перекисного окисления липидов в субклеточных фракциях печени

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) субклеточных фракций печени оценивали по нескольким методам. Проводили измерение индуцированной хемилюминесценции в пробах (ХЛ), концентрации молонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей липидов (Гп).

2.4.1 Метод хемилюминисценции Исследование ХЛ проводили на приборе хемилюминометре 1420.1 с ФЭУ-140 (ООО «Конструктор», Н. Новгород). Прибор был соединен через интерфейс с персональным компьютером IBM PC/AT 286 с установленной на нём программой «Диагност», предназначенной для регистрации и расчета параметров ХЛ. Результаты исследования получали в виде графика зависимости интенсивности свечения от времени (3 минуты) в виде показателей светосуммы (S ХЛ) и амплитуды хемилюминесценции (h ХЛ) (Рис. 1, 2). Регистрацию ХЛ проводили по методу Г.А. Бабенко с соавт. (1983) и Я.И. Серкиза с соавт. (1984), описанным также у других авторов (Журавлёв А.И. с соавт., 1985; Зенков Н.К. с соавт., 1991; Добротина H.A. с соавт., 1991).

Ход исследования: 1 мл исследуемой субклеточной фракции вносили в термостатируемую затемненную кюветную камеру хемилюминометра, снабженную мешалкой для перемешивания пробы. Прогревали в течение 3 минут до температуры 37°С. Записывали фоновое значение свечения. Затем в пробу вводили 0,5 мл 2% перекиси водорода для стимуляции ПОЛ в стандартных условиях. По окончании заданного времени регистрации (180 секунд) компьютерная программа «Диагност» рассчитывала в относительных единицах величину максимального подъема кривой - «Ь» ХЛ (иначе называемую амплитудой быстрой вспышки) и площадь, ограниченную осью абсцисс и кривой ХЛ - «8» ХЛ (иначе называемую светосуммой). В данном методе «Ъ» ХЛ отражает в основном содержание в пробе легкодоступных для окисления соединений, в то же время «8» ХЛ отражает соотношение в пробе про- и антиоксидантов (Серкиз Я.И. с соавт., 1984; Досон Р. с соавт, 1991).

Однако оценка хемилюминисценции только по показателям «Ь» и «8» не позволяет выявить истинную антиоксидантную ёмкость образца при высоком содержании легко окисляемых субстратов (когда высокое «8» следует из высокого «Ь»). Для количественной оценки содержания антиоксидантов в пробе биоматериала нами были введёны понятия 8о и кЗ. Численно 8о отражает площадь идеального графика в виде прямоугольного треугольника, образованного двумя катетами, один из которых равен «И», а другой соответствует времени измерения (170 секундам):

80 = 11*170/2 или = 85

При идеальном графике свечение должно ровно снижаться от наиболее высоких показателей при впрыскивании перекиси до значений шума, что соответствует постепенному затуханию реакции. Однако реальный график и его 8, как правило, отличаются от идеального либо в большую, либо в меньшую сторону. Это отличие объясняется цепным характером люминесцирующих реакций с одной стороны, и наличием антиоксидантов -с другой. Цепной характер процессов ПОЛ присущ любой исследуемой пробе, поэтому мы предположили, что отличие «8» от «8о» заключается, прежде всего, в содержании антиоксидантов. Для выражения отношения «8» и «8о» нами был введён коэффициент к8: кБ = 80 / 8, или к8 = И * 85 / 8

Таким образом, коэффициент кЗ прямо пропорционален «Ь» и обратно пропорционально зависим от светосуммы «8» и отражает скорость снижения показателя хемилюминесценции после первоначального пика

IOS

144

Рис. 3. Хемилюминограмма 1.

7.00?

Рис. 4. Хемилюминограмма 2. t Чем выше кБ, тем большее количество собственных антиоксидантов присутствует в пробе.

На рис. 3 показана хемилюминограмма, характеризующая недостаточное количество собственных антиоксидантов. Показатель К8 ниже 1. Хемилюминограмма на рис. 4 отражает высокое содержание легкоокисляемых соединений при достаточном уровне собственных антиоксидантов. Показатель К8 выше 1.

Для калибровки хемилюминометра в качестве стандартного источника свечения использовали светодиод, дающий сверхслабое излучение в области 400 - 600 нм.

2.4.2. Метод определения МДА

Определение концентрации МДА проводили на основе общепринятого метода [Стальная И.Д. с соавт., 1977; Каган В.Е. с соавт., 1986; Камышников В. С., 2000, 2002]. Принцип метода заключался в том, что гидроперекиси при инкубации при £=90-100°С разлагаются до конечного продукта - МДА, который, в свою очередь, образует с тиобарбитуровой кислотой устойчивый окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации МДА и может определяться спектрофотометрически.

Ход определения: к 2 мл гомогената органа добавляли 0,5 мл 0,05 М трис-НС1-буфера с рН 7,36 и инкубировали в термостате при температуре 37 С0 в течение 1,5 часов. Затем производили осаждение белка добавлением 0,2 мл 50% трихлоруксусной кислоты на холоду, после этого пробы центрифугировали 15 минут при 4000 об/мин. К образовавшемуся супернатанту приливали 1 мл 0,8% тиобарбитуровой кислоты и помещали на кипящую водяную баню на 15 минут, затем вновь центрифугировали. Полученный раствор розового цвета фотометрировали при длинах волн 535 нм (максимум специфического поглощения образовавшегося триметинового комплекса) и 450 нм (неспецифическое поглощение). Расчет концентрации

МДА проводили по формуле ММда = (Е535 - Е450)-* 1,92 / Б, где Б -содержание белка в исследуемой субклеточной фракции, а Ммда -концентрация МДА в мкМоль/л. Фотометрию проводили на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, г.Санкт-Петербург).

2.4.3. Метод определения гидроперекисей

Принцип метода определения концентрации гидроперекисей (Гп) в пробе [Романова JL А., Стальная И. Д., 1977] основан на том, что в присутствии протонов Н+ гидроперекиси липидов окисляют ионы Fe2+ до

Ii Ol i

Fe . Ионы Fe обнаруживают с помощью тиоцианата аммония (роданистого аммония). Интенсивность окраски тиоцианата железа (3+) пропорциональна содержанию гидроперерекисей.

Ход определения: к 0,5 мл безбелкового экстракта исследуемой пробы добавляли 3,0 мл этанола (как фазы в которой растворяются гидроперекиси жирных кислот), 0,5 мл 10% р-ра соляной кислоты (HCl для подкисления о i среды), 0,5 мл 0,25% р-ра соли Моора (содержит ионы Fe ), и непосредственно перед фотоэлектроколориметрией - 0,5 мл 20% р-ра тиоцианата аммония. Сразу после добавления последнего реактива измеряли экстинкцию на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, г.Санкт-Петербург), настроив прибор по контрольной пробе без гидроперекисей. Безбелковый экстракт получали добавлением к 0,5 мл пробы 0,5 мл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 5% и центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об. в минуту. Расчет концентрации Гп проводили по формуле МГп = Е54о7 1.56 * Б, где Б — содержание белка в исследуемой субклеточной фракции, а Ммда — концентрация МДА в мкМоль/л. I

I 2.4.4. Коэффициент перекисного окисления липидов

Для комплексной оценки состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса при предварительном воздействии нейромедиаторами, и на основе предложенного С.Н. Нагорневым с соавт. (1996) коэффициента антиокислительной защиты (КАОЗ), во второй серии экспериментов нами был введён коэффициента перекисного окисления липидов (КПОЛ):

КПОЛ = (МДА/МДАср+Гп/Гпср+Ь/ЬСр)ЛЧ

Где N = 3 (количество исследуемых показателей, входящих в формулу),

МДА - содержание молонового диальдегида,

Гп - содержании гидроперекисей в пробе,

Ь - максимальная амплитуда хемолюминисценции, ср - средние значения по данной методике для всех животных.

2. 5. Оценка антиокислительной активности в субклеточных фракциях печени

Для оценки АОА проводилось исследование активности антиокислительных ферментов - каталазы и пероксидазы. Дополнительно во второй серии эксперимента учитывался коэффициент КБ отражающий скорость снижения показателя хемилюминесценции после первоначального пика и пропорциональный содержанию антиокислителей в пробе (раздел 2.4.1.).

2. 5.1. Метод определения активности пероксидазы

Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли по методу Попова Т. с соавт. (1971). Метод основан на регистрации снижения интенсивности окраски раствора при окислении перекисью водорода индигокармина в присутствии пероксидазы.

Ход определения. К 1 мл 0,2 М ацетатного буфера с рН 4,9 приливали 1 мл 0,0005 М раствора индигокармина и 0,5 мл гомогената тканей исследуемых органов или 0,5 мл гемолизата цельной крови в разведении 1 : 1000. Смесь прогревали 5 минут на водяной бане при I = 30 С0 и приливали к ней 0,5 мл 0,03 М перекиси водорода. Реакцию останавливали через 2 минуты добавлением 3 мл 20% серной кислоты. Фотометрию проводили на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, г.Санкт-Петербург), при длине волны 610 нм против дистиллированной воды.

Расчет активности пероксидазы осуществляли по формуле А = (Е к - Е о)' 1,9051/ Сб, где А - активность фермента (млкат/ г белка), Ек и Е0 - экстинкции контрольной и опытной пробы, соответственно, а Сб - концентрация белка исследуемой субклеточной фракции в г/л.

2.5.2 Метод определения активности каталазы

Для определения активность каталазы (КФ 1.11.1.6) нами использовался метод, разработанный Королюк М. А. с соавт. в 1988 году. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Ход определения: В длинные пробирки наливали 3 мл раствора 0,06% перекиси водорода, добавляли 0,02 мл гомогената печени. Пробирки помещали в термостат на 10 минут при температуре 37°С, затем вынимали из термостата и добавляли 1 мл 4% аммония молибденово-кислого. В контроле вместо гомогената используют 1 мл Н2О. Фотометрию проводили на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, г.Санкт-Петербург), при длине волны 410 нм.

Расчет активности каталазы осуществляли по формуле А = (Е к - Е о)' 1,33/ Сб, где А - активность фермента (млкат/ г белка),

Ек и Е0 - экстинкции контрольной и опытной пробы, соответственно, а Сс - концентрация белка исследуемой субклеточной фракции в г/л.

2. 5. 3. Коэффициент антиокислительной активности

Для комплексной оценки антиокислительной активности в субклеточных фракциях регенерирующей печени в условиях стресса при предварительном воздействии нейромедиаторами, и на основе предложенного С.Н. Нагорневым с соавт. (1996) коэффициента антиокислительной защиты (КАОЗ), во второй серии экспериментов нами был введён подобный коэффициент :КАОЗ.

КАОЗ = (Ак/Акер+Ап/Апер+Кв/Квер)^

Где N = 3 (количество исследуемых показателей, входящих в формулу),

Ак - активность каталазы,

Ап - активность пероксидазы,

Ь - коэффициент К8 хемилюминесценции, ср - средние значения по данной методике для всех животных.

2. 6. Оценка обмена фосфолипидов в субклеточных фракциях

Оценить значение перекисного окисления для вновь образующихся мембран субклеточных органелл регенерирующего органа невозможно без оценки фосфолипидного обмена в этих мембранах. Участие процессов ПОЛ в регуляции формирования мембраны уже доказано (Сауаггош М. е1 а1., 1999, Кохуако^^кл А. I., Уегсез1 А. Е., 1999). В нашей работе мы проводили измерение содержания в субклеточных фракциях фосфолипидов и измерение активности фосфолипазы А2 как основных показателей фосфолипидного обмена.

2. 6.1. Методика определения содержания фосфолипидов

Для определения концентрации фосфолипидов нами использовался метод описанный у В. С. Камышникова (2000 г.) в нашей модификации, необходимой для измерения концентрации фосфолипидов гомогената и субклеточных фракций печени.

Метод основан на определении концентрации органического фосфата, освободившегося при кислотном гидролизе фосфолипидов, экстрагированных из пробы. Измерение содержания неорганического фосфата проводится реакцией с молибдатом аммония.

Ход измерения:

К 1 мл. пробы (субклеточные фракции) добавляли 1 мл 10%-ной ТХУ для получения безбелкового экстракта. Центрифугировали полученные пробы 15 мин. при 3000 об/мин. Осадок после полного удаления ТХУ (просушка на фильтровальной бумаге) заливали 5 мл. спирт-эфирной смесью (этанол и диэтиловый эфир в соотношение 3:1) и оставляли на 24 часа в закрытом боксе. Потом безбелковый экстракт (без осадка) переливали в длинные пробирки и испаряли на водяной бане под вытяжкой, досуха. После этого в пробирки осторожно приливали по 1 мл. концентрированной хлорной кислоты, помещали в каждую по 2 стеклянных бусинки (для безопасного кипения) и ставили на песчаную баню при 180°С для гидролиза до обесцвечивания содержимого пробирок (как правило 60 - 120 минут). После обесцвечивания содержимого, пробирки охлаждали при комнатной температуре. В охлаждённые пробирки приливали по 3 мл. дистиллированной воды, по 1 мл молибдата аммония (7,5г молибдата аммония + 100мл Н20 + 100мл НКОз 32%) и по 1 мл восстанавливающего реактива (1% р-р аскорбиновой кислоты, приготовленный на 0,016% р-ре СиБОД Тщательно перемешивали содержимое пробирок и оставляли на 10 мин. при комнатной температуре. Опытные пробы фотометрировали против контрольной при 630 нм (красный светофильтр) в кювете с длинной оптического пути 0,5 см. Контрольная проба состояла из 1 мл концентрированной хлорной кислоты, 3 мл дистиллированной воды, 1 мл. реактива молибдата аммония и 1 мл восстанавливающего реактива.

Метод калибровали по стандартным разведениям фосфорной кислоты, с содержанием 0,01 мг фосфора на 1 мл раствора. Фотометрию проводили на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, г.Санкт-Петербург).

Расчет уровня липидного фосфора производили по формуле:

Соп (млМоль/л) = Еоп / Ест * 3,23 / Б

Где Б - содержание в данной субклеточной фракции белка.

Для повышения надёжности измерения, из каждой субклеточной фракции отбирали две пробы и использовали в дальнейшем среднее арифметическое между полученными результатами.

2. 6. 2. Методика определения активности фосфолипазы А2

Для определения активности в субклеточных фракциях печени - фермента фосфолипазы А2 [3.1.1.4] мы использовали методику С. А. Тужилина и А. И. Салуэнья в 1975г. Принцип метода сводится к определению титрованием количества жирных кислот, которые будут освобождены фосфолипазой Аг пробы из богатого фосфолипидами субстрата.

Ход определения: 0,25 мл биоматериала (опыт) выдерживали на водяной бане при t=60C° 15 мин. После этого добавляли 0.25 мл 1% трипсина в физиологическом растворе и выдерживали пробу 1 час при t=4C°, после чего добавляли 1 мл субстратной смеси и инкубировали 1 час при t=37C° в термостате. После инкубирования добавляли 0.5 мл CaС1г (0.06 Н) для остановки реакции. Одновременно готовили контрольную пробу, не содержащую трипсина и не подвергавшуюся инкубации. Субстратная смесь готовилась на основе раствора дезоксихолевой кислоты в 50% NaOH (рН=8), в котором растворяют эмульгированный в 70мл трис-буфера (pH 8) яичный желток (на 10 мл эмульгированного желтка - 30 мл дезоксихолата). Сразу после добавления СаСЬ и опытную и контрольную пробы титровали 0,01н NaOH в присутствии 1 -2 капли фенолфталеина до появления бледно розового окрашивания. Расчет активности фосфолипазы производили исходя из затраченного на титрование NaOH, вычитая показатели контроля из показателей опыта.

Активность фермента рассчитывали по формуле: (Von-VK)*0,01/B где АР - активность фосфолипазы А2 (млКат/ г белка), Von и VK соответственно объём затраченного на титрование NaOH в опытной и контрольной пробе, Б — содержание в данной субклеточной фракции белка.

2. 7. Определение содержания белка в пробе субклеточных фракций

За основу метода определения белка в субклеточных фракциях использовался биуретовый метод Кингслея-Вейксельбаума [Камышников 2000]. Принцип метода сводится к реакции растворенного белка в щелочной среде с сернокислой медью, с образованием соединения, окрашенного в фиолетовый цвет.

Ход определения: к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива добавляли, избегая образования пены, 0,1 мл пробы (субклеточной фракции). Через 30 минут пробу калориметрировали на ФЕКе в кювете с длинной оптического пути 10 мм при зелёном светофильтре (с максимальным пропусканием при длинне волны 540 и 560 нм, авторы методики допускали возможность использования среднего арифметического показателей экстинции при обеих длинах волн). Показатели абсорбции учитывали в сравнении с таковыми у контрольной пробы - 5 мл реактива, без добавлений субстратов. Пересчет производился с использованием экстинкции стандартных разведений белка 100 г/л по формуле Сб = Е0П* 100/Ест

Где Сб - концентрация белка (г/л), Еоп и Ест соответственно экстинкции опытной и стандартной проб. Фотометрию проводили на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, г.Санкт-Петербург).

2. 8. Методы статистической обработки результатов исследования

Результаты подвергали статистической обработке с использованием параметрических и непараметрических критериев. Предварительно производили отбрасывание выпадающих данных с достоверностью р<0,05 или 0,01 (Ашмарин И.П. с соавт., 1975; Зайцев В.М. с соавт., 2003). Для оценки достоверности отличий между сравниваемыми группами использовали t-критерий Стъюдента (Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1998), а также непараметрические критерии для парного сравнения показателей опытных и контрольных групп животных внутри групп (парный критерий Вилкоксона), и для сравнения независимых выборок (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) (Гублер Е.В. с соавт., 1973; Гланц С., 1998; Воробейчик Е.Л. с соавт., 2004). Для каждой группы значений вычисляли среднюю арифметическую величину, ошибку средней величины (в соответствии с параметрическими критериями статистики). Статистическая обработка результатов проводилась в ПСП EXCEL и STATISTICA 5.0 (StatSoft, Inc. 2001). При проверке статистических гипотез использован уровень значимости не более 5% (р<0,05).

2.9. Доказательства стресса у иммобилизуемых животных

Лейкоцитарную формулу (процентное соотношение различных видов лейкоцитов) подсчитывали в мазках периферической крови, высушенных на воздухе, зафиксированных в метаноле в течение 5 минут и окрашенных по I

Романовскому (азур-эозином в течение 25 минут) [Меньшиков В.В. с соавт., 1987]. Подсчет лейкоцитарной формулы проводили на 300 клеток по рекомендации [Караш Ю.М. с соавт., 1988] для более точного вычисления соотношения количества лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов, необходимого для определения разновидности адаптационной реакции [Гаркави JI.X. с соавт., 1976]. Для исследования состава периферической крови использовался микроскоп МБИ-6 (JIOMO, г.Санкт-Петербург).

Стереотипная гематологическая реакция на стресс выражается в увеличении количества циркулирующих сегментоядерных нейтрофилов на фоне лимфопении [Гаркави JI.X. с соавт., 1977; Чирки A.A. с соавт., 1994; Волчегорский И.А. с соавт., 2000]. В среднем и у старых и у зрелых крыс при иммобилизации уровень сегментоядерных нейтрофилов увеличивался на 84,55% (р<0,05), а лимфоцитарный индекс периферической крови понизился на 56,11% (р<0,05), что соответствует данным, приводимым указанными авторами при описании гематологической картины в условиях стресс-реакции.

Нервная система контролирует состояние вегетативных функций и механизмы эндокринной регуляции многих биологических систем, включая животных и человека позволяя осуществлять поведенческую адаптацию [Буреш Я. и др., 1991; Сох Т, 1978]. Поэтому изучение поведения животных может служить важным критерием оценки наличия стресс-реакции на экстремальное воздействие (иммобилизация). Исследование двигательной активности животных проводилось в тесте «открытое поле», предложенным Волчегорским И.А. с соавт. (2000). Нами производился подсчет суммарной двигательной активности животных (горизонтальной локомоции и вставания на задние конечности) спустя 12-часов после 12-часовой иммобилизации.

Исследование двигательной активности животных в тесте «открытое поле» показало у обеих возрастных групп при 12-часовой иммобилизации достоверное снижение суммарной двигательной активности. Так у старых животных двигательная активность, спустя 12-часов после 12-часовой иммобилизации, уменьшилась на 76,7% р<0,05, у зрелых животных - на 57,1% р<0,05, по сравнению с контролем. Это соответствует данным полученным Волчегорским И.А. с соавт. (2000). При изучении поведения животных в «открытом поле» после стресс-воздействия во всех случаях он наблюдал депрессию поведения, что, по мнению автора, может служить доказательством наличия стресс-реакции в виде осуществления поведенческой адаптации.

Масса надпочечников входит в классическую «триаду» Селье и является часто используемым показателем наличия стресс-реакции у животных. Взвешивались надпочечники животных спустя 12-часов после 12-часовой иммобилизации. Для взвешивания надпочечников использовались весы торсионные ВТ-500. Масса надпочечников в среднем увеличилась на 105% (р<0,05), что соответствует классическому представлению о стрессе [Г. Селье, 1979].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лукаш, Вячеслав Александрович, Екатеринбург

1. Айрапетянц М. Г. Роль свободно радикального окисления липидов в механизмах адаптации Текст. / М. Г. Айрапетянц, А. М. Вейн // Вестн. АМН СССР.- 1988.- №1.- С. 49 - 55.

2. Амосов Е. Н. Анализ жирнокислотного состава липидов у больных хроническим гепатитом и циррозом печени Текст. / Е. Н. Амосов, О. И. Лыховский, Т. С. Брюзгина // Врачебное дело, 1999.- №2.- С. 47 50.

3. Андреев А. А. Динамика компонентов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы у больных с тяжелой сочетанной травмой. Текст. / А. А. Андреев, В. И. Картавенко, П. П. Голиков, и др. // Вопр. мед. химии. 1998. - Т. 44, Вып. 5. - С. 485-493.

4. Анисимов В.Н. Мелатонин и эпиталамин угнетают процесс перекисного окисления липидов у крыс Текст. / В.Н. Анисимов, A.B. Арутюнян, В.Х. Хавинсон // Докл. Академии Наук. 1996. - Т. 348, № 2. - С. 265-267.

5. Анисимов В.Н. Старение и рак Текст. / В.Н. Анисимов // Клиническая геронтоолгия. 2003. - № 8. - С. 3-8.

6. Анисимов В.Н. Эволюция концепций в геронтологии: достижения и перспективы Текст. / В.Н. Анисимов. // Успехи геронтологии. 1999. - Вып. З.-С. 32-53.

7. Анисимов В. Н. Средства профилактики преждевременного старения (геропротекторы). Текст. / В.Н. Анисимов. // Успехи геронтол., 2004. №4. -С. 55-74.

8. Антонов В. Ф. Липиды мембран при фазовых превращениях Текст. / В. Ф. Антонов, Е. Ю. Смирнова, Е. В. Шевченко // М: Наука, 1992.- 136с.

9. Ашмарин И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов Текст. / И.П. Ашмарин, H.H. Васильев, В.А. Амбросов. Л.: Изд-во ЛГУ им. A.A. Жданова, 1975. - 76 с.

10. Бабенко Г.А. О роли процессов свободно-радикального окисления в тканях организма по данным спонтанной и индуцированной хемилюминесценции Текст. / Г.А. Бабенко, Я.И. Гонский, И.М. Антоник // Биохемилюминесценция. -М.: Наука, 1983.-С. 164-179.

11. Барабой В. А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов Текст. / В. А. Барабой // Успехи соврем, биол., 1991.- Т. 111, №6- С. 923931.

12. Барабой В. А. Роль перекисного окисления в механизме стресса. Текст. / В. А Барабой // Физиол. журн. им. Сеченова, 1989.- т.35, №5 — С. 8597.

13. Белай И. М. Изменение фармакометаболизирующей функции печени в процессе старения Текст./ И. М. Белай // Ускоренное старение, связь с возрастной патологией: Тез. Докл. Науч. конф., 13-15 окт. 1992 г. Киев, 1992? С. 17.

14. Блюгер А. Ф. Ультраструктурная патология печени: Электронно микроскопический атлас Текст. / А. Ф. Блюгер, В. К. Заяцмане, О. Я. Карташова//Рига: Зинатне, 1989.- 319с.

15. Богацкая Л. Н. Липидный состав и свойства плазматических мембран при старении и некоторых видах экспериментальной патологии Текст. / Л. Н. Богацкая, О. К. Кульчицкий, Р. И. Потапенко // Вестн. АМН. 1990. № 1. С. 31-34.

16. Божков А. И. Снижается ли способность печени к регенерации с возрастом? Динамика функциональной активности митохондрий в процессе регенерации печени Текст. / Божков А. И., Малеев В. А. // Успехи геронтологии. 2004. - Вып. 13 - С. 58-65.]

17. Бродский В. Я. Форма пролиферации клеток при регенерации тканей. Клеточная полиплоидия. В кн.: Современные проблемы регенерации Текст. / В. Я. Бродский // Йошкар-Ола: Марийский гос. университет, 1980.- 182с.

18. Брюсов П. Г. и др. Состояние перекисного окисления липидов при травматическом шоке и некоторые пути его коррекции Текст. / Брюсов П. Г., Шарапов Г. Н., Елькин А. И., Пивоваров А. А. // Вестн. хир. 1992. - Т. 149, №9-10.-С. 216-219.

19. Бурлакова Е.Б. Регуляторная функция мембран при злокачественном росте Текст. / Е.Б. Бурлакова, Н.П. Пальмина // Вестн. АМН СССР. 1982. -№3. - С.74-86.

20. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения Текст. / Я. Буреш, О. Бурешова, Д. П. Хьюстон // Под ред. Батуева А. С.; Пер. с англ. Е. Н. Живописцевой- М.: Высш. шк., 1991. 399 с.

21. Ванюшин Б. Ф. Молекулярно-генетические механизмы старения Текст. / Б. Ф. Ваеюшин, Г. Д. Бердышев // М., 1977.- 144с.

22. Вартанян JI. С. Образование супероксидных радикалов в мембранах субклеточных органелл регенерирующей печени Текст. / JI. С. Вартанян, И. П. Садовникова, С. М. Гуревич, И. С. Соколова // Биохимия.- 1992.- Т.57, №5.- С. 671 -678.

23. Владимиров Ю. А. Биологические мембраны и ^запрограммированная смерть клетки Текст./ Ю. А. Владимиров // Соросовский образовательныйжурнал.- 2000.- №9.- С. 2 9. |

24. Влияние липидов мембран на активность ферментов. Бурлакова Е.Б., Джалябова М.И., Гвахария В.О., Глущенко H.H., Молочкина Е.М., Штолько В.Н. Черноголовка, 1978. - 33с.

25. Воейков В.Л. Роль реакций гликирования и свободно-радикальных процессов в развитии и предотвращении старения Текст. / В.Л. Воейков // Клиническая геронтология. 1998. - №3. - С. 57

26. Воер В.А. Стрессовая модель ускоренного старения Текст. / В.А. Воер // Ускоренное старение, связь с возрастной патологией: Тезисы докладов научной конференции. Киев, 13-15 октября, 1992. Киев, 1992. - С. 26.

27. Вундер П. А. Стимуляция регенерации печени под влиянием сочетанного воздействия адреналина, глюкагона и тиофилина. Текст. / П. А Вундер, В. П. Вундер // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1973. №8, С. 109 - 111.

28. Гаврилов И. В. Воздействие различных газовых режимов на состояние перекисного окисления липидов в условиях возрастной инволюции Текст. /112

29. Автореф. дис. канд. биол. наук // И. В. Гаврилов, Уральская государственная медицинская академия. Екатеринбург, 2000. - 23 с.

30. Газиев А. И., Подлучкий А. Я. Нестабильность митохондриального генома Текст. / А. И. Газиев, А. Я. Подлучкий // Митохондрии в патологии. Материалы Всеросийского рабочего совещания. Пущино, 2001. - С. 51-53.

31. Гаркави Л. X. Адаптационные реакции и резистентность организма / Л. X. Гаркави, Е. Б. Квакина, М. А. Уколова Текст. // 2 изд. Ростов: Изд - во Рост, ун - та, 1976. - 120 с.

32. Гланц С. Медико-биологическая статистика Текст. / С. Гланц. Пер. с англ. — М. 1998.-459 с.

33. Глыбочко П. В. Состояние эндокринной системы и её связь с тканями мишенями в пожилом возрасте Текст. / П. В. Глыбочко, А. А. Свистунов // Клиническая геронтология.- 2006.- т.6, №5-6.- С. 40 42.

34. Голубев А. Г. Изнанка метаболизма (обзор) Текст. / А. Г. Голубев // Биохимия. 1996. - Т. 61. - С. 2018-2039.

35. Грашин Р. А. Состояние свободнорадикального окисления при тяжелой сочетанной травме Текст.: Автореф. дис. канд. мед. наук. С.-Пб., 1996. — 34с.

36. Гродзинский Д.М. Надежность и старение биологических систем Текст. / Д.М. Гродзинский, В.П. Войтенко, В.К. Кольтовер. Киев: Наукова думка, 1987. - 172 с.

37. Гублер Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях Текст. / Е.В. Гублер, A.A. Генкин. -Л.- 1973.-141 с.

38. Гумерова А. А. Репаративная регенерация печени после повреждения нитратом свинца : Автореф. . канд. мед. наук. / А. А. Гумерова ; // Казанский гос. мед. университет.- Казань, 1999.- 20 с.

39. Гусев В. А. Свободно радикальная теория старения в парадигме геронтологии Текст. /Гусев В. А. //Успехи геронтол — 2000-№4.-С. 41-49.

40. Давыдов В. В. Особенности свободно радикальных процессов в печенивзрослых и старых крыс при стрессе Текст. / В. В. Давыдов, И. В. Захарченко, В. Г. Овсянников // Бюлл. эксп. биологии и медицины. 2004 — Том 137, №2.-С. 160-163.

41. Давыдов В. В. Возрастные особенности изменения углеводного обмена в печени крыс при иммобилизационном стрессе Текст. / В. В. Давыдов, И. В. Захарченко, В. Г Овсянников // Бюлл. эксп. биологии и медицины 2005Т. 137, №2 - С. 160- 163.

42. Дбаг М. М. Холинергическая регуляция энергетического обмена в митохондриях миокарда: Автореф. . канд. биологических наук. / М. М. Дбаг; Львовская гос. мед. академия.- Львов, 1990.- 20 с.

43. Дильман В.М. Старение, климакс и рак Текст. / В.М. Дильман // Л.: Медицина, 1968.-378 с.

44. Добротина H.A. Хемилюминесценция в оценке гомеостаза человека: Методические указания Текст. / H.A. Добротина Г.П. Ежова, М.В. Курова. -Н. Новгород: Изд-во Нижегород. гос. ун-та, 1991. 38 с.

45. Довганский А.П. Печень при экстремальных состояниях Текст. / А. П. Довганский//Кишинев «Штиница»,- 1989. 136с.

46. Долиба Н. М. Реципрокное сукцинату и катехоламинам действие введённых альфакетоглутарата натрия и ацетилхолина на окисление субстратов в митохондриях сердца и нейрогуморальный статус организма /114

47. Н. М. Долиба, Н. Н. Кургалюк, Абдула Локаль, И. В. Шостаковская, М. Н. Кондрашова // Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве: Сб. науч. статей.- Пущино, 1997.- С. 21-27.

48. Ескунов П.Н. Возможности коррекции постишемических перфузионных изменений миокарда крыс с помощью финоптина Текст. / П.Н. Ескунов // Бюллетень СО РАМН.- 2005.- №3 (117).

49. Жданов Г. Г. Проблемы гипоксии у реанимационных больных в свете свободнорадикальной теории Текст. / Г. Г. Жданов, М. Л. Нодель // Анестезиол. и реаниматол. 1995. - № 1. - С. 7-11.

50. Журавлёв А.И. Метод регистрации перекисной хемилюминесценции плазмы крови Текст. / А.И. Журавлёв, М.П. Шерстнёв // Лабораторное дело. 1985.-№10.-С. 586-587.

51. Зайцев В.М. Прикладная медицинская статистика Текст. / В.М. Зайцев, В.Г. Лифляндский, В.И. Маринкин. С.Пб- ООО «Издательство ФОЛИАНТ»,- 2003. - 432 с.

52. Захарченко И. В., Овсянников В. Г., Давыдов В. В. Роль свободнорадикальных процессов в возрастном изменении энергетического обеспечения крыс при стресс Текст. // Успехи геронтол. 2003. - Вып. 12. -С. 99-102.

53. Зенков Н.К. Индуцированая перекисью водорода биохемшпоминесценция сыворотки крови Текст. / Н.К. Зенков, Е.Б.

54. Меньшикова // Лабораторное дело 1991- № 8. - С. 30-32.

55. Зиновьева В. Н. Свободно-радикальное окисление ДНК и его биомаркер окисленный гуанозин Текст. / В. Н. Зиновьева, О. В. Островский. / Вопр. медиц. химии. 2002. - Т. 48, № 5. - С. 419 - 431.

56. Зубов В. А. Динамика состава липидов в процессе регенерации печени. Сравнительные аспекты изучения регенерации и клеточной пролиферации. Часть 2 Текст. / В. А. Зубов, А. В. Каргаполов // М., 1985.- С. 369 372.

57. Иванова-Незнамова А. Ю. К вопросу о функциональных и морфологических изменениях в печени в связи с возрастом Текст. / А. Ю. Иванова-Незнамова, В. Б. Золотаревский, В. П. Полянский // Терапевтический архив, 1968.- №5,- С. 42 48.

58. Каган В.Е. Проблемы анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов Текст. / В.Е. Каган, О.Н. Орлов, Л.Л. Прилипко // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. ВИНИТИ АН СССР. М., 1986. - Т. 18. -С. 1-131.

59. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике Текст. / B.C. Камышников. В 2 т.- Мн.: Беларусь, 2000. - Т. 1. 495 е.: ил. - Т. 2. 463 е.: ил.

60. Карагезян К. Фосфолипиды и их роль в жизнедеятельности организма Текст. / К. Карагезян. // «Анастан». Ереван. - 1972. - 267с.

61. Караш Ю. М., Чижов А. Я. Использование газовых гипоксических смесей для оптимизации лучевой терапии злокачественных новообразований Текст./ Ю. М. Караш, А. Я. Чижов // Сборник научных трудов. Обнинск, 1984.-С.71.

62. Кармалита Е. Г. и др. Активность фосфолипазы Аг в липосомах

63. Текст. / Е. Г. Кармалита, В. Ю. Серебров, С. В. Новицкий, Т. В. Новицкая //Бюл. эксп. биол. и мед. 2002 т. 134.- №9.- С 291 - 295.

64. Клишов А. А. Гистогенетическая концепция регенерации тканей. Сравнительные аспекты изучения регенерации и клеточной пролиферации. Часть 1 Текст. / А. А. Клишов // М., 1985.- С. 126 130.

65. Ковру гина С. В. Окислительная модификация белков и антиокислительной системы плазмы крови у пожилых людей с сосудистой деменцией Текст. / С. В. Ковругина// Автореф. дис. канд. мед. наук. С.-Пб-2000.-21с.

66. Кольтовер В.К. Свободнорадикальная теория старения: современноесостояние и перспективы Текст. / В.К. Кольтовер // Успехи геронтологии. -С.-Пб.: Эскулап.- 1998.-Вып.2. С. 37-42.

67. Кольтовер В. К. Свободно радикальная теория старения: исторический очерк. Текст. / В. К. Кольтовер // Усп. геронт. 2000. №4.- С. 33-40.

68. Коркушко О.В. Современные представления о патогенетических факторах гипоксии в пожилом возрасте Текст. / О.В. Коркушко // Вестник АМН СССР. 1990. -N.1. - С. 41-45.

69. Кольтовер В. К. Свободные радикалы Текст. / В. К. Кольтовер // Хим. физика.-1996.-Т. 15.-С. 101-106.

70. Коркушко О.В. Пептидные препараты тимуса и эпифиза в профилактике ускоренного старения Текст. / О.В. Коркушко, В.Х. Хавинсон, Г.М. Бутенко, В.Б. Шатило. СПб.: Наука, 2002. - 202 с.

71. Коркушко О. В. Значение изменения отдельных показателей внутрисосудистого гомеостаза в развитии циркуляторной гипоксии при старении Текст. / О. В. Коркушко., В. Ю. Лишневская. // Усп. геронт-2002.-№9.-С 78-80.

72. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы Текст. / М. А. Королюк, Л. И. Иванова, А. Г. Майорова и др. // Лаб. дело. 1988. - №1. - С. 16-19.

73. Костюк В.А., Устойчивость продуктов окисления липидов печени крыс и пути их утилизации. Текст. / В.А. Костюк // Биохимия 1986 - №8 - с.125-131.

74. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биологич. спец. вузов Текст. / Г.Ф. Лакин. // 3 изд., перераб. и доп. М.: Высш. школа, 1980. - 293 е.: ил.

75. Левицкая Е. Л. Возрастные особенности репликации ДНК в интактной печени белых крыс Текст. / Е. Л. Левицкая // Бюлл. экспериментальной биол. и медицины, 1980.- №6.- С. 733 735.

76. Литошенко А. Я. Митохондрии и старение Текст. / А. Я. Литошенко, М. Хартвиг // Пробл. старения и долголетия. 1998. - Т.7, № 3. — С. 241 -250.

77. Л1шневська В. Ю. Реолопчш властивост1 кров! в ос1б похилого вжу, хворих на 1ХС Текст. / В. Ю Л1шневська //Буковинський медичний вюник.-2002. Т. 6, №4.- С. 93-96.

78. Лишневская В. Ю. Роль свободно-радикального окисления в нарушение гемоваскулярного гомеостаза при старении Текст. / В. Ю Лишневская //Усп. геронтол -2004-Вып. 13.- С. 52- 57.

79. Лобанок Л. М. Гормоны и старение: регуляция сократительной функции сердца / М. Л. Лобанок,- Минск: Наука и техника, 1994.- 200 с.

80. Малышев В. Д. Нарушение процессов перекисного окисления липидов у хирургических больных на этапах лечения Текст. / В. Д. Малышев, А. Ф. Потапов, В. Е. Трепилец, В. Ю. Шило // Анестезиол. и реаниматол. 1994. -№6.-С. 53-59.

81. Мампория Н. М. Морфофункциональные особенности печени после частичной гепатэктомии (в возрастном аспекте). Сравнительные особенности изучения регенерации и клеточной пролиферации. Часть 2 Текст. / Н. М.

82. Мампория, Т. Г. Мачавариани, К. Г. Кавтиашвилли // М., 1985,- С. 191 194.

83. Медведев Е. А. Влияние адреналина на активность и функциональную подвижность трансгидрогеназы во внутренней мембране митохондрий Текст. / Е. А. Медведев // Вопросы медицинской химии.- 1994,- т.40, №1.- С. 7-10.

84. Меерсон Ф. 3. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука. - 1981. - 276с.

85. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотницкая и др.; Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987, - 368 е., ил.

86. Меньшикова Б. Е. Биохимия окислительного стресса (оксиданты и антиоксиданты) Текст. / Е. Б. Меньшикова, Н. К. Зенков, С. М. Шергин.-Новосибирск.: Наука, 1994.- 203с.

87. Меньшикова Е. Б. Молекулярно клеточные механизмы развития окислительного стресса. Текст.: Автореф. Дис. . д-ра мед. наук.: 14. 00. 16. /РОС. АМН. Новосибирск, 1998.-48с.

88. Мещанинов В.Н. Состояние перекисного окисления липидов системы крови в процессах возрастной инволюции организма и в условиях воздействия экстремальных факторов Текст.: Автореф. дис. докт. мед. наук/ В.Н. Мещанинов. Челябинск, 1999. - 35 с.

89. Митохондрии как многоликий Янус. Обзор / Д.Б. Зоров, Н.К. Исаев, Е.Ю. Плотников, Л.Д. Зорова, Е.В. Стельмашук, А.К. Васильева, A.A. Архангельская, Т.Г. Хряпенкова // Биохимия, 2007, том 72, вып. 10, с 13711384.

90. Михельсон В.М. Наследственное преждевременное старение человека Текст. / В.М. Михельсон // Клиническая геронтология. 1996. - № 4. — С. 4— 10.

91. Мозжухина Т. Г. и др. Регенерирующая печень как модель ускоренного старения Текст. / Т. Г Мозжухина, В. Н Чабаный, А. Я Литошенко. // Ускоренное старение, связь с возрастной патологией: Тез. докл. науч. конф., 13 15 окт.

92. Новикова С. Н. Возрастные особенности энергетического обмена и белоксинтезирующей функции печени крыс после острого кровопускания Текст./ С. Н. Новикова: Автореф. Дис. канд. мед. наук / Киев. мед. ин-т. Киев, 1978. - 22 с.

93. Немченко Н. С. Биохимические механизмы патогенеза тяжелой сочетанной травмы Текст./ Н. С. Немченко // Клин. мед. и патофизиол. -1997.-№2.-С. 85-92.

94. Парамонова Г. И. // Докл. АН Украины. 1994. №6. С. 174-177.

95. Петрович Ю. А. Свободно-радикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса Текст./ Ю. А. Петрович, Д. В.

96. Гуткин // Пат. физиол.- 1986 № 5 - С. 85-92.

97. Пептидные препараты тимуса и эпифиза в профилактике ускоренного старения / Каркушко О.В., Хавинсон В.Х., Бутенко Г.М., Шатило В.Б. // СПб.:Наука, 2002. 202с.

98. Подколзин А. А. Антиоксидантная защита при старении и некоторых патологических состояниях с ним связанных Текст./ А. А. Подколзин, В. И. Донцов // Клин, геронтол.- 2001№3-4 С. 50 - 58.

99. Попов Т. Метод определения пероксидазной активности крови / Т. Попов, JI. Нейковска // Гигиена и санитария. 1971. - № 10. - С. 89-91.

100. Романова J1. А. Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоционата аммония Текст. / JI. А. Романова, И. Ф. Стальная // Современные методы в биохимии М: Медицина, 1977 - С. 77 - 78.

101. Романова Ю. А. Пролиферативная система и клеточный гомеостаз тканей. Сравнительные особенности изучения регенерации и клеточной пролиферации. Часть 2 Текст. / Ю. А. Романова, А. И. Антохин // М., 1985.-С. 251 -255.

102. Саакян И. Р. Активация и ингибирование сукцинат зависимого транспорта Са2+ в митохондриях печени при развитие адаптационных реакций Текст. / И. Р. Саакян, С. Г. Саакян, М. Н. Кондрашова // Биохимия, 2001.- т.66, №7.- С. 976 984.

103. Саркисов Д. С. Очерки по структурным основам гомеостаза Текст. / Д. С. Саркисов // М: Медицина, 1977.- 350 с.

104. Саркисов Д. С. Морфология компенсаторно приспособительных процессов Текст. / Д. С. Саркисов // Итоги науки и техники: Патологическая анатомия,- М: Медицина, 1983.- ч.4.- 136с.

105. Серкиз Я.И. Хемилюминесценция крови в экспериментальной иклинической онкологии Текст. // Я.И. Серкиз, Е.Е. Чеботарёв, В.А. Барабой. Киев: Наукова думка, 1984. - 184 с.

106. Сидорова В.Ф. Возраст и восстановительная способность органов у млекопитающих Текст. / В.Ф. Сидорова // М.: Медицина, 1976. 200 с.

107. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации высших ненасыщенных жирных кислот Текст. / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии. Москва, 1977. - С. 63-64.

108. Терлецкая О. И. Особенности изменения энергетического обмена при развитии дистрофических и компенсаторных процессов в ткани печени: Автореф. . канд. биол. наук. / О. И. Терлецкая; Львовский гос. мед. институт.- Львов, 1990,- 18 с.

109. Титов С. А. Современные представления о механизмах старения Текст. / С. А. Титов, В. Н. Крутько // Физиология человека. 1996. Т. 22, № 27 С. 118-123.

110. Тужилин С. А. / Метод определения фосфолипазы А2 в сыворотке крови Текст. / С. А. Тужилин, А. И. Салуэнья // Лаб. дело, 1976, №6, с. 334335.

111. Урываева У. В. Регенерация печени, повреждённой мутагенами. Сравнительные аспекты изучения регенерации и клеточной пролиферации. Часть2 Текст. // У. В. Урываева, В. М. Фактор, В. П. Бродский // М., 1985.- с. 316-319.

112. Фролькис В. В. Регулирование, приспособление и старение Текст. / В. В. Фролькис //Л.: Наука, 1970. 160с.

113. Фролькис В. В. Старение и увеличение продолжительности жизни — Л:Наука.- 1988.-239 с.

114. Фролькис В.В. Ускоренное старение, филогенез и этагенез Текст. /

115. B.В. Фролькис // Ускоренное старение, связь с возрастной патологией: Тезисы докл. науч. конф. Киев, 13-15 октября, 1992 г. Киев, 1992. - С. 96.

116. Фролькис В. В., Мурадян X. К. Старение, эволюция и продление жизни. Киев: Наук. Думка - 1992.- 336 с.

117. Хазанов В. А. Возрастные особенности гепатопротекторного действия митохондриальных субстратов при стрессе и интоксикации Текст. / В. А. Хазанов, К. Ю. Васильев // Бюл. эксперим. биол. и мед.- 2005.- прил.№1.- С. 54-60.

118. Anantharaju A., Feller А. // Gerontology. 2002. - Vol. 48, № 6. - P. 343353.

119. Culter R.G. Human longevity and aging: possible role of reactive oxygen species/R.G. Culter // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1991.-Vol. 621.-P. 1-28.

120. Culter R.G. Oxidative stress: Its potential relevance to human disease and longevity determinants / R.G. Culter // Age. 1995. - Vol. 18, № 3. - P. 91-96.

121. Harman D. Prolongation of life: role of free radical reactions in aging / D. Harman // J. of the Amer. Geriatrics Society. 1969. - P. 721-735.

122. Harman D. Free-radical theory of aging: inversing the functional life span / D. Harman // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 717. - P. 1-15.

123. A decrease of free radical production near critical targets as a cause of maximum longevity in animals Text. / Barja G, Cadenas S, Rojas C, Lopez-Torres M, Perez-Campo R. // Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol. 1994 Aug;108(4):501-12.

124. Age-related changes in protein and lipid oxidation in the liver of prematurely aging rats OXYS Text. / NG Kolosova NG, AIu Grishanova, ZhS Krysanova, TV Zueva, IuA Sidorova, OI Sinitsyna // Biomed Khim. 2004 Jan-Feb;50(l):73-8.

125. Aging-related oxidative stress depends on dietary lipid source in rat postmitotic tissues / Ochoa JJ, Quiles JL, Ibanez S, Martinez E, Lopez Frias M, Huertas JR, Mataix J. // J Bioenerg Biomembr. 2003 Jun;35(3):267-75.

126. Anisimov V. N. Carcinogenesis and aging // Adv. Cancer Res. 1983. -Vol.40.- P. 265 - 324.

127. Arakawa M. N-acetylcysteine and neurodegenerative diseases: Basic and clinical pharmacology / Arakawa M, Ito Y // Cerebellum. 2007 Jan 19;:l-7.

128. Aydogan S. Melatonin and nitric oxide Text. / Aydogan S, Yerer MB, Goktas A. // J Endocrinol Invest. 2006 Mar;29(3):281-7.

129. Bardieri M., Rizzo M. R., Manzell D. at al.// Exp. Gerontol. 2003. Vol. 38, N 1-2. P. 137-143.

130. Brody J. A., Grant M. D. // Aging. 2001. - Vol. 13, № 2. - P. 64-67.

131. Briganti S. Antioxidant activity, lipid peroxidation and skin diseases. What's new Text. / S. Briganti, M. Picardo // J Eur Acad Dermatol Venereol.- 2003.-Nov;17(6).- C.663-9.

132. Bucher N. Regeneration of mammalian liver // Int. Rev. Cytol. — 1963. — Vol. 15.-P. 245.

133. Cadenas E., Davies K. J. A. // Free Rad. Biol. Med. 2000. Vol. 29, N 3-4. P. 222-230.

134. Cadenas E., Kelvin J. A. D. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. // Free Radical Biology and Medicine. 2000.- 29(3-4). P 222230.

135. Calorie restriction attenuates age-related alterations in the plasma membrane antioxidant system in rat liver Text. / De Cabo R, Cabello R, Rios M, Lopez-Lluch G, Ingram DK, Lane MA, Navas P // Exp. Gerontol. 2004 Mar;39(3):297-304.

136. Cavazzoni M., Baroi S., Baracca A. et al. The affect of aging and an oxidative stress on peroxide levels and the mitochondrial membrane potential in isolated ret hepatocytes // FEBS Lett. 1999. - Vol. 36. - P. 53-56.

137. Comfort A The biology of senescence. Edinbourgh; London: Churchill Livins, 1979.-414p.

138. Cox T. Stress. London: Macmillan press, 1978. - 213 p.

139. Champion H. R., Sacco W. J., Copes W. S. et al. // Ibid. 1989. - Vol. 20. -P. 623.

140. Characterization of the genetic apparatus of cell nuclei and mitochondria of mouse liver during aging. Text. / Mozzhukhina TG, Potapenko RI, Orlichenko LS, Kul'chitskii OK, Litoshenko Ala. // Ukr Biokhim Zh. 1996 Jul-Aug; 68(4):84-90.

141. Culter R.G. Human longevity and aging: possible role of reactive oxygen species / R.G. Culter // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1991. - Vol. 621. - P. 1-28.

142. Culter R.G. Oxidative stress: Its potential relevance to human disease and longevity determinants / R.G. Culter // Age. 1995. - Vol. 18, № 3. - P. 91-96.

143. Dellipizzi A., Guan H., Tong X. Lipoxygenaze dependent mechanisms in hypertension //Clin. Exp. Hyperttens.- 2000.- Vol. 22. - P. 181 - 192.

144. Desagher S., Martinou J. //Trends Cell. Biol. 2000. Vol. 10. P. 369-377.

145. Dietary antioxidant supplementation reduces lipid peroxidation but impairs vascular function in small mesenteric arteries of the streptozotocin-diabetic rat

146. Text. / Palmer AM, Thomas CR, Gopaul N, Dhir S, Anggard EE, Poston L, Tribe RM // Diabetologia. 1998 Feb;41(2): 148-56.

147. Effects of fasting on oxidative stress in rat liver mitochondria Text. / Sorensen M, Sanz A, Gomez J, Pamplona R, Portero-Otin M, Gredilla R, Barja G. // Free Radic Res. 2006 Apr;40(4):339-47

148. Fatty acid oxidation products in human atherosclerotic plaque: an analysis of clinical and histopathological correlates Text. / E. I. Waddington, K. D. Croft, K. Sienuarine, B. Latham, I. B. Puddey // Atherosclerosis.- 2003.- Mar; 167(1).1. C. 111-20.

149. Giorgadze S. The ESR study of redox state of hepatocytes during'agin in white rats. Text. / Giorgadze S., Rukhadze R., Sanikidze T. // Georg. Med. News. 2005. №1, P. 62-64.

150. Gorla GR. Polyploidy associated with oxidative injury attenuates proliferative potential of cells Text. // Gorla GR, Malhi H, Gupta S // J Cell Sei. 2001 Aug; 114(Pt 16):2943-51

151. Harman D. Prolongation of life: role of free radical reactions in aging / D. Harman // J. of the Amer. Geriatrics Society. 1969. - P. 721-735.

152. Harman D. Free-radical theory of aging: inversing the functional life span /

153. D. Harman // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1994. - Vol. 717. - P. 1-15.

154. Harman D. Role of antioxidant nutrients in aging: Overview / D. Harman // Age. 1995. - Vol. 18, N.2. - P. 51-62.

155. Harman D. Role of antioxidant nutrients in aging: Overview / D. Harman // Age. 1995.-Vol. 18,N.2.-P. 51-62.

156. Harrison D.E., Archer J.R. Biomarkers of aging: tissue markers. Future research needs, strategies, directions and priorities // Exp. Gerontol. 1988. - Vol. 23, № 4 - 5. - P. 309-321.

157. Healing effect of ketanserin on chronic leg ulcers in patients with diabetes

158. Text. / Quatresooz P, Kharfi M, Paquet P, Vroome V, Cauwenbergh G, Pierard GE. // J Eur Acad Dermatol Venereol. 2006 Mar;20(3):277-81

159. Kenyon J The role of DNA damage repair in aging of adult stem cells / Kenyon J, Gerson SL // Nucleic Acids Res. 2007;35(22):7557-65.

160. Kim JD. Influence of age, exercise, and dietary restriction on oxidative stress in rats. Text. / Kim JD, McCarter RJ, Yu BP. // Aging (Milano). 1996 Apr;8(2): 123-9.

161. KirkPatrick D. T. et al. Detection of in vivo lipid peroxidation using the thiobarbituric acid assay for lipid hydroperoxides. // J. Biochem. Toxicol. 1986, Mar., 1(1), p. 93-104.

162. Kondrashova M. N., Dolida N. M. // FEBS Lett., 1988.- Vol.243, №2.- P. 153-155.

163. Konopliannikov AG. Ischemia/reperfusion" for stem cells of two "critical" cell renewal systems of organism Text. / Konopliannikov AG, Konopliannikova OA, Proskuriakov Sla // Radiats Biol Radioecol. 2005 Sep-Oct;45(5):605-9.

164. Kovalenko S. A., Kopsidas G., Kelso J. and Linnane A. W. Deltoid human muscle mtDNA is extensively rearranged in old age subjects // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - Vol. 232. - P. 147-152.

165. Kowaltowski A. J., Vercesi A. E. Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative stress // Free Radical Biol. Med. 1999. - Vol. 26, № 3-4. -P. 463-471.

166. Kulkybaev GA. The effect of nutritional factors on lipid peroxidation in the microsomes of rats of varying ages Text. / Kulkybaev GA. // Vopr Pitan. 1992 Jul-Aug; (4): 5 3 6.

167. Lemeshko W. Lipid peroxidation in the postnuclear and microsomal fractions of rat liver homogenates upon aging Text./ VV Lemeshko, PA Kaliman, IuV Nikitchenco//Biochimia. 1981 Apr;46(4):620-7.

168. Linnane A.W. Cellular redox regulation and prooxidant signaling systems: a new perspective on the free radical theory of aging Text. / A.W. Linnane, H. Eastwood // Ann. N-Y. Acad. Sci. 2006. - № 1067. - P. 47 - 55.

169. Lipid peroxidation and extracellular matrix in normal and cirrhotic rat livers following 70% hepatectomy Text. / Andiran F, Kilinc K, Renda N, Ayhan A, Tanyel FC // Hepatogastroenterology. 2003 May-Jun;50(51):805-8.

170. Lipid peroxidation and trace elements in systemic sclerosis Text. / M. Tikly, K. Channa, P. Theodorou, M. Gulumian // Clin Rheumatol.- 2006.-May;25(3).- C.320-4.

171. Malonaldehyde acts as a mitochondrial toxin: Inhibitory effects on respiratory function and enzyme activities in isolated rat liver mitochondria Text. / Long J, Wong X, Gao H, Liu Z, Liu C, Miao M, Liu J // LiFe Sci. 2006 May 7 [Epub ahead of print].

172. May J. How does ascorbic acid prevent endothelial dysfunction? //Free Radic. Boil. Med.- 2000.- Vol. 28.- P. 1421 1429.

173. Medvedev Z.A. An attempt at a retional classification of theories of aging / Z.A. Medvedev // Biol. Rev. 1990. - № 65. - P. 375-398.

174. Meed J. F. Inter. Simp. Lipid Peroxide Biol. Med., Nagoya, Absir., 1980, p. 11.

175. Meyer MH Altered expression of mitochondrial genes in response to fracture in old rats / Meyer MH, Meyer RA Jr // Acta Orthop. 2006 Dec;77(6):944-51.

176. Mitochondria, endoplasmic reticulum, and alternative pathways of cell deathin critical illness / Yasuhara S, Asai A/Sahani ND, Martyn JA // Crit Care Med. 2007 Sep;35(9 Suppl):S488-95.

177. Mitochondrial oxidative metabolism is required for the cardiac differentiation of stem cells / Chung S, Dzeja PP, Faustino RS, Perez-Terzic C, Behfar A, Terzic A // Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2007 Feb;4 Suppl 1 :S60-7.

178. Mitochondrial respiratory function and antioxidant capacity in normal and cirrhotic livers following partial hepatectomy Text. / Yang S, Tan TM, Wee A, Leow CK. // Cell Mol Life Sei. 2004 Jan;61(2):220-9.

179. Mi J Age-related subproteomic analysis of mouse liver and kidney peroxisomes / Mi J, Garcia-Arcos I, Alvarez R, Cristobal S // Proteome Sei. 2007 Nov 27;5:19.

180. Modzelewski B. Lipid peroxidation product as prognostic factors in acute necrotizing pancreatitis Text. / B. Modzelewski, A. Janiak // Pol Merkur Lekarski.- 2005.- Oct; 19(112).-C.511-3.

181. Nohl H., Staniek K., Gille L. // Exp. Gerontol. 1997. Vol. 32, N 4-5. P. 485500.

182. Okatani Y. Melatonin protects hepatic mitochondrial respiratory chain activity in senescence-accelerated mice Text. / Okatani Y, Wakatsuki A, Reiter RJ // J Pineal Res. 2002 Apr;32(3): 143-8.

183. Oxidative status in senescence-accelerated mice Text. / Park JW, Choi CH, Kim MS, Chung MH. // J Gerontol A Biol Sei Med Sei. 1996 Sep;51(5):B337-45.

184. Olovnikov A.M. Telomeres, telomerase and aging: Origin of the theory // Exp. Gerontol. 1996. - Vol. 31. - P. 443 - 448.

185. Platelet-derived serotonin mediates liver regeneration Text. / Lesurtel M, Graf R, Aleil B, Walther DJ, Tian Y, Jochum W, Gachet C, Bader M, Clavien PA // Science. 2006 Apr 7;312(5770): 104-7

186. Proton leak and hydrogen peroxide production in liver mitochondria from energy-restricted rats Text. / Ramsey JJ, Hagopian K, Kenny TM, Koomson EK, Bevilacqua L, Weindrush R, Harper ME. // Am J Pfisiol Endocrinol Metab. 2004 Jan;286( 1 ):E31 -40.

187. Rafique R. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in ageing; influence of vitamin E deficiency Text. / Rafique R, Schapira AH, Coper JM // Free Radic Res. 2004 Feb;38(2): 157-65.

188. Reiter RJ. Oxygen radical detoxification processes during aging: the functional importance of melatonin Text. / Reiter RJ. // Aging (Milano), 1995 0ct;7(5):340-51.

189. Relation between both oxidative and metabolic-osmotic cell damages and initial injury severity in bombing casualties Text. / M. Vuceljic, G. Zunic, P. Romic, M. Jevtic // Vojnosanit Pregl.- 2006.- Jun;63(6).- C.545-51.

190. Saakyan IR. Activation and inhibition of succinate-dependent Ca2+ transport in liver mitochondria during adaptation Text. / Saakyan IR, Saakyan SG, Kondrashova MN. // Biochemistry (Mose). 2001 Jul;66(7):795-802.

191. Schachter F. Genetic associations with human longevity at the APOE and ACE loce / F. Schachter, L. Faure-Delanef, F. Guenot // Nature Genetics. 1994. -Vol. 6. - P. 29-32.

192. Schmucker D. L. // Gerontol. A: Biol. Sei. 1998. - Vol. 53, № 5. - P. 315320.

193. Shigenaga M. K., Hagen T. M., Ames B. N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 10771-10778.

194. Skulachev V. P. Cytohrome C in The apoptotic and antioxidant cascades // FEBS Lett. 1998. - Vol. 423. - P. 275 - 280.

195. Seckin S., Aiptekin N., Dogru Abbasoglu S. // Pharmacol. Res. - 1997.1. Vol. 36, № 1.- P. 55-57.

196. Sequential opening of mitochondrial ion channels as a function of glutathione redox thiol status / Aon MA, Cortassa S, Maack C, O'Rourke B // J Biol Chem. 2007 Jul 27;282(30):21889-900.

197. Simek J. F., Rubin F., Lieberman S. Biochem. biophis. ges. Commun., 1968, vol. 30, p. 571.

198. The effect of age on the enzyme activities of tryptophan metabolism along the kynurenine pathway in rats Text. / Comai S, Costa CV, Ragezzi E, Bertazzo A, Allegri G. // Clin Chim Acta. 2005 Oct; 360(l-2):67-80

199. Ueno S. Reactive oxygen species derived from NADPH oxidase system is not essential for liver regeneration after partial hepatectomy / Ueno S, Campbell J, Fausto N. // Surg Res. 2006 Dec;136(2):260-5.

200. Vishnevsky E. L., Kondrashova M. N., Pushkar D. Y. et al // Mitochondrion. 2003. Vol. 3. P. 67-73.

201. Warnholtz A,, Nickenig G., Schulz E. Increazed NADH oxidease -mediated superoxide production in the early stages og atherosclerosis evidence for involement of the rennin - angiotensin system // Circulation. - 1999.- Vol. 99-P.2027 — 2033.

202. Wong YT. Relationship between levels of oxidative DNA damage, lipid peroxidation and mitochondrial membrane potential in young and old F344 rats. Text. / Wong YT, Ruan R, Tay FE. // Free Radic Res. 2006 Apr;40(4):393-402

203. Zeeh J. The aging liver structural and functional changes and their consequences for drug treatment in old age. / Zeeh J., Piatt D. // Gerontology 2002. vol 48, №3, C. 121-127.

Информация о работе

Лукаш, Вячеслав Александрович
кандидата биологических наук
Екатеринбург, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Возрастные особенности пероксидного окисления липидов в субклеточных фракциях гепатоцитов при регенерации печени в условиях стресса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы