Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома и клеточного старения у мышей, облученных ионизирующей радиацией в малых дозах на ранних стадиях развития

Велегжанинов, Илья Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома и клеточного старения у мышей, облученных ионизирующей радиацией в малых дозах на ранних стадиях развития
ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома и клеточного старения у мышей, облученных ионизирующей радиацией в малых дозах на ранних стадиях развития"

На правах рукописи

ВЕЛЕГЖАНИНОВ Илья Олегович

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

СТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА И КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ У МЫШЕЙ, ОБЛУЧЕННЫХ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИЕЙ В МАЛЫХ ДОЗАХ НА РАННИХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ

03.01.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Обнинск 2011

4847182

Работа выполнена в Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Москалев A.A.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гераськин С.А.

доктор биологических наук, профессор Рябченко Н.И.

Ведущее учреждение:

Институт экологии растений и животных УрО РАН

Защита диссертации состоится <30 » JIUU?_2011 г. в

_ ___часов

на заседании диссертационного совета Д 006.068.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии по адресу: 248032, Калужская обл., г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км, ГНУ ВНИИСХРАЭ Россельхозакадемии, Диссертационный совет.

Факс: (48439) 6-80-66

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИСХРАЭ

Автореферат разослан »2011

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ' ^ O.A. Шубина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Изучение воздействия на клетку ионизирующих излучений в малых дозах выявило специфичные для данного диапазона доз радиобиологические эффекты, такие как гормезис, адаптивный ответ и гиперчувствительность. В исследованиях in vitro были обнаружены ключевые механизмы данных эффектов, связанные с контролем клеточного цикла, репарацией ДНК, детоксификацией свободных радикалов, апоптозом (Le et al., 1998; Prekeges, 2003; Zhou, Rigaud, 2001; Ding et al., 2009; Miura, 2004; Matsumoto et al., 2007; Saenko et al., 1990). В том случае, если облученная клетка не погибает, существует вероятность проявления отдаленных последствий ее облучения у дочерних клеток - генетическая нестабильность (Пелевина и др., 1996; Осипов и др., 2000; Мазурик, Михайлов, 2001; Seymour et al., 1986; Mothersill, Seymour, 1987; Kadhim et al., 1992; Kronenberg, 1994). Радиация модифицирует и межклеточные взаимодействия: облучение одних клеток может индуцировать эффект свидетеля в других (Nagasawa, Little, 1992).

Однако следует отметить, что зная некоторые механизмы ответа клеток на облучение из экспериментов на иммортализованных культурах клеток in vitro, мы пока имеем мало представления о том, как они взаимодействуют на уровне систем органов in vivo и каким образом они влияют на жизнеспособность целого организма. Например, как связана гиперчувствительность, генетическая нестабильность, адаптивный ответ или гормезис клетки с радиационно-индуцированным изменением функционирования органов, продолжительности жизни, репродукции, заболеваемости у облученных индивидуумов и их потомства? Какие гены ответственны за индивидуальную радиочувствительность у человека и животных? Впоследствии ответы именно на эти вопросы позволят в полной мере использовать на практике достижения современной радиобиологии. Таким образом, одной из ведущих задач радиобиологии является выявление путей интеграции мо-лекулярно-клеточных механизмов, индуцируемых ионизирующим излучением в малых дозах, в ответную реакцию всего организма (патологию, приспособленность, продолжительность жизни) в зависимости от генетического фона и радиочувствительности индивидуума (Москалев, Шапошников, 2009).

Особенно чувствительным к воздействию ионизирующего излучения в малых дозах является период эмбрионального и раннего постэмбрионального развития организма. Отдаленные последствия пренатального облучения, по-видимому, являются следствием декомпенсационных процессов на уровне клетки - радиационно-индуцированной нестабильности генома (Streffer, 2004; Devi, Hossain, 2000; Devi, Satyamitra, 2005), а на уровне организма - нарушения развития органов и систем. Например, известно, что пренатальное облучение в малых дозах способно приводить к атрофии белого вещества мозга (Reyners 1999), замедлению миграции нейробластов в формирующуюся кору головного мозга (Корнев и др., 2004), а также к замедлению развития организма по общим морфометрическим показателям (Hossain et al., 1999).

на задача воспроизвести аналогичный эксперимент на мышах, привнеся в него прижизненный контроль апоптоза, стабильности генома и старения клеток, а также анализ таких интегральных показателей жизнеспособности, как продолжительность жизни и масса тела. Постановка такого эксперимента на дрозофиле невозможна, кроме того использование в качестве объекта исследования мышей увеличивает практическую значимость работы с точки зрения оценки рисков воздействия ионизирующего излучения на человека.

Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в сопоставлении эффектов хронического низкоинтенсивного у-излучения у самцов и самок мышей на клеточном (адаптивный ответ, возрастная динамика уровня повреждения ДНК, апоптоза и клеточного старения) и организмен-ном уровнях (продолжительность жизни, масса тела животного). Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать адаптивный ответ спленоцитов самцов и самок мышей линий СБА и SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения. Оценить уровень повреждения ДНК и частоты апоптоза спленоцитов в ответ на острое облучение непосредственно после воздействия и через 30 мин.

2) Изучить возрастную динамику уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза в лейкоцитах периферической крови, активность каспазы-3 (маркера апоптоза) и лизосомальной Р-галактозидазы (маркера клеточного старения) в дермальной ткани хвоста мышей линии SHK, а также продолжительность жизни и динамику массы тела самцов и самок данной линии, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Воздействие хронического низкоинтенсивного у-излучения в малых дозах в период раннего развития самцов мышей линии СБА приводит к адаптивному ответу спленоцитов при остром облучении in vitro в результате повышения эффективности предотвращения и репарации повреждений ДНК.

2. У постоблученных мышей линии SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения в малых дозах, наблюдается отсроченная генетическая нестабильность клеток кроветворной системы и гиперчувствительность на уровне целого организма (снижение продолжительности жизни и массы тела).

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в течение 2005-2010 гг. в рамках бюджетных тем Отдела радиоэкологии ИБ Коми НЦ УрО РАН «Биологическое действие ионизирующего излучения в малых дозах и факторов нерадиационной природы на живые организмы и природные экосистемы» (Гр 01.2.00 102214), «Реакция экосистем и их компонентов на хроническое воздействие факторов низкой интенсивности» (Гр 0120.0 603503), «Оценка значимости эффектов, вызванных хроническим радиационным и нерадиационным воздействием на молекулярно-клеточном уровне, для организма и популяций животных и растений» (Гр 0120.0 853805). Проведенные исследования были также поддержаны инициативным проектом РФФИ №08-04-00456-а на 2008-2010 гг., грантами Президиума РАН по программам «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки - медицине» на 2009-2011 гг., молодежным научным грантом УрО РАН на 2009 и 2010 гг.

тельности последних к апоптозу, а также к снижению продолжительности жизни и массы тела животных. В тоже время обнаружено, что развитие мышей в условиях низкоинтенсивного облучения in vivo вызывает повышение резистентности спленоцитов к облучению в острой дозе in vitro, проявляющееся как непосредственно сразу после воздействия, так и спустя некоторое время (30 мин.) после выявляющего воздействия. Результаты проведенных исследований способствуют пониманию путей интеграции молекулярных и клеточных механизмов, индуцируемых ионизирующим излучением в малых дозах, в ответную реакцию всего организма.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные, свидетельствующие о реакции гиперчувствительности мышей к хроническому воздействию низкоинтенсивного ионизирующего излучения на ранних стадиях онтогенеза, могут быть использованы при оценке рисков радиационного загрязнения окружающей среды и повышенного естественного радиационного фона, прогнозировании отдаленных последствий профессионального и медицинского облучения развивающегося организма, а также при разработке рекомендаций по снижению негативных последствий этих явлений для здоровья человека и экологического состояния биоты.

Личный вклад автора. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке и решении задач исследования, осуществил большую часть экспериментальных работ, включая статистическую обработку и анализ данных. Активно участвовал в интерпретации полученных результатов и подготовке публикаций.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на научных конференциях молодых ученых Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2007, 2008, 2009, 2010 гг.) и Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2007 и 2009 гг.), всероссийском семинаре «Генетика продолжительности жизни и старения» в 2008 г; международных конференциях «БИОРАД 2009» (Сыктывкар), «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар, 2010), LowRad 2009 (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2009), «Rapid Diagnosis in Population at Emergency and Risk "RADIPER"» (Краков-Закопане, Польша, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе три статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, материала и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 166 работ, в том числе 141 зарубежную публикацию. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста и содержит три таблицы и 26 рисунков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из двух основных частей. В первой части изложены современные представления о механизмах ответа клетки на повреждения, вызываемые воздействием ионизирующего излучения. В данном разделе отдельно рассматриваются механизмы ответа клетки на повреждение ДНК (распознавания и репарации повреждений ДНК, обратимой и необратимой остановки клеточного цикла и индукции апоптоза) и ответа на нарушения в других клеточных структурах (репарация белков и липидов мембран, детоксификация свободных радикалов).

Вторая часть обзора литературы посвящена специфическим эффектам малых доз ионизирующего излучения, таким как гиперрадиочувствитель-

ность, радиационно-индуцированный гормезис, адаптивный ответ и эффект свидетеля. Современные представления о механизмах рассматриваемых эффектов приведены для двух уровней организации: клеточного и организ-менного.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект и условия облучения

В экспериментах по изучению адаптивного ответа спленоцитов мышей, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, использовали мышей линий СБА и SHK. При изучении отдаленных эффектов облучения эксперименты проводили с использованием животных линии SHK, так как они обладают меньшей частотой образования опухолей в сравнении с мышами линии СБА.

Мыши линии СБА имеют окрас дикого типа. Линия выведена от скрещивания линий Bagg albinoxDBA в 1920 г. Имеют высокий уровень спонтанного опухолеобразования (до 75% опухолей молочных желез у самок и до 64% гепатом у самцов). Животные чувствительны к облучению всего тела. Обладают низкой плодовитостью (3.9 помета на фертильную самку, 5.7 мышонка в помете) (Бландова и др., 1983).

Мыши линии SHK (Swiss-Н) имеют белый окрас. Самки подвержены раку молочной железы с частотой до 50%, склонны к ожирению, высокоплодовиты (8.7 живых эмбрионов в первую беременность) (Бландова и др., 1983).

Родительских особей в возрасте 2 мес. ставили на размножение при хроническом воздействии у-излучения мощностью 0.04 мГр/ч (источник 22eRa). Зачатие, внутриутробное развитие и первые 60 сут. жизни потомства F1 проходили в условиях облучения. Накопленная доза для F1 составила 6-10 сГр (определяли с помощью дозиметров экспозиционной дозы ДТУ-1 на базе детекторов ДТГ-4). Контрольные животные развивались одновременно в стандартных условиях вивария.

2.2. Схемы экспериментов по изучению адаптивного ответа спленоцитов мышей линии СБА, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивого у-излучения

2.2.1. Эксперимент 1

Для анализа использовали 22 контрольных животных (11 самцов и 11 самок) и 22 животных, развивавшихся в условиях облучения (11 самцов и 11 самок). Забой проводили в течение 2 ч с момента окончания хронического облучения, для выравнивания экспериментальных условий контрольных и облученных мышей забивали по очереди. Клетки селезенки суспендировали в охлажденном (4 °С) фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7.4), а затем иммобилизовали на предметные стекла в 0.7-ном% агарозном геле, приготовленном на PBS (Zheng, Olive, 1996). Готовили по 3 препарата на каждое животное. Один из трех препаратов живых спленоцитов подвергали острому облучению in vitro в дозе 1 Гр (источник е0Со, мощность 1.2 Гр/ мин., в PBS при температуре 37 °С). В первую минуту после облучения препарат фиксировали в лизирующем растворе для последующего анализа уровня повреждения ДНК (щелочным вариантом метода * ДНК-комет», детектирующим совокупность одно- и двунитевых разрывов ДНК и АП-сай-тов (Tice et al., 2000). Одновременно проводили анализ уровня поврежде-

ний и частоты апоптоза (методом «гало» (Singh, 2000)) на препаратах, не подверженных облучению.

2.2.2. Эксперимент 2

Для анализа использовали 16 контрольных животных (7 самцов и 9 самок) и 16 животных, развивавшихся в условиях облучения (9 самцов и 7 самок). Забой проводили в течение 2 ч с момента окончания хронического облучения, для выравнивания экспериментальных условий контрольных и облученных мышей забивали по очереди. Клетки селезенки суспендировали в PBS (4 °С), а затем иммобилизовали на предметные стекла в 0.7%-ном агарозном геле, приготовленном на PBS. Готовили по 9 препаратов на каждое животное. Перед основным экспериментом тестировали жизнеспособность клеток, иммобилизованных вышеуказанным способом. Для этого использовали окраску трипановым синим (Epps, 1974). В результате были выявлены лишь единичные клетки, в которые проникал краситель.

Препараты живых спленоцитов подвергали острому облучению in vitro и последующему анализу уровня повреждения ДНК (щелочным вариантом метода «ДНК-комет) и частоты апоптоза (методом «гало»). Препараты фиксировали в лизирующем растворе:

1. сразу после иммобилизации клеток;

2. непосредственно после острого облучения живых иммобилизованных клеток в дозе 2 Гр (источник б0Со, мощность 1.2 Гр/мин.) в двух вариантах: при температуре 37 'С, когда все ферментативные механизмы защиты активны, и при температуре 4 "С, когда активность биохимических систем подавлена.

3. через 30 мин. после острого облучения (37 °С);

4. спустя 30 мин. без облучения (37 °С).

Облучение и инкубацию препаратов с иммобилизированными в гель клетками проводили в питательной среде RPMI 1640 (Sigma, США).

2.3. Схемы экспериментов по изучению адаптивного ответа

спленоцитов мышей линии SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивого у-излучения

Для каждого анализа использовали по 16 мышей линии SHK (8 контрольных животных и 8 развивавшихся условиях облучения). Эксперимент проводили в двух биологических повторностях для каждого пола. Забор проб проводили в течение 2 ч с момента окончания хронического облучения, для выравнивания экспериментальных условий контрольных и облученных мышей забивали по очереди. Клетки селезенки суспендировали в охлажденной (4 °С) питательной среде RPMI 1640, в расчете 1 мл среды на 10 мг массы селезенки. Далее суспензии клеток каждого животного использовали для семи вариантов эксперимента:

Вариант 1: Суспензию клеток иммобилизовали в гель (0.7%-ная агаро-за, приготовленная на питательной среде) на предметные стекла и подвергали лизису для анализа уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза.

Варианты 2 и 3: Суспензию клеток иммобилизовали в гель на предметные стекла и помещали в емкость Шиффердекера с питательной средой. Готовые препараты живых клеток облучали в дозе 2 Гр (источник б0Со, мощность 1.2 Гр/мин., вариант 2 при 37 °С, вариант 3 при 4 °С). В течение нескольких секунд после окончания облучения помещали препараты в ли-зирующий раствор для последующего анализа уровня повреждения ДНК.

Варианты 4 и 5: Аликвоты суспензии (по 150 мкл в микропробирке) подвергали облучению в дозе 2 Гр при 37 °С, после чего помещали в термостат при той же температуре на 30 (вариант 4) или 120 мин. (вариант 5).

После указанного времени клетки иммобилизовали в гель и подвергали лизису для анализа уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза.

Варианты 6 и 7: Одновременно с вариантами 4 и 5 аликвоты суспензии вариантов 6 и 7 подвергали нагреву до 37 "С на указанные периоды времени, но не облучали. После этого иммобилизовали в гель и подвергали лизису для анализа уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза.

2.4. Схема изучения возрастной динамики цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома

мышей линии SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения

У интактных мышей и мышей, развивавшихся в условиях облучения, одновременно проводили прижизненный анализ уровня повреждения ДНК (с использованием щелочного варианта метода «ДНК-комет») и частоты апоптоза (методом диффузии ДНК в геле) лимфоцитов периферической крови, а также активности каспазы-3 - эффекторной протеазы апоптоза (флюори-метрически, как описано в (Nicholson et al., 1995) и уровня клеточного старения в дермальных клетках хвоста (флюориметрически, по активности лизосомальной ß-галактозидазы (Kurz et al., 2000). Для каждого из анализов использовали от 6 до 15 животных каждого пола на вариант эксперимента. Перед анализом регистрировали вес животных. Отбор образцов тканей для анализа вышеуказанных параметров проводили прижизненно в день прекращения облучения и далее на 5, 8, 11, 15, 20, 24 и 27 мес. жизни. Кроме того, оценивали продолжительность жизни каждого животного (190 контрольных животных и 143 облученных). Мыши, чья кровь не использовалась для анализа, также подвергались процедуре отрезания кончика хвоста, что позволило выровнять условия, оказывающие влияние на продолжительность жизни. Осуществляли повторный эксперимент, включающий анализ уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза лейкоцитов крови в день прекращения облучения и далее на 5 и 8 мес. жизни.

2.5. Методы цитогенетических и биохимических исследований, использованные в работе

Уровень повреждения ДНК определяли по методу «ДНК-комет», детектирующему совокупность одно- и двунитевых разрывов ДНК и АП-сайтов (щелочной вариант) (Tice et al., 2000).

При изучении возрастной динамики цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома мышей линии SHK обсчет результатов проводили с помощью визуальной оценки. Анализировали по 200 клеток с препарата, при этом каждую клетку относили к одному из 5 классов по величине хвоста «кометы» от 0 (неповрежденные клетки, отсутствует хвост) до 4 (сильно поврежденные клетки, почти вся ДНК мигрирует в хвост) (Collins, 2004). Определяли средний кометный индекс (СКИ) по формуле:

СКИ = (lx/i 1 + 2хи2 + ЗхпЗ + 4xn4)/N, где nl-n4 - число комет в категориях 1-4, и N - сумма всех подсчитанных комет, включая число комет в категории 0 (Мязин и др., 2002).

Сравнение распределения всех проанализированных в группе клеток по классам повреждения проводили с использованием критерия у.2.

При изучении адаптивного ответа спленоцитов мышей линий СБА и SHK результаты анализировали с помощью программы «CometScore 1.5» (TriTek Corp, США). С изображений, полученных с помощью видеосистемы на основе цифровой камеры Olympus С7070, оценивали величину «момента хвоста» по П. Оливе (Olive et al., 1990) (произведение расстояния от

центра ядра «кометы» до центра плотности хвоста на % ДНК в хвосте). На каждом препарате анализировали по 100 комет. Вычисляли среднюю арифметическую от Ln(M+0.001), где М - «момента хвоста» по П. Оливе для каждого животного и использовали эту величину для дальнейших статистических вычислений (Wiklund, Agurell, 2003). Статистическую обработку проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Частоту апоптоза определяли методом диффузии ДНК в геле (метод «гало») (Singh, 2000). Подсчитывали по 1000 клеток на препарат. Количество клеток, перешедших к апоптозу, выражали в промилях. Вычисляли среднюю частоту апоптоза для животных одной группы. Статистическую обработку данных проводили с помощью (р-критерия Фишера для выборочных долей.

Флуориметрический анализ активности каспазы 3 выполняли с использованием набора реактивов «Caspase 3 assay kit» (Sigma-Aldrich, CIIIA) по протоколу производителя, разработанному на основе Nicholson et al. (1995). Измерения проводили на флуориметре TD-700 (Turner Design, США). Активность каспазы-3 определяли в единицах концентрации красителя, накопившегося в пробе за время инкубации (в нмоль/л), в трех технических повторностях для пробы дермы каждого животного. Результат выражали в величине, равной отношению средней активности каспазы в ткани облученных животных к средней активности каспазы в ткани контрольных животных. Статистическую обработку проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Флуориметрический анализ активности лизосомалъной $-галактози-дазы осуществляли с использованием реактивов производства фирмы Sigma на флуориметре TD-700 (Turner Design, США) по протоколу производителя флуориметра. Анализ производили в двух технических повторностях для пробы дермальной ткани каждого животного. Результат, полученный в единицах концентрации красителя, накопившегося в пробе за время инкубации (в нмоль/л), выражали в величине, равной отношению средней активности ß-галактозидазы в ткани облученных животных к этому же показателю в ткани контрольных животных. Статистическую обработку производили с помощью U-критерия Манна-Уитни.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

В настоящей работе проведены исследования последствий воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения на мышей линий БНК и СВА (6-10 сГр, 0.04 мГр/ч) в период эмбрионального и первых двух месяцев постнатального развития. В первой части работы представлены данные исследований адаптивного ответа спленоцитов мышей линий СВА и БНК. Во второй части описаны результаты изучения возрастной динамики уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза лейкоцитов периферической крови, активности каспазы-3 (маркера апоптоза) и лизосомальной (5-галакто-зидазы (маркера клеточного старения) в дермальной ткани хвоста, а также продолжительности жизни и динамики массы тела мышей линии ЭНК, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения.

3.1. Адаптивный ответ спленоцитов мышей линий СВА и ЭНК, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивого

у-излучения

Проведен анализ изменения радиочувствительности спленоцитов мышей линии СВА, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения (6-10 сГр, 0.04 мГр/ч). Спленоциты живот-

ных контрольной и облученной групп подвергали острому облучению in vitro в дозе 1 и 2 Гр и анализировали уровень повреждения ДНК и частоту апоптоза на момент острого воздействия и через 30 мин. после него. Воздействие хронического низкоинтенсивного у-излучения в период эмбрионального и раннего постнатального развития не приводило к изменению уровня повреждений ДНК спленодитов. В то же время наблюдали изменение реакции данных клеток на острое облучение in vitro (1 Гр, при 37 °С), проявляющееся в более низком уровне повреждения ДНК спленоцитов облученных мышей относительно спленоцитов контрольных животных. Данные различия проявлялись сразу после острого облучения клеток in vitro, длительность которого составляла 1 мин. (рис. 1а), Отмечено, что у самок спонтанный уровень повреждений, а также реакция на острое облучение значительно ниже, чем у самцов, однако, описанные тенденции сохранялись.

Частота апоптоза спленоцитов облученных самцов была ниже, чем у контрольных. У самок таких различий не наблюдали (рис. 16).

_ с5Й ?¥ $$ 9?

lJ- Контроль Я - 6-5 0 сГр in vivo й - 1 Гр in vitro (37°С) Й - 6-10 сГр in vivo + 1 Гр in vitro (37°С)

Рис. 1. Уровень повреждения ДНК (а) и частота апоптоза (б) спленоцитов мышей линии СВА, развивавшихся в условиях у-излучения (6-10 сГр). * - различия достоверны при р < 0.05, ** - при р < 0.01 (U-критерий Манна-Уитни). В каждом варианте эксперимента использованы клетки, полученные от 11 животных.

Для оценки вклада репарации ДНК в различия реакции клеток на острое облучение in vitro провели аналогичный эксперимент, в котором измеряли уровень повреждения ДНК спленоцитов как непосредственно после острого облучения, так и спустя 30 мин. Как и в предыдущем эксперименте, у самцов обнаружен радиоадаптивный ответ, заключающийся в том, что ДНК клеток предоблученных животных была в меньшей степени повреждена в результате воздействия острого облучения. Спленоциты предоблученных самок не проявляли статистически значимого радиоадаптивного ответа (рис. 2а, б).

Спустя 30 мин. после острого облучения в результате процесса репарации уровень повреждения ДНК в клетках самцов, развивавшихся в условиях хронического облучения, снижался до соответствующего значения в интактных клетках. В то же время различия между уровнем повреждения ДНК спленоцитов предоблученных животных и животных, развивавшихся без облучения, возросли. У самок за обозначенный период времени репарация происходила полностью в обеих экспериментальных группах.

При облучении спленоцитов в условиях пониженной температуры (4 °С), когда ферментативные системы защиты неактивны (в том числе участвующие в детоксификации свободных радикалов), радиоадаптивный ответ, оцениваемый по уровню повреждения ДНК, не проявлялся (рис. 2а, б). В обоих экспериментах у самок спонтанный уровень повреждения ДНК и уровень повреждения ДНК, полученных в результате острого облучения, был ниже, чем у самцов (рис. 1а и 2а, б).

350

si 300 Я 250

1 200

S 150

LJ- Контроль H - 6-10 сГр in vivo tÜU - 2 Гр in vitro (4°C) SH -6-10 сГр in vivo + 2 Гр in vitro (4°C) Й-2ГР in vitro (37°C) И - 6-10 сГр in vivo + 2 Гр in vitro (37°C)

Рис. 2. Уровень повреждения ДНК (а, б) и частота апотоза (в, г) спленоцитов самцов и самок мышей линии СБА. * - различия достоверны при р < 0.05, ** - при р < 0.01 (U-критерий Манна-Уитни). В каждом варианте эксперимента использованы клетки, полученные от 7-9 животных.

Обнаружена тенденция к снижению частоты апоптоза спленоцитов мышей, развивавшихся в условиях хронического облучения, по сравнению с клетками контрольных животных, особенно выраженная после острого облучения in vitro (рис. 2в, г).

Таким образом, спленоциты мышей линии СБА, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения (6-10 сГр), имели меньший уровень повреждения ДНК непосредственно после острого облучения в дозах 1 и 2 Гр. Спустя 30 мин. различия становились еще более выраженными. При облучении клеток в условиях пониженной температуры (4 °С) данные различия не наблюдались. Имела место тенденция к снижению частоты апоптоза клеток животных, развивавшихся в условиях пред облучения, в большинстве вариантов экспериментов.

Для того, чтобы выявить адаптивный ответ у особей линии SHK, провели аналогичные эксперименты, дополнительно привнеся анализ уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза спустя 120 мин. после острого облучения в дозе 2 Гр. Эксперимент проводили на самцах и самках в двух биологических повторностях.

Облучение спленоцитов in vitro в дозе 2 Гр в условиях пониженной температуры (4 °С) привело к приблизительно равному повышению уровня повреждения ДНК в клетках контрольных животных и животных, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения в дозе 6-10 сГр. В то же время в ответ на острое облучение при 37 °С в спленоцитах пред облученных самцов проявлялась тенденция к уменьшению количества повреждений ДНК в сравнении с контрольными животными, причем в двух повторностях (рис. За, б). У самок данный эффект не выявлен (рис. Зв, г). Тот факт, что эффекты воздействия острого облучения in vitro при различных температурах (4 и 37 'С) и спустя различные

I -i

В -2

0 аз

™ -3 х

1 -4,

-5

<и S

о -i

Е -3

I__I- Контроль Н - 6-10 сГр in vivo till] - 2 Гр in vilro (4°C) Я - 6-10 сГр in vivo + 2 Гр in vitro (4°C)

И- 2 Гр in vitro (37°C) WA- 6-10 сГр in vivo + 2 Гр in vitro (37°C)

Рис. 3. Уровень повреждения ДНК спленоцитов самцов (а - эксперимент 1,6- эксперимент II) и самок (в, г) мышей линии SHK. Представлены результаты двух экспериментальных повториостей. В каждом варианте эксперимента использованы клетки, полученные от 8 животных.

X с£

а I с S

л t

5 Í 9 К

5 =г о

л S -10

t í

о <V

£ ® '20

Го О а. с

5 s -30

х да

5 О

<u О.

а > -40

- Контроль ЯН -6-10 сГр in vivo

Рис. 4. Средняя разность пар значений уровня повреждения ДНК спленоцитов а -непосредственно после острого облучения при 37 °С и без него, б-через 30 мин. (37 °С) после острого облучения при 4 °С и через 30 мин. (37 °С) без острого облучения, в -через 30 мин. (37 °С) после острого облучения при 4 °С и непосредственно после острого облучения при 4 °С. Представлены результаты двух экспериментальных повториостей (I и II). В каждом варианте эксперимента использованы клетки, полученные от 8 животных.

промежутки времени (0, 30 и 120 мин.) изучали на клетках одних и тех же особей, позволил проследить изменение уровня повреждений ДНК спленоцитов каждой мыши в ответ на острое облучение. Усредненные разности пар значений уровня повреждения ДНК до острого облучения при 37 °С и

сразу после него представлены на рис. 4а. Обнаружена тенденция к снижению реакции по показателю уровня повреждения ДНК в ответ на острое облучение спленоцитов самцов, развивавшихся в условиях хронического облучения, по сравнению с клетками контрольных животных. Из наблюдаемого результата можно сделать предположение, что в спленоцитах самцов, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, имеет место увеличение эффективности ферментативных систем, осуществляющих предотвращение повреждений ДНК, по сравнению со спле-ноцитами контрольных животных. У самок данный эффект не обнаружен.

В том случае, когда клетки, облученные при 4 °С, инкубировали 30 мин. при 37 °С в питательной среде, у предоблученных самцов по сравнению с интактными вновь проявлялась тенденция к снижению уровня повреждения ДНК (рис. 46). Это свидетельствует о повышении эффективности репарации повреждений ДНК в спленоцитах животных, развивавшихся в условиях хронического облучения. Необходимо отметить, что наблюдаемые изменения способности спленоцитов предоблученных самцов мышей линии SHK к предотвращению и репарации повреждений ДНК носят характер воспроизводимой тенденции. У самок данной тенденции не наблюдали.

Оценить эффективность репарации при данной постановке эксперимента можно также проанализировав разность уровня повреждения ДНК через 30 мин. (37 °С) после острого облучения при 4 °С и непосредственно после острого облучения при 4 °С. (рис. 4в). Из диаграммы видно, что спле-ноциты самцов, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения, имели воспроизводимую тенденцию к более эффективной элиминации повреждений ДНК, чем клетки контрольных животных. У самок данная тенденция выражена в меньшей степени.

Так же, как и у линии СБА, уровень повреждения ДНК у самок линии SHK ниже, чем у самцов, а реакция на острое облучение выражена в меньшей степени.

Реакция спленоцитов предоблученных самцов на острое облучение in vitro по показателю частоты апоптоза не отличалась от реакции спленоцитов контрольных животных. В одном из двух экспериментов у самок наблюдалось повышение частоты апоптоза спустя 30 мин. после острого облучения, значительно более выраженное у предоблученных животных.

Для того, чтобы оценить изменения, произошедшие у исследуемых животных на уровне организма, при забое измеряли массу тела и массу изолированных органов (селезенки, печени и семенников). Животные, развивавшиеся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения, имеют воспроизводимые тенденции к снижению массы тела, увеличению относительной массы селезенки и печени (табл. 1).

Таблица 1

Масса тела и относительная масса органов мышей линии SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения

Масса тела, г Селезёнка, % Печень, % Левый семенник, % Правый семенник, %

<56 I 28.64 25.16* 0.608 0.946* 4.22 4.99* 0.308 0.237 0.315 0.258

1 1 28.21 27.94 0.516 0.598 4.45 4.57 0.338 0.344 0.359 0.357

99 1 25.77 24.66 0.716 1.602** 5.08 6.34** - - - -

1 I 25.7 25.37 0.577 0.694 5.23 5.5 - - - -

I и II - первый и повторный эксперимент. * - различия с контролем достоверны при р < 0.05, ** - при р < 0.01 (У-критерий Манна-Уитни).

Таким образом, воздействие хронического низкоинтенсивного у-излуче-ния (6-10 сГр, 0.04 мГр/ч) в период эмбрионального и первых двух месяцев постэмбрионального развития у самцов линии СВА приводило к адаптивному ответу спленоцитов на острое облучение in vitro в дозах 1 и 2 Гр. У самцов линии SHK наблюдалась слабо выраженная, но воспроизводимая тенденция к адаптивному ответу, предположительно обусловленному повышением эффективности предотвращения и репарации повреждений ДНК клетками предоблученных животных. Спленоциты самок обеих исследованных линий реагировали на облучение менее выраженным изменением уровня повреждения ДНК, чем спленоциты самцов. На уровне целого организма у самцов и самок облученных мышей линии SHK наблюдалась воспроизводимая тенденция к снижению массы тела, повышению относительной массы селезенки и печени, относительно необлученных животных.

3.2. Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома, продолжительность жизни и масса тела мышей линии SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения

С целью изучить отдаленные последствия воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения (0.04 мГр/ч) на мышей линии SHK в период эмбрионального и двух месяцев постнатального развития, в день окончания облучения, а также на 5, 8, 11, 15, 20, 24 и 27 мес. жизни у облученных и контрольных животных осуществляли прижизненный забор крови и фрагмента хвоста и анализировали уровень повреждения ДНК и частоту апоптоза лейкоцитов периферической крови, активность каспазы-3 и лизо-сомальной Р-галактозидазы в дермальной ткани хвоста. Для того, чтобы проследить отдаленные последствия клеточных эффектов облучения на жизнеспособность целого организма, анализировали продолжительность жизни и массу тела животных.

В результате проведенных исследований было показано, что непосредственно после окончания хронического облучения различий по уровню повреждения ДНК лейкоцитов исследуемых животных не наблюдалось. Однако к 8-му и 11-му месяцу жизни данный показатель у облученных самцов был выше, чем у контрольных на 63 и 50% соответственно (р < 0.05) (рис. 5а). Еще более выраженное повышение (117%; р < 0.001) уровня повреждений ДНК повторилось также на 24-й мес. жизни облученных самцов. У облученных самок подобных изменений в течение жизни не наблюдалось. В повторном эксперименте повышение уровня повреждения ДНК на 8-м мес. жизни наблюдалось в виде выраженной тенденции (60%, относительно контрольного уровня). Менее выраженное (27%), но однонаправленное изменение наблюдалось в дополнительном эксперименте у девятимесячных мышей, развивавшихся в идентичных экспериментальных условиях (рис. 5в).

Несмотря на повышение уровня повреждения ДНК лейкоцитов на 8-й и 11-й мес. жизни у облученных самцов не наблюдалось (в двух повторнос-тях) повышения частоты апоптоза (рис 6а, б). Более того, к 11-му мес. происходит снижение частоты апоптоза на 40% (р < 0.05) относительно контроля. Повышение уровня повреждения ДНК на 24-й мес. жизни сопровождается повышением частоты апоптоза лейкоцитов на 124% (р < 0.05) (рис. 6а). У облученных самок на 11-й мес. жизни частота апоптоза лейкоцитов была достоверно ниже (на 47%; р < 0.05), чем в контрольной группе (рис. 66).

Таким образом, хроническое низкоинтенсивное облучение в период эмбрионального и двух месяцев постнатального развития мышей привело к

0,3 0,25

2 0,15 и

ОД

2 4,5 7 10,5 15 19,5 23,5 26,5 Возраст, тес

0,3 0,25 0,2 ! 0,15 ОД 0,05 О

ОД 0,08 0,06 0,04 0,02

10,5 15 19,5 23,5 26,5 Возраст, мес

лЫ

4,5 8 Возраст, мес

Ц-контроль Л-6-10сГр

Рис. 5. Возрастная динамика изменения уровня повреждения ДНК лейкоцитов самцов (а, в) и самок (б, г), развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения (6-10 сГр). Представлены результаты двух экспериментальных повторностей. СКИ - средний кометный индекс. Различия по сравнению с контролем: *- достоверны при р<0.05; ***- при р<0.001 (критерий %2)- В каждом варианте эксперимента использованы клетки, полученные от 6-15 животных.

7 10,5 15 19,5 23,5 26,5 Возраст, мес

5 5

2 4,5 8 9 Возраст, мес.

* 20 та

I 15

О с

л 10 о

п 5 у

* 20

10,5 15 19,5 23,5 26,5 Возраст, мес

Ц - контроль В - 6-10 сГр

2 4,5 8 9 Возраст, мес.

Рис. 6. Возрастная динамика изменения частоты апоптоза лейкоцитов самцов (а, в) и самок (б, г), развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения (6-10 сГр). Представлены результаты двух экспериментальных повторностей. * - различия с контролем достоверны при р<0.05, (1/-критерий Манна-Уитни). В каждом варианте эксперимента использованы клетки, полученные от 6-15 животных.

отсроченному повышению уровня повреждений ДНК лейкоцитов периферической крови при сниженной или неизменной частоте апоптоза данных клеток.

Анализ активности каспазы 3 (одного из ключевых эффекторных ферментов апоптоза) в клетках дермальной ткани хвоста показал, что у мышей, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, активность этого фермента выше, чем у контрольных мышей на момент окончания облучения. С возрастом, наоборот, активность каспазы 3 в клетках облученных животных становилась ниже, чем у контрольных животных (рис. 7а).

Еще одним механизмом, ограничивающим деление клеток с поврежденной ДНК, является необратимая остановка клеточного цикла или стресс-индуцированное клеточное старение. Для выяснения его вклада в наблюдаемые эффекты проанализировали активность (3-галактозидазы в дермальной ткани хвоста (рис. 76). Этот фермент накапливается в клетках, находящихся в состоянии клеточного старения. Несмотря на то, что достоверных различий в активности Р-галактозидазы между облученными и контрольными животными нами не выявлено, у облученных самцов имела место тенденция к повышению ее активности с возрастом.

Возраст животных, мес.

Возраст, мес.

- самцы

Рис. 7. Возрастная динамика изменения активности каспазы 3 (а) и лизосомальной р-галактозидазы (б) в клетках дермы хвоста мышей, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения (% относительно необлученного контроля). * - различия с контрольным значением достоверны при р<0.05 (11-критерий Ман-на-Уитни). В каждом варианте эксперимента использованы клетки, полученные от 6-12 животных.

Для того, чтобы оценить отдаленные последствия хронического низкоинтенсивного облучения в период эмбрионального и первых двух месяцев по-стнатального развития на уровне целого организма, проводили анализ продолжительности жизни исследуемых животных. Выявлено, что средняя и медианная продолжительность жизни мышей, развивавшихся в условиях хронического облучения, ниже, чем у контрольных животных (табл. 2, рис. 8). Различия продолжительности жизни сохранялись также в том случае, когда из анализа исключали особей, имеющих опухоли, выявляемые при внешнем осмотре животного. Кроме того, частота образования таких опухолей не изменялась у животных, развивавшихся в условиях облучения.

Траектории интенсивности смертности (рис. 9) животных, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, смещены параллельно вверх, что говорит о преждевременном начале процесса старения.

Еще одной интегральной реакцией организма на облучение было снижение массы тела животных, развивавшихся в условиях облучения. Данный эффект наблюдался как у самцов, так и у самок. Различия сохранялись в течение всей жизни животных (рис. 10а) и воспроизводились при частичном повторении эксперимента (рис. 10в, г).

Таблица 2

Продолжительность жизни (сут.) мышей линии ЭНК, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного

у-излучения

Пол Группа N Средняя ПЖ ± ошибка Медианная ПЖ Мин. Макс. С опухолями

Общая Без опухолей Общая] Без опухолей ПЖ ПЖ N | %

с? Контроль 94 636±17 642±17 657.5 669.5 60 915 6 6.4

6-10 оГр 76 558±20" 563+21" 561" 575.5" 74 915 4 5.3

2 Контроль 96 470±16 502+25 469.5 505.5 46 861 34 35.4

6-10 сГр 67 423±19 408±30* 418 399* 45 818 24 35.8

Время, сут Время, сут

- контроль ----6-10 сГр

Рис. 8. Кривые выживаемости самцов (а) и самок (б) мышей, развивавшихся в условиях воздействия у-излучения (6-10 сГр). * - различия достоверны при р = 0.004 (Критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона).

0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000

Возраст, сут Возраст, сут

контроль 6-10 сГр

Рис. 9. Логарифм интенсивности смертности самцов (а) и самок (б), развивавшихся в условиях воздействия у-излучения (6-10 сГр). * - различия с контрольной группой достоверны при р < 0.001 (метод максимального правдоподобия).

Таким образом, мыши линии вНК, развивавшиеся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения, характеризуются сниженной продолжительностью жизни и массой тела, а также отсроченным повышением уровня повреждения ДНК лейкоцитов периферической крови при неизменной или сниженной частоте апоптоза этих клеток. В дермаль-ной ткани в процессе облучения наблюдается повышение активности маркера апоптоза - каспазы 3, а спустя 15-25 мес. после облучения, наоборот, снижение данного показателя.

ПЖ- продолжительность жизни, N - количество животных в группе, р < 0.05, "-при р < 0.01.

- различия достоверны при

iitiil

2 4,5 7 10,5 15 19,5 23,5 26,5 Возраст животных, мес.

и 40 го

5 35

130 I

25 20

2 4,5 8 Возраст животных, мес.

4,5 7 10,5 15 19.5 23,5 26,5 Возраст животных, мес.

45 40

^ 35 oj

В 30

25 20

2 4,5 8 Возраст животных, мес.

I j - контроль И-6-ЮсГр

Рис. 10. Возрастная динамика изменения массы тела (г) самцов (а, в) и самок (б, г), развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения (610 сГр). Представлены результаты двух экспериментальных повторностей, различия по сравнению с контролем: '-достоверны при р<0.05; ** - при р<0.01 ((-критерий Стьюден-

та).

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1. Адаптивный ответ спленоцитов мышей линий СВА и SHK

В результате проведенных исследований был обнаружен адаптивный ответ спленоцитов у самцов линии СВА, развитие которых происходило в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения. Адаптивный ответ проявлялся в том, что клетки предоблученных (6-10 сГр) животных получали меньше повреждений ДНК в результате острого облучения in vitro (1-2 Гр) при физиологической температуре (37 °С), по сравнению с клетками животных, развивавшихся без хронического облучения (рис. 1а и 2а, б). Поскольку фиксацию клеток производили в холодном лизирующем растворе сразу после окончания острого облучения, длительность которого составляла 1-2 мин., можно предположить, что в обнаруженном адаптивном ответе наибольшую роль играет повышение эффективности системы детоксификации свободных радикалов, так как она предотвращает повреждения непосредственно в момент облучения, тогда как для репарации ДНК необходимо время. В пользу данного предположения свидетельствует и тот факт, что адаптивный ответ не наблюдался при облучении спленоцитов в условиях пониженной температуры (4 °С), когда не активны ферментативные системы детоксификации свободных радикалов.

Для оценки вклада репарации ДНК в наблюдаемый адаптивный ответ облученные in vitro спленоциты оставляли на 30 мин. в питательной среде в термостате (37 °С), после чего анализировали уровень повреждения ДНК. В клетках животных, развивавшихся при отсутствии хронического облучения, через 30 мин. после острого облучения in vitro сохранялся повы-

шенный уровень повреждений ДНК, тогда как в клетках предоблученных животных он снижался до спонтанного уровня.

Таким образом, адаптивный ответ спленоцитов предоблочунных мышей линии СБА был обусловлен как повышением эффективности детоксификации свободных радикалов, так и репарации повреждений ДНК. Явление повышения эффективности репарации ДНК и детоксификации свободных радикалов в клеточных культурах и целых организмах, подвергнутых облучению в малых дозах, известен из литературы (Le et al., 1998; Otsuka et al., 2006; Саенко и др., 1991; Prekeges, 2003). В нашей работе впервые показан вклад индуцибельной репарации ДНК и детоксификации свободных радикалов в радиоадаптивный ответ клеток организма, подверженного хроническому низкоинтенсивному облучению in vivo в период эмбрионального и раннего постнатального развития.

Вероятно, что обнаруженный эффект обусловлен синтезом и повышением активности ферментов репарации ДНК и детоксификации свободных радикалов (Matsumoto et al., 2007; Miura, 2004). Например, известен радиоадаптивный ответ по уровню повреждения ДНК, сочетающийся с повышением экспрессии каталазы и Mn-SOD в спленоцитах мышей, подверженных хроническому облучению в более высоких дозах (0.5 Гр) (Otsuka et al., 2006). Вклад в повышение эфективности репарации ДНК может вносить изменение чувствительности контрольных точек клеточного цикла (Zhou, Rigaud, 2001; Ding et al., 2009). Важную роль в радиоадаптивном ответе клеток (Miura, 2004) и целого организма (Moskalev et al., 2009) играют белки теплового шока, активность которых, как известно, также влияет на активность ферментов репарации ДНК (Mendez et al., 2003).

Помимо метаболических изменений в самих клетках, на уровне целого организма вклад в наблюдаемый адаптивный ответ могут внести механизмы селекции клеток по показателю жизнеспособности. В связи с этим в дополнение к анализу уровня повреждения ДНК оценивали частоту апоп-тоза спленоцитов. В результате была обнаружена тенденция к снижению частоты апоптоза клеток мышей, развивавшихся в условиях хронического облучения, по сравнению с контрольными животными, особенно выраженная после острого облучения in vitro (рис. 16 и 2в, г). Рассматриваемые совместно, наблюдаемые у предоблученных мышей более низкие значения частоты апоптоза и уровня повреждения ДНК могут свидетельствовать о прошедшей под воздействием облучения в процессе эмбрионального и раннего постнатального развития селекции более устойчивых клеток. Известно, например, что облучение мышей в дозе 5 сГр на стадии гаструлы, вызывая значимое повышение апоптоза эмбриональных клеток, при этом способствует снижению частоты тератогенеза (Heyer et al., 2000). Селекция клеток под воздействием генотоксического стресса, вероятно, является универсальным механизмом повышения стрессоустойчивости для живых организмов разных таксономических групп, поскольку ранее была показана ее роль в гормезисе по продолжительности жизни облученных дрозофил (Moskalev, 2003, 2007).

Тенденция к повышению эффективности предотвращения и репарации повреждений ДНК наблюдалась и в экспериментах на линии SHK (рис. 3). Однако адаптивный ответ был выражен в значительно меньшей степени, чем у линии СБА. Для выявления вклада ферментатинвых механизмов предотвращения повреждения ДНК спленоциты контрольных и предоблученных (6-10 сГр) животных подвергали острому облучению (2 Гр) при различных температурах (4 и 37 °С). Непосредственно после облучения in vitro в условиях пониженной температуры (4 °С) адаптивного ответа не наблюдали, в том же случае, если температура питательной среды во время острого облучения была физиологической (37 °С) клетки предоблученных самцов проявляли тенденцию к адаптивному ответу (рис. 4а). Для того, чтобы отдельно выявить вклад репарации ДНК, клетки, облученные при

4 °С, перед фиксацией инкубировали 30 мин. при 37 °С в питательной среде. Воспроизводимая тенденция к снижению уровня повреждения ДНК пре-доблученных самцов относительно самцов, развивавшихся без предоблуче-ния, при этом, может быть обусловлена лишь повышением эффективности репарации ДНК. В отличие от линии СНА, у мышей SHK наблюдали тенденцию к повышению частоты апоптоза у предоблученных животных. Возможно, что различия в реакции тканевых механизмов селекции клеток напрямую связаны со степенью выраженности адаптивного ответа по показателю уровня повреждения ДНК у использованных в работе линий мышей.

Обнаружены половые различия в уровне повреждения ДНК спленоци-тов мышей обеих линий. Спонтанный уровень повреждения, и уровень повреждений, индуцированных острым облучением, почти во всех вариантах экспериментов у самок ниже, чем у самцов. Кроме того, спустя 30 мин. после острого облучения спленоцитов самок линии СБА большинство повреждений ДНК репарируется как у интактных особей, так и у особей, развивавшихся в условиях облучения, тогда как у самцов репарация происходит не полностью и наблюдается адаптивный ответ. Все это свидетельствует о том, что предотвращение повреждений и репарация ДНК у самок происходили значительно эффективнее, чем у самцов. Наиболее вероятными причинами наблюдаемого полового диморфизма в отношении радиочувствительности являются гормональные различия. Например, облучение мышей в дозе 1 Гр приводит к значительно более выраженному увеличению уровня повреждений ДНК спленоцитов самцов, в сравнении с самками. Однако, удаление гонад приводит исчезновению различий в радиочувствительности (Koturbash et al., 2008). Возможно, это связано с большей эффективностью их свободнорадикальной защиты. Как известно, самки крыс имеют в 2 раза более высокую активность супероксиддисмутазы и глутати-оновой пероксидазы, чем самцы, поскольку эстрогены, связываясь со своими рецепторами, активируют ядерный транскрипционный фактор NF-kB, запускающий экспрессию данных антиокислительных ферментов (Vina et al., 2005). Активация NF-кВ может приводить к повышению эффективности не только антиоксидантной защиты, но и репарации ДНК, так как он регулирует активность белков участвующих в распознавании (ATM) и репарации повреждений ДНК (ЕРЗОО и Ов-метилгуанин-ДНК-метилтрансфе-раза) (De Siervi et al., 2009; Lavon et al., 2007). Половые различия в радиочувствительности известны также из исследований на людях (Wang et al., 2000). Из сказанного выше следует, что организм самок изначально более эффективно справляется с генотоксическим стрессом, и, возможно, поэтому обладает меньшей способностью к индукции адаптивного ответа.

Таким образом, развитие самцов мышей линий СБА в условиях хронического низкоинтенсивного облучения приводило к увеличению активности систем, предотвращающих образование новых повреждений, и репарации ДНК спленоцитов, что являлось причиной адаптивного ответа этих клеток при остром облучении в высокой дозе in vitro. Аналогичные тенденции наблюдались у самцов линии SHK. Самки обеих линий не проявляют радиоадаптивного ответа.

4.2. Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома мышей линии SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения

Описанные выше эксперименты с острым облучением спленоцитов животных, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения свидетельствовали о наличии у них адаптивного отве-

та, обусловленного, вероятно, повышением эффективности предотвращения и репарации повреждений ДНК. Однако для более глубокого понимания последствия хронического воздействия низкоинтенсивного у-излуче-ния (6-10 сГр) в период эмбрионального и двух месяцев постэмбрионального развития необходимо было проанализировать эффекты, наблюдающиеся в течение дальнейшей жизни животных без облучения, а также продолжительность их жизни.

В представленных исследованиях показано, что у животных, развивавшихся в условиях облучения сверхнизкой интенсивности, наблюдается отсроченный эффект радиационно-индуцированной генетической нестабильности (РИНГС) в клетках одной из самых радиочувствительных тканей организма - кроветворной. Такой вывод можно сделать исходя из обнаруженного повышения уровня повреждения ДНК лейкоцитов крови к 8-му и 11-му мес. жизни облученных самцов (рис. 5).

РИНГС известна как из исследований in vitro, так и in vivo и регистрируется даже в ответ на облучение в малых дозах. Например, облучение клеток HeLa в дозах 20-40 сГр приводит к снижению количества клеток в клоне на протяжении 7-10 генераций. Повышенная частота микроядер регистрируется в течение 20 генераций клеток китайского хомячка, облученных в дозе 0.5 Гр, причем пик образования микроядер приходится на 14-ю генерацию после воздействия (Пелевина и др., 2003). Повышенный уровень хромосомных аберраций наблюдался в фибробластах кожи плодов мышей, облученных на стадии зиготы в дозе 2 Гр, спустя более чем 30 клеточных генераций (Pampfer, Streffer, 1989). Облучение мышей на 14 или 17 день внутриутробного развития в дозах 0.25-1.5 Гр не влияет на частоту аберраций в клетках костного мозга новорожденных и молодых животных, однако приводит к повышению числа аберрантных клеток костного мозга на 9-12 мес. жизни, а также к появлению отдельных особей с выраженным лейкоцитозом (Devi, Satyamitra, 2005; Devi, Hossain, 2000). Проявление генетической нестабильности наблюдается у представителей флоры и фауны обитающих в зоне аварии на Чернобыльской АЭС (Geras'kin et al., 2008). Несмотря на это в литературе почти нет данных о генетической нестабильности индуцированной хроническим облучением сверхнизкой интенсивности in vivo, которая была обнаружена в нашей работе.

Важным механизмом поддержания стабильности ДНК клеток белой крови, постоянно подвергающихся процессам естественной селекции, является апоптоз. Увеличение его частоты при непосредственном воздействии ионизирующего излучения в малых дозах в различные периоды развития на организм млекопитающих хорошо известно (Heyer et al., 2000; Benekou et al., 2001; Bolaris et al., 2001). Однако в нашем эксперименте наблюдалось отсроченное уменьшение частоты апоптоза лейкоцитов у облученных животных по сравнению с необлученными (рис. 6). Таким образом, обнаруженная генетическая нестабильность клеток крови облученных самцов может быть результатом снижения чувствительности к апоптозу. Это предположение косвенно подтверждается тем, что наблюдавшиеся изменения среднего кометного индекса в представленном эксперименте происходило преимущественно за счет изменения количества слабо поврежденных клеток.

Так же как и радиоадаптивный ответ, обнаруженное снижение чувствительности лейкоцитов к апоптозу может быть следствием усиленной селекции клеток кроветворной ткани в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, приводящей к тому, что оставались более устойчивые клетки, в меньшей степени подвергавшиеся апоптозу. К такому же выводу можно прийти при интерпритации результатов анализа активности каспазы-3 (эф-фекторной протеазы апоптоза) в дермальной ткани хвоста мышей. Активность этого фермента, а значит и частота апоптоза клеток дермы, у животных развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсив-

ного у-излучения, в день окончания облучения была достоверно выше чем у контрольных животных, а затем, наоборот, снижалась ниже спонтанного уровня в течение дальнейшей жизни (рис. 7а).

Известно, что с возрастом происходит дисрегуляция систем апоптоза, и наоборот, с нарушением регуляции апоптоза связано множество возрастных заболеваний (Zainullin, Moskalev, 2001; Camplejohn et al., 2003; Москалев, 2008). Исходя из этого, можно предположить, что снижение чувствительности клеток облученных животных к апоптозу в представленной работе внесло вклад в наблюдавшееся изменение продолжительности жизни.

Альтернативным путем защиты ткани от малигнизации является стресс-индуцированное старение клеток несущих нерепарируемые повреждения ДНК и других жизненно важных структур. Клеточное старение характеризуется выходом клетки из клеточного цикла, что предотвращает ее бесконтрольную пролиферацию и возможную малигнизацию. В тоже время, увеличение числа стареющих клеток в ткани нарушает ее функцию и приводит к ускорению старения организма. В настоящей работе анализ активности лизосомальной ß-галактозидазы (маркера клеточного старения) показал отсутствие значимых различий в уровне клеточного старения дермы контрольных мышей и мышей, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения. Отмечена лишь небольшая тенденция к увеличению этого параметра с возрастом в группе облученных животных относительно контрольных. По всей видимости, в процессе развития организма защита от пролиферации клеток, несущих нерепарируемые повреждения, происходит преимущественно путем регуляции уровня апоптоза, так как накопление клеток, подвергнувшихся стресс-индуцированному клеточному старению в молодом возрасте может быть более пагубно для функции ткани, чем удаление сильно поврежденных клеток.

Продолжительность жизни является наиболее подходящим параметром для оценки реакции целого организма на облучение в период развития. На основании данного параметра можно делать вывод об интегральной эффективности клеточных, тканевых и системных механизмов защиты. Механизмы действия ионизирующего излучения на живые организмы во многом схожи с механизмами старения. Радиационно-индуцированное увеличение уровня активных форм кислорода и накопление повреждений ускоряют спонтанные и индуцируемые факторами окружающей среды деструктивные процессы (Hong et al., 2010; Bumann et al., 1995; Tsai et al., 2005; Kcrr et al., 2001). Кроме того при облучении происходит изменение стрессоустойчивости клеток (Olivieri et al., 1984; Саенко и др., 1991; Le et al., 1998), уровня апоптоза и пролиферации в тканях (Москалев, Зайнул-лин, 2004, Enns et al., 2004, Okada et al., 2007; Fan, Bergmann, 2008), наблюдается реакция со стороны иммунной и нейрогуморальной системы (Ina, Sakai, 2004; Ina et al., 2005;). Все это приводит к изменению скорости старения и продолжительности жизни.

Ускорение старения организма при воздействии ионизирующего излучения происходит в результате усиления интенсивности или дисрегуляции процессов, в норме происходящих при старении. К таким процессам можно отнести репликативное и стресс-индуцированное старение клеток, апоп-тоз клеток постмитотических тканей, нестабильность генома, а также эпигенетические изменения, приводящие к дисрегуляции экспрессии генов. В то же время облучение в малых дозах может привести к активации систем стресс-ответа в большей степени (по интенсивности или времени), чем это необходимо для компенсации повреждающего действия облучения, и увеличить стрессоустойчивость и продолжительность жизни организма. Таким образом, изменение продолжительности жизни зависит от интенсивности процессов, ускоряющих старение с одной стороны, и процессов противостоящих им (активация детоксификации свободных радикалов, репа-

рации ДНК и белков, повышение чувствительности контрольных точек клеточного цикла, элиминация путем апоптоза клеток, не справляющихся с повреждениями, активация иммунитета) с другой стороны.

В представленной работе наблюдалось снижение средней и медианной продолжительности жизни животных развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения (0.04 мГр/ч) по сравнению с контрольными животными (рис. 8). Кроме того, параллельное смещение траектории логарифма интенсивности смертности свидетельствует о преждевременном наступлении старения (рис. 9). Различия в продолжительности жизни сохранялись также в том случае, когда из анализа исключали особей, имеющих опухоли, выявляемые при внешнем осмотре животного. Кроме того, частота образования таких опухолей не изменялась у животных, раннее развитие которых происходило в условиях низкоинтенсивного облучения. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что однократное облучение в дозе 20 сГр или выше является канцерогенным. Однако при воздействии облучения в более низких дозах вопрос остается дискуссионным (Johansson, 2003). Наоборот, облучение очень низкой интенсивности может индуцировать механизмы, защищающие клетки от неопластической трансформации. Например, хроническое облучение клеток в культуре, при мощности дозы от 1-4 мГр/сут. приводит к снижению частоты неопластических трансформаций, индуцируемых последующим острым облучением в большой дозе (Elmore et al., 2008). Имеющиеся в наличии данные, тем не менее, не позволяют полностью исключить возможность канцерогенной природы (лейкозы, аденокарциномы) наблюдаемого изменения продолжительности жизни и требуют дальнейшего анализа.

Обнаруженное снижение продолжительности жизни противоречит эффектам облучения, выявленным нами в исследованиях на дрозофиле (Moskalev, 2003; Moskalev 2007), а также Maisin et al. (1996) на мышах. Однако следует отметить, что в этих исследованиях гормезис проявлялся при накопленной дозе 40 сГр для дрозофил и 50 сГр для мышей. Напротив, доза облучения 8 сГр относится к диапазону, в котором клетки нередко проявляют гиперрадиочувствительность. В то время как количество повреждений, приходящихся на клетку, при этих дозах уже достаточно велико, компенсаторные механизмы индуцируются неэффективно. Например, максимальный уровень автофосфорилирования (индукции) ATM -ключевой киназы, запускающей ответ клетки на повреждение ДНК, наблюдается только при 40 сГр (Marples, 2004).

Помимо уменьшения продолжительности жизни животных, генетической нестабильности и изменения чувствительности лейкоцитов к апоптозу, у облученных мышей наблюдалось снижение массы тела (рис. 76). Вероятных причин изменения данного интегрального показателя может быть несколько. Возможно, что хроническое облучение в процессе развития вызвало компенсаторный стресс-ответ, одним из эффектов которого является угнетение деления и роста клеток за счет снижения экспрессии генов, кодирующих структурные белки и активаторы пролиферации (Coleman et al., 2005), что могло отразиться на массе развивающегося организма. Эффект снижения массы тела животных в совокупности с другими морфометри-ческими показателями развития в ответ на пренатальное облучение известен для однократного облучения в более высоких дозах (0.3-1.5 Гр) (Hos-sain et al., 1999). В экспериментах по изучению адаптивного ответа помимо снижения массы тела было обнаружено повышение относительной массы селезенки и печени у хронически облученных животных, что, вероятно, свидетельствует о повышенной нагрузке на эти органы в процессе облучения, причиной которой может быть более активное разрушение клеток крови, чем у животных, развивавшихся без воздействия радиации.

Основной вопрос, возникающий при интерпретации полученных нами данных, заключается в том, как столь малая доза низкоинтенсивного облу-

чения могла вызвать столь значительные эффекты как снижение продолжительности жизни, генетическую нестабильность клеток кроветворной системы, снижение массы тела и относительной массы селезенки и печени. Мы предполагаем, что причиной является одновременное проявление гиперрадиочувствительности на уровне клетки и организма. Основным механизмом гиперрадиочувствительности на уровне клетки считают наличие порога чувствительности активации защитных систем, таких как репарация ДНК, детоксификация свободных радикалов и задержка клеточного цикла. Например, известно о существовании двух типов G2/M контрольных точек, имеющих различный порог чувствительности, скорость ответной реакции и эффективность (Xu et al., 2002). Кроме того, ионизация при облучении в сверхмалых дозах может затрагивать недостаточное количество структур, повреждение которых приводит к запуску защитных механизмов, приводя, однако, к снижению функции и жизнеспособности клетки (Maeda et al., 2008). На уровне организма причиной гиперрадиочувствительность может быть повышенная реакция чувствительных структур и в определенные периоды развития. В случае хронического облучения в течение всего раннего развития затронутыми оказываются практически все чувствительные периоды. Известно, например, что облучение самок мышей линии C57B1/6J интенсивностью 10 сГр/г, начиная с трехнедельного возраста не приводило к изменению продолжительности жизни и частоты онкологических, сосудистых и инфекционных заболеваний (Соurtade et al., 2002). Помимо гиперчувствительности к облучению в малых дозах, обнаруженные эффекты можно объяснить радиационно-индуцированной генетической нестабильностью. Как известно, генетическая нестабильность является одним из механизмов естественного старения организма (Москалев, 2008). Таким образом, ее индукция хроническим низкоинтенсивным облучением может обусловливать наблюдаемое снижение продолжительности жизни. Генетическая нестабильность является предрасполагающим фактором для малигнизации, в том числе для лейкозов. В литературе отмечено, что пренатальное облучение мышей в дозе 0.5 Гр у некоторых особей приводит к 2-2.5 кратному увеличению числа лейкоцитов в крови, а также к экстремально высокой частоте анеуплоидии этого типа клеток (Devi, Hossain, 2000; Devi, Satyamitra, 2005), что может говорить о начинающейся малигнизации кроветворных тканей. В других экспериментах, пренатальное облучение в дозе 0.25 Гр и облучение новорожденных мышат в дозе 0.19 Гр привело к увеличению частоты рака яичника с возрастом (Devi, Hossain, 2000; Sasaki, Fukuda, 2008). Поскольку в представленной работе анализировали только солидные опухоли, нельзя исключать возможность канцерогенной природы наблюдаемого уменьшения продолжительности жизни.

Известно, что эмбриональное и раннее постэмбриональное развитие организма является наиболее чувствительной фазой к воздействию стрессовых факторов. Клетки в этот период активно пролиферируют и растут, времени для полноценной репарации между фазами клеточного цикла недостаточно, а получаемая клетками энергия расходуется на рост и развитие, в ущерб воспроизводству и поддержанию активности белков стрессоустойчивости. При этом в период формирования органов и систем организм не может допускать накопления соматических мутаций и трансформированных клеток, поэтому механизм селекции проблемных клеток путем апоптоза может приобретать первостепенное значение, защищая эмбрион от возникновения уродств и предотвращая повышение эмбриональной смертности (Неуег et al., 2000). Данные, представленные в нашей работе, косвенно свидетельствуют об усилении селекции клеток в период развития в условиях хронического облучения.

Таким образом, хроническое воздействие низкоинтенсивного у-излуче-ния в период эмбрионального и первых двух месяцев постнатального раз-

вития мышей (6-10 сГр) приводило к снижению продолжительности жизни и массы тела, отсроченному повышению уровня повреждения ДНК лейкоцитов крови и снижению чувствительности последних к апоптозу, а также к изменениям уровня апоптоза клеток дермальной ткани хвоста с одной стороны и к увеличению устойчивости спленоцитов к острому облучению в высокой дозе (1 и 2 Гр) с другой стороны. Одновременно наблюдались гиперрадиочувствительность, генетическая нестабильность, и адаптивный ответ клеток облученных животных.

ВЫВОДЫ

1. Спленоциты самцов мышей линии СВА, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения in vivo (0.04 мГр/ч; в период внутриутробного развития и первых 2 месяцев жизни), имели меньший уровень повреждения ДНК, выявляемый непосредственно после острого облучения in vitro в дозах 1 и 2 Гр (на 32 и 19% соответственно), по сравнению с клетками особей, не подвергавшихся хроническому облучению, что свидетельствует о проявлении адаптивного ответа. Спустя 30 мин. после воздействия выраженность адаптивного ответа значительно возрастала (до 49%). При остром облучении клеток в условиях пониженной температуры (4 °С) различия в реакции клеток предоблученных и интактных животных не наблюдались.

2. Развитие мышей линии SHK в условиях хронического низкоинтенсивного облучения привело к отсроченному (6-й и 9-й мес. после окончания облучения) повышению уровня повреждений ДНК лейкоцитов периферической крови самцов при сниженной или неизменной частоте апоптоза данных клеток, что свидетельствует о генетической нестабильности и снижении чувствительности к апоптозу клеток облученной белой крови.

3. Спонтанный уровень повреждения ДНК и уровень повреждений ДНК, индуцированных острым облучением in vitro, у самок линий SHK и СВА ниже, чем у самцов. У самок линии СВА, в отличие от самцов, адаптивный ответ не наблюдается.

4. Самцы и самки мышей линии SHK, развивавшиеся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, по сравнению с интактными животными характеризовались сокращенной продолжительностью жизни и меньшей массой тела.

5. В дермальной ткани самцов мышей линии SHK, развивавшихся в условиях хронического облучения, активность каспазы-3 (маркера апоптоза) на момент окончания облучения была выше, чем у контрольных животных. Спустя 13-21 мес. после облучения данный показатель снижался по сравнению с уровнем в контроле, как у самцов, так и самок.

6. Полученные данные свидетельствуют о гиперчувствительности мышей к малым дозам ионизирующей радиации в период раннего индивидуального развития (0.04 мГр/ч; от стадий внутриутробного развития до первых 2 мес. жизни), проявляющейся как в реакциях на клеточном уровне (повышение уровня повреждений ДНК, снижение чувствительности к апоптозу), так и в реакцях целого организма (сокращение продолжительности жизни и снижение массы тела).

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Велегжанинов И.О., Москалев A.A., Осипов А.Н. Феномен уменьшения уровня однонитевых разрывов ДНК клеток системы крови в первом поколении хронически облучаемых мышей // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007. - Т. 47. - № 5. - С. 567-570.

2. Велегжанинов И.О., Москалев A.A. Возрастная динамика уровня повреждения ДНК, апоптоза и клеточного старения у мышей, облученных малыми дозами ионизирующей радиации на ранних стадиях развития // Успехи геронтологии. - 2008. - Т. 21. - № 3. - С. 480-484.

3. Велегжанинов И.О., Мезенцева В.Н., Москалев A.A. Сравнение адаптивного ответа спленоцитов мышей линии СВА и нейробластов личинок Drosophila melanogaster, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивого у-излучения // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2009. - Т.49. - №6. - С. 665-670.

Материалы и тезисы докладов

4. Велегжанинов И.О., Москалев A.A. Влияние хронического гамма-излучения в малых дозах на возрастную динамику уровня повреждений ДНК и апоптоза лимфоцитов крови и активности каспазы-3 в дермальной ткани кончика хвоста // Матер, докл. XV Всерос. молодеж. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар. - 2008. С. 352а-3526.

5. Moskalev A.A., Velegzhaninov I.O., Mezentseva V.N. Radioadaptive response of Drosophila melanogaster larva neuroblast // Abstr. International conference on the effects of low doses and very low doses of ionizing radiation on human health and biotopes. Rio de Janeiro (Brazil). - P. 120.

6. Велегжанинов И.О., Москалев A.A. Изучение механизмов радиационного адаптивного ответа клеток селезенки мышей линии СВА, развивавшихся в условиях хронического воздействия низкоинтенсивного гамма-излучения // Матер, докл. XVI Всерос. молодеж. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар. - 2009. - С. 41-43.

7. Велегжанинов И.О., Мезенцева В.Н., Москалев A.A. Сравнение адаптивных реакций спленоцитов мышей линии СВА и нейробластов личинок Drosophila melanogaster в ответ на хроническое воздействие низкоинтенсивного гамма-излучения // Матер, междунар. конф. «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды». Сыктывкар. - 2009. - С. 17-20.

8. Велегжанинов И.О., Москалев A.A. Продолжительность жизни и возрастная динамика уровня повреждения ДНК, апоптоза и клеточного старения у мышей, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения // Матер, междунар. конф. «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды». Сыктывкар. - 2009. - С. 20-24.

9. Велегжанинов И.О., Мезенцева В.Н., Москалев A.A. Влияние хронического низкоинтенсивного облучения на мышей в эмбриональной и ранней постэмбриональной стадии развития: радиоадаптивный ответ спленоцитов, возрастная динамика показателей стабильности генома и изменение продолжительности жизни // Тез. докл. международ, конф. «Генетика продолжительности жизни и старения». Сыктывкар. - 2010. - С. 35-36.

10. Moskalev A.A., Velegzhaninov I.O. Age dynamics of DNA damage, apoptosis, and cell senescence in mice after exposure to low dose gammairradiation at early development stages // Rapid diagnosis in populations at risk from radiation and chemicals / Eds. Cebulska-Wasilewska A. et al. - IOS Press, 2010 - P. 301-305.

Лицензия № 19-32 от 26.11

.96 г. КР 0033 от 03.03.97 г.

Тираж 100 Заказ 10(11)

Информационно-издательский отдел Учреждения Российской академии наук Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Велегжанинов, Илья Олегович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизмы ответа клетки на повреждения, вызываемые воздействием ионизирующего излучения.

1.1.1. Ответ клетки на повреждение ДНК.

1.1.1.1. Типы повреждения ДНК.

1.1.1.2. Механизмы распознавания и репарации повреждений ДНК.

1.1.1.3. Остановка клеточного цикла в проверочных точках.

1.1.1.4. Индукция клеточного старения.

1.1.1.4. Апоптоз.

1.1.2. Механизмы ответа на повреждение клеточных структур.

1.1.2.1. Повреждение и репарация белков.

1.1.2.2. Повреждение липидных мембран.

1.1.2.3. Повреждение митохондриальных белков и ДНК.

1.1.2.4. Система детоксификации свободных радикалов.

1.2. Специфические эффекты малых доз ионизирующего излучения.

1.2.1. Гиперрадиочувствительность.

1.2.1.1. Механизмы клеточной гиперрадиочувствительности.

1.2.1.2. Механизмы гиперрадиочувствительности на уровне целого организма.

1.2.2. Гормезис.

1.2.2.1. Клеточные механизмы гормезиса.

1.2.2.2. Механизмы радиационного гормезиса на уровне целого организма.

1.2.3. Радиационный адаптивный ответ.

1.2.3.1. Клеточные механизмы радиационного адаптивного ответа.

1.2.3.2. Механизмы радиационного адаптивного ответа на уровне организма

1.2.4. Эффект свидетеля.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект и условия облучения.

2.2. Схемы экспериментов по изучению адаптивного ответа спленоцитов мышей линии СВА, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивого у-излучения.

2.2.1. Эксперимент 1.

2.2.2. Эксперимент 2.

2.3 Схемы экспериментов по изучению адаптивного ответа спленоцитов мышей линии БНК, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивого у-излучения.

2.4. Схема изучения возрастной динамики цитогенетических и биохимических-показателей стабильности генома мышей линии БНК, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения.

2.5. Определение уровня повреждений ДНК методом «ДНК-комет».

2.6. Определение частоты апоптоза методом «гало».

2.7. Определение активности каспазы-3.

2.8. Определение активности лизосомальной Р-галактозидазы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Адаптивный ответ спленоцитов мышей линий СВА и БНК, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивого у-излучения-.

3.2. Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома, продолжительность жизни и масса тела мышей линии БНК, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Адаптивный ответ спленоцитов мышей линий СВА и БНК.

4.2. Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома мышей линии БНК, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучепия.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома и клеточного старения у мышей, облученных ионизирующей радиацией в малых дозах на ранних стадиях развития"

Актуальность темы. Изучение воздействия на клетку ионизирующих излучений в малых дозах выявило специфичные для данного диапазона доз радиобиологические эффекты, такие, как гормезис, адаптивный ответ и гиперчувствительность. В исследованиях in vitro были обнаружены ключевые механизмы данных эффектов, связанные с контролем клеточного цикла, репарацией ДНК, детоксификацией свободных радикалов,, апоптозом (Le et al., 1998; Prekeges, 2003; Zhou, Rigaud; 2001; Ding et al:, 2009; Miura, 2004; Matsumoto et al., 2007; Saenko et all, 1990): В том случае, если облученная клетка не погибает, существует вероятность проявления; отдаленных последствий ее облучения- у дочерних клеток — генетическая нестабильность (Пелевина и др., 1996; Осипов, и др., 2000; Мазурик^,Михайлов, 2001; Seymour et al., 1986; Mothersill, Seymour, 1987;: KadHim et al., 1992; Kronenberg, 1994); Радиация модифицирует и межклеточные взаимодействия: облучение одних клеток может индуцировать эффект свидетеля в других (Nagasawa, Little, 1992).

Однако следует отметить, что зная некоторые механизмы ответа клеток на облучениеизэкспериментовна иммортализованных культурах raeTOKinvitro,Mbi пока имеем:мало представления о том, как оншвзаимодействуют на уровне систем органов in vivo и каким?, образом они влияют на жизнеспособность целого организма; Например, как. связана гиперчувствительность, генетическая* нестабильность, адаптивный; ответ. или; гормезис клетки, с: радиационно-индуцированным; изменением« функционирования: органов, продолжительности жизни, репродукции;, заболеваемости у облученных индивидуумов и их потомства? Какие гены: ответственны: за индивидуальную радиочувствительность у человека и животных? Впоследствии ответы именно на эти вопросы позволят- в полной мере: использовать на практике достижения- современной радиобиологии: Таким? образом;. одной из: ведущих задача радиобиологии? является выявление: путей, интеграции! молекулярно-клеточных механизмов; индуцируемых ионизирующим* излучением в малых дозах, в ответную реакцию всего организма: (патологию; приспособленность, продолжительность жизни); в зависимости: от генетического фона и радиочувствительности индивидуума (Москалев; Шапошников; 2009)?

Особенно чувствительным к воздействию ионизирующего излучения в малых дозах является период эмбрионального и раннего постэмбрионального развития организма. Отдалённые последствия пренатального облучения, по-видимому, являются следствием декомпенсационных процессов на уровне клетки — радиационно-индуцированной нестабильности генома (Streffer, 2004; Devi, Hossain, 2000; Devi, Satyamitra, 2005), а на уровне организма — нарушения развития органов и систем. Например, известно, что пренатальное облучение в малых дозах способно приводить к атрофии белого вещества мозга (Reyners 1999), замедлению миграции нейробластов в формирующуюся кору головного мозга (Корнев и др., 2004), а также к замедлению развития организма по общим морфометрическим показателям (Hossain et al., 1999).

К ключевым отдаленным эффектам облучения следует отнести изменение продолжительности жизни, механизмы которого интенсивно изучаются. Ранее, при исследовании продолжительности жизни мутантных по апоптозу линий Drosophila melanogaster, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, в нашей лаборатории был выявлен радиационный гормезис по данному показателю, и выяснено, что этот эффект являетсяt следствием усиления элиминации не справляющихся с повреждением клеток под воздействием облучения в процессе развития организма (Moskalev, 2003; 2007). Опираясь на эти результаты, была поставлена задача воспроизвести аналогичный эксперимент на мышах, привнеся в него прижизненный контроль апоптоза, стабильности генома и старения клеток, а также анализ таких интегральных показателей жизнеспособности, как продолжительность жизни и масса тела. Постановка такого эксперимента на дрозофиле невозможна, кроме того использование в качестве объекта исследования мышей увеличивает практическую значимость работы с точки зрения оценки рисков воздействия ионизирующего излучения на человека.

Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в сопоставлении эффектов хронического низкоинтенсивного у-излучения у самцов и самок мышей на клеточном (адаптивный ответ, возрастная динамика уровня повреждения ДНК, апоптоза и клеточного старения) и организменном уровнях (продолжительность жизни, масса тела животного). Для достижения указанной цела были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать адаптивный ответ спленоцитов самцов и самок мышей линий СВА и SHK, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения. Оценить уровень повреждения ДНК и частоты апоптоза спленоцитов в ответ на острое облучение непосредственно после воздействия и через 30 мин.

2) Изучить возрастную динамику уровня повреждения ДНК и частоты апоптоза в лейкоцитах периферической крови, активность каспазы-3 (маркера апоптоза) и лизосомальной р-галактозидазы (маркера клеточного старения) в дермальной ткани хвоста мышей линии SHK, а также продолжительность жизни и динамику массы тела самцов и самок данной линии, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Воздействие хронического низкоинтенсивного у-излучения в малых дозах в период раннего развития самцов мышей линии СВА приводит к адаптивному ответу спленоцитов при остром облучении in vitro в результате повышения эффективности предотвращения и репарации повреждений ДНК.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в течение 2005-2010 гг. в рамках бюджетных тем Отдела радиоэкологии ИБ Коми НЦ УрО РАН "Биологическое действие ионизирующего излучения в малых дозах и факторов нерадиационной природы на живые организмы и природные экосистемы" (Гр 01.2.00 102214), "Реакция экосистем и их компонентов на хроническое воздействие факторов низкой интенсивности" (Гр 0120.0 603503), "Оценка значимости эффектов, вызванных хроническим радиационным и нерадиационным воздействием на молекулярно-клеточном уровне, для организма и популяций животных и растений" (Гр 0120.0 853805). Проведенные исследования были также поддержаны инициативным проектом РФФИ №08-04-00456-а на 20082010 гг., грантами Президиума РАН по программам «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки - медицине» на 2009-2011 гг., молодежным научным грантом УрО РАН на 2009 и 2010 гг.

Теоретическая значимость и научная новизна работы. Впервые изучена продолжительность жизни и динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома и клеточного старения мышей, развивавшихся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения (0.04 мГр/ч; с внутриутробного развития до первых 2 мес. жизни). Показано, что такое воздействие приводит к отсроченному повышению уровня повреждения ДНК лейкоцитов крови при одновременном снижении чувствительности последних к апоптозу, а также к снижению продолжительности жизни и массы тела животных. В тоже время обнаружено, что развитие мышей в условиях низкоинтенсивного облучения in vivo вызывает повышение резистентности спленоцитов к облучению в острой дозе in vilro, проявляющееся как непосредственно сразу после воздействия, так и спустя некоторое время (30 мин) после выявляющего воздействия. Результаты проведённых исследований способствуют пониманию путей интеграции молекулярных и клеточных механизмов, индуцируемых ионизирующим излучением в малых дозах, в ответную реакцию всего организма.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные, свидетельствующие о реакции гиперчувствительности мышей к хроническому воздействию низкоинтенсивного ионизирующего излучения на. ранних стадиях онтогенеза, могут быть использованы при оценке рисков радиационного загрязнения окружающей среды и повышенного естественного радиационного фона, прогнозировании отдалённых последствий профессионального и медицинского облучения развивающегося организма, а также при разработке рекомендаций по снижению негативных последствий этих явлений для здоровья человека и экологического состояния биоты.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на научных конференциях молодых ученых Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2007, 2008, 2009, 2010 гг.) и Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2007 и 2009 гг.), всероссийском семинаре «Генетика продолжительности жизни и старения» в 2008 г; международных конференциях «БИОРАД 2009» (Сыктывкар), «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар, 2010), LowRad 2009 (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2009), «Rapid Diagnosis in Population at Emergency and Risk 'RADIPER'» (Краков-Закопане, Польша, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Велегжанинов, Илья Олегович

ВЫВОДЫ

1. Спленоциты самцов мышей линии СБА, развивавшихся в условиях воздействия хронического низкоинтенсивного у-излучения in vivo (0.04 мГр/ч; в период внутриутробного развития и первых 2 месяцев жизни), имели меньший уровень повреждения ДНК, выявляемый непосредственно после острого облучения in vitro в дозах 1 и 2 Гр (на 32 и 19 %, соответственно), по сравнению с клетками особей, не подвергавшихся хроническому облучению, что свидетельствует о проявлении адаптивного ответа. Спустя 30 мин после воздействия выраженность адаптивного ответа значительно возрастала (до 49%). При остром облучении клеток в условиях пониженной температуры (4°С) различия в реакции клеток предоблучённых и интактных животных не наблюдались.

2. Развитие мышей линии SHK в условиях хронического низкоинтепсивного облучения привело к отсроченному (6-й и 9-й месяц после окончания облучения) повышению уровня повреждений ДНК лейкоцитов периферической крови самцов при сниженной или неизменной частоте апоптоза данных клеток, что свидетельствует о генетической нестабильности и снижении чувствительности к апоптозу клеток облученной белой крови.

3. Спонтанный уровень повреждения ДНК и уровень повреждений ДНК, индуцированных острым облучением in vitro, у самок линий SHK и СБА ниже, чем у самцов. У самок линии СБА, в отличие от самцов, адаптивный ответ не наблюдается.

4. Самцы и самки мышей линии SHK, развивавшиеся в условиях хронического низкоинтенсивного облучения, по сравнению с интактными животными характеризовались сокращённой продолжительностью жизни и меньшей массой тела.

5. В дермальной ткани самцов мышей линии SHK, развивавшихся в условиях хронического облучения, активность каспазы-3 (маркера апоптоза) на момент окончания облучения была выше, чем у контрольных животных. Спустя 13-21 месяц после облучения данный показатель снижался по сравнению с уровнем в контроле, как у самцов, так и самок.

6. Полученные данные свидетельствуют о гиперчувствительности мышей к малым дозам ионизирующей радиации в период раннего индивидуального развития (0.04 мГр/ч; от стадий внутриутробного развития до первых 2 месяцев жизни), проявляющейся как в реакциях на клеточном уровне (повышение уровня повреждений ДНК, снижение чувствительности к апоптозу), так и в реакцях целого организма (сокращение продолжительности жизни и снижение массы тела).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Велегжанинов, Илья Олегович, Обнинск

1. Бабынин Э.А. Молекулярный механизм гомологичной рекомбинации в мейозе: происхождение и биологическое значение // Цитология. — 2007. — Т.49. — №3. — С.182-193.

2. Бландова 3. К., Душкин В. А., Малашенко А. М., Шмидт Е. Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. — М.: Наука, 1983.-191 с.

3. Бондарчук И.А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2003. — Т.43. №1. -С. 19-28.

4. Бурлакова Е. Б., Конрадов А. А., Мальцева Е. Л. Действие сверхмалых доз биологически активных веществ и низкоинтенсивных физических факторов // Химическая физика. 2003. - Т. 22. - № 2. - С. 390-424.

5. Велегжанинов И.О., Москалев A.A. Возрастная динамика уровня повреждения ДНК, апоптоза и клеточного старения у мышей, облучённых малыми дозами ионизирующей радиации на ранних стадиях развития // Успехи геронтологии. 2008. - Т. 21. - № 3. - С.480-484.

6. Зайнуллин В.Г., Москалев A.A., Шапошников М.В., Таскаев А.И. Современные аспекты радиобиологии Drosophila melanogaster. Апоптоз и старение // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. - Т.39. - №1. - С.49-57.

7. Корнев М. А., Куликова Е .А., Кульбах О. С. Клеточный состав коры большого мозга плодов крысы в условиях фракционированного воздействия радиации в малых дозах // Морфология. 2004. - Т. 125. - № 3. - С. 78-81.

8. Кудряшёв Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующее облучение). — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2004. 448 с.

9. Мазурик В.Н., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцированная нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. - Т.41. - №3. - С.272-289.

10. Матвеева Н.Ю. Апоптоз: морфологические особенности и молекулярные механизмы // Тихоокеанский медицинский журнал. — 2003. — №4. — С.12-16.

11. Михеев А.Н., Гуща Н.И. Малиновский Ю.Ю. Эпигенетические реакции клеток на действие ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. -1999. Т.39. - №5. - С.548-556.

12. Москалёв А. А., Зайнуллин В. Г. Возрастная динамика активности имаго после хронического облучения личинок у линий дрозофилы с нарушениями регуляции апоптоза // Генетика. 2004. - Т.40. - №2. - С. 1-4.

13. Москалёв А. А. Старение и гены. СПб.: Наука, 2008. - 359 с.

14. Москалёв А. А., Шапошников М. В. Генетические механизмы воздействия ионизирующих излучений в малых дозах. СПб.: Наука, 2009. - 137 с.

15. Осипов А.Н., Григорьев М.В., Сыпин В.Д., Померанцева М.Д. Влияние хронического воздействия кадмия и у-излучения в малых дозах на генетические структуры мышей // Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. - Т.40. - №4. -С. 373-377.

16. Пелевина И. И., Алещенко А. В., Антощина М. М., Готлиб В. Я., Кудряшова О. В., Семенова Л. П., Серебрянный А. М. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2003. — Т.43. — №2. — С.161-166.

17. Пелевина И.И., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В. и др. Нестабильность генома после воздействия радиации в малых дозах (в 10-километровой зоне аварии на ЧАЭС и в лабораторных условиях) // Радиационная биология. Радиоэкология. — 1996. Т.36. - №4. - С.546-560.

18. Пелевина И.И., Саенко А.С., Готлиб В.Я., Сынзыныс Б.И. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК. — М.: Энергоатомиздат, 1985.-120 с.

19. Саенко А.С., Семенец Т.Н., Семина О.В. Повышение радиорезистентности (адаптивный ответ) in vivo селезеночных колониеобразующих единиц (КОЕ-С) после воздействия на мышей у-луч ей б0Со в малых дозах // Радиобиология. — 1991. -Т.31, —№5. -С.716-718.

20. Сойфер В.Н. Репарация генетических повреждений // Соросовский образовательный журнал. — 1997. — №8. — С.4-13.

21. Abukhdeir А. М., Park В.Н. Р21 and р27: roles in carcinogenesis and drug resistance // Expert. Rev. Mol. Med. 2008. - N 10. - el9.

22. Adler V., Yin Z., Tew K. D., Ronai Z. Role of redox potential and reactive oxygen species in stress signaling // Oncogene. 1999. - N 18. - P.6104-6111.

23. Ahmed K.M., Li J.J. ATM-NF-kappaB-mediated adaptive resistance to ionizing radiation//Free Radic. Biol. Med. -2008.- Vol.44.-N 1.-P.l-13.

24. Arya R., Mallik M., Lakhotia S. C. Heat shock genes integrating cell survival and death // J. Biosci. - Vol.32. - N 3. - P.595-610.

25. Benekou A., Bolaris S., Kazanis E., Bozas E., Philippidis H., Stylianopoulou F. In utero radiation-induced changes in growth factor levels in the developing rat brain // Int. J. Radiat. Biol. 2001. - Vol.77. - N 1. - P.83-93.

26. Berneburg M., Kamenischa Y., Krutmann J. Repair of mitochondrial DNA in aging and carcinogenesis //Photochem. Photobiol. Sci. -2006. -N 5. -P.190-198.

27. Bolaris S., Bozas E., Benekou A., Philippidis H., Stylianopoulou F. In utero radiation-induced apoptosis and p53 gene expression in the developing rat brain // Int. J. Radiat. Biol. -2001. Vol.77. -N 1. -P.71-81.

28. Bonner W. M. Phenomena leading to cell survival values which deviate from linear-quadratic models // Mutation Research. 2004. - Vol.568. - N 1. - P.33-39.

29. Brunk U. T., Terman A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol.269. -N 8. - P. 1996-2002.

30. Burke R. E. Inhibition of MAPK and stimulation of AKT kinase signaling pathways: two approaches with therapeutic potential in the treatment of neurodegenerative disease // Pharmacol Ther. 2007. - Vol. 114. - N 3. - P.261-277.

31. Cai L., Liu S.Z. Induction of cytogenetic adaptive response of somatic and germ cells in vivo and in vitro by low-dose X-irradiation // Int. J. Radiat. Biol. 1990. -Vol.58.-N 1.-P. 187-194.

32. Calderwood S. K., Murshid A., Prince T. The shock of aging: Molecular chaperones and the heat shock response in longevity and aging // Gerontology. 2009. -Vol.55.—N 5. - P.550-558.

33. Camplejohn R. S., Gilchrist R., Easton D., McKenzie-Edwards E., Barnes D. M., Eccles D. M., Ardern-Jones A., Hodgson S. V., Duddy P. M., Eeles R. A. Apoptosis, ageing and cancer susceptibility // British Journal of Cancer. 2003. - N 88. - P.487-490.

34. Casalini P., Iorio M.V., Berno V., Bergamaschi A., Borresen Dale A. L., Gasparini P., Orlandi R., Casati B., Tagliabue E., Menard S. Relationship between p53 and p27 expression following HER2 signaling // Breast. 2007. - Vol.16. - N 6. - P.597-605.

35. Chen S. L., Cai L., Meng Q. Y., Xu S., Wan H., Liu S. Z. Low-dose whole-body irradiation (LD-WBI) changes protein expression of mouse thymocytes: effect of a LD

36. WBI-enhanced protein RIP 10 on cell proliferation and spontaneous or radiation-induced thymocyte apoptosis // Toxicological sciences. 2000. - Vol.55. —N 1. - P.97-106.

37. Chen W. The late stage of T cell development within mouse thymus // Cellular & Molecular Immunology. 2004. - Vol. 1. - N 1. - P.3-11.

38. Collins A.R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair // Molecular Biotechnology. 2004. - Vol.26. - N 3. - P.249-261.

39. Courtade M., Billote C., Gasset G., Caratero A., Charlet J. P., Pipy B., Caratero C. Life span, cancer and non-cancer diseases in mouse exposed to a continuous very low dose of gamma-irradiation // Int J Radiat Biol. 2002. - Vol.78. - N 9. - P.845-855.

40. Devi P. U., Hossain M. Induction of chromosomal instability in mouse hemopoietic cells by fetal irradiation // Mutat. Res. 2000. - Vol.456. - N 1-2. - P.33-37.

41. Devi P. U., Satyamitra M. Tracing radiation induced genomic instability in vivo in the haemopoietic cells from fetus to adult mouse // Br. J. Radiol. 2005. - Vol.78. - N 934. - P.928-33.

42. Enns L., Bogen K. T., Wizniak J., Murtha A. D., Weinfeld M. Low-Dose Radiation Hypersensitivity Is Associated With p53-Dependent Apoptosis // Mol. Cancer Res. 2004. - Vol.2. - N 10. - P.557-566.

43. Epps D.E., Andersen B.R., Streptolysin 0 inhibition of neutrophil Chemotaxis and mobility: nonimmune phenomenon with species specificity // Infection and Immunity. -1974. Vol.9. - N 1. - P. 27-33.

44. Fadeel B., Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in human disease // Journal of Internal Medicine. 2005. -N258. -P.479-517.

45. Fan Y., Bergmann A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell! // Trends in Cell Biology. 2008. - Vol.18. - N 10. - P.467-473.

46. Feinendegen L.E. Evidence for beneficial low level radiation effects and radiation hormesis // The British Journal of Radiology. 2005. - N 78. - P.3-7.

47. Geras'kin S. A., Fesenko S. V., Alexakhin R. M. Effects of non-human species irradiation after the Chernobyl NPP accident // Environment International. 2008. - N 34. -P.880-897.

48. Giorgio M., Trinei M., Migliaccio E., Pelicci P. G. Hydrogen peroxide: a metabolic by-product or a common mediator of ageing signals? // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. - Vol.8. - N 9. - P.722-728.

49. Haan J. B., Cristiano F., Iannello R. C., Kola I. Cu/Zn-superoxide dismutase and glutathione peroxidase during aging // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. - Vol.35. - N 6. -P.1281-1297.

50. Heyer S.B., MacAuley A., Behrendtsen O., Werb Z. Hypersensitivity to DNA damage leads to increased apoptosis during early mouse development // Genes. Dev. -2000.-N 14. -P.2072-2084.

51. Hiona A., Leeuwenburgh C. The role of mitochondrial DNA mutations in aging and sarcopenia: Implications for the mitochondrial vicious cycle theory of aging // Exp. Gerontol. 2008. - Vol.43. -N 1. -P.24-33.

52. Hossain M., Devi P.U., Bisht K.S. Effect of prenatal gamma irradiation during the late fetal period on the postnatal development of the mouse // Teratology. 1999. -Vol.59. -N3.-P.133-138.

53. Ina Y., Sakai K. Activation of immunological network by chronic low-dose-rate irradiation in wild-type mouse strains: Analysis of immune cell populations and surface molecules // Int. J. Radiat. Biol. 2005(a). - Vol.81. - N 10. - P.721-729.

54. Ina Y., Sakai K. Further study of prolongation of life span associated with immunological modification by chronic low-dose-rate irradiation in MRL-lpr/lpr mice: effects of whole-life irradiation // Radiation Research. 2005(b). - N 163. -P.418-423.

55. Ina Y., Sakai K. Prolongation of life span associated with immunological modification by chronic low-dose-rate irradiation in MRL-lpr/ipr mice // Radiation Research.-2004.-N 161.-P.168-173.

56. Ina Y., Tanooka H., Yamada T., Sakai K. Suppression of thymic lymphoma induction by life-long low-dose-rate irradiation accompanied by immune activation in C57BL/6 mice // Radiation Research. 2005. -N 163. -P.153-158.

57. Ishii K, Watanabe M. Participation of gap-junctional cell communication on the adaptive response in human cells induced by low dose of X-rays // Int. J. Radiat. Biol. 1996. Vol.63. -N 3. - P.291-299.

58. Iyer R., Lehnert B. E. Alpha-particle-induced increases in the radioresistance of normal human bystander cells // Radiat. Res. 2002. - Vol. 151. - N 1. - P.3-7.

59. Johansson L. Hormesis, an update of the present position // European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 2003. - Vol.30. - N 6. - P.921-933.

60. Junttila M. R., Li S-P.,Westermarck J. Phosphatase-mediated crosstalk between MAPK signaling pathways in the regulation of cell survival // The FASEB Journal. -2008. Vol.22. - P.954-965.

61. Kabakov A. E., Malyutina Y. V., Latchman D. S. Hsfl-mediated stress response can transiently enhance cellular radioresistance // Radiat. Res. 2006. - Vol.165. - N 4. — P.410-423.

62. Kadhim M.A., Macdonald D.A., Goodhead D.T., Lorimore S. A., Marsden S. J., Wright E. G. Transmission of chromosomal instability after plutonium alpha-particle irradiation // Nature. 1992. - Vol.355. - N 6362. - P.738-740.

63. Kaushik S., Kiffin R., Cuervo A. M. Chaperone-mediated autophagy and aging: a novel regulatory role of lipids revealed // Autophagy. 2007. - Vol.3. - N 4. - P.387-389.

64. Kerr J. F. R., Wyllie A. H., Currie A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. 1972. -Vol.26. -N 4. -P.239-257.

65. Kim G. J., Fiskum G. M., Morgan W. F. A role for mitochondrial dysfunction in perpetuating radiation-induced genomic instability // Cancer Res. 2006. - Vol.66. - N 21. —P.10377-10383.

66. Kinner A., Wu W., Staudt C., Iliakis G. y-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin // Nucleic Acids Res. — 2008. -Vol.36. N 17. - P.5678-5694.

67. Kronenberg A. Radiation-induced genomic instability // Int. J. Radiat. Biol. -1994. Vol.66. - N 5. - P.603-609.

68. Koczor C. A., Shokolenko I. N., Boyd A. K., Balk S. P., Wilson G. L., Ledoux S. P. Mitochondrial DNA damage initiates a cell cycle arrest by a Chk2-associated mechanism in mammalian cells // J. Biol. Chem. 2009. - Vol.284. - N 52. - P.36191-36201.

69. Korr H., Thorsten Rohde H., Benders J., Dafotakis M., Grolms N., Schmitz C. Neuron loss during early adulthood following prenatal low-dose X-irradiation in the mouse brain // Int J Radiat Biol. 2001. - Vol.77. - N 5. - P.567-580.

70. Koturbash I., Kutanzi K., Hendrickson K., Rodriguez-Juarez R., Kogosov D., Kovalchuk O. Radiation-induced bystander effects in vivo are sex specific // Mutation Research. 2008. - N 642. - P.28-36.

71. Kultz D. Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response // Annu. Rev. Phisiol. 2005. - N 67. - P. 13.1-13.33.

72. Kurz D. J., Decary S., Hong Y., Erusalimsky J. D. // J. Cell Sei. 2000. - Vol. 113. -P. 3613-3622.

73. Kuranaga E., Miura M. Molecular genetic control of caspases and JNK-mediated neural cell death //Arch. Histol. Cytol. 2002. - Vol.65. -N 4. -P.291-300.

74. Kuypers F. A. Membrane lipid alterations in hemoglobinopathies // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2007. - P.68-73.

75. Lam E. W.-F., Francis R. E., Petkovic M. FOXO transcription factors: key regulators of cell fate // Biochemical Society Transactions. — 2006. — Vol.34. P.722-726.

76. Le X.C., Xing J.Z., Lee J., Leadon S.A., Weinfeld M. Inducible repair of thymine glycol detected by an ultrasensitive assay for DNA damage // Science. — 1998. Vol.280. -P.1066-1069.

77. Lee B. Y., Han J. A., Im J. S., Morrone A., Johung K., Goodwin E. C., Kleijer W. J., DiMaio D., Hwang E.S. Senescence-associated p-galactosidase is lysosomal p-galactosidase// Aging Cell. -2006. Vol.5. -N 2. - P. 187-195.

78. Liebermann D. A., Hoffman B. Gadd45 in stress signaling // Journal of Molecular Signaling.-2008.-Vol.3.-N 15.

79. Loeb L. A., Wallace D. C., Martin G. M. The mitochondrial theory of aging and its relationship to reactive oxygen species damage and somatic mtDNA mutations // PNAS. 2005. - Vol. 102. - N 52. - P. 18769-18770.

80. Lu T., Pan Y., Kao S.-Y., Li C., Kohane I., Chan J., Yankner B. A. Gene regulation and DNA damage in the ageing human brain // Nature. 2004. - Vol.429. -P.883-891.

81. Maeda M., Usami N., Kobayashi K. Low-dose hypersensitivity in nucleus-irradiated V79 cells studied with synchrotron X-ray microbeam // J. Radiat. Res. 2008. - N49.-P.171-180.

82. Maisin J.R., Gerber G.B., Vankerkom J., Wambersie A. Survival and diseases in C57BL mice exposed to X rays or 3.1 MeV neutrons at an age of 7 or 21 days // Radiat. Res. 1996. - Vol.146. - N 4. - P.453-460.

83. Maiuri M.C., Zalckvar E., Kimchi A. Kroemer G. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2007. - Vol.8. -N 9. -P.741-752.

84. Malakhova L., Bezlepkin V. G., Antipova V., Ushakova T., Fomenko L., Sirota N., Gaziev A. I. The increase in mitochondrial DNA copy number in the tissues of y-irradiated mice // Cell. Mol. Biol. Lett. 2005. - Vol. 10. - N 4. - P.721-732.

85. Marples B. Is low-dose hyper-radiosensitivity a measure of G2-phase cell radiosensitivity? // Cancer and Metastasis Reviews. 2004. - Vol.23. - N 3-4. - P. 197207.

86. Matsumoto H., Hamada N., Takahashi A., Kobayashi Y., Ohnishi T. Vanguards of Paradigm Shift in Radiation Biology: Radiation-Induced Adaptive and Bystander Responses // J. Radiat. Res. 2007. - Vol.48. - N 2. - P.97-106

87. Mendez F., Kozin E., Bases R. Heat shock protein 70 stimulation of the deoxyribonucleic acid base excision repair enzyme polymerase beta // Cell Stress Chaperones.- 2003.-Vol.8.- N2.-P.153-161.

88. Miura Y. Oxidative stress, radiation-adaptive responses, and aging // J. Radiat. Res. 2004. - Vol.45. - N 3. - P.357-372.

89. Moskalev A. Radiation-induced life span alteration of Drosophila lines with genotype differences // Biogerontol. 2007. - Vol.8. - N 5. - P.499-504.

90. Moskalev A., Shaposhnikov M., Turysheva E. Life span alteration after irradiation in Drosophila melanogaster strains with mutations of Hsf and Hsps II Biogerontology. -2009.-Vol.10.-Nl.-P.3-ll.

91. Mothersill C., Seymour C. The influence of lethal mutations on the quantification of radiation transformation frequencies // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 1987. - Vol.51. - N 4. - P.723-729.

92. Mu D., Bessho T., Nechev L. V., Chen D. J., Harris T. M., Hearst J. E., Sancar A. DNA interstrand cross-links induce futile repair synthesis in mammalian cell extracts // Mol. Cell. Biol. 2000. - Vol.20. - N 7. P.2446-2454.

93. Nagasawa H., Little J. B. Induction of sister chromatid exchanges by extremely low doses of alpha-particles // Cancer Res. 1992. - Vol.52. - N 22. - P.6394-6396.

94. Naugler W. E., Karin M. NF-kB and cancer identifying targets and mechanisms // Curr. Opin. Genet. Dev. - 2008. - Vol. 18. - N 1. - P. 19-26.

95. Nicholson D. W., Ali A., Thornberry N. A. et al. // Nature. 1995. - N 376. - P. 37-43.

96. Nomura T. Transgenerational effects of radiation and chemicals in mice and humans // J. Radiat. Res. 2006. - Vol.47. - P.83-97.

97. Oberdoerffer P., Sinclair D. A. The role of nuclear architecture in genomic instability and ageing // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. - Vol.8 - N 9. - P.692-702.

98. Olive P.L., Banath J.P., Durand R.E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay // Radiat. Res.- 1990.-Vol.122.-N 1.-P.86-94.

99. Olivieri G., Bodycote J., Wolff S. Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine // Science. — 1984. — Vol.223. — N 4636. — P.594-597.

100. Otsuka K., Koana T., Tauchi H., Sakai K. Activation of antioxidative enzymes induced by low-dose-rate whole-body gamma irradiation: adaptive response in terms of initial DNA damage // Radiat. Res. 2006. - Vol. 166. - N 3. - P.474-478.

101. Pampfer S., Streffer C. Increased chromosome aberration levels in cells from mouse fetuses after zygote X-irradiation // Int. J. Radiat. Biol. 1989. - Vol.55. - N 1. P.85-92.

102. Parsons P.A. Low level exposure to ionizing radiation: do ecological and evolutionary considerations imply phantom risks // Perspectives in Biologi and Medicine. -1999. -N43.-P.57-68.

103. Pietsch E. C., Sykes S. M., McMahon S. B., Murphy. M.E. The p53 family and programmed cell death // Oncogene. 2008. - Vol.27. - N 50. - P.6507-6521.

104. Pollycove M., Feinendegen L.E. Radiationinduced versus endogenous DNA damage: possible effect of inducible protective responses in mitigating endogenous damage // BELLE newsletter. 2003. - Vol.11. - N 2. - P.2-22.

105. Prekeges J. L. Radiation hormesis, or, could all that radiation be good for us? // Journal of nuclear medicine technology. -2003. Vol.31. -N 1. -P.ll-17.

106. Reyners H., Gianfelici de Reyners E., Yan J., De Saint-Georges L., Desaintes C. Delayed effects of prenatal low-dose irradiation in the white matter of the rat brain // Int. J. Radiat. Biol. 1999.-Vol.75.-N 10.-P. 1327-1334.

107. Ricci C., Pastukh V., Leonard J., Turrens J., Wilson G., Schaffer D., Schaffer S. W. Mitochondrial DNA damage triggers mitochondrial-superoxide generation and apoptosis // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2008. - Vol.294. - N 2. - P.413-422.

108. Rogakou E. P., Boon C., Redon C., Bonner W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo // J. Cell. Biol. 1999. - Vol.146. - N 5. P.905-916.

109. Rosette C., Karin M. Ultraviolet light and osmotic stress: activation of the JNK cascade through multiple growth factor and cytokine receptors // Science. 1996. -Vol.274. - N 5290. - P. 1194-1197.

110. Saenko A. S., Synzynys B. I., Brozmanová J., Pelevina 1.1. Inducible processes in DNA replication and repair after gamma, UV-irradiation and action of some chemicals in mammalian cells // Acta Biol Hung. 1990. - Vol.41. - N 1-3. - P.223-230.

111. Sanear A. Lindsey-Boltz L.A., Unsal-Kacmaz K., Linn S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints // Annu. Rev. Biochem. -2004. N 73. - P.39-85.

112. Sasaki S., Fukuda N., Dose-response relationship for induction of ovarian tumorsin mice irradiated during prenatal, early postnatal and elder periods // J. Radiat. Res. 2008. - N 49. - P.623-633.

113. Saunders J.W. Jr. Death in embryonic systems // Science. 1966. - Vol.154. - N 749. - P.604-612.

114. Schollnberger H., Stewart R. D., Mitchel R. E. Low-LET-induced radioprotective mechanisms within a stochastic two-stage cancer model // Dose-response. 2005. -Vol.3.-P.508-518.

115. Seymour C.B., Mothersill C., Alper T. High yields of lethal mutations in somatic mammalian cells that survive ionizing radiation // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med.- 1986,-Vol.50.-N 1.-P.167-179.

116. Singh N.P. A simple method for accurate estimation of apoptotic cells // Experimental cell research. 2000. - N 256. - P.328-337.

117. Streffer C. Bystander effects, adaptive response and genomic instability induced by prenatal irradiation // Mutation Research. 2004. - N 568. - P.79-87.

118. Suzuki K., Ojima M., Kodama S., Watanabe M. Radiation-induced DNA damage and delayed induced genomic instability // Oncogene. 2003. - Vol.22. - N 45. -P.6988-6993.

119. Tamburini B. A., Tyler J. K. Localized histone acetylation and deacetylation triggered by the homologous recombination pathway of double-strand DNA repair // Mol. Cell Biol. 2005. - Vol.25. - N 12. - P.4903-4913.

120. Terman A., Abrahamsson N., Brunk U. T. Ceroid/lipofuscin-loaded human fibroblasts show increased susceptibility to oxidative stress // Exp. Gerontol. 1999. -Vol.34.-N 6.-P.755-770.

121. Terman A., Brunk U. T. Autophagy in cardiac myocyte homeostasis, aging, and pathology // Cardiovasc. Res. 2005. - Vol.68. - N 3. - P.355-365.

122. Tice R. R., Agurell E., Anderson D. et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing // Environ. Mol. Mutagen. 2000. - N 35. —P.206-221.

123. Tsai K. K., Chuang E. Y-Y., Little J.B., Yuan. Z.M. Cellular mechanisms for low-dose ionizing radiation-induced perturbation of the breast tissue microenvironment // Cancer Res. 2005. - Vol.65. - N 15. - P.6734-6744.

124. Tsai K. K., Stuart J., Chuang Y. Y., Little J. B., Yuan Z. M. Low-dose radiation-induced senescent stromal fibroblasts render nearby breast cancer cells radioresistant // Radiat Res. 2009. - Vol. 172. - N 3. - P.306-313.

125. Ulsh B.A., Miller S.M., Mallory F.F., Mitehel R.E., Morrison D.P., Boreham D.R. Cytogenetic dose-response and adaptive response in cells of ungulate species exposed to ionizing radiation // J. Environ. Radioact. 2004. - Vol.74. - N 1-3. - P.73-81.

126. Vairapandi M., Balliet A. G., Hoffman B., Liebermann D. A. GADD45b and GADD45g are cdc2/cyclinBl kinase inhibitors with a role in S and G2/M cell cycle checkpoints induced by genotoxic stress // J. Cell Physiol. 2002. - Vol.192. - N 3. -P.327-338.

127. Valerie K., Yacoub A., Hagan M. P., Curiel D. T. Fisher P. B., Grant S. Dent P. Radiation-induced cell signaling: inside-out and outside-in // Mol. Cancer Ther. 2007. -Vol.6.-N3.-P.789-801.

128. Vina J., Borras C., Gambini J., Sastre J., Pallardo F. V. Why females live longer than males? Importance of the upregulation of longevity-associated genes by oestrogenic compounds // FEBS Lett. 2005. - Vol.579. - P.2541-2545.

129. Wang G.J., Cai L. Induction of cell-proliferation hormesis and cell-survival adaptive response in mouse hematopoietic cells by whole-body low-dose Radiation // Toxicological Sciences. 2000. - N 53. - P.369-376.

130. Wang J. Y. Cellular responses to DNA damage // Current option in cell biology. -1998.-N 10. — P.240-247.

131. Wang L. E., Bondy M. L., De Andrade M., Strom S. S, Wang X., Sigurdson A., Spitz M. R., Wei Q. Gender difference in smoking effect on chromosome sensitivity to gamma radiation in a healthy population // Radiat Res. 2000. - Vol.154. - N 1. - P.20-27.

132. Wang M., Wu W., Wu W., Rosidi B., Zhang L., Wang H., Iliakis G. PARP-1 and Ku compete for repair of DNA double strand breaks by distinct NHEJ pathways // Nucleic Acids Research. -2006. Vol.34. -N 21. -P.6170-6182.

133. Wang P., Qiu W., Dudgeon C., Liu Ii., Huang C., Zambetti G. P., Yu J., Zhang L. PUMA is directly activated by NF-kappaB and contributes to TNF-alpha-induced apoptosis // Cell. Death Differ. 2009. - Vol.16. - N 9. - P. 1192-1202.

134. Wang Y., Schulte B. A., Zhou D. Hematopoietic stem cell senescence and long-term bone marrow injury // Cell Cycle. 2006. - Vol.5. - N 1. - P.35-38.

135. Wiklund S.J., Agurell E. Aspects of design and statistical analysis in the Comet assay // Mutagenesis. 2003. - Vol.18. - N 2. - P. 167-175.

136. Wykes S. M., Piasentin E., Joiner M. C., Wilson G. D., Marples B. Low-dose hyper-radiosensitivity is not caused by a failure to recognize DNA duble-strand Breaks // Radiation research. 2006. - N 165. - P.516-524.

137. Xu B., Kim S. T., Lim D. S., Kastan M. B. Two Molecularly Distinct G2/M Checkpoints Are Induced by Ionizing Irradiation // Molecular and cellular biology. -2002. Vol.22. - N 4. - P. 1049-1059.

138. Zainullin V. G., Moskalev A. A. Role of Apoptosis in Age-Related Pathologies // Russian Journal of Developmental Biology. 2001. - Vol.32. -N 4. - P. 199-204.

139. Zhang J-H., Zhang Y., Herman B. Caspases, apoptosis and aging // Ageing Research Reviews. 2003. - N 2. - P.357-366.

140. Zhang J., Powell S. N. The role of the BRCA1 tumor suppressor in DNA doublestrand break repair//Mol. Cancer Res. -2005. Vol.3. -N 10. -P.531-539.

141. Zheng H., Olive P. L., Reduction of tumor hypoxia and inhibition of DNA repair by nicotinamide after irradiation of SCCVII murine tumors and normal tissue // Cancer research. 1996. -N 56. - P. 2801-2808.

142. Zhou P. K., Rigaud O. Down-regulation of the human CDC 16 gene after exposure to ionizing radiation: a possible role in the radioadaptive response // Radiat. Res. 2001. -V.155.-N 1. — P.43-49.

143. Zou L., Elledge S. J. Sensing DNA damage through ATRIP recognition of RPA-ssDNA complexes // Science. -2003. Vol.300. - P. 1542-1548.

Информация о работе

Велегжанинов, Илья Олегович
кандидата биологических наук
Обнинск, 2011
ВАК 03.01.01

Диссертация

Возрастная динамика цитогенетических и биохимических показателей стабильности генома и клеточного старения у мышей, облученных ионизирующей радиацией в малых дозах на ранних стадиях развития - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы