Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Возбудители вирусных болезней томатов в Молдове и усовершенствование методов их диагностики

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Возбудители вирусных болезней томатов в Молдове и усовершенствование методов их диагностики"

) • \ ,

, - $ и £ ^ "4

1»

(

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМ. ЛЕНИНА ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи

Тертяк Дмитрий Дмитриевич

УДК 632. 38:57.083.2:635.64

ВОЗБУДИТЕЛИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТОМАТОВ В МОЛДОВЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИХ ДИАГНОСТИКИ

06.01.11 - Защита растений от вредителей и болезней

Авторе ферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград—Пуппсин 1991-

глтпЕШ

1$ а .ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ I АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМ. ЛЕНИНА -5»и| ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ^ тдел НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАШИТЫ РАСТЕНИЙ

^ртеция I

На правах рукописи

Тертяк Дмитрий Дмитриевич

УДК 632. 38:57,083.2:635.64

ВОЗБУДИТЕЛИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТОМАТОВ В МОЛДОВЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИХ ДИАГНОСТИКИ

06.01.11 - Защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Леншпрад-Пушкин 1990

Работа выполнена в Отделе микробиологии АН ССР Молдова и в Институте экологической генетики АН ССР Молдова

Научные руководители: член-корр.АН ССРМ,доктор с/х наук М.Я.Молдован,

доктор биологических наук, профессор Ю.И.Власов

Официальные оппоненты: доктор с.-х.наук Ж.В.Блоцкая,

канд.с.-х.наук А.Е.Цылленков

Ведущая организация:Всесоюзный НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова

Защита состоится " /{ " о./т./^_199Я^г. в " /2 "

часов на заседании Специализированного совета, шифр Д-020.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 188620« г.Ленинград-Пушкин 6, шоссе Псюельского д.З, ШЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследоватгльског института защиты растений.

Автореферат разослан " {2- " $_19915 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета ВИЗР

Г.А.Наоедкина

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В CCFM вирусные болезни томатов изучены недостаточно и сведения о видовом составе их возбудителей ограничены. Наиболее полные исследования проведены по идентификации и дифференциации штамыоыго состава вируса табачной мозаики (ВТЫ) (Вердеревская, 1962; 1964; Балашова, 1971; 1^тцук, Балашова, 1981; Балашова, Король, Тимина и'др., 1983), а также проведена частичная идентификация возбудителей мозаичных забиваний в связи с селекцией томатов на устойчивость к ШЫ (Рущук, 1903).

Большим пре/г?тстьием в изучении видового разнообразия виру-сов-воабудителей болезней томатов и других сельскохозяйственных культур не только в Молдове, но вообще в СССР служит слабое развитие методов диагностики, в частности, наиболее современных из них - электронной микроскопии, серологии и их сочетания. Развитие и совершенствование методов диагностики вирусов является актуальной научной и практической задачей.

Цель и задачи исследований. Работа посвящена выявлению основных возбудителей вирусных болезней томатов в Молдове, дифференциации их штаммов и усовершенствовании методов диагностики. В задачи исследований входило:

1. Выявить и идентифицировать вирусы-возбудители основных заболеваний томатов в республике.

2. Дифференцировать штаммовый состав изучаемых вирусов.

3. Испытать и усовершенствовать методы диагностики вирусов, поражающих томаты в республике.

Объекты исследований. Объектами исследований служили растения томатов с симптомами вирусных болезней и их возбудители.

Научная новизна работы. Научная новизна результатов исследований заключается в следующем:

- впервые в ССРМ наиболее полно описаны вирусные болезни томатов, определен их ареал;

- впервые в CCFU комплексам методов на томатах идентифицированы вирусы бронзовости томатов (ВЕТ), огуречной мозаики (BOII), аспермци томатов (ВАТ) и Y-вирус картофеля (*Ш);

- дифференцированы и описаны штаммы ВТЫ, ВЕТ, BOU;

- впервые в СССР испытаны и усовершенствованы методы имму-ноэлектронной микроскопии (IBU) для диагностики ВТЫ, ВБТ, BOU, ВАТ и Ш;

- экспериментально доказана возможность использования методов ИЭМ для вирусологической экспертизы семян томатов на присутствие в них ВТМ и оценки эффективности мероприятий по оздоровлению семян в производстве;

- разработаны метода фиксации лабильных вирусов ВОМ, ВАТ и ВБТ в тканях растений для изучения их морфологии.

Практическая значимость рабогт. Ь;явлень1 основные заболевания томатов в ССР Молдова, определен их ареал, описаны симптомы с учетом видовой и штаммовой принадлежности с одинарной и смешанной инфекциях. Усовершенствованы высокочувствительные метода ИЭМ для идентификации вирусов в растениях томатов, а также для вирусологической экспертизы семян на лораженность ВТМ.

Предложенные методы ИЭМ на примере возбудителей вирусных болезней томатов могут быть использованы для диагностики вирусных заболеваний большого числа овощных, бахчевых, декоративных и других культур, поражаемых ВТМ, ВБТ, ВОМ, ВАТ и УВК.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 2-ом Всесоюзном симпозиуме по штаммам вирусов растений (г.Елгава, 1981); на П Республиканской научно-технической конференции по электронной микроскопии (г.Кишинев, 1931); на ХП Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (г.Сумы, 1932), на IУ Республиканской конференции физиологов и биохимиков Молдовы (Кишинев, 1986); на Ш Республиканской научно-технической конференции по электронной микроскопии (Кишинев, 1986); на Всесоюзной конференции по теоретической и прикладной карпологип (Кисшие, 1989).

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 13 работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав и выводов. Список использованной литературы включает 235 наименований, в том числе 105 иностранных. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 37 рисунками.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДШИ^

В введении освещена актуальность теш, ее научная новизна и практическая значимость.

- б -

МАТЕРИАЛЫ и метода ИССЛВДОВАНИЙ

Исследования проводились в течение 1978-1989 гг. в лаборатории вирусологии Отдела микробиологии и в лаборатории биологических методов индуцирования генетической изменчивости Института эколоп-.:ской генетики АН ССШ. Выявление возбудителей вирусных болезней томатов, определение их распространенности проводили по результатам обследою.ний томатов в II основных овощеводческих районах республики как в открыто!.так и в защищенном грунте на общей площади свыше 6 тыс.га.

Материалом для исследований служили: растения томатов основных районированных сортов (Ранний 83, Молдавский ранний, Факел, Новинка Приднестровья,' Волгоградский 12, Нистру, Яикурич, Бируин-ца и др.) с симптомами вирусных болезней, собранные с обследованных районов республики; вирусные препараты и антисыворотки (АС): к КШ (АС из ВИЗР), к ВБТ (АС из НР Болгарии), к ВОМ (АС из МГУ), к ВАТ (АС из ЛСХА) ихШ (АС из ДВЦ АН СССР).

Обследования и диагностику вирусных болезней томатов проводили соответственно по методике Ю.И.Власова и Е.С.Лантас (1962) и по типовым методикам, одобренным специалистами стран-членов СЭВ (1970). Механический перенос вирусов на травянистые индикаторы осуществляли по методике П.Г.Чеснокова (1962) с использованием 0,1 И фосфатного буфера (рН 7,2), 0,1^ раствора никотиновой кислоты или буфера Ополь-Кеглера (н.срл, н.к^кт, 1969).

Для изучения морфологии частиц исследуемых вирусов препараты готовили по методикам Проценко, Легунковой (1962), «/.Ъ/-ы.сь-ц, (1957),«'-^-1и1сЬЬог.»,(;.1.Ш11з , (1968). В качества контрастан-тов использовали 2^-ную соль фосфорно-вольфрамового натрия при различных значениях рН и 2$-ный водный раствор уранилацетата при рН 4,5-4,7. Для предотвращения разрушения частиц ВОМ, ВАТ, ВБТ их стабилизировали по методикам, разработанным Э.И.Лариной (1974) и нами (Д.Д.Тертяк, 1981).

Для изучения ультраструкг,ры порайонных клеток использовали методы заливки ткани в эпоны, описанные Б.Уикли (1975). Ультратонкие срезы изготовляли на ультрамикротома УМИТ-3, контрастировали по Рейнольдцу ( ¿.Е.н^.сзЫе, 1963) и исследовали в электронном микроскопе ЭМВ-ЮОЛ.

Имщ ноэлекгронно-микроскопические исследования идентифицируемых вирусов проводили методами группирования и декорирования

- D -

частиц ( R.Milnt, jS.Luiuoni, 1977), Даррика ( K.Dr rrini:, 1973; к. Derrick , H.hrium-.kjT , 1976), модифицированным методом Деррика ( n.kii if,, b.Luit;oiii , 1577) и методом Деррика в сочетании с Л-белком с нашими изменениями. В качестве подложки во всех указанных методах использовали коллодиевуго пленку. Для разведения антисывороток и промывания препаровальных сеточек пользовались 0,1 М фосфатном буфером (рН 7,0).

Подсчет вирусных частиц в методе Деррика и его модификациях осуществляли на 9-ти фотопластинках размером 9 х 12 см, с последующим определением среднего числа на одной фотопластинке.

Источниками инфекции служили тест-растения и томаты с.Факел, зараженные исследуемыми вирусами, с которых при появлении порвнх симптомов отбирали листья для проведения экспериментов.

ВОЗБУДЛГШ БЛРУСШХ БОЛЕЗНЕЙ ТОМАТОВ В 1ЮЛД/ШЛИ (симптомология, распространение, идентификация, штаммоЕый состав)

Вирус бронзовости томатов ( Ton.Vjo rf-oU.'ci v.'l] t virus) группа 'i'oiL;ito mot ted wilt virur, . Распространен в ресг^ублике повсеместно на посадках открытого грунта. В ореднем по районам поражает от единичных растений до 23,8$.

Вызывает заболевания в виде двух форм. Первая характеризуется сильной некротизацией верхушечных листьев и стебля. На плодах вызывает некротические кольца, полукольца, штрихи, восьмерки; семена щуплые, некротические, отдельные камеры вовсе бессемянные. Корневая система некротизирована. Бри раннем инфицировании растения полностью усыхают.

Вюрая форма отличается менее жесткими проявлениями, но как и в первой, некротизация распространяется сверху вниз, захватывая листья, черешки и стебель. На плодах проявляется в виде хлоротических кольцевых поражений.

Изолятн, отобранные с растений с указанными симптомами, диагностировали методами тест-растений и электронной микроскопии.

При тестировании изолятов на 10 видах травянистых индикаторов, рекомендованных для идентификации ВБТ, для повышения эффективности инокуляции применяли различные стабилизирующие растворы, среди которых лучшим был буфер Опель-Кеглера, обеспечивший 60-90$ передачи вируса.

Элэктрогчэ-микроскопические исследования проводили методами

ультратонких срезов и негативного контрастирования вирионов в соке инфицированных тест-растений и томатов. При изучении морфологии вирусных частиц in vitro было выявлено, что предварительное фиксирование инфицированных листьев 2^-ной осмиевой кислотой и контрегт'фованиа 0,5$-ннм уранилацетатом позволяет значительно увеличить сохранность вирионов и провести изучение их морфологических особенностей чри небольших затратах времени.

Изучение физических свойств проводили в соке Nicotiona glutinosa на половинках листьев Petunia 1>J brida.

Используемыми Meiудами идентификации установлено, что возбудителем выявленных форм заболеваний является ВБТ.

Различия в симптомах на томатах, ряде тест-растений и физическим свойствам позволили считать, что ВБТ на томатах представлен двумя штаммами. ВБТ-1 - сильнопатогенный штамм, на томатах вызывает 1-ую форму заболевания и характеризуется следующими физическими свойствами: точка температурной инактивации (ТТИ) 43-45°С, предельное разведение сока (ПР) 1:50 и инфекционность в соке (ПСИ) üicotiina glutinosa сохраняется в течение 5-ти часов. ВБТ-2 менее патогенный штамм, на томатах вызывает 2-ую форму заболевания. Его физические свойства: ТТИ - 43-45°С, ПР -1:200, ПСИ - 6 часов.

Основными растениями-дифференциаторами для них являются: Си-ernnia eativua с.Деликатес, на семядолях которого штамм ВБТ-1 вызывает некрозы и не заражается штаммом ЕБТ-2; Uicotiaau rué -ticte- с трудом заражается штаммом ВБТ-1, проявляя хлоротичную пятнистость на инокулированннх и отрастающих листьях, и легко заражается штаммом ВБТ-2, реагируя местными и системными некротическими поражениями; Datura etramonium на котором ВБТ-I вызывает некротизацию инокулированннх и отрастающих листьев, в результате чего большинство растений погибает, а ВБГ-2 проявляется р виде сморщенности и хлороиичности отрастающих листьев.

В электронно-микроскопических исследованиях при сравнительном изучении более 200 препаратов у выявленных штаммов морфологических отличий не обнаружено. Вирионы характеризуются, в основном, сферической, реже - овальной или яйцевидной формой с наружной мембраной или баз нее. Размеры их варьируют от 30 до 160 ни со средним и модальным диаметрами соответственно: для частиц с наружной мембраной -98,52*1,47 и 100 ш.1. Выявлен ряд характер-

- о -

них для ВБТ морфологических особенностей, ранее не описанных в нашей стране, в частности, гантелепидше частицы, вирионы, напоминающие по '{юрмо теннисше ракетки, наличие инвагинаций наружной мембраны вирионов, наличие внутренней мембраны, окружающей электронно плотные центры и др.

Сопоставлял полученные данные с литературными, можно констатировать, что штамм ВЕГ-1 по симптомам на большинства тест-растений и физическим свойствам наиболее тесное сходство имеет со штаммом некротической бронзовости, описанной в Болгарии Ковачев-ским и Парковым (И.Копачевский, М.Марков, 1961), а штамм ВБТ-2 близок к штамму ВБТ, описанному на табаке в Молдове (М.Я.Молдован, I9UI; Н.Г.Чебан, 1981).

Вирус табачной мозаики (tobacco mosaic virus_), группа

Tobagovlrus. По результатам обследований посадок томатов ВТМ распространен повсеместно и поражает растения в открытом грунте, в среднем по районам, на 3,8-50,6$, а в защищенном - на 62-100$. В открытом грунте, в основном, вызывает симп^томы зеленой мозаики, реке - желтой с некротизацией листьев и стебля, а в защищенном - наряду с мозаикой и такие вредоносные формы как нитевид-ность, папоротниковидность листьев, стрик, внутренний некроз плодов.

Возбудитель был идентифицирован следующими методами: тест-растений, электронной микроскопии и серологии.

При тестировании изолятов на II видах травянистых индикаторов, рекомендованных для ВТМ выявлено, что симптомы зеленой мозаики, деформации листьев и некротизации стебля вызваны одним штаммом - зеленой мозаики. Значительные отличия симптомов изолята желтой мозаики с некротизацией листьев и стебля на томатах и большинстве тест-г.астений дало основание считать его самостоятельным штаммом.

Основными растениями-дифференциаторами для выявленных штаммов являются: томаты с.Факел и перец с.Подарок Молдовы, на которых штамм желтой мозаики с некротизацией листьев вызывает сисгем-нчй некроз и гибель растений перца на 12-14, а томатов - на 26-28 донь после инокуляции, а штамм зеленой мозаики - симптомы зе-ленэй м;к?аики. На растениях Petunia hybrida, Gotphrena globose штэмч зеленой мозаики вызывает местные некрозы, а штамм келтой мозаики с некротизацией листье? и стебля наряду с местными пора-*сш»(.',>и,ч:?лч,ую, до белого цвета, мозаику.

Дальнейшая идентификация серологией, электронной микроскопией подтвердила их принадлежность к ВТМ.

Сравнительное изучение морфологии вирионов показало, что они мевду собой не отличаются и являются жесткими палочковидными частицами с модальным размером 300 нм.

'¿изическио свойства, изученные в соке табака с.Переможец 83, составили для шчамма зеленой мозаики: ТТИ - 95°С, ПР -1:100000 и ПСИ - более 30 суток; ¿¡ля штамма желтой мозаики с некротиэицией листьев и стебля соответственно: 90°С, 1:10000 и более 30 суток.

Таким образом, штамм золеной мозаики способен при определенных условиях, особенно на томатах защищенного грунта, вызывать различные формы заболевания, такие как деформации листьев, некроз стебля и др. и иденти^он возбудителю зеленой мозаики, описанному в Молдове Т.Д.Вердеревской (1959). Штамм желтой мозаики с нокротизацией листьеп и стебля характеризуется высокой вредоносностью, ранее в республике не описан и отнесен к группе желт»« штаммов.

Вирус огуречной мозаики (Qucumber чюмЛс у!гии ). группа Cucujiiovirua . BOU выявлен на посадках томатов в открытом грунте во всех обследованных районах. Поражает единичные растения и вызывает симптомы слабой мозаичности, нитевидности и папоротни-ковидности листьев.

Идентификация возбудителя была проведена методами тест-растений, серологии и электронной микроскопии.

Тестированием на 9-ти видах травянистых индикаторов, роко-меидованных для идентификации B0M, установлено, что симптомы слабой мозаичности листьев и нитевидности и папоротниковидности листьев обусловлены штаммовыми различиями патогена. При заражении растений íl.glitti-osa, P.hjbrida штамм слабой мозаичности листьев на инокулированшк листьях вызывал хлоротические пятна и слабую мозаичность отрастающих листьев с последующей маскировкой симптомов, а штамм нитевидности и папоротниковидности липть-ав - резкую деформацию отрастающих листьев.

На инокулированных листьях парца с.Подарок Молдозы штамм слабой мозаичности листьев характеризовался симптомами в виде ажурного рисунка, состоящего из хлоротичзских концентрических колец, полуколец, черточек, а системное поражение вн/иигалооь в

слабой моэаичиости отрастающих листьев. Штамм нитевидности и папоротниковидности листьев на этом виде индикатора вызывал резкую деформацию отрастающих листьев и преждевременное их опадание.

При использовании метода двойной иммунодиффуэии в агаре наиболее четкие положительные реакции с антисывороткой к ВОМ. были получены при тестировании сока ил инфицированного табака с.Самсун IWI, зараженного обоими штаммами.

В электронно-микроскопических препаратах in vitro , приготовлениях с предварительной фиксацией образцов 5$-шм глутаровчч альдегидом по методике, предложенной нами, а также на ультратонких срезах в клетках томатов, табака и других тест-растений, инфицированных идентифицируемыми штаммами, были выявлены сферические частицы с электронноплотнмм центром, со средним диаметром 30,79+0,24 ни и модальным размером 30 нм.

Штаммовые различия возбудителя были подтверждены результатами изучения физических свойств в соке табака с.Самсун на половинках листьев Chenopodium qulnoa и составляют для штамма слабой мозаичности листьев: ТТИ - 68°С, ПСИ - 2 суток, ДР - 1:1000, а для штамма нитевидности и папоротниковидности листьев: 65°С, 2 суток и 1:1000, соответственно.

На основании проведенной идентификации штамм, вызывающий нитевидность и папоротниковидность листьев томатов, по характеру поражения томатов и тест-растений отнесен к группе штаммов деформирующего типа, а штамм слабой мозаичности листьев к группе слабопатогенных штаммов (Н.Н.Артемьева, С.Ю.Рай, 1981; С.Ю.Рай 1983).

Вирус аспермик томатов (Tomato aspermv virus ). трупа Cucumo-virus . Проведенными обследованиями посадок томатов установ-, лено, что ВАТ, как правило, встречается на небольших, в сильной степени засоренных полях, где число больных растений составило от единичных до 11,1%.

Характеризуется симптомами низкорослости и повышенной кустистости растений с деформацией листовых пластинок в виде "лодочки". Отличительной чертой является то, что на больных томатах в период цветения происходит массовое опадение чветков, а завязавшиеся плоды мелкие, деформированные, большей частью бессемянные.

Тестирование методом тес--растений на б видах травянистых

индикаторах, рекомендованных для иидентификации ВАТ, показало, что индентифицируемнй возбудитель проявил симптомы, характерные для ВАТ.

При изучении физических свойств установлено, что 'П'И возбудителя ч зтавляет 60°С; ПСИ - 2 суток и ПР - 1:1000.

Принадлежность возбудителя к ВАТ била подтверждена получением положительной реакции с антиснвороткой к ВАТ в серологическом тесте двойной иммунодиффузи!." j агаре.

В электронно-микроскопических исследованиях при просмотре нагативноокрашенНбгх препаратов, приготовленных из соковых экстрактов листьев инфицированного табака с.СамсунЛИ , томатов с.Факел и других растений наблюдали частицы со средним диаметром 98,06+0,19 с модальным размером 30 нм, соответствующему ВАТ. На ультратонких срезах, наряду с диффузноразбросанными частицами, в клетках инфицированных растений были обнаружены агрегаты в виде рядов плотнолежащих вирионов, расподоконных кольцами, полукольцами и дугами.

11ри изучении ультратонких срезов генеративных органов томатов , в частности тычинок, было установлено, что ВАТ способен накапливаться в значительной концентрации в клетках среднего слоя (нльников, а также в клетках выстилающего слоя - талетумв. В клетках среднего слоя агрегаты вирусных частиц нередко занимали весь обьем цитоплазмы. Такой концентрации вирионов не на -

Й.ведалось даже на ультра-гонких срезах клеток сильно пораженных листьев томатов. В инфицированных шльниках образовывалось неболь вое количество пыльцевых зерен, большинство из которых были сте-рильт. Для них характерны молкив размеры, утрата сферической {орш, сильная деформированность, расслоение экзины и интины, частичное или полное отсутствие цитоплазмы. Видимо, способность ВАТ накапливаться в о'ольпой концентрации в тычинках, а гакхз связанный с этим высокий уровень стерильности пыльцы и яв-иштся одной из причин высокой }рвдоносности патогена, тем 6oj«a ito томаты являются самоогидлемыми растениями.

* -вирус картофеля ( * virui; ), группа

Potyvirua .На томатах был обнаружен в составе смешанной инфекции с НГМ и ВБТ при обследованиях томатов открытого грунта. На растениях в смеси с ЕГМ вызывает симптомы морцинистой мозаики, скручивания листьев и повышенной кустистости растений, а с ЕКГ -доминируют симптомы ВБТ с более высокой степенью некротизации. Выделение УВК из смеси с BIM проведши на растениях n. Riuti.no-ва и табака с.Иммунный 580, локализующих ELM в местных некрозах и заражающихся системно УВК. Разделение УВК от BET было проведено на основании различия возбудителей по основным физическим свойствам. Чистота изолятов в обоих случаях проверялась с помощью электронной микроскопии. Зараженные 6 видов тест-растений чистыми изолятами проявили симптомы, характерные для УВК, а томаты реагировали слабым просветлением жилок отрастающих листьев.

При тестировании капельным методом чистых изолятов с антисывороткой к УВК получены положительные реакции.

При электронно-микроскопических исследованиях в негативно-окрашенных препаратах выявлены нитевидные частицы размером 720 нм, характерные для УВК.

Однлм из важных диагностических признаков УВК является его способность индуцировать в инфицированных клетках цитоплаз-матические включения типа "шестеренок"(М.Я.Молдован, 1979; В.В.Бужоряну, 1981; l-liiwnrson, п. Christie,197S ). На ультратонких срезах клеток зараженных томатов и табака были обнаружены аналогичные цитоплазматические включения, что послукило дополнительным подтверждением принадлежности индентифицируемого возбудителя к УВК.

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИЭМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ, ПОРАЖАЮЩИХ ТСМА1Ы

Важной особенностью методов ИЭМ является сочетание в себе простоты исполнения, высокой чувствительности, достоверности, возможности использования антисывороток невысокого качества для диагностики вирусов непосредственно в соке больных растений. При индентификации вирусов в одинарных и смешанны:: инфекциях и др. широко применяются три разновидности методов ИЭМ. В первой, в электронном микроскопе исследуют образцы, приготовленные из смеси вирус-антисыворс:ка (метод группирования частиц).

Во второй, изучают препараты с адсорбированными на пленке-подложке вирусными частицами, последовательно обработанными антисыворотками (метод декорирования). В третьей, препаровальные сеточки обрабатывают антисывороткой, затем помещают на вирусную суспензию для специфического связывания вирусных частиц адсорбированными на пленке антителами (иммуносорбентнан электронная микроскопия, ИСЭМ).

Однако, в настоящее время существуе'1' множество вариаций в технических деталях при использовании методв ИЭМ, и в каждом конкретном случае выбор метода и оптимальных условий проведения анализов необходимо определять с помощью предварительных тестов. В связи с этим, одной из стоявших перед нами задач было определение возможности использования методов ИЭМ для диагностики вирусов, поражающих томаты в Молдове, и подбор оптимальных уело-" вий для проведения анализов.

Метод группирования частиц Метод группирования частиц был использован для диагностики ВГМ (штаммы зеленой мозаики и желтой с некротизацией листьев и стебля), ВСМ (штамм слабой мозаичности листьев),ВБТ(штамм ВБТ-1) и ВАТ. Тестирование указанных вирусов в листьях инфицированных тест-растений и томатов с.Факел проводили по одной и& наиболее распространенных методик, предложенной Р.Милном и Е.Луисони (1977). Ее достоинством является простотч исполнения и небольшие затраты времени на получение результатов (10-15 мин.).

При взаимодействии указанных вирусов с гомологической анти-сыворотксй в электронном микроскопе наблюдали группирование частиц в агрегаты. В контрольных препаратах, где применялись неродственные антисыворотки, они отсутствовали. Однако, полученные препараты отличались невысоким качеством. В агрегатах вирионы располагались беспорядочно, взгромождаясь несколькими слоями друг на друга. Часто вирусные частицы были окружены ореолом из антител, но из-за большой скученности, неравномерного распределения контрастанта, избытка загрязнений, превносимых самой антисывороткой и захватываемых при формировании агрегатов, не всегда его можно было рассмотреть.

Усовершенствование методики приготовления препаратов было проведено по пути использования серийного разведения антисывороток.Так, авторами метода было установлено, что для приготовления

препаратов оптимальным является применение антисывороток в разведении в 10 раз меньше предельного. В наших экспериментах лучшие препараты были получены при использовании антисывороток в более высоких разведениях, близких к предельному. Так, для ВАТ лучшие препараты были получены с антисыворотками в разведении 1:32-1:64, при ее предельном разведении 1:12В; для ВСЫ-1:16-1:32 при 1:64; для ВГМ - 1:126-1:250, при 1:512; для ВЫ-1:8 при 1:32 соответственно.

Использование более высоких разведений антисывороток позволило экономнее расходовать их и получать более чистые препараты.

Метод декорирования

При использовании метода декорирования ( Milne, Luisoni, •ЮТ) от начала приготовления препаратов и до получения результатов затрачивается 15-20 минут, т.е. по быстроте и простоте исполнения он не уступает методу группировали?, частиц и позволяет диагностировать вирусы в вегетативных органах томатов и тест-растений при выраженных симптомах заболевания, -i.e. когда концентрация вирусов в соке достаточна для выявления их обычными методами негативного контрастирования. При тестировании всех выявленных нами вирусов (BUT, ИМ, В Л, BAI' и УВК) и их штаммов, препараты, приготовленные по этому методу, отличались более высоким качеством, чем в методе группирования частиц. В них вирусные частицы, адсорбированные на пленке-подложке препаровальных сеичек, теряли подвижность и последующая обработка антисывороткой, при положительных реакциях, приводила только к образование ореола »а антител, не вызывая их группирования в агрегаты. Более равномерное распределение частиц По препарату дало возможность качественно отконтрастировать' их и хорошо рассмотреть характер декорирования вирионов антителами. Декорированные частицы легко отличались от контрольных, обработанных неродственной антисывороткой. * '

¡¡ак и в методе группирования частиц, использование антисы-вороте:', разбавленных в 10 раз меньше их предельного разведения, приводило к значительным загрязнениям препаратов, а из-за плотного декорирования частицы почти не просматривались, что затрудняло выявление сферических вирионов В Cf.' и ВАТ. Оптимальным было применение антисывороток в таких же разведениях, как и в ые-

годе группирования частиц. Это позволило получать более чистые препараты с хорошим качеством изображения.

Метод декорирования весьма удобен для диагностики вирусов в смешанных инфекциях, как электронный микроскоп позволяет выявить практически все вирусы, присутствующие в растении в концентрации 10^ и более частиц в I мл инфекционного сока, а последующее декорирование дает возможность отличить даже сходные по морфологии серологически неродственные вирусы.

В наших опытах для выявления возможностей метода декорирования в диагоностикэ смешанных инфекций использовали смесь Y - вируса картофеля, выделенного с томатов, иг- вируса табака. Оба вируса относятся к потигруппе, обладают одинаковой морфологией, но серологически неродственны.

При исследовании в электронном микроскопе смеси этих вирусов, обработанных антисывороткой к Ш'М, наблюдаемые нитевидные вирионы не отличались по своим морфологическим признакам. На опытных сеточках, обработанных антисывороткой к УВК, декорированные частицы УВК легко отличались от недекорированных вирионов Z - вируса табака.

Методом декорирования было также изучено серологическое родство ВОТ и ВАТ.

Перекрестное титрование показало, что исследуемые вирусы серологически родственны, но не идентичны и различаются нелду собой в пределах одного разведения антисыворотки.

Имл^уносорбентная электронная микроскопия (ИСЭМ).

Основным достоинством методов ИСЭМ является сочетание в себе простоты исполнения и высокой чувствительности.

Из этой группы методов для тестирования ВГМ(зеленый штамм), ВСМ (штамм слабой мозаичности листьев), ВАТ и УВК были испытана; метод Деррика (Derrick, Brlancky , 1976), модификация метода Деррика, предложенная Милном и Луисони(Milne, Luinonl, 1Э77 ) и метод Деррика в сочетании с А-белком с некоторыми изменениями. В частности, для разбавления антисывороток и промывания препаровальных сеточек использовали 0,1М фосфатный буфер (рН 7,2), вирусные экстракты получали путем раздавливания на предметных стеклах в капле указанного буфера, кусочке инфицированной ткани, площадью около 2 мм^, и подложкой служила коллодиевая пленка.

Проведенные исследования показали, что метод Деррика в

модификации Милна и Луисони при тестировании BOU и ВАТ позволяет получать увеличение концентрации вирусных частиц за счет специфического связывания в гомологических реакциях в 4-6 раз, по сравнению с контрольными, обработанными неродственной антиснво-роткой, и в 2-3 раза, по сравнению с препаратами, приготовленными обычными методами негативного контрастирование. Рекомендованное разбавление антисывороток в 10 раз меньше их предельного разведения приводит к загрязнению препаратов и может вызывать ингибирование взаимодействия антител с вирусными частицами в гомологических реакциях. Поэтому при тестировании остальных вирусов указанный метод не использовался.

В базисном методе Деррика оптимальными являются более высокие разведения антисывороток в пределах 1:1000. В экспериментах были использованы следующие разведения: 1:256; 1:512; 1:1024; I:204U. В процессе работа было установлено, что чувствительность метода в значительной степени зависит от адсорбционных свойств пленки-поддожки, определяющих количество адсорбированных антител при ее обработке антисывороткой, которые, в свою очередь, и способствуют специфической сорбции вирус»« частиц m суспензии при положительных роакцилх. Отмечено, что хранение раствора коллодия в амилацетате более 2-х месяцев и препаровальных сеточек, покрыт« пленкой-подложкой более 1-2 суток, ухудшает ев адсорбционные свойства и снижает чувствительность метода. Так, в опытах, в которых использовали пленку-подложку, приготовленную из 0,'7% раствора коллодия, хранившегося в течение 6-ти месяцев, а покрытие ею препаровальных сеточек проводилось за 2-3 суток до проведения тестирования, увеличение концентрации вирусных частиц в гомологических реакциях было невысоким. При инкубации сеточек на капле антисыворотки в течение 30 мин. и специфической сорбции на них вирусных частиц в течение 1-го часа лучшие результат i для BQM получены при использовании антисыворотки в разведении 1:512, что позволило повысить концентрацию вирионов на специфических сеточках в 18 раз по сравнению с контрольными, обработанными антисывороткой к ВТМ и в 4-5 раз, по сравнению с сеточками, приготовлениями обычшми методами негативного контрастирования. Приблизительно такие же результаты подучо1 ai и для ВАТ.

Для ВТМ оптимальным было разведение антисыворотки 1:1024.

При этом количество частиц на сеточках покрытых гомологическими антителами бмло в 30-35 раз выше, чем на обработанных антисм-вороткой к ВАТ и в 7 ^,аз, чем на необработанных.

Наибольшее число УВК в гомологических реакциях превышало контрольные, приготовленные обычными методами негативного контрастирования в 6-7 раз, а на контрольных сеточках, обработанных антисывороткой к ВТМ, их практически не наблюдалось.

Применение коллодиевсй пленки из свежего раствора и покрытие ею препаровальных сеточек непосредственно перед тестированием позволили существенно повысить чувствительность метода. Возрастание числа вирусных частиц на опытных сеточках, по сравнению с контрольными, приготовленными обычными методами негативного контрастирования, било столь значительно, что в ряде случаев, , особенно при тестировании.ВТМ и УВК, из-за высокой Исходной концентрации вирионов в соке, невозможно было их подсчитать и выявить оптимальные разведения антисьтвороток, обеспечивающих наиболее высокую чувствительность метода. В связи с этим, каплю, в которой был раздавлен кусочек инфицированной ткани, разбавляли фосфатным буфером до получения в контрольных препаратах, приготовленных обычными методами негативного контрастирования, в среднем одной частицы в поле зрения микроскопа. Далее, для специфической сорбции вирусных частиц на разбавленные суспензии помещали опытные сеточки, покрытые антителами, и инкубировали их в течение I, 4 часов при комнатной температуре и 24 часа при температуре 4°С, во избежание разрушения частиц. Полученные результаты представлет в таблице I.

Таблица I

Влияние различных разведений антисывороток на специфическую сорбцию вирусных частиц

! Среднее число nupyciwx частиц в 9-ти просмотренных Вариант j полях___________

:В0М при вре- ВАТ при вре- ВТМ при вре- УВК при вро-¡мени отлав- мони отлав- мени отлав- мени отлавли-¡ливания в ливания в лииания в вания в ча-j часах______часах__сах_______

__! I I 4 ! 24 I I 1 4 1 £4 1 I 1 4 !. 24 I I ! 4 ! 24___~

I I 2 I 3 ! 4_15 16 17 Те 1 9 I 10 1 III 12! 13_____

Гомологич-

I 1 2 1 3 1 4 ! 5 ! 6 ! 7 18 19 ! 10 1 II I 12 1 13

нно анти-

снворотки в разведениях:

1:256 21 54 67 24 51 71 42 91 116 25 61 81

1:512 28 67 86 31 78 96 46 119 135 42 96 НО

1:1024 25 58 79 30 57 74 51 134 172 47 93 140

1:2048 16 39 51 17 41 61 48 112 153 36 54 10Э

Контроль I I I I I I I I I I I I

Как видно из дашппс, приведенных в таблице I, при тестировании ВОМ наиболее высокая чувствительность метода наблюдалась при использовании антисыворотки в разведении 1:512 и времени инкубирования 24 часа, что позволило превысить чувствительность обмот методов негативного контрастирования в 86 и 96 раз соответственно.

Для ЮТ и УШ было оптимальным использование антисыворотки в разведении 1:1024 при том же времени инкубирования, что позволило превысить чувствительность методов негатирного контрастирования в 172 и 140 раз соответственно.

Для повышения чувствительности метода Деррика и расширения его возможностей в обнаружении одной штаммоспецифичной аши-сывсроткой различных штаммов одного вируса использовали стеноч-шй А-белок золотистого стафилококка в концентрации 0,1 мг/мл, что позволило повысить чувствительность метода в среднем в 2,5 раза. В атом случае увеличение чувствительности по сравнению с методом негативного контрастирования составило: для ШЪ1 - 430 раз; для УВ1С - 350 раз; для ВАТ - 240 раз и для ВОМ - 215 раз.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИСЭМ В ВШ1ВЛШИИ ВТЫ В СЕМЕНАХ ТОМАТОВ

Высокая чувствительность и простота исполнения позвбдили с успехом применить метод Деррика в сочетании с А-белком в вирусологической экспертизе семян. Опытами, проведенными на партии семян томатов с.Молдавский ранний, собранных с больных растений и хранившихся в течение года, установлена их 100%-ная заракен-и ;ть. При этом вирус легко выявлялся как в сильнопораженных (с некротическими поражениями, хорошо заметными невооруженным

глазом), так и в среднепораженных (с едва различимыми некрозами на поверхности увлажненных семян) и бессимптомных (без внешних симптомов поражения).

С помощью указанного метода HTM был обнаружен во всех частях пораженных семян, подтвердив данные литературы, что оснолши масса вируса локализована в кожуре (в 100% тестированных семян в поле зрения электронного микроскопа наблюдалось но менее 20-160 частиц вируса). В значительно меньшей концентрации вирус присутствовал в эндосперме (в 100% тестированных семян в поле зрения электронного микроскопа наблюдалось а среднем 3-7 частиц вируса), а для обнаружения вируса в зародыша необходимо было просмотреть порой всю площадь qeT04KH, чтобы обнаружить 1-2 частицы (вирус обнаружен в I0/J тестированных семян).

При тестировании средних проб \-стод позволил выявить одно сильнэпоратшое семя в пробе из 200 семян, одно среднепораягап-ное в пробе из 100 семян и одно бессимптомное d проба из 50 семян.

На основании тестирования 12-ти дневных проростков было установлено, что МО.И-ная. зараженность семян приводит и к 100$-ной зараженности получоннчх из них проростков.

Использование дезинфекции семян Т0$-ннм тринатрийфосфатом и 20^-ной соляной кислотой способствует оздоровлению семян, но но приводит к их полному обеззараживанию и вирус выявляется в 6,6% дезинфицированных нопророепшх семян и 10$ полученных из них проростков.

Следует отметить, что вопрос о степени зараженности семян томатов ВТМ требуем специального изучения, причем процент их инфицирования, очевидно, зависит от сортовой специфики, от времени заражения растений и других факторов. Не исследована и динамике, накопления ВТМ, обнаруженного в проростках, тогда как от этого во многом зависит последующее развитие болезни. Поэтому мы должны подчеркнуть, что паши опыты, проведенные с одним сортом томатов, носят презде всего методический характер и показывают возможности применения rlCSM для обнаружения вирусп в семенах.

- го -выводы

I. Впервые в ССР Молдова наиболее полно описаны и изучены вирусные болезни томатов открытого и защищенного грунта, установлен их ареал.

Ü. Изучен видовой и штаммовый состав вирусов-возбудителей.

Установлено, что в открытом грунте томаты поражаются ВБТ, Ь'ГМ, ВШ, ВАТ, УВК в одинарной и смешанной инфекцилх; в защищенном грунте - Ш'М.

3. Изучены свойства вирусов и описаны штаммы ВЕ1',Ш'М, ВШ.

Установлено, что в условиях Молдовы на томатах ВШ' представлен двумя штаммами: ВБГ-1 - сильнопатогенный штамм - вызывает усыхание верхушки томатов и некротические кольцевые поранения плодов; ВЫ'-2 - среднепатогеиный штамм - вызывает на листьях томатов бронзовый загар и некротические пятна, а на плодах - хлоротические кольцевые поражения.

Ш'М представлен двумя штаммами: зеленой мозаики и желтой мозаики с некротизацией листьев и стебля.

ВОМ представлен двумя штаммами: нитевидности и пгпоротни-ковидности листьев и слабой мозаичности листьев.

4. Изучена вредоносность ВАТ. Получены новые данные но накоплению вируса в генеративных органах. Установлено, что ВАТ на томатах способен накапливаться в большой концентрации в генеративных органах томатов, в частности, в клетках среднего слоя и тапетума тычинок. Это снижает количество образуемой пыльцы и по-выш.'.от уровень ее стерильности, с чем связаны плохая завязываемое ть и бессемянность лаодов.

5. Проведены исследования вирионов лабильных вирусов Ш1', ВШ и ВАТ на основании разработки метода фиксации их в тканях пораженных растений 2$-ным 01 и б^-ным глутаровым альдегидом.

Впервые в СССР описан ряд морфологических особенностей структуры вирионов BLT.

6. Впервые в СССР испытаны и усовершенствованы метоДы им-цуноолектронной микроскопии для диагностики вирусов, поражающих томаты в Молдове.

Установлено, что метод декорирования позволяет: диагностировать вирусы в вегетативных органах томатов при выраженных сии .омах болезни в течение 15-20 мин; различать в смешанных инфекциях морфологически схожие серологически неродственные ви-

- 21 -

русы; изучать серологическое родство вирусов.

7. Результаты испытания методов иммуноэлектронной микроскопии показали, что наиболее высокой чувствительностью обладает метод Деррика в сочетании с А-белком. Использование метода в нашей модификации позволило превысить чувствительность методов негативного контрастирования при тестировании ВАТ- в 240; BCJ.1-в 215; В1М - в 430; УВК - в 350 раз.

8. Усовершенствованы методы вирусологической экспертизы семян на зараженность Ш'М. Использован метод Деррика в сочетании с А-белком, позволяющий выявить локализацию вируса в семенах различной степени пораженности и в 12-ти дневных проростках.

9. Метод Деррика в сочетании с А-белком может быть использован для практической оценки различных методов обеззараживания семян.

Методические рекомендации

1. Для повышения эффективности инокуляции растений БЕГ, ВСМ и ВАТ использовать в качестве стабилизатора буфер Опель-Кеглера,

2. Для стабилизации вирионов лабилышх вирусов, при изучении их морфологии in vitro использовать 30-ти минутную предварительную фиксацию инфицированных тканей растений: для ВБТ -ным ОзС^, а для ВСМ и ВАТ - 5$-ным глутаровым альдегидом.

3. Для быстрой диагностики БЕГ, ВГМ, ВСМ, ВАТ и УВК в одинарной и смешанной инфекциях в соке томэтов и других растений, содержащих вирус в достаточной концентрации для выявления обычными методами негативного контрастирования, применять метод декорирования с использованием диагностических антисывороток в разведениях близких к конечному.

4. Для выявления вирусов в низкой концентрации в тканях и семенах томатов методом Деррика в сочетании с А-белком в нашей модификации испольэоюать: свежеприготовленную коллодиевую пленку-подложку; А-белок в концентрации 0,1 мг/мл; антисыворотки з разведениях 1:512-1:1024 и сеточки, покрытые антителами, инкубировать на вирусных суспензиях в течение 24 часов при температуре 4°С.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: I. Тертяк Д.Д. Изучение вирусных болезней томатов в Молдавии/ /Фитолатогенные микроорганизмы культурных pacieimfi Молдавии .-Кишинев:Штиинца, 1981.-С.63-69.

2. Киринк Г.Я., Тертяк Д.Д., Базелюк Ф.М., Кайсын Ф.Я. Вирусы табачной мозаики и мозаик;: томатов на растениях самайс."оа пасленовых в Молдавии//Штамын вирусов растений и их практическое использование. 'Гр. ЛСХА, вып. ШI. -С.78-80.

3. Тертяк Д.Д.Ыатод фиксирования нестойких вирусов в тканях растений при негативном контрастировании // II Респ.научно-техническая конф.по электронной микросКопии:Тез.докл.-Кишинев,1981. -C.I33.

4. Тертяк Д.Д., Кайсын Ф.Я. Изучение морфологии части вирусов бронзовости томатов и аспермии томатов.-Там ка.-С.134.

5. Вердаревскан Т.Д., Тертяк Д.Д., Кирияк Г.Я. Индентифика-цил фитопатогечных иирусов методом иммуниэлектронной микроскопии //XII Всесоюз,конф.по электронной микроскопии:Тез.докл.-М.,1982. -С.296.

6. Тертяк Д.Д. Имыуноэлектронная микроскопия как быстрый меюд диагностики вирусов растений //Вирусные заболевании культурных растений Молдавии.-Кишинев:Штиинца, 1984. -C.I30-I42.

7. Тертяк Д.Д. ,Баэелюк Ф.М. Индентификацин вирусов огуречной мозаики и аспермии томатов на томатах и перцах в Молдавии. -Там ео.-С.142-166.

8. Тертяк Д.Д., Букоряну Ü.B., Брынзан А.П. Морфологические особенности вируса бронзовости томатов // Ш Респ.научно-технической конф.по электронной микроскопии.Таз.докл.-Кишинев, 1986. -C.IL7.

9. Бужо^кцу В.В.,Тертяк Д.Д., Лупан A.C. Влияние вирусов асиармии томатов и табачной мозаики на генеративные органы томатов //Физиолоро-биохимичаскиа основы повышения продуктивности и устойчивости растений. Материалы 1У-Расп.конф.физиологов и биохимиков Молдавии.-Кишинев;Штиинца,1986.-C.II6-II7.

10. Букоряну В.В., Лулан A.C., Тертяк Д.Д. Влияние вирусной инфекции на ульт>аструктуру ластиков томатов.//.1зв,AU МССР.сер. биол.и хим.наук -1988.-№ 3.-С.34-38. '

11. Дупан A.C., Тертнк Д.Д. Ультраструктура чашелистиков томатов при смешанной инфекции://Ультраструктура растений:-Киев, 1988.-С.214.

12. Тертяк Д.Д. Использование имцуносорбентной электронной микроскопии в выявлении вируса табачной юзаики в семенах тома-тов//Влитше фитопатогенов на репродуктивную систему растений-

- 23 -

-хозяев.-Кишинев, 1989.-С.87-97.

13. Тертян Д.Д. Выявление и локализации вируса табачной мозаики в семенах томатов// Теоретическая и прикладнап карполо гия:Тез.докл.-Кишинев,1969.-С.223.

ПГТ! МТ осгч. П;жЛ7/!П, Тнр.ТГ^П. р^.пц т,2п.л. Гси.изл. Т,0 п..т.. Нопттго^тто п ттпччтх, Т.^ГЛ"0!1!'.