Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Возбудители вирусных болезней томатов в Молдове и усовершенствование методов их диагностики

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Возбудители вирусных болезней томатов в Молдове и усовершенствование методов их диагностики"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМ. ЛЕНИНА ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАШИТЫ РАСТЕНИЙ

ВОЗБУДИТЕЛИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТОМАТОВ В МОЛДОВЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИХ ДИАГНОСТИКИ

06.01.11 — Защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Тертяк Дмитрий Дмитриевич

УДК 632. 38:57.083.2:635.64

Ленинград—Пушкин 1991

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМ. ЛЕНИНА ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАШИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи

Тертяк Дмитрий Дмитриевич

УДК 632. 38:57,083.2:635.64

ВОЗБУДИТЕЛИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТОМАТОВ В МОЛДОВЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИХ ДИАГНОСТИКИ

06.01.11 - Защита растения от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленмшрад-Нушкин 1990

- г -

Работа выполнена в Отделе микробиологии АН ССР Молдова и в Институте экологической генетики АН ССР Молдова

Научные руководители: член-корр.АН ССРМ,доктор с/х наук М.Я.Молдован,

доктор биологических наук, профессор С.И.Власов

Официальные оппоненты: доктор с.-х.наук Ж.В.Блоцкая,

канд.с.-х.наук А.Е.Цылленков

Ведущая организация:Всесоюзный НИИ растениеводства им.

ЩИ.Вавилова . .

Защита состоится * -/о" (У/И^тЛсС&'_1990 г. в "

часов на заседании Специализированного совета, шифр Д-020.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте защиты пастений по адресу: 189620, г.Ленинград-Пушкин 6, шоссе Нсюельского д.З, ВИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться 8 библиотеке Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследоватачьского института защиты растений.

Автореферат разослан " ьССО/Ы^иХ,

Ученый секретарь Ц 1/л /—~

Специализированного Совета ВИЗР Г.А.Неседкина

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В CCFM вирусные болезни томатов изучены недостаточно и сведения о видовом составе их возбудителей ограничены. Наиболее полные исследования проведены по идентификации и дифференциации HTaMMOLüi'o состава вируса табачной мозаики (ВТМ) (Вердеревская, 1962; I9G4; Балашова, 1971; Р^ущук, Балашовй, 1981; Балашова, Король, Тимина и°др., 1983), а также проведена частичная идентификация возбудителей мозаичных забиваний в связи с селекцией томатов на устойчивость к ШЪ1 (Р^щук, 1983).

Больший препятствием в изучении видового разнообразия вирусов-возбудителей болезней томатов и других сельскохозяйственных культур не только в Молдове, но вообще в СССР служит слабое развитие методов диагностики, в частности, наиболее современных из них - электронной микроскопии, серологии и их сочетания. Развитие и совершенствование методов диагностики вирусов является актуальной научной и практической задачей.

Цель и задачи исследиваний. Работа посвящена выявлению основных возбудителей вирусных болезней томатов в Молдове, дифференциации их штаммов и усовершенствовании методов диагностики. В задачи исследований входило:

1. Выявить и идентифицировать вирусы-возбудители основных заболеваний томатов в республике.

2. Дифференцировать штаымовмй состав изучаемых вирусов.

3. Испытать и усовершенствовать методы диагностики вирусов, поражающих томаты в республике.

Объекты исследований. Объектами исследований служили растения томатов с симптомами вирусных болезней и их возбудители.

Научная новизна работы. Научная новизна результатов исследований заключается в следующем:

- впервые в ССРМ наиболее полно описаны вирусные болезни томатов, определен их ареал;

- впервые в CCFV комплексом методов на томатах идентифицированы вирусы бронзовости томатов (ВБТ), огуречной мозаики.(BOU), асперм|ш томатов (ВАТ) их-вирус картофеля (*ВК);

- дифференцированы и описаны штаммы ВТЫ, ВБТ, BOU;

- впервые в СССР испытаны и усовершенствованы методы шшу-ноэлектронной микроскопии (iBU) для диагностики BTU, ВБТ, BOU, ВАТ и Ш;

- экспериментально доказана возможность использования методов ЮМ для вирусологической экспертиз« семян томатов на присутствие в них ВТМ и оценки эффективности мероприятий по оздоровлению семян в производстве;

- разработаны метода фиксации лабильных вирусов BOM, ВД.Т и НБТ в тканях растений для изучения их морфологии.

Практическая значимость работы. Выявлены основные заболевания томатов в ССР Молдова, определен их ареал, описаны симптомы с учетом видовой и штаммовой принадлежности в одинарной и смешанной инфекциях. Усовершенствованы высокочувствительные метода ИЗ!': для идентификации вирусов в растениях томатов, а такта для вирусологической экспертизы семян на пораженность ВТМ.

Предложенные метода ЮМ на примере возбудителей вирусных болезней томатов могут быть использованы для диагностики вирусных заболеваний большого числа овощных, бахчевых, декоративных и других культур, поражаемых ВТМ, ВБТ, ВОМ, ВАТ и УВК.

Апробация работа. Основные результаты диссертационной работы доложены на 2-ом Всесоюзном симпозиуме по штаммам вирусов растений (г.Елгава, 1981); на П Республиканской научно-технической конференции по электронной микроскопии (г.Кишинев, 1981); :>а ХП Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (г.Сумы, 1932), на 1У Республиканской конференции физиологов и биохимиков Молдовы (Кишинев, 1986); на Ш Республиканской научно-технической конференции по электронной микроскопии (Кишинев, 1986); на Всесоюзной конференции по теоретической и прикладной карпологии (Кишинев, 1989).

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 13 работах.

Объем и структура диссертации» Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав и выводов. Список использованной литературы включает 235 наименований, в том числе 105 иностранных. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 37 рисунками.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДШИ

В введении освещена актуальность темы, ее научная новизна и практическая значимость.

- б -

МАТЕРИАЛЫ 11 МЫЗД ИССЛВДОВАНИЙ

Исследования проводились в течение 1978—I9B9 гг. в лаборато*-рии вирусологии Отдела микробиологии и в лаборатории биологических методов индуцирования генетической изменчивости Института экологической генетики АН CCFU. Выявление возбудителей вирусных болезней томатов, определение их распространенности проводили по результатам обследований томатов в II основных овощеводческих районах ресцублики как в открытой, так и в защищенном грунте на общей площади свыше б тыс.га.

Ыатериалом исследований служили: растения томатов основных районированных сортов (Ранний 83, Молдавский ранний, Факел, Новинка Приднестровья, Волгоградский 12, Нистру, Ликурич, Бируин-ца и др.) с симптомами вирусных болезней, собранные с обследованных районов республики; вирусные препараты и антисыворотки (АС): к BIM (АС из ВИЗР), к ВБТ (АС из НР Болгарии), к BOU (АС из-МГУ), к ВАТ (АС из ЛСХА) и к УВК (АС из ДВЦ АН СССР).

Обследования и диагностику вирусшпс болезней томатов проводили соответственно по методике Ю.И.Власова и Е.С.Лантас (1962) и по типовым методикам, одобренным специалистами стран-членов СЭВ (1970). Механический перенос вирусов на травянистые индикаторы осуществляли по методике П.Г.Чеснокова (1962) с использованием 0,1 Н фосфатного буфера (рН 7,2), 0,1% раствора никотиновой кислоты или буфера Опель-Кеглера (U.Cinl, и.К<.(;1иг, 1969).

Для изучения морфологии частиц исследуемых вирусов препараты готовили по методикам Проценко, Легунковой (1962), J.iíj-uuü.-u, (1957),J• ¿l.Hitchbori.,tf.l.iiilla , (1963). В качества контрастан-тов использовали 2$-ную соль фосфорно-вольфраыового натрия при различных значениях рН и 2£-ный водный раствор уранилацетата при рН 4,6-4,7. Для предотвращения разрушения частиц BOU, ВАТ, ВЫ' их стабилизировали по методикам, разработанным Э.И.Лариной (1974) и нами (Д.Д.Тертяк, 1961).

Для изучения ультраструкт^ры пораженных клеток использовали методы заливки ткани в эпоны, описанные Б.Уикли (1975). Ультратонкие срезы изготовляли на ультрамикротоме УМ1ГГ-3, контрастировали по Рейнольдцу ( ¿.s.Hiy.ialdn, 1963) и исследовали в электронном микроскопе ЭИВ-100Л. •

Имщноэлекгрошш-микроикопические исследования идентифицируемых вирусов проводили методами группирования и декорирования

- о -

частиц ( п.Milne, jK.LuIboiií , 1977), Дзррика ( к.г,< rrioit, 1973; к. Derrick , Jf.iirlunr.ky , 1976), модифицированным методом Деррика ( H.iuii к,, b.Luiuoui , 1777) и методом Деррика в сочетании с А-белком с нашими изменениями. В качестве подложки во всех указанных методах использовали коллодиевуго пленку. Для разведения антисывороток и промывания препаровальных сеточек пользовались 0,1 М фосфатним буфером (pH 7,0).

Подсчет вирусных частиц в методе Дзррика и его модификациях осуществляли на 9-ти фотопластинках размером 9 х 12 см, с последующим определением среднего числа на одной фотопластинке.

Источниками инфекции служили тест-растония и томата с.Факел, зараженные исследуемыми вирусами, с которых при появлении первых симптомов отбирали листья для проведения экспериментов.

ВОЗБУДИТЕЛИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТОМАТОВ В МОЛДАВИИ (симптомология, распространение, идентификация, штоммовый состав)

Вирус бронзовости томатов ( Чос.п'са ( Г Ott.' <1 v.'i]t, vi ruf) группа Toa-lito rpot-tcii wilt virus . Распространен в республике повсеместно на посадках открытого грунта. В ореднем по районам поражает от единичных растений до 23,8$.

Вызывает заболевания в виде двух форм. Первая характеризуется сильной некротизацией верхушечных листьев и стебля. На плодах вызывает некротические кольца, полукольца, штрихи, восьмерки; семена щуплые, некротические, отдельные камеры вовсе бессемянные. Корневая система некротизирована. При раннем инфицировании растения полностью усыхают.

Втирая форма отличается менее жесткими проявлениями, но как и в первой, некротизация распространяется сверху вниз, захватывая листья, черешки и стебель. На плодах проявляется в виде хлоротических кольцевых поражений.

Изоляты, отобранные с растений с указанными симптомами, диагностировали методами тест-растений и электронной микроскопии.

При тестировании изолятов на 10 видах травянистых индикаторов, рекомендованных для идентификации ВБТ, для повышения эффективности инокуляции применяли различные стабилизирующие растворы, среди которых лучшим был буфер Опель-Кеглера, обеспечивший 60-90$ передачи вируса.

Электронно-микроскопические исследования проводили методами

ультратонких срезов и негативного контрастирования вирионов в соке инфицированных тест-растений и томатов. При изучении морфологии вирусных частиц i" vitro было выявлено, что предварительное фиксированно инфицированных листьев 2%-ной осмиевой кислотой и контрастирование 0,5^-ным уранилацетатом позволяет значительно увеличить сохранность вирионов и провести изучение их морфологических особенностей при небольших затратах времени.

Изучение физических свойств проводили в соке Nicotiana glutinosa на половинках листьев Petunia hy brida.

Используемыми ме!идами идентификации установлено, что воз-будитегум выявленных форм заболеваний является ВВТ.

Различия в симптомах на томатах, ряде тест-растений и физическим свойствам позволили считать, что ВБТ на томатах представлен двумя штаммами. ВБГ-1 - сильнопатогенный штамм, на томатах вызывает 1-ую форму заболевания и характеризуется следующими физическими свойствами: точка температурной инактивации (ТТЛ) 43-45°С, предельное разведение сока (ПР) 1:50 и инфекционность а соке (11СЛ) ШсоИи-ш glutinosa сохраняется в течение 5-ти часов. BLT-2 менее патогенный штамм, на томатах вызывает 2-ую форму заболевания. Его физические свойства: ТТИ - 43-45°С, ПР -1:200, ПСИ - 6 часов.

Основными растениями-дифференциаторами дли них являются: Си-eumia eativue с.Деликатес, на семядолях которого штамм ВЬТ-1 вызывает некрозы и не заражается штаммом ВБТ-2; ¡licotiauu rus -tic ir- с трудом заражается штаммом ШГ-1, проявляя хлоротичную пятнистость на инокулированных и отрастающих листьях, и легко заражается штаммом ВБТ-2, реагируя местными и системными некротическими поражениями; Datura etramonium на котором ВБТ-I вызывает некротизацию инокулированных и отрастающих листьев, в результате чего большинство растений погибает, а ВБТ-2 проявляется р виде сморщанности и хлорогичности отрастающих листьев.

В электронно-микроскопических исследованиях при сравнительном изучении более 200 препаратов у выявленных штаммов морфологических отличий не обнаружено. Вирионы характеризуются, в основном, сферической, реке - овальной или яйцевидной формой с наружной мембраной или баз нее. Размеры их варьируют от 30 до 160 нм со средним и модальным диаметрами соответственно: для частиц с наружной мембраной -98,52*1,4? и 100 нм. Выявлен ряд характер-

- о -

них для ВБТ морфологических особенностей, ранее не описанных в нашей стране, в частьости, гантелепидше частицы, вирионы, напоминающие по формо теннис)we ракотки, наличие инвагинаций наружной мембраны вирионов, наличие внутренней мембраны, окружающей эле-ктронноплотные центры и др.

Сопоставлял полученные данные с литературными, можно констатировать, что штамм ВБТ-1 по симптомам на большинстве тест-растений и физическим свойствам наиболее тесное сходство имеет со штаммом некротической бронзовости, описанной в Болгарии Ковачев-ским и Марковым (И.Косачевекий, М.Марков, 1961), а штамм ВБТ-2 близок к штамму ВБТ, описанному на табаке в Молдове (М.Я.Молдован, I9UI; Н.Г.Чебан, 1981).

Вирус табачной мозаики (Tobacco mosaic virus_),группа

TobamovlruB. По результатам обследований посадок томатов ВТМ распространен повсеместно и поражает растения в открытом грунте, в среднем по районам, на 3,8-50,6%, а в защищенном - на 62-100%. В открытом грунте, в основном, вызывает симпртомы зеленой мозаики, реке - желтой с некротизацией листьов и стебля, а в защищенном - наряду с мозаикой и такие вредоносные формы как нитевид-ность, папоротниковидность листьев, стрик, внутренний некроз плодов.

Возбудитель был идентифицирован следующими методами: тест-растений, электронной микроскопии и серологии.

При тестировании изолятов на II видах травянистых индикаторов, рекомендованных для ВШ выявлено, что симптомы зеленой мозаики, деформации листьев и некротизации стебля вызваны одним штаммом - зеленой мозаики. Значительные отличия симптомов изолята желтой мозаики с некротизацией листьев и стебля на томатах и большинстве тест-растений дало основание считать его самостоятельным штаммом.

Основными растениями-дифференциаторами для выявленных штаммов являются: томаты с.Факел и перец с.Подарок Молдовы, на которых штамм желтой мозаики с некротизацией листьев вызывает системней некроз и гибель растений перца на 12-14, а томатов - на 26-28 донь после инокуляции, а штамм зеленой мозаики - симптомы эе-ЛенэП мозаики. На растениях Petunie hybride, Gonphrejia globosa iuT8VM зеленой мозаики вызывает местные некрозы, а штамм пелтой мманки с некротизацией листьев и стебля наряду с местными поражениями, тгл-гуи, до белого цЕета, мозаику.

Дальнейшая идентификация серологией, электронной микроскопией подтвердила их принадлежность к ВТМ.

Сравнительное изучение морфологии вирионов показало, что они мовду собой не отличаются и являются жесткими палочковидными часищами с модальним размером 300 нм.

Физические свойства, изученные в соке табака с.Переможец 33, составили для иламма зеленой мозаики: ТТИ - 95°С, ПР -1:100000 и ПСИ - более 30 суток; для штамма желтой мозаики с некротиэацией листьев и стебля соответственно: 90°С, 1:10000 и более 30 суток.

Таким образом, штамм золеной мозаики способен при определенных условиях, особенно на томатах защищенного грунта, вызывать различные формы заболевания, такие как деформации листьев, некроз стебля и др. и идентичен возбудителю зеленой мозаики, описанному в Молдове Т.Д.Вердеревской (1959). Штамм желтой мозаики с некротизацией листьев и стебля характеризуется высокой вредоносностью, ранее в республике но описан и отнесен к группа желтых штаммов.

Вирус огуречной мозаики (Cucumber mosaic у1гив ) f группа Cucumovlrua . BOU выявлен на посадках томатов в открытом грунте во всех обследованннх районах. Поражает единичные растения и вызывает симптомы слабой мозаичности, нитевидности и папоротни-ковидности листьев.

Идентификации возбудителя была проведена методами тест-растений, серологии и электронной микроскопии.

Тестированием на 9-ти видах травянистых индикаторов, рекомендованных для идентификации B0M, установлено, что симптомы слабой мозаичности листьев и нитевидности и папоротниковидности листьев обусловлены штамыовыми различиями патогена. При заражении растений N.glutinosa, P.hybrida штамм слабой мозаичности листьев на инокулированных листьях вызывал хлоротические пятна и слабую мозаичность отрастающих листьев с последующей маскировкой симптомов, а штамм нитевидности и папоротниковидности липть-эв - резкую деформацию отрастающих листьев.

На ннокулированиых листьях перца с.Подарок Молдовы штамм глабой мозаичности листьев характеризовался симптомами в виде ажурного рисунка, состоящего из хлоротнчзских концентрических колец, полуколец, черточек, а системное поражение внргталось в

слабой мозаичности отрастающих листьев. Штамм нитевидности и папоротниковидности листьев на этом виде индикатора вызывал резкую деформацию отрастаюг/ю листьев и преждевременное их опадание.

При использовании метода двойной иммунодиффузии в агаре наиболее четкие положительные реакции с антиснвороткой к ВОМ были получены при тестировании сока и.ч инфицированного табака с.Самсун Щ, зараженного обоими штаммами.

В электронно-микроскопических препаратах in vitro , приготовленных с предварительной фиксацией образцов В^-ньтм глутаровчч альдегидом по методике, предложенной нами, а также на ультратонких срезах в клетках томатов, табака и других тест-растений, инфицированных идентифицируемыми штаммами, были выявлены сферические частицы с электронноплотным центром, со средним диаметром 30,79+0,24 ни и модальным размером 30 нм.

Штаммовые различия возбудителя были подтверждены результатами изучения физических свойств в соке табака с.Самсун на половинках листьев Chenopodium quinoa и составляют для штамма слабой мозаичности листьев: ТТИ - 68°С, ПСИ - 2 суток, ПР - 1:1000, а для штамма нитевидности и папоротниковидности листьев: 65°С, 2 суток и 1:1000, соответственно.

На основании проведенной идентификации штамм, вызывающий нитевидность и папоротниковидность листьев томатов, по характеру поражения томатов и тест-растений отнесен к группе штаммов деформирующего типа, а штамм слабой мозаичности листьев к группе слабопатогенннх штаммов (Н.Н.Артемьева, С.Ю.Рай, 1981; С.Ю.Рай 1983).

Вирус аспермик томатов (Tomato aspermr virus ). трупа Cucumo-virus . Проведенными обследованиями посадок томатов установлено, что ВАГ, как правило, встречается на небольших, в сильной степени засоренных полях, где число больных растений составило от единичных до 11,1$.

Характеризуется симптомами низкорослости и повышенной кустистости растений с деформацией листовых пластинок в виде "лодочки". Отличительной чертой является то, что на больных томатах в период цветения происходит массовое опадение цветков, а завязавшиеся плоды мелкие, деформированные, большей частью бессемянные.

Тестирование методом тест-растений на б видах травянистых

индикаторах, рекомендованных для «идентификации ВАТ, показало, что индентифицируемый возбудитель проявил симптомы, характерные для ВАТ.

При изучении физических свойств установлено, что ТТИ возбудителя составляет 60°С; ПСИ - 2 суток и ПР - 1:1000.

Принадлежность возбудителя к BAI была подтверждена получением положительной реакции с антисниороткой к ВАТ в серологическом тесте двойной иммунодиффузии"/з агаре.

В электронно-микроскопических исследованиях при просмотре негативноокрашеш*нх препаратов, приготовленных из соковых экстрактов листьев инфицированного табака с.Самсун 1)1! , томатов с.Факел и других растений наблюдали частицы со средним диаметром Э8,Ш±0,19 с модальным размером 30 нм, соответствующему ВАТ. На рльтратонких срезах, наряду с диффуэноразбросанными частицами, в клетках инфицированных растений были обнаружены агрегаты а виде рядов плотнолекащих вирионов, расположенных кольцами, полукольцами и дугами.

При изучении ультратонких срезов генеративных органов тома-гов, в частности тычинок, было установлено, что ВАТ способен на-шпливаться в значительной концентрации в клетках среднего слоя тыльников, а также в клетках выстилающего слоя - тапетума. В клерках среднего слоя агрегаты вирусных частиц нередко занимали весь збьем цитоплазмы. Такой концентрации вириоиов не на -

$людалось даже на ультратонких срезах клеток сильно пораженных ■истьев томатов. В инфицированных пыльниках образовывалось неболь -юе количество пыльцевых зерен, большинство из которых были стерильны. Для них характерны молкие размеры, утрата сферической [юрмы, сильная деформированность, расслоение экзины и интины, ча-!Тичное или полное отсутствие цитоплазмы. Видимо, сло-

жность ВАТ накапливаться в большой концентрации в тычинках, а гакхе связанный с этим высокий уровень стерильности пыльцы и яв-шются одной из причин высокой вредоносности патогена, тем более 1то томаты являются самоопыляемыми растениями.

* -вирус картофеля ( т. virm; ), группа

Potyyiruü .На томатах был обнаружен в составе смешанной инфекции с В1М и ВБТ при обследованиях томатов открытого грунта. На растениях в смеси с ВГМ вызывает симптомы морщинистой мозаики, скручивания листьев и повышенной кустистости растений, а с ЕКГ -доминируют симптомы ВБТ с более высокой степенью некротизации. Выделение УВК из смеси с BIM проводили на растениях N. Rlutino-ва и табака с.Иммунный 580, локализующих ELM в местных некрозах и заражающихся системно УВК. Разделение УВК от ВБ1 было проведено на основании различия возбудителей по основным физическим свойствам. Чистота изолятов в обоих случаях проверялась с помощью электронной микроскопии. Зараженные 6 видов тест-растений чистыми изолятами проявили симптомы, характерные для УВК, а томаты реагировали слабым просветлением жилок отрастающих листьев.

При тестировании капельным методом чистых изолятов с антисывороткой к УВК получены положительные реакции.

При электронно-микроскопических исследованиях в иегативно-окрашенных препаратах выявлены нитевидные частицы размером 720 нм, характерные для УВК.

Однгм из важных диагностических признаков УВК является его способность индуцировать в инфицированных клетках цитоплаз-матические включения типа "шестеренок"(М.Я,Модцован, 1979; В.В.Бужоряну, 1981; i.lüvmrson, п. Chriütie,i978 ). На ультратонких срезах клеток зараженных томатов и табака были обнаружены ана"огичные цитоплазматические включения, что послужило дополнительным подтверждением принадлежности иидентифицируемого возбудителя к УВК.

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЙЭМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ, ПОРАЖАЮЩИХ ТСМАТЫ

Важной особенностью методов ИЭМ является сочетание в себе простоты исполнения, высокой чувствительности, достоверности, возможности использования антисывороток невысокого качества для диагностики вирусов непосредственно в соке больных растений. При идентификации вирусов в одинарных и смешанны: инфекциях и др. широко применяются три разновидности методов ИЭМ. В первой, в электронное микроскопе исследуют образцы, приготовленные из смеси вирус-антисыворотка (метод группирования частиц).

Во второй, изучают препараты с адсорбированными на пленке-подложке вирусными частицами, последовательно обработанными антисыворотками (метод декорирования). В третьей, препаровальнке. сеточки обрабатывают антисывороткой, затем помещают на вирусную суспензию для специфического связывания вирусных частиц адсорбированными на пленке антителами (иммуносорбентная электронная микроскопия, ИСЭМ).

Однако, в настоящее время существуем множество вариаций в технических деталях при использовании м'етодв ИЭМ, и в каждом конкретном случае выбор метода и оптимальных условий проведения анализов необходимо определять с помощью предварительных тестов. В связи с этим, одной из стоявших перед нами задач было определение возможности использования методов ИЭМ для диагностики вирусов, поражающих томаты в Молдове, и подбор оптимальных уело-* вий для проведения анализов.

Метод группирования частиц Метод группирования частиц был использован для диагностики ИМ (штаммы зеленой мозаики и желтой с некротизацией листьев и стебля), ВШ (штамм слабой мозаичности листьев) ,ВЕ1'(штамм ВБТ-1) и ВАТ. Тестирование указанных вирусов в листьях инфицированных тест-растений и томатов с.Факел проводили по одной и!з наиболее распространенных методик, предложенной Р.Милном и Е.Луисони (1977). Ее достоинством является простота исполнения и небольшие затраты времени на получение результатов (10-15 мин.).

При взаимодействии указанных вирусов с гомологической анти-сывороткоИ в электронном микроскопе наблюдали группирование частиц в агрегаты. В контрольных препаратах, где применялись неродственные антисыворотки, они отсутствовали. Однако, полученные препараты отличались невысоким качеством. В агрегатах внрионы располагалис беспорядочно, взгромождаясь несколькими слоями друг на друга. Часто вирусные частицы были окружены ореолом из антител, но из-за большой скученности, неравномерного распределения контрастанта, избытка загрязнений, превносишх самой антисывороткой и захватываемых при формировании агрегатов, не всегда его можно было рассмотреть.

Усовершенствование методики приготовления препаратов было проведено по пути использования серийного разведения антисывороток.Так, авторами метода было установлено, что для приготовления

препаратов оптимальным является применение антисывороток в разведении в 10 раз меньше предельного. В наших экспериментах лучшие препараты были получены при использовании антисывороток в Солее высоких разведениях, близких к предельно»^. Так, для BAT лучшие препараты были получены с антисиворотками в разведении 1:32-1:64, при ее предельном разведении 1:128; для B0M-I:16-1:32 при 1:64; для Ш'М - 1:128-1:250, при 1:512; для ВЬТ-1:8 при 1:32 соответственно.

Использование более высоких разведений антисывороток позволило экономнее расходовать их и получать более чистые препараты.

Метод декорирования

При использовании метода декорирования ( Milne, LuiBoni, 1977) от начала приготовления препаратов и до получения результатов затрачивается 15-20 минут, т.е. по быстроте и простоте исполнения он не уступает методу группирование частиц и позволяет диагностировать вирусы в вегетативных органах томатов и тест-растений при выраженных симптомах заболевания, т.е. когда концентрация вирусов в соке достаточна для выявления их обычными методами негативного контрастирования. При тестировании всех выявленных нами вирусов (ВЫ', Ш'М, BUM, ВАТ и УВК) и их штаммов, препараты, приготовленные по этому методу, отличались более высоким качеством, чем в методе группирования частиц. В них вирусные- частицы, адсорбированные на пленке-подложке препаровальных сеточек, терлли подвижность и последующая обработка антисывороткой, при положительных реакциях, приводила только к образованию ореола из антител, не вызывая их группирования в агрегаты. Более равномерное распределение частиц Но препарату дало возможность качественно отконтрастировать их и хорошо рассмотреть характер декорирования вирионов антителами. Декорированные частицы легко отличались от контрольных, обработанных неродственной антисывороткой. 1

Гшк и в методе группирования частиц, использование антисы-воротсг, разбавленных в 10 раз меньше их предельного разведения, приводило к значительным загрязнениям препаратов, а из-за плот-ноги декорирования частицы почти не просматривались, что затрудняло выявление сферических вирионов ВСМ и ВАТ. Оптимальным было применение антисывороток о таких же разведениях, как и в ме-

тоде группирования частиц. Это позволило получать более чистые препараты с хорошим качеством изображения.

Метод декорирования весьма удобен для диагностики вирусов в смешанных инфекциях, так как электронный микроскоп позволяет выявить практически все вирусы, присутствующие в растении в концентрации 10^ и более частиц в I мл инфекционного сока, а последующее декорирование дает возможность отличить даже сходные по морфологии серологически неродственные вирусы.

В наших опытах для выявления возможностей метода декорирования в диагоностике смешанных инфекций использовали смесь Y - вируса картофеля, выделенного с томатов, и Z - вируса табака. Оба вируса относятся к потигруппе, обладают одинаковой морфологией, но серологически неродственны.

При исследовании в электронном микроскопе смеси этих вирусов, обработанных антисывороткой к Ш'М, наблюдаемые нитевидные вирионы не отличались по своим морфологическим признакам. На опытных сеточках, обработанных антисывороткой к УВК, декорированные частицы УВК легко отличались от недекорированных вирионсв Z - вируса табака.

Методом декорирования было также изучено серологическое родство ВШ и ВАТ.

Перекрестное титрование показало, что исследуемые вирусы серологически родственны, но не идентичны и различаются между собой в пределах одного разведения антисыворотки.

Имцунссорбентная электро!шая микроскопия (ИСЭМ).

Основным достоинством методов ИСЭМ является сочетание в себе простоты исполнения и высокой чувствительности.

Из этой группы методов для тестирования ВЩзеленый штамм), ВШ (штамм слабой мозаичности листьев), ВАТ и УВК были испытана: метод Деррика (Derrick, Brlancky , 1976), модификация метода Деррика, предложенная Милном и Луисони(Milne, Luinoni, 1077 ) и метод Деррика в сочетании с А-белком с некоторыми изменениями. В частности, для разбавления антисывороток и промывания препаровальных сеточек использовали О,IM фосфатный буфер (pH 7,с), вирусные экстракты получали путем раздавливания на предметных стеклах в капле указанного буфера, кусочке инфицированной ткани, площадью около 2 мм^, и подложкой служила коллодиевая пленка.

Проведенные исследования показали, что метод Деррика и

модификации Милна и Луисони при тестировании B0U и ВАТ позволяет получать увеличение концентрации вирусных частиц за счет специфического связывания в гомологических реакциях в 4-6 раз, по сравнению с контрольными, обработанными неродственной антиснвороткой, и в 2-3 раза, по сравнению с препаратами, приготовленными обычными методами негативного контрастирование. Рекомендованное разбавление антисмвороток в 10 раз меньше их продельного разъедания приводит к загрязнению препаратов и может вызывать ингибирование взаимодействии антител с вирусными частицами в гомологических реакциях. Поэтому при тестировании остальных вирусов указанный метод не использовался.

В базисном метода Деррика оптимальными являются более высокие раэводения антисывороток в пределах 1:1000. В экспериментах были использованы следующие разведения: 1:256; 1:512; 1:1024; 1:204а. В процессе работе было установлено, что чувствительность метода в значительной степени зависит от адсорбционных свойств пленки-подложки, определяющих количество адсорбированных антител при ее обработке антиснвороткой, которые, в свою очередь, и способствуют специфической сорбции вирусных частиц

суспензии при положительных реакциях. Отмечено, ч'.'о хранение раствора коллодия в амилацетате более 2-х месяцев и препаровальных сеточек, покрытых пленкой-подложкой более 1-2 суток, ухудшает ее адсорбционные свойства и снижает чувствительность метода. Так, в опытах, в которых использовали пленку-подложку, приготовленную >..■] О,'1% раствора коллодия, хранившегося в течение 6-ти месяцев, а покрытие ею препаровальных сеточек проводилось за 2-3 суток до проведения тестирования, увеличение концентрации вирусных частиц в гомологических реакциях было невысоким. При инкубации сеточек на капле антиснворотки в течение 30 мин. и специфической сорбции на них вирусных частиц в течение 1-го часа лучшие результату для ВОМ получены при использовании антисыворотки в разведении 1:512, что позволило повысить концентрацию вирионов на специфических сеточках в 18 раз по сравнению с контрольными, обработанными антиснвороткой к ВТМ и в 4-5 раз, по сравнению с сеточками, приготовленными обычными методами негативного контрастирования. Приблизительно такие же результата по луче) 31 и для ВАТ.

Для ВТМ оптимальным было разведение антисыворотки 1:1024.

При этом количество частиц на сеточках покрытых гомологическими антителами било в 30-35 раз выше, чем на обработанных антисч-вороткой к ВЛТ и в 7 ^аз, чем на необработанных.

Наибольшее число YEK в гомологических реакциях превышало контрольные, приготовленные обычными методами негативного контрастирования в 6-7 раз, а на контрольных сеточках, обработанных антисывороткой к ВТМ, их практически не нчблюдалось.

Применение коллодиевсй пленки из свежего раствора и покрытие ею препаровальных сеточек непосредственно перед тестированием позволили существенно повысить чувствительность метода. Возрастание числа вирусных частиц на опытных сеточках, по сравнению с контрольными, приготовленными обычными методами негативного контрастирования, было столь значительно, что в ряде случаев, , особенно при тестировании ВТМ и YBK, из-за высокой исходной концентрации вирионов в соке, невозможно было их подсчитать и выявить оптимальные разведения антиснвороток, обеспечивающих наиболее высокую чувствительность метода. В связи с этим, каплю, в которой был раздавлен кусочек инфицированной ткани, разбавляли фосфатным бу'|*зром до получения в контрольных препаратах, приготовленных обычными методами негативного контрастирования, в среднем одной «астицы в поле,зрения микроскопа. Далее, для специфической сорбции вирусных частиц на разбавленные суспензии помещали опытные сеточки, покрытые антителами, и инкубировали их в течение I, 4 часов при комнатной температуре и 24 часа при температуре 4°С, во избежание разрушения частиц. Полученные результаты представлен:,! в таблице I.

Таблица I

Влияние различных разведений антисывороток на специфическую сорбцию вирусных частиц

¡Среднее число вирусных частиц в 9-ти просмотренных Вариант j полях____________

•ВОМ при вре- ВАТ при вре- ВТМ при вре- УШ при вре-¡мени отлав- мони отлав- мени отлав- мени отлавли-¡ливания в ливания в лииания в ванил в ча-j часах___часах___часах_сах________

__! I 1 4 ! 24 I I 1 4 ! £4 Г~I 1 4 ! 24 1 I ! 4 I 24__1

I 12 13 14 151617 1 8 1 9 I IQ 1 III 12! 13_____

Гомологич-

I ! 2 1 3 1 4 ! 5 ! 6 1 7 18 19' ! 10 ! II 1 12 1 13

ныо антисыворотки в разведениях:

1:256 21 54 67 24 51 7Ï 42 91 116 25 61 81

1:512 28 67 86 31 78 96 46 119 135 42 96 НО

1:1024 . 25 58 79 ■30 57 74 51 134 172 47 93 140

1:2048 16 39 51 17 41 61 48 112 153 36 54 103

Контроль I I I I I I I I I I I I

Как видно из данных, приведенных в таблица I, при тестировании ВОМ наиболее высокая чувствительность метода наблюдалась при использовании аитисыворотки в разведении 1:512 и времени инкубирования 24 часа, что позволило превысить чувствитодьнос'ь обычных методов негативного контрастирования в 86 и 96 раз соответственно.

Для ШМ и УВК было оптимальным использование аитисыворотки в разведении 1:1024 при том же времени инкубирования, что позволило превысить чувствительность методов ногатирного контрастирования в 172 и 140 раз соответственно.

Для повышения чувствительности метода Деррика и расширения его возможностей в обнаружении одной штаммоспецифичной аши-смвсроткой различных штаммов одного вируса использовали станочный А-белок -золотистого стафилококка в концентрации 0,1 ыг/мл, что позволило повысить чувствительность метода в среднем в 2,5 раза. Б атом случае увеличение чувствительности по сравнению о методом негативного контрастировании составило: для ВШ - 430 раз; для УВК - 350 раз; для ВАТ - 240 раз и для ВОМ - 215 раз.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИСЭМ В ШЯВЛШИИ ВШ В CEM£liAX ТОМАТОВ

Высокая чувствительность и простота исполнения позвбднди с успехом применить метод Деррика в сочетании с А-белком в вирусологической экспертизе семян. Опытами, проведенными на партии сем.ш томатов с.Молдавский ранний, собранных с больных растений и хранившихся в течение года, установлена их 100^-ная заражение зть. При этом вирус легко выявлялся как в сильнопораженных (с некротическими поражениями, хорошо заметными невооруженным

глазом^ так и в среднепораженных (с едва различимыми некрозами на поверхности увлажненных семян) и бессимптомных (без внешних симптомов поражения).

С помощью указанного метода ВТМ был обнаружен во всех частях пораженных семян, подтвердив данные литературы, что основнпл масса вируса локализована в кожуре (в 100$ тестированных семян в поле зрения электронного микроскопа наблюдалось но менее 20-150 частиц вируса). В значительно меньшей концентрации вирус присутствовал в эндосперме (в 100% тестированных семян в поле зрения электронного микроскопа наблюдалось в среднем 3-7 частиц вируса), а для обнаружения вируса в зародыша необходимо было просмотреть порой всю площадь qeтoчI:и, чтобы обиарукить 1-2 частицы (вирус обнаружен в 10% тестированных семян).

При тестировании средних проб veтoд позволил быяшть одно сильнопоракепноо семя в пробе из 200 сгмлп, одно среднепоражеи-ное в пробо из 100 семян и -одно бессимптомное в пробе из 50 семян.

Ка основании тестирования 12-ти дневных проростков было установлено, что 100/5-ная зараженность семян приводит и к 100%-ной зараженности полученных из них проростков.

Использование дезинфекции семян 10%-ным тринатрийфосфатом и 20%-ной соляной кислотой способствует оздоровлению семян, но но приводит к их полному обеззараживанию и вирус выявляется в 6,6% дезинфицированных непроростаих семян и 10$ полученных из них проростков.

Следует отметить, что вопрос о степени зараженности семян томатов ВТМ требует специального изучения, причем процент их инфицирования, очевидно, зависит от сортовой специфики, от времени заражения растений и других факторов. Не исследована и динамикс накопления ВТМ, обнаруженного в проростках, тогда как от этого во многом зависит последующее развитие болезни. Поэтому мы должны подчеркнуть, что наши опыты, проведенные с одним сортом томатов, носят прелую всего методический характер и показывают возможности применения ИСЗМ для обнаружения вирусп в семенах.

- zo -выводи

I. Впервые в ССР Молдова наиболее полно описаны и изучены вирусные болезни томатов открытого и защищенного грунта, установлен их ареал.

X. Изучен видовой и штаммовый состав вирусов-возбудителей.

Установлено, что в открытом грунте томаты поражаются ВБТ, Щ'М, ВСЫ, ВАТ, УВК в одинарной и смешанной инфекцилх; в защищенном грунте - Щ'М.

3. Изучены свойства вирусов и описаны штаммы ВБГ,В1'М, ВСМ.

Установлено, что в условиях Молдовы на томатах ВШ' представлен двумя штаммами: ВСГ-1 - сильнопатогенный штамм - вызывает усыхание верхушки томатов и некротические кольцевые поранения плодов; ЗБГ-2 - среднепатогенный штамм - вызывает на листьях томатов бронзовый загар и некротические пятна, а на плодах - хлоротические кольцевые поражения.

В1М представлен двумя штаммами: зеленой мозаики и желтой мозаики с некротизацией листьев и стебля.

BGM представлен двумя штаммами: нитевидности и л.'.-.мротни-ковидности листьев и слабой мозаичности листьев.

4. Изучена вредоносность ВА1'. Получены новые данные но накоплении вируса в генеративных органах. Установлено, что BAI' на томатах способен накапливаться в большой концентрации в генеративных органах томатов, в частности, в клетках среднего слоя и тапетума тычинок. Это снижает количество образуемой пыльцы и повышает уровень ее стерильности, с чем связаны плохая завязывае-мость и бессемянность диодов.

5. Проведены исследования вирионов лабильных вирусов ШГ, ВШ и ВАТ на основании разработки метода фиксации их в тканях пораженных растений 2%-ным О в и б/К-ным глутаровым альдегидом.

Впервые в СССР описан ряд морфологических особенностей структуры вирионов ВБТ'.

6. Впервые в СССР испытаны и усовершенствованы метоДы им-цуномектронной микросколии для диагностики вирусов, поражающих томаты в Молдове,

Установлено, что метод декорирования позволяет: диагностировать вирусы в вегетативных органах томатов при выраженных сим .омах болезни в течение 15-20 мин; различать в смешанных инфекциях морфологически схожие серологически неродственные ви-

- 21 -

русы; изучать серологическое родство вирусов.

7. Результаты испытания методов иммуноэлектронйой микроскопии показали, что наиболее высокой чувствительностью обладает метод Деррика в сочетании с А-белком. Использование метода в нашей модификации позволило превысить чувствительность методов негативного контрастирования при тестировании ВАТ- в 240; ВШ-в 215; BIM - в 430; УВК - в 350 раз.

8. Усовершенствованы методы вирусологической экспертизы семян на зараженность Ш'М. Использован метод Деррика в сочетании с А-белком, позволяющий выявить локализацию вируса в семенах различной степени пораженности и в 12-ти дневных проростках.

9. Метод Деррика в сочетании с А-белком может быть использован для практической оценки различных методов обеззараживания семян.

Методические рекомендации

1. Для повышения эффективности инокуляции растений ВБТ, ВШ и BAIL' использовать в качестве стабилизатора буфер Онель-Кеглерл.

2. Для стабилизации вирионов лабильных вирусов, при изучении их морфологии in vitro использовать 30-ти минутную предварительную фиксацию инфицированных тканей растений: для BET - Zf«-ным CbCj, а для В(11 и ВАТ - 5%-ним глутаровым ачьдегидом.

3. Для быстрой диагностики ВБГ, ВТМ, ВШ, ВАТ и УВК в одинарной и смешанной инфекциях в соке томатов и других растений, содержащих вирус в достаточной концентрации для выявления обычными методами негативного контрастирования, применять метод декорирования с использованием диагностических антисывороток в разведениях близких к конечному.

4. Для выявления вирусов в низкой концентрации в тканях и семенах томатов методом Деррика в сочетании с А-белком в нашей модификации использовать: свежеприготовленную коллодиевую пленку-подложку; А-белок в концентрации 0,1 мг/мл; антисыворотки в разведениях 1:512-1:1024 и сеточки, покрытые антителами, инкубировать на вирусных суспензиях в течение 24 часов при температуре 4°С.

По материалам диссертации опубликованы следугяцие работы: I. Тертяк Д.Д. Изучение вирусных болезней томатов в Мол-давии//Фитопатогенные микроорганизмы культурных растений Молдавии .-Кишинев:Штиинца, 1981.-С.63-69.

2. Кирияк Г.Я., Тертяк Д.Д., Базелш 4.М., Кайсын Ф.Я. Вирусы табачной мозаики и мозаик;: томатов на растениях семейства пасленовых в 11олдаьии//Штаммы вирусов растений и их практическое и спольз овш ше.Тр.ЛСХА,вып Л9UI.-С.78-ö0.

3. Тертяк Д.Д.Метод фиксирования нестойких вирусов в тканях растений при негативном контрастировании // II Респ.научно-техническая конф.по электронной микросКопии:Тез.докл.-Кишинев,1981. -С. 133.

4. Тертяк Д.Д. | Кайсын Ф.Я. Шученио морфологии части вирусов бронзовости томатов и аспермии томатов.-Там ко.-С.134.

5. Вердаревская Т.Д., Тертяк Д.Д., Кирияк Г.Я. Индонтифика-ц/л фитопатогечнмх вирусов методом иммуноэлектронной микроскопии //XII Всесоюз.конф.по электронной микроскопии:Тез.докл.-М.,1982. -С.296.

6. Тертяк Д.Д. Иммуноэлектронная микроскопия как быстрый метод диагностики вирусов растений //Вирусные заболевания культурных растений Молдавии.-Кишинив:Штиинца, 1984. -С.130-142.

7. Тортяк Д.Д. .Базелюк Ф.М. Идентификация вирусов огуречной мозаики и аспермии томатов на томатах и перцах в Молдавии. -Там кв.-С.142-166.

8. Тертяк Д.Д., Букоряну В.В., Бршиан A.A. Морфологические особенности вируса бронзовости томатов // Ш Респ.научно-технича-ской конф.по электронной микроскопии.Тез.докл.-Кишинев, 1986. -C.Ii:?.

9. Букоряну В.В.,Тертяк Д.Д., Лупаа A.C. Влияние вирусов асиормии томатов и табачной мозаики на генеративные органы томатов //Лиаиолого-биохиипчесииа основы повышзния продуктивности и устойчивости растений. Материалы 1У Pacn.конф.физиологов и биохимиков Ыолд&вии.-Кишинев¡Штишща,1986.-С.II6-II7.

10. Букоряну В.В., Лулан A.C., Тертяк Д.Д. Влияние вирусной инфекции на ультраструктуру пестиков томатов.//.1зв.Ali МССР,сер. бнол.и хим.наук -1988.-» 3.-С.34-38, '

11. Дупан A.C., Тертяк Д.Д. Ультраструктура чашелистиков -томато* при смешанной инфекции¡//Удьтраструктура растений .'-Киев, 1988.-С.214.

12. Тертяк Д.Д. Использование иммуносорбентной электронной микроскопии в выявлении вируса табачной мозаики в семенах тома-гов//Вдишше фитопатогенов на репродуктивную систему растений-

-хозяев.-Кишинев, 1989.-С.87-97.

13. Твртяк Д.Д. Выявление и локализации вируса табачюП мозаики в семенах томатов// Теоретическая и прикладная карпология :Твз. докл. -Кипшюр, 1989. -С. 223.

о

ППЧ тгг ОСГМ. Я-т.Т'ЧР, Тир.ТПП. гмъпм Т.Яп.л. Усп.взл. 1,0 П..гг.. П0ЛП!!П"НП Т) ппчптъ Т/'Т.ТРТг.