Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутривидовой генетический полиморфизм русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Внутривидовой генетический полиморфизм русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii)"

1111111111111111111111

0034Б3979

На правах рукописи УДК 575.22:597.583.1

ТИМОШКИНА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

ВНУТРИВИДОВОЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ РУССКОГО ОСЕТРА {Ааретег gueldenstaedtii)

Специальность 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2009

Работа выполнена в Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (АзНИИРХ).

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Усатов Александр Вячеславович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Васецкий Сергей Григорьевич

доктор биологических наук, профессор

Асланян Марлен Мкртычевич

Ведущая организация: Кубанский государственный университет

Защита состоится "25" марта 2009 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета № Д002.238.01 Учреждения Российской академии наук Института биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова. Адрес: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26. Телефон: 8 (499) 135 33 22, факс: (499) 135-80-12, e-mail: idbras@bk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения РАН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан 24 февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук e-mail: ele0806@vndex.ru

Абрамова Б.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Русский осетр {Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833) относится к реликтовой группе хрящевых ганоидов, первые находки которых датируются верхнеюрским периодом (более 200 млн. лет). До недавнего времени вид был многочисленным в фауне внутренних водоемов Евразии (бассейнов Каспийского и Черного морей) и имел большое промысловое значение. На сегодняшний день, русский осетр, как и другие 24 представителя отряда Acipenseriformes, отнесен к группе редких видов и включен в Приложение II CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) (Raymakers, 2006). Катастрофическое снижение численности русского осетра в основном обусловлено интенсивным строительством гидротехнических сооружений, препятствующих проходу половозрелых особей к местам нереста, расположенным в верховьях рек. Кроме того, высокий спрос и цена на черную икру и товарную осетрину привели к чрезмерному вылову (Vaisman, Raymakers, 2001). Восполнение численности русского осетра в значительной мере осуществляется за счет искусственного воспроизводства на рыбоводных заводах. Так, например, в азовской популяции доля искусственно воспроизведенных рыб достигает 95% (Реков, 2000). В связи с этим мероприятия по поддержанию численности вида должны учитывать сохранение его устойчивости, в значительной мере обусловливаемой его генетической гетерогенностью, и, соответственно, требуют знаний об эволюционно сформировавшейся популяционной структуре вида. Внутривидовая систематика русского осетра остается до сих пор предметом дискуссий. Основываясь на поведенческих, экологических и меристических признаках, одни авторы подразделяют A. gueldenstaedtii на 3-4 географически изолированные формы с несколькими нерестовыми популяциями в каждой (Берг, 1948; Чугунов и др., 1964; Подушка, 2003), другие выделяют только популяции (Соколов, 2002; Vecsei, 2004). В современной систематике наряду с морфологическим анализом широко используются методы оценки генетического полиморфизма с помощью молекулярных маркеров. Ранее проведенные исследования русского осетра выявили высокий уровень полиморфизма белков крови (Субботкин, 1987) и митохондриальной ДНК (Birstein, 2000; Корниенко и др. 2003; Doukakis et al., 2005; Rastorguev et al., 2008). Высокая плоидность генома (Birstein et al.,

1997; Fontana et al., 2001), затрудняют анализ полиморфизма по ядерным маркерам. В литературе имеются данные по оценке полиморфизма некоторых видов осетровых рыб с помощью AFLP и микросателлитного (STR) анализа (Jenneckens et al., 2001; King et al., 2001; Congiu et al„ 2002; Zane et al., 2002; Welsh et al., 2003). Популяционная структура и полиморфизм русского осетра по этим параметрам изучены в меньшей степени.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование внутри- и межпопуляционного генетического полиморфизма русского осетра с помощью морфологического, а также молекулярно-генетического анализов с использованием методов RAPD, STR и ПЦР-идентификации митохондриальных гаплотипов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Исследовать уровень морфологической изменчивости азовской популяции русского осетра и сравнить с ранее опубликованными данными по изменчивости популяций Каспийского моря и северо-западной части Черного моря.

2. Изучить с помощью RAPD- и STR-маркеров внутри- и межпопуляционную генетическую изменчивость вида.

3. Определить тип наследования ряда известных микросателлитных (STR) маркеров в экспериментальных скрещиваниях русского осетра.

4. Оценить эффективность использования микросателлитных маркеров для определения популяционной принадлежности особей русского осетра.

5. С целью определения частоты встречаемости "baerii-like" митотипа провести широкомасштабный скрининг трех (каспийской, азовской и черноморской) популяций русского осетра.

Научная новизна полученных результатов. Впервые с помощью морфологических и молекулярно-генетических маркеров проведен сравнительный анализ изменчивости трех популяций русского осетра (азовской, каспийской и западно-черноморской). Исследована частота встречаемости митохондриального маркера («baerii-like» гаплотип) в азовской и черноморской популяциях. Для этих популяций определена также временная динамика частот встречаемости изученных митохондриальных гаплотипов. Предложена экспериментально обоснованная методика

популяционной идентификации особей русского осетра с использованием базы аллельных частот БТЯ-локусов. Получены молекулярно-генетические доказательства микроэволюционных процессов дивергенции черноморской и каспийской популяции с последующим отделением азовской популяции.

Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют важное значение для изучения эволюционной систематики и филогении рода Ааретег и вида Л с ¡ре те г ¡гиеЫетКхк'й. Предложен набор генетических маркеров, который используется для индивидуальной паспортизации половозрелых особей русского осетра на осетровых рыбоводных заводах Каспийского бассейна. Выявленная временная динамика частот «сибиреподобного» («Ьаеги-Нке») гаплотипа мтДНК и популяционных частот БТЯ-аллелей может быть использована для более корректной оценки промыслового возврата особей русского осетра при искусственном воспроизводстве осетровых в Азовском бассейне.

В ходе выполнения экспериментальной части работы для постановки индивидуальных скрещиваний был создан лабораторный стенд для инкубации икры рыб, который зарегистрирован 27.05.2007 в Госреестре полезных моделей РФ (патент № 63172). Был предложен способ иммобилизации образцов очищенной ДНК, предусматривающий ее выделение, очистку и заключение в защитную оболочку для длительного хранения, что позволяет оптимизировать работу с тканевыми и ДНК-содержащими пробами (дата приоритета 14.11.2007).

Материалы диссертации включены в состав учебных материалов для занятий студентов биолого-почвенного факультета ЮФУ по курсам «Генетика» и «Теория эволюции», а также по специальным курсам кафедры генетики.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002); Международной научной конференции «Проблемы естественного и искусственного воспроизводства рыб в морских и пресноводных водоемах» (Ростов-на-Дону, 2004); Международном семинаре «Современные технологии мониторинга и освоение природных ресурсов южных морей России» (Ростов-на-Дону, 2005); I Международной конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2006); II

Международной рабочей встрече «Identification of Acipenseriformes Species in Trade» (Берлин, 2006); Международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем» (Ростов-на-Дону, 2006); III Научно-практической конференции «Экологические проблемы. Взгляд в будущее» (СОЛ «Лиманчик», 2006); Съезде Украинского общества генетиков и селекционеров, посвященном 120-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Алушта, 2007); IX Съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Гомель, 2007); Конференции «Вавиловские чтения - 2007» (Саратов, 2007); Международном симпозиуме «Структура и функционирование естественных и антропогенных экосистем» (Кишинев, 2008); II Международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Международной конференции «Генетика, селекция, гибридизации, племенное дело и воспроизводство рыб» (Санкт-Петербург, 2008); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008).

Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 6 в журналах перечня ВАК, 10 тезисов докладов на международных конференциях, получено 2 патента.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 32 рисунка и 27 таблиц. Список цитируемой литературы включает 154 источника.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему руководителю A.B. Усатову за внимательное и конструктивное руководство, Н.С. Мюге за неоценимую помощь в работе, при обсуждении диссертации. Также автор выражает благодарность группе исследователей, оказавших содействие в сборе материалов для настоящей работы: сотрудникам АзНИИРХ Ю.И. Рекову, Д.А. Подойницину, H.A. Небесихиной, А.Е. Барминцевой (ВНИРО, г. Москва), А.Н. Михайлюку и А.К Чащину (ЮгНИРО, г. Керчь, Украина), В.Ю. Шевченко и И.М. Чурай (ДОРЗ, г. Херсон, Украина).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом настоящего исследования был русский осетр Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833. Использовали особей из трех популяций (азовской, каспийской, черноморской), выловленных в 1999-2005 гг. в северо-западной акватории Черного моря (86 экз.), в Азовском море (92 экз.), а также в северной части Каспийского моря (360 экз.). Для молекулярно-генетических исследований прижизненно отбирали и фиксировали в 96%-ом этаноле тканевые пробы плавников рыб. Использовали также спилы первого луча грудного плавника особей из коллекции ихтиологических сборов АзНИИРХ, проводившихся в Азовском и Черном морях в период с 1960 по 1971 гг.

Для определения характера наследования STR-маркеров были поставлены экспериментальные скрещивания между произвольно отобранными родительскими парами русского осетра азовской популяции. Полученное потомство инкубировали до стадии перехода личинок на активное питание строго по семьям с использованием оригинального лабораторного стенда. Работы проводили на базе ФГУ «Ачуевский ОРЗ» (Краснодарский край) в 2006 г.

Морфометрический анализ проводили по признакам, общепринятым в систематике осетровых рыб: определяли число лучей в спинном плавнике (D), число лучей в анальном плавнике (А), число жаберных тычинок (GR), количество спинных жучек (DS), количество боковых жучек (LS), количество брюшных жучек (VS), длину головы (С), абсолютную длину тела (AL) (Vecsei et al., 2004). В сравнительный межпопуляционный анализ включены результаты аналогичных измерений рыб каспийской и черноморской популяций из работ Берга (1948) и Подушки (2003).

Тотальную ДНК выделяли из фрагментов плавников методом солевой экстракции (Aljanabi and Martinez, 1999), с нашими модификациями для экстракции ДНК из архивных спилов лучей плавника.

RAPD-анализ. В предварительных экспериментах из 30 случайных олигонуклеотидов, различающихся по размеру и содержанию GC-nap, мы отобрали пять праймеров, при использовании которых были получены четкие, стабильно воспроизводимые, полиморфные спектры (рис. 1): ОРА-05 (5' - AGGGGTCTTG-3'), ОРА-07 (5 '-GA A ACGGGTG-3'), ОРВЗ (5'-CATCCCCCTG-3'), ОРВ11 (5'-GTAGACCCGT-3'), Р8 (5'-

CCTGACCAGGCACTGGCAGA-3'). ПЦР проводили в стандартных условиях (Зеленина и др., 2006). Продукты амплификации фракционировали методом электрофореза в 6%-ом ПААГ. Полученные RAPD-профили представляли в виде общей бинарной матрицы типа «объект-признак» с помощью программы Phoretix ID Database ("Nonlinear Dynamics", Великобритания).

Анализ микросателлитной ДНК (STR). Анализ проводили методом, первоначально разработанным для видов A. naccarii (Zane et al., 2006), A. fulvescens (Welsh et al., 2003) и A. oxyrinchus (King et al., 2001) по четырем микросателлитным локусам: An20, Afug41, Afug51, AoxD165. Условия проведения ПЦР были оптимизированы для исследуемого вида A.gueldenstadtii. ПЦР-продукты фракционировали в денатурирующем ПААГ согласно (Muyzer and Smalla, 2003).

Статистическая обработка данных. Учитывая доминантную природу RAPD-локусов и тетраплоидность исследованного вида, рассчитывали частоту рецессивного нуль-аллеля q), несмещенную оценку гетерозиготности Н) и ее дисперсию Var(H'j) согласно Хедрик (2003), Токарская и др. (2000). Эффективную численность популяции определяли вычислением с использованием экспериментально определенных параметров по предложенным нами формулам.

Частоту аллелей микросателлитных локусов р, рассчитывали разработанным нами методом кумулятивного «минус-аллеля». Для проверки эффективности микросателлитного анализа для определения популяционной принадлежности особи проводили "assignment test" (Hansen и др., 2001). FSt -статистику Райта (Хедрик, 2003), генетическое расстояние D по Нею (Nei, 1972,) вычисляли с помощью программы Arlequin 3.0. (Excoffier et al., 2005). Достоверность различий средних значений оценивали с помощью F-критерия Фишера, /-критерия и (Lewontin, 1972; Хедрик, 2003).

Определение митотипов: «baerii-Iike» (BL) и «русский» (GUE). BL и GUE митотипы определяли с помощью метода видовой идентификации осетровых рыб, предложенного в работе Мюге и др. (2008).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Морфологический полиморфизм популяций русского осетра.

Результаты морфометрического анализа азовской популяции в сравнении с каспийской и черноморской приведены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика популяций А. ^иеМет1айт по морфометрическим показателям

Показатель Популяции

Каспийская Азовская Черноморская

Число лучей в спинном плавнике(Б) среднее значение 41,0 35,7 36,3*

пределы 33-51 27-41 3(МЭ

Число лучей в анальном плавнике(А) среднее значение 25,8 21,9 23,9

пределы 21-33 18-25 20-28

Число жаберных тычинок (вЯ) среднее значение 23,5 21,5 21,8

пределы 19-29 16-26 17-27

Кол-во спинных жучек (ОБ) среднее значение 12,1 11,9 12,0

пределы 9-18 8-15 9-15

Кол-во боковых жучек (ЬБ) среднее значение 39,0 30,5 34,2

пределы 30-50 25-36 27-38

Кол-во брюшных жучек (УБ) среднее значение 9,8 9,6 9,6

пределы 7-12 8-11 7-12

Отношение длины головы к абсолютной длине тела (С/АЬ), % 18,1 16,4 17,5

Примечание: жирным шрифтом выделены показатели, имеющие промежуточные значения при сравнении трех популяций. Значения показателей каспийской и черноморской популяции приводятся по (Берг, 1948; Подушка, 2003).

Самая большая из трех по численности каспийская популяция обладает большим размахом изменчивости по всем изученным признакам. По большинству морфометрических показателей черноморская популяция занимает промежуточное положение по отношению к каспийской и азовской выборкам (табл. 1). Сравнительный анализ, проведенный на основании данных многолетнего мониторинга размерно-возрастного состава азовской

популяции и средних показателей размеров разных возрастных групп каспийской и черноморской популяций, выявил, что азовская популяция характеризуется достоверно более интенсивной скоростью роста (Г - 0,93 и 1,10, соответственно,;) < 0,05).

Сравнительная межпопуляционная оценка средних значений данных морфометрии, проведенная с помощью /•'-критерия Фишера, выявила существенное различие только между азовской и каспийской популяциями по единственному морфометрическому показателю - количеству лучей в спинном плавнике (Б). Таким образом, полученные результаты показывают, что на практике использование классической морфометрии для идентификации популяционной принадлежности особей неэффективно.

Межпопуляционные различия русского осетра по ИАРО-маркерам. Пример ЯАРО-профилей, полученных для двух нерестовых популяций (каспийской и азовской) русского осетра, приведен на рис. 1.

ы

: ; I |i«i *

IW 1Яяя

!

М№| МН

(яИ'1Н1в11У§

¡щ

i 1, 1

В ¡И ÍH 111

• -j -I ( 1 •• i Г - ' : I ■ I •

I —-1 >-ва с -i I—I ».-I t¡~i I—'Ч С» М ■" -=5 И ...

Штття и !■*•)- лг; u> jui *.

I - i ■ М ~< h —-4 i .1 ....... . ------ • ■ . • -4 > •

^f W-j i-J !— ■ ■ «

' *r 4 1 * """"" '"" "Щ í.....<4 Щт fo'iiiKffj ш |щ |l|i |&U4

á fessl wd}

4 > * -

L,... . | ntf 11/ i......11 '........ ч ........ * . ..-..w i.-.™--.' a

-ií-JUJ — ■■—»■ ........... Ь—» *>.!.. «

Рис. 1. Электрофореграмма RAPD-фрагментов русского осетра по праймеру 0РА07. 1-8 - особи азовской популяции, 9-16 - особи каспийской популяции, L - маркер молекулярной массы ДНК X/PstI (Fermentas).

Размеры проанализированных RAPD-фрагментов варьировали от 250 до 1000 пн. Общее количество RAPD-фрагментов по пяти использованным

праймерам составило 295, из которых 22 являются мономорфными и, при сравнении с ЯАРО-профилями севрюги и стерляди, видоспецифичными. Среднее количество фрагментов на особь варьировало от 23,2 (ОРА-05) до 30,5 (ОРА-07). Анализ генетической изменчивости выборок русского осетра из азовской популяции, относящихся к поколениям 1978-1983 гг. и 1993— 2000 гг., показал недостоверность различий (средние значения гетерозиготности - Н'] 0,355+0,135 и 0,316+0,137, соответственно), что свидетельствует об отсутствии в популяции временного тренда.

Сравниваемые выборки каспийской и азовской популяций в целом имеют высокий уровень полиморфизма (табл. 2). Кластерный анализ (иРвМА), проведенный на основании ЯАРО-спектров, не выявил межпопуляционных различий. На фоне высоких значений внутрипопуляционного полиморфизма (Я/, Р) уровень межпопуляционной дифференциации оказался также недостоверным (Р5Т= 0,011).

Таблица 2. Показатели изменчивости анализируемых групп русского осетра по КАРЭ-локусам, полученным с помощью пяти праймеров

Популяции Среднее значение я) 1- критерий (Р<0.001) Уровень полиморфизма Р,% Среднее значение гетерозиготности Я/ Дисперсия Уаг (1ф

Азовская 0,813 5,809 92,3 0,379 0,060

Каспийская 0,799 93,6 0,396 0,059

Результаты ЛАРО-анализа использовали для расчета эффективной численности популяций. Оказалось, что для сохранения с 99%-ой вероятностью наиболее редкого КАРО-аллеля 0,016) количество

производителей, отбираемых для искусственного воспроизводства русского осетра, должно быть не менее 205.

Анализ наследования вТК-маркеров русского осетра. Нами получены результаты анализа распределения генотипов в четырех экспериментальных скрещиваниях русского осетра. Согласно полученным данным во всех вариантах скрещивания распределение комбинаций аллелей и их частоты у потомства соответствуют тетрасомному типу наследования (достоверность различий оценена с помощью критерия %2). Пример

наследования аллелей в экспериментальном скрещивании представлен на рис. 2.

Неполное совпадение опытного и ожидаемого распределения в отдельных случаях наиболее вероятно вызвано ограниченностью размеров выборки потомства. Учитывая менделеевские закономерности, распределение аллельных частот в р! было использовано для уточнения генотипа гетерозиготных тетраплоидных родителей.

СВСВО х с^АВОЕ

ИШЕ ЛВШ) БШ)Е ВШЕ ВСВЕ ЛИВЕ Ш АП0Е ЫШЕ ВШЕ ШЕ СОВЕ АОЮ АВОО АВО)

^ *....... "А &*»»»* Ь л » ..1,1^

^ .....^ фивяш ■ ■ ^„„^„„и ^ вм***^ %тиш*

£■■* 0тя Ц*яй £¡¡5» I......."» ИМ (¡¡Я^*™"- ЬйЗ I..... 45Я 523 1555» — »>"•-*

Рис. 2. Тетрасомный характер наследования в микросателлитном локусе ААщ41. Генетический анализ экспериментального скрещивания $ВСОО х б АБЭЕ (в центре) и генотипы полученного потомства (указаны для каждого Р1). Каждый потомок наследует два любых аллеля одного родителя, и два другого в случайной комбинации.

Межпопуляционные различия русского осетра по 8ТЯ-локусам.

Данные микросателлитного анализа трех популяций русского осетра по четырем локусам представлены в табл. 3 и на рис. 3.

Анализ БТЯ-спектров выявил в исследованной выборке в среднем более семи аллелей на локус. Все локусы оказались полиморфными. В сумме у проанализированных особей (п=540) в четырех локусах выявлено 74 аллеля. Число аллелей на локус в среднем варьировало от 11,5 (АохЭ165) до 17,5 (Айщ51). Каждая из исследованных популяций имела набор аллелей, достоверно различающихся по частотам (р<0.01). Исключение составил локус Аох0165, по которому не выявлено различий между каспийской и азовской популяциями.

0,6

0,4

Ап20

|1 1п А * / * * *

1.6-1.1 ' й ''Л [Я» -А от

0,3 и 0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 -О -

0,35

0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 -0 --0,05 -

0,7 -,

0,6 -

0,5 -

0,4 -

0,3 -

0,2 -

0,1 -

0 -

АН)д41

.Й. .Й-

кмМАЫ

смсмсмсмсмсммсмсмсмсмсмсм

АЛ|д51

£

к

с\|

(ОСМОЭ^ОСОСМСО^ОЮСМСО^-ОСОСО СЧС\|СЧ|С\|С\|СЧСЧСЧ|С\|СЧ|СЧ|СЧ|С\|СЧСЧ<\|т-

Аох0165

^¡^у Л к

3 8

И каспийская

□ азовская

и черноморская

Рис. 3. Распределение частот аллелей микросателлитных локусов в популяциях русского осетра. По осям абцисс - размеры аллелей, пн; по осям ординат - аллельные частоты, выраженные в долях с обозначением 95%-ных доверительных интервалов.

Таблица 3. Значения показателей межпопуляционной изменчивости русского осетра по микросателлитным локусам

Локус Число аллелей Гетерозиготность наблюдаемая, Н0 Гетерозиготность ожидаемая, НЕ Коэффициент внутри выборочный

Азовская популяция

Ап 20 11 0,940 0,969 0,033

ААщ41 15 0,986 0,998 0,010

АЙ1Й51 13 0,730 0,999 0,267

АохО 165 10 0,911 0,957 0,035

Среднее значение 0,892 0,096

Каспийская популяция

Ап 20 13 0,971 0,971 -0,000

А&я 41 23 0,995 0,999 0,005

АШЙ51 18 0,837 0,998 0,155

АохО165 16 0,962 0,992 0,027

Среднее значение 0,941 0,046

Черноморская популяция

Ап 20 14 0,871 0,944 0,068

АШЙ 41 15 0,971 0,997 0,025

АПщ51 20 0,885 0,998 0,108

АохО 165 9 0,796 0,934 0,080

Среднее значение 0,881 0,109

Значения наблюдаемой гетерозиготности (Н0) по микросателлитным локусам близки к ожидаемым (НЕ) в каспийской выборке и несколько занижены в азовской и черноморской (табл. 3). Наибольшее аллельное разнообразие по всем локусам выявлено в каспийской выборке. В результате тестирования данных микросателлитного анализа на соответствие равновесию Харди-Вайнберга в черноморской и азовской популяциях был выявлен дефицит гетерозигот (Р15 > 0). В азовской популяции снижение гетерозиготности, возможно, вызвано дрейфом генов, поскольку анализировали выборки, усредненные по многим генерациям. Каждое поколение формировалось искусственно относительно небольшим числом особей, используемых в качестве производителей на осетровых рыбоводных заводах. Этот же эффект вероятен и для черноморской выборки. Кроме того, так как она представлена двумя нерестовыми субпопуляциями - днепровской

и дунайской, то в данном случае может иметь место эффект Валунда, характерный для выборок из генетически подразделенных популяций (Алтухов, 1997).

Таблица 4. Матрица значений FSt (в верхней правой части таблицы) между выборками русского осетра и результаты вероятностного теста р на значимость различий (в левой нижней части таблицы)

Каспийская Азовская Черноморская

Каспийская - 0,070 0,058

Азовская 0,00024 _ 0,043

Черноморская 0,00293 0,06641 -

Высокая вариабельность внутри популяций и тетраплоидная природа локусов определила небольшой уровень межпопуляционной изменчивости русского осетра (1,9 %). Тем не менее, полученные значения генетических расстояний Р<;Т для каждой пары исследованных групп достоверно значимы (табл. 4). При этом межпопуляционные генетические различия в 4 - 7 раз превышают межгодовые различия между поколениями в азовской популяции.

Выявленное распределение аллельных частот в каждой популяции русского осетра было использовано для оценки эффективности популяционной идентификации особей. Для этого использовали выборки, полностью состоящие из особей одной популяции. Для каждой особи на основании наблюдаемого распределения аллельных частот в четырех локусах рассчитывали вероятность принадлежности к каждой из трех популяции. Наибольший показатель вероятности определял особь в соответствующую популяцию. В среднем, доля особей, принадлежность которых была определена корректно, составила 86%. Максимальная точность определения рассчитана для черноморской популяции - 96%, для каспийской популяции этот показатель составил 86%, для азовской - только 67%.

Следует отметить, что точность идентификации зависит от общего числа признаков (в нашем случае - аллелей). Ранее в исследовании популяционной принадлежности нерки по БТЯ-маркерам было показано, что для достижения 80%-ной точности необходимо проанализировать не менее

80 аллелей (Beachem et al., 2002). Кроме того, разрешающая способность микросателлитного анализа зависит от степени полиморфизма локусов. В работе исследовали высокополиморфные маркеры. Для повышения корректности идентификации особей азовской популяции следует увеличить количество STR-локусов.

Определение BL и GUE митотипов. Ранее было показано, что около трети особей русского осетра из Каспийского моря имеют гаплотип, четко отличающийся от мтДНК, типичной для этого вида (Jenneckens и др., 2000; Мюге и др., 2008), и характеризующийся высокой гомологией с мтДНК сибирского осетра (A.baerii). По аналогии с латинским наименованием вида этот митотип был обозначен как "baerii-like"(BL). Мы провели массовый скрининг по данному митохондриальному маркеру и видоспецифичному для русского осетра GUE-митотипу в выборках трех популяций (табл. 5).

Таблица 5. Количество особей с митотипами «baerii-like» (BL) и видоспецифичным (GUE) в популяциях русского осетра

Кол-во Кол-во особей с Кол-во особей с

Популяции исследо- видоспецифичным «baerii-like» (BL)

ванных (GUE) митотипом митотипом

особей абсолютное % абсолютное %

Каспийская 527 362 68,69 165 31,31

Азовская (генерации 1931-1956 гг.) 102 102 100,00 0 0,00

Азовская (генерации 1980-2005 гг.) 759 745 98,12 14 1,88

Черноморская (генерации 19451970гг.) 163 163 100,0 0 0,00

Частота встречаемости ВЬ-особей в каспийской популяции была близка ранее показанной и составила 31%. В черноморской выборке во всех исследованных образцах ВЬ-митотип отсутствовал. В азовской популяции из 759 исследованных рыб идентифицировано 14 ВЬ-особей. Для определения происхождения ВЬ-митотипа в Азовском море дополнительно были проанализированы выборки из полностью сменившихся поколений азовской и черноморской популяций, относящихся к генерациям естественного нереста. В этих группах ВЬ- маркер не обнаружен (табл. 5).

В настоящее время русский осетр обитает в пределах морей, весьма различающихся по экологическим особенностям, а его внутривидовая дифференциация связана с эволюцией трех морей. Известно существование в конце плейстоцена распресненного водоема, располагавшегося в Азово-Черноморском бассейне, связь которого со Средиземным морем прекратилась вследствие падения уровня Мирового океана 15-40 тыс. лет назад (Федоров, 1978; Свиточ и др., 1999). Азовское море в этот период исчезало и превращалось в низменную долину, пересекаемую рекой Дон. Отсутствие ВЬ-митотипа в черноморской популяции свидетельствует о незначительности или отсутствии миграции русского осетра из Каспийского моря в бассейн Черного моря по существовавшему непродолжительное время в конце ледникового периода Кумо-Манычскому водосбросу. Последовавшая затем трансгрессия Черного моря, вызванная прорывом средиземноморских соленых вод через Босфор, и появление вследствие подъема уровня вод Азовского моря позволили сформироваться азовской популяции русского осетра из части черноморской популяции и закрепили изоляцию популяций русского осетра в северо-западной части Черного моря и в Азове.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании анализа результатов исследований можно высказать предположение, что дивергенция каспийской и черноморской популяций русского осетра предшествовала отделению азовской популяции, что объясняет промежуточное положение черноморских особей, как по морфометрическим показателям (табл. 1), так и по данным микросателпитного анализа (рис. 3).

Данные о распространении митохондриального ВЬ-маркера (табл. 5) в современных популяциях и отсутствие его в Черном море позволяют сделать предположение о том, что появление осетров с ВЬ-митотипом в Азовском море вероятнее всего произошло в 20 веке, когда проводилась интродукция каспийский осетровых в Азовское море (Реков, 2000), что подтверждается отсутствием маркера в выборке азовского осетра до 1960-х годов (до начала планомерного вселения осетра из Каспия).

Таким образом, генетическая структура русского осетра отражает историю формирования современного ареала вида, процессы расселения и изоляции его локальных популяций, вследствие геологических

преобразований внутриевразийских водоемов. В то же время, появление осетров с ВЬ-митотипом в азовской популяции связано с началом интродукции каспийских осетровых в Азовское море. Данные микросателлитного анализа свидетельствуют о наименьшем уровне генетической изменчивости азовской популяции, испытывающей на протяжении последнего столетия наибольшее антропогенное давление.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ трех популяций русского осетра свидетельствует о высокой внутривидовой изменчивости основных морфометрических характеристик русского осетра, на фоне которых азовскую популяцию отличают пропорции головы (С/АЬ) и более интенсивная скорость роста, каспийскую - больший полиморфизм по всем изученным признакам.

2. Результаты анализа геномной ДНК по ЯАРВ- и БТЯ-маркерам подтверждают высокий внутрипопуляционный полиморфизм русского осетра. По результатам БТЯ-анализа генетическое расстояние, определенное для азовской и каспийской популяций несколько выше (Р5т=0,070), чем генетические дистанции, отделяющие черноморскую от каспийской и азовской (Р5т=0,058 и 0,043 соответственно).

3. С помощью микросателлитного анализа родительских пар и поколения Рь полученного в результате экспериментальных скрещиваний, определен тетрасомный тип наследования использованных в работе БТЯ-маркеров.

4. Исследованные маркеры микросателлитной и митохондриальной ДНК позволяют с высокой точностью определять принадлежность особей русского осетра к каспийской и черноморской популяциям (точность определения по данным БТЯ анализа - 86 и 96% соответственно).

5. Распределение частот встречаемости "Ьаеги-Нке" маркера митохондриальной ДНК дифференцирует популяции русского осетра. Обнаружение ВЬ-маркера мтДНК в Азовском море и данные микросателлитного анализа свидетельствует об изменениях в сложившейся популяционной структуре и генном разнообразии русского осетра уже в исторический период в результате искусственного воспроизводства и интенсивного рыболовства.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Воинова Н.В., Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Олейникова Н.Л., Соколова И.В., Брень А.Б. ДНКазная активность гомогенатов метаболически активных тканей русского осетра Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseridae) как показатель пригодности тканей для генетического коллекционирования // Вопросы ихтиологии. 2001. Т. 41. № 6. С. 842-845.

2. Корниенко И.В., Войнова Н.В., Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Вечканов Е.М., Петров А.В. Полиморфизм первичной последовательности сегмента гена цитохрома b митохондриальной ДНК азовской популяции Acipenser gueldenstaedtii // Вопросы ихтиологии. 2003. Т. 43. № 1. С. 73-77.

3. Черенкова И.Ф., Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Соколова И.В. Интенсивность свободнорадикальных процессов в гомогенатах метаболически-активных тканей русского осетра Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseridea) как показатель пригодности тканей для генетического коллекционирования // Вопросы ихтиологии. 2003. Т. 43. № 1. С. 142-144.

4. Voynova N.V., Mirzoyan A.V., Timoshkina N.N., Rynza E.T. Occurrence of non-native specimens of Caspian origin within the Sea of Azov population of the Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii) II J. Appl. Ichthyol. 2008. V. 24. P. 50-51.

5. Чистяков B.A., Тимошкина H.H., Рынза E.T., Мирзоян А.В., Войнова Н.В. RAPD анализ генетического разнообразия азовской популяции севрюги (Acipenser stellatus) и русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) II Вопросы рыболовства. 2008. Т 9. №4 (36). С. 797-801.

6. Тимошкина Н.Н., Барминцева А.Е., Усатов А.В., Мюге Н.С. Внутривидовой генетический полиморфизм русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) И Генетика. 2009. № 9.

Патенты:

7. Небесихина Н.А., Тимошкина Н.Н. Патент № 63172. Лабораторный стенд для инкубации икры рыб. Зарегистрировано в Госреестре полезных моделей РФ 27.05.2007.

8. Чистяков В.А., Мирзоян А.В., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т. Способ хранения ДНК. Заявка № 2007142152/13(046147) от 20.10.2008. Дата приоритета 14.11.2007.

Статьи в сборниках научных трудов и конференций:

9. Рынза Е.Т., Тимошкина H.H., Мухоньков М.М. Видовая идентификация археологического материала осетровых рыб с помощью метода полимеразной цепной реакции // Сб. науч. тр. АзНИИРХ (20042005гг.)- Ростов-на-Дону: «МедиаПресс». 2006. С.289-292.

10. Тимошкина H.H., Небесихина H.A. Сравнительный анализ морфометрических показателей современной азовской популяции русского осетра // Сб. науч. тр. АзНИИРХ (2006-2007гг.) - Ростов-на-Дону: «МедиаПресс», 2008. (в печати).

11. Тимошкина H.H., Рынза Е.Т. Исследование влияния интродукции на генетическую структуру азовской популяции Acipenser gueldenstadtii // там же.

12. Тимошкина H.H. Идентификация «сибирского» митотипа в азовской популяции русского осетра // Материалы Межд. науч. конф. «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем». Ростов-на-Дону, 9-12 октября 2006 - Ростов-на-Дону: 2006. С. 424-425.

13. Тимошкина H.H., Рынза Е.Т., Усатов A.B. ДНК-идентификация "baerii-like" митотипа в азовской популяции русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) // Сб. науч. тр. Съезда Украинского общества генетиков и селекционеров «Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии» - Киев: Логос. 2007. Т.1. С.326-329.

14. Тимошкина H.H., Усатов A.B. Исследование полиморфизма микросателлитных локусов русского осетра // Сб. науч. тр. IX Съезда Белорусского общества генетиков и селекционеров, Гомель, Республика Беларусь 2-5 окт. 2007 - Минск: 2007. С 134-135.

15. Тимошкина H.H., Усатов A.B. Наследование микросателлитных маркеров у русского осетра (Acipenser gueldenstadtii) // Мат. конф. «Вавиловские чтения - 2007». Саратов, 26-30 ноября 2007- Саратов: Научная книга. 2007. 4.1. С.344-347.

16. Мирзоян A.B., Горбачева Л.Т., Тимошкина H.H., Чихачева В.П. Биологические основы сохранения русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) азовской популяции // Материалы Второй Межд. научно-практ. Конф. «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». Москва, 26-27 ноября 2008 - М.: изд-во ВНИРО. 2008. С. 206-208.

17. Тимошкина H.H., Барминцева А.Е., Мюге Н.С., Усатов A.B. Анализ генетического полиморфизма русского осетра (Acipenser gueldenstadtii) с помощью маркеров ядерной и митохондриальной ДНК // Мат. II Межд. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» Ростов-на-Дону, 8-10 октября 2008 г. - Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ. 2008. -С.79-81.

Тезисы докладов научных конференций:

18. Войнова Н.В., Тимошкина H.H., Чистяков В.А., Барминцев В.А., Абрамова А.Б., Чудинов О.С. Генетическая паспортизация производителей осетровых рыб // Тез. докл. междунар. конф. «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах». Москва, 27-29 мая 2002 -М.:МАКС Пресс. 2002. С. 91.

19. Чистяков В.А., Барминцев В.А., Тимошкина H.H., Рынза Е.Т. Количественный анализ генетических параметров азовской популяции русского осетра на основе RAPD маркеров // Тез. докл. междунар. конф. «Проблемы естественного и искусственного воспроизводства рыб в морских и пресноводных водоемах». Ростов-на-Дону, 9-10 июня 2004 - Ростов-на-Дону: изд. ООО «ЦВВР». 2004. С. 148-150.

20. Чистяков В.А., Тимошкина H.H., Рынза Е.Т., Мухоньков М.М., Мирзоян A.B. Использование RAPD-ПЦР для оценки генетического разнообразия азовских популяций русского осетра и севрюги // Тез. докл. межд. сем. «Современные технологии мониторинга и освоение природных ресурсов южных морей России» - Ростов-на-Дону: изд. ООО «ЦВВР». 2005. С. 161-163.

21. Тимошкина H.H. Исследование микросателлитных локусов производителей русского осетра // Сбор. тр. 111 научно-практ. конф. «Экологические проблемы. Взгляд в будущее». СОЛ «Лиманчик», 4-7 сентября 2006 - Ростов-на-Дону: 2006. С.209-210.

22. Мирзоян A.B., Тимошкина H.H., Рынза Е.Т., Чистяков В.А. Генетическое разнообразие азовских популяций русского осетра и севрюги: мониторинг и сохранение при искусственном воспроизводстве // Тез. 1-ой Межд. конф. «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». Москва, 1-2 ноября 2006 - М.: изд-во ВНИРО. 2006. С 87.

23. Voinova N., Timoshkina N., Myrzoyn A., Rynsa E. Preliminary results on identification of Russian Sturgion (Acepernser gueldenstaedtii) individuals of the Caspian origin in Asov sea // 2ndWorkshop. Identification of Acipenseriformes Species in Trade. 29 Sept.-l Oct. 2006. Berlin. - 2006. P. 22.

24. Тимошкина H.H., Рынза E. Т., Мирзоян А. В., Усатов А. В. Использование маркера мтДНК для оценки внутривидового полиморфизма русского осетра (Acipenser gueldenstaedti) // Сб. науч. тр. IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11 -15 мая 2008. С.272.

25. Тимошкина H.H., Небесихина H.A. Сравнительный анализ морфометрических показателей современной азовской популяции русского осетра // Межд. симп. «Структура и функционирование естественных и антропогенных экосистем». Кишинев, 18 августа 2008. С. 121.

26. Тимошкина H.H., Усатов A.B. Молекулярно-генетическая идентификация русского осетра (Acipenser gueldenstadtii) в условиях искусственного воспроизводства // Тез. докл. Межд. конф. «Генетика, селекция, гибридизации, племенное дело и воспроизводство рыб». С-Пб. 1012 сентября 2008.-С.77.

27. Тимошкина H.H., Мирзоян A.B., Рынза Е.Т. Использование маркера мтДНК для оценки влияния интродукции на генетическую структуру азовской популяции русского осетра // там же. - С. 118-119.

Список сокращений:

пн - пары нуклеотидов;

ОРЗ - осетровый рыбоводный завод;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПААГ - полиакриламидный гель;

BL - «baerii-like» митотип;

GUE - «gueldenstadtii» митотип;

AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism;

STR - Short Tandem Repeats;

RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л.

Заказ №1151. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимошкина, Наталья Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Особенности биологии и среды обитания русского осетра

1.1.1 Морфологические и анатомические признаки вида

1.1.2 Характеристика ареала обитания популяций

1.1.3 Происхождение вида

1.2 Внутривидовая изменчивость и её анализ

1.2.1 Морфометрические маркеры

1.2.2 Биохимические маркеры

1.2.3 Молекулярно-генетические маркеры

1.2.3.1 Случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD)

1.2.3.2 Анализ полиморфизма длины амплифицированных 29 фрагментов (AFLP)

1.2.3.3 Анализ микросателлитной ДНК (STR)

1.2.3.4 Анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP)

1.2.3.5 Анализ полиморфизма митохондриальной ДНК

1.3 Принципы формирования ДНК-коллекций

1.4 Особенности генетического анализа осетровых рыб

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объект исследования

2.2 Отбор проб

2.3 Морфометрические измерения

2.4 Определение возраста рыб

2.5 Постановка экспериментальных скрещиваний

2.6 Молекулярно-генетические методы

2.6.1 Экстракция тотальной ДНК

2.6.2 RAPD-анализ

2.6.3 Микросателлитный анализ (STR) ядерной ДНК

2.6.4 Определение «baerii-like» (BL) и «gueldenstaedtii» (GUE) 65 митотипов

2.7 Статистический анализ данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Исследование внутри- и межпопуляционного морфологического 69 полиморфизма русского осетра.

3.2 Генетический полиморфизм русского осетра по ДНК-маркерам

3.2.1 Внутри- и межпопуляционная изменчивость русского осетра 79 по RAPD-маркерам

3.2.2 Наследование микросателлитных маркеров в F

3.2.3 Внутри- и межпопуляционная изменчивость вида по STR- 92 маркерам

3.2.4 Определение «baerii-like» (BL) и «gueldenstaedtii» (GUE) 102 митотипов в природных популяциях русского осетра

3.3 Индивидуальная идентификация популяционной 105 принадлежности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутривидовой генетический полиморфизм русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii)"

Русский осетр (Acipenser gaeldenstaedtii Brandt, 1833) относится к реликтовой группе хрящевых ганоидов, первые находки которых датируются верхнеюрским периодом (более 200 млн. лет). До недавнего времени вид был многочисленным в фауне внутренних водоемов Евразии (бассейнов Каспийского и Черного морей) и имел большое промысловое значение. На сегодняшний день русский осетр, как и другие 24 представителя отряда Acipenseriformes, отнесен к группе редких видов и включен в Приложение II CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) (Raymakers, 2006). Катастрофическое снижение численности русского осетра в основном обусловлено интенсивным строительством гидротехнических сооружений, препятствующих проходу половозрелых особей к местам нереста, расположенным в верховьях рек. Кроме того, высокий спрос и цена на черную икру и товарную осетрину привели к чрезмерному вылову (Vaisman, Raymakers, 2001).

Восполнение численности русского осетра в значительной мере осуществляется за счет искусственного воспроизводства на рыбоводных заводах. Так, например, в азовской популяции доля искусственно воспроизведенных рыб достигает 95% (Реков, 2000).

В связи с этим мероприятия по поддержанию численности вида должны учитывать сохранение его устойчивости, в значительной мере обусловливаемой его генетической гетерогенностью, и, соответственно, требуют знаний об эволюционно сформировавшейся популяционной структуре вида. Тем не менее, внутривидовая систематика русского осетра остается до сих пор предметом дискуссий. Являясь анадромным видом, русский осетр для размножения входит в определенные реки, а основную часть своей жизни проводит в малосоленых водах бассейнов трёх морей (Каспийского, Азовского, Чёрного), которые различаются по пространственным, температурным и продуктивным возможностям. Основываясь на поведенческих, экологических и меристических признаках, одни авторы подразделяют А. gueldenstaedtii на 3-4 географически изолированные формы с несколькими нерестовыми популяциями в каждой (Берг, 1948; Чугунов и др., 1964; Подушка, 2003), другие выделяют только популяции (Соколов, 2002; Vecsei et al., 2004).

В современной систематике наряду с морфологическим анализом широко используются методы оценки генетического полиморфизма с помощью молекулярных маркеров. Ранее проведенные исследования русского осетра выявили высокий уровень полиморфизма белков крови (Субботкин, 1987) и митохондриальной ДНК (Birstein, 2000; Корниенко и др. 2003; Doukakis et al., 2005; Rastorguev et al., 2008). Высокая плоидность генома (Birstein et al., 1997; Fontana et al., 2001), затрудняет анализ полиморфизма по ядерным маркерам. В литературе имеются данные по оценке полиморфизма некоторых видов осетровых рыб с помощью AFLP и микросателлитного (STR) анализа (Jenneckens et al., 2001; King et al., 2001; Congiu et al., 2002; Zane et al., 2002; Welsh et al., 2003). Популяционная структура и полиморфизм русского осетра по этим параметрам изучены в меньшей степени.

В связи с высокой экологической пластичностью, изменчивостью морфологических и биохимических признаков, сложной внутрипопуляционной организацией вида, ставшего редким, изучение популяциопной структуры русского осетра имеет большое практическое и научное значение.

Целью настоящей работы является исследование внутри- и межпопуляционного генетического полиморфизма русского осетра с помощью морфологического, а также молекулярно-генетического анализов с использованием методов RAPD, STR и ПЦР-идентификации митохондриальных гаплотипов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Исследовать уровень морфологической изменчивости азовской популяции русского осетра и сравнить с ранее опубликованными данными по изменчивости популяций Каспийского моря и северо-западной части Черного моря.

2. Изучить с помощью RAPD- и STR-маркеров внутри- и межпопуляционную генетическую изменчивость вида.

3. Определить тип наследования ряда известных микросателлитных (STR) маркеров в экспериментальных скрещиваниях русского осетра.

4. Оценить эффективность использования микросателлитных маркеров для определения популяционной принадлежности особей русского осетра.

5. С целью определения частоты встречаемости "baerii-like" митотипа провести широкомасштабный скрининг трех (каспийской, азовской и черноморской) популяций русского осетра.

В ходе выполнения работы впервые с помощью морфологических и молекулярно-генетических маркеров был проведен сравнительный анализ изменчивости трех популяций русского осетра (азовской, каспийской и западно-черноморской). Исследована частота встречаемости митохондриального маркера («baerii-like» гаплотип) в азовской и черноморской популяциях. Для этих популяций определена также временная динамика частот встречаемости изученных митохондриальных гаплотипов. Предложена экспериментально обоснованная методика популяционной идентификации особей русского осетра с использованием базы аллельных частот STR-локусов. Получены молекулярно-генетические доказательства микроэволюционных процессов дивергенции черноморской и каспийской популяции с последующим отделением азовской популяции.

Полученные результаты имеют важное значение для изучения эволюционной систематики и филогении рода Acipenser и вида Acipenser gueldenstaedtii. Предложен набор генетических маркеров, который используется для индивидуальной паспортизации половозрелых особей русского осетра на осетровых рыбоводных заводах Каспийского бассейна. Выявленная временная динамика частот «сибиреподобного» («baerii-like») гаплотипа мтДНК и популяционных частот STR-аллелей может быть использована для более корректной оценки промыслового возврата особей русского осетра при искусственном воспроизводстве осетровых в Азовском бассейне.

В ходе выполнения экспериментальной части работы для постановки индивидуальных скрещиваний был создан лабораторный стенд для инкубации икры рыб, который зарегистрирован 27.05.2007 в Госреестре полезных моделей РФ (патент № 63172). Был предложен способ иммобилизации образцов очищенной ДНК, предусматривающий ее выделение, очистку и заключение в защитную оболочку для длительного хранения, что позволяет оптимизировать работу с тканевыми ДНК-со держащим и пробами (дата приоритета 14.11.2007).

Материалы диссертации включены в состав учебных материалов для занятий студентов биолого-почвенного факультета ЮФУ по курсам «Генетика» и «Теория эволюции», а также специальным курсам кафедры генетики.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Тимошкина, Наталья Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ трех популяций русского осетра свидетельствует о высокой внутривидовой изменчивости основных морфометрических характеристик русского осетра, на фоне которых азовскую популяцию отличают пропорции головы (C/AL) и более интенсивная скорость роста, каспийскую - больший полиморфизм по всем изученным признакам.

2. Результаты анализа геномной ДНК по RAPD- и STR-маркерам подтверждают высокий внутрипопуляционный полиморфизм русского осетра. По результатам STR-анализа генетическое расстояние, определенное для азовской и каспийской популяций несколько выше (FST=0,070), чем генетические дистанции, отделяющие черноморскую от каспийской и азовской (FST=0,058 и 0,043 соответственно).

3. С помощью микросателлитиого анализа родительских пар и поколения F|, полученного в результате экспериментальных скрещиваний, определен тетрасомный тип наследования использованных в работе STR-маркеров.

4. Исследованные маркеры микросателлитной и митохондриальной ДНК позволяют с высокой точностью определять принадлежность особей русского осетра к каспийской и черноморской популяциям (точность определения по данным STR анализа - 86 и 96% соответственно).

5. Распределение частот встречаемости "baerii-like" маркера митохондриальной ДНК дифференцирует популяции русского осетра. Обнаружение BL-маркера мтДНК в Азовском море и данные микросателлитиого анализа свидетельствует об изменениях в сложившейся популяционной структуре и генном разнообразии русского осетра уже в исторический период в результате искусственного воспроизводства и интенсивного рыболовства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сравнительно-морфологические, отологические и генетико-биохимические исследования русского осетра, проведенные в последние десятилетия, значительно расширили представления о путях миграции, формировании ареалов и популяционной структуре этого вида. Тем не менее, единой общепризнанной точки зрения на его внутривидовую систематику до сих пор не существует. Важными препятствиями на пути решения этого вопроса являются высокий уровень полиморфизма по многим изучаемым признакам и легкость образования не только межпопуляционных, но и межвидовых гибридов в отряде Acipenseriformes. В последнее десятилетие стремительное падение численности осетровых рыб Понто-Каспийского бассейна определяют сложность и ограничения в подборе материала для исследований, в результате чего осетровые не только потеряли промысловое значение, но и поставлены на грань исчезновения (Кнапп, 2007). Особая ситуация сложилась в Азовском море, где до 95 % популяции восполняется через систему искусственного воспроизводства и частично путем вселения рыб из каспийской популяции (Реков, Корнеев, 1987; Реков, 2000). Тем не менее, полученные нами результаты морфологических исследований современной азовской популяции согласуются с её характеристикой, приведенной в более ранних работах (Марти, 1940; Берг, 1947; Чугунов и Чугунова, 1964; Мовчан, 1967; Подушка, 2003). Наблюдаемые при межпопуляционном сравнении различия по морфометрическим признакам (количество жучек в продольных рядах, количество лучей в плавниках) не эффективны для индивидуальной идентификации, так как характеризуют группы перекрывающимися диапазонами значений (табл. 3.2). Более информативные для этих целей пластические признаки подвержены сильной индивидуальной и возрастной изменчивости. Таким образом, на сегодняшний день популяционную принадлежность русского осетра нельзя достоверно идентифицировать по морфологическим признакам.

Данные RAPD-анализа выявили высокий уровень внутрипопуляционной генетической изменчивости русского осетра (табл. 3.5). Однако этот тип молекулярно-генетических маркеров оказался также неэффективным при дифференциации популяций. Генетические дистанции между особями были больше, чем расстояния между формируемыми этими особями кластерами (рис. 3.7).

Микросателлитный анализ позволил надежно дифференцировать азовскую, каспийскую и черноморские популяции русского осетра (табл. 3.14). При этом была выявлена субпопуляционная структура выборки из Северо-западной части Чёрного моря, соответствующая локальным нерестовым группам.

Показанное на примере STR-анализа азовской популяции отсутствие изоляции меду смежными поколениями согласуется с возрастной структурой половозрелой части A. gueldenstaedtii (табл. 3.12, рис. 3.1). Разные сроки полового созревания самцов и самок обеспечивают участие в размножении производителей разных поколений, то есть существование потока генов между смежными генерациями. Приток в азовскую популяцию каспийских вселенцев должен был сопровождаться процессом «дедифференциации», то есть смешения и размывания диагностических признаков. Тем не менее, согласно тестам ;на дифференциацию азовскую популяцию от каспийской отделяет большее генетическое расстояние, чем расстояния, разделяющие их от черноморской популяции (табл. 3.14). Эффект интродукции удалось выявить с помощью STR-маркеров только в поколениях 2003-2004 гг.

Результаты определения "baerii-like" митотипа (BL) в трёх исследованных популяциях подтвердили специфичность данного маркера для каспийской популяции (табл. 3.15), в которой он и был впервые описан (Birstein et al., 1998; Jenneckens et al., 2000; Мюге и др. 2008).

В настоящее время русский осетр обитает в бассейнах морей, весьма различающихся по экологическим особенностям, а его внутривидовая дифференциация связана с эволюцией этих морей. Известно существование в конце плейстоцена распресненного водоема, располагавшегося в Азово-Черноморском бассейне, связь которого со Средиземным морем прекратилась вследствие падения уровня Мирового океана 15-40 тыс. лет назад (Федоров, 1978; Свиточ и др., 1999). Азовское море в этот период исчезало и превращалось в низменную долину, пересекаемую рекой Дон. Отсутствие BL-митотипа в черноморской популяции свидетельствует о незначительности или отсутствии миграции русского осетра из Каспийского моря в бассейн Черного моря по существовавшему непродолжительное время в конце ледникового периода Кумо-Манычскому водосбросу. Последовавшая затем трансгрессия Черного моря, вызванная прорывом средиземноморских соленых вод через Босфор, и появление вследствие подъема уровня вод Азовского моря позволили сформироваться азовской популяции русского осетра из части черноморской популяции и закрепили изоляцию популяций русского осетра в северо-западной части Черного моря и в Азове.

На основании анализа результатов исследований можно высказать предположение, что дивергенция каспийской и черноморской популяций русского осетра предшествовала отделению азовской популяции, что объясняет промежуточное положение черноморских особей, как по морфометрическим показателям (табл. 3.2), так и по данным микросателлитного анализа (табл. 3.14).

Данные о распространении митохондриального BL-маркера (табл. 3.15) в современных популяциях и отсутствие его в Черном море позволяют сделать предположение о том, что появление осетров с BL-митотипом в Азовском море вероятнее всего произошло в 20 веке, когда проводили интродукцию каспийских осетровых в Азовское море (Реков, 2000), что подтверждается отсутствием маркера в выборке азовского осетра до 1960-х годов (до начала планомерного вселения осетра из Каспия).

Таким образом, генетическая структура русского осетра отражает историю формирования современного ареала вида, процессы расселения и изоляции его локальных популяций, вследствие геологических преобразований внутриевразийских водоемов. В то же время, появление осетров с BL-митотипом в азовской популяции связано с началом интродукции каспийских осетровых в Азовское море. Данные микросателлитного анализа свидетельствуют о наименьшем уровне генетической изменчивости азовской популяции, испытывающей на протяжении последнего столетия наибольшее антропогенное давление.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимошкина, Наталья Николаевна, Москва

1. Алтухов ЮЛ. Динамика генофондов при антропогенных воздействиях // Вестник ВОГиС. - 2004. - Т. 8. № 2. - С. 40-60.

2. Алтухов ЮЛ. Генетические процессы в популяциях. — М.: ИКЦ «Академкнига». 2003. -431с.

3. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. - Т. 38, № 9. - С. 1173-1195.

4. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. Популяционная генетика лососевых рыб. -М.: Наука, 1997. 288 с.

5. Артюхин Е.Н. Осетровые (экология, географическое распространение и филогения) СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2008. - 137 с.

6. Артюхин Е.Н., Заркуа З.Г. К вопросу о таксономическом ранге осетра реки Риони (бассейн Черного моря) // Вопросы ихтиологии. — Т. 96. № 1. — С 6167.

7. Бабурина Е.А. Развитие глаз и их функции у осетра и севрюги // Труды института морфологии животных. 1957. - Вып. 20. - С. 148-186.

8. Беляев В.Н. Осетр {Acipenser gueldenstaedti Br.) // Бюллетень Всекаспийской науч. рыбохоз. экспедиции. № 5-6. Баку. - С. 66-77.

9. Беляева В.Н., Ходоревская Р.П. Поведение осетровых на ранних этапах онтогенеза // Труды ЦНИОРХ. 1972. - Т. 4. - С. 40-51.

10. Ю.Берг JT.C. Яровые и озимые расы у проходных рыб // Изв. АН СССР, отд. мат. и ест. наук. 1934. - С. 711-732.

11. Берг JT.C. Рыбы пресных вод СССР и сопредельных стран. М.-Л.: Изд-во АН СССР. 1948.-Ч. 1.-467 с.

12. Бойко Е.Г. Избранные труды — Ростов-на-Дону: Эверест. 2005. — 514 с.

13. Водолаэ/сский Д.И., Конриенко И.В., Войнова Н.В. Гипервариабельность региона D-петли митохондриальной ДНК русского осетра Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseriformes, Acipenseridae) // Вопросы ихтиологии -2008. Т. 48, № 2. - С. 266-275.

14. Добровольский А.Д., Зологин Б.С. Моря СССР. М.: изд-во МГУ. - 1982. -192 с.18 .Дюжиков А.Т., Серебрякова Е.В. Некоторые черты экологии и продолжительность полового цикла осетровых рыб Волги // Тр. ВНИРО. -1964. Т. LYI, сб.З. - С.105-115.

15. Журавлева О.Л. Динамика биологических показателей нерестовой части волжской популяции русского осетра Acipenser gueldenstaedtii Brandt в условиях зарегулированного стока реки. Автореф. дисс.канд.биол.наук. -М.: ВНИРО. 2000.-28с.

16. Коблицкая А.Ф. Определитель молоди пресноводных рыб. М.: «Легкая и пищевая промышленность». 1981. -208 с.

17. Корниенко КВ., Воинова Н.В., Чистяков В.А. и др. Полиморфизм первичной последовательности сегмента гена цитохрома b митохондриальной ДНК азовской популяции Acipenser gueldenstaedtii II Вопросы ихтиологии. 2003. -Т. 43, № 1.-С. 73-77.

18. Кузьмин Ю.В. Сравнительное исследование аллозимов мышечной малат дегидрогеназы в популяциях сибирского осетра Acipenser baeri р. Обь и стерляди A. ruthenus р. Дон и Камы // Вопросы ихтиологии. — 1991. — Т.31 -С. 139-144.

19. Левин А.В. Расселение и особенности поведения молоди русского осетра Acipenser gueldenstaedti Brandt (Acipenseridae) в Каспийском море // Вопросы ихтиологии, 1981.-Т. 21.-Вып. 3. - С 344-349.

20. Левонтин Р.С. Генетические основы эволюции. -М.: Мир,'1978. 351 с.2&.Легеза М.И. Роль абиотических факторов среды при распределении осетровых (сем. Acipenseridae, Pisces) в Каспийском море // Вопросы ихтиологии. 1972. - Т.121. -Вып.1. - С.13-24.

21. Ли Ч. Введение в популяционную генетику. -М.: «Мир». 1978. 555 с.

22. Лудаииый Р.И., Хрисанфова Г.Г., Васильев В.А. и др. Генетическое разнообразие и дифференциация отечественных пород карпа (Cyprinus carpio L.), выявляемая с помощью RAPD-маркеров // Генетика. 2006. - Т. 42, № 8. — С 1121-1129ю

23. ЪХ.Лукьяненко В.И., Гераскин 77.77., Баль Н.В. Гетерогенность и полиморфизм гемоглобина у двух видов рода Huso II Докл. АН СССР. 1977. - Т. 237. - № 4.-С. 994-997.

24. Ъ2.Лукъяненко В.И., Дубинин В.И., Сухопарова А.Д. Влияние экстремальных условий приплотинной зоны реки на осетровых рыб. Рыбинск. — 1990. — 272 с.

25. ЪЪ.Малецкий С.И. Введение в популяционную биологию и генетику растений -Новосибирск: ИЦИГ СО РАН НГАУ 1995. - 154с.

26. ЪЪ.Малецкий С.И. Биномиальные распределения в генетических исследованиях на растениях Новосибирск: ИЦИГ СО РАН - 2000. - 126с.

27. Марти В.Ю. Систематика и биология русского осетра кавказского побережья Черного моря // Зоологический журнал. 1940. -Т. 19. № 6. - С. 865-872.

28. Микулин А.Е. Зоогеография рыб: Учебное пособие М.: изд-во ВНИРО, 2003. 210 с.

29. Миллер Р. Четвертичные пресноводные рыбы Северной Америки. Четвертичный период в США. М.: МИР 1969. - 384 с

30. Митрофанов В.П., Дукравец Г.М., Песериди Н.Е. и др. Рыбы Казахстана. Миноговые, Осетровые, Сельдевые, Лососевые, Щуковые.— Алма-Ата: Наука. 1986. -Т.1.-272 с.

31. Мовчан Ю.В. Осетр русский северо-западной части Черного моря и р. Кубани // Вестник зоологии. 1967. - № 6. - С. 26-32.

32. Мусатова Г.Н. Осетровые рыбы реки Кубани и их воспроизводство — Краснодар: Краснодарское книжное изд-во. 1973. 111 с.

33. Мюге Н.С., Барминцева А.Е., Расторгуев С.М. и др. Полиморфизм контрольного региона митохондриальной ДНК восьми видов осетровых и разработка системы ДНК-идентификации видов // Генетика. 2008. - Т.44. -№7.-С. 1-7.

34. Паавер Т. Биохимическая генетика карпа Cyprinus carpio L. — Таллин: «Валгус». 1983. 122 с.

35. Подушка С.Б. Вариабельность числа жучек у русского осетра (Acipenser gueldenstaedti Brandt) реки Дона // Биологические науки. 1988. - № 4. - С. 52-57.

36. Подушка С. Б. О систематическом положении азовского осетра // Научно-технический бюллетень лаборатории ихтиологии ИНЭНКО. С-Пб., 2003. -Вып.7. - С. 19-44.

37. Реков Ю.И. Динамика численности и структура популяции азовского осетра в условиях изменяющегося режима моря: Дис. .канд.биол.наук. М.: АзНИИРХ, 2000.- 112с.

38. Реков Ю.И., Корнеев А.А. Эффективность воспроизводства и пополнение промысловых стад азовских осетровых / Воспроизводство запасов осетровых рыб в Каспийском и Азово-Черноморском бассейнах. Сб. научн. тр. — М.: ВНИРО. 1987. - С. 94-101.

39. Решетников Ю.С., Богуцкая Н.Г., Васильева Е.Д. и др. Список рыбообрзных и рыб пресных вод России // Вопросы ихтиологии. 1997. — Т. 37. № 6. — С. 723-771.

40. Рябова Г.Д., Офицеров М.В., Шишанова Е.И. Исследование связи между аллозимной изменчивостью и некоторыми компонентами приспособленности у севрюги Acipenser stellatus (Pallas) // Генетика. — 1995. -Т.31, № 13.-С. 1679-1692.

41. Свиточ А.А., Селиванова А.О., Янина Т.А. Новейшая история трёх морей // Природа, 1999. №12. - С. 17-25.

42. Субботкин М.Ф. Сравнительный иммунохимический анализ межвидовых и внутривидовых особенностей сывороточных белков трех видов осетровых рода Acipenser // Вопросы ихтиологии, 1987. Т.27. - №5. - С. 794-800.

43. Чихачев A.C., Цветненко Ю.Б. Оценка влияния искусственного воспроизводства и интродукции на генетическую структуру популяции азовских осетровых / Воспроизводство рыбных запасов Каспийского и Азовского морей. М.: ВНИРО. - 1984. - С. 114-125.

44. Чугунов Н.Л., Чугунова НИ. Сравнительная промыслово-биологическая характеристика осетровых Азовского моря // Труды ВНИРО. Т.52. - Вып. 1.-С. 87-182.

45. Цветненко Ю.Б. Оценка влияния искусственного воспроизводства и интродукции на генетическую структуру популяцию азовских осетровых // Тр. ВНИРО-1984.-С. 114-125.

46. Цветненко Ю.Б. Эффективность и генетические последствия интродукции севрюги Acipenser stellatus из Каспийского в Азовский бассейн // Вопросы ихтиологии. 1993. - Т.ЗЗ, № 3. - С. 382-387.

47. Федоров П.В. Плейстоцен Понто-Каспия // Тр. ГИН АН СССР. 1978. - Вып. 310. - 164 с.

48. Шляхов В.А. Оценка численности днепровского стада осетра в северозападной части Чёрного моря // Труды ЮгНИРО. 1994. - Керчь. - Т.40. -С. 50-55.61 .Яблонская Е.А. Кормовая база осетровых южных морей // Тр. ВНИРО. -1964.-Т.54.-С. 81-112.

49. Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques // Nucleic Acids Res. 1999. - V.25. -N22.-P. 4692-4693.

50. Allendorf F. W., Danzmann R.G. Secondary tetrasomic segregation of MDH-B and preferential pairing of homeologs in Rainbow trout // Genetics. 1997. - V. 145. -P. 1083-1092.

51. Allendorf F. W., Thorgaard G.H. Tetraploidy and the evolution of Salmonid fishes / Evolutionaty genetics of fishes // Ed. В J. Turner. N.Y.: Plenum press, 1984. -P. 1-53.

52. Barmintsev V. A.; Chudinov O. S.; Abramova A. B. Molecular and biological methods of identification and certification of sturgeons and their products. // Fish Farm. Fish.-2001.- V. l.-P. 70-71.

53. Birstein V.J., Poletav A.I., Goncharov B.F. The DNA content in Eurasian sturgeon species determined by flow cytometry // Cytometry. 1993. - V. 14. - P. 377383.

54. Comincini S., Lanfredi M, Rossi R., Fontana F. Use of RAPD markers to determine the genetic relationships among sturgeons (Acipenseridae, Pisces) // Fish. Sci. 1998.-V. 64.-P. 35-38.

55. Cornuet J.M. and Lidkart G. Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data // Genetics. -1996. V. 144. - P. 2001-2014.

56. Diaz-Jaimes P. and Uribe-Alcocer M. Allozyme and RAPD variation in the eastern Pacific yellowfin tuna (Thunnus albacares) // Fish. Bull. 2003. — V. 101, N4.-P. 769-777.

57. M.Excoffier L., Laval G. and Schneider S. Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis // Evolutionary Bioinformatics Online. 2005. - V. 1. P. 47-50.

58. Fontana F., Lanfredi M., Rossi R., Bronzi P., Arlati G. Established cell lines from three sturgeon species // Sturg. Quart. 1995. - V. 3, N4. - P. 6-7.

59. Fontana F., Tagliavini J., Congiu L. Sturgeon genetics and cytogenetics: recent advancements and perspectives // Genetica. 2001. - V. 111. - P. 359-373.

60. Ford E. Polymorphism and taxonomy // The new systematics. Oxford: Clarendon press. 1940.-P. 493-513.

61. Gharaei A., Pourkazemi M., Rezvani S., Mojazi Amiri B. Genetic differences; and resemblance between Acipenser persicus and Acipenser gueldenstaedtii by means of RAPD technique. // Iran. Sci. Fish. J. 2005. -V. 14. -P. 91-102.

62. Gordon M. Speciation in fishes // Adv. Genet. 1947. - Vol. 1 - P. 95-132.

63. Hansen M., Kenchington E., Nielsen E.E. Assigning individual fish to populations using microsatellite DNA markers // Fish and Fisheries/ 2001. - №2. - P. 93-112.

64. Henderson-Arzapalo A., King T.L. Novel microsatellite markers for Atlantic sturgeon (Acipenser oxyrinchus) population delineation and broodstock management // Mol.Ecol.Notes 2002. - V.2. - P. 437-439.

65. Johnson K.R., Wright J.E., May B. Linkage relationships reflecting ancestral tetraploidy in salmonid fish // Genetics. 1987. -V. 116. - P. 579-591.

66. Kasamatsu H. et al. A novel closed-circular mitochondrial DNA with properties of a replicating intermediate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. - V. 68, N 9. - P. 2252-2257.

67. Keyvanshokooh S., Pourkazemi M., Katbassi M.R. The RAPD technique failed to identify sex-specific sequences in beluga {Huso huso) // J. Appl. Ichthyol. -2007. -V. 23. -P. 1-2.

68. King J.P., Kimmel M., Chakraborty R. A power analysis of microsatellite-based statistics for inferring past population growth // Mol. Biol, and Evol. 2000. -V. 17.-P. 1859-1868.

69. King T.L., Lubinski B.A., Spidle A.P. Microsatellite DNA variation in Atlantic sturgeon (Acipenser oxyrinchus oxyrinchus) and cross-species amplification in the Acipenseridae // Cons. Gen. 2001. - V. 2. - P. 103-119.

70. Krutovskii K.V., Vollmer S.S., Sorensen F.C. et al. RAPD genome map of Douglas-fir//F. Heredity. 1998. -V. 89, N 3. - P. 197-205.

71. Landsteiner К, Wiener A.S. An agglutinable factor in human blood recognized by immune sera for rhesus blood // Proc.Soc. Exp. Biol. Med. 1940. -V. 43.-P. 223-224.

72. Lansman R.A., Shade R.O., Shapiro J.F., Avise J.C. The use of restriction endonucleases to measure mitochondrial DNA sequence relatedness in natural populations III. Techniques and potential applications // J. Mol. Evol. 1981. - V. 17.-P. 214-226.

73. Lewontin R.C. The apportionment of human diversity // Evol.Biol. 1972. -№6.-P. 381-398.

74. Ludwig A., Belfiore N.M. et al. Genome duplication events and functionfl reduction of ploidy levels in sturgeon {Acipenser, Huso and Scaphirhynchus) II Genetics 2001. - V. 158. - N 3. - P. 1203-1215.

75. Ludwig A., Debus L., Jenneckens I. A molecular approach for trading control of black caviar // Int. Rev. Hydrobiol. 2002. - V. 87. - P. 661-674.

76. Ludwig A., Congiu L., Pitra C. et al. Nonconcordant evolutionary history of maternal and paternal lineages in Adriatic sturgeon // Mol. Ecol. 2003. - V. 12. P. 3253-3264.

77. Luikart G., Allendorf F.W., Cornuet J.-M., Sherwin W.B. Distortion of allele frequency distributions provides a test for recent population bottlenecks // J. Heredity. 1998. -V. 89. № 3. - P. 238-247.

78. May В., Krueger C.C., Kincaid H.L. Genetic variation at microsatellite loci in sturgeon: primer sequence homology in Acipenser and Scaphirhynchus // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1997. - V. 54. - P. 1542-1547.

79. McQuown E.,Krueger C.C., Kincaid H.L. et al. Genetic comparison of lake sturgeon populations: Differentiation based on allelic frequencies at seven microsatellite loce // F. Great. Lakis Res. 2003. - V. 29, N 1. - P. 3-13.

80. McQuown E., Gall G.A.E., May B. Characterization and inheritance of six microsatellite loci in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) II Trans. Am. Fish. Soc. 2002. - V. 131.-299-307.

81. Modica-Napolitano J.S., Kulawiec M., Singh K.K. Mitochondria and human cancer // Cur. Mol. Med. -2007. -V. 7. P. 121-131.

82. Moody M.E., Mueller L.D., Soltis D.E. Genetic variation and random drift in autotetraploid populations // Genetics 1995. - V. 134. - P. 649-657.

83. Mueller U.G., Wolfenbarger L.L. AFLP genotyping and fingerprinting // Trends Ecol. Evol. 1999. - V. 14. - P. 389-394.

84. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Sci. Am. 1990. -V. 262.-P. 64-65.

85. Muyzer G., Smalla К Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology // Antonie Van Leeweenhoek. 1998. - V.73. - P. 127-141.

86. Navodaru I., Stara§ M, Banks R. Management of sturgeon stocks of the lower Danube River system // Conference Proceedings "The Delta's: State-of-art protection and management" Tulcea, Romania, 26-31 July 1999. - P. 229-237.

87. Nei M. Genetic distance between populations // Am.Naturalist. 1972. - № 106.-P. 283-292.

88. Nei M, Tadjima F. DNA polymorphism detectable by restriction endonucleases // Genetics. 1981. - V. 105. - P. 207-217.

89. Ocho S., Stenius C., Faisst E., Zenzes M.T. Post-zygotic chromosomal rearrangements in rainbow trout (Salmo irideus Gibbons) // Cytogenetics. 1965. -V. 4.-P. 117-129.

90. O'Connell M. and Wright J. M. Microsatellite DNA in Fishes // Reviews in Fish Biology and Fisheries. 1997. - V. 7. - P. 331-363.

91. O'Reilly P. and Wright J.M. The evolving technology of DNA fingerprinting and its application to Fisheries and aquaculture // J. Fish Biol. -1995. V. 47, Suppl. A - P. 29-55.

92. Pogson G.H., Mesa K.A., Boutilier R. G. Genetic population structure and gene flow in Atlantic cod, Gadus morhua: a comparison of allozyme and RFLP loci // Genetics. 1995. - V. 139. - P. 375-3 85.

93. Pyatskowit J.D., Krueger C.C., Kincaid H.L., May B. Inheritance of microsatellite loci in the polyploid derivative lake sturgeon (Acipenser fulvescens) И Genome. 2001. -V. 44. - P. 185-191.

94. Rastorguev S., Mugue N., Volkov A., Barmintsev V. Complete mitochondrial DNA sequence analysis of Ponto-Caspian sturgeon species // J. Appl. Ichthyol. 2008. -V. 24, Suppl. 1. -P.46-49.

95. Raymakers С. CITES, the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora: its role in the conservation of Acipenseriformes // J. Appl. Ichthyol. -2006. V. 22, Suppl. 1. - P. 53-65.

96. Richer W.E. Hereditary and environmental factors affecting certain salmonid populations / The stock concept of Pacific salmon. Vancouver: Univ. Brit. Columbia. 1972. - P. 19-160.

97. Rodzen J. A., Famula T.R., May B. Estimation of parentage and relatedness in the polyploid white sturgeon (Acipenser transmontanus) using a dominant marker approach for duplicated microsatellite loci // Aquaculture — 2004. — V. 232.-P. 165-182.

98. Roe B.A., Ma D.P., Wilson R.K., Wong J.F. The complete nucleotide sequence of the Xenopus laevis mitochondrial genome // J. Biol. Chem. 1985. -V. 260, N 17. - P. 9759-9774.

99. Royle N.J., Clarkson R.E., Wong Z., Jeffreys A.J. Clustering of hypervariable minisatellites in the preterminal regions of human autosomes // Genomics. 1988. -V. 3. - P. 352-360.

100. Saccone C., Pesole G., Sbisa E. The main regulatory region of mammalian mitochondrial DNA: structure-function model and evolutionary pattern // J. Mol. Evol. 1991. - V. 33, N 1. - P. 83-91.

101. Shaw P. W., Turan C., Wright J.M. et al. Microsatellite DNA analysis of population structure in atlantic herring {Clupea harengus), with direct comparison to allozyme and mtDNA RFLP analysis // Heredity. 1999. - V. 83. - P. 490499.

102. Schldtterer C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA // Chromosoma. 2000. - V. 109. - P. 365-371.

103. Smith C., Seeb L. Number of Alleles as a Predictor of the Relative Assignment Power of SNP and STR Baselines for Chum Salmon // SNP WORKSHOP II. Applications of SNP Genotypeng en Fesheries Management. Girdwood, Alaska. September 21-22. P. 25.

104. Smith P., McVeagh M. Allozyme and microsatellite DNA markers of toothfish population structure in the Southern Ocean // J. Fish Biol. 2000. - V. 57.-P. 72-83.

105. Smith C.T., Nelson R.J., Pollard S. et al. Population genetic analysis of white sturgeon {Acipenser transmontanus) in the Fraser River // J. Appl. Ichthyol. 2002. - V. 18. - P. 307-312.

106. Soltis D.E., Soltis P.S. The dynamic nature of polyploidy genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 8089-8091.

107. Taggart J.B., Ferguson A. Hypervariable minisatellite DNA single locus probes for the Atlantic salmon, Salmo salar L. // F. Fish. Biol. 1990. - V. 37. -P. 991-993.

108. Tranah G., Campton D. E., May B. Genetic evidence for hybridization of pallid and shovelnose sturgeon // Heredity. -2004. V. 95. - P. 474-480.

109. Urquhart A., Kimpton C.P., Downes T.J., Gill P. Variation in short tandem repeat sequences — a survey of twelve microsatellite loci for use as forensic identification markers // Int. J. Leg. Med. 1994. - V. 107. - P. 13-20.

110. Van Eenennaam A.L., Murray J.D., Medrano J.F. Synaptonemal complex analysis in spermatocytes of white sturgeon, Acipenser transmontanus Richardson (Pisces, Acipenseridae), a fish with a very high chromosome number // Genome. -1998. -V. 41. -P. 51-61.

111. Vecsei P., Charette R., Hochleithner M. et al. Guide to the Identification of Sturgeon and Paddlefish Species Controlled under the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora. Ottava:CITES. - 2004. -P. 30-33.

112. Vaisman A. and Raymakers C. The Status of Sturgeon resources in Russia // TRAFFIC Bulletin. 2001. - V. 19, №1. - P. 33-44.

113. Vignal A., Milan D., San Cristobal M., Eggen A. A review of SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics // Genet. Sel. Emol. -2002.-V. 34.-P. 275-305.

114. Welsh A.B., Blumberg M., May B. Identification of microsatellite loci in lake sturgeon, Acipenser fulvescens, and their variability in green sturgeon, A.medirostrisll Mol.Ecol.Notes. 2003. - V.3. - P. 47-55.

115. Welsh A. and May B. Development and standardization of disomic microsatellite markers for lake sturgeon genetic studies // J. Appl. Ichthyol. -2006. -V. 22.-P. 337-344.

116. Walsh M.G., Bain M.B., Squiers Т., Waldman J.R., Wirgin I. Morphological and genetic variation among Shortnose Sturgeon Acipenser brevirostrum from Adjacent and Distant Rivers 11 Estuaries. 2001. - V. 24, N 1. - P. 41-48.

117. Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalski F.A., Tingey S.V. Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers // Methods Enzymol. 1993. -V. 218.-P. 704-740.

118. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nuc. Acids Res. -1990.-V. 18, N22.-P. 6531-6535.

119. Wright J.M. DNA fingerprinting in fishes / In Hochachka P.W. and Mommsen T. eds. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes. 1993. - V. 2. Amsterdam: Elsevier. - P. 58-91.

120. Zane L., Patarnello Т., Ludwig A. et al. Isolation and characterization of microsatellites in the Adriatic sturgeon {Acipenser naccarii) II Mol.Ecol.Notes. -2002. V.2. - P.586-588.

121. Zhivotovsky L.A. Estimating population structure in diploids with multilocus dominant DNA markers // Molecular Ecology. 1999. - V. 8. - P. 907-913.