Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus (Georgii, 1775)

Рожкован, Константин Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus (Georgii, 1775)
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus (Georgii, 1775)"

На правах рукописи

РОЖКОВАН КОНСТАНТИН ВАСИЛЬЕВИЧ

Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus

(Georgii, 1775)

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2008

003450259

Работа выполнена в Биолого-почвенном институте Дальневосточного отделения Российской Академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Челомина Галина Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Брыков Владимир Алексеевич доктор биологических наук, профессор Подгорная Ольга Игоревна

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится "14" ноября 2008 г. в "10" часов на заседании диссертационного совета

Д005.008.01 при Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН по адресу:

690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

Факс: (4232) 310-900, e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им. A.B.

Жирмунского ДВО РАН.

Адрес: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@,mail.ru

Автореферат разослан " 09"ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ващенко М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Отряд Acipenseriformes (осетры и веслоносы) - древняя груша рыб, ведущая свое происхождение из Юрского Периода (Grande, Bemis, 1991). Осетры и их ближайшие филогенетические родственники веслоносы считаются живыми ископаемыми, поскольку за последние 200 млн лет своего существования они не подверглись крупным морфологическим изменениям (Gardiner, 1984). Широкое использование этой группы в коммерческих целях привело к масштабному вылову осетровых, что отразилось на значительном уменьшении их численности. В настоящее время все представители рода Acipenser включены в списки Международной конвенции по редким видам (CITES). Генетические исследования обнаружили, что кариотипическая эволюция осетровых рыб сопровождалась ограниченным числом изменений в хромосомах (Birstein et al., 1997). Скорость молекулярной эволюции осетров на уровне белков, последовательностей митохондриальной и ядерной ДНК тоже оказалась пониженной (Brown et al., 1996; Birstein et al., 1997), что ассоциируется с недавней дивергенцией этой группы (Choundhury, Dick, 1998). Недавнее открытие у видов Acipenser (Krieger, Fuerst, 2002, 2004; Krieger et al., 2006) множественных копий ядерного гена 18S рРНК делает осетров уникальной группой среди позвоночных. Все осетровые являются полиплоидами (4и-8«-16л) и обладают большим (120-500) числом хромосом (Birstein et al., 1993; Blacklidge, Bidwell, 1993). Эти факторы, возможно, явились причиной относительно простой межвидовой и межродовой гибридизации, усугубляемой перекрытием зон нереста. Гибридизация делает систематику Acipenseridae весьма запутанной (Birstein, 2002). Статус редких видов, высокий эволюционный возраст, особенности морфологической и молекулярной эволюции делают эту группу особенно привлекательной для всестороннего изучения, и прежде всего - для ее сохранения в природе во всем генетическом разнообразии.

Цель и задачи исследования. Цель работы - исследование особенностей молекулярной эволюции и механизмов формирования генетического разнообразия у амурского осетра, калуги и их гибридов как основы сохранения генофонда аборигенных видов. Основные задачи исследования:

1. Дать оценку генетического разнообразия осетровых рыб Амура из природных популяций и полученных при искусственном разведении, включая межвидовые гибриды, с помощью мультилокусных RAPD-PCR-маркеров;

2. Клонировать и секвенировать участок гена 18S рРНК амурского осетра, калуги и межвидовых гибридов (A, schrenckii х A. baerii и A. schrenckii х H. dauricus), а также полную последовательность 18S рДНК амурского осетра;

3. Провести детальный анализ полиморфизма, дивергенции, функциональной значимости и филогенетических связей клонированного участка гена 18S рРНК осетровых рыб Амура и их гибридов;

4. По результатам секвенирования полной последовательности 18S рДНК амурского осетра и данным из Genbank провести анализ филогенетических связей амурского осетра с другими видами осетровых рыб.

гибридов содержат часть признаков обоих родителей, а таже гибрид-специфичные локусы, отсутствующие в геномах родительских видов; наследование некоторых признаков зависит от направления скрещивания. Впервые клонирована и секвенирована полная последовательность ядерного гена 18S рРНК амурского осетра, проведены ее структурно-функциональный и филогенетический анализы. Впервые клонированы и секвенированы 486 пн участки 18S рДНК амурского осетра, кахуги, гибридов амурского осетра с калугой и с сибирским осетром. Показаны множественгость аллелей этих генов у дальневосточных видов осетровых рыб и повышение генетического разнообразия рДНК при межвидовой гибридизации. Доказано существование среди аллельных вариантов функциональных последовательностей 18S рДНК и последовательностей, эволюционирующих под ослабленным селективным давлением. Даны высокие оценки шанса выживания осетровых рыб Амура, при условии отсутствия антропогенного пресса; обнаружение в природных популяциях межвидовых гибридов рассматривается как один из факторов риска. RAPD маркеры признаны полезными для генетического мониторинга природных популяций осетровых рыб Амура в целях сохранения их генофонда.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты важны для понимания общих закономерностей формирования гибридного генома, эволюционной судьбы дуплицированных генов, а также механизмов генерирования и поддержания генетического разнообразия у полиплоидных видов животных в целом. Уточнение филогенетических связей осетров Амура является вкладом в разработку систематики и филогении Acipenseriformes. Поскольку осетры имеют большой экономический интерес, молекулярные данные могут быть использованы для сертификации коммерческих продуктов. В связи со статусом редких видов, данные об осоэенностях генетического разнообразия осетров Амура крайне необходимы для разработке эффективных мер по их сохранению и рациональному природопользованию.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 ргбот, из них 5 статьей в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 209 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 54 рисунками. Список литературы включает 316 наименований, из них 276 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

В работе использован материал по четырем видам (A. schrmckii, A. baerii, A. ruthenus, Huso dauricus) и межвидовым гибридам (A. schrenckii х A. baerii, A- baerii * A. schrenckii, А. schrenckii х A. ruthenus, A. ruthenus х A. schrenckii, A. schrenckii х Н. dauricus) осетровых рыб из реки Амур и из маточных стад Лучегорской научно-исследовательской станции ТИНРО-Центра.

ДНК выделяли из крови и фиксированной в 80% э-аноле печени стандартным фенол ьно-детергснтным способом (Маниатис и др., 1984). Оценку качества полученных препаратов ДНК и выравнивание концентрации для PCR проводили электрофоретически, используя 1% агарозный гель и ДНК фага лямбда известной концентрации.

Внутрипопуляционная генетическая изменчивость вычислялась по ряду параметров: па - наблюдаемое и ne - эффективное число аллелей на локус iKi'mura, Crow, 1964); Р и Рд5 - доля полиморфных локусов без критерия и с 95% критерием полиморфизма; Нет -

теоретически ожидаемая гетерозиготность с поправкой на величину выборки (Stephanes et al., 1992); I - индекс гетерогенности выборки Шеннона-Вивера (Shannon, Weaver, 1949). Генетическая дифференциация выборок оценивалась по Dun - несмещенным генетическим дистанциям (Nei, 1972); Dst - межпопуляционному генному - разнообразию и Gst -коэффициенту генных фиксаций (Nei, 1975); Nm - числу мигрантов на поколение (Wright, 1951); и Exact test - точному тесту на дифференциацию популяций включая %2, df и р (Raymond, Rousset, 1995). Расчёт генетических параметров осуществляли с помощью программ PopGen 32 (Yeh, Boyle, 1997). NTSYS (Rohlf, 1992) и TFPGA (Miller, 1997).

Для амплификации 486 пн участка гена 18S рРНК использовали универсальные праймеры: прямой - 5'-TCAAGAACGAAAGTCGGAGG, обратный - 5'-GGACATCTAAGGGCATCACA. Амплификация полноразмерного гена малой рибосомной субъединицы (около 1800 пн) осуществлялась с использованием праймеров, разработанных для А. fulvescens (Krieger, Fuerst, 2002) и применением Long PCR Enzyme Mix (Fermentas). После амплификации продукты осаждали спиртом и растворяли в 20 мкл ТЕ буфера. Клонирование проводили по липким концам с использованием InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit (Fermentas). Секвенирование осуществляли на автоматическом лазерном секвенаторе ABI Prism 310 на базе БПИ ДВО РАН.

Анализ полиморфизма последовательностей рДНК, характера мутационных замен и тесты на нейтральность проводили с помощью программ DnaSP 4.0 (Rozas et al., 2003) и Arlequin 3.11 (Excoffier et al., 2005). Реконструкции филогенетических связей выполнены посредством кластерного анализа невзвешенным парно-групповым методом с арифметическим усреднением (UPGMA), методом ближайшего связывания (NJ), и построением минимального спеннинг-древа (MST) на основе попарных генетических дистанций Нея с использованием программ TreeConw (Van de Peer, De Wächter, 1994), TFPGA (Miller, 1997), MEGA 4 (Tamura, Dudley, Nei, Kumar, 2007) и NTSYS (Rohlf, 1992). Филогенетическую модель определяли с помощью Modeltest (Posada, Grandall, 1998). Многомерное шкалирование (MDS) выполняли в программе NTS YS (Rohlf, 1992) для установления основных дивергентных групп.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Молекулярная идентификация и особенности генетического разнообразия межвидовых гибридов амурского осетра, полученных при искусственном

скрещивании

RAPD-спектры анализируемых видов осетровых рыб обычно демонстрировали достаточно высокую видоспецифичность. Например, для праймера ОРА-18 таксонспецифичными в геномах A. schrenckii, A. baerii и A. ruthenus были фрагменты длиной 1140 и 1030 пн, блок фрагментов в диапазоне 1000-870 пн, и 420 пн фрагмент, соответственно (рис. 1).

У гибридов RAPD паттерны оказались более похожими между собой, чем с родительскими видами. Их особенности могут быть обобщены следующим образом: 1 -содержание маркерных фрагментов ДНК обоих родителей (Рис. 2 а), что ожидаемо в Fi генерации для локусов, наследуемых в соответствии с законами Менделя; 2 - появление дополнительных фрагментов, отсутствующих у родителей (рис. 2 б); наличие этих зон у гибридов менее предсказуемо; 3 - зависимость наследования некоторых зон от направления скрещивания; аналогичные данные по другим видам не известны (рис. 2 в, г).

A . schrenckii

A. baerii

A. ruthenus

Рис. 1. RAPD паттерны трех видов осетров, генерируемые праймером OPA-18

Всего в анализируемой выборке из 70 особей идентифицировано 252 локуса. Основные показатели генетической изменчивости (Р, I, Hurt) были выше в объединенной выборке родительских видов, по сравнению с их гибридами. Однако когда сравнивали каждый родительский вид с каждым типом гибридов, показатели гибридов оказывались выше.

Чтобы установить уровень генетической дифференциации между видами осетров и их гибридами, использовали разные подходы (см. методы). Все они указали на более высокую дифференциацию видов по сравнению с гибридами, а также на существенную дифференциацию между гибридами и их родителями.

Для визуализации генетической дифференциации осетров на основные группы было использовано многомерное шкалирование основанное на результатах попарных генетических дистанций (рис. 3).

S $S х (?в gB*(?S В

Рис. 2. Примеры ЯДРО полиморфизма осетров, выявленные с помощью праймеров ОРС-09 (а, б) и ОРР-08 (в, г). Б - Ааретег ясИгепскИ, В - А. Ьаегп, Я - А. ШИепш. Стрелками указаны маркерные фрагменты ДНК.

Полученные данные продемонстрировали хорошее разделение сравниваемых видов и их гибридов в пространстве трех координат; причем, эффективно разделились даже гибриды от разных направлений скрещивания.

Филогенетические N1 деревья со 100% бутстреп-поддержкой распределяют всех анализированных особей в разные кластеры согласно их в вдовой принадлежности; гибриды каждого тина скрещиваний образуют собственные кластеры. иРСМА дендрограммы генетического сходства разделяют сравниваемые формы менее эффективно.

Таким образом, мы показали, что метод ЯАРП-РСИ пригоден для идентификации гибридного потомства амурского осетра со стерлядью и сибирским осетром. Это важно,

S ?S х

т.к. первая генерация гибридов у осетров не всегда является морфологически промежуточной по отношению к родительским видам, а морфологическая "промежуточность" - не всегда показатель межвидовой гибридизации (Тгапа11 е! а1„ 2004).

Рис. 3. Многомерный анализ генетического разнообразия осетров (а - амурский и сибирский осетры, гибриды амурского и сибирского осетров: б - амурский осетр и стерлядь, гибриды амурского осетра и стерляди)

Межвидовая гибридизация имеет широкие последствия; она может привести к хромосомным перестройкам, активизации мобильных элементов. изменениям метилирования ДНК и генной экспрессии и т.д. (Adams, Wendel, 2005). Множество исследований указывают, что гибридизация может повышать генетическую изменчивость и генерировать новые признаки или их комбинации (н-р, Goldman et al., 2004; Mandak et al., 2005). В этом плане осетровые рыбы не являются исключением: полученные нами данные свидетельствуют о повышенной изменчивости гибридов по сравнению с исходными видами, и появлению у них новых признаков (фрагментов ДНК).

Тем не менее, в целом уровень генетической изменчивости в проанализированных нами выборках, как родителей, так и гибридов, не может быть признан высоким, что, видимо, обусловлено искусственным разведением рыб от ограниченного числа родителей. Изменения показателей генетической изменчивости осетров при объединении популяционных выборок вполне закономерны.

Теоретически, плоидность может влиять на уровень генетической изменчивости видов (Ludwig et al., 2001). Однако нами не выявлено предполагаемых отличий в уровне генетической изменчивости между A. ruthenus (п = 118) и A. schrenckii (п = 240) с A. baerii (п = 248). Такой результат, прежде всего, указывает на необходимость использования статистически значимых выборок. Вместе с тем, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о непрерывном процессе функциональной редукции уровня плоидности у осетров (Ludwig et al., 2001), что, видимо, может в целом отражаться на их генетической изменчивости. Весьма примечательно, что появление разного количества новых признаков (фрагментов ДНК) у гибридов между равно- и разнохромосомными видами согласуется с имеющимся данными о прекопуляционных изолирующих механизмах, которые лучше развиты между видами осетров, менее всего отличающимися по числу хромосом (Васильев, 1985). Зависимость RAPD паттернов от направления скрещиваний можно объяснить опосредованным влиянием пол-специфичных локусов; связь с полом двух аллозимных локусов была описана для радужной форели (Allendorf et al., 1974). Такие пол-

связанные маркеры полезны для получения информации о возможных случаях гибридизации в недавнем прошлом (Allendorf, Waples, 1996).

Дискриминация межвидовых гибридов в природных популяциях осетровых рыб

Амура

Для оценки уровня генетического разнообразия природных популяций осетровых рыб Амура мы использовали RAPD-PCR анализ. В общей выборке выявлено 173 локуса. При визуальном анализе спектры, полученные для видовых выборок, имели высокую степень сходства. Наилучшие картины межвидовой дифференциации были получены с помощью праймеров ОРА-09, ОРА-Ю, ОРА-11 и ОРА-17. Например, локус ОРА-10320 является специфичным для A. schrenckii, у Н. dauricus он отсутствует, а локус ОРА-Ю460 имеет выраженные частотные отличия между сравниваемыми видами (рис. 4). Надежных маркеров (гибрид-специфичных фрагментов ДНК) для идентификации фенотипических гибридов осетровых рыб р. Амур выявлено не было.

Рис. 4. RAPD паттерны осетров Амура, генерируемые праймером ОРА-Ю. S — A. schrenckii, D - Н. dauricus, М - маркер.

Выборки амурского осетра А. вскгепски и калуги Н. Лаипсш оказались высоко полиморфными, введение 95% критерия существенно не повлияло на показатель полиморфизма амурского осетра (табл. I), что свидетельствует о малочисленности редких аллелей у ЯАРО локусов. Значения других параметров генетической изменчивости для каждой из видовых выборок также оказались достаточно высокими (см. табл. 1); различия между видами обусловлены неравными объемами выборок (из-за низкой численности калуги).

Таблица 1. Параметры генетической изменчивости амурского осетра и калуги

Выборки N па пе 1 Р,% Р95, % Нип

A. schrenckii (п=37) 165 1.71 1.44 0.38 71.1 65.9 0.26

Н. dauricus (п=9) 167 1.58 1.38 0.32 58.4 0.23

N-число локусов; па, пе, 1,Рц Нип -как в материапах и методах.

Наиболее эффективным для дискриминации видов оказался Exact test (р = 0.0), а для гибридов с видами (дивергировавших значительно слабее, чем виды) - генетические дистанции и коэффициент генных фиксаций. При анализе амурских осетровых рыб методом многомерного шкалирования особи распределились в две основные группы. В одну группу вошли все экземпляры калуги, в другую - амурского осетра; фенотипические гибриды расположились между калугой и амурским осетром (рис. 5).

Данные кластерного анализа, полученные методами NJ и UPGMA, в целом, согласуются с данными многомерного шкалирования; отличия связаны с локализацией

. С1репхег .чсИгепски

Ншп сЬипсш

гибридов. На НТ-древе фенотипические гибриды входят в кластер амурского осетра (базальная ветвь), а на дендрограмме иРОМА - калуги (самостоятельная ветвь). М8Т демонстрирует четкую дифференциацию видов, которые соединяются между собой через фенотипические гибриды. Примечательно, что эта реконструкция указывает на гетерогенность популяции А. зскгепскИ, предполагая у него наличие, по крайней мере, двух генетически дискретных групп.

Исследование изменчивости 11АРО-маркеров позволяет сделать вывод, что осетровые виды рыб бассейна р. Амур имеют достаточно высокий уровень генетического разнообразия. По сравнению с показателями генетического разнообразия осетров Лучегорской научной станции, изменчивость природной популяции выше на порядок и сопоставимы с таковыми у массовых видов позвоночных (Спиридонова и др., 2005; Атопкин и др., 2007).

Высокие показатели генетического разнообразия популяционных выборок осетровых рыб р. Амур могут быть обусловлены некоторыми биологическими особенностями АарепвегЛогтев: большой срок жизни (до 60-80 лет), размножение не ежегодное, а с промежутками до 5 лет, позднее созревание (после 10-15 лет) иногда с существенной временной разницей между полами (в некоторых речных системах самцы созревают быстрее самок) (н-р.: Крыхтин, 1986; ОгшшаМ е! а1., 2002). Такие особенности ведут к генетическому "эффекту сохранения", который заключается в сохранении стабильного сосуществования видов в постоянно меняющейся среде (Сасегеэ, 1997).

Эффективность статистических методов в дискриминации межвидовых гибридов продемонстрирована в ряде исследований (н-р.: Согщш ег а1., 2001; Цвирка и др., 2006). В данной работе высокая статистическая поддержка видовых кластеров получена только для Ю древа; в иРвМА реконструкциях она значительно ниже. Возможной причиной этому, может быть наличие в исследуемой популяционной выборке отдаленных гибридов между осетровыми видами рыб. Поэтому для прояснения ситуации в дальнейшем мы планируем использование также других молекулярных маркеров.

Таким образом, наши данные указывают на достаточно высокий уровень генетического разнообразия природных популяций амурского осетра А. ¡сИгепски и калуги Н. скшпсш, что может быть свидетельством стабильного состояния видов. Популяция амурского осетра, вероятно, генетически структурирована, что повышает ее шансы на выживание. Однако популяция имеет биологический фактор риска - межвидовые гибриды. Интенсивный вылов рыбы, межвидовая гибридизация, экологические загрязнения, а также инвазия искусственно разводимых рыб требует постоянного генетического мониторинга для сохранения генофонда аборигенных популяций осетровых рыб бассейна р. Амур.

Рис. 5. Многомерный анализ генетического разнообразия осетров

Мультилокусные RAPD-PCR маркеры в сочетании со статистическими методами могут быть для этого удобным и надежным инструментом.

Анализ генетического разнообразия последовательностей 18S рДНК амурского

осетра и калуги

Всего для двух видов, амурского осетра Л. schrenckii и калуги H. dauricus, изучено 60 клонов с 486 пн вставкой гена ядерной 18S рРНК. Максимальное количество клонов и гаплотипов (аллельных вариантов) от одной особи составило 30 и 12, соответственно. Наши данные продемонстрировали высокое генетическое разнообразие клонированных последовательностей осетров Амура, сопоставимое с таковым северо-американского озерного осетра A. fulvescens (табл. 3, рис, 6).

Среди 22 клонов амурского осетра обнаружено 11 аллельных вариантов гена ядерной 18S рРНК, имеющих различия по 21 замене и 1 делеции. Из 38 клонов калуги выделено 13 вариантов последовательности, различающихся по 14 заменам и 11 делециям. Некоторые отличия оказались таксон-специфичными (рис. 7).

Таблица 3. Полиморфизм последовательностей 18S рДНК трех видов осетровых рыб

Вид п S h Hd Pi k

A. fulvescens* 18 31 12 0.935 0.01138 5.510

A. schrenckii 22 20 11 0.714 0.00878 4.251

H. dauricus 38 13 16 0.863 0.00979 4.649

В целом 78 44 34 0.871 0.01123 5.335

* - здесь и далее - данные вепВапк. п - число клонов, Э -число полиморфных (сегрегирующих) сайтов, Ь - число гаплотипов, Щ - аллельное разнообразие, Р) -нуклеотадное разнообразие, к - среднее число нуклеотидных различий.

0,025 - .-if.

0,02 U u . • /"V

0,015 -■ Af-. I -s * / Ls—\ : J T.- " 4UL d

0,01 - f Ч Г J IJ„J

0,005 - Hd ^

0 -

100

400

200 300 Нукяеотидаая позиция Рис. 6. Распределение нуклеотидного разнообразия рДНК у трех видов. Pi -нуклеотидное разнообразие, Af - Acipenser fulvescens, As - Acipenser schrenckii, Hd - Huso dauncus.

Примечательно, что характер распределения нуклеотидного

разнообразия вдоль исследованного фрагмента рДНК у осетров Амура такой же, как у североамериканского озерного осетра, включая консервативную область между 100 и 200 нуклеотидными позициями (см. рис. 6).

Тесты на дифференциацию показали, что основная часть 500 аллельного и нуклеотидного разнообразия последовательностей рДНК (70-90%) приходится на внутрипопуляционную компоненту. Уровень изменчивости аллельных вариантов гена 18S рРНК, оцененный с помощью индекса

генетических дистанций, у анализируемых видов практически не отличался и варьировал в широком диапазоне: 0.2-3.7% у Acipenser schrenckii и 0.2-3.5% у Huso dauricus. Хотя верхний предел генетических дистанций достаточно высок, он ниже межвидовых различий Acipenseriformes (примерно 5%), и почти такой, как у A. fulvescens (4%) (Krieger, Fuerst, 2002).

Таким образом, результаты исследований указывают, что феномен множественности аллелей ядерных генов 18S рРНК осетров распространяется и на дальневосточные виды; следовательно, механизмы согласованной эволюции у дальневосточных видов, подобно североамериканским, не реализуются в полной мере.

ГЧ I U Ce и с и— А AUA(3

до-Cß <5А-U M i " 1 Г "g G в С —G ч

A—U ¡Zp А§=&А,,

í hfm ñf?i"ñí'fu?j!fTí

С' А

•ф и"

О UGJJUG ^QOb GGAGAUU-..UCAA O U—GÜ с

Ô (í ««о "V1"3

G • UC

Д—8 8—S

iff °!î ;

Л. é

AUUCA UCGAaA

ûArAaG

Ü G A С —,

ccAcc. .ou

AGGGCA GG

Рис. 7. Фрагмент вторичной структуры 18S рРНК Polyodon spathula (по: Kriger, 2000). Жирным курсивом обозначены мутации, специфичные доя A. schrenckii, жирным подчеркнутым - для H. dauricus. Общие мутапци обозначены кружком.

Точные причины высокой внутривидовой изменчивости 18S рДНК у осетров пока неизвестны. Полиплоидная природа генома осетров - наиболее вероятный фактор возникновения и поддержания множественности вариантов последовательности гена 18S рРНК по двум причинам. Гибридизация могла внести разные аллели от разных родителей, или аллополиплоидизация могла увеличить число хромосом, а также кластеров рДНК по сравнению с предковыми формами (Krieger, Fuerst, 2002, 2004). У растений, где полиплоидия широко распространена, в большинстве случаев внутривидовая изменчивость внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) в последовательностях рДНК ассоциирована с полиплоидией или множественностью ядрышкообразующих регионов (NOR) (Camplell et al., 1997). Гибридизацию, как причину разнообразия последовательностей 5.8S рДНК, называют исследователи коралла Acropora (Marquez et al., 2003). Возможно, существует причинная связь между размером генома и обилием копий генов; известно, что псевдогены у организмов с небольшим геномом удаляются быстрее относительно накопления мутаций (Petrov, 2001).

Разнообразие последовательностей 18S рДНК у гибридов осетровых рыб

Поскольку существуют предположения, что реализация механизмов согласованной эволюции осложняется межвидовой гибридизацией, мы эту проблему рассмотрели на примере двух гибридов: A. schrenckii х A. baerii w A. schrenckii х H. dauricus.

Результаты показали, что гибриды, по сравнению с родителями, являются более полиморфными (табл. 4), причем их изменчивость повышается как за счет увеличения частоты мутаций в полиморфных сайтах родителей, так и за счет появления новых, гибрид-специфичных мутаций, отсутствующих в геномах родителей (рис. 8). Вместе с тем, характер распределения нуклеотидного разнообразия вдоль исследуемого фрагмента 18S рДНК у них сохраняется (рис. 9).

Таблица 4. Полиморфизм последовательностей 18S рДНК гибридов осетровых рыб

Таксоны п S h Hd Pi k

A. schrenckii х H. dauricus 26 42 21 0.978 0.01666 8.031

A. schrenckiiх A. baerii 14 18 10 0.890 0.01258 6.088

В целом 40 50 29 0.955 0.01530 7.373

п - число клонов, в - число полиморфных (сегрегирующих) сайтов, Ь - число гаплотипов, ВД - аллельное разнообразие, Р> - нуклеотидное разнообразие, к -среднее число нуклеотидных различий.

Рис. 8. Фрагмент вторичной структуры 18S рРНК Polyodon spathula (по: Kriger, 2000). Жирным курсивом обозначены мутации, специфичные для A. schrenckii х H. dauricus, жирным подчеркнутым - для A. schrenckii х A. baerii. Общие мутации обозначены квадратом.

Дифференциация гибридов с родительскими видами, а также между собой значительно ниже межвидовой дифференциации; согласно тесту AMOVA эти группы сравнения разделяют между собой >90% общего генетического разнообразия. Следовательно, механизмы согласованной эволюции действительно становятся менее эффективными при высоких потоках генов, обусловленных межвидовой гибридизацией.

Pi 0,03 --I

0,02 -

0,01 -

¡Гибри! u

Родите и

Рассматривая возможность повышения разнообразия последовательностей рДНК в результате межвидовой гибридизации, некоторые авторы полагают, что у осетровых рыб вклад гибридизации должен быть минимальным, поскольку межвидовое разнообразие 18S рДНК у них низкое (Krieger, Fuerst, 2004). С этим можно было бы согласиться, если бы формирование гибридного генома было простым суммированием генных комплексов. Косвенное доказательство тому -феномен "гибризимов" (Congiu et а., 2001; Woodruff, 1989). Межвидовая гибридизация - событие драматическое на геномном уровне и не изученное в должной мере, в особенности у полиплоидных видов животных, поэтому наши данные полезное дополнение к имеющимся сведениям.

юо

200 зоо

Нуклеотдцная позиция

400

500

Рис. 9. Распределение нуклеотидного разнообразия рДНК у родителей и гибридов осетровых рыб.

Филогенетический анализ 486 пн последовательностей 18S рДНК осетровых рыб:

гены или псевдогены?

Альтернативным источником внутригеномного полиморфизма рДНК может быть присутствие псевдогенных последовательностей, которые утрачивают свои функции, и как следствие имеют пониженные селективные ограничения и повышенную аккумуляцию мутаций. Недавно возможность присутствия псевдогенов 18S рРНК обсуждалось для североамериканских видов рода Acipenser (Krieger, Fuerst, 2002, 2004). В этой связи мы провели филогенетический анализ клонированных 486 пн последовательностей 18S рДНК. Отдельно сравнивали между собой виды, гибриды, и виды с гибридами. В каждом случае последовательности разделялись на две группы. Первая включала последовательности с высоким уровнем гомологии, вторая, гетерогенная, - более дивергированные последовательности, в которые входили функциональные гены и предполагаемые псевдогены 18S рДНК A. fiilvescens (GenBank), соответственно. Поэтому, эти группы

последовательностей мы условно назвали "генами" и "псевдогенами".

По разным критериям полиморфизм рДНК "псевдогенов" в группе видов в 3-10 раз выше, чем у "генов"; в группе гибридов эти различия составляли не более 40% (табл. 4). Распределение нуклеотидного разнообразия у "генов" и "псевдогенов" в группе родительских видов разительно отличается (рис. 10), причем изменчивость генов минимальна на

~ ~ - .... -г /г

h _ __{~

0,1)1 Srï«*

__^-^^

0 100 200 300 400

1- ■РсдаЕяиГам'" НфдаГаы *** "RyjramrbayrrffM* " 'ПфдаГЬадогеш!

Рис. 10. Распределение нуклеотидного разнообразия у "генов" и "псевдогенов".

всем отрезке анализируемого фрагмента, что свойственно функциональным генам. В группе гибридов эти различия заметно ниже. Дифференциация генов и псевдогенов существенно выше, чем дифференциация видов, или гибридов - они разделяют не >50% общего генетического разнообразия (тест AMO VA).

Анализ характера замен и тесты на нейтральность свидетельствуют о том, что "псевдогены" действительно испытывают меньшие селективные ограничения по сравнению с "генами" (табл. 5).

При анализе распределения мутаций по вторичной структуре участка гена 18S рРНК, мы обнаружили, что в спирали 27 (позиции 1103-1129 полноразмерного гена) "псевдогенов" имеются как нуклеотидные замены, так и деления (рис. 11).

Ï "^Ил^пЧЧгц" eAAuA4!/U3GUUAU<í0GGCc"U'3" О •! !•( V I •!• I M MI i - Hl I -II ^

U.o ^Cgu OeACAUl^uUCAA Оц-UG Oj. ^ ^ ¿

O izl i •Л i

GC А

G AU

GGGAGL) U

A U U A,

№

« G

cu c

Saaa

Рис. 11. Фрагмент вторичной структуры Polyodon spathula (по: Krieger, 2000). Жирным курсивом обозначены мутации для псевдогенов, D - делеция, I - инсерция. Спираль 27 отмечена дугой, в квадрате - увеличенное изображение Н27.

Таблица 5. Характер нуклеотидных замен и тесты на нейтральность для генов и псевдогенов

Груша сравнения ZnS (С-»Т) + (G—>А): Другие замены La-Lb

Виды Гены 0.182 1:2.5 -0.009159 (Z=2.326)

Псевдогены 0.082 1 :1

Гибриды Гены 0.226 1:2 -0.010587 (Z=2.083)

Псевдогены 0.276 1: 1.5

- тест на нейтральность Келли; Ьа и ЬЬ - среднее наблюдаемое число замен на сайт (длины ветвей) кластеров А (гены) и В (псевдогены) в сравнении с общим предком, различия считаются достоверными при Z>1.96.

По существующим литературным данным, спираль 27 является конформационным переключателем, отвечающим за точность трансляции, и выполняет функции межсубъединичного моста (НоеЛег <¡1 а1., 2004). Это делает ее ключевой структурой в динамике и функционировании рибосомы. Наличие делеции в конформационном

переключателе свидетельствует о нарушении его функциональности. Это дает основания предполагать потерю "псевдогенами" функциональной активности. У "генов" мутаций, влияющих на функционирование рибосомы, не обнаружено.

Таким образом, эта часть исследований подтверждает наличие в геномах осетровых рыб Амура различных по функциональной значимости копий ядерного гена 18S рРНК. Вместе с тем, по результатам анализа только участка гена нельзя сказать, какая последовательность является геном, а какая псевдогеном; для этого необходимо детальное исследование полноразмерного гена.

Псевдогены рРНК малой субъединицы рибосом найдены в разных организмах, от бактерий (Skamarov et al., 1995) до приматов (Brownell et al., 1983). Такие последовательности часто идентифицируются потому, что они усечены, или несут множественные замены и инсерции/делеции по сравнению с их функциональными двойниками. Теоретически, "псевдогенизация" - наиболее вероятная судьба большинства генных экстра-копий; более 90% вновь образованных копий гена деградируют до псевдогенов. Недавно пришли к убеждению, что наиболее общая судьба комплекса дуплицированных генов должна быть ни в не-функциональности, ни в неофункциональности, а в суб-функционализации, которая определяется как часть функции (функций), первоначально выполняемой одиночным предковым геном между его дупликациями (Rodin, Riggs, 2003). Суб-функционализация может быть обеспечена мутационными процессами дупликации-дегенерации-комплементации, которые либо сохраняют дупликаты, как они есть, либо освобождают гены от селективных ограничений для дальнейшей эволюционной шлифовки субфункций (Linch et al., 2001).

Эволюционную перспективу множественных копий 18S рДНК осетров Амура мы попытались прояснить с помощью филогенетического анализа, используя реконструкцию MST, требующую для построения минимальное число шагов (рис. 12). Филогенетический анализ, выполненный для шести видов осетровых рыб, распределил все последовательности рДНК в два кластера с 3 основными аллельными вариантами (А, В и С). Различия варианта А с вариантами В (1.9%) и С (1.5%) существенно выше различий между вариантами В и С (0.4%). Вариант А, составляющий основу первого кластера (32% проанализированных сиквенсов), включал 12 последовательностей Л. schrenckii, 11 - H. dauricus, I - A. sturio и функциональные гены A. fulvescens. Варианты В и С были центральными во втором кластере; они объединяли 12% и 7% от общего числа последовательностей соответственно, причем вариант В представлен рДНК преимущественно амурских видов осетров, а С - североамериканских.

Дифференциация кластеров по гаплотипическому разнообразию невысока (Gst = 0.122), но по данным нуклеотидного разнообразия она существенна (Fst = 0.629), причем эти значения заметно выше оценок, полученных при сравнении видов. Анализ характера замен, тесты на нейтральность указывают, что вариант А действительно представлен главным образом функциональными генами, а варианты В и С - последовательностями, эволюционирующими под действием ослабленного давления (табл. 4). Логично предположить, что центральные последовательности вариантов В и С - наиболее вероятные "кандидаты" на суб-функционализацию, связанную с локальными адаптациями видов (которые более схожи у амурского осетра и калуги по сравнению с североамериканским озерным осетром). Обнаруженная подразделенность "псевдогенов"

Рис. 12. MST-реконструкция последовательностей 18S рДНК шести видов осетровых рыб. S -A. schrenckii, R - A. ruthenus, F - A. fulvescens, В - A. brevirostrum, D - Я. dauricus, St - А. sturio. Число штрихов и числа на соединяющих ветвях соответствуют количеству мутаций. Размер кружка пропорциональна количеству клонов.

дает основание предположить и альтернативное объяснение; оно заключается в том, что у осетров могут быть два функциональных варианта гена 18S рРНК, мажорный и минорный, что сближает их с другими изученными видами. Например, у кузнечика Podisma pedeslris обнаружено две функциональных группы последовательностей рДНК и несколько псевдогенных (многие из которых транскрибируются), причем, только одна их функциональных групп представлена высоким числом копий (Keller et al., 2006). В любом случае, множественность копий рДНК придает виду эволюционную пластичность. И улучшение свойств функциональной последовательности такого гена, как 18S рРНК, и наличие разных функциональных последовательностей, является очень важным для адаптации вида в постоянно изменяющейся среде обитания. Возможно, отчасти по этой причине Acipenseriformes смогли сохраниться в течение многих миллионов лет, намного пережив фауну динозавров.

Филогенетические связи амурского осетра но данным полной последовательности

18S рДНК

Для анализа филогенетических связей амурского осетра с другими видами Acipenseridae нами было секвенировано 7 клонированных полноразмерных последовательностей 18S рДНК длиной 1746 п.н., у которых 486 нуклеотидные участки (позиции 960-1444 п.н. полноразмерного гена) были наименее изменчивы. Анализ распределения вставок и делеций относительно вторичной структуры 18S рДНК Polyodon spathula (Krieger, 2000), ближайшего филогенетического родственника видов Acipenser, подтвердил наличие у A. schrenckii 6 "горячих точек", т.е. сайтов со вставками/делециями во всех проанализированных последовательностях, выявленных ранее у Acipenseriformes в пределах двух участков I8S рДНК общей длиной 788 п.н. (Krieger et al., 2006). Все без исключения "горячие точки" находятся в вариабельных областях молекулы 18S рРНК. Кроме того, нами обнаружена специфичная для A. schrenckii вставка аденина после

позиции 658 п.н., не вошедшая в исследованный ранее участок (табл. 6). Данный признак может быть полезен в дальнейшем для таксономической идентификации амурского осетра.

Таблица 6. Распределение инсерций и делений в полноразмерных копиях гена 18S рРНК осетровых рыб

Вид Нуклеотидная позиция

53 265 658 771 840 1366 1696

Af* + + + + + +

As + + + + + + +

Позиции пронумерованы согласно

последовательности Р. зра№и1а (АР 1883 71). Инсерций выделены жирным, делеция -курсивом. Для инсерций номер позиции предшествует мутации. Знак "+" обозначает присутствие мутации; родоспедифичные мутации подчеркнуты. АР* - А. ^Ь/еисет, Къ-А.

Используя модель вторичной структуры 18S рРНК американского весдоноса Polyodon spathula (Krieger. 2000), мы проследили распределение мутаций по функциональным доменам молекулы для каждого из 7 клонов рДНК A. schrenckii. Структурно-функциональный анализ не выявил каких-либо мутаций в ключевых структурах, связанных с декодированием, транслокацией и трансляционной точностью (спирали 27, 34. 45 петля 530 и участок С1400 с А- и Р-сайтами) анализируемых вариантов 18S рРНК, что предполагает сохранение ими функциональной значимости. Наибольшую важность среди функциональных доменов представляет спираль 27 (Н27). Мутационный профиль ¡8S рДНК A. schrenckii имеет выраженное сходство с таковым A. fulvescens (данные GenBank) (рис. 13).

Филогенетические реконструкции, построенные для As-7 (т.е. последовательности, предположительно кодирующей функциональные молекулы 18S рРНК А. schrenckii) при помощи разных методов, показали одинаковую топологию. Амурский осетр A. schrenckii и стерлядь A. ruthenus определяются в них сестринскими таксонами, от которых последовательно ответвляются А. sturio, A. fulvescens и P. spathula (рис. 14). Причем, достаточно высокую статистическую поддержку получает лишь монофилия рода осетров Acipenser.

Полученные результаты согласуются с данным Артюхина (Artyukhin, 1995; 2006), основанными на исследовании морфологии и экологии Acipenseridae. Филогенетические связи осетров, реконструированные в цитируемой работе по 21 синапоморфии, указывают на близкие отношения между A. schrenckii я A. ruthenus, и большую удаленность этих видов от A. fulvescens по

Ins (10%) Del (4%) Complex

A. fulvescens

Del (7%) Complex { /0%)

A. schrenckii

Puc. 13. Мутационный профиль 18S рДНК озерного (GenBank) и амурского осетров. Ts - транзиции, Tv -трансверсии, Ins - вставки, Del - делеции. Complex -мутации, затрагивающие более трех нуклеотидов.

сравнению с А. 5Сипо. По мнению автора, виды, обитающие в одной эндемичной зоне, являются наиболее близкими, но не обязательно монофилетическими; группы осетровых рыб внутри одной эндемичной зоны могут быть распределены в разные подроды. В частности, амурский осетр (Амурская эндемичная зона) и стерлядь (Адриатическо-Понто-Каспийекая зона) входят в один подрод &е/7е/<з; балтийский осетр (Северо-Атлантическая

зона) и озерный осетр (Восточно-Американская эндемичная зона) включены в два разных подрода: Sturio и Dinectus, соответственно.

Иной является топология филогенетических древ, полученных по данным изменчивости гена цитохрома b мтДНК (Ludwig et al., 2001). В ней кластер Acipenseridae разделяется на две монофилетичные группы, объединяющие соответственно Атлантические и Тихоокеанские виды, по отношению к которым А. sturio занимает базальное положение.

66/66/65/69

-/-/55/66

80/72/70/89 -

100

- Oncorhynchus mykiss

Рис. 14. Филогенетические связи амурского осетра A. schrenckii с другами видами Acipenseriformes (данные GenBank) по данным полной последовательности 18S рДНК. Цифры над узлами древа показывают уровень статистической поддержки ветвления для NJ/ME/ML/Bayesian реконструкций, под узлами - для МР; ~ означает, что уровень поддержки ниже 50%. АПК -Адриатическо-Понго-Каспийская, СА - Северо-Атлантическая, ВА - Восточно-Американская эндемичные зоны.

Хотя филогенетические реконструкции, основанные на признаках, имеющих разный тип наследования, совпадают далеко не всегда, мы не исключаем, что с вводом в анализ 18S рДНК дополнительных данных по другим видам Acipenser, океаническая дифференциация осетровых рыб, выявленная при анализе мтДНК, может быть подтверждена. Пока наши данные можно рассматривать, как доказательство выраженной географической дифференциации Acipenseridae, подчеркивающее глубокую связь видов осетровых рыб с озерными и речными системами.

Таким образом, филогенетический анализ указывает на достоверную генетическую дифференциацию между видами, обитающими в Северной Америке и Евразии, и более тесные связи амурского осетра со стерлядью, чем с атлантическим осетром. Полученные данные позволяют признать полезным использование полноразмерных последовательностей 18S рДНК для биогеографических реконструкций и исследований филогенетических связей между видами осетровых рыб.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование включает RAPD-PCR анализ выборки из 46 особей природных популяций осетровых рыб Амура, а также 70 сеголеток, полученных в результате семи индивидуальных скрещиваний (внутри и между видами, включая разные роды) на базе научно-исследовательской станции ТИНРО-центра, основанный на данных по 173 и 252 локусам, соответственно; клонирование, секвенирование, структурно-функциональный и филогенетический анализы 110 участков 18S рДНК (размером 486 пн) амурского осетра, калуги и гибридов амурского осетра с калугой и сибирским осетром; а также определение полной (1746 пн) последовательности 18S рДНК амурского осетра (7

Acipenser schrenckii

АПК

Acipenser ruthenus -1 Acipenser sturio CA

Acipenser ftitvescens —i

Polyodon spathula

клонов) и реконструкции ее филогенетических связей с аналогичными участками родственных и филогенетически более далеких видов.

Согласно RAPD данным, аборигенные популяции амурского осетра Acipenser schrenckii и калуги Huso dauricus, ранее генетическими методами не изучавшиеся, сохранили достаточно высокий уровень генетического разнообразия, намного превышающий таковой в выборках, полученных при искусственном разведении (вероятнее всего, вследствие использования ограниченного числа производителей). Вместе с тем, получены генетические свидетельства гибридного происхождения двух особей (фенотипических гибридов); наличие гибридов в природных популяциях Acipenseridae расценивается как один из факторов риска.

Для каждого из 4 сравниваемых ввдов осетровых рыб (амурский и сибирский осетры, стерлядь и калуга) выявлены таксон специфичные RAPD маркеры. Диагностические фрагменты для гибридных особей первой генерации не обнаружены, но для них выделены некоторые особенности RAPD спектров; сохранение в одном геноме маркерных фрагментов ДНК обоих родителей (1), наличие специфичных фрагментов ДНК, отсутствующих у родителей (2), и зависимость частоты встречаемости некоторых фрагментов ДНК от направления скрещиваний (3). Если две первые особенности достаточно широко обсуждаются в литературных источниках, третья упоминается лишь в единичных исследованиях искусственных популяций лососевых рыб, что заслуживает особого внимания и дальнейшего исследования.

Статистические методы по данным изменчивости RAPD спектров отчетливо разделяют особей исходных видов и Fj гибридное потомство с дифференциацией на группы с разным направлением скрещивания. В природной популяции для дискриминации видов и гибридов наиболее эффективными оказались точный тест на дифференциацию популяций и многомерное шкалирование. Таким образом, мультилокусные RAPD-PCR маркеры могут служить удобным и надежным инструментом для проведения генетического мониторинга популяций амурских осетровых рыб с целью сохранения их генофонда, а также использоваться для видовой идентификации коммерческих продуктов.

Феномен множественности аллелей 18S рДНК, свидетельствующий о неполной реализации механизмов согласованной эволюции, был недавно обнаружен у североамериканского вида A. fulvescens. Проведенные нами исследования позволили не только выявить в геномах осетровых рыб Амура множественные варианты 18S рДНК, но впервые получить доказательства того, что они (при минимальных межвидовых отличиях характера распределения нуклеотидного разнообразия) подвергаются разным эволюционным ограничениям, предполагающим высокую вероятность наличия среди изученных копий как генных, так и псевдогенных последовательностей. Основной ролью псевдогенизации, по крайней мере, у осетровых рыб, очевидно, является улучшение свойств функциональной последовательности.

гибридизацией. Выявленные особенности молекулярной эволюции рДНК осетровых рыб, их высокое разнообразие на молекулярном уровне, очевидно, дают эволюционное преимущество, помогая видам более успешно адаптироваться к изменениям внешней среды.

Структурно-функциональный и филогенетический анализы полной последовательности 18S рДНК амурского осетра, выполненные впервые, позволили выявить видоспецифичные мутации A. schrenckii, а также выделить среди изученных клонов предположительно функциональные последовательности. Филогенетический анализ генов 18S рРНК с привлечением имеющихся к настоящему времени данных из GenBank (по A. fulvescens, A. sturio и A. ruthenus) с высокой вероятностью разделил евразийские виды осетровых рыб с североамериканским озерным осетром и указал на высокую филогенетическую близость амурского осетра со стерлядью.

Таким образом, в настоящей работе получены новые данные о характере генетического разнообразия осетровых рыб и механизмах, генерирующих это разнообразие, имеющие научный и практический интерес. Дальнейшее изучение механизмов согласованной эволюции рДНК и филогенетических связей между видами осетровых рыб по данным полной последовательности гена 18S рРНК представляется нам наиболее перспективными и актуальными направлениями исследований.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены видоспецифичные RAPD-локусы для амурского осетра Acipenser schrenckii (1140), сибирского осетра^, baerii (1030-870) и стерляди^, ruthenus (420).

2. Выявлено три основных типа отличий в RAPD спектрах геномов гибридов: сохранение маркерных фрагментов ДНК обоих родителей, наличие гибрид-специфичных фрагментов ДНК и зависимость частоты встречаемости некоторых фрагментов ДНК от направления скрещиваний.

3. С помощью молекулярных маркеров ядерной ДНК (RAPD-локусы и локусы 18S рДНК) установлено, что гибриды осетровых рыб Fj генерации более вариабельны, чем их родители.

4. Получены генетические свидетельства гибридного происхождения двух фенотипических гибридов между амурским осетром и калугой из природной популяции Амура; наличие гибридов расценивается как один из факторов риска.

5. Показано, что аборигенные популяции Acipenser schrenckii и Huso dauricus Амура сохранили высокий уровень генетического разнообразия; мультилокусные RAPD-маркеры признаются удобным и надежным инструментом для проведения генетического мониторинга популяций амурских осетровых рыб с целью сохранения их генофонда.

6. Обнаружена высокая внутри-индивидуальная изменчивость последовательностей 18S рДНК A. schrenckii и H. dauricus-, уровень изменчивости и характер распределения нуклеотидных замен у осетров Амура такой же, как у североамериканского A. fulvescens (GenBank).

7. Доказано, что разные аллельные варианты гена 18S рРНК осетровых рыб Амура испытывают разные селективные ограничения, что позволяет выделить среди них функциональные гены и псевдогены.

8. С привлечением данных из GenBank по полной последовательности гена 18S рРНК, установлены географическая подразделенность осетров на североамериканскую и евразийскую группы и тесные эволюционные связи амурского осетра и стерляди.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рожкован К.В. Феномен индивидуальной изменчивости 18S рДНК у осетров Амура // Вестник ДВО РАН. 2007. Т. 4. С. 136-140.

2. Челомина Г.Н., Рожкован К.В., Киселев К.В., Иванов С.А., Булгаков В.П. Множественность аллелей гена ядерной 18S рРНК осетров Амура: гены или псевдогены // Доклады Академии Наук. 2008. Т. 420 (2). С. 257-260.

3. Челомина Г.Н., Рожкован К.В., Рачек Е.И., Журавлев Ю.Н. Повышенное генетическое разнообразие 18S рДНК в геномах F, гибридов (Acipenser schrenckii х A. baerii и А. schrenckii х H. dauricus) осетровых рыб // Доклады Академии Наук. 2008. Т. 421 (6). С. 845849.

4. Челомина Г.Н., Рожкован К.В., Иванов С.А. Дискриминация межвидовых гибридов в природных популяциях осетровых рыб Амура с помощью мультилокусных RAPD-PCR маркеров // Цитология и генетика. 2008. Т. 42 (5). С. 61-71.

5. Рожкован К.В., Челомина Г.Н., Рачек Е.И. Молекулярная идентификация и особенности генетического разнообразия межвидовых гибридов амурского осетра (Acipenser schrenckii X A. baerii, A. baerii х A. schrenckii, A. schrenckii х A. ruthenus, A. ruthenus х A. schrenckii) по данным изменчивости мультилокусных RAPD-маркеров // Генетика. 2008. Т. 44 (11). С. 1453-1460.

6. Рожкован К.В., Челомина Г.Н., Валова В.Н., Рачек Е.И. Секвенирование последовательности ДНК, кодирующей ген 18S рРНК амурского осетра Acipenser schrenckii Brandt, 1869: гены или псевдогены? // Эволюция жизни на Земле. Материалы III Международного симпозиума. Томск, 2005. С. 66-68.

7. Рожкован КВ., Челомина Г.Н., Рачек Е.И. Идентификация межвидовых гибридов осетровых рыб методом RAPD-PCR анализа // Молекулярная и прикладная генетика. T. I. Ин-т генетики и цитологии Национальной акад. наук. Беларуси. Минск, 2005. С. 110.

8. Рожкован К.В., Челомина Г.Н., Иванов С.А. Молекулярная эволюция рДНК амурского осетра Acipenser schrenckii и калуги Huso dauricus: данные частичного секвенирования гена 18S рРНК // Современные проблемы биологической эволюции: материалы международной конференции, посвященной 100-летию Дарвиновского музея. Москва, 2007. С. 162.

9. Rozhkovan K.V., Chelomina G.N., Ivanov S.A. Identification of interspecific hybrids between Acipenser schrenckii and Huso dauricus in natural populations of Amur River by multilocus nuclear markers // MAPEEG-2007. P. 29.

10. Rozhkovan K.V., Chelomina G.N., Ivanov S.A., Kiselev K.V., Bulgakov V.P. Multiple alleles of the nuclear ribosomal RNA gene in sturgeons of Amur River (Acipenser schrenckii and Huso dauricus) based on partial sequencing data of cloned 18S rDNA // MAPEEG-2007. P. 30.

РОЖКОВАН КОНСТАНТИН ВАСИЛЬЕВИЧ

Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus (Georgii, 1775)

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 28.09.2008 г. Формат 60x90/16.1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 103. Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» г. Владивосток, уд. Западная, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рожкован, Константин Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биология, молекулярная эволюция и филогения осетровых рыб.

1.1.1. Происхождение и разнообразие.

1.1.2. Осетровые рыбы Амура.

1.1.3. Полиплоидия.

1.1.4. Межвидовая гибридизация.

1.1.5. Филогенетика и систематика.

1.1.6. Популяционная генетика.

1.1.7. Гены ядерной 18S рДНК.

1.2. Краткая характеристика используемых методов и маркеров.

1.2.1. Полимеразная цепная реакция и RAPD-анализ.

1.2.2. Секвенирование ДНК.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Получение геномной ДНК.

2.2. RAPD-PCR анализ.

2.3. PCR-амплификация 18S рДНК.

2.4. Клонирование 18S рДНК.

2.5. Секвенирование последовательности 18S рДНК.

2.6. Статистический анализ молекулярных данных.

2.6.1. Обработка RAPD-данных.

2.6.2. Обработка данных секвенирования 18S рДНК.

2.6.3. Филогенетические реконструкции.

2.6.4. Многомерное шкалирование (MDS).

2.6.5. Тесты для пседогенов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Генетическое разнообразие и таксономическая идентификация осетровых рыб по данным изменчивости мультилокусных RAPD-маркеров.

3.1.1. Молекулярная идентификация и особенности генетического разнообразия межвидовых гибридов амурского осетра, полученных при искусственном скрещивании.

3.1.2. Дискриминация межвидовых гибридов в природных популяциях осетровых рыб Амура.

3.2. Молекулярная эволюция, генетическое разнообразие и филогенетические связи 18S рДНК.

3.2.1. Генетическое разнообразие последовательностей 18S рДНК амурского осетра и калуги.

3.2.2. Разнообразие последовательностей 18S рДНК у гибридов осетровых рыб.

3.2.3. Филогенетический анализ 486 пн последовательностей 18S рДНК осетровых рыб: гены и псевдогены?.

3.2.5. Филогенетические связи амурского осетра по данным полной последовательности 18S рДНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus (Georgii, 1775)"

Актуальность проблемы. Отряд Acipenseriformes (осетры и веслоносы) является древней группой рыб, ведущей свое происхождение из Юрского Периода (Grande, Bemis, 1991). Осетровые имеют ряд морфологических особенностей: хрящевой скелет, спиральный клапан в пищеварительном тракте, гетероцеркальный хвост и хорошо развитый рострум с низко расположенным ртом (Sokolov, Berdichevskii, 1989). Другими важными особенностями осетровых рыб являются долгая продолжительность жизни, возможность достижения больших размеров и медленное созревание. Широкое использование этой группы в коммерческих целях привело к масштабному вылову осетровых, что значительно уменьшило их численность. В настоящее время весь род включен в списки Международной конвенции по редким видам (CITES). Основными факторами уменьшения численности осетровых рыб являются (1) некоторые биологические особенности этих рыб (прежде всего медленное созревание, размножение с промежутками в несколько лет, миграции), (2) загрязнение и уничтожение естественных мест обитания и нерестилищ, строительство дамб на нерестовых путях и (3) чрезмерный вылов (Krieger et al., 2008; Ludwig, 2008).

Генетические исследования осетровых выявили некоторые особенности, такие как, консервативный характер кариологической (Lanfredi et al., 2001; Chicca et al., 2002), биохимической (Khabarov et al., 2002) и молекулярной (de la Herran et al., 2001; Krieger, Fuerst, 2000) эволюции, a также множественность аллелей гена ядерной 18S рРНК (Krieger, Fuerst, 2002; 2004; Krieger et al., 2006), что делает эту группу особенно привлекательной для всестороннего изучения. Все осетровые являются полиплоидами (4w-8/7-16w) и обладают большим (120-500) числом хромосом (Birstein et al., 1993; Fontana et al., 1999). Эти факторы, возможно, явились причиной относительно простой межвидовой и межродовой гибридизации, усугубляемой перекрытием зон нереста. Гибридизация делает систематику Acipenseridae весьма запутанной (Birstein, 2002).

Цель и задачи исследования. Цель работы - исследование особенностей молекулярной эволюции и механизмов формирования генетического разнообразия у осетровых рыб на примере амурского осетра, калуги и их гибридов. Основные задачи исследования:

2. Клонировать и секвенировать участок гена 18S рРНК амурского осетра, калуги и межвидовых гибридов (A. schrenckii х A. baerii и A. schrenckii х Н. daaricus), а также полную последовательность 18S рДНК амурского осетра;

Научная новизна. Практически все полученные в работе результаты являются новыми и приоритетными. Впервые выполнено сравнительное исследование генетической изменчивости двух видов осетровых рыб из природных популяций Амура; дан анализ особенностей наследования RAPD-локусов в F] генерации межвидовых гибридов: геномы гибридов содержат часть признаков обоих родителей, а также гибрид-специфичные локусы, отсутствующие в геномах родительских видов; наследование некоторых признаков зависит от направления скрещивания. Впервые клонирована и секвенирована полная последовательность ядерной 18S рДНК амурского осетра, проведены ее структурно-функциональный и филогенетический анализы. Впервые клонированы и секвенированы 486 пн участки 18S рДНК амурского осетра, калуги, гибридов амурского осетра с калугой и с сибирским осетром. Показаны множественность аллелей генов 18S рРНК у дальневосточных видов осетровых рыб и повышение их генетического разнообразия при межвидовой гибридизации. Доказано существование среди аллельных вариантов функциональных последовательностей 18S рДНК и последовательностей, эволюционирующих под ослабленным селективным давлением. Даны высокие оценки шанса выживания осетровых рыб Амура, при условии отсутствия антропогенного пресса; обнаружение в природных популяциях межвидовых гибридов рассматривается как один из факторов риска. RAPD маркеры признаны полезными для генетического мониторинга ч природных популяций осетровых рыб Амура в целях сохранения их генофонда.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты важны для понимания общих закономерностей видообразования и формирования гибридного генома, эволюционной судьбы дуплицированных генов, а также механизмов генерирования и поддержания генетического разнообразия у полиплоидных видов животных в целом. Уточнение филогенетических связей осетров Амура является вкладом в разработку систематики и филогении Acipenseriformes. Поскольку осетры имеют большой экономический интерес, молекулярные данные могут быть использованы для сертификации коммерческих продуктов. В связи со статусом редких видов, данные об особенностях генетического разнообразия осетров Амура крайне необходимы для разработки эффективных мер по их сохранению и рациональному природопользованию.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международных конференциях "Эволюция жизни на Земле", г. Томск (2005), "Современные проблемы генетики", г. Минск (2005), "Современные проблемы биологической эволюции", г. Москва (2007), "MAPEEG", г. Владивосток (2007) и конкурсе молодых ученых БПИ ДВО РАН, г Владивосток (2006, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 208 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 54 рисунками. Список литературы включает 318 наименований, из них 278 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рожкован, Константин Васильевич

выводы

1. Обнаружены видоспецифичные RAPD-локусы для амурского осетра Acipenser schrenckii (1140), сибирского осетра A. baerii (1030-870) и стерляди A. ruthenus (420);

2. Выявлено три основных типа отличий в RAPD спектрах геномов гибридов по сравнению с родительскими видами: сохранение маркерных фрагментов ДНК обоих родителей, наличие гибрид-специфичных фрагментов ДНК и зависимость частоты встречаемости некоторых фрагментов ДНК от направления скрещиваний;

3. С помощью молекулярных маркеров ядерной ДНК (RAPD-локусы и локусы 18S рДНК) установлено, что гибриды осетровых рыб Fi генерации более вариабельны, чем их родители;

6. Обнаружена высокая внутри-индивидуальная изменчивость последовательностей 18S рДНК A. schrenckii и Н. dauricus; уровень изменчивости и характер распределения нуклеотидных замен у осетров Амура такой же, как у североамериканского A. fulvescens (GenBank);

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для каждого из 4 сравниваемых видов осетровых рыб (амурский и сибирский осетры, стерлядь и калуга) выявлены таксон специфичные RAPD маркеры. Диагностические фрагменты для гибридных особей первой генерации не обнаружены, но для них выделены некоторые особенности RAPD спектров: сохранение в одном геноме маркерных фрагментов ДНК обоих родителей (1), наличие специфичных фрагментов ДНК, отсутствующих у родителей (2), и зависимость частоты встречаемости некоторых фрагментов ДНК от направления скрещиваний (3). Если две первые особенности достаточно широко обсуждаются в литературных источниках, третья упоминается лишь в единичных исследованиях искусственных популяций лососевых рыб, что заслуживает особого внимания и дальнейшего исследования.

Статистические методы по данным изменчивости RAPD спектров отчетливо разделяют особей исходных видов и Fi гибридное потомство с дифференциацией на группы с разным направлением скрещивания. В природной популяции для дискриминации видов и гибридов наиболее эффективными оказались точный тест на дифференциацию популяций и многомерное шкалирование. Таким образом, мультилокусные RAPD-PCR маркеры могут служить удобным и надежным инструментом для проведения генетического мониторинга популяций амурских осетровых рыб с целью сохранения их генофонда, а также использоваться для видовой идентификации коммерческих продуктов.

Впервые получены генетические свидетельства снижения эффективности механизмов согласованной эволюции 18S рДНК в геномах осетровых рыб при высоких потоках генов, обусловленных гибридизацией, которые выражаются в существенном повышении общего генетического разнообразия последовательностей данного семейства у гибридов, включая появление гибрид-специфичных мутаций, а также "сглаживание" различий между генами и псевдогенами. Такой результат, может быть, прежде всего, обусловлен взаимодействиями (генные конверсии и рекомбинации) между локусами с последовательностями рДНК различной функциональной значимости, индуцированными межвидовой/межродовой гибридизацией. Выявленные особенности молекулярной эволюции рДНК осетровых рыб, их высокое разнообразие на молекулярном уровне, очевидно, дают эволюционное преимущество, помогая видам более успешно адаптироваться к изменениям внешней среды.

Структурно-функциональный и филогенетический анализы полной последовательности 18S рДНК амурского осетра, выполненные впервые, позволили выявить видоспецифичные мутации A. schrenckii, а также выделить среди изученных клонов предположительно функциональные последовательности. Филогенетический анализ генов 18S рРНК с привлечением имеющихся к настоящему времени данных из GenBank (по А. fulvescens, A. sturio и A. ruthenus) с высокой вероятностью разделил евразийские виды осетровых рыб с североамериканским озерным осетром и указал на высокую филогенетическую близость амурского осетра со стерлядью.

Таким образом, в настоящей работе получены новые данные о характере генетического разнообразия осетровых рыб и механизмах, генерирующих это разнообразие, имеющие научный и практический интерес. Дальнейшее изучение механизмов согласованной эволюции рДНК (включая их нарушение при межвидовом скрещивании) и филогенетических связей между видами осетровых рыб по данным полной последовательности гена 18S рРНК представляется нам наиболее перспективными и актуальными направлениями исследований.

161

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рожкован, Константин Васильевич, Владивосток

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. Популяционная генетика лососевых рыб. М.: Наука, 1997. 288 с.

2. Аннотированный каталог круглоротых и рыб континентальных вод России // Под ред. Ю.С. Решетникова. М.: Наука, 1998. 218 с.

3. Арефьев В.А. Поликариограммный анализ шипа Acipenser nudiventris Livetsky (Acipenseridae, Chondrostei) // Вопр. ихтиологии. 1983. Т. 23, вып. 2. С. 209-218.

4. Атлас пресноводных рыб России: В 2 т. Т.1. // Под ред. Ю.С. Решетникова. М.: Наука. 2002. 379 с.

5. Атопкин Д.М., Богданов А.С., Челомина Г.Н. Генетическая изменчивость и дифференциация полевой мыши Apodemus agrarius II Генетика. 2007. Т. 43. С. 804-817.

6. Берг JI.C. Рыбы пресных вод СССР и сопредельных стран. Т. 1. JL: Изд-во АН СССР. 1948. 468 с.

7. Боровиков В.П. Популярное введение в программу Statistica // Компьютер Пресс. 1998. 266 с.

8. Васильев В.П. Эволюционная кариология рыб. М.: Наука. 1985. 300 с.

9. Войнова Н.В. RAPD-фингерпринтинг производителей русского осетра {Acipenser gueldenstaedtii). II Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. 2004. Т. 1. С. 38-45.

10. Гриценко О.Ф., Костюнин Г.М. Амурский сиг Coregonus ussuriensis Berg и калуга Huso dauricus Georgi в сахалинских водах // Вопр. ихтиологии. 1979. Т. 19. Вып. 6. С. 1125-1128.

11. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях // Под ред. Ю.П. Алтухова. М.: Наука, 2004. - 619 с.

12. Кимура М. Молекулярная эволюция: Теория нейтральности. М.: Мир, 1985. -398 с.

13. Красная книга Российской Федерации. М.: ACT, Астрель. 2001. С. 25-260.

14. Крыхтин М.Л. Современное состояние и перспективы развития осетрового хозяйства в бассейне Амура. // В сб. Биолог, основы развития осетрового хозяйства в водоемах СССР. М.: Наука. 1979. С. 68-74.

15. Крыхтин М.Л. Темп полового созревания и ритм размножения калуги Huso dauricus (Georgi) лимана Амура // Вопросы ихтиологии. 1986. Т. 26. С. 945-954.

16. Крыхтин М.Л., Горбач Э.И. Осетровые рыбы Дальнего Востока // Экономическая жизнь Дальнего Востока. 1994. №1 (3). С. 86-91.

17. Кутергина И.Г., Рябова Г.Д. Генетический анализ наследования дуплицированных локусов лактатдегидрогеназы Ldh3 и Ldh4 у севрюги. //Генетика. 1990. Т. 26. С. 952-954.

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.

19. Мюге Н.С., Барминцева А.Е., Расторгуев С.М., Мюге В.Н., Барминцев В.А. Полиморфизм контрольного региона митохондриальной ДНК восьми видов осетровых и разработка системы ДНК-идентификации видов. // Генетика. 2008. Т. 44. С. 913-919.

20. Никольский Г.В. 1956. Рыбы бассейна Амура. М.: Изд-во АН СССР, 551 с.

21. Панов Е.Н. Гибридизация и экологическая изоляция у птиц. М.: Наука, 1989. 509 с.

22. Подушка С.Б. Стерильны ли "стерильные" гибриды осетровых? // Аквакультура осетровых рыб: достижения и перспективы развития: Материалы докладов III международной начно-практической конференции. Астрахань, 2004. С. 202-203.

23. Рожкован К.В., Челомина Г.Н., Рачек Е.И. Идентификация межвидовых гибридов осетровых рыб методом RAPD-PCR анализа // Молекулярная и прикладная генетика. Т. I. Ин-т генетики и цитологии Национальной акад. наук. Беларуси. Минск. 2005. С. 110.

24. Рябова Г.Д., Кутергина И.Г. Анализ аллозимной изменчивости севрюги Acipenser stellatus (Pallas) северного Каспия. // Генетика. 1990. Т. 26. С. 902-911.

25. Рябова Г.Д., Офицеров М.В., Шишанова Е.И. Исследование связи между аллозимной изменчивостью и некоторыми компонентами приспособленности у севрюги Acipenser stellatus (Pallas). // Генетика. 1995. Т. 31. С. 1679-1692.

26. Рябова Г.Д., Климонов В.О., Афанасьев К.И, Вышкварцев Д.И., Москалейчик Ф.Ф., Рубцова Г.А. Изменчивость морфометрических характеристик молоди севрюги при выращивании в прудах с различной плотностью посадки. //Генетика. 2006 а. Т. 42. С. 244-255.

27. Рябова Г.Д., Климонов В.О., Афанасьев К.И., Рубцова Г.А., Довгопол Г.Ф., Ходоревская Р.П. Сравнение динамики нерестовой миграции, генетических и биологических параметров севрюги волжского стада 1985, 1996 гг. //Генетика. 2006 б. Т. 42. С. 1406-1414.

28. Свирский В.Г. Амурский осетр и калуга (систематика, биология, перспективы воспроизводства). Автореф. канд. биол. наук. Владивосток: ДВГУ, 1967. 32 с.

29. Семенова С.К., Илларионова Н.А., Васильев В.А., Шубкина А.В., Рысков А.П. Генетический анализ и оценка генетического разнообразия восточноевропейских пород борзых собак (Cams familiaris L.) // Генетика. Т. 2002. Т. 38. С. 842-852.

30. Солдатов В.К. Исследование осетровых Амура // Материалы к познанию русского рыболовства. 1915. Т. 3. Вып. 12. 415 с.

31. Спиридонова JI.H., Челомина Г.Н., Мориваки К., Ионекава X., Богданов А.С. Генетическое и таксономическое разнообразие домовых мышей Mus musculus //Генетика. 2004. Т. 40. С. 1378-1388.

32. Хрисанфова Г.Г., Луданный Р.И., Слынько Ю.В. Яковлев В.Н., Семенова С.К. RAPD фингерпринт леща (Abramis brama L.), плотвы (Rutilus rutilus L.) и гибридов первого поколения лещ х плотва и плотва х лещ // Генетика. 2004. Т. 40. С. 1432-1436.

33. Цвирка М.В., Челомина Г.Н., Кораблев В.П. Генетические свидетельства гибридизации между бледнохвостым Spermophilus pallidicauda Satunin, 1903 и алашанским S. alashanicus Buchner, 1888 сусликами в Монголии // Генетика. Т. 42. С. 530-537.

34. Черешнев И.А. Состав ихтиофауны и особенности распространения пресноводных рыб в водоемах Северо-Востока СССР. // Вопр. ихтиологии. 1990. Т. 30. Вып. 5. С. 836-844.

35. Шварц С.С. Экологические закономерности эволюции. М.: Наука, 1980. 278 с.

36. Adams K.L., Wendel J.F. Allele-specific, bidirectional silencing of an alcohol dehydrogenase gene in different organs of interspecific diploid cotton hybrids // Genetics. 2005. V. 171. P. 2139-2142.

37. Akaike H. A new look at the statistical model identification. // IEEE Trans. Automat. Contr. 1974. AC-19. P. 716-723.

38. Allarcon J.A., Alvarez M.C. Genetic identification of sparid species by isozyme markers: application to interspecific hybrids // Aquaculture. 1999. Vol. 173. P. 95-103.

39. Allendorf F.W., Gellman W.A., Thorgaard G.H. Sex linkage of two enzyme loci in rainbow trout//Heredity. 1974. Vol. 72. P. 498-507.

40. Allendorf F.W., Waples R.S. Conservation and genetics of salmonid fishes. In: Conservation genetics (case histories from nature). Ed. J.C. Avise and J.L. Hamrick. Chapman & Hall, N.Y. 1996 P. 238-280.

41. Altukhov Yu.P., Salmenkova E.A. Straying intensity and genetic differentiation in salmon populations // Aquaculture and Fish. Manag. 1994. Vol. 5. P. 99120.

42. Altukhov Yu.P., Salmenkova E.A., Omelchenko V.T. Salmonid fishes: Population biology, genetics and managment. Oxford: Blackwell, 2000. 354 p.

43. Appels R., Gerlach W.L., Dennis E.S., Swift H., Peacock W.J. Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal RNAs in cereals. // Chromosoma. 1980. Vol. 78. P. 293-311.

44. Arefjev V. A. Karyotype variability in successive generations after hybridization between the great sturgeon (Huso huso) and the sterlet (Acipenser ruthenus). //Journal of Fish Biology. 1989. Vol. 35. P. 819-828.

45. Syst. 1992. Vol. 23. P. 237-261. Artyukhin E.N. On biogeography and relationships within the Genus Acipenser. II

46. Sturgeon Quarterly. 1995. Vol. 3. P. 6-8. Artyukhin E.N. Morphological phylogeny of the Order Acipenseriformes. // J.

47. Appl. Ichthyol. 2006. Vol. 22. P. 66-69. Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. N.Y.: Chapman & Hall, 1994.511 p.

48. Copeia. 1972. Vol. 1972. P. 363-365. Bemis W.E., Findeis E.K., Grande L. An overview of Acipenseriformes // Env.

49. Bermingham E., Lamb Т., Avise J.C. Size polymorphism and heteroplasmy in the mitochondrial DNA of lower vertebrates. // J. Hered. 1986. Vol. 77. P. 249252.

50. Binkowski F.P., Doroshov S.I. North American Sturgeons: Biology and Aquaculture Potential / Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 1985.

51. Birstein V.J., Vasil'ev V.P. Tetraploid-octoploid relationships and karyological evolution in the order Acipenseriformes (Pisces): karyotypes, nucleoli, and nucleolus-organizer regions in four acipenserid species. // Genetica. 1987. Vol. 73. P. 3-12.

52. Birstein VJ. Sturgeons and paddlefishes: Threatened fishes in need ofconservation. // Conservation Biology. 1993a. Vol. 7. P. 773-787. Birstein V.J. Is Acipenser medirostris one or two species? // Sturgeon Quarterly. 1993b. Vol. l.P. 8.

53. Birstein V.J., Poletaev A.I., Goncharov B.F. The DNA content in Eurasian sturgeon species determined by flow cytometry. // Cytometry. 1993. Vol. 14. P. 337-383.

54. Birstein V.J., Bemis W.E. Leo Semenovich Berg and the biology of Acipenseriformes: a dedication. // Environmental Biology of Fishes. 1997. Vol. 48. P. 15-22.

55. Birstein V.J., Betts J., DeSalle R. Molecular identification of Acipenser sturio specimens: A warning note for recovery plans. // Biological Conservation. 1998a. Vol. 84. P. 97-101.

56. Birstein Y.J, DeSalle R. Molecular phylogeny of Acipenserinae. II Molecular phylogenetics and evolution. 1998b. Vol. 9. P. 141-155.

57. Birstein V.J., Doukakis P., DeSalle R. Molecular phylogeny of Acipenserinae and black caviar species identification. // Journal of Applied Ichthyology. 1999. Vol. 15. P. 12-16.

58. Birstein V.J. Stugeon species and hybrids: can hybrids produce caviar? // Environmental policy and law. 2000. Vol. 32. P 210-214.

59. Birstein V.J., Doukakis P., DeSalle R. Polyphyletic genetic structure of the Russian sturgeon and caviar species identification. // Conservation genetics. 2000. Vol. l.P. 81-88.

60. Black W.C. Statistical analysis of arbitrary primed PCR patterns in molecular taxonomic studies. // Species diagnostics protocols: PCR and other nucleic acid methods. 1996. Humana press. P. 39-56.

61. Blacklidge K.H., Bidwell C.A. Three ploidy levels indicated by genome quantification in Acipenseriformes of North America. // J. Hered. 1993. Vol. 84. P. 427-430.

62. Braverman J.M., Hudson R.R., Kaplan N.L., Langley C.H., Stephan W. The hitchhiking effect on the site frequency spectrum of DNA polymorphisms // Genetics. 1995. Vol. 140. P. 783-796.

63. Brown J.R., Beckenback A.T., Smith M.J. Influence of Pleistocene glaciations and human intervention upon mitochondrial DNA diversity in white sturgeon {Acipenser transmontanus) populations. // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1992a. Vol. 49. P. 358-367.

64. Brown J.R., Beckenbach A.T., Smith M.J. Mitochondrial DNA length variation and heteroplasmy in populations of white sturgeon {Acipenser transmontanus). II Genetics. 1992b. Vol. 132. P. 221-228.

65. Brown J.R., Beckenbach К., Beckenbach A.T., Smith M.J. Length variation, heteroplasmy and sequence divergence in the mitochondrial DNA of four species of sturgeon {Acipenser). II Genetics. 1996. Vol. 142. P. 525-535.

66. Brownel E., Krystal M., Arnheim N. Structure and evolution of human and African ape rDNA pseudogenes. // Molecular Biology and Evolution. 1983. Vol. 1. P. 29-37.

67. Bruch R.M. Management of lake sturgeon on the Winnebago System — long term impacts of harvest and regulations on population structure. // J. Appl. Ichthyol. 1999. Vol. 15. P. 142-152.

68. Buroker N.E., Brown J.R., Gilbert T.A., O'Hara P.J., Beckenbach A.T., Thomas W.K., Smith M.J. Length heteroplasmy of sturgeon mitochondrial DNA: an illegitimate elongation model. // Genetics. 1990. Vol. 124. P. 157-163.

69. Caceres С. E. Temporal variation, dormancy, and coexistence: A field test of the storage effect//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. Vol. 94. P. 9171-9175.

70. Cagigas M.E., Vazquez E., Blanco G., Sanchez J.A. Combines assessment of genetic variability in populations of brown trout {Salmo trutta L.) based on allozymes, microsatellites and RAPD markers // Mar. Biotechnol. 1999. Vol. 1. P. 286-296.

71. Callejas C., Ochando M.D. Phylogenetic relationships among Spanish Barbus species (Pisces, Cyprinidae) shown be RAPD markers // Heredity. 2002. Vol. 89. P. 36-43.

72. Campton D.E., Bass A.L., Chapman F.A., Bowen B.W. Genetic distinction of pallid, shovelnose, and Alabama sturgeon: emerging species and the US endangered species act. // Conservation Genetics. 2000. Vol. 1. P. 17-32.

73. Carlson D.M., Kettler M.K., Fisher S.E., Whitt G.S. Low genetic variability in paddlefish populations. // Copeia. 1982. Vol. 3. P. 721-723.

74. Cheng F.S., Weeden N.F., Brown S.K. Identification of co-dominant RAPD markers tightly linked to fruit skin color in apple. // Theor. Appl. Genet. 1996. Vol. 93. P. 222-227.

75. Choudhury A., Dick T.A. The historical biogeography of sturgeons (Osteichthyes: Acipenseridae): a synthesis of phylogenetics, palaeontology and palaeogeography. //Journal of Biogeography. 1998. Vol. 25. P. 623-640.

76. Clark A.G. Deterministic theory of heteroplasmy. // Evolution. 1988. Vol. 42. P. 621-626.

77. Comincini S., Lanfredi M., Rossi R., Fontana F. Use of RAPD markers to determine the genetic relationships among sturgeons (Acipenseridae, Pisces) // Fisheris Science. 1998. Vol. 64. P. 35-38.

78. Congiu L., Dupanloup I., Patarnello Т., Fontana F., Rossi R., Arlati G., Zane L. Identification of interspecific hybrids by amplified fragment length polymorphism: the case of sturgeon // Mol. Ecol. 2001. Vol. 10. P. 23552359.

79. Congiu L., Fontana F., Patarnello Т., Rossi R., Zane L. The use of AFLP in sturgeon identification. // J. Appl. Ichthyol. 2002. Vol. 18. P. 286-289.

80. Cooper M.L. Random amplified polymorphic DNA analysis of southern brown bandicoot (Isoodon obesidus) populations in western Australia revealsgenetic differentiation related to environmental variables // Mol. Ecol. 2000. Vol. 9. P. 469-479.

81. Cornuet J.M., Luikhart G. Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data. // Genetics. 1996. Vol. 144. P. 2001-2014.

82. Coulondre C., Miller J.H., Farabaugh P J., Gilbert W. Molecular basis of base substitution hotspots in Escherichia coil // Nature. 1978. Vol. 274. P. 775780.

83. Crandall K.A., Templeton A.R. Applications of intraspecific phylogenetics // New uses for new phylogenies / P.H. Harvey et al.. — New York: Oxford University Press, 1996. P. 81-99.

84. Curtsinger J.W., Fukui H.H., Resler A.S., Kelly K., Khazaeli A.A. Genetic analysis of extended life span in Drosophila melanogaster. I. RAPD screen for genetic divergence between selected and control lines // Genetica. 1998. Vol. 104. P. 21-32.

85. Dadswell M.J., Taubert B.D., Squiers T.S., Marchette D., Buckley J. Synopsis of biological data on shortnose sturgeon, Acipenseer brevirostrum, LeSueur 1818 //FAO Fisheries Synopsis. 1984. P. 140.

86. Dame J.B., Sullivan M., McCutchan T.F. Two major sequence classes of ribosomal RNA genes in Plasmodium berghei. II Nucleic Acids Research. 1984. Vol. 12. P. 5943-5952.

87. Densmore L.D., Wright J.W., Brown W.M. Length variation and heteroplasmy in mitochondrial DNA from parthenogenetic and bisexual lizards (genus Спетidophorus). II Genetics. 1985. Vol. 110. P. 689-707.

88. DeSalle R, Birstein V.J. PCR identification of black caviar. // Nature. 1996. Vol. 381. P. 197-198.

89. Dinesh K.R., Liin Т., Chua K.L., Phang V.P.E. RAPD analysis: an efficient method of DNA fingerprinting in fishes // Zool. Sci. 1993. Vol. 10. P. 849854.

90. Dingerkus G., Howell W.M. Karyotypic analysis and evidence of tetraploidy in the North American paddlefish, Polyodon spathula. И Science. 1976. Vol. 194. P. 842-843.

91. Dong Z., Zhou E. Application of the random amplified polymorphic DNA technique in a study of heterosis in common carp, Cyprinus carpio L. // Aquacult. Res. 1998. Vol. 29. P. 389-396.

92. Dover G., Brown S., Coen E., Dallas J., Strachan Т., Trick M. The dynamics of genome evolution and species differentiation. In: Genome Evolution. Dover G., Flavell R.B., eds. Academic Press, London. 1982.

93. Edwards S.V. Mitochondrial gene genealogy and gene flow among island and mainland populations of a sedentary, the grey-crowned babbler (.Pomatostomus temporalis) // Evolution. 1993. Vol. 47. P. 1118-1137.

94. Ellsworth D.L., Rittenhouse, K.D., Honeycutt, R.L. Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. // Biotechniques. 1993. Vol. 14. P. 214-218.

95. Esa Y.B., Waters J.M., Wallis G.P. Introgressive hybridization between Galaxias depressiceps and Galaxias sp D (Teleostei: Galaxiidae) on Otago, New Zealand: Secondary contact mediated by water races // Cons. Genet. 2000. Vol. l.P. 329-339.

96. Ewens W.J. Population genetics theory-the past and the future. In Mathematical and Statistical Developments of Evolutionaly Theory, edited by S. Lessard. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 1990. pp. 177227

97. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin ver. 3.1: An Integrated software package for population genetics data analysis // Switzerland: Institute of Zool. Сотр. and Mol. Pop. Gen. Lab. (CMPG), 2006. 145 p.

98. Fauron C.M.-R., Wolstenholme D.R. Structural heterogeneity of mitochondrial DNA molecules within the genus Drosophila. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. P. 3623-3627.

99. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach//J. Mol. Evol. 1981. Vol. 17. P. 368-376.

100. Felsenstein J. Numerical methods for inferring evolutionary trees // Quart. Rev. Biol. 1982. Vol. 57. P. 379-404.

101. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using bootstrap // Evolution. 1985. Vol. 39. P. 783-791.

102. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package), version 3.5c. Department of Genetics, University of Washington, Seattle. 1993.

103. Ferguson M. M., Duckworth G. A. The status and distribution of lake sturgeon, Acipenser fulvescens, in the Canadian provinces of Manitoba, Ontario and Quebec: a genetic perspective. // Env. Bio. Fish. 1997. Vol. 48. P. 299-309.

104. Findeis E.K. Osteology and phylogenetic interrelationships of sturgeons (Acipenseridae). // Environmental Biology of Fishes. 1997. Vol. 48. P. 73126.

105. Flajshans M., Vajcova V. Odd ploidy levels in sturgeon suggest a backcross of interspecific hexaploid sturgeon hybrids to evolutionary tetraploid and/or octaploid parental species. // Folia Zool. 2000. Vol. 49. P. 133-138.

106. Fontana F. Chromosomal nucleolar organizer regions in four sturgeon species as markers of karyotype evolution in Acipenseriformes (Pisces). // 1994. Genome. Vol. 37. P. 888-892.

107. Gardiner B.G. Sturgeons as living fossils. In: Living Fossils. Eldredge N., Stanley

108. Epidendroideae): circumscription, phylogeny, polyploidy, and possible hybrid speciation //Amer. J. Botany. 2004. V. 91. P. 707-723.

109. Gouin N., Grandjean F., Bouchon D., Reynolds J.D., Souty-Grosset C. Population genetic structure of the endangered freshwater crayfish Austropotamobius pallipes, assessed using RAPD markers //Heredity. 2001. Vol. 87. P. 80-87.

110. Grande L., Bemis W.E. Osteology and phylogenetic relationships of fossil and recent paddlefishes (Polyodontidae) with comments on the interrelationships of Acipenseriformes. // Journal of Vertebrate Paleontology. 1991. Vol. 11. P. 1-121.

111. Greef B.D., Triest L. The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) for hybrid detection in Scirpus from the river Schelde (Belgium) // Mol. Ecol. 1999. Vol. 8. P. 379-386.

112. Grosberg R. K. Characterization of genetic structure and genealogies using RAPD-PCR markers: a random primer for the novice and nervous // Molecular Zoology. Ferraris J. D., Palumbi S. R, eds. A John Willey & Sons, Inc. New-York. 1996. P. 67-100.

113. Grunwald G., Stabile J., Waldman, J.R., Gross, R., Wirgin, I. Population genetics of shortnose sturgeon Acipenser brevirostrum based on mitochondrial DNA control region sequences I I Molecular ecology. 2002. Vol. 11. P. 1885-1898

114. Guenette S., Fortin R., Rassart E. Mitochondrial DNA variation in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) from the St. Laurence River and James Bay Drainage Basins in Quebec, Canada. // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1993. Vol. 50. P. 659664.

115. Gunderson J.H., Sogin M.L., Wollett G., Hollingdale M., de la Cruz V.F., Waters A.P., McCutchan T.F. Structurally distinct, stage-specific ribosomes occur in Plasmodium. II Science. 1987. Vol. 238. P. 933-937.

116. Gurdebeke S., Maelfait J-P., Backeljau T. Contrasting allozyme and RAPD variation in spider populations from patchy forest habitats // Genetica. 2003. Vol. 119. P. 27-34.

117. Gutell R.R., Larsen N.,Woese C.R. Lessons from an evolving rRNA: 16S and 23S rRNA structures from a comparative perspective. // Microbiol. Rev. 1994. Vol. 58. P. 10-26.

118. Hadrys H., Balick M., Schierwater B. Application of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology // Mol. Ecol. 1992. Vol. 1. P. 55-63.

119. Harrison R. G. Hybrid zones and evolutionary process. Oxford: Oxford Univ. Press, 1993.

120. Harrison R.G., Rand D.M., Wheeler W.C. Mitochondrial DNA size variationwithin individual crickets. // Science. 1985. Vol. 228. P. 1446-1448. Hartl D.L., Clark A.G. Principles of Population Genetics. Sinauer Associates,

121. Sunderland, MA. 1989. Hasegawa M, Kishino H, Yano T. Dating of the human-ape splitting by a molecular clock of mitochondrial DNA // J. Mol. Evol. 1985. Vol. 22. P. 160-174.

122. Hatanaka Т., Galetti Jr.P.M. RAPD markers indicate the occurrence of structured populations in a migratory freshwater fish species // Genet. Mol. Biol. 2003. Vol. 26. P. 19-25.

123. Kelly J.K. A test of neutrality based on interlocus associations // Genetics. 1997. Vol. 146. P. 1197-1206.

124. Kimura M., Crow J.F. The number of alleles that can be maintained in a finite population// Genetics. 1964. Vol. 49. P. 725-738.

125. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. Vol. 16. P. 111-120.

126. Kimura M. 1983. The Neutral Theory of Molecular Evolution. Cambridge University Press, Cambridge.

127. King T.L., Lubinski B.A., Spidle A.P. Microsatellite DNA variation in Atlantic sturgeon (Acipenser oxyrinchus oxyrinchus) and cross-species amplification in Acipenseridae. // Journal of Conservation Genetics. 2001. Vol. 2. P. 103119.

128. Kocher T.D., Thomas W.K., Meyer A., Edwards S.V., Paabo S.F., Villablanca F.X., Wilson A.C. Dynamics of mtDNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 6196-6200.

129. Kohlmann K., Kersten P. Genetic variability of German and foreign common carp (Cyprinus carpia L.) populations // Aquaculture. 1999. Vol. 173. P. 435-445.

130. Kovarova M., Draber P. New specificity and yield enchancer of polymerase chain reactions. //Nucleic Acids Research. 2000. Vol. 28. P. 1-4.

131. Kreitman M. Detectings election at the level of DNA. In Evolution at the Molecular Level, edited by Selander R.K., Clark A.G., Whittam T.S. Sinauer Associates, Sunderland, MA. 1990. pp. 204-221.

132. Krieger J. Molecular phylogenetics and evolution of the North American sturgeon and paddlefish (Order Acipenseriformes). Doc. diss., Ohio State Univ., Columbus, Ohio, USA. 2000.

133. Krieger J., Fuerst P.A., Cavender T.M. Phylogenetic relationships of the North American sturgeons (Order Acipenseriformes) based on mitochondrial DNA sequences. // Mol. Phylo. Evol. 2000. Vol. 16. P. 64-72.

134. Krieger J., Fuerst P.A. Evidence of multiple alleles of the nuclear 18S ribosomal RNA gene in sturgeon // J. Appl. Ichthyol. 2002. Vol. 18. P. 290-297.

135. Krieger J., Fuerst P.A. Characterization of nuclear 18S rRNA gene sequence diversity and expression in an individual lake sturgeon {Acipenser fulvescens) II J. Appl. Ichthyol. 2004. Vol. 20. P. 433-439.

136. Krieger J., Hett A.K., Fuerst P.A., Birstein V.J., Lndwig A. Unusual intraindividual variation of the nuclear 18S rRNA gene is widespread within the Acipenseridae. // J. Hered. 2006. Vol. 97. P. 218-225.

137. Krieger J., Hett A.K., Fuerst P.A., Artyukhin E.N., Ludwig A. The molecular phylogeny of the order Acipenseriformes revisited. // J. Appl. Ichthyol. 2008. Vol. 24. P. 36-45.

138. Krykhtin M.L., Svirskii V.G. Endemic sturgeon of the Amur river: kaluga, Huso dauricus and Amur sturgeon, Acipenser schrenckii II Environ. Biol. Fishes. 1997. Vol. 48. P. 231-239.

139. May В., Krueger C.C., Kincaid H.L. Genetic variation at microsatellite loci in sturgeon: primer sequence homology in Acipenser and Scaphirhynchus. II Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1997. Vol. 54. P. 1542-1547.

140. May den R.L., Kuhajda B.R. Systematics, taxonomy, and conservation status of the endangered Alabama sturgeon Scaphirhynchus suttkusi William and Clemmer {Actinopteiygii, Acipenseridae). II Copeia. 1996. Vol. 1996. P. 241-275.

141. McQuown E.C., Gall G.A.E., May B. Characterization and inheritance of six microsatellite loci in lake sturgeon. // Transactions of the American Fisheries Society. 2002. Vol. 131. P. 299-307.

142. McQuown E.C., Krueger C.C., Kincaid H.L., Gall G.A.E., May B. Genetic comparison of lake sturgeon populations: differentiation based on allelicfrequencies at seven microsatellite loci. // J. Great Lakes Res. 2003. Vol. 29, P. 3-13.

143. Meyer A., Kocher T.D., Basasibwaki P., Wilson A.C. Monophyletic origin of Lake Victoria cichlid fishes suggested by mitochondrial DNA sequences. // Nature. Vol. 347. P. 550-553.

144. Miller M.P. Tools for population genetics analyses (TFPGA) 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population data. 1997. Computer software distributed by author.

145. Miracle A.L., Campton D.E. Tandem repeat sequence variation and length heteroplasmy in the mitochondrial DNA D-loop of the threatened Gulf of Mexico sturgeon A oxyrichus desotoi. //J. Hered. 1995. Vol. 86. P. 22-21.

146. Monnerot M., Mounolou J-C., Solignac M.J. Intraindividual length heterogeneity of Rana esculenta mitochondrial DNA. // Biol. Cell. 1984. Vol. 52. P. 213218.

147. Montandon P.E., Wagner R., Stutz E. E. coli ribosomes with a C912 to U base change in the 16S rRNA are streptomycin resistant. // EMBO J. 1986. Vol. 5. P. 3705-3708.

148. Moritz C. Uses of molecular phylogenies for conservation. // Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 1995. Vol. 349. P. 113-118.

149. Mylvaganam S., Dennis P.P. Sequence heterogeneity between the two genes encoding 16S rRNA from the halophilic Archaebacterium Haloarcula marismrtui. II Genetics. 1992. Vol. 130. P. 399-410.

150. Nei M. Genetic distance between populations // Amer. Nat. 1972. Vol. 106. P. 283398.

151. Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 2231-3323.

152. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. Vol. 89. P. 583-590.

153. Ohno S., Muramoto J., Stenius C., Christian L., Kitterell W.A. Microchromosomes in holocephalian, chondrostean and holostean fishes. // Chromosoma. 1969. Vol. 226. P. 35-40.

154. Ong T.-L., Stabile J., Wirgin I., Waldman J.R. Genetic divergence between Acipenser oxyrinchus oxyrinchus and A. o. desotoi as assessed by mitochondrial DNA sequencing analysis. // Copeia. 1996. Vol. 2. P. 464469.

155. Page R.D.M., Holmes E.C. Molecular Evolution: A phylogenetic approach // Ed. M.A. Maiden. USA: Blackwell Science. 1998. - 346 p.

156. Partis L., Wells R.J. Identification of fish species using random amplified polymorphic DNA (RAPD) // Mol. Cell. Probes. 1996. Vol. 10. P. 435-441.

157. Pendas A.M., Moran P., Martinez J.L., Garcia-Vazquez E. Application of 5S in Atlantic salmon, brown trout, and in Atlantic salmon x brown trout hybrid identification//Mol. Ecol. 1995. Vol. 4. P. 275-276.

158. Phelps S.R., Allendorf F.W. Genetic identity of pallid and shovelnose sturgeon (Scaphirhynchns albus and S. platorynchus). II Copeia. 1983. Vol. 3. P. 696700.

159. Posada D., Crandall K.A. Modeltest: testing the model of DNA substitution // Bioinformatic. 1998. Vol. 14. P. 817-818.

160. Pourkazemi M., Skibinski D.O.F., Beardmore J.A. Application of mtDNA d-loop region for the study of Russian sturgeon population structure from Iranian coastline of the Caspian Sea. // Journal of Applied Ichthyology. 1999. Vol. 15. P. 23-28.

161. Prober J.M., Trainor G.L., Dam R.J., Hobbs F.W., Robertson C.W., Zagursky R.J., Cocuzza A.J., Jensen M.A., Baumeister K. A system for rapid DNAsequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides // Science. 1987. Vol. 238. P. 336-341.

162. Pyatskowit J.D., Krueger C.C., Kincaid H.L., May B. Inheritance of microsatellite loci in the polyploid lake sturgeon (Acipenser fulvescens). II Genome. Vol. 44. P. 185-191.

163. Qari S.H., Goldman I.F., Pieniazek N.J., Collins W.E., Lai A.A. Blood and sporozoite stage-specific small subunit ribosomal RNA-encoding genes of the human malaria parasite Plasmodium vivax. II Gene. 1994. Vol. 150. P. 43-49.

164. Quattro J.M., Jones W.J., Rohde F.C. Evolutionarily significant units of rare pygmy sunfishes (Genus Elassomd) II Copeia. 2001. Vol. 101. P. 514-520.

165. Quattro J.M., Greig T.W., Coykendall D.K., Bowen B.W., Baldwin J.D. Genetic issues in aquatic species management: the shortnose sturgeon (Acipenser brevirostrum) in the southeastern United States. // Cons. Genet. 2002. Vol. 3.P. 155-166.

166. Questiau S., Eybert M.C., Taberlet P. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers reveal extra pair parentage in a bird species: the bluethroat (Luscinia svecica). //Mol. Ecol. 1999. Vol. 8. P. 1331-1339.

167. Rand D.M., Harrison R.G. Molecular population genetics of mtDNA size variation in crickets. // Genetics. 1989. Vol. 121. P. 551-569.

168. Raymond M., Rousset F. Genepop (version 1.2) population genetics software for exact test and ecumenicism // J. of Heredity. 1995. Vol. 86. P. 248-249.

169. Raymond M.L., Rousset F. An exact test for population differentiation // Evolution. 1995. Vol. 49. P. 1280-1283.

170. Razin A., Riggs A.D. DNA methylation and gene function // Science. 1980. Vol. 210. P. 604-610.

171. Riedy M.F., Hamilton W.J. III, Aquadro C.F. Excess of nonparental bands in offspring from known primate pedigrees assayed using RAPD PCR // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P. 918.

172. Robinson M.R., Ferguson M.M. Genetics of North American Acipenseriformes. In: Sturgeons and Paddlefishes of North America. LeBreton G.T.O., William F., Beamish H., McKinley R.S., eds. Springer, Netherlands. 2004. P. 217230.

173. Rodzen J.A., May B. Inheritance of microsatellite loci in the white sturgeon (Acepenser transmontanus). 2002. Vol. 45. P. 1064-1076.

174. Rohlf F.J. A probabilistic minimum spanning tree algotithm // Inf. Proc. Letters. 1973. Vol. 7. P. 44-48.

175. Rohlf J.F. Numerical taxonomy system of multivariable statistical programs (NTSYS-pc). 1992.

176. Roques S., Sevigny J-M., Bernatchez L. Evidence for broad scale introgressive hybridization between redfish (genus Sebastes) in the North-west Atlantic: a rare marine example // Mol. Ecol. 2001. Vol. 10. P. 149-165.

177. Ruban G.I. 1999. The Siberian sturgeon, Acipenser baerii Brandt: The structure of the species and its ecology.

178. Ruiz-Martinez M.C., Berka J., Belenkii A., Foret F., Miller A.W., Karger B.L. DNA sequencing by capillary electrophoresis with replaceable linear polyacrylamide and laser-induced fluorescence detection // Anal. Chem. 1993. Vol. 65. P. 2851-2858.

179. Rusak J.A., Mosindy T. Seasonal movements of lake sturgeon in Lake of the Woods and Rainy River, Ontario. // Can. J. Zool. 1997. Vol. 74. P. 383-395.

180. Ryman N., Laikre L. Effects of supportive breeding on the genetically effective population size // Cons. Biol. 1991. Vol. 5. P. 325-329.

181. Rzhetsky A., Nei M. A simple method for estimating and testing minimum evolution trees. // Molecular Biology and Evolution. 1992. Vol. 9. P. 945967.

182. Sage R.D., Selander R.K. Hybridization between species of the Rana pipiens complex in Central Texas // Evolution. 1979. Vol. 33. P. 1069-1088.

183. Saitou N., Nei M. The Neighbor-Joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4. P. 406-425.

184. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors //Proc. Nalt. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. P. 5463-5467.

185. Saunders G.C., Dukes J., Parkes H.C., Cornett J.H. Interlaboratory study on thermal cycler performance in controlled PCR and random amplified polymorphic DNA analysis. // Clinical Chemistry. 2001. Vol. 47. P. 47-55.

186. Schilthuizen M., Hoekstra R.F., Gittenberger E. Selective increase of a rare haplotype in a land snail hybrid zone // Proc. R. Soc. Lond. 1999. Vol. 266. P. 2181-2185.

187. Schwarzacher H.G., Mikelsaar A.-V., Schnedl W. The nature of the Ag-staining of nucleolus organizer regions. // Cytogenetics and Cell Genetics. 1978. Vol. 20. P. 24-39.

188. Scott M.P., Haymes K.M., Williams S.M. Parentage anlysis using RAPD PCR // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P. 5493.

189. Scott W., Ihssen P.E., White B.N. Inheritance of RAPD molecular markers in lake trout Salvelinus namaycush // Mol. Ecol. 1997. Vol. 6. P. 609-613.

190. Senanan W., Kapuscinsky A.R., Na-Nakom U., Miller L.M. Genetic impacts of hybrid catfish farming (Clarias macrocephalus x C. gariepinus) on native catfish populations in central Thailand // Aquaculture. 2004. Vol. 235. P. 167-184.

191. Shannon C.E. A mathematical theory of computation // The Bell Syst. Tech. J. 1948. Vol. 27. P. 379-423.

192. Shannon C.E., Weaver W. The Mathematical Theory of Communication. University of Illinois Press, Urbana. 1949.

193. Shikano Т., Taniguchi N. Using microsatellite and RAPD markers to estimate the amount of heterosis in various strain combinations in the guppy Poecilia reticulata as a fish model 11 Aquaculture. 2002. Vol. 204. P. 271-281.

194. Simonsen K.L., Churchill G.A., Aquadro C.F. Properties of statistical tests of neutrality for DNA polymorphism data. // Genetics. 1995. Vol. 141. P. 413429.

195. Skamrov A., Goldman M., Klasova J., Beabealashvilli R. Mycoplasma gallisepticum 16S ribosomal RNA genes. // FEMS Microbiology Letters. 1995. Vol. 128. P. 321-325.

196. Slade R.W., Moritz C., Heideman A., Hale P.T. Rapid assessment of single-copy nuclear DNA variation in diverse species // Mol. Ecol. 1993. Vol. 2. P. 359373.

197. Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dood C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B.H., Hood L.E. Fluorescence detection in automated DNA sequences analysis //Nature. 1986. Vol. 321. P. 674-679.

198. Smith C.T., Nelson R.J., Pollard S., Rubidge E., McKay S.J., Rodzen J., May В., Koop B. Population genetic analysis of white sturgeon (Acipenser fulvescens) in the Fraser River. // J. Appl. Ichthyol. 2002. Vol. 18. P. 307312.

199. Sneath P.H.A., Sokal R.R. Numerical taxonomy. San Francisco: W.H. Freeman, 1973. 573 p.

200. Snyder M., Fraser A.R., Larochek J., Gartner-Kepkay E., Zouros E. Atypical mitochondrial DNA from the deep-sea scallop Placopecten magellanicus. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1987. Vol. 84. P. 7595-7599.

201. Sokal R., Rolf F J. Biometry. 3rd ed. W. H. Freeman publ. Inc., 1995.

202. Sokolov L.I., Berdichevskii L.S. 1989. Acipenseriformes Berg, 1940. In: The Freshwater Fishes of Europe. J. Holcik, ed. AULA-Verlag, Wiesbaden. Vol. l.P. 148-153.

203. Solignac M.J., Genermont J., Monnerot M., Mounolou J-C. Drosophila mitochondrial genetics: evolution of heteroplasmy through germ line cell divisions. //Genetics. 1987. Vol. 117. P. 687-696.

204. Stahl G. Genetic population structure of Atlantic salmon // Population genetic and fishery management / Ed. N. Ryman, F.M. Utter. Seattle; L.: Univ. Wash, press, 1987. P. 121-140.

205. Stockwell C.A., Mulvey M., Vinyard G.L. Translocations and the preservation of allelic diversity // Cons. Biol. 1996. Vol. 10. P. 1133-1141.

206. Swofford D.L., Olsen G.J., Waddel P.J., Hillis D.M. Phylogenetic inference // Molecular Systematics / Eds. Hillis D.M. et al.. USA: Sinauer. Assoc. Inc., 1996.-P. 407-514.

207. Takezaki N., Rzhetsky A., Nei M. Phylogenetic Test of the Molecular Clock and Linearized Trees //Mol. Biol. Evol. 1995. Vol. 12. P. 823-833.

208. Tagliavini J., Conterio F., Gandolfi G., Fontana F. Mitochondrial DNA sequences of six sturgeon species and phylogenetic relationships within Acipenseridae. // Journal of Applied Ichthyology. 1999. Vol. 15. P. 17-22.

209. Tajima F. Evolutionary relationship of DNA sequences in finite populations // Genetics. 1983. V. 105. P. 437-460.

210. Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. // Genetics. 1989. Vol. 123. P. 585-595.

211. Tingey S.V., Tufo J.P. Genetic analysis with random amplified polymorphic DNA markers. //Plant Physiol. 1993. Vol. 101. P. 349-352.

212. Topal M.D., Fresco J.R. Complementary base pairing and the origin of substitution mutations //Nature. 1976. Vol. 263. P. 285-289.

213. Tranah G.J., Kincaid H.L., Krueger C.C., Campton D.E., May B. Reproductive isolation in sympatric populations of pallid and shovelnose sturgeon. // North American Journal of Fisheries Management. 2001. Vol. 21. P. 367373.

214. Tranah G.J., Campton D.E., May B. Genetic evidence for hybridization of pallid and shovelnose sturgeon. // J. Hered. 2004. Vol. 95. P. 474-480.

215. Utter F. Genetic problems of hatchery-reared progeny released into the wild, and how to deal with them // Bull. Mar Sci. 1998. Vol. 62. P. 623-640.

216. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the constructions and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 1994. Vol. 10. P. 569-570.

217. Van Eenennaam A.L., Murray J.D., Medrano J.F. Karyotype of the American green sturgeon // T. Am. Fish. Soc. 1999. Vol. 128. P. 175-177.

218. Vasil'eva E.D. Some morphological characteristics of Acipenserid fishes: considerations of their variability and utility in taxonomy. // Journal of Applied Ichthyology. 1999. Vol. 15. P. 32-34.

219. Waldman J.R., Hart J.T., Wirgin I.I. Stock composition of the New York Bight Atlantic sturgeon fishery based on analysis of mitochondrial DNA. // Trans. Amer. Fish. Soc. 1996a. Vol. 125. P. 364-371.

220. Waldman J.R., Nolan K., Hart J.T., Wirgin I.I. Genetic differentiation of three key anadromous fish populations of the Hudson River. // Estuaries. 1996b. Vol. 19. P. 759-768.

221. Waldman J.R., Wirgin I. Status and restoration options for Atlantic sturgeon in North America// Cons. Biol. 1998. Vol. 12. P. 631-638.

222. Wallis G.P. Mitochondrial DNA insertion polymorphism and germ line heteroplasmy in the Triturus cristatins complex. // Heredity. 1987. Vol. 58. P. 229-238.

223. Wang Y., Zhang Z., Ramanan N. The Actinomycete Thermobispora bispora contains two distinct types of transcriptionally active 16S rRNA genes. // Journal of Bacteriology. 1997. Vol. 179 P. 3270-3276.

224. Wang Y-M., Dong Z-Y., Zhang Z-J., Lin X-Y., Shen Y., Zhou D., Liu B. Extensive de novo genomic variation in rice introduced by introgression from wild rice (Zizania latifolia Griseb.) I I Genetics. 2005. V. 170. P. 19451956.

225. Waples R.S. Dispelling some myths about hatcheries // Fisheries. 1999. Vol. 24. P. 12-16.

226. Wasko A.P., Galetti Jr.P.M. RAPD analysis in the Neotropical fish Brycon lundii: genetic diversity and its implications for the conservation of the species // Hydrobiologia. 2002. Vol. 474. P. 131-137.

227. Waters A.P., Syin C., McCutchan T.F. Developmental regulation of stage-specific ribosome populations in Plasmodium. //Nature. 1989. Vol. 342. P. 438-440.

228. Watterson G.A. The homozygosity test of neutrality. Genetics. 1978. Vol. 88. P. 405-417.

229. Wei Q., Ke F., Zhang J., Juang P., Luo J., Zhou R., Yang W. Biology, fisheries, and conservation of sturgeons and paddlefish in China // Env. Biol. Fishes. 1997. Vol. 48. P. 241-255.

230. Weir B.S., Cockerham C.C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure // Evolution. 1984. V. 38. P. 1358-1370.

231. Welsh A.B., Blumberg M., May B. Identification of microsatellite loci in lake sturgeon Acipenser fulvescens, and their variability in green sturgeon, A. medirostris. // Molecular Ecology Notes. 2003. Vol. 3. P. 47-55.

232. Welsh A.B., May B. Development and standartization of disomic microsatellite markers for lake sturgeon genetic studies. // J. Appl. Ichthyol. 2006. Vol. 22. P. 337-344.

233. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 7213-7218.

234. Williams J.G.K. Kubelik A.R., Livak J.K., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers //Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 6531-6535.

235. Wirgin I., Stabile J.E., Waldman J.R. Molecular analysis in the conservation of sturgeons and paddlefish. // Environmental Biology of Fishes. 1997. Vol. 48. P. 385-398.

236. Wirgin I., Waldman J.R., Rosko J., Gross R., Collins M.R., Rogers S.G., Stabile J. Genetic structure of Atlantic sturgeon populations based on mitochondrial DNA control region sequenses. // Trans. Amer. Fish. Soc. 2000. Vol. 129. P. 476-486.

237. Woese C.R., Gutell R., Gupta R., Noller H.F. Detailed analysis of the higher-order structure of 16S-like ribosomal ribonucleic acids. // Microbiol. Rev. 1983. Vol. 47. P. 621-669.

238. Woodruff D.S. Genetic anomalies associated with Cerion hybrid zones: the origin and maintenance of new electrophoretic variants called hybrizymes // Biol. J. Linn. Soc. 1989. Vol. 36. P. 281-294.

239. Yao M.-C., Gall J.G. A single integrated gene for ribosomal RNA in a eucaryote, Tetrahymenapyriformis. I/ Cell. 1977. Vol. 12. P. 121-132.

240. Yap W.H., Zhang Z., Wang Y. Distinct types of rRNA operons exists in the genome of the Actinomycete Thermomonospora chromogena and evidence for horizontal transfer of an entire rRNA operon. 11 Journal of Bacteriology. 1999. Vol. 181. P. 5201-5209.

241. Yeh F.C., Boyle T.B.J. Population genetics analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits // Belgian J. Botany. 1997. Vol. 129. P. 157.

242. Yoon J.M., Kim G.W. Randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction analysis of two different populations of cultured Korean catfish Silurus asotus I/ J. Biosci. 2001. Vol. 26. P. 641-647.

243. Zane L., Patarnello Т., Ludwig A., Fontana F., Congiu L. Isolation and characterization of microsatellites in the Adriatic sturgeon (Acipenser naccarii). //Molecular Ecology Notes. 2002. Vol. 2. P. 586-588.

244. Zhang S-M, Yang Y, Deng H, Wei Q-W, Wu Q-J. The preliminary evidence for low genetic diversity in the Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) revealed by protein electrophoresis. // Zool. Res. 1999a. Vol. 20. P. 93-98.

245. Zhang S-M, Deng H, Wang D, Zhang Y-P, Wu Q-J. Mitochondrial DNA length variation and heteroplasmy in the Chinese sturgeon {Acipenser sinensis). // Acta Genet. Sin. 1999b. Vol. 26. P. 18-25.

246. Zhang S-M, Deng H, Yang Y, Wu Q-J. Population genetic structure and genetic diversity of the Chinese sturgeon {Acipenser sinensis) based on random amplified polymorphic DNA analysis. // Oceanol. Limnol. Sin. 2000a. Vol. 31. P. 1-7.

247. Zhang S-M, Wu Q-J, Zhang Y-P. On the taxonomic status of the Yangtze sturgeon, Asian and American green sturgeons inferred from mitochondrial control region sequences. // Acta Zool.Sin. 2001. Vol. 47. P. 632-639.

248. Zhang X.Q., Salomon В., van Bothmer R. Application of random amplified polymorphic DNA markers to evaluate intraspecific genetic variability in the Elymus alciksanus complex (Poaceae) // Genet. Res. Corp. Evol. 2002. V. 49. № 4. P. 397-407.

249. Zhang S.-M., Wang D.-Q., Zhang Y.-P. Mitochondrial DNA variation, effective female population size and population history of the endangered Chinese sturgeon, Acipenser sinensis. II Conservation Genetics. 2003. Vol. 4. P. 673683.

250. Zhou L., Wang Y., Gui J.F. Analysis of genetic heterogeneity among five gynogenetic clones of silver crucian carp, Carassius auratus gibelio Bloch, based on detection of RAPD molecular markers // Cytogenet. Cell Genet. 2000. Vol. 88. P. 133-139.

Информация о работе

Рожкован, Константин Васильевич
кандидата биологических наук
Владивосток, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus (Georgii, 1775) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы