Влияние теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus с картофелем

Перфильева, Алла Иннокентьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus с картофелем
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus с картофелем"

На правах рукописи

«Г-

ПЕРФИЛЬЕВА Алла Иннокентьевна

ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА И МОНОЙОДАЦЕТАТА НАТРИЯ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СЬА УІВАСТЕН МІСНЮАШШІБ вЭР. БЕРЕООтСиБ С КАРТОФЕЛЕМ

03.01.05 —физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 АВГ 2012

Иркутск - 2012

005046655

Работа выполнена в лаборатории фитоиммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, г. Иркутск

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Рихванов Евгений Геннадьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Верхотуров Василий Владимирович

кандидат биологических наук

Прадедова Елена Владимировна

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

Защита диссертации состоится «11» сентября 2012 г. в 14 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952)510754, e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Текст автореферата размещен на сайте Института (www.sifibr.irk.ru).

Автореферат разослан «-С» августа 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 003.047.01 кандидат биологических наук

J/wMcf^ ГЛ1-Лкимова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Грамположительная бактерия Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms) вызывает заболевание, известное как кольцевая гниль картофеля (Eichenlaub, Gartemann, 2011). До 45% урожая картофеля теряется в результате заражения Cms (Калач и др., 2010). Развитие симптомов заболевания часто характеризуется латентной фазой, поэтому не существует эффективных методов борьбы с данным заболеванием.

На устойчивость растений к патогенными микроорганизмам, скорость их колонизации и развитие симптомов заболевания влияют многие факторы. Согласно современным преставлениям немаловажную роль в этих процессах играет температура. Установлено, что изменение температуры инкубации в одних случаях может усиливать, а в других подавлять проявление симптомов заболевания (Garrett et al., 2006). Существенное влияние оказывают и такие факторы, как ингибиторы дыхательной цепи. Некоторые из них способны значительно повышать фунгицидное действие высоких температур (Rikhvanov et al., 2002). Токсическое действие многих пестицидов, используемых в настоящее время в сельском хозяйстве, определяется их способностью подавлять функционирование дыхательной цепи патогена (Анисимов и др., 2009; Leroux et al., 2010). Большинство таких препаратов обладает высокой персистентностью (Горбатов и др., 2008). Персистентность пестицидов снижается при повышении температуры (Мельников и др., 1980). Представляется чрезвычайно важным исследовать эффект высоких температур в сочетании с бактерицидным действием ингибиторов дыхательной цепи на устойчивость растений к патогенным микроорганизмам. Для этого необходимы такие пестициды, которые бы обладали высоким бактерицидным эффектом, но в тоже время быстро бы разлагались на неопасные соединения после температурного воздействия. Предъявляемым требованиям соответствует монойодацетат натрия (МИА), являющийся ингибитором триозофосфатдегидрогеназы, одного из ключевых ферментов гликолиза (Webb, 1963). Подавляя гликолиз, МИА ингибирует дыхание (Варакина, 1971). МИА отличается слабой персистентностью и при повышении температуры до 40°С через 2 ч полностью разлагается на уксусную кислоту и йод (Webb, 1963). Показано, что монойодацетат натрия является индуктором фитоаплексинов, антимикробных соединений у сои (Keen et al., 1981). В связи с рассмотренными характеристиками, представляло интерес изучить эффект МИА и повышенной температуры на жизнеспособность Cms и картофеля, а также на взаимодействие патогена и его растения-хозяина.

В ответ на мягкое повышение температуры в растениях синтезируются белки теплового шока (БТШ) (Wang et al., 2004). В ряде случаев вторжение патогена вызывает у растений повышение синтеза некоторых БТШ (Duan et al., 2011). Неизвестно, как повышение синтеза БТШ сказывается на способности картофеля противостоять вторжению Cms.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния теплового шока и мо-нойодацетата натрия на взаимодействие возбудителя кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus с картофелем.

Цель определяла необходимость решения следующих задач:

1) исследовать эффект теплового шока (45°С) и МИА на жизнеспособность клеток Cms;

2) исследовать комбинированный эффект теплового шока (45°С) и МИА на жизнеспособность суспензионной культуры клеток картофеля, культуры картофеля in vitro и прорастание клубней картофеля;

3) изучить влияние теплового шока (45°С) и МИА на продуктивность картофеля в полевом и вегетационном экспериментах;

4) изучить влияние теплового стресса (39°С) и МИА на проникновение Cms в растения картофеля in vitro;

5) изучить влияние заражения, теплового стресса (39°С) и МИА на синтез БТШ в растениях картофеля in vitro.

Научная новизна. В настоящей работе впервые продемонстрировано, значительное снижение жизнеспособности бактерий Cms, суспензионной культуры клеток картофеля и растений картофеля in vitro в ходе термической обработки в присутствии МИА. Подобный эффект не наблюдается на клетках с замедленным метаболизмом (клубни картофеля). Обработка клубней МИА способна повышать продуктивность картофеля.

Установлено, что усиление проникновения Cms в растения картофеля in vitro происходит при тепловом стрессе (39°С), который индуцирует синтез БТШ, а также при обработке МИА. Полученные результаты, а также данные биоинформационного анализа указывают, что тепловой стресс подавляет активацию защитных реакций растений картофеля in vitro в ответ на вторжение Cms.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание физиологических механизмов иммунитета растений при биотическом и абиотическом (тепловом) воздействии. В работе впервые получены данные, указывающие на то, что активация одной защитной программы может подавлять другую защитную программу. Так, активация защитных реакций на тепловой стресс может подавлять защитные реакции на биотическое воздействие.

С практической точки зрения, полученные результаты могут быть использованы в оптимизации методов для обеззараживания клубней картофеля. Было показано, что МИА имеет бактерицидный эффект на клетки Cms, но не влияет на клубни картофеля и может быть рекомендован для дальнейших испытаний в сельском хозяйстве.

Данные, представленные в работе, указывают, что агенты, которые подавляют функционирование митохондрий, могут оказывать обеззараживающий эффект на стадии покоя растения (клубни), но могут усиливать проникновение патогена в растения на стадии их активного роста и развития. К усилению колонизации растений патогенными микроорганизмами может приводить также повышение температуры окружающей среды.

Личное участие автора в получении научных результатов. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении экспериментальной части работы, которая проводилась в период с 2006 по 2012 гг., самостоятельно осуществлял статистическую обработку и интерпретацию полученных данных, лично участвовал в написании статей.

2008); на Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); на Всероссийском симпозиуме физиологов растений (Москва, 2010); на научно-практической конференции, посвященной 80-летию ИрГТУ (Иркутск, 2010); на Всероссийском съезде физиологов растений (Нижний Новгород, 2011); на заочной II Научно-практической конференции с международным участием «Эколого-биологические проблемы Сибири и сопредельных территорий» (Нижневартовск, 2011); на Международной научно-практической заочной конференции «Современные изменения климата: социальные, экономические и экологические последствия» (Чебоксары, 2011), а также на научной сессии СИФИБР СО РАН (Иркутск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 4 статьи в журналах из списка ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 224 работы, из них 83 отечественных и 141 зарубежных источников. Работа изложена на 152 страницах, содержит 34 рисунка и 3 таблицы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали культуры Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms), штаммы: 5369 (п. Коренево, Московской обл.), CsR14 (университет г. Турку, Финляндия), Ас-1405 (Всероссийская коллекция микроорганизмов г. Москва).

В работе также были использованы: суспензионная культура клеток картофеля, растения in vitro, клубни и вегетирующие растения картофеля (Solanum tuberosum L). Сорт Луговской (Украинский НИИ картофельного хозяйства) - устойчивый к Cms. Сорт Лукьяновский (ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха) — восприимчивый к Cms.

Культивирование растений in vitro. Микроклональное размножение пробирочных растений осуществляли с помощью черенкования на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга (4,2 г/л) с добавлением 30 г/л сахарозы, 1 мл/л пиридоксина, 1 мл/л тиамина и 1 мл/л феруловой кислоты, pH 5,8-6,0. Черенки культивировали при 26°С, освещенности 5-6 кЛк. Черенкование проводили через 20 дней (Бутенко, 1984).

Культивирование суспензионной культуры. Суспензионную культуру клеток картофеля культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга (4,2 г/л) с добавлением 20 г/л сахарозы, 100 мг/л мезоинозита, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л пиридоксина, 0,5 мг/л тиамина, 5 мг/л фолиевой кислоты, 1,0 мг/л аденина, 1 мг/л глицина, 0,1 г/л гидролизата казеина, 0,2 мг/л кинетина, 3 мг/л 2,4 Д, pH 5,8. Колбы помещали на качалку (80 об/мин) для выращивания, в темноте при 26°С.

Культивирование бактерий. Культуру Cms выращивали на среде YPGA, содержащей 10 г/л дрожжевого экстракта, 15 г/л глюкозы, 10 г/л агар-агара, 5 г/л СаС03, pH 7,0 (Иванова, 1987) в темноте при 26°С. Пересадку на свежую питательную среду проводили через 7-10 дней. Для получения бактериальной суспензии, единичную колонию бактерий переносили в жидкую среду YPGA. Через 5-7 пассажей для сохранения вирулентных свойств бактерии высевали на картофельно-глюкозный агар: 200 г картофеля с добавлением 20 г/л глюкозы, 17 г/л агара-агара.

Определение дыхательной активности бактерий. Измерение скорости поглощения кислорода клетками Cms проводили на разных фазах роста культуры (2, 7,13 сутки) на полярографе ОН-105 (Венгрия) с платиновым электродом закрытого типа (электрод Кларка) (Трушанов, 1973).

Определение жизнеспособности бактериальных и растительных клеток. Для определения влияния теплового шока и МИА на жизнеспособность клеток Cms, использовали 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорид (ТТХ) (Еникеев и др., 1995). Также жизнеспособность бактерий определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ). В экспериментах на бактериях использовали железные чашки и репликатор (рис. 2, А), с помощью которых производили посев на среду роста YPGA.

Жизнеспособность суспензионной культуры клеток картофеля определяли с использованием метода ТТХ (Еникеев и др., 1995). Время инкубации с ТТХ в темноте — 4 часа.

Влияние МИА и теплового шока на растения картофеля in vitro. В среду роста растений картофеля in vitro вносили МИА, подвергали термообработке при 26 или 45°С, 1 ч, отмывали от МИА и выращивали 17 суток при 26°С. На каждый вариант обработки использовали 3-5 растений. В конце опыта производили подсчет желтых листьев и определяли активность общей пероксидазы по методу Бояркина (Бояркин, 1951).

Заражение растений in vitro и клубней картофеля. Во всех экспериментах растения in vitro инфицировали суспензией Cms (1 мл) (Титр = 1 • 10® КОЕ/мл).

Клубни картофеля инфицировали суспензией Cms уколом (Титр = 1-Ю9 КОЕ/мл). В контрольные клубни вводили дистиллированную воду.

Термическая обработка. Используемые в работе температуры по типу воздействия классифицировали: 26°С - контроль, 37-39°С - тепловой стресс; 45°С -тепловой шок. Термическую обработку бактериальных клеток (45°С, 1 ч) и клеток суспензии картофеля (37°С, 1 ч; 45°С, 1 ч) проводили на минитермошейкере TS-100 («BioSan», Латвия). Обработку клубней (45°С, 1 ч) и растений картофеля in vitro (39°С, 2 ч; 45°С, 1 ч) осуществляли в термостате.

Определение продуктивности картофеля. Для вегетационного опыта клубни картофеля сортов Луговской и Лукьяновский (7 клубней на вариант) за две недели до посадки инокулировали уколом Cms. До посадки клубни подвергали термообработке 45°С, 1 ч и высаживали в вегетационные сосуды с почвой. После окончания срока вегетации (90 суток) оценивали продуктивность путем определения массы клубней.

Для полевого опыта клубни картофеля (по 10 клубней на вариант) обрабатывали 1 мМ водным раствором МИА, после чего подвергали тепловой обработке 26 или 45°С, 1 ч. Клубни высаживали в поле и после окончания периода вегетации (90 суток) оценивали продуктивность путем определения массы клубней.

Определение проникновения Cms в растения in vitro. Ежедневно, в течение 6 суток, производили высев гомогената из зараженных растений на чашки Петри со средой YPGA. Предварительно растения стерилизовали 10 мин в растворе 10% гипохлорида натрия с добавлением 2 капель детергента Твин 80, промывали 3 раза стерильной водой. Далее растения делили на зоны: зона корней, стебель, верхушка. Каждую зону отдельно растирали, полученный гомогенат соответствующим образом разбавляли и высевали на среду YPGA. Чашки инкубировали при. температуре 26°С в темноте 7 суток и определяли КОЕ.

Электрофорез в ПААГ. Выделение белка осуществляли по стандартной методике (Побежимова и др., 2004). Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1957). Электрофорез в ПААГ проводили по модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), на приборе Mini-PRONEAN 111 Electrophoretic Cell фирма Bio-Rad (USA).

Вестерн-блоттинг. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану ("Sigma", США) проводили в специальном приборе для блоттинга ("BIO-RAD", США). В работе использовали антитела против БТШ101 (Agrisera As 07253) и БТШ17,6 ТТР 2 (Agrisera As 07255) класс I.

Биоинформационный анализ. Для анализа изменения экспрессии генов БТШ и генов PR-белков при тепловом стрессе (38°С, 15, 30, 60 и 180 мин) в побегах, корнях и культуре клеток Arabidopsis thaliana использовали результаты Kilian et al. (2007) с применением базы данных AtGenExpress (http://jsp.weigelworld.org/expviz/expviz.jsp).

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты были статистически обработаны с использованием пакета программ Microsoft Excel. Приведены средние арифметические значения и стандартные отклонения.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Действие теплового шока и МИА на жизнеспособность Cms

Многие пестициды являются дыхательными ядами (Анисимов и др., 2009; Leroux et al., 2010). МИА - ингибитор гликолиза, а значит и дыхания (Webb, 1963). Эффект МИА на жизнеспособность Cms ранее не исследовался. Скорость поглощения кислорода клетками Cms в присутствии МИА снижалась на 30% по сравнению с контролем. Инкубация при температуре 26°С в течение 1 ч показала, что МИА в концентрациях 0,1; 0,3 и 1,0 мМ оказывал бактерицидный эффект на клетки

Cms, находящиеся в логарифмической фазе роста (2 суток). Причем наибольшая гибель клеток Cms, определяемая по образованию КОЕ, наблюдалась при концентрации 1 мМ (рис. 1, А).

Известно, что бактерицидный эффект различных антибиотиков зависит от фазы роста микроорганизмов (Yetka, Wiebe, 1974). На клетки Cms в стационарной фазе (7 суток) МИА в концентрации 0,1 и 0,3 мМ не оказывал отрицательного эффекта, и только 1,0 мМ МИА незначительно снижал

жизнеспособность клеток бактерий (рис. 1, Б). По-видимому, такой эффект МИА связан с тем, что у более молодых клеток метаболические процессы, в том числе и дыхание, идут более интенсивно по сравнению с бактериями в стационарной фазе роста.

А Б

Рис. 1. Влияние МИА на выживаемость Cms (штамм 5369).

Клетки Cms в логарифмической фазе роста (А) и стационарной фазе роста (Б) обрабатывали 0; 0,1; 0,3; 1,0 мМ МИА при 26°С в течение 1 ч., после чего высевали на среду YPGA. Жизнеспособность Cms определяли по образованию КОЕ спустя 7 суток инкубации при 26°С. По горизонтали слева направо представлены разведения бактериальной суспензии (в 10 раз; в 100 раз; в 1000 раз; в 10 000 раз). Представлены данные типичного эксперимента, п=3.

0 0.1 0.3

- -- О чаш '' ........: \15ы

# « # » ® * ® * %

* . Ф # * «

it ¿g^^Jtt м

\ *> «Г «- «

♦ ♦ Jjf

0.1 I

(U !

1 I

мМ|

.«.ад«

Для определения устойчивости Cms к действию теплового шока в работе была определена точка температурной гибели Cms. При 50°С все клетки Cms в логарифмической фазе погибали за 10 мин. Обработка при 45°С показала, что практически полная гибель клеток в данной фазе наблюдалась после экспозиции в течение

1 ч (рис. 2, А). Скорость поглощения кислорода клетками Cms после такого теплового воздействия снижалась на 83% по сравнению с контролем.

Термотолерантность многих фитопатогенных бактерий зависит от фазы роста (Grondeau et al., 1994). Как показали результаты, в стационарной фазе роста бактерии Cms были более устойчивы к действию термообработки (рис. 2, Б). Таким образом, способность Cms переносить летальный тепловой шок зависит от фазы роста.

Изучение комбинированного действия МИА и теплового шока на жизнеспособность Cms показало, что тепловой шок значительно усиливал бактерицидный эффект МИА на клетки Cms в логарифмической фазе роста (рис. 2, А). Скорость поглощения кислорода клетками Cms при тепловом шоке в присутствии МИА снижалась на 93% по сравнению с контролем. Полная гибель бактерий наблюдалась через 45 и 60 мин обработки при 45°С в присутствии МИА (рис. 2, А). В тоже время, бактерии в фазе стационарного роста оказались более устойчивы к совокупности неблагоприятных факторов (рис. 2, Б).

Таким образом, несмотря на то, что МИА быстро распадается при повышении температуры (Webb, 1963), тепловой шок значительно усиливает бактерицидное действие МИА. Клетки Cms, находящиеся в стационарной фазе, отличаются повышенной устойчивостью к МИА, тепловому шоку, а также к комбинированному воздействию этих двух факторов. Очевидно, что бактерицидный эффект используемых стрессоров зависит от интенсивности метаболизма в разные фазы роста бактерий. В логарифмической фазе бактериальные клетки активно утилизируют субстрат и делятся. В стационарной фазе прекращается деление клеток, накапливаются БТШ, антиоксидантные ферменты и другие стрессовые белки (Банакьян, 2003). Таким образом, бактерицидный эффект комбинированного действия МИА и теплового шока снижается при прекращении деления клеток. Вероятно, это объясняется тем, что МИА является инги-

Б (стационарная

Рис. 2. Влияние монойодацетата (МИА) на термотолерантность Cms (штамм 5369). Клетки Cms в логарифмической фазе роста (А) и стационарной фазе роста (Б) инкубировали при тепловом шоке (45°С) в течение 0, 15, 30, 45 и 60 минут в присутствии 0,1; 0,3; 1,0 мМ МИА. После последовательных разбавлений бактерии высевали на среду YPGA. По горизонтали слева направо представлены разведения бактериальной суспензии (в 10 раз; в 100 раз; в 1000 раз; в 10 000 раз). Термотолерантность Cms определяли по количеству КОЕ спустя 7 суток инкубации при 26°С. Представлены данные типичного эксперимента, п=3.

битором триозофосфатдегидрогеназы, одного из ферментов гликолиза, а ингибиро-вание гликолиза угнетает жизнеспособность растущих клеток, и незначительно ослабляет жизнеспособность клеток, которые закончили свое деление.

3.2. Эффект МИЛ и теплового шока на жизнеспособность картофеля Поскольку МИА и тепловой шок 45°С обладают ярко выраженным бактерицидным эффектом на клетки Cms (рис. 1 и 2), необходимо было выяснить, как эти стрессовые воздействия повлияют на жизнеспособность картофеля.

Суспензионную культуру клеток картофеля обрабатывали при 26, 37 и 45°С в присутствии 1 мМ МИА. Эксперименты показали, что тепловое воздействие 37°С отрицательно не влияло на жизнеспособность суспензионной культуры, а обработка температурой 45°С снижала жизнеспособность на 70% (рис. 3). МИА при температуре 26 и 37°С заметно угнетал жизнеспособность клеток, а при температуре 45°С влияние МИА было не таким выраженным (рис. 3). Таким образом, было установлено, что стрессовые воздействия (45°С и 1 мМ МИА) угнетают жизнеспособность не только клеток Cms, но и суспензионной культуры клеток картофеля.

Двухнедельные растения картофеля in vitro, сорт Луговской, обрабатывали 1 ч при 26 и 45°С в присутствии 1 мМ МИА. Обработка МИА при 26°С не оказывала визуально заметного эффекта на рост растений по сравнению с контролем (рис. 4). Однако в конце срока наблюдения число желтых листьев в этом варианте было больше, чем в контроле (табл. !)•

26"С 2бЧ>МИА 45»С 45-С+МИА

i сутки

МИА

17 суши

WCWGHtfliA 45-С 45ЧН-МИА

Иршюриети шейка растений кзргофеля ж vitro, ааршж 4УС-МИА.

Рис. 3. Влияние термообработки и МИА на жизнеспособность суспензионной культуры картофеля сорта Лукьяновский. Суспензионную культуру клеток картофеля обрабатывали МИА (1 мМ) при 37°С; 45°С, (1 ч). Жизнеспособность клеток картофеля определяли по интенсивности восстановления ТТХ. п=3. М±8.0.

Рис. 4. Влияние теплового шока и МИА на жизнеспособность растений картофеля in vitro сорта Луговской. Растения картофеля in vitro обрабатывали 1 мМ МИА при 45°С (1 ч). Культивировали 17 суток. Приведены данные типичного эксперимента, п=3.

Эффект воздействия температуры (45°С) выражался в утолщении стеблей и укрупнении листьев (рис. 4, Б). Эта обработка не оказывала негативного влияния на растения, о чем свидетельствует отсутствие желтых листьев в конце периода наблюдения (табл. 1).

Тепловой шок значительно усиливал отрицательный эффект обработки МИА на растения. Растения имели истонченный, искривленный стебель, листья завядали. На 17 сутки инкубации отрицательный эффект обработки был максимальный (рис. 4, Б), число желтых листьев достигало 51% (табл. 1). Иногда наблюдалось истончение прикорневой шейки (рис. 4, В).

Таким образом, отрицательный эффект комбинированного воздействия МИА и теплового шока на жизнеспособность проявляется не только в отношении патогенных бактерий, но и активно делящихся клеток суспензионной культуры и растений картофеля in vitro. В отличие от клеток Cms и суспензионной культуры, не наблюдалось ярко выраженного отрицательного эффекта теплового шока 45°С на картофель in vitro, а обработка МИА при 26°С оказывала слабый негативный эффект.

Маркером стрессового состояния может служить активность ферментов антиоксидантной защиты, например, такого фермента как пероксидаза (Савич, 1989). Известно, что активность этого фермента возрастает при поражении растений картофеля Cms, а также при тепловом шоке (Граскова, 2011). Спустя 17 суток после обработки активность пероксидазы повышалась как при обработке тепловым шоком, так и МИА. При комбинированном воздействии активность пероксидазы была максимальной (рис. 5).

Таким образом, наблюдается обратная зависимость между активностью пероксидазы и устойчивостью растений in vitro. Чем выше степень повреждения растений, тем выше активность пероксидазы.

Для изучения эффекта МИА и теплового шока на прорастание клубней картофеля использовали семенной материал картофеля на различных стадиях хранения. Клубни погружали в раствор 1 мМ МИА, затем выдерживали 1 ч при 45°С. Исследования показали отсутствие какого-либо влияния обработки на клубни. Не обнаружено статистически значимых различий между контрольными и опытными клубнями: ни по количеству, ни по длине, ни по массе проростков (табл. 2).

Таблица 1. Влияние обработки МИА при 45°С на растения картофеля in vitro с. Лу-говской, 17 суток инкубации, п=12

Варианты обработ- Число желтых ли-

ки стьев, %

26°С 0

26°С+МИА 18 ±2

45°С 0

45°С+МИА 51 ±25

26«С

МСШИА 48С «С+МИА 1ЦШ11Ш обработки

Рис. 5. Влияние обработки 1 мМ МИА при 45°С (1 ч) на активность общей пероксидазы картофеля in vitro сорта Луговской. Активность пероксидазы определяли через 17 суток культивирования, п=6. M±S.D.

Таблица 2. Влияние обработки 1 мМ МИА при 37, 45°С (1 ч) на количество, длину и массу проростков картофеля (эксперименты проведены в марте 2010 г. и 2011 г.) п=Т0. \liS.D.

Вариант Среднее количество проростков, шт. Средняя длина проростка, см Средняя масса проростков, г.

Лукьяновский 26'С 8,3±2,2 1,1±0,3 1±0,3

Лукьяновский 26'С + МИА 10,3±2 1,5±0,3 1,8±0,6

Лукьяновский 37°С 8±1,3 2,1±0,4 2±0,6

Лукьяновский 37°С + МИА 8,3±2,2 1,8±0,5 2±0,3

Лукьяновский 45 'С 10,5±3 1,1±0,3 1,1±0,4

Лукьяновский 45'С + МИА 10,2±2,2 1±0,3 0,9±0,7

Луговской 26'С 7,7±1,8 1,9±0,6 2,3±1,3

Луговской 26'С + МИА 7,5±2,5 1,6±0,3 1,9±0,7

Луговской 37°С 6±2,2 1,7±0,4 2±1,2

Луговской 37'С + МИА 6,3±1,7 1,9±0,3 2,2±0,7

Луговской 45"С 8,5±2,1 1,7±0,3 2,1 ±0,5

Луговской 45'С + МИА 7,6±2,1 0,7±0,2 0,7±0,5

Таким образом, МИА угнетает клетки с активным метаболизмом: клетки C/wj в логарифмической фазе роста, суспензионную культуру клеток картофеля, растения картофеля in vitro, но не оказывает отрицательного влияния на клубни картофеля.

3.3. Эффект МИА и теплового шока на продуктивность картофеля в

вегетационном опыте

Вегетационные опыты проводили в 2009 г. и 2011 г. Клубни заражали Cms, подвергали тепловому шоку 45°С, затем высаживали в сосуды с почвой. В конце вегетации (90 суток) у зараженных растений восприимчивого сорта без термической обработки проявлялись явные симптомы заболевания (вилт, пожелтение листьев). В 2009 г. зараженные клубни сорта Лукьяновский не отличались по продуктивности от контрольных, но в 2011 г. наблюдалось снижение продуктивности более чем на 50 % (рис. 6). Заражение клубней сорта Луговской не вызывало видимых признаков заболевания. Результаты показали некоторое повышение продуктивности у этого сорта при инфицировании Cms. Полученные результаты подтверждают данные других исследователей (Romanenko et al., 1999; Граскова, 2011), которые показали, что заражение Cms растений картофеля in vitro сорта Луговской на 20% стимулировало их рост.

Однако анализ клубней экспериментальных растений показал, что спустя 8 месяцев хранения (апрель 2012 г.) заражение Cms вызывает типичное проявление симптомов заболевания (кольцевое поражение сосудистого пучка) как у клубней восприимчивого сорта, так и у устойчивого. Следовательно, несмотря на то, что заражение Cms не приводило к вилту и пожелтению листьев у сорта Луговской, и даже повышало его продуктивность (рис. 6), бактерии проникали в клубни и вызывали их поражение во время хранения. Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что отсутствуют сорта картофеля абсолютно устойчивые к Cms, различия между сортами могут наблюдаться только в скорости проявления симптомов заболевания (Eichenlaub, Gartemann, 2011). Очевидно, что длительность латентной стадии имеет сортовую специфику.

Предпосадочная тепловая обработка клубней 45°С оказывала стимулирующий эффект на незараженные растения сорта Лукьяновский. Это выражалось в интенсивной окраске листьев, утолщении стеблей и в повышении продуктивности. У устойчивого сорта Луговской тепловой шок понижал продуктивность (рис. 6, вариант 45°С).

Тепловая обработка 45°С зараженных клубней сдерживала проявление внешних признаков инфекции у выросших из них растений восприимчивого сорта Лукьяновский и повышала их продуктивность (рис. 6, вариант Cms+45°C). Анализ клубней спустя 8 месяцев хранения показал наличие ярко выраженных симптомов заболевания в варианте Cms+45°С. Таким образом, несмотря на то, что обработка 45°С повышала устойчивость и продуктивность зараженных растений картофеля сорта Лукьяновский, клубни, полученные из этих растений, были не пригодны для длительного хранения.

У растений устойчивого сорта Луговской в варианте Cms+A5°C симптомов заболевания не отмечалось. Согласно данным за два года наблюдений заражение растений снимало неблагоприятный эффект теплового шока на продуктивность (рис. 6, вариант Cms+450C).

Таким образом, результаты вегетационного опыта позволяют предполагать, что на ранних стадиях инфекции Cms может стимулировать рост растений. В этом случае развитие симптомов заболевания происходит на более поздней стадии при хранении клубней. Очевидно, что предварительная тепловая обработка (45°С) клубней может только замедлять проявление симптомов заболевания на ранней стадии. Полученные результаты подтверждают положение, согласно которому нет

Cms+26'C 45-С CmsHS'C с. Луговской

26°С Cms+26°C 454' Cms+45'C. 26»С с. Лукьяновский

Рис. 6. Влияние заражения Cms (штамм Ас-1405) и теплового шока (45°С, 1ч) на продуктивность картофеля сортов Лукьяновский и Луговской в вегетационных сосудах. Клубни картофеля за 2 недели до посадки инокулировали суспензией Cms, перед посадкой подвергали тепловому шоку (45°С, 1 ч). Затем клубни высаживали в вегетационные сосуды с почвой. В конце вегетации взвешивали выросшие клубни. Приведены данные опытов, выполненных в 2009 и 2011 гг. n=7. M±S.D.

четкой границы между патогенезом и мутуализмом (Rodriguez, Redman, 2008; Ко-bayashi, Crouch, 2009).

3.4. Эффект МИА и теплового воздействия на продуктивность картофеля в полевом опыте

Cms является карантинным организмом во многих странах (Калач и др., 2010), поэтому не допустимо использовать зараженные клубни в полевых экспериментах. В сезонах 2009-2011 гг. изучали, как предварительное тепловое воздействие и МИА повлияют на вегетацию и продуктивность картофеля в полевых условиях. Результаты показали, что предварительная обработка МИА и повышенной температурой клубней сорта Лукьяновский не приводила к какому-либо ярко выраженному эффекту (рис. 7). Продуктивность в каждом варианте эксперимента значительно изменялась от сезона к сезону.

Иная ситуация наблюдалась в случае сорта Луговской (рис. 7). В течение трех лет эксперимента клубни картофеля, обработанные при 37°С, давали растения с более высокой продуктивностью. Аналогичное повышение продуктивности наблюдалось у растений сорта Луговской, клубни которых были обработаны МИА при 26°С. Таким образом, предпосадочная обработка МИА как при обычной температуре, так и в комбинации с термообработкой не имеет негативного эффекта на продуктивность картофеля, но даже способна ее повышать. Поскольку МИА обладает сильным летальным эффектом в отношении Cms, а также дрожжей Saccharo-myces cerevisiae (Рымарева и др., 2008) и не имеет отрицательного влияния на продуктивность, можно предполагать, что этот агент способен обладать широким спектром бактерицидного и фунгицидного действия и безопасен для растений при обработке клубней. Отсутствие стимулирующего эффекта обработки МИА на продуктивность сорта Лукьяновский, вероятно, можно объяснить тем, что при обра-

с. Лукьяновский с. Луговской

Рис. 7. Влияние предпосадочной обработки клубней МИА и повышенной температурой на продуктивность картофеля (масса клубней, г/куст) в полевых опытах. Клубни картофеля (сорт Лукьяновский и сорт Луговской) до посадки обрабатывали 1 мМ раствором МИА, после чего подвергали термообработке (37°С, 45°С, 1 ч). Затем клубни высаживали в поле. Спустя 90 суток взвешивали выросшие клубни. Представлены данные экспериментов, выполненных в 2009-2011 гг.

боткс МИА клубней картофеля восприимчивого сорта следует использовать другую концентрацию агента и время обработки. Так, показано, что обработка семян растений семейства крестоцветных при 40°С ацетатом меди в растворе уксусной кислоты приводила к избавлению от Xanthomonas campestris pv. campestris, но эффективность обработки различалась в зависимости от сорта (Grondeau et al., 1994).

Что же касается термической обработки, то направленность ее эффекта, как показали результаты вегетационного и полевого опытов, во многом зависела от условий выращивания растений картофеля того или иного сорта.

3.5. Синтез БТШ у растений картофеля in vitro В вышеописанных экспериментах использовали тепловой шок 45°С, который снижает жизнеспособность бактерий и метаболически активных клеток растений. Известно, что при мягком тепловом стрессе синтезируются белки теплового шока БТШ (Wang et al., 2004), которые защищают клетку от гибели при более жестком тепловом шоке (Wahid et al., 2007). В ряде случаев БТШ индуцируются при вторжении патогенов в растения и при обработке элиситорами (Maimbo et al., 2007; Duan et al., 2011). В тоже время отсутствует информация о роли БТШ в ответной

БТШ101 - наиболее важный защитный белок при тепловом шоке (Singh et al., 2010). Предварительные эксперименты показали, что наибольшая индукция этого белка в растениях картофеля in vitro наблюдается при 39°С. Как видно из рис. 8, каких-либо различий в конститутивном синтезе данного белка при 26°С у восприимчивого и устойчивого сортов картофеля не обнаружено. Поэтому относительная устойчивость сорта Луговской к заражению Cms не связана с повы-1 растений при 39°С (2 ч) приводила к значительному увеличению содержания этого белка у обоих сортов (рис. 8).

3.6. Эффект теплового стресса 39°С и МИА на колонизацию Cms растений картофеля in vitro Чтобы изучить роль теплового стресса при взаимодействии растений картофеля с патогеном, была определена динамика проникновения Cms в растения in vitro. Исследования показали, что спустя первые сутки коинкубации бактерии проникали в корневую и стеблевую зоны растений обоих сортов. На вторые сутки у растений сорта Луговской бактерии обнаруживались преимущественно в корневой зоне. У сорта Лукьяновский отмечали колонизацию патогеном всего растения. Полученные данные подтверждают результаты И.А. Грасковой, согласно которым проникновение Cms по тканям картофеля устойчивого сорта происходит менее интенсивно, чем восприимчивого сорта (Граскова, 2011).

Ранее, в клетках растений картофеля были выявлены рецепторы, специфичные к экзополисахаридам Cms, и показано их преобладающее количество в клеточных стенках и на плазмалемме клеток растений картофеля восприимчивого сорта (Рымарева, 2001; Шафикова., 2003). Согласно данным А.С. Романенко, в разных сортах картофеля осуществляется различная стратегия защиты от бактериального

реакции картофеля на вторжение Cms.

с. Луговской с. Лукьяновский 26-С 3<ГС 26"С 39"С

—— кшл Штат ^тт БТШ 101 ^ggg^l дащрде

Рис. 8. Синтез БТШ101 при тепловом стрессе в растениях картофеля in vitro. Растения картофеля in vitro (сорт Лукьяновский и сорт Луговской) обрабатывали при 39°С (2 ч), после чего определяли содержание БТШ. Представлены данные типичного эксперимента, п=3.

шением уровня синтеза БТШ101. Обработ]

патогена. У устойчивого сорта она связана с наличием в клеточных стенках и на плазмалемме небольшого, но достаточного количества рецепторов к экзометаболи-там патогена, необходимым для восприятия и быстрого формирования защитных ответов с участием сигнальных систем, в частности, аденилатциклазной и НАДФ-оксидазной сигнальных систем (Romanenko et al., 2003). Известно, что у картофеля устойчивого сорта конститутивно более высокий уровень антиоксидантных ферментов, в частности пероксидазы, а синтез таковых у картофеля восприимчивого сорта начинается только после стресса (Граскова, 2011).

Тепловой стресс 39°С значительно усиливал эффективность проникновения Cms в растения картофеля (рис. 9). В растениях восприимчивого сорта повышение КОЕ Cms после обработки 39°С наблюдалось во всех зонах. В растениях устойчивого сорта тепловая обработка усиливала проникновение Cms в верхушечной и стеблевой зонах. Следовательно, тепловое воздействие (39°С), которое само по себе не повреждает растение, индуцирует синтез БТШ (рис. 8), не только не препятствует проникновению патогена в растения картофеля, но и значительно его стимулирует.

Есть основания полагать, что взаимодействие патогенных микроорганизмов с растениями зависит от активности митохондрий. Показано, что при биотическом стрессе может наблюдаться повышение интенсивности дыхания и изменение потенциала на внутренней митохондриальной мембране (Vidal et al., 2007; Krause, Durner, 2004). Поэтому на следующем этапе был изучен эффект МИА, который ин-гибирует дыхание (Варакина, 1971). Обработка 1 мМ МИА при 26°С значительно усиливала проникновение Cms в растения картофеля in vitro обоих сортов (рис. 9, Б). Следовательно, несмотря на то, что обработка МИА клубней картофеля сорта Луговской стимулирует продуктивность в полевом эксперименте, обработка МИА растений картофеля in vitro значительно усиливает проникновение патогенных

с. Лукмшовский с. Луговской

Рис. 9. Влияние обработки МИА при 39°С на колонизацию Cms (штамм Ас-1405) картофеля in vitro.

(А) В среду роста растений картофеля in vitro (сорт Лукьяновский и сорт Луговской) добавляли 1 мМ раствор МИА, выдерживали 1 ч, после чего обрабатывали при 39°С (2 ч). Затем растения отмывали от МИА и инокулировали Cms. Спустя 2 суток культивирования производили высев гомогената, полученного из зон растения (верхушка, стебель, корни). (Б) Графическое представление полученных данных. Интенсивность колонизации определяли по количеству КОЕ. n=3-5. M±S.D.

бактерий в растение-хозяина. Токсическое действие на патогены многих пестицидов, используемых в сельском хозяйстве, определяется их способностью ингибиро-вать дыхательную цепь переноса электронов (Анисимов и др., 2009; Leroux et al., 2010). Вероятно, дыхательные яды могут оказывать побочный эффект. Обработка ими посадочного материала обеззараживает его, но действие этих агентов на веге-тирующие растения может подавлять активность митохондрий, а значит стимулировать проникновение патогена в растение.

Несмотря на то, что тепловой шок и МИА по отдельности усиливали проникновение патогена в растения картофеля in vitro, синергического действия этих двух стрессоров при совместном действии теплового шока и МИА не наблюдалось. МИА в сочетании с термической обработкой при 39°С несколько снижал эффективность колонизации растений при тепловом стрессе (рис. 9). Таким образом, эффект МИА на взаимодействие растений и Cms не однозначен. Вероятно, отсутствие синергического эффекта на проникновение Cms в растения при одновременной обработке МИА и высокими температурами обусловлено снижением стабильности МИА.

Предположительно, феномен повышения эффективности проникновения Cms в растения картофеля in vitro при тепловом стрессе может быть связан с повышением синтеза при тепловом воздействии у Cms ее установленных факторов вирулентности — сериновой протеазы и целлюлазы (Eichenlaub, Gartemann, 2011). Также возможно, что тепловой стресс блокирует активацию экспрессии защитных генов картофеля, которые обычно активизируются при биотическом стрессе, что приводит к усилению колонизации.

3.7. Эффект заражения Cms и обработки МИА на способность растений

индуцировать синтез БТШ

Растения картофеля in vitro заражали Cms и после двух суток инкубации при 26°С подвергали тепловому стрессу 39°С (2 ч) и анализировали изменение в уровне синтеза БТШ101 и БТШ 17,6. В контрольных растениях, не подверженных действию теплового стресса и заражения, синтез исследуемых белков был незначительным (рис. 10). Тепловая обработка 39°С индуцировала синтез БТШ101 и БТШ17,6.

Заражение Cms растений картофеля in vitro влияло на индукцию синтеза БТШ у восприимчивого и устойчивого сортов различным образом. В растениях сорта Лукьяновский заражение индуцировало синтез БТШ, а у сорта Луговской, наоборот, подавляло. Согласно литературным данным, бактериальный элиситор харпин активировал экспрессию ряда генов БТШ у клеток A. thaliana. Однако активация экспрессии имела временный характер. Активация наблюдалась через 30 мин обработки, а через 4 ч, наоборот, экспрессия снижалась ниже контрольного уровня (Krause, Durner, 2004). Можно предположить, что аналогичное явление наблюдается и в растениях картофеля in vitro при заражении Cms. Поэтому динамика изменения уровня БТШ имеет различный характер у устойчивого и восприимчивого сортов. Заражение растений устойчивого сорта подавляло их способность синтезировать БТШ, а у восприимчивого сорта этот эффект был слабо выражен (рис. 10).

Поскольку обработка МИА при 26°С усиливала проникновение патогена в растения картофеля (рис. 9), необходимо было проверить, связан ли этот процесс с синтезом БТШ.

с. Лукьяновский с. Луговской

26 26Б 39 39Б 26 26В 39 Ш,

БТШ101

БТШ 17,6(1) Рис. 10. Синтез БТШ в картофеле in vitro.

26 - контрольные растения; 26Б - растения, инокулированные Cms (штамм Ас-1405); 39 - растения, обработанные при 39°С (2 ч); 39Б - растения, инокулированные Cms и обработанные при 39°С (2 ч).

Растения картофеля in vitro (сорт Лукьяновский и сорт Луговской) инокулировали Cms. Спустя 2 суток коинкубации, растения обрабатывали при 39°С (2 ч) и определяли содержание Б'ГШ. Представлены данные типичного эксперимента, п=4.

с. Лукьяновский с. Луговской

26 26М 39 39М 26 26М 39 39М

™ , ^БТШ 101 ——•

Рис. 11. Синтез БТШ в картофеле in vitro.

26 - контрольные растения; 26М - растения, обработанные 1 мМ МИА; 39 - растения, обработанные при 39°С (2 ч); 39М - растения, обработанные МИА и обработанные при 39°С (2 ч).

В среду роста растений картофеля in vitro (сорт Лукьяновский и сорт Луговской) добавляли 1 мМ МИА, выдерживали 1 ч, после чего обрабатывали при 39°С (2 ч). Затем растение отмывали от МИА и определяли содержание БТШ. Представлены данные типичного эксперимента, п=3.

Растения обрабатывали 1 мМ МИА, в течение 1 ч, затем подвергали тепловому стрессу 39°С (2 ч). Как видно на рис. 11, обработка МИА понижала экспрессию БТШ 101 как при 26°С, так и при 39°С. Таким образом, можно сделать вывод, что усиление колонизации Cms растений при обработке МИА не связано с индукцией синтеза БТШ. Растение становится более восприимчивым к колонизации после обработки МИА вследствие нарушения других метаболических процессов клеток растения.

3.8. Биоинформационный анализ экспрессии генов БТШ и генов PR-

белков в A. thaliana

Стимулирующий эффект теплового стресса на колонизацию бактериями картофеля in vitro, а также подавление индукции синтеза БТШ у зараженных растений картофеля устойчивого сорта позволило предположить, что активация защитной

программы в ответ на тепловой стресс находится в обратной зависимости от активации защитной программы в ответ на биотическое воздействие.

При биотическом стрессе синтезируются PR-белки (Малиновский, 2010). Биоинформационный анализ экспрессии генов арабидопсиса, полученный Kilian et al. (2007), с использованием базы данных AtGenExpress показал, что активация экспрессии генов БТШ при тепловом стрессе, как правило, сопровождается подавлением экспрессии генов PR-белков (рис. 12).

Тепловое воздействие 38"С , .мин

Локус Ген •г о о s ф|8|а О 8 о -

Побега Корни культура клеток

Atlg74310 БТШ 101 ■■

Atlg53540 БТШ 17,6 1 1 нл

At3g23990 БТШ60 1 litt« ■ и

At2gl4610 PR1 Ш ■ ■ и

At3g57260 PR2 я I |

At3g04720 PR4 щ Bp 1 Шти

At 1 ¡>75040 PR5 ■ ■Я _ 1

Рис. 12. Экспрессия генов БТШ и генов PR-белков в растениях А. thaliana. Красный цвет характеризует высокий уровень экспрессии генов, зеленый — низкий уровень, черный - экспрессия генов не изменилась. Использованы данные микроэррэй анализа (Kilian et al., 2007). Анализ данных проведен при участии Я. Федотовой.

Этот результат подтверждает предположение, что в условиях, когда развивается устойчивость к тепловому шоку, устойчивость к биотическому стрессу снижается. Таким образом, повышение эффективности колонизации растений Cms при тепловом стрессе, вероятно, объясняется тем, что повышение температуры подавляет экспрессию защитных генов картофеля, активируемых в ответ на биотический стресс.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день мало изучено действие стрессовых факторов на жизнеспособность Cms. Обработка МИА оказывала значительный бактерицидный эффект на клетки Cms (рис. 1). Гибель клеток Cms еще больше усиливалась, если клетки обрабатывали МИА в комбинации с тепловым шоком (45°С) (рис. 2). Возможно, такое действие связано с денатурацией и агрегацией клеточных белков, нарушением липидного состава мембран и повреждением структуры ДНК, а также с повышением продукции АФК (Vabulas, et al., 2010). Показано, что тепловой шок (45°С) приводит к повышению уровня АФК в клетках S. cerevisiae (Rikhvanov et al., 2005). Также губительный эффект МИА и теплового шока на Cms можно объяснить тем, что МИА ингибирует продукцию АТФ (Lash et al., 1996; Beltran et al., 2000). Бактерицидный эффект МИА и теплового шока в отношении Cms зависел от фазы роста. Клетки Cms в стационарной фазе роста были более устойчивы как к МИА (рис. 1) и тепловому шоку, так и к совместному действию этих двух факторов (рис. 2). Эти данные подтверждаются литературными сведениями о том, что термотолерантность Е. coli (Diaz-Acosta et al., 2006) и дрожжей Yarrowia lipolytica (Бирюкова и др., 2007) повышается в стационарной фазе роста. Такой эффект объясняют накоплением БТШ, антиоксидантных ферментов и других стрессовых белков в прекративших деление клетках (Банакьян, 2003).

Эффект влияния губительных для бактерий обработок (МИА и тепловой шок 45°С) был проверен на хозяине данного патогена - картофеле. Было показано, что комбинированная обработка подавляла жизнеспособность активно функционирующих клеток суспензионной культуры картофеля (рис. 3) и растений картофеля

in vitro (рис. 4, табл. 1). Однако отрицательного действия МИА и теплового шока на прорастание клубней не было обнаружено (табл. 2). Таким образом, комбинированная обработка МИА в условиях теплового шока оказывает выраженный токсический эффект как на прокариоты, так и эукариоты, находящиеся в процессе роста и развития, но значительно меньше влияет на организмы, которые находятся в состоянии покоя.

Результаты полевых опытов показали, что обработка клубней МИА как совместно с тепловым шоком, так и без него не имела негативного эффекта на продуктивность картофеля и даже в некоторых случаях могла стимулировать ее, например, у сорта Луговской (рис. 7). Полученные в настоящей работе результаты и данные предыдущих исследований (Рымарева и др., 2008) указывают на то, что МИА обладает сильным бактерицидным и фунгицидным эффектом и может быть использован против широкого круга патогенов.

Тепловой шок усиливает губительный эффект МИА на жизнеспособность клеток Cms. Аналогичным образом дыхательные яды снижали термотолерантность дрожжей (Rikhvanov et al., 2002). Можно предполагать, что применение уже используемых пестицидов совместно с тепловым шоком приведет к повышению эффективности обеззараживания посадочного материала и позволит снизить действующие концентрации агентов. Таким образом, сведения, полученные в настоящей работе, могут быть использованы для оптимизации предпосевной обработки посадочного материала.

Предпосадочная термическая обработка зараженных клубней картофеля снимала симптомы заболевания у сорта Лукьяновский на стадии вегетации. Однако это не приводило к полному обеззараживанию клубней. Термообработка повышала устойчивость растений к инфекции на стадии вегетации, но не предотвращала поражение вновь образованных клубней Cms на стадии хранения.

Тепловой стресс 39°С приводил к индукции синтеза БТШ101 (рис. 8) и значительно усиливал эффективность проникновения Cms в растения картофеля (рис. 9). Следовательно, тепловое воздействие, которое само по себе не повреждает растение и защищает его от гибели при жестком тепловом шоке, не только не препятствует проникновению патогена в растения картофеля, но и значительно его стимулирует.

Обработка МИА при обычной температуре инкубации, так же как и тепловой стресс 39°С, значительно усиливала проникновение Cms в растения in vitro обоих сортов картофеля (рис. 9). Это обстоятельство вводит определенные ограничения на возможность использования МИА в сельскохозяйственной практике. Полученные результаты указывают, что используемые в настоящее время дыхательные яды могут иметь побочный эффект: оказывая токсичное действие на патоген, они могут подавлять активность митохондрий растений, а значит стимулировать проникновение патогена в растение-хозяина.

Способность МИА стимулировать проникновение Cms в растения указывает на то, что функционирование митохондрий имеет большое значение при взаимодействии патогена с растением картофеля. Есть основания полагать, что взаимодействие патогенных микроорганизмов с табаком (Vidal et al., 2007) и арабидопси-сом (Krause, Durner, 2004) также зависит от активности митохондрий растительной клетки.

Стимулирующий эффект теплового стресса на колонизацию бактериями картофеля in vitro, а также подавление индукции синтеза БТШ у зараженных растений

устойчивого сорта (рис. 10) позволило предположить, что активация защитной программы в ответ на тепловой стресс находится в обратной зависимости к активации защитной программы в ответ на биотическое воздействие. Биоинформационный анализ показал, что при тепловом стрессе (38°С) происходит активация экспрессии генов БТШ в A. thaliana. Одновременно уменьшается экспрессия генов, кодирующих PR-белки (рис. 12), что, по-видимому, снижает способность растений противостоять вторжению патогена.

Заражение Cms растений картофеля in vitro различным образом влияло на" индукцию синтеза БТШ в растениях восприимчивого и устойчивого сортов. У восприимчивого сорта при заражении Cms индуцировался синтез БТШ, у устойчивого сорта, наоборот, синтез БТШ подавлялся (рис. 10). Из литературы известно, что экспрессия генов БТШ имеет временную динамику при биотическом стрессе (Krause, Durner, 2004). По-видимому, различная динамика изменения уровня БТШ в растениях картофеля при взаимодействии с Cms имеет сортоспецифичный характер.

5. ВЫВОДЫ

1. Обработка МИА оказывает бактерицидный эффект на клетки Cms. Повреждающий эффект МИА усиливается при тепловом шоке. Клетки Cms, находящиеся в стационарной фазе, отличаются повышенной устойчивостью к МИА, тепловому шоку, а также к комбинированному воздействию этих двух факторов.

2. Обработка МИА в сочетании с тепловым шоком снижает жизнеспособность культуры клеток картофеля и растений картофеля in vitro, но не имеет отрицательного влияния на прорастание клубней картофеля.

3. Обработка МИА и тепловым шоком клубней картофеля не имеет отрицательного влияния на продуктивность картофеля в полевом эксперименте. Обработка МИА повышает продуктивность сорта Луговской.

4. Тепловой шок (45°С) замедляет проявление симптомов заболевания кольцевой гнилью у картофеля на стадии вегетации, но усиливает поражение клубней на стадии хранения.

5. Усиление проникновения Cms в растения картофеля in vitro происходит при тепловом стрессе (39°С), который индуцирует синтез БТШ101 и БТШ17,6, а также при обработке МИА при 26°С.

6. Заражение Cms растений картофеля in vitro сорта Луговской подавляло их способность индуцировать синтез БТШ при тепловом стрессе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В., Живетьев М.А. Изменение ферментативной активности, устойчивости и продуктивности растений картофеля при термическом и химическом воздействии // Известия ИГУ. Серия: Биология, Экология. - 2011. - Т. 4 ,№ 1, - С.3-13.

2. Перфильева А.И. Рымарева Е.В. Влияние температуры и монойод-ацетата на жизнеспособность картофеля in vitroll Вестник ИрГСХА. - 2011. - № 43. С. 18-28.

3. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В. Влияние гипертермии на распространение возбудителя кольцевой гнили по растениям картофеля in vitro II Вестник ИрГСХА. - 2011. - № 46. - С.30-36.

4. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В. Проблема бактериальных заболеваний при озелении городов // Материалы международной конференции «Проблемы

озеленения городов Сибири и сопредельных территорий», Иркутск. Вестник Ир-ГСХА. - 2011. - № 44 (5). - С.81-85.

5. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В., Рихванов Е.Г. Эффект гипертермии и монойодацетата на продуктивность картофеля в вегетационных и полевых экспериментах // Агрохимия. - 2012. (в печати).

6. Перфильева А.И.. Живетьев М.А., Рымарева Е.В., Папкина A.B. Влияние гипертермии и заражения на активность общей пероксидазы картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus Н Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2012. - Vol. 8, № 1. - P. 48-57.

7. Перфильева А.И.. Рымарева E.B., Шевцов Д.А., Рихванов Е.Г. Влияние гипертермии и монойодацетата на развитие симптомов кольцевой гнили и вегетацию картофеля, выращенного в естественных условиях // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2012. - Vol. 8, 1. - P. 126-137.

8. Рымарева E.B. , Рихванов Е.Г., Торгашина М.А., Перфильева А.И., Копытчук В.Н., Варакина H.H. Влияние монойодацетата на термотолерантность Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus и дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2008. - Vol. 4, № 2. - P. 4-13.

9. Перфильева А.И. Влияние различной обработки картофеля на симптомы кольцевой гнили // LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH&Co. KG, Germany.-2012.-97 c.

10. Рымарева E.B., Перфильева А.И. Рихванов Е.Г., Копытчук В.Н. Влияние монойодацетата на термотолерантность возбудителя кольцевой гнили картофеля // Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2007. - С.236-239.

11. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В., Копытчук В.Н. Влияние монойодацетата и теплового шока на выживаемость возбудителя кольцевой гнили картофеля // Материалы научно-теоретической конференции ИГУ, журнал «Вестник ИГУ», Иркутск, 2008. - С. 36-37.

12. Рымарева Е.В., Перфильева А.И.. Рихванов Е.Г., Копытчук В.Н., Варакина H.H. Влияние монойодацетата и теплового шока на выживаемость возбудителя кольцевой гнили картофеля // Материалы Международной научно-практической конференции «Проблемы современного картофелеводства», Минск, 2008. - С. 328331.

13. Рымарева Е.В., Перфильева А.И.. Рихванов Е.Г., Копытчук В.Н. Комбинированное действие термообработки и монойодацетата на обеззараживание клубней картофеля // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания», Иркутск. - С. 42-45.

14. Перфильева А.И., Рымарева Е.В., Рихванов Е.Г., Раченко Е.И. Влияние термообработки и МИА на жизнеспособность картофеля и возбудителя кольцевой гнили Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus II Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2009. - С. 367-370.

15. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В. Распространение Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus по растению картофеля in vitro // Материалы Всероссийский симпозиум физиологов растений «Растение и стресс», Москва, 2010. - С. 237-374.

16. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В. Комбинированное действие термообработки и монойодацетата на обеззараживание клубней картофеля // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию ИрГТУ, Иркутск, 2010.-С.11-16.

17. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В. Проблема защиты картофеля от возбудителя кольцевой гнили С1т>1Ьас1ег michiganensis Бэр. иерес1отсш // Материалы заочной II Научно-практической конференции с международным участием «Эколо-го-биологические проблемы Сибири и сопредельных территорий», Нижневартовск," 2011.-С. 137-139.

18. Перфильева А.И. Аномальная жара и урожайность картофеля // Материалы Международной научно-практической заочной конференции «Современные изменения климата: социальные, экономические и экологические последствия», Чебоксары, 2011. - С. 167-169.

19. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В., Рихванов Е.Г. Влияние предпосадочной термообработки на жизнеспособность и урожайность картофеля // Материалы Всероссийского съезда общества физиологов растений России, Нижний Новгород, 2011. - С.540-541.

20. Перфильева А.И.. Рымарева Е.В., Рихванов Е.Г. Влияние предпосадочной термообработки и заражения на жизнеспособность и урожайность картофеля // Материалы Всероссийского съезда общества физиологов растений России, Нижний Новгород, 2011. - С.541-542.

Подписано к печати 31.07.2012 г. Формат 60*84/16. Объем 1,3 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 559. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Перфильева, Алла Иннокентьевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Характеристика возбудителя кольцевой гнили клубней картофеля Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus и симптомов вызываемого им заболевания.

2.1.1. Взаимодействие Cms с растениями.

2.1.2. Симптомы заболевания картофеля кольцевой гнилью.

2.1.3. Факторы вирулентности С. michiganensis.

2.1.3.1. Экзополисахариды (ЭПС).

2.1.3.2. Факторы вирулентности, имеющие плазмидное кодирование у Clavibacter michiganensis.

2.1.3.3. Другие факторы вирулентности С. michiganensis.

2.1.3.4. Остров патогенности.

2.1.4. Защитная реакция растений в ответ на заражение С. michiganensis.

2.2. Влияние повышенной температуры на проникновение патогенов в растения.

2.3. Механизмы влияния повышенной температуры.

2.3.1. Влияние повышенной температуры на микроорганизмы.

2.3.2. Влияние повышенной температуры на растения.

2.3.2.1. Защитные реакции растительной клетки при действии стрессора.

2.4. Белки теплового шока растений.

2.4.1. Семейство БТШ 100.

2.4.2. Низкомолекулярные БТШ.

2.5. Пестициды - ингибиторы дыхательной цепи.

2.6. Монойодацетат натрия.

2.7. Выводы из обзора литературы.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объекты исследования и условия культивирования.

3.2. Концентрации МИА.

3.3. Тепловая обработка.

3.4. Определение динамики роста Cms.

3.5. Определение дыхательной активности Cms.

3.6. Определение дегидрогеназной активности клеток Cms.

3.7. Заражение растений картофеля in vitro и клубней Cms.

3.8. Определение жизнеспособности Cms, суспензионной культуры клеток картофеля и растений картофеля in vitro.

3.9. Определение активности общей пероксидазы.

3.10. Определение продуктивности картофеля.

3.11. Определение колонизации Cms растений in vitro.

3.12. Схема экспериментов по влиянию теплового шока и МИА на проникновение Cms в растения картофеля in vitro.

3.13. Выделение суммарного белка.

3.14. Электрофорез в ПААГ с ДЦС-Na.

3.15. Иммуноблоттинг.

3.16. Биоинформационный анализ.

3.17. Статистическая обработка результатов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Влияние МИА и теплового шока на жизнеспособность Cms и картофеля.

4.1.1. Влияние МИА на жизнеспособность Cms при 26°С в зависимости от фазы роста.

4.1.2. Влияние теплового шока 45°С на термотолерантность Cms.

4.1.3. Влияние комбинированной обработки (МИА и 45°С) на термотолерантность Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus.

4.1.4. Влияние МИА и теплового шока на дыхательную активность Cms.

4.1.5. Влияние МИА и теплового шока на жизнеспособность суспензионной культуры клеток картофеля.

4.1.6. Влияние МИА и теплового шока на жизнеспособность культуры картофеля in vitro.

4.1.7. Влияние МИА и теплового шока на прорастание клубней картофеля.

4.1.8. Влияние МИА и теплового шока на продуктивность картофеля в вегетационном опыте.

4.1.9. Влияние МИА и теплового шока на продуктивность картофеля в полевых экспериментах.

4.2. Синтез БТШ и проникновение Cms в растения картофеля in vitro.

4.2.1. Индукция синтеза БТШ101 у картофеля in vitro.

4.2.2. Влияние теплового стресса 39°С и МИА на колонизацию

Cms растений картофеля in vitro.

4.2.3. Влияние теплового стресса, заражения Cms и МИА на экспрессию БТШ в растениях картофеля in vitro.

4.2.4. Биоинформационный анализ экспрессии генов БТШ и генов

PR-белков в A. thaliana.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus с картофелем"

В последнее десятилетие в связи с активным товарооборотом между странами широко распространились опасные заболевания культурных растений, наносящие существенный вред экономическому благосостоянию аграрных стран. Среди фитопатогенных бактерий наиболее опасными являются представители рода Clavibacter. Потери сельского хозяйства от заболеваний, вызываемых этими патогенами, а также сложность контроля распространения заболевания привели к тому, что представители этого рода классифицируются как карантинные виды во многих странах мира. Грамположительная бактерия Clavibacter michiganensis spp. michiganensis (Стт) является опасным патогеном томатов {Solanum lycopersiciim). Другой подвид этой бактерии Clavibacter michiganensis spp. sepedonicits (Cms) вызывает заболевание, известное как кольцевая гниль картофеля (Solanum tuberosum) (Eichenlaub, Gartemann, 2011). До 45% урожая картофеля теряется в результате заражения Cms (Калач и др., 2010). Сравнение нуклеотидной последовательности Стт и Cms продемонстрировало, что хромосомы этих микроорганизмов отличаются высоким уровнем гомологии (Bentley et al., 2008; Gartemann et al., 2008).

Изучение факторов вирулентности С michiganensis показало, что Стт и Cms содержат две плазмиды. Элиминация плазмид приводит к тому, что патогенные бактерии не теряют способности колонизировать растение-хозяина, но при этом симптомы заболевания либо проявляются очень слабо, либо не проявляются совсем (Meletzus et al., 1993; Nissinen et al., 2001). Показано, что возникновение симптомов заболевания у растений зависит от присутствия генов, кодирующих сериновую протеазу и целлюлазу (Dreier et al., 1997). Мутация в этих генах снижала вирулентность патогена при заражении картофеля (Nissinen et al., 2009) и томата (Stork et al., 2008).

Анализируя сложившуюся ситуацию, интересно отметить, что элиминации плазмид в клетках Стт, которые собственно и определяют вирулентность патогена, можно добиться повышением температуры от 26 до 32°С (Meletzus, Eichenlaub, 1991). Изменение температуры инкубации может оказывать значительное влияние на растения, в частности, на их устойчивость к поражению патогенными бактериями, грибами и вирусами. Причем, в одних случаях изменение температуры усиливает, а в других случаях подавляет проявление симптомов заболевания (Garrett et al., 2006). Поэтому, возникает вопрос, как тепловая обработка повлияет на взаимодействие картофеля с Cms.

Известно, что в ответ на повышение температуры в интервале от 37 до 40°С в растениях синтезируются белки теплового шока (БТШ) (Wang et al., 2004). Повышение температуры, не влияющее на жизнеспособность, которое в настоящей работе далее будет называться тепловым стрессом, способствует индукции БТШ в растительной клетке (Wang et al., 2004). БТШ защищают клетку от гибели при более жестком тепловом воздействии (тепловом шоке), а также при других абиотических стрессах (Косаковская, 2008; Wahid et al., 2007). Показано, что в ряде случаев вторжение патогена вызывает у растения экспрессию ряда генов БТШ (Maimbo et al., 2007; Duan et al., 2011), но неизвестно как повышение уровня БТШ повлияет на способность растения противостоять вторжению патогена.

Можно предположить, что в зависимости от интенсивности теплового воздействия защитные системы растения-хозяина, связанные с вторжением патогена, либо активируются, либо подавляются. Изучение этого вопроса имеет огромное значение, если принять во внимание повышение среднегодовой температуры на планете. Это явление может привести к распространению как самих патогенов, так и повысить эффективность их проникновения в растение-хозяина (Garrett et al., 2006). Таким образом, проблема изменения устойчивости растений при тепловом воздействии весьма многогранна и включает в себя обширный круг задач.

Жесткий тепловой шок, сам по себе, может приводить к гибели патогена и этот факт можно использовать для разработки способа избавления 6 растений от патогенной микрофлоры (Grondeau et al., 1994). Безусловно, в системе патоген-растение летальное тепловое воздействие будет убивать не только клетки патогена, но и повреждать растение. В этом отношении важно заметить, что восприимчивость растительного организма к тепловому шоку зависит от стадии его развития. Активно делящиеся клетки микроорганизмов и растений отличаются повышенной чувствительностью к летальному тепловому шоку и, наоборот, клетки, которые закончили свое деление лучше переживают повреждающее действие высоких температур (Grondeau et al., 1994; Рихванов и др., 2003; Rikhvanov et al., 2005; Kotak et al., 2007).

Известно, что ингибиторы дыхательной цепи значительно усиливают летальное действие теплового шока на клетки дрожжей (Rikhvanov et al., 2002). Фунгицидное и бактерицидное действие многих пестицидов, используемых в настоящее время в сельском хозяйстве, зависит от их способности ингибировать дыхательную цепь (Анисимов и др., 2009; Leroux et al., 2010). Безусловно, подавление функционирования дыхательной цепи скажется отрицательным образом не только на патогене, но и на растении. В тоже время, как и в случае с тепловой обработкой, фунгицидный эффект ингибиторов дыхания ярко выражен в случае активно делящихся клеток и практически отсутствует у клеток, завершивших деление (Rikhvanov et al., 2005).

Инфицирование картофеля Cms может протекать в латентной форме (Nelson, 1982). Если изначальная концентрация Cms в растении незначительна, то в первый год симптомы заболевания отсутствуют, но патоген сохраняется в клубнях. При посадке таких клубней симптомы заболевания проявляются на второй год (Nelson, 1982). Клубни картофеля при хранении находятся в состоянии покоя, а патоген в этих условиях, очевидно, активно размножается. Таким образом, можно предполагать, что обработка клубней картофеля дыхательными ядами при повышенной температуре до посадки приведет к снижению вирулентности и жизнеспособности патогена, но не окажет значительного негативного влияния на растение-хозяина.

Использование практически любых пестицидов несет за собой значительный экологический риск (Горбатов и др., 2008). Одним из решений данной проблемы является использование пестицидов с низкой персистентностью (способностью быстро разлагаться). Таким потенциальным кандидатом является монойодацетат натрия (МИА), который, ингибируя гликолиз, угнетает дыхание (Webb, 1963). В отличие от других пестицидов МИА слабо персистентен и при повышении температуры до 40°С через 2 ч полностью разлагается на уксусную кислоту и йод (Webb, 1963). Кроме того, показано, что МИА индуцирует синтез фитоаллексинов, антимикробных соединений у сои Glycine hispida (Keen et al., 1981). В связи с рассмотренными характеристиками МИА представляет интерес для изучения в качестве бактерицидного агента.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие возбудителя кольцевой гнили Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus с картофелем.

Представленная цель определяла необходимость решения следующих задач:

1) исследовать эффект теплового шока (45°С) и МИА на жизнеспособность клеток Cms;

4) изучить влияние теплового стресса (39°С) и МИА на проникновение Cms в растения картофеля in vitro;

5) изучить влияние заражения Cms, теплового стресса (39°С) и МИА на синтез БТШ в растениях картофеля in vitro.

Теоретическая н практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание физиологических механизмов иммунитета растений при биотическом и абиотическом (тепловом) воздействии. В работе впервые получены данные, указывающие на то, что активация одной защитной программы может подавлять другую защитную программу. Так, активация защитных реакций на тепловой стресс может подавлять защитные реакции на биотическое воздействие.

Данные, представленные в работе, указывают, что агенты, которые подавляют функционирование митохондрий, могут оказывать обеззараживающий эффект на стадии покоя растения (клубни), но могут усиливать проникновение патогена в растения на стадии их активного роста 9 и развития. К усилению колонизации растений патогенными микроорганизмами может приводить также повышение температуры окружающей среды.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007); Научно-теоретической конференции ИГУ (Иркутск, 2008); Международной научно-практической конференции «Проблемы современного картофелеводства» (Минск, 2008); Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009); Всероссийском симпозиуме физиологов растений (Москва,

2010); научно-практической конференции, посвященной 80-летию ИрГТУ (Иркутск, 2010); Всероссийском съезде физиологов растений (Нижний Новгород, 2011); заочной II Научно-практической конференции с международным участием «Эколого-биологические проблемы Сибири и сопредельных территорий» (Нижневартовск, 2011); Международной научно-практической заочной конференции «Современные изменения климата: социальные, экономические и экологические последствия» (Чебоксары,

2011), а также на научной сессии СИФИБР СО РАН (Иркутск, 2012). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 4 статьи в журналах из списка ВАК РФ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Перфильева, Алла Иннокентьевна

6. выводы

3. Обработка МИА и тепловым шоком клубней картофеля не оказывает отрицательного влияния на продуктивность картофеля в полевом эксперименте. Обработка МИА повышает продуктивность сорта Луговской.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время отсутствуют эффективные и безопасные методы борьбы с возбудителем кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis spp. sepedonicus (Cms) (Eichenlaub, Gartemann, 2011). Применяемые на сегодняшний день пестициды для ограничения распространения Cms представляют значительную опасность для обитателей природы (Горбатов и др., 2008). Поэтому для снижения экологического риска очень важно использовать химические агенты, которые бы, убивая патогенную микрофлору, не накапливались в окружающей среде. Для этого необходимо использовать пестициды, быстро разлагающиеся на неопасные соединения. В качестве агента, подходящего на эту роль, в настоящей работе был рассмотрен монойодацетат натрия или МИА, который быстро распадается на неопасные соединения при повышении температуры, теряя свои токсические свойства (Webb, 1963). МИА ингибирует ключевой фермент гликолиза триозофосфатдегидрогеназу (Webb, 1963). Пировиноградная кислота является конечным продуктом гликолиза и субстратом для дыхания и окислительного фосфорилирования. Поэтому ингибирование гликолиза в результате действия МИА вызывает подавление дыхания в клетках Cms (рис. 4.8). Согласно литературным данным МИА ингибировал дыхание в корнях и колеоптиле кукурузы (Варакина, 1971). Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что обработка МИА оказывает значительный бактерицидный эффект на клетки Cms вследствие подавления дыхания бактерий (рис. 4.2).

Бактерицидный эффект может оказывать и термическая обработка (Grondeau et al., 1994). Однако на сегодняшний день остаются мало исследованными механизмы, функционирующие в клетках Cms при воздействии на них таких стрессовых факторов, как высокие температуры. В частности, недостаточно сведений о влиянии теплового шока на жизнеспособность Cms, поэтому в настоящей работе была изучена термотолерантность Cms. Было показано, что тепловой шок (45°С, 1 ч) оказывает значительный бактерицидный эффект на клетки Cms (рис. 4.4; рис. 4.5). Возможно, такое действие связано с денатурацией и агрегацией клеточных белков, нарушением липидного состава мембран и повреждением структуры ДНК (Карпец, Колупаев, 2009). Ранее с использованием дрожжей S. cerevisiae было показано, что тепловой шок (45°С) приводит к повышению уровня АФК в клетке, что способствует ее гибели (Rikhvanov et al., 2005). Вероятно, что воздействие этой температуры усиливает генерацию АФК и в клетках Cms. Например, на бактериях Е. coli показано, что мутация по гену, кодирующему супероксиддисмутазу, приводила к снижению устойчивости к тепловому шоку 45°С (Benov, Fridovich, 1995).

Гибель клеток Cms возрастала, если их обрабатывали в комбинации МИА с повышенной температурой (45°С) (рис. 4.4., рис. 4.5). Данный эффект можно объяснить тем, что МИА ингибирует продукцию АТФ (Lash et al., 1996; Beitran et al., 2000). Известно, что АТФ необходима для функционирования шаперонов, многие из которых являются БТШ (Slepenkov, Witt, 2002). В связи с этим недостаточное содержание АТФ в клетке может усугубить повреждающее действие высокой температуры.

Нельзя также исключить, что обработка МИА при 45°С оказывает синергический эффект на генерацию АФК. Показано, что ингибирование дыхательной цепи митохондриальными ингибиторами и разобщителями повышает генерацию АФК у дрожжей с окислительным энергетическим метаболизмом (Rikhvanov et al., 2005). Поскольку Cms является аэробной бактерией (Определитель бактерий Берджи, 1997), очевидно, что, так же как и в случае дрожжей, подавление дыхания в результате обработки МИА при повышении температуры будет усиливать продукцию АФК, что приведет к гибели клеток Cms. Таким образом, можно предполагать, что устойчивое функционирование дыхательной цепи необходимо для выживания клеток Cms при тепловом шоке.

В настоящей работе обнаружено, что способность комбинированной обработки МИА и повышенной температурой оказывать бактерицидный эффект на Cms зависела от фазы роста. Клетки Cms в стационарной фазе роста были более устойчивы к действию МИА (рис. 4.2), к действию теплового шока, и к совместному действию этих двух факторов (рис. 4.4). Эти данные подтверждаются литературными сведениями о том, что термотолерантность Е. coli (Diaz-Acosta et al., 2006) и дрожжей Yarrowia lipolytica (Бирюкова и др., 2007) повышается в стационарной фазе роста по сравнению с клетками в логарифмической фазе роста. Такой эффект объясняется накоплением БТШ, антиоксидантных ферментов и других стрессовых белков в прекративших деление клетках (Банакьян, 2003).

Эффект влияния губительных для бактерий обработок (МИА и тепловой шок 45°С) был проверен на хозяине данного патогена — картофеле. Было показано, что комбинированная обработка (МИА и тепловой шок 45°С) подавляла жизнеспособность активно функционирующих клеток суспензионной культуры картофеля (рис. 4.10) и растений картофеля in vitro (рис. 4.11, 4.12, табл. 4.1). Активность пероксидазы является маркером стрессового состояния организма и указывает на усиление окислительных процессов в клетке, которые сопровождаются изменением уровня генерации АФК (Минибаева, Гордон, 2003; Полесская, 2007; Граскова, 2011). Соответственно, снижение жизнеспособности растений сопровождалось повышением уровня активности пероксидазы (рис. 4.13), что свидетельствует о высоком уровне стресса и активной генерации АФК у исследуемых организмов. Однако отрицательного действия МИА и теплового шока на прорастание клубней картофеля трех различных сортов не было обнаружено (рис. 4.14., табл. 4.2). Таким образом, комбинированная обработка МИА и тепловым шоком оказывает выраженный токсический эффект как на прокариоты так и эукариоты, находящиеся в процессе активного роста и развития, но значительно меньше влияет на организмы, которые находятся в состоянии покоя.

Результаты полевых экспериментов показали, что обработка клубней МИА как совместно с тепловым шоком, так и без него не имела негативного эффекта на продуктивность картофеля (рис. 4.22). Более того, в течение трех лет наблюдений предпосадочная обработка МИА при 26°С стимулировала продуктивность картофеля сорта Луговской. Таким образом, обработка клубней МИА не имеет отрицательного влияния на продуктивность картофеля. Для того, чтобы ответить на вопрос можно ли применять МИА в сельском хозяйстве как бактерицидный агент, требуются дальнейшие эксперименты с использованием различных сортов картофеля и способов проверки, применяемых в сельском хозяйстве. Тем не менее, даже на этом этапе исследования результаты, полученные в этой работе, и результаты предыдущих исследований (Рымарева и др., 2008) указывают на то, что МИА обладает сильным бактерицидным и фунгицидным эффектом и может быть эффективен против широкого круга патогенов.

Многие из используемых в настоящее время пестицидов являются дыхательными ядами (Анисимов и др., 2009; Leroux et al., 2010). В отличие от применяемых пестицидов, МИА способен распадаться после теплового воздействия 40°С на йод и уксусную кислоту (Webb, 1963), поэтому можно предполагать, что этот агент будет более экологически безопасен. Результаты, представленные в настоящей работе, показывают, что тепловой шок усиливает губительный эффект МИА на жизнеспособность клеток Cms (рис. 4.4, рис. 4.5). Аналогичным образом, дыхательные яды снижали термотолерантность дрожжей (Rikhvanov et al., 2002). Можно предполагать, что применение уже используемых пестицидов совместно с тепловым шоком приведет к повышению эффективности обеззараживания посадочного материала и позволит снизить действующие концентрации агентов. Таким образом, сведения, полученные в настоящей работе, могут быть использованы для оптимизации предпосевной обработки посадочного материала.

Данные вегетационного эксперимента показали различную степень устойчивости к возбудителю заболевания сортов картофеля Лукьяновский и Луговской. Заражение Cms клубней устойчивого сорта Луговской не приводило к появлению признаков бактериального поражения (рис. 4.15) и даже стимулировало продуктивность (рис. 4.16), что подтверждает результаты, полученные другими исследователями на растениях картофеля in vitro (Romanenko et al., 1999; Граскова, 2011). Однако анализ клубней спустя 8 месяцев хранения показал, что заражение Cms вызывает типичные симптомы заболевания у клубней устойчивого и восприимчивого сортов (рис. 4.17). Полученные результаты подтверждают имеющиеся литературные данные, согласно которым отсутствуют сорта абсолютно устойчивые к Cms (Eichenlaub, Gartemann, 2011). Вероятно, длительность латентной фазы инфицирования Cms у картофеля имеет сортовую специфику. По-видимому, различия между сортами могут наблюдаться только в скорости проявления симптомов заболевания и их интенсивности.

Предпосадочная термическая обработка зараженных клубней картофеля снимала симптомы заболевания у сорта Лукьяновский на стадии вегетации (рис. 4.15). Однако термообработка лишь замедляла проявление инфекции на стадии вегетации и образования клубней, но усиливала поражение клубней Cms на стадии хранения (рис. 4.18).

Неблагоприятный эффект тепловой обработки на взаимодействие Cms с картофелем подтвердили эксперименты с растениями картофеля in vitro. Тепловой стресс 39°С приводил к индукции синтеза БТШ101 и БТШ17,6 (рис. 4.23, рис. 4.26) и значительно усиливал эффективность проникновения Cms в растения картофеля (рис. 4.25). Показано, что индукция синтеза БТШ при тепловом стрессе приводит к повышению устойчивости к жесткому тепловому шоку, а также к другим абиотическим стрессам (Wang et al., 2004). Следовательно, тепловое воздействие, которое само по себе не повреждает растение и защищает его от гибели при жестком тепловом шоке, не только не препятствует проникновению патогена в растения картофеля, но и значительно его стимулирует.

Обработка МИА при обычной температуре инкубации, так же как и тепловой стресс 39°С, значительно усиливала проникновение Cms в растения in vitro обоих сортов картофеля (рис. 4.25). Поэтому, несмотря на то, что обработка МИА клубней картофеля сорта Луговской стимулировала продуктивность в полевом эксперименте (рис. 4.22), обработка МИА значительно усиливала проникновение патогенных бактерий в растение картофеля in vitro (рис. 4.25). Это обстоятельство вносит определенные ограничения на возможность использования МИА в сельскохозяйственной практике. Обработка МИА подавляет активность митохондрий растений (Варакина, 1971). Поэтому полученные результаты указывают, что используемые в настоящее время в сельском хозяйстве дыхательные яды могут иметь побочный эффект: оказывая токсичное действие на патоген, они могут подавлять активность митохондрий растений, а значит стимулировать проникновение патогена в растение-хозяина.

Способность МИА стимулировать проникновение Cms в растения (рис. 4.25) указывает, что функционирование митохондрий растений имеет большое значение при взаимодействии патогена с растением картофеля. Это предположение подтверждается рядом литературных данных. Есть основания полагать, что взаимодействие патогенных микроорганизмов с табаком (Vidal et al., 2007) и арабидопсисом (Krause, Durner, 2004) также зависит от активности митохондрий растительной клетки.

Стимулирующий эффект теплового стресса на колонизацию бактериями картофеля in vitro (рис. 4.25), а также подавление индукции синтеза БТШ у зараженных растений устойчивого сорта (рис. 4.26) позволило предположить, что активация защитной программы в ответ на тепловой стресс находится в обратной зависимости к активации защитной программы в ответ на биотическое воздействие. Биоинформационный анализ показал, что при абиотическом стрессе (тепловой стресс 38°С) происходит активация экспрессии генов БТШ, которые защищают A. thaliana от повреждающего теплового шока. Одновременно уменьшается экспрессия генов, кодирующих РЛ-белки (рис. 4.28), что, по-видимому, снижает способность растений противостоять вторжению патогена. Поскольку на планете за последние 50 лет наблюдается повышение среднегодовой температуры (Карпец, Колупаев, 2009; Пивоварова и др., 2011), то согласно предположению Garrett et al. (2006), колонизация растений патогенными микроорганизмами будет усиливаться.

Известно, что при биотическом стрессе может активироваться экспрессия БТШ. Так, заражение пшеницы (Triticum aestivum L.) патогенным грибом Puccinia striiformis f. sp. Tritici. приводило к индукции синтеза БТШ70 (Duan et al., 2011). Инфицирование табака (Nicotiana tabacum) бактерией Ralstonia solanacearum усиливало индукцию нмБТШ (Maimbo et al., 2007). Однако отсутствует информация об изменении экспрессии БТШ картофеля при взаимодействии с Cms. Согласно результатам, представленным в настоящей работе, заражение Cms растений картофеля in vitro различным образом влияло на индукцию синтеза БТШ в растениях восприимчивого и устойчивого сортов (рис. 4.26). У восприимчивого сорта при заражении Cms индуцировался синтез БТШ, у устойчивого сорта, наоборот, синтез БТШ подавлялся (рис. 4.26). По литературным данным активация экспрессии генов БТШ при обработке элиситором харпином клеток A. thaliana имела временную динамику. На ранних стадиях обработки наблюдалась активация экспрессии, а на более поздних стадиях, наоборот, подавление (Krause, Durner, 2004). По-видимому, динамика изменения уровня БТШ в растениях картофеля при взаимодействии с Cms имеет сортоспецифичный характер. Зараженные Cms растения картофеля in vitro сорта Луговской отличались пониженной способностью синтезировать БТШ при тепловом стрессе (рис. 4.26). Этот результат подтверждает выше высказанное предположение, что развитие устойчивости растений к биотическому и абиотическому стрессам имеет разнонаправленный характер.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Перфильева, Алла Иннокентьевна, Иркутск

1. Акимова Т.В. Сравнительное изучение реакции растений на действиевысоких закаливающих и повреждающих температур / Т.В. Акимова, А.Ф. Титов, JT.B. Топчиева// Физиология растений. 1994. - Т. 41. - С. 381-385.

2. Алексеенко A.JI. Особенности взаимодействия условно-патогенных энтеробактерий с растениями: дис. канд. биол. наук: 03.01.05 / A.JI. Алексеенко; СИФИБР СО РАН. Иркутск, 2010.- 143 с.

3. Банакьян И.А. Стресс у бактерий / И.А. Банакьян. М.: Медицина, 2003. - 136 с.

4. Барабой В.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и при патологии / В.А. Барабой, Д.А. Сутковой. Киев: Наук, думка, 1997. - 420 с.

5. Бирюкова E.H. Адаптация дрожжей Yairowia lipolytica к тепловому воздействию / E.H. Бирюкова, А.Г. Меденцев, А.Ю. Аринбасарова и др. // Микробиология. 2007. - Т. 76, №2. - С. 184-190.

6. Бирюкова E.H. Дыхательная активность дрожжей Yarrowia lipolytica в условиях окислительного и теплового стрессов / E.H. Бирюкова, А.Г. Меденцев, А.Ю. Аринбасарова, В.К. Акименко // Микробиология. 2008. -1.11, №4. - С. 448-452.

7. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы / А.Н. Бояркин //Биохимия. 1951. - Т. 16. - С. 352.

8. Бутенко Р.Г. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля / Р.Г. Бутенко, Л.М. Хромова, Г.Г. Седнина. М.: ВАСХНИЛ, 1984. - 28 с.

9. Варакина H.H. Дыхание растущих и стареющих колеоптилей кукурузы. Дисс. канд. биол. наук: 03.00.12 / H.H. Варакина; СИФИБР СО РАН. -Иркутск, 1971. 187 с.

10. Войников В.К. Роль стрессовых белков в клетках при гипертермии / В.К. Войников, Г.Б. Боровский // Успехи современной биологии. 1994. -Т. 114. -С. 85-95.

11. Горбатов B.C. Экологическая оценка пестицидов: источники и формы информации / B.C. Горбатов, Ю.М. Матвеев, Т.В. Кононова // Arpo XXI. -2008.-№ 1-3. С. 7-9.

12. Граскова И. А. Роль пероксидаз в устойчивости растений к биотическому стрессу / И.А. Граскова. Berlin: LAP LAMBER Academic Publishing, 2011.-356 с.

13. Гусев M.B. Микробиология / M.B. Гусев, JT.A. Минеева. M.: Академия, 2006. - 464 с.

14. Дмитриев О.П. Активные формы кислорода в иммунитете растений / О.П. Дмитриев, Ж.М. Кравчук // Цитология и генетика. 2005. - Т. 39. - С. 6475.

15. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. М.: Мир, 1991.-543 с.

16. Дроздов С.В. Терморезистентность активно вегетирующих растений / С.В. Дроздов, В.К. Курец. М.: Наука, 2003. - 168 с.

17. Дроздов С. Н. Влияние температуры почвы на нетто-фотосинтез культуры тепличного огурца / С. Н. Дроздов, Е. С. Холопцева, Э. Г. Попов // Тр. / Карельский научный центр РАН. Петрозаводск, 2008. - Вып. 3. - С. 4548.

18. Дьяков Ю.Т. Общая и сельскохозяйственная фитопатология / Ю.Т. Дьяков, М.И. Дементьева, И.Г. Семенкова. М.: Колос, 1974. - 260 с.

19. Еникеев А.Г. Об использовании 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида для оценки жизнеспособности культур растительных клеток / А.Г. Еникеев, Е.Ф. Высоцкая, Л.А. Леонова, К.З. Гамбург // Физиология растений. 1995. - Т. 42. - С. 423-426.

20. Ерко В.Н. Замена proEL гена Escherichia coli его гомологом из Sinorisobium meliloti / В.Н. Ерко, П.А. Ланд // Биополимеры и клетка. 2000. -Т. 16, №5. -С. 403-408.

21. Желдакова Р. А. Фитопатогенные микроорганизмы: Учеб.-метод. комплекс для студентов биол. фак. / Р.А. Желдакова, В.Е. Мямин. Мн.: БГУ, 2006. - 116 с.

22. Иванова Н.Г. Разработка селективного фактора для проведения клеточной селекции на устойчивость к Corynebacterium sepedonicum. Использование клеточных технологий в селекции картофеля / Н.Г. Иванова // Науч. труды. 1987. - С. 26-28.

23. Иванюк В.Г. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / В.Г. Иванюк, С.А. Банадысев, Г.К. Журомский. Мн.: Бенлпринт, 2005. - 696 с.

24. Самохваловичи: РУП «Научно-практический центрНАН Беларусии по картофелеводству и плодоовощеводству», 2010. 12 с.

25. Каплин Е. А. Пути повышения продуктивности маточников клоновых подвоев яблони с использованием горизонтально ориентированных растений и органического субстрата : Автореф. дисс. канд. сельхоз. наук: 06.01.07 /Е.А. Каплин. Мичуринск, 2007. - 23 с.

26. Карпец Ю.В. Ответ на гипертермию: молекулярно-клеточные аспекты / Ю.В. Карпец, Ю.Е. Колупаев // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Сер. Биология. 2009. - №16. - С. 19-38.

27. Каталог средств защиты растений, 2011 (http://www.agro.basf.ru)

28. Кетания М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кетания, А.И. Лукаш, Е.П. Гуськов // Успехи соврем, биологии. 1993. - №113. - С. 456-470.

29. Колупаев Ю.Е. Формирование адаптивных реакций растений на действие абиотических стрессоров / Ю.Е. Колупаев, Ю.В. Карпец. Киев: Основа, 2010.-352 с.

30. Коржов В.И. Белки теплового шока (обзор литературы) / В.И. Коржов, М.В. Коржов, Е.А. Пунщикова, A.C. Сахненко // Журнал академии медицинских наук Украины. 2008. - Т. 14, №1. - С. 26-43.

31. Косаювська I.B. Ф13юлого-бюх1М1чш основи адаптацн рослин до стрес1в / I.B. Коса^вська. К.: Сталь, 2003. - 192 с.

32. Косаковская И.В. Стрессовые белки растений / И.В. Косаковская. К.: Институт ботаники, 2008. - 154 с.

33. Красильников А.П. Микробиологический словарь справочник / А.П. Красильников, Т.Р. Романовская. - Минск.: Асар, 1999. - 400 с.

34. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу / О.Н. Кулаева // Соросовский образовательный журнал. Биология. 1997. -№2.-С. 5-13.

35. Ломоватская Л.А. Влияние экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили на кинетические параметры аденилатциклаз растений картофеля / Л.А. Ломоватская, A.C. Романенко, Н.В. Филинова, Р.К. Саляев // ДАН. 2011. - Т. 441, № 4. - С.1-4.

36. Люй X. Влияние теплового шока на синтез антибиотиков тремя штаммами Streptomyces / X. Люй, Т.А. Амхова, Л.М. Захарчук // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 1. - С. 14-27.

37. Малиновский В.И. Механизмы устойчивости растений к вирусам / В.И. Малиновский. Владивосток: Дальнаука, 2010. - 324 с.

38. Медведев С.С. Физиология растений / С.С. Медведев. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2004. - 336 с.

39. Медведев С.С. Генетическая и эпигенетическая регуляция развития растительных организмов (обзор) / С.С. Медведев, Е.И. Шарова // J. of Siberian Federal University. Biology. 2010. - Т. 2, № 3. - С. 109-129.

40. Минибаева Ф.В. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе / Ф.В. Минибаева, Л.Х. Гордон // Физиология растений. 2003. - Т. 50. - С. 459-464.

41. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук. М.: Академия, 2005. - 608 с.

42. Николайчик Е.А. Регуляция метаболизма: Курс лекций / Е.А. Николайчик. Мн: Изд-во БГУ, 2002. - 92 с.

43. Озерцовская O.J1. Проблемы специфического фитоиммунитета / O.JI. Озерцовская // Физиология растений. 2002. - Т. 49, № 1. - С. 148 - 154.

44. Определитель бактерий Берджи / Дж. Хаунт, Н. Криг, П. Снит, Дж. Стейли, С. Уильяме. М.: Мир, 1997. - Т. 2. - 584 с.

45. Пивоварова Е.Г. Влияние климатических изменений на урожайность картофеля и моркови в условиях Алтайского Приобъя / Е.Г. Пивоварова, А.О. Люцигер, Е.В. Райхерт, Т.А. Кузнецова // Известия АТУ. Биологические науки. 2011. - №3. - С. 40-44.

46. Побежимова Т.П. Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез / Т.П. Побежимова, A.B. Колесниченко, О.И. Грабельных. М.: ООО « НПК «ПРОМЭКОБЕЗОПАСНОСТЬ», 2004. - 98 с.

47. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода / О.Г. Полесская. М.: Изд-во КДУ, 2007. - 140 с.

48. Порфирова С.А. Влияние ингибиторов синтеза РНК и белка на ответ клеток листьев Arabidopsis thaliana (L.) на тепловой шок / С.А. Порфирова, П.Ю. Клюева, В.А. Хохлова, О.Н. Кулаева // Физиология растений. 1992. -Т. 39. - С. 524-632.

49. Рихванов Е.Г. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae / Е.Г. Рихванов, H.H. Варакина, Т.М. Русалева, Е.И. Раченко, В.А. Киселева, В.К. Войников // Микробиология. -2001.-Т. 70, №4. С.531-535.

50. Рихванов Е.Г. Действие ингибиторов цитохром оксидазного комплекса на термоустойчивость дрожжей / Е.Г. Рихванов, H.H. Варакина, Т.М. Русалева, Е.И. Раченко // Микробиология. 2003. - Т. 72, № .2 - С. 174-179.

51. Рихванов Е.Г. Функции Hspl04p в развитии индуцированной термотолерантности и прионном наследовании у дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Е.Г. Рихванов, В.К. Войников. // Успехи соврем, биологии. 2005. -Т. 125.№1.- С. 115-128.

52. Романенко A.C. Стабилизация корнями картофеля pH среды, смещаемого возбудителем кольцевой гнили / A.C. Романенко, И.А. Граскова, A.A. Рифель, В.Н. Копытчук, М.А. Раченко // Физиология растений. 1996. -Т. 43.- С. 707-712.

53. Романенко A.C. Компоненты оболочек клеток картофеля, обладающие сродством к токсину возбудителя кольцевой гнили / A.C. Романенко, Е.В. Рымарева, Т.Н. Шафикова// Доклады АН. 1998. - Т.358. - С. 277-279.

54. Романенко A.C. Характеристика экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили и аффинных к ним сайтов оболочек клеток картофеля / A.C. Романенко, Е.В. Рымарева, В.Н. Копытчук, Е.Г. Екимова, A.M. Собенин // Биохимия. 1999. - Т. 64. - С. 1370-1376.

55. Рымарева Е.В. Роль клеточных стенок растения-хозяина и экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля на детерминантной стадии патогенеза: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.01.05 / Е.В. Рымарева; СИФИБР СО РАН. Иркутск, 2001. -24 с.

56. Савич И.М. Пероксидазы стрессовые белки растений / И.М. Савич // Успехи совр. биологии. - 1989. - Т. 107. №3. - С. 406-417.

57. Судьина Е.Г. Основы эволюционной биохимии растений / Е.Г. Судьина, Г.И. Лозовая. К.: Наукова думка, 1982. - 360 с.

58. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе / И.А. Тарчевский. -Казань: Фэн, 2001.-448 с.

59. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А. Тарчевский. М.: Наука, 2002. - 294 с.

60. Тарчевский И.А. Салицилат-индуцированная модификация протеомов у растений / И.А. Тарчевский, В.Г. Яковлева, A.M. Егорова // Прикл. биохимия и микробиология. 2010. - Т. 46. - С. 263-275.

61. Титов А.Ф. Влияние высоких концентраций кадмия на рост и развитие ячменя и овса на ранних стадиях хранения / А.Ф. Титов, Г.Ф. Лайдинен, Н.М. Казнина // Агрохимия. 2002. - №9. - С. 61-65.

62. Титов А.Ф. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур / А.Ф. Титов, Т.В. Акимова, Л.В. Таланова, Л.В. Топчиева. М.: Наука, 2006. - 143 с.

63. Топчиева Л. В. Сравнительное изучение реакции растений на действие высоких закаливающих и повреждающих температур. Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.01.05 Петрозаводск, 1994. - 19 с.

64. Третьякова О.М. Экспрессия .РЯ-генов при бактериальной инфекции / О.М. Третьякова, А.И. Евтушенков // Труды БГУ. 2011. - Т. 6, №1. - С. 163167.

65. Трушанов В.Н. Руководство по изучению биологического окисления поляграфическим методом / В.Н. Трушанов. М.: Наука, 1973. - 221 с.

66. Чересиз C.B. Мобильные элементы и стресс / C.B. Чересиз, H.H. Юрченко, A.B. Иванников, И.К. Захаров // Вестник ВОГиС. 2008. - Т. 12, № 1,2.-С. 216-241.

67. Шафикова Т.Н. Экзополисахариды возбудителя кольцевой гнили картофеля и их взаимодействие с рецепторами плазмалеммы клеток растения-хозяина: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.01.05 / Т.Н. Шафикова; СИФИБР СО РАН. Иркутск, 2003. -23 с.

68. Шафикова Т.Н. Экстрацеллюлярные полисахариды возбудителя кольцевой гнили картофеля / Т.Н. Шафикова, Е.В. Рымарева, В.Н. Копытчук, Е.Ю. Эпова, A.C. Романенко // J. of Stress Physiology & Biochemistry. 2006. -T.2. - С. 4-9.

69. Шевирева О.М. Везикулярный транспорт PIP-аквапоринов в растительной клетке при осмотическом стрессе: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.01.05 / О. М. Шевирева; МГУ. Москва, 2008. - 26 с.

70. Шкаликов В.А. Защита растений от болезней: Учебник. 2-е изд. / В.А. Шкаликов, О.О. Белошапкина, Д.Д. Букреев и др. М.: Наука, 2005. - 327 с.

71. Эпова Е.Ю. In vitro протеолитическая активность возбудителя кольцевой гнили картофеля / Е.Ю. Эпова, Т.Н. Шафикова, A.C. Романенко // Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию Иркусткого НИИСХ. -2007. С. 156-160.

72. Agarwal М. Plant HSP100 proteins: structure, function and regulation / M. Agarwal, S. Katiyar-Agarwal, A. Grover // Plant Science. 2002. - V. 153. - P. 397-405.

73. Ali R.M. The effects of treatment with polyamines on dry matter, oil and flavonoid contents in salinity stressed chamomile and sweet marjoram / R.M. Ali, H.M. Abbas, R.K. Kamal // Plant, Soil and Environment. 2007. - V.53. - P. 529543.

74. Apffel C.A. Induction of tumour immunity with tumour cells treated with iodoacetate / C.A. Apffel, B.G. Arnason, J.H. Peters // Nature. 1966. - V.209, №5024. - P. 694-696.

75. Arnholdt-Schmitt B. Stress-induced cell reprogramming. A role for global genome regulation? / B. Arnholdt-Schmitt // Plant Physiol. 2004. - V. 136. - P. 2579-2586.

76. Ashburner M. The induction of gene activity in Drosophila by heat shock / M. Ashburner, J J. Bonner// Cell. 1979. - V. 17, №2. - P. 241-254.

77. Beltran B. The effect of nitric oxide on cell respiration: A key to understanding its role in cell survival or death / B. Beltran, A. Mathur, M.R. Duchen, J.D. Erusalimsky, S.Moncada // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. -V. 97, №26. P. 14602-14607.

78. Benov L. Superoxide dismutase protects against aerobic heat shock in Escherichia coli / L. Benov, I. Fridovich // J. Bacteriol. 1995. - V. 177, №11.- P. 3344-3346.

79. Bermpohl A. Exopolysaccharides in the pathogenic interaction of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis with tomato plants / A. Bermpohl, J. Dreier, R. Bahro, R. Eichenlaub // Microbiol. Res. 1996. - V. 151. - P. 391-399.

80. Bernard D.H. Environmental model predicting bacterial ring rot symptom expression / D.H. Bernard, M. Kalischuk, D.R. Waterer, B. Bizimungu, R. Howard, M. Lawrence, A. Kawchuk // American Journal of Potato Research. -2011. V. 88, №3. - P. 294-301.

81. Bosl B. The molecular chaperone Hspl04 a molecular machine for protein disaggregation / B. Bosl, V. Grimminger, S. Walter. // J. Struct. Biol. - 2006. - V. 156, №1.-P. 139-1348.

82. Boston R.S. Molecular chaperones and protein folding in plants / R.S. Boston, P.V. Viitanen, E. Vierling // Plant Mol Biol. 1996. - V. 32. - P. 191-222.

83. Bugbee W.M. The recovery of Corynebacterium sepedonicum from sugarbeet seed / W.M. Bugbee, N.C. Gudmestad // Phytopathology. 1988. - V. 78. - P. 205-208.

84. Chandran P. Scope of horticultural land-use system in enhancing carbon sequestration in ferruginous soils of the semi-arid tropics / P. Chandran, S.K. Ray, S.L. Durge, P. Raja, A.M. Nimkar, T. Bhattacharyya // Curr. Sci. 2009. - V. 97. -P. 1039-1046.

85. Chang R.J. Effects of temperature, plant age, inoculum concentration, and cultivar on the incubation period and severity of bacterial canker of tomato / R J. Chang; S.M. Ries; J.K. Pataky // Plant Disease. 1992. - V. 76, №11. - P. 11501155.

86. Chang W.C. 2,3,5-Triphenyltetrazolium reduction in the viability assay of Ulva fasciata (Chlorophyta) in response to salinity stress / W.C. Chang, M.-H. Chen, T.M. Lee // Bot. Bull. Acad. 1999. - V. 40. - P. 207-212.

87. Chin D. Calmodulin: a prototypical calcium sensor / D. Chin, A.R. Means // Trends Cell. Biol. 2000. - V. 10. - P. 322-328.

88. Currie S. Influence of bioenergetic stress on heat shock protein gene expression in nucleated red blood cells of fish / S. Currie, B.L. Tufts, C.D. Moyes //Am J. Physiol. 1999. - V. 276, №4. - P. 990-996.

89. Dammann C. Subcellular targeting of nine calcium-dependent protein kinase isoforms from Arabidopsis / C. Dammann, A. Ichida, B. Hong // Plant Physiol. -2003.-V. 132.-P. 1840-1848.

90. Dat J. The interplay between salicylic acid and reactive oxygen species during cell death in plants / J. Dat, N. Capelli, F.Van Breusegem // Springer, Dordrecht. 2007. - P. 247-276.

91. Denny T.R. Involvement of bacterial polysaccharides in plant pathogenesis / T.R. Denny // Anny. Rev. Phytopathol. 1995. - V. 33. - P. 173-197.

92. Doyle S.M. Hspl04 and ClpB: protein disaggregating machines / S.M. Doyle, S. Wickner // Trends Biochem. Sci. 2009. - V.34, №1. - P.40-48.

93. Dreier J. Characterization of the plasmid encoded virulence region pat-1 of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis / J. Dreier, D. Meletzus, R. Eichenlaub // Mol Plant Microbe Interact. 1997. - V. 10, №2. - P. 195-206.

94. Eichenlaub R. Clavibacter michiganensis, a group of Gram-positive phytopathogenic bacteria / R. Eichenlaub, K.H. Gartemann, A. Burger // Plant-Associated Bacteria. 2006. - P. 385-422.

95. Eichenlaub R. The Clavibacter michiganensis subspecies: molecular investigation of gram-positive bacterial plant pathogens / R. Eichenlaub, K.H. Gartemann // Annu Rev Phytopathol. 2011. - V. 49. - P. 445-464.

96. Eulalio A. Pbodies: at the crossroads of posttranscriptional pathways / A. Eulalio, I. Behm-Ansmant, E. Izaurralde // Nat Rev Mol Cell Biol. 2007. - V. 8. -P. 9-22.

97. Fahim F.A. Antitumor activities of jodoacetate and dimethylsulphoxide against solid ehrlich carcinoma growth in mice / A. F. Fahim // Biol Res. 2003. -V. 36, №2. - P. 253-262.

98. Friedrich K.L. Interacions between small heat shock protein subunits and substrate in small heat shock proteinsubstrate complexes / K.L. Friedrich, K.C. Giese, N.R. Buan, E. Vierling // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 1080-1089.

99. Fukui R. Effect of temperature on the incubation period and leaf colonization in bacterial blight of anthurium / R. Fukui, H. Fukui, A.M. Alvarez // Phytopathology. 1999. - V. 89, №11. - P. 1007-14.

100. Garrett K.A. Climate change effects on plant disease: genomes to ecosystems / K.A. Garrett, S.P. Dendy, E.E. Frank, M.N. Rouse, S.E.Travers // Annu Rev Phytopathol. 2006. - V. 44. - P. 489-509.

101. Kalinowski, O. Kaup, O. Kirchner, L. Krause // J. Bacteriol. 2008. - V. 190, №6. -P. 2138-2149.

102. Gifford E.M. The use of heat therapy and in vitro shoot tip culture to eliminate fanleaf virus from the grapevine / E.M. Gifford, M.A. Hewitt // Amer. J. Enol. Vitic. 1961. - №12. - 129-130.

103. Gottesman S. Regulation by proteolysis: developmental switches / S. Gottesman // Current Opinion in Microbiology. 1999. - V. 2. - P. 142-147.

104. Groundean C. A Review of thermotherapy to free plant materi from pathogens, especially seeds from bacteria / C. Groundean, R. Samson, D.S. Sands // Critical Reviews in Plant Sciences. 1994. - V. 13, №1. - P. 57-75.

105. Guo Z. Iodoacetate protects hippocampal neurons against excitotoxic and oxidative injury: involvement of heat-shock proteins and Bcl-2 / Z. Guo, J. Lee, M. Lane, M. Mattson // Acad. Sci. Paris. 2009. - V. 320. - P. 2383-2386.

106. Hanson P.I. AAA+ proteins: have engine, will work / P.I. Hanson, S.W. Whiteheart. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. - V. 6, №7. - P. 519-529.

107. Hendershott C. H. The effect of iodoacetic acid on citrus fruit abscission / C. H. Hendershott // Proc. Fla. State Hort. Soc. 1965. - V. 78. - P. 36-41.

108. Holtsmark I. Expression of putative virulence factors in the potato pathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus during infection / I. Holtsmark, G.W. Takle, M.B. Brurberg // Arch Microbiol. 2008. - V. 189, №2. - P. 131-139.

109. Holtsmark I. Bacteriocins from plant pathogenic bacteria / I. Holtsmark, V.G.H. Eijsink // FEMS Microbiol. Lett. 2008. - V. 280. - P. 1-7.

110. Hong S.W. Mutants of Arabidopsis thaliana defective in the acquisition of tolerance to high temperature stress / S.W. Hong, E. Vierling. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97, №8. - P. 4392-4397.

111. Hong S.W. Arabidopsis hot mutants define multiple functions required for acclimation to high temperatures / S.W. Hong, U. Lee, E. Vierling // Plant. Physiol. 2003. - V.132, №2.- P. 757-767.

112. Howarth, C.J. Molecular responses of plants to an increased incidence of heat shock / C.J. Howarth // Plant Cell Environment. 1991. -V. 14. - P. 831-841.

113. Jaattela M. Overexpression of major heat shock protein hsp 70 inhibits tumor necrosis factor-induced activation of phospholipase A2 / M. Jaattela // J. Immunol. 1993. - V. 151. - P. 4286-4294.

114. Jahr H. Interactions between Clavibacter michiganensis and its host plants / H. Jahr, R. Bahro, A. Burger, J. Ahlemeyer, R. Eichenlaub // Environ Microbiol.1999.-V. 1, №2. P. 113-118.

115. Katiyar-Agarwal S. Search for the cellular functions of plant HsplOO/Clp family proteins / S. Katiyar-Agarwal, M. Agarwal, D.R. Gallie, A. Grover // Crit Rev Plant Sci. 2001. - V. 20. - P. 277-295.

116. Keeler S.J. Acqired thermotolerance and expression of the HSP 100/ ClpB genes of Lima bean / S.J. Keeler, C.M. Boettger, J.G. Haynes // Plant Physiol.2000.-V. 132.-P. 1121-1132.

117. Kim M.S. Calcium and calmodulin-mediated regulation of gene expression in plants / M.S. Kim, W.S. Chung, D. Yun, M.J. Cho // Molecular Plant 2009. -№2.-P. 13-21.

118. Klinkert B. Microbial thermosensors / B. Klinkert, F. Narberhaus // Cell Mol Life Sci. 2009. - V. 66, №16. - P. 2661-2676.

119. Kobayashi D.Y. Bacterial/Fungal interactions: from pathogens to mutualistic endosymbionts / D.Y. Kobayashi, J.A. Crouch // Annu Rev Phytopathol. 2009. -V.47. - P.63-82.

120. Kotak S. A. Novel transcriptional cascade regulating expression of heat stress proteins during seed development of Arabidopsis / S. Kotak, E. Vierling, H. Baumlein, P. von Koskull-Doring // Plant Cell. 2007. - V. 19, №1. - P. 182-195.

121. Krause M. Harpin inactivates mitochondria in Arabidopsis suspension cells / M. Krause, J. Durner // Mol Plant Microbe Interact. 2004. - V.17, №2.- P. 131139.

122. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assemble of the head bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - V.227, № 5259. - P. 680-685.

123. Lash L.H. ATP depletion by iodoacetate and cyanide in renal distal tubular cells / L.H. Lash, J.J. Tokarz, Z. Chen, B.M. Pedrosi, E.B. Woods // J. Pharmacol Exp Ther. 1996. - V.276, №1P. 194-205.

124. Lee S. The structure of ClpB: a molecular chaperone that rescues proteins from an aggregated state / S. Lee, M.E. Sowa, Y.H. Watanabe et al. // Cell. 2003. - V. 115, №2.-P. 229-240.

125. Lee U. Genetic analysis reveals domain interactions of Arabidopsis HsplOO/ClpB and cooperation with the small heat shock protein chaperone system / U. Lee, C. Wie, M. Escobar et al. // Plant Cell. 2005. - V. 17, №2. - P. 559-571.

126. Leroux P. Exploring mechanisms of resistance to respiratory inhibitors in field strains of Botrytis cinerea, the causal agent of gray mold / P. Leroux, M. Gredt, M. Leroch, A.S. Walker // Appl Environ Microbiol. 2010. - V. 76, №19. -P. 6615-6630.

127. Li L. Distinct roles for jasmonate synthesis and action in the systemic wound response of tomato / L. Li, C.Y. Li, G.I. Lee, G.A. Howe // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002. - V. 99. - P. 6416-6421.

128. Liu H.T. Contributions of PIP2-specificphospholipase C and free salicylic acid to heat acclimation-induced thermotolerance in pea leaves / H.T. Liu, W.D. Huang, Q.H. Pan // J. Plant Physiol. 2006. - V. 163. - P. 405-416.

129. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent /O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr et al. // J. Biol. Chem. 1957. - V. 193. -P. 265-275.

130. McLellan C.A. A rhizosphere fungus enhances Arabidopsis thermotolerance through production of an HSP90 inhibitor / C.A. McLellan, TJ. Turbyville, E.M. Wijeratne et al. // Plant Physiol.- 2007. V. 145, №1.-P. 174-182.

131. Meletzus D. Transformation of the phytopathogenic bacterium Clavibacter michigcmense subsp. michiganens by electroporation and development of a cloning vector / D. Meletzus, R. Eichenlaub // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 184-90

132. Meletzus D. Evidence for plasmid-encoded virulence factors in the phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB382 / D. Meletzus, A. Bermpohl, J. Dreier, R. Eichenlaub // J. Bacteriol. -1993.-V. 175.-P. 2131-2136.

133. Michaelis B.L. The reaction of iodoacetic on mercaptans and amines / B.L. Michaelis, M.P. Schubert//J. Am. Chem. Soc. 1934. - V. 78. - P. 162-173.

134. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance / R. Mittler // Trends Plant Sei. 2002. - V. 7. - P. 405-410.

135. Mowart D.M. The effect of iodoacetic acid and other substances on the disappearance of glucose from shed blood / D.M. Mowart, C. P. Steart // Biochem. J. 1934.-№28.-P. 774-778.

136. Mur L.A. The hypersensitive response; the centenary is upon us but how much do we know? / L.A. Mur, P. Kenton, A.J. Lloyd, H. Ougham, E. Prats // J. Exp Bot. 2008. - V. 59, №3. - P. 501-520.

137. Nelson G.A. Corynebacterium sepedonicum in potato: Effect of inoculum concentration on ring rot symptoms and latent infection / G.A. Nelson // Canadian Journal of Plant Pathology. 1982. - V.4, №2.- P. 129-133.

138. Nissinen R. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus elicits a hypersensitive response in tobacco and secretes hypersensitive response-inducing protein(s) / R. Nissinen, F.M. Lai, M.J. Laine, P.J. Bauer, A.A. Reilley, X. Li, S.H.145

139. De Boer, C.A. Ishimaru, M.C. Metzler // Phytopathology. 1997. - V. 87, №7. - P. 678-684.

140. Pastori G.M. Common components, networks, and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of redox and abscisic acid-mediated controls / G.M. Pastori, C.H. Foyer // Plant Physiology. 2002. - V. 129. - P. 460-468.

141. Pitzschke A. Mitogen-activated protein kinases and reactive oxygen species signaling in plants / A. Pitzschke, H. Hirt // Plant Physiology. 2006. - V. 141. - P. 351-356.

142. Polverari A. Nitric oxide-mediated transcriptional changes in Arabidopsis thaliana / A. Polverari // Mol Plant-Microbe Interact. 2003. - V. 16. - P. 10941105.

143. Queitsch C. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis / C. Queitsch, S.W. Hong, E. Vierling, S. Lindquist // Plant Cell. -2000. V.12, №4. - P.479-492.

144. Rangel D.E.N. Stress induced cross-protection against environmental challenges on prokaryotic and eukaryotic microbes / D.E.N. Rangel // World J Microbiol Biotechnol. 2011. - V. 27. - P. 1281-1296.

145. Ries S.M. Phytotoxic glycopeptide from cultures of Corynebacterium insidiosum / S.M. Ries, G.A. Strobel // Plant Physiol. 1972. - V.49, №5. - P. 67684.

146. Rikhvanov E.G. Sodium azide reduces the thermotolerance of respiratively grown yeasts / E.G. Rikhvanov, N.N. Varakina, T.M. Rusaleva, E.I. Rachenko, V.K. Voinikov // Curr. Microbiol. 2002. - V. 45, №6. - P. 394-399.

147. Rikhvanov E.G. Do mitochondria regulate the heat-shock response in Saccharomyces cerevisiae! / E.G. Rikhvanov, N.N. Varakina, T.M. Rusaleva, E.I. Rachenko, D.A. Knorre, V.K.Voinikov // Curr Genet. 2005. - V 48, №1. - P. 4459.

148. Ritossa F. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila / F. Ritossa // Experientia. 1962. - V. 18. - P. 571-573.

149. Rodriguez R. More than 400 million years of evolution and some plants still can't make it on their own: plant stress tolerance via fungal symbiosis / R. Rodriguez, R. Redman // J. Exp. Bot. 2008. - V. 59, №5. - P. 1109-14.

150. Rolland F. Sugar sensing and signaling in plants / F. Rolland, J. Sheen // Biochem. Soc. Trans. 2005. - V. 33. - P. 269-271.

151. Romanenko A.S. The role of extracellular pH-homeostasis in potato resistance to ring-rot pathogen / A.S. Romanenko, A.A. Riffel, I.A. Graskova, M.A. Rachenko // J. of Phytopathology.- 1999.- V.147, №11-12.- P.679-686.

152. Romanenko A.S. Potato cell plasma membrane receptors to ring rot pathogen extracellular polysaccharides / A.S. Romanenko, L.A. Lomovatskaya, T.N.

153. Shafikova, G.B Borovskii, N.V. Krivolapova // J. Phytopathol. 2003. - V.151. - P. 1-6.

154. Romero A.M. Temperature Sensitivity of the Hypersensitive Response of Bell Pepper to Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria / A.M. Romero, C.S. Kousik, D.F. Ritchie // Phytopathology. 2002. - V.92 №2. - P. 197-203.

155. Sánchez-Aragó M. The bioenergetic signature of isogenic colon cancer cells predicts the cell death response to treatment with 3-bromopyruvate, iodoacetate or 5-fluorouracil / M. Sánchez-Aragó , J.M. Cuezva // J Transí Med. 2011. - V. 8. -P. 9-19.

156. Scharf K.D. The expanding family of small Hsps and other proteins containing an a-crystallin domain / K.D. Scharf, M. Siddique, E. Vierling // Cell Stress Chaperones. 2001. - V. 3. - P. 225-237.

157. Schmidt M.M. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes / M.M. Schmidt, R. Dringen // Front Neuroenergetics. 2009. - V.l. - P. 1-10.

158. Schwarzbach E. Heat induced susceptibility of mlo-barley to powdery mildew / E. Schwarzbach // Czech J. of Genetics and Plant Breeding. 2001. -V.37,№3.-P 82-87.

159. Schweizer P. Heat-induced resistance in barley to the powdery mildew fungus Erysiphe graminis f.sp. Hordei / P. Schweizer, L. Vallelian-Bindschedler, E. Mosinger // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1995. - V.47.- P.51-66.

160. Singh A. Plant HsplOO/ClpB-like proteins: poorly-analyzed cousins of yeast ClpB machine / A. Singh, A. Grover // Plant Mol. Biol. 2010. - V. 74, №4-5. - P. 395-404.

161. Slepenkov S.V. The unfolding story of the Escherichia coli Hsp70 DnaK: is DnaK a holdase or an unfoldase? / S.V. Slepenkov, S.N. Witt. // Mol. Microbiol. -2002.-V. 45.-P. 1197-1206.

162. Sniekers Y.H. Estrogen modulates iodoacetate-induced gene expression in bovine cartilage explants / Y.H Sniekers, G.J van Osch, H. Jahr, H. Weinans, J.P. van Leeuwen // Journal of Orthopaedic Research. 2010. - V. 28, №5. P. - 607-615.

163. Somerville C. Plant lipids, metabolism and membranes / C. Somerville, J. Browse // Science. 1991. - №252. - P. 80-87.

164. Taylor J. Signalling crosstalk in plants: Emerging issues / J. Taylor, M. McAinsh // Journal of Experimental Botany. 2004. - V. 55. - P. 147-149.

165. Vabulas R.M. Protein folding in the cytoplasm and the heat shock response / R.M. Vabulas, S. Raychaudhuri, M. Hayer-Hartl, F.U. Hartl // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010. - V.l, №12. - P. 2-18.

166. Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants / E. Vierling // Plant Mol. Biol. 1991. - V. 42. - P. 579-620.

167. Wahid A. Heat tolerance in plants / A. Wahid, S. Gelani, M. Ashraf, M.R. Foolad // An overview. Environmental and Experimental Botany. 2007. - V. 61. -P. 199-223.

168. Walter M.H. The induction of phenylpropanoids biosynthetic enzymes by ultraviolet light or fungal elicitor in cultured parsley cells is overridden by a heat-shock treatment / M.H. Walter // Planta. 1989. - V. 177. - P. 1 -8.

169. Wang W. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response / W. Wang, B. Vinocur, O. Shoseyov, A. Altman // Trends Plant Sci. 2004. - V.9, №5.- P.244-252.

170. Wang P.C. Analysis of global expression profiles of Arabidopsis genes under abscisic acid and H202 Applications / P.C. Wang, Y.Y. Du, G.Y. An, Y. Zhou, C. Miao, C.P. Song // Journal of Integrative Plant Biology. 2006. - V. 48. - P. 62-74.

171. Wang Y. Analysis of temperature modulation of plant defense against biotrophic microbes / Y. Wang, Z. Bao, Y. Zhu, J. Hua // Mol Plant Microbe Interact. 2009. - V.22, №5.- P.498-506.

172. Webb E.C. Enzyme and metabolic inhibitors / E.C. Webb. New York, 1963.-V. 1.-340 p.

173. Westra A.A. Isolation and characterization of extracellular polysaccharide of Clavibacter michiganensis susp. Sepedonicus / A.A. Westra, S.A. Slack // Physiology and Biochemistry. 1992. - №82. - P. 1193.

174. Whrit C. Using reflexivity to optimize teamwork in qualitative research / C. Whrit, C.A. Barry, N. Britten, N. Barber, C. Bradley, F. Stevenson // Qual Health Res. 1999. - V.9, №1. - P. 26-44.

175. Xu M.J. Signal interaction between nitric oxide and hydrogen peroxide in heat shock-induced hypericin production of Hypericum perforatum suspension cells / M.J. Xu, J.F. Dong, X.B. Zhang // Sci. China. Ser.CrLife Sci. 2008. - V. 51. - P. 676-686.

176. Yang J.Y. The involvement of chloroplast HSPlOO/ClpB in the acquired thermotolerance in tomato / J.Y. Yang, Y. Sun, A.Q. Sun, S.Y. Yi, J. Qin, M.H. Li, J. Liu // Plant Mol Biol. 2006. - V. 62, №3. - P. 385-395.

177. Yetka J.E. Ecological application of antibiotics as respiratory inhibitors of bacterial populations / J.E. Yetka, W.J. Wiebe // Appl Microbiol. 1974. - V. 28, №6.-P. 1033-1039.

178. Zhu Y. Temperature modulates plant defense responses through NB-LRR proteins / Y. Zhu, W. Qian, J. Hua // PLoS Pathog. 2010. - V. 6, №4. - P. 1-8.

Информация о работе

Перфильева, Алла Иннокентьевна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2012
ВАК 03.01.05

Диссертация

Влияние теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus с картофелем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние теплового шока и монойодацетата натрия на взаимодействие Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus с картофелем - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы