Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние супрессии крахмальных синтаз на структуру и термодинамические свойства крахмалов из различных источников

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние супрессии крахмальных синтаз на структуру и термодинамические свойства крахмалов из различных источников"

На правах рукописи

Козлов Сергей Сергеевич

ВЛИЯНИЕ СУПРЕССИИ КРАХМАЛЬНЫХ СИНТАЗ НА СТРУКТУРУ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРАХМАЛОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ

ИСТОЧНИКОВ

03.00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА, 2008

003447762

Работа выполнена в Институте биохимической физики им Н. М. Эмануэля Российской Академии Наук.

Научный руководитель- кандидат химических наук

Юрьев Владимир Павлович

Официальные оппоненты-

доктор химических наук, профессор Заиков Геннадий Ефремович

доктор химических наук Гумаргалиева Клара Зеноновна

Ведущая организация Институт элементоорганических соединений им А Н Несмеянова РАН

Защита диссертации состоится «_»_ 2008г в_часов на

заседании диссертационного совета Д 002.039 01 в Институте биохимической физики им. НМ Эмануэля РАН по адресу 119334, Москва, ул Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н Семенова Российской Академии Наук Автореферат разослан «_»_2008г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.039 01, кандидат химических наук

Смотряева М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Крахмал, запасаемый в семенах, клубнях и корнях высших растений в виде нерастворимых гранул, является одним из основных компонентов возобновляемого растительного сырья, такого как пшеница, картофель, кукуруза Крахмал и его основные составляющие, амилоза и амилопекпш, в настоящее время широко используются в химической и пищевой промышленности В последнее время появилась потребность в крахмалах с улучшенными функциональными свойствами, что достигается в основном путем химической модификации напевных крахмалов Новым перспективным подходом является получение крахмалов с заданными характеристиками (соотношение амилоза/амилопекгин, содержание фосфатных групп) непосредственно в растениях путем модификации процессов биосинтеза гфахмала На сегодняшний день выявлены и исследованы основные ферменты, участвующие в биосинтезе полисахаридов крахмала, установлена их роль в процессах биосинтеза амилозы и амилопектина Несмотря на это, вопрос о влиянии генетических изменений в процессах биосинтеза на структуру и физико-химические свойства крахмалов оставался до конца не выясненным Одним из подходов для решения этой проблемы является создание методами селекции, химического мутагенеза или генной инженерии новых линий растений с супрессией (уменьшением активности) основных ферментов, участвующих в биосинтезе амилозы и амилопектина Физико-химические исследования крахмалов (крахмальных гранул), выделенных из таких новых линий растений, позволили бы установить взаимосвязь между изменениями в процессах биосинтеза полисахаридов крахмала и структурой и функциональными свойствами крахмалов Принимая во внимание сложную, иерархическую структуру крахмальных гранул, эта взаимосвязь может быть установлена путем использования комбинации физико-химических методов, позволяющих исследовать строение гранул крахмала на различных уровнях их организации

Цель диссертационной работы состояла в изучении влияния супрессии основных крахмал-синтезирующих ферментов на структуру и физико-химические характеристики крахмалов из различных источников (пшеница, картофель, горох).

Для достижения поставленной цели в настоящей работе были поставлены следующие задачи

1 Исследовать влияние различных комбинаций мутантных аллелей в локусах ¡Ух, кодирующих гранул-связанную крахмальную сингазу в растениях пшеницы, на структуру и термодинамические свойства пшеничных крахмалов

2 Исследовать структуру и термодинамические свойства гранул картофельных крахмалов, выделенных из линий картофеля с ангасмысловой супрессией транул-связанной крахмальной сингазы и фосфорилирующего фермента

3 Исследовать особенности структурной организации гранул крахмалов, выделенных га сортов гороха с мутацией в локусе г (^ояш), кодирующем глюканветвящий фермент, а также установить влияние супрессии глюканветвящего фермента на структуру и термодинамические свойства картофельных крахмалов

Научная новизна работы. Исследованы физико-химические характеристики и структура гранул крахмалов, выделенных из новых линий и сортов пшеницы, картофеля и гороха с супрессией специфических ферментативных активностей, участвующих в биосинтезе

полисахаридов крахмала (амилозы и амилопекгана). Оценены размеры надмолекулярных структур на различных уровнях организации гранул крахмалов Для крахмалов из различных источников были выявлены следующие общие закономерности 1. Супрессия гранул-связанной крахмальной синтазы или изменение числа активных изоформ этого фермента (одна, две или три мутантные аллели) приводит как к изменению соотношения амипоза/амилопекгин, так и к изменениям в локализации макромолекул амилозы в крахмальных гранулах Показано, что различия в локализации амилозы в гранулах проявляются в изменениях термодинамических свойств пшеничных и картофельных крахмалов

2 Супрессия фосфорилирующего фермента не оказывает заметного влияния на структуру и термодинамических свойства картофельных крахмалов

3 Установлено, что уменьшение активности глюканветвящего фермента приводит как к увеличению содержания амилозы в крахмале, так и к значительным изменениям в структурной организации гранул картофельных и гороховых крахмалов Для высокоамилозных гороховых крахмалов впервые обнаружен новый тип структурной организации с неупорядоченным расположением частично-кристаллических структур в гранулах

Практическая значимость работы. На основе полученных результатов можно предсказать изменения в структуре и термодинамических свойствах крахмалов, выделенных из новых линий растений с супрессией различных крахмал-сингезирующих ферментов, что открывает широкие возможности создания новых типов крахмалов с заданными свойствами путем направленных изменений в процессе биосинтеза крахмала Апробация работы Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях 1. V ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2005 г, 2 ХШ International Starch Convention, Moscow (Russia), June 21-23,2005,2 XIV International Starch Convention, Cracow (Poland), June 20-24, 2006, 3 XV International Starch Convention, Moscow (Russia), June 19-21,2007;

Публикации Основные результаты исследования по теме диссертации опубликованы в 8 печатных работах, из них 3 статьи в зарубежных журналах (входящих в список ВАК), 1 статья в сборниках трудов научных конференций и 4 тезиса докладов Личный вклад диссертанта состоял в планировании и проведении экспериментов, обработке, анализе и трактовке полученных данных, формулировании положений и выводов работы

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 125 страницах, содержит 22 рисунка, 11 таблиц Список литературы составляет 140 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность выбранного направления исследований и практическая значимость работы

Первая глава представляет собой литературный обзор, посвященный современным представлениям о структуре крахмалов, их физико-химическим свойствам, а также процессам биосинтеза крахмала. Частично-кристаллические гранулы крахмала

состоят из полисахаридов двух типов - линейной амилозы, содержание которой обычно составляет 25-30%, и разветвленного амилопектина Структурные исследованиям крахмалов показали, что в строении крахмальных гранул можно выделил, несколько уровней организации составляющих их полисахаридов Ламеллярные кристаллиты (ламели) толщиной 5-6 нм, образованные двойными спиралями амилопектина, представляют собой низший уровень. Чередующиеся с периодом повторения 9-10 нм кристаллические и аморфные ламели (области ветвления макромолекул амилопектина) образуют надмолекулярные структуры размером 120-400 нм (тн "кольца роста") Концентрически расположенные "кольца роста" и находящиеся между ними аморфные области представляют собой макроскопический уровень организации крахмальных гранул Анализ литературных данных позволяет заключить, что амилопекган, образуя упорядоченные структуры, играет основную роль в формировании структуры гранул крахмала Роль макромолекул амилозы в структурной организации крахмальных гранул, а также их конформация и локализация в гранулах остаются до конца не изученными

Далее рассмотрены современные представления о биосинтезе крахмала и основные ферменты, входящие в эту метаболическую систему АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза катализирует реакцию синтеза АДФглюкозы, субстрата для синтеза молекул полисахаридов Крахмальные синтазы катализируют удлинение полисахарндных цепей. Три изоформы растворимых синтаз (SSI, SSII, SSIII) участвуют в биосинтезе амилопектина, тогда как грапул-связанная крахмальная синтаза (GBSS) является ключевым ферментом биосинтеза амилозы Глкжанветвящий фермент отщепляет линейный фрагмент полисахаридной цепи и присоединяет его с образованием а-1,6 гликозидной связи к другой линейной цепи, образуя таким образом боковые цепи в ма1фомолекуле амилопектина Для картофельного крахмала характерно большое (~1%) количество фосфорилированных глюкозных остатков Фермент, фосфорилирующий глюкозные остатки в молекуле амилопектина (GWD), был выделен из растений картофеля Согласно современным представлениям, биосинтез амилопектина происходит на поверхности растущей крахмальной гранулы, тогда как амилоза синтезируются внутри 1ранулы в матриксе амилопектина

Различные мутации или изменения активностей ферментов, участвующих в биосинтезе крахмала, непосредственно влияют на количество и химическую структуру полисахаридов и, соответственно, на физико-химические и функциональные свойства крахмалов (структура гранул крахмалов, подверженность кислотному/ферментативному гидролизу, реологические характеристики крахмальных дисперсий и гелей) Одним из основных параметров, характеризующих функциональные свойства крахмалов, является соотношение амилоза/амилопектин Уменьшение активности гранул-связанной крахмальной синтазы (GBSS) или глюканветвящего фермента (SBE) может привести к изменению этого соотношения. Известно, что для крахмалов из мутантной линии кукурузы, в которой отсутствует белок GBSS, температура и энтальпия плавления ламеллярных кристаллитов повышается по сравнению с диким типом Крахмал из линии кукурузы ае с уменьшенной активностью фермента SBE, а также аналогичный гороховый крахмал, характеризуются повышенным (до 70%) содержанием амилозы, а также уменьшением степени кристалличности Для пшеницы и картофеля влияние супрессии

ферментов, участвующих в биосинтезе крахмала, на структуру и функциональные свойства крахмальных гранул практически не исследовано

Во второй главе описаны объекты и методы исследования Для решения поставленных в работе задач было важно исследовать крахмалы, выделенные из генетически охарактеризованных линий растений В качестве объектов исследования были выбраны крахмалы, выделенные из линий пшеницы, картофеля и гороха с супрессией различных крахмал-синтезирующих ферментов, при этом растения выращивали в контролируемых условиях (в теплицах) для устранения влияния параметров окружающей чреды на физико-химические свойства крахмалов

Пшеничные крахмалы с различным содержанием амилозы (21-22 4%) были выделены из линий пшеницы с различными комбинациями мутаций в локусах Wx (Wx-Al, Wx-Bl, Wx-Dl), кодирующих три изоформы гранул-связанной крахмальной синтазы

Картофельные крахмалы с пониженным содержанием амилозы (16% и 12 6%) были выделены из линий картофеля, в которых активность фермента GBSS была уменьшена путем антисмысловой супрессии соответствующего гена Также были исследованы крахмалы с из линий картофеля с антисмысловой супрессией фосфорилирующего фермента (GWD) и крахмалы с повышенным содержанием амилозы (> 40%), выделенные из линий картофеля с антисмысловой супрессией двух изоформ глюканветвящего фермента (SBEI и SBEII)

Высокоамилозные гороховые крахмалы (>60% амилозы) были выделены из сортов морщинистого гороха, выведенных методом химического мутагенеза, для которых реализуется мутация в кодирующем глюканветвящий фермент SBE I локусе г (rugosus)

Термодинамические свойства крахмалов изучали с использованием дифференциального сканирующего микрокалориметра ДА.СМ-4 (Пущино, Россия) в разбавленных (0 3 %) водных дисперсиях крахмалов, в интервале температур 10-120 °С при скорости нагрева 2 °С/мин и избыточном давлении 2 5 бар Образцом сравнения служила дистиллированная вода Из экспериментальных ДСК-термограмм были оценены значения параметра кооперативное™ и толщины ламеллярных кристаллитов в гранулах крахмалов

Разделение линейных цепей амилопектина по степеням полимеризации (после ферментативного расщепления разветвлённой структуры амилопектина) проводили методом высокоэффективной анион-обменной хроматографии с амперомегрической детекцией (ВЭАОХ)

Кислотный гидролиз крахмалов проводили в 2 2 М р-ре НС1 при 30 °С Количество нерастворенного (не гидролизованного) вещества, определяли путем высушивания при 115 °С до постоянного веса Количество гидролизованного вещества определяли по разности между начальным количеством крахмала и количеством нерастворенного вещества

Измерения рентгеновского рассеяния крахмалов в области больших углов проводили на рентгеновской ошически-фокусирующей камере («Baird&Tatlok») с зеркальной системой фокусировки рентгеновского пучка в диапазоне углов рассеяния 2°-40° Дифрактограммы были представлены как функции интенсивности дифракции (Г) от дифракционного угла (29), определены угловые положения основных рефлексов Для определения параметров часгачшнфисталлических надмолекулярных структур в гранулах крахмалов использовали метод рентгеновского рассеяния под малыми углами Измерения проводили на диффрактометре с одномерным позиционно-чувствительным детектором

Интенсивность рассеяния представляли в виде функции от s=(2sinG)/X, где 29 - угол рассеяния, Л - длина волны излучения СиКц (0 154 нм) Для анализа малоугловых диффрактограм использовали паракристаллическую теорию малоуглового рассеяния Аппроксимация экспериментальных кривых рассеяния была выполнена с использованием программного пакета TableCurve 2D (SYSTAT Software), определялись средняя толщина кристаллических ламелей (L^) и величина периода повторения D

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin Pro 7 5 На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения

Третья глава посвящена результатам исследования, их обсуждению и состоит из 4 разделов В первом разделе обсуждается структура и термодинамические свойства пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы, выделенных из изогенных линий пшеницы с различными комбинациями активных изоформ гранул-связанной крахмальной синтазы В пшенице гранул-связанная крахмальная синтаза кодируется тремя локусами (Wx-Al, Wx-Bl и Wx-Dl), мутация (образование нуль-аллели) в одном или нескольких локусах приводит к уменьшению содержания амилозы или ее полному отсутствию в крахмале Линии с различными комбинациями мутаций в локусах Wx были идентифицированы путем элекгрофорегического разделения изоформ гранул-связанной синтазы (Miura et al 1994) Характеристики исследованных пшеничных крахмалов представлены в таблице 1

Таблица 1 Сопоставление различных комбинации мутаншых аллелей в локусах Wx в использованных линиях пшеницы с содержанием амилозы в пшеничных крахмалах

Линия пшеницы Комбинации мутаций в локусах Wx* Содержание амилозы, (%)

Wx-A Wx-B Wx-D

wxABD + + + 21

wxBD - + + 17 1

wxAB + + - 186

wxAD + - + 19 5

wxD - - + 21 1

wxB - + - 22 0

wxA + - - 22 4

*Наличие (+) или отсутствие (-) мутации в локусе Wx

Экспериментальные ДСК-термограммы водных дисперсий пшеничных крахмалов, а также зависимости определенных из них величин энтальпии {АНт) и температуры (Тт) плавления кристаллических ламелей от содержания амилозы в исследованных крахмалах представлены на рис 1 Низкотемпературный эндотермический переход относится к плавлению кристаллических ламелей, тогда как высокотемпературный пик соответствует разрушению амилозо-липидных комплексов С увеличением содержания амилозы дан исследованных крахмалов наблюдается уменьшение как энтальпии, так и температуры плавления кристаллических ламелей Причина уменьшения энтальпии плавления может заключаться в уменьшении степени кристалличности крахмалов при увеличении

содержания амилозы, наблюдавшемся в предыдущих исследованиях крахмалов из различных источников (кукуруза, горох, пшеница)

{-

5 10 15 20

Содержание амилозы, %

5 10 15 20

Содержание амилозы, %

Рис. 1 ДСК-термограммы 0 3% водных дисперсий пшеничных крахмалов (а), зависимость энтальпии (ЛНт) и температуры (Тт) плавления кристаллических ламелей от содержания амилозы в пшеничных крахмалах (б)

Для оценки параметра кооперативности и толщины ламеллярных кристаллитов в гранулах крахмалов использовалась одностадийная модель плавления (Р Ь Рпуа1оу, Б А Ро1ейш1, 1986) Значения энтальпии Вант-Гоффа (А#"я), параметра кооперативности плавления (у) и толщины кристаллических ламелей (Ь^) были рассчитаны согласно уравнениям (1-3)

ДЯ"я = 4Тт2ЩСр -0 5 АС^/АНт (1)

V =АН'н/АНт (2)

Ькрл = 035 у/2 (3),

где Тт - температура максимума теплоемкости на термограмме (температура плавления), Ср -значение максимума избыточной теплоемкости, АСР - разность между теплоемкостями нативного и расплавленного состояния в точке максимума теплоемкости, АН„ - экспериментальная энтальпия плавления кристаллических ламелей При оценке Ьт учитывалось, что проекция одного мономера глюкозы на ось двойной спирали составляет 0 35 нм (Оепм! й а1,1993)

Оценка толщины ламеллярных кристаллитов (1^,) показала (Таблица 2), что для исследованных пшеничных крахмалов эта величина остается практически неизменной в пределах ошибки расчета и составляет 4 5-5.5 нм, что хорошо согласуется с известными данными для других типов пшеничных крахмалов

Чтобы объяснить изменения температуры плавления кристаллических ламелей, необходимо проанализировать полученные данные с использованием уравнения Томсона-

Гиббса, которое определяет температуру плавления частично-кристаллических полимеров

Тт = Тт[1- 2Г/(гиРяРьЬрМ (4),

где Тп и МР„ - температура и энтальпия плавления кристалла неограниченного размера (идеального кристалла), р^, - плотность кристалла, #-свободная поверхностная энергия торцевой грани кристалла. Величину ^ рассчитывали из уравнения (4) используя известные значения Т°т= 366 5 К, АН°т = 355 Дяс/г и д^ = 1 48 г/см3 для кристаллов с моноклинной упаковкой двойных спиралей, которая характерна для крахмалов из злаковых растений (в т ч пшеницы) Также была оценена величина поверхностной энтропии кристаллов (¡¡)

Я, = [(Шт° - АНЛРМ/2 5 (5)

(6),

где - поверхностная энергия кристалла

Из литературы известно, что для пшеничных крахмалов увеличение содержания амилозы до 40% не приводит к изменению типа кристаллической упаковки двойных спиралей (р^, не изменяется) Величина Ь^ также остается практически постоянной для исследованных крахмалов (Таблица 2) Таким образом, изменения температуры плавления кристаллических ламелей вызвано изменением величины у„ которая в основном определяется поверхностной эптропией кристалла, пропорциональной количеству дефектов в кристалле Можно заключить, что увеличение величины у, (Таблица 2) свидетельствует об увеличении степени дефектности кристаллитов с ростом содержания амилозы Дефектами в данном случае являются амилозные проходные цепи - молекулы амилозы, проникающие через несколько кристаллических и аморфных слоев и нарушающие кристаллическую упаковку двойных спиралей амилопекгина

Таблица 2. Значения толщины кристаллической ламели (1^,). свободной поверхностной энергии (у,) и энтропии торцевой грани кристалла для пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы

Линия пшеницы Содержание амилозы, % Tm, К Lgpa, HM y„{Джсм"2)106 s„ (Дж см-2 К"') 108

wxABD 21 3349 4610 3 1 1 1 30

wxBD wxAB wxAD 171 18 6 195 334 1 333 1 332 6 5 5+01 5 8±0 2 4 7±02 12 12 12 16 16 16

wxD wxB wxA 21 1 22 0 22 4 3315 328 9 3310 4 7+02 5 4±0 2 5 1±0 1 14 14 14 1 8 18 19

Среднее 5 1±0 6

Анализ изменений термодинамических характеристик кристаллических ламелей {Тт У» ■О показывает, что исследованные пшеничные крахмалы можно разделить на три группы К первой группе относится амилопектиновый крахмал (\vxABD) Для крахмалов из второй группы (171-19 5% амилозы) термодинамические характеристики кристаллических ламелей незначительно отличаются от таковых для крахмала из линии \vxABD Для крахмалов из третьей группы (>21% амштозы) наблюдаются наибольшие

различия величин Тю уи ^ по сравнению с амилопекгиновым крахмалом. Известно, что для линии \vxABD отсутствуют синтезирующие амилозу ферменты (три нуль-аллели в локусах 1¥х), для крахмалов второй группы (1ЛгхВО, \VxAB и ^МхАО) синтез амилозы осуществляется одной изоформой гранул-связанной синтазы (две нуль-аллели), тогда как для крахмалов из третьей группы (№хА, \УхВ и WxD) в биосинтезе амилозы участвуют две изоформы белка ОВБЭ (одна нуль-аллель)

Учитывая различия термодинамических характеристик кристаллических ламелей (Гт ук .?,), можно сделать вывод, что для крахмалов из первой и второй групп степень дефектности кристаллических структур отличается незначительно, тогда как для крахмалов из третьей группы наблюдается значительное увеличение количества дефектов в кристаллитах Принимая во внимание близкие значения содержания амилозы в крахмалах из второй и третьей групп, можно полагать, что причиной наблюдаемых отличий термодинамических характеристик кристаллических ламелей для этих групп крахмалов является различная локализация молекул амилозы в гранулах Для проверки этого предположения крахмалы из трех групп (\vxABD, чухАВ, \ухВ) были подвергнуты кислотному гидролизу. Известно, что кислотный гидролиз крахмалов происходит в две стадии, на первой (I) идет гидролиз аморфных областей гранулы, на второй (II) - гидролиз кристаллических областей (рис 2)

70 60 50 V? 40 И 30 20 10 0

10 12 14 16 1, сутки

18 20

Рис.2 Кислотный гидролиз пшеничного крахмала из линии \vxABD Б-количество растворенного вещества Показана аппроксимация двух стадий гидролиза

Скорости гидролиза на обеих стадиях зависят от скорости проникновения в гранулу ионов ЬГ через частично-кристаллические «кольца роста» Найденные значения скоростей кислотного гидролиза для крахмалов из различных групп (\vxABD, \vxAB, \ухВ) приведены в таблице 3 Видно, что для крахмала из линии \ухВ скорость гидролиза на обоих стадиях выше по сравнению с крахмалами из линий \vxAB и адтсАВЦ для которых скорости кислотного гидролиза в пределах ошибки определения практически одинаковы. Увеличение скорости гидролиза кристаллических областей (г2) для образца \ухВ можно объяснил, увеличением содержания в них дефектов (амилозных проходных цепей), так как дефекты играют роль «каналов», ускоряющих проникновение протонов внутрь гранулы. После завершения первой стадии пиролиза было определено содержание амилозы в кристаллических областях Для амилопекгинового крахмала (\vxABD) амилозы в кристаллических ламелях не обнаружено, тогда как для крахмала \ухВ наблюдается большее содержание амилозы в 1фисталл1тгах по сравнению с крахмалом \vxAB Таким

образом, крахмалы из третьей группы (У/хА, \УхВ и WxD) по всей видимости действительно характеризуются большим количеством дефектов (амилозных проходных цепей) в кристаллических ламелях по сравнению с крахмалами из двух других групп Данные кислотного гидролиза также свидетельствуют, что для крахмалов из второй и третьей групп локализация макромолекул амилозы в гранулах очевидно действительно различна, что проявляется в обнаруженных различиях в скоростях кислотного гидролиза крахмалов и в термодинамических характеристиках кристаллических ламелей (Тт уи .$,)•

Таблица 3. Сопоставление скоростей кислотного гидролиза на первой (г^ и второй (г2) стадиях для пшеничных крахмалов из трех групп, содержание амилозы в кристаллитах, определенное после завершения первой стадии кислотного гидролиза (АСкр)

Тип крахмала Содержание амилозы, % Гь %/день Г2, %/день ■в о4

лухАВО 21 4.4±0.2 (0 99) 1 8±0 2 (0 99) 0

УУХАВ 186 4 0±0 3 (0.99) 1.6±02(0 98) 15

техВ 22 0 5 5±0 3 (0 99)* 2 4Ш 01 (099)* 5.4

* Скорость гидролиза на двух стадиях определялась как коэффициент соответствующей линейкой регрессии, коэффициенты корреляции линейных регрессий приведены в скобках

Для уточнения строения частично-кристаллических «колец роста» пшеничные крахмалы были исследованы методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) На Рис 3. представлены малоугловые диффрактохраммы пшеничных крахмалов Видно, что интенсивность малоуглового рефлекса (1мам) для крахмала wxABD выше по сравнению со всеми остальными типами крахмалов, причем с увеличением содержания амилозы наблюдается уменьшение величины 1макс (Табл 4) Однако, анализ малоугловых диффрактограм с помощью паракристаллической теории малоуглового рассеяния показал, что для исследованных крахмалов величины как периода повторения (£)), так и толщины кристаллических ламелей (Ькрл) практически равны в пределах ошибки определения (Табл 4). При этом, значения толщины кристаллических ламелей, оцененные с использованием двух независимых методов (ДСК и малоуглового рентгеновского рассеяния) для исследованных пшеничных крахмалов (Табл 2 и 4) практически совпадают в пределах ошибки этих методов

Таблица 4. Значения параметров частично-кристаллических «колец роста» для пшеничных крахмалов, рассчитанных с применением паракристаллической модели средний период повторения (О), толщина кристаллических ламелей (Х^,), интенсивность малоуглового рефлекса (4^)

Тип крахмала Содержание амилозы. % Д нм 1макс (отн единицы)

\vxABD 2.1 9 1±0.1 4 7±0.1 118

\vxBD 171 89±0 1 4 7±0 1 53

\vxAB 186 8 7±02 4 3±02 52

\vxl3 21 1 92±02 44±0 5 3.3

\vxJ3 220 8 8±02 44±02 30

Среднее значение 4.5±02

Наблюдаемые изменения в величине 1УЖС согласно теории дифракции рентгеновских лучей, могут быть связаны в основном с различием электронных плотностей между кристаллической и аморфной фазами в частично-кристаллических структурах крахмальных гранул, что в нашем случае может быть обусловлено различиями в локализации молекул амилозы в упорядоченных частичшмфисташшческих структурах гранул Кроме того, го сопоставления данных ДСК и малоуглового рентгеновского рассеяния видно, что для крахмалов второй группы (две нуль-аллели в локусах 1№х) наблюдается значительное уменьшение величины по сравнению с крахмалом \vxABD, тогда как температура плавления кристаллических ламелей практически не изменяется. Для крахмалов же из третьей группы (одна нуль-аллель в локусах Шх) наблюдаются как дальнейшее уменьшение интенсивности малоуглового рефлекса, так и значительное уменьшение температуры плавления кристаллических ламелей по сравнению с амилопекгиновым крахмалом Таким образом можно с уверенностью предположить, что для тфахмалов второй группы уменьшение величины 1махс обусловлено накоплением молекул амилозы, не являющихся дефектами в кристаллических ламелях и не влияющих на их температуру плавления, но при этом уменьшающих разницу электронных плотностей между кристаллическими и

аморфными ламелями Такие амилозные цепи располагаются в основном в аморфных ламелях и ориенгарованны параллельно кристаллитам (вкЦеу, 1995) Для крахмалов из третьей группы, помимо накопления амилозы в аморфных ламелях, увеличивается также содержание амилозных проходных цепей Накопление молекул амилозы двух указанных типов может объяснить как наблюдаемое уменьшение интенсивности дифракционного максимума ¡мак., так и изменение температуры плавления кристаллических ламелей.

Суммируя полученные данные можно сделать вывод, что в зависимости от набора активных изоформ гранул-связанной крахмальной синтезы молекулы амилозы локализуются в различных областях крахмальных гранул Для крахмала из линии с тремя нуль-аллелями в локусах Жх (\vxABD) наблюдается отсутствие молекул амилозы в крахмальных гранулах Если биосинтез амилозы контролируется одним ферментом (\VxBD, 'ЭДхАВ, WxAD), молекулы амилозы локализованы преимущественно в аморфных ламелях и ориентированны параллельно кристаллитам Если биосинтез амилозы контролируется двумя изоформами (\УхА, АУхВ, молекулы амилозы расположены как в аморфных ламелях параллельно кристаллитам, так и в кристаллических областях, образуя дефекты упаковки двойных спиралей амилопектина - амилозные проходные цепи Различия в локализации молекул амилозы влияют на скорость кислотного гидролиза пшеничных крахмалов и определяют их термодинамические свойства

Учитывая современные представления о биосинтезе амилозы, можно предположить, что локализация макромолекул амилозы в гранулах зависит от соотношения скоростей биосинтеза амилозы и амилопектина. Когда скорость синтеза амилопектина значительно выше чем скорость синтеза амилозы, молекулы амилозы не успевают встроиться в частично-кристаллические структуры и вытесняются в аморфные области Если скорости синтеза амилозы и амилопектина сопоставимы, тогда процессы формирования упорядоченных структур и синтеза амилозы происходят одновременно В этом случае амилозные цепи образуют дефекты в кристаллитах. Для линий пшеницы с одной нуль-аллелью в локусах И5с (два активных локуса РУх) синтез амилозы по всей вероятности происходит быстрее по сравнению с другими линиями пшеницы, что отражается как в более высоком содержании амилозы, так и в изменении локализации амилозы в крахмальных гранулах.

Во втором разделе изложены результаты структурных и термодинамических исследований картофельных крахмалов с различным содержанием амилозы, выделенных из линий картофеля с антисмысловой супрессией гранул-связанной гфахмальной сингазы (ОВЗБ) и фосфорилирующего фермента (Габл 5) Из литературы известно, что супрессия фермента ОВБЗ значительно уменьшает содержание амилозы в крахмале по сравнению с диким типом. Также известно, что активность гранул-связанной сингазы в ходе биосинтеза крахмала линейно коррелирует с содержанием амилозы (Ткрзе й а1 1996) Таким образом, более высокое содержание амилозы в тфахмале из линии ОВ58#2 по сравнению с амилопектиновым картофельным 1фахмалом (ОВ88#1) свидетельствует о частичной супрессии фермента ОВЭЗ для этой линии картофеля

Таблица 5. Влияние супрессии ферментов ОВБв и вМ) на содержание амилозы и

фосфатных групп в картофельных гдрахмалах, соответственно.

Тип супрессии Генотип Содержание амилозы8, % 01и-6Р, нмоль/мг крахмала

ОВ8Б#1 Курас 1 9±0 3 213

ОВ88#2 Дианелла 12 6±02 17 2

вт>#1 Дианелла 3б.0±0.3 2 25

Дианелла 36.5±0 4 231

Дикий тип Дианелла 31 1±02 141

"Средние значения и стандартные отклонения для шести независимых измерений, уровень значимости 95%

Экспериментальные ДСК-термограммы водных дисперсий картофельных крахмалов представлены на Рис. 4. Для всех исследованных крахмалов, кроме крахмала из линии с частичной супрессией гранул-связанной синтезы,

наблюдаются симметричные ДСК-термограммы Причина асимметрии ДСК-термотраммы может заключаться в наличии в гранулах упорядоченных структур с различной термостабильностью Это предположение было проверено путем нагрева дисперсии крахмала до 65 °С, охлаждения и последующего повторного напева (Рис 4) В результате такого «отжига» структура с низкой температурой плавления была расплавлена и на термограмме наблюдается один симметричный пик - плавление более стабильных кристаллитов Значения температуры и энтальпии плавления кристаллических ламелей двух типов были определены путем деконволюции исходного калориметрического пика

Значения термодинамических параметров плавления кристаллических ламелей для исследованных картофельных крахмалов представлены в таблице 6 Супрессия транул-связанной синтазы приводит к значительному увеличению как температуры, так и энтальпии плавления кристаллических ламелей, в то время как супрессия фермента СТО существенно не отражается на параметрах плавления кристаллических ламелей, наблюдается лишь небольшое увеличение энтальпии плавления по сравнению с контролем (дикий тип)

Дикий тип

СВ8в#2 повторный аагрев -

вВввйг _

СВБвМ

С\УШ1

Рис. 4 ДСК-термограммы водных дисперсий

картофельных крахмалов с различным содержанием амилозы.

Рассмотрим изменения температуры плавления кристаллических ламелей с увеличением содержания амилозы в картофельных крахмалах с применением уравнения Томсона-Гиббса Толщина кристаллических ламелей для исследованных крахмалов остается неизмененной в пределах ошибки определения (Таблица 6). Более того, как показали калориметрические исследования в 06 М растворе КС1, для исследованных картофельных крахмалов величина Т„ увеличилась на 2-3 К, что свидетельствует о гексагональном типе (В-типе) упаковки двойных спиралей в гранулах крахмалов Таким образом, понижение температуры плавления кристаллических ламелей с увеличением содержания амилозы вызвано увеличением свободной энергии торцевой грани кристалла ув т е накоплением дефектов (амилозных проходных цепей) в кристаллических ламелях Необходимо отметил., что для крахмала из линии ОВ88#2 накопление дефектов и понижение температуры плавления происходит не для всех кристаллитов, что приводит к появлению выраженной асимметрии на термограммах ДСК

Таблица 6. Влияние супрессии ферментов СВвБ и вШ) на значения энтальпии (АНт) и температуры (Тт) плавления кристаллических ламелей, толщину (Дрл) и свободную поверхностную энергию образования торцевой грани кристалла (у,) для исследованных картофельных крахмалов

Тип супрессии Содержание амилозы, % Тш,к АНщ, кДж/моль Црл-™ У» (Джем"2) 107

СВ88#1 19±03 342 3±0 1 4 1±0 1 55 16

СВ88#2 12 6±0 2 343 7±0 1 4 3±02 5.8* 15

340 2±0 1 26

вЖШ 36 0±0 3 337 30±0 05 3 4±02 5.1 34

36 5±0.4 337 2±0 1 3 3±0 1 50 35

Дикий тип 31.1±0 2 337 5±0 05 29±0 1 57 38

Среднее 5 3±02

♦Среднее значение для двух различных кристаллических структур

Исследования картофельных крахмалов методом малоуглового рентгеновского рассеяния (Рис 5) показали, что интенсивность малоуглового рефлекса (1щк;) уменьшается с увеличением содержания амилозы Анализ малоугловых диффракгограм с помощью паракристаллической теории малоуглового рассеяния показал, что для исследованных картофельных крахмалов величина периода повторения (С) и толщина кристаллических ламелей не изменяются (Таблица 7)

8, НИ"1

Рис. 5. Кривые малоуглового рассеяния 50% водных дисперсий картофельных крахмалов (1-ОВ88#1, 2-ОВ88#2, 3-дикий тип (контроль), 4- GWD#1)

Таблица 7. Влияние супрессии ферментов СВБЗ и GWD на значения структурных параметров для исследованных картофельных крахмалов1 средний период повторения (£>), толщина кристаллических ламелей (1^,), интенсивность малоуглового рефлекса (1макс)

Тип супрессии Содержание амилозы, % ^макс (ота единицы) Б, нм Цш,НМ

ОВ88#1 1 9±03 7.5 90 52

ОВ88#2 12 6±02 51 86 5.1

Дикийтип 31.1±02 35 88 54

втт 360±03 25 88 5.6

Среднее значение 8 8±0.2 5 3±02

Как было показано выше, изменения в величине 1мак: с увеличением содержания амилозы можно объяснить различиями в локализации молекул амилозы в упорядоченных частично-1фисталлических структурах Сопоставление данных ДСК и малоуглового рентгеновского рассеяния показало, что для крахмала из линии ОВ8Б#2 наблюдается как уменьшение величины 1макс, так и образование фракции кристаллитов с пониженной температурой плавления Таким образом, для крахмала из линии с частичной супрессией гранул-связанной синтазы (ОВЗЭ) происходит как накопление молекул амилозы, расположеных в аморфных ламелях параллельно кристаллитам, так и амилозных проходных цепей, являющихся дефектами и уменьшающих температуру плавления кристаллитов Для крахмала из дикого типа, как и для крахмалов из растений с супрессией фермента вШ), наблюдаются дальнейшее уменьшение интенсивности малоуглового рефлекса, а также значительное уменьшение температуры плавления кристаллических ламелей по сравнению с амилопектиновым крахмалом (ОВ88#1). Эти результаты свидетельствуют о накоплении амилозных проходных цепей в кристаллических ламелях для указанных крахмалов, что связано с увеличением активности гранул-связанной синтазы до нормального уровня.

Таким образом, супрессия двух крахмал-синтезирующих ферментов (ОВЭЗ и ОЖ>) по разному влияет на структуру и термодинамические свойства картофельных ¡фахмалов Супрессия фермента вЖ) практически не изменяет структуру крахмальных гранул, за исключением небольшого увеличения энтальпии плавления 1фисталлических

ламелей по сравнению с крахмалом из дикого типа Можно сделать вывод, что фосфатные группы, ковалентно присоединенные к полисахаридам крахмала, могут препятствовать образованию двойных спиралей и/или их упаковке в кристаллиты Супрессия гранул-связанной сингазы (ОВЭБ) приводит не только к уменьшению содержания амилозы, но и уменьшению дефектности упорядоченных частично-кристаллических структур в 1ранулах картофельных крахмалов Более высокая активность фермента вЙБЭ доя линии с частичной супрессией этого фермента приводит к образованию двух типов кристаллических структур в гранулах, которые различаются температурами плавления и соответственно, дефектностью Влияние локализации молекул амилозы на структурные и термодинамические свойства картофельных крахмалов в целом повторяют аналогичные закономерности, описанные выше для пшеничных крахмалов из изогенных линий

В третьем разделе изложены результаты исследований картофельных крахмалов с повышенным содержанием амилозы, выделенных из линий с антисмысловой супрессией глюканветвящего фермента (БВЕ) Понижение активности фермента БВЕ приводит как к увеличению содержания амилозы в крахмале (Табл 8), так и к также значительному повышению количества фосфорилированных гшокозных остатков

Таблица 8. Влияние супрессии активности фермента БВЕ в линиях картофеля на

содержание амилозы и фосфатных групп в картофельных 1фахмалах

Тип супрессии Активность фермента SBE, Aads* 103/мин/мг веса клубня Содержание амилозы, % Glu-бР, нмоль/мг крахмала

Дикий тип 20±2 31 1±0 2 141

SBE#1 4±1 42 7±0 6 472

SBE#2 5±1 41 9±0 7 52 5

Чтобы установить, как изменения в активности фермента SBE повлияло на химическую структуру амилопекгина, картофельные крахмалы (после ферментативного расщепления разветвленной структуры амилопекгина изоамилазой) были исследованы методом ВЭАОХ. Анализ распределений линейных цепей амилопекгина по степеням полимеризации (СП) показал (Рис. 6), что супрессия фермента SBE приводит к уменьшению относительного содержания коротких (СП 10-20) и увеличению относительного содержания длинных цепей (СП 25-40), тек увеличению средней длины боковых цепей амилопекгина. Таким образом, уменьшение активности фермента SBE приводит изменению молекулярной структуры макромолекул амилопекгина.

ЯЕИ, 4Г7%ампвы -»- ¡5ЕВ>2, 419%амиивы -■- Д«айтщ Ш%амивы

Рис 6. Влияние супрессии фермента БВЕ в линиях картофеля на распределения линейных цепей

амилопекгина по степеням полимеризации для

картофельных крахмалов

20 30 40 Я) Сшнь швмрпаии (СЦ|

Чтобы проверить, как изменения в молекулярной структуре амилопекгина влияют на надмолекулярную организацию полисахаридов, картофельные крахмалы были исследованы методом малоуглового рентгеновского рассеяния Малоугловые диффракгограммы картофельных крахмалов с повышенным содержанием амилозы, выделенные из линий с супрессией фермента БВЕ, представлены на Рис 7 Малоугловая диффракгограмма для крахмала из контрольной линии (дикий тип) характеризуется симметричным пиком в диапазоне значений вектора рассеяния 0 09-011 нм'1. В отличие от крахмала из контрольной линии, для картофельных крахмалов из 8ВЕ-супрессированных линий на кривой рассеяния наблюдается широкий и асимметричный малоугловой пик, сдвинутый в область меньших значений вектора рассеяния Анализ данных МУРР для крахмала из контрольной линии с использованием паракристаллической модели дал следующие значения структурных параметров толщина кристаллических ламелей Ь^ - 5 4±0.2 нм, период повторения - 8 7±0,4 нм, число кристаллических слоев в «кольце роста» - 20 Полученные значения структурных параметров хорошо совпадают с известными данными для картофельных крахмалов со сравнимым содержанием амилозы 10-

1-Дикий тип, 311% амилозы

2-8ВЕ#1,42 7% амилозы

3-вВЕИ, 41.9% амилозы

Рис. 7. Кривые малоуглового рассеяния картофельных крахмалов (1- дикий тип (контроль), 2-8ВЕ#1,3-БВЕ#2)

Анализ асимметричных малоугловых дифрактограмм, полученных для картофельных крахмалов из 8ВЕ-супрессированных линий, проводили с помощью

паракристашшческой модели, которая учитывает наличие переходного слоя между кристаллическими и аморфными слоями в частично-кристаллических упорядоченных структурах крахмальных гранул Полученные результаты (Табл. 9) свидетельствуют, что супрессия фермента ЭВЕ приводит как к увеличению величины периода повторения (О), так и средней толщины кристаллических ламелей (Ь^м) в крахмальных гранулах по сравнению с крахмалом из контрольной линии С другой стороны, значительно уменьшается число когерентно рассеивающих слоев в частично-кристаллических структурах, те уменьшается расстояние, на котором сохраняется коррелированное расположение кристаллических ламелей Именно этот факт позволяет объяснить асимметричность экспериментальных малоугловых диффракгограмм для картофельных крахмалов из линий с супрессией глюканветвящего фермента БВЕ. Значения средней толщины кристаллических ламелей, полученные для картофельных крахмалов из БВЕ-супрессированных линий, соответствуют длине боковых цепей амилопекгина в 22-25 остатков гшокозы (проекция остатка глюкозы на ось двойной спирали составляет 035 нм), те увеличение толщины кристаллических ламелей и среднего периода повторения хорошо согласуется с увеличением средней дайны боковых цепей амилопекгина. На основании полученных данных можно заключить, что изменения в молекулярной структуре амилопекгина отражаются на надмолекулярной организации макромолекул амилопекгина в гранулах картофельных крахмалов.

Таблица 9. Влияние супрессии фермента ЭВЕ в линиях картофеля на значения структурных параметров картофельных крахмалов средний период повторения (О), толщину кристаллических ламелей (Ьцрл) ширина распределения кристаллитов по толщине (ас), число когерентно рассеивающих кристаллических слоев (И)

Тип супрессии Содержание амилозы, % Екр» нм Б, нм °с, нм N

Дикий тип 31 1 54±02 8 7±04 1 8±0 1 20

8ВЕ#1 42.7 82±02 120 49±0.1 23

8ВЕ#2 41.9 87±0 3 119 5 0±0.1 23

Изменения струтоурных параметров для картофельных крахмалов из линий с супрессией глюканветвящего фермента БВЕ проявляются и в изменении их термодинамических свойств, что было продемонстрировано методом ДСК (рис. 8) Видно, что температура плавления для крахмалов из ЭВЕ-супрессированных линий повышается по сравнению с крахмалом из контрольной линии, что согласуется с увеличением толщины ламеялярных кристаллитов Оценка толщины кристаллических ламелей с применением модели двух состояний дает значения 7.5±0 2 и 7 3±0 3 нм для крахмалов из линий БВЕ#1 и 8ВЕ#2, соответственно Необходимо отметить, что значения толщины тфисталлических ламелей, оцененные с использованием двух методов (ДСК и малоугловое рентгеновское рассеяние) для картофельных тфахмалов с повышенным содержанием амилозы, практически одинаковы Для крахмалов из ЗВЕ-супрессированных линий наблюдается также и увеличение ширины калориметрических пиков, т.е. меньшая

кооперативность процесса плавления кристаллитов. Это можно объяснить более широким распределением кристаллитов по толщине, что согласуется с результатами анализа малоугловых дифрактограмм (Табл. 9).

вВЕ#2 Тт=345.4

Рис. 8 ДСК-термограммы водных дисперсий картофельных крахмалов с нормальным (1) и повышенным (2,3) содержанием амилозы

Т,К

На рисунке 9 представлены микрофотографии в плоско-поляризованном свете гранул картофельных крахмалов из линий с супрессией глюканветвящего фермента БВЕ. Видно, что для крахмалов наблюдается характерная картина двулучепреломления («мальтийский крест»), что говорит о радиальной ориентации упорядоченных полисахаридных цепей по отношению к поверхности гранулы. Таким образом, несмотря на уменьшение числа когерентно рассеивающих слоев в частично-кристаллических структурах (Ы), для крахмалов из ЭВЕ-суирессированных линий сохраняется упорядоченное расположение этих структур в объеме гранулы.

Рис. 9. Микрофотографии гранул картофельных крахмалов в плоско-поляризованом свете. А - 8ВЕ#1, Б - 8ВЕ#2 (увеличение 40Х).

Таким образом, супрессия глюканветвящего фермента в картофельных линиях приводит как к повышению содержания амилозы, так и к увеличению степени полимеризации боковых цепей амилопекггана. На более высоком уровне изменения в разветвленной структуре амилопектина отражаются на надмолекулярной организации макромолекул амилопектина в гранулах картофельных крахмалов (увеличение периода повторения и толщины кристаллических ламелей). Для картофельных крахмалов из БВЕ-супрессированных линий реализуется новый тип организации, характеризующийся уменьшением числа когерентно рассеивающих слоев в частично-кристаллических

структурах, которые при этом расположены упорядоченно (параллельно поверхности гранулы) Уменьшение размеров частично-кристаллических структур можно объяснить изменением соотношения скоростей биосинтеза амилозы и амилопекпша, вызванного супрессией фермента БВЕ

Четвертый раздел посвящен исследованию особенностей структурной организации высокоамилозных крахмалов, выделенных из сортов морщинистого гороха («Эрика» и «Изумруд») с мутацией в локусе г (п^олш), который кодирует глюканветвящий фермент (ЭВЕ) Крахмал гладкого гороха сорта «Орловчанин» был использован в качестве контроля Содержание амилозы в крахмалах составило 27.5±0 2 %, 60 0±0 5 % и 65 0±0 4 % для сортов гороха «Орловчанин», «Эрика» и «Изумруд», соответственно Исследование амилопекшновых фракций методом ВЭЖХ показало, что для гороховых крахмалов распределения линейных цепей амилопекгана по степеням полимеризации не отличаются, что говорит о неизменности разветвленной структуры амилопекпша

Широкоугловые дифракгограммы гороховых крахмалов представлены на рис 10 Были определены положения основных рефлексов для крахмала из сорта «Орловчанин», (29 = 5 6°, 15 3°, 17 3°, 23 Г) и для высокоамилозных крахмалов (29= 5 6°, 14 5°, 16 9°, 221°) Хорошо известно, что существует два типа упаковки двойных спиралей, образующих ламеллярные кристаллиты А-тип (моноклинная) и В-тип (гексагональная), которые характерны соответственно для 1фахмалов из злаковых растений и корнеплодов Анализ широкоугловых дифрактограмм показал, что для контрольного образца горохового крахмала реализуется С-тип кристаллической структуры (смесь А и В типов) Положения рефлексов для высокоамилозных гороховых крахмалов соответствуют В-типу структуры Таким образом, увеличение содержания амилозы для исследованных гороховых крахмалов сопровождается изменением типа упаковки двойных спиралей

Рис. 10 Широкоугловые дифракгограммы контрольного образца горохового крахмала (1) и высокоамилозных гороховых крахмалов (сорта «Эрика» (2) и «Изумруд» (3))

На рис 11 приведены малоугловые дифрактограммы исследованных гороховых крахмалов Для контрольного образца горохового крахмала (1) наблюдается характерный пик в диапазоне значений вектора рассеяния 0 09-011 нм"1, который соответствует упорядоченному расположению кристаллических ламелей В отличие от контрольного образца, на малоугловых дифракгограммах высокоамилозных гороховых крахмалов в этом же диапазоне значений вектора рассеяния пика не наблюдается (2,3) Этот результат является достаточно необычным, принимая во внимание наличие кристаллических рефлексов на широкоугловых дифракгограммах, и для нативных крахмалов наблюдался впервые

Рис. 11 Малоугловые дифрактограммы для

контрольного образца

^ горохового крахмала из сорта

^ «Орловчанин» (1) и

^ высокоамилозных крахмалов

из сортов «Эрика» (2) и «Изумруд» (3),

соответственно

00 01 02 03

8, нм"1

Экспериментальные малоугловые дифрактограммы исследованных гороховых крахмалов были проанализированы с помощью паракристаллической теории малоуглового рассеяния Значения параметров, характеризующих частично-кристаллические структуры гранул, приведены в табл 10 Для контрольного образца горохового крахмала («Орловчанин») средняя толщина кристаллических ламелей составляет 5 0±0 2 нм, величина среднего периода повторения (толщина одного кристаллического и одного аморфного слоя) составляет 10 3±0 3 нм, число кристаллических слоев в «кольце роста» равно 25 Для высокоамилозных крахмалов значения средней толщины кристаллов значительно превышают соответствующие величины для контрольного образца горохового крахмала, а расстояние между коррелированно расположенными кристаллическими слоями составляет ~14 нм Более того, число когерентно рассеивающих слоев значительно уменьшается (до 2) Соответственно, уменьшается расстояние, на котором сохраняется коррелированное расположение кристаллических ламелей, что свидетельствует о низкой упорядоченности частично-кристаллических структур в гранулах исследованных высокоамилозных крахмалов

Таблица 10. Структурные параметры исследованных гороховых крахмалов: средняя толщина кристаллических ламелей (Ькрл), средний период повторения (О), ширина распределения кристаллитов по толщине (<7С); число рассеивающих кристаллических слоев (14).

Сорт гороха Ькрп, нм А нм °с, нм N

Орловчанин 5.0±0.2 10.3+0.3 1.2+0.1 25

Эрика 12.7+0.2 14.4+0.2 8.3±0.1 2

Изумруд 11.6±0.2 14.0+0.2 7.8±0.1 2

На рис. 12 приведены микрофотографии гранул гороховых крахмалов в плоско-поляризованном свете. Видно, что для контрольного образца наблюдается характерная картина двулучепреломления («мальтийский крест»), что говорит о радиальной ориентации упорядоченных полисахаридных цепей по отношению к поверхности гранулы. Для высокоамилозных гороховых крахмалов двулучепреломления не наблюдается, свидетельствуя в пользу неупорядоченного расположения кристаллических структур в объеме гранулы. Полученные результаты подтверждают сделанный выше вывод о низкой упорядоченности частично-кристаллические структур для исследованных высокоамилозных гороховых крахмалов. Фактически, для этих крахмалов реализуется новый тил структурной организации, когда частично-кристаллические структуры с небольшим числом когерентно рассеивающих слоев распределены неупорядоченно в аморфной «матрице».

Рис. 12. Микрофотографии нативных гранул крахмалов в плоско-поляризованом свете. А -контрольный образец горохового крахмала, В - высокоамилозный крахмал из сорта гороха «Эрика».

Таким образом, супрессия глюканветвящего фермента для исследованных сортов гороха не приводит к изменению разветвленной структуры амилопектина, однако сказывается на структурной организации крахмальных гранул. Для исследованных высокоамилозных гороховых крахмалов реализуется новый тип организации с неупорядоченным расположением частично-кристаллических структур в объеме гранулы.

выводы

1 На примере 1фахмалов, выделенных из изогенных линий пшеницы было показано, что структура и термодинамические свойства крахмалов зависят от числа активных изоформ фермента гранул-связанной крахмальной синтезы (одна, две или три мутантные аллели в локусах Wx) Впервые установлено, что локализация амилозы в гранулах пшеничных крахмалов зависит от числа активных изоформ фермента гранул-связанной крахмальной синтазы, что в свою очередь проявляется в изменениях термодинамических свойств пшеничных крахмалов

2 Супрессия гранул-связанной сингазы (GBSS) в растениях картофеля приводит как к уменьшению содержания амилозы, так и к уменьшению дефектности упорядоченных частично-1фисталлических структур в гранулах картофельных крахмалов Частичная супрессия этого фермента приводит к образованию двух типов кристаллических структур в гранулах, которые различаются дефектностью и соответственно, температурой плавления Показано, что локализация макромолекул амилозы в гранулах зависит от активности гранул-связанной крахмальной сингазы Супрессия фермента GWD практически не оказывает заметного влияния на структуру и термодинамических свойства картофельных крахмалов

3. Установлено, что уменьшение активности двух изоформ гдюканветвящего фермента в картофеле приводит как к изменению молекулярной структуры амилопекгана, так и к изменениям в структурной организации крахмальных гранул Впервые показано, что для картофельных крахмалов с повышенным содержанием амилозы уменьшается число когерентно рассеивающих слоев в частично-кристаллических структурах, которые при этом располагаются упорядочению (параллельно поверхности гранулы)

4 Для высокоамилозных гороховых крахмалов впервые обнаружен новый тип структурной организации, характеризующийся неупорядоченным расположением частично-кристаллических структур в гранулах

Основные результаты диссертации изложены в работах:

1 Kozlov S S, Noda T\ Bertoft E, Yuryev VP// Structure of starches extracted from near-isogemc wheat lines Part 1 Effect of different GBSS I combinations / Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2006, v. 86 (2), pp 291-301

2 Kozlov S S, Krivandin A V, Shatalova О V, Noda T, Bertoft E, Fornal J, Yuryev V P, Structure of starches extracted from near-isogemc wheat lines Part 2 // Molecular organization of amylopectm clusters / Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2007, v 87 (2), pp 575-584.

3 Kozlov S S., Blennow A, Krivandin A.V., Yuryev V.P // Structural and thermodynamic properties of starches extracted from GBSS and GWD suppressed potato lines./ International Journal of Biological Macromolecules, 2007, v 40 (5), pp. 449-460

4. Kozlov S S, Krivandin A V, Yuryev V P, Structural and thermodynamic properties of new high-amylose wrinkled pea and SBE-suppressed potato starches, In Starch Progress m basic and applied science, Eds P. Tomasik, V P. Yuryev, E Bertoft, Polish Society of food technologists, Malopolska branch, Krakow, 2007, pp 43-78, ISBN 978-8-390269-96-2.

5. Kozlov S S , Yuryev V P., Annealing of wheat starches extracted from near-isogenic wheat lines with different amylose content. Xlllth International Starch Convention, Moscow-Cracow, Moscow, June 2005, p. 44.

6 Kozlov S S , Knvandm A.V., Yuryev V. P, Structural features and thermodynamic behavior of starches extracted from potato and pea Imes with different enzymatic deficiencies. XVth International Starch Convention, Moscow-Cracow, Moscow, June 2007, pp 27-28

7 Kozlov S S , Knvandin A V, Blaszczak W, Yuryev V P , Developmental changes m structural features and thermodynamic properties of Starches extracted from SBE-suppressed potato lines XVth International Starch Convention, Moscow-Cracow, Moscow, June 2007, pp 60-61.

8 Козлов C.C, Юрьев В П Изменение термодинамических параметров пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы, экстрагированных из близко-изогенных линий, в процессе отжига кристаллических ламелей Труды V Международной Молодежной Конференции ИЕХФ РАН-ВУЗЫ «БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА», 14-16 декабря 2005 г, Москва, с 355

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 02 09 2008 г Формат 60x901/16 Уел печ л 1,5 Тираж 100 экз Заказ 475 Тел 939-3890 Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Козлов, Сергей Сергеевич

Принятые сокращения

Введение

Глава 1. Современные представления о структуре, биосинтезе и 10 физико-химических свойствах крахмалов.

1.1 Состав крахмальных гранул и химическая структура 11 полисахаридных компонентов крахмала

1.2. Современные представления о строении крахмальных гранул

1.3. Современные представления о процессах биосинтеза крахмала

1.4. Физико-химические свойства крахмалов и их связь со 32 структурной организацией крахмальных гранул. Факторы, определяющие физико-химические свойства крахмалов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние супрессии крахмальных синтаз на структуру и термодинамические свойства крахмалов из различных источников"

Крахмал является основным запасным полисахаридом растений и одним из самых распространенных полисахаридов в природе. Крахмал образуется в листьях, семенах, клубнях и корнях высших растений, а также образуется у фотосинтезиругощих эукариот, таких как зелёные водоросли. В хлоропластах листьев крахмал накапливается в течение светового дня, запасая таким образом глюкозу, синтезированную в процессе фотосинтеза. В ходе темнового периода крахмал гидролизуется, обеспечивая энергетические потребности растения. В запасающих органах растений (семена, клубни) крахмал образуется в виде нерастворимых частично-кристаллических гранул, что позволяет растению запасать большое количество глюкозы, синтезируемой в процессе фотосинтеза, в компактной осмотически неактивной форме. Крахмальные гранулы состоят из полисахаридов двух типов — линейных макромолекул амилозы, содержание которой обычно составляет 20-30%, и разветвленных макромолекул амилопектина. Морфология, химический состав и внутренняя структура крахмальных гранул зависит от источника выделения крахмала и является характерной для того или иного вида растений.

Помимо важной биологической функции, крахмал является одним из основных пищевых компонентов в рационе человека и играет важную роль в обеспечении энергией обменных процессов в человеческом организме. Недавно было показано, что употребление в пищу резистентных крахмалов оказывает значительный положительный эффект на пищеварительную систему человека. Резистентные крахмалы не подвержены ферментативному гидролизу в тонком кишечнике, и ферментируются посредством кишечной микрофлоры в толстом кишечнике. Помимо непосредственного уменьшения поглощения глюкозы и ее уровня в крови, употребление резистентных крахмалов увеличивает синтез коротко-цепочечных жирных кислот и бутирата, что оказывает стимулирующий (пребиотический) эффект на кишечную микрофлору и снижает риск развития рака толстой кишки.

Крахмал является одним из важнейших компонентов возобновляемого растительного сырья. Ежегодно в мире производится более 50 миллионов тонн крахмала, основными источниками которого являются кукуруза, пшеница и картофель. На сегодняшний день крахмал очень широко используется в пищевой и химической промышленности, как в нативной (немодифицированной) форме, так и после физической и/или химической модификации. В пищевой промышленности крахмал применяется в качестве загустителя, гелеобразователя, для улучшения текстуры и связывающих свойств пищевых продуктов, а также в качестве одного из основных компонентов хлебопекарных изделий и экструдированных продуктов. Крахмал обладает широким спектром непищевых применений, включающих в себя бумажную промышленность (связывающие и клеящие вещества), фармацевтическую промышленность (основа для лекарственных форм, доставка лекарств), нефтедобывающую промышленность (регулятор вязкости), использование в качестве поверхностно-активных веществ, флоккулирующих и отбеливающих агентов. Крахмалы с высоким (> 50 %) содержанием амилозы используются в качестве сырья для производства биодеградируемых материалов и биопластиков.

В основе широкого применения крахмалов в различных областях промышленности лежит многообразие проявляемых ими физико-химических свойств. Основными физико-химическими характеристиками крахмалов, которые определяют их функциональность, являются морфология и внутренняя структура крахмальных гранул, подверженность кислотному и ферментативному гидролизу, термодинамические характеристики желатинизации и ретроградации, реологические характеристики крахмальных дисперсий и гелей. Многие из этих физико-химических характеристик определяются молекулярной структурой амилозы и амилопектина и их надмолекулярной организацией.

В последнее время появилась потребность в крахмалах с улучшенными функциональными свойствами, что достигается в основном путем химической модификации нативных крахмалов. Новым перспективным подходом является получение крахмалов с заданными характеристиками (соотношение амилоза/ амилопектин, содержание фосфатных групп) непосредственно в растениях путем модификации процессов биосинтеза крахмала. На сегодняшний день выявлены и исследованы основные ферменты, участвующие в биосинтезе полисахаридов крахмала, установлена их роль в процессах биосинтеза амилозы и амилопектина. Несмотря на это, вопрос о влиянии генетических изменений в процессах биосинтеза на структуру и физико-химические свойства крахмалов оставался до конца не выясненным. Одним из подходов для решения этой проблемы является создание методами селекции, химического мутагенеза или генной инженерии новых линий растений с супрессией (уменьшением активности) основных ферментов, участвующих в биосинтезе амилозы и амилопектина. Физико-химические исследования крахмалов (крахмальных гранул), выделенных из таких новых линий растений, позволили бы установить взаимосвязь между изменениями в процессах биосинтеза полисахаридов крахмала и структурой и функциональными свойствами крахмалов. Принимая во внимание сложную, иерархическую структуру крахмальных гранул, эта взаимосвязь может быть установлена путем использования комбинации физико-химических методов, позволяющих исследовать строение гранул крахмала на различных уровнях их организации.

Цели и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в изучении влияния супрессии основных крахмал-синтезирующих ферментов на структуру и физико-химические характеристики крахмалов из различных источников (пшеница, картофель, горох).

Для достижения поставленной цели в настоящей работе были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать влияние различных комбинаций мутантных аллелей в локусах Wx, кодирующих гранул-связанную крахмальную синтазу в растениях пшеницы, на структуру и термодинамические свойства пшеничных крахмалов.

2. Исследовать структуру и термодинамические свойства гранул картофельных крахмалов, выделенных из линий картофеля с антисмысловой супрессией гранул-связанной крахмальной синтазы и фосфорилирующего фермента.

3. Исследовать особенности структурной организации гранул крахмалов, выделенных из сортов гороха с мутацией в локусе г (rugosus), кодирующем глюкан-ветвящий фермент, а также установить влияние супрессии глюкан-ветвящего фермента на структуру и термодинамические свойства картофельных крахмалов.

Научная новизна работы

Исследованы физико-химические характеристики и структура гранул крахмалов, выделенных из новых линий и сортов пшеницы, картофеля и гороха с супрессией специфических ферментативных активностей, участвующих в биосинтезе полисахаридов крахмала (амилозы и амилопектина). Оценены размеры надмолекулярных структур на различных уровнях организации гранул крахмалов. Для крахмалов из различных источников были выявлены следующие общие закономерности:

1. Супрессия гранул-связанной крахмальной синтазы или изменение числа активных изоформ этого фермента (одна, две или три мутантные аллели) приводит как к изменению соотношения амилоза/амилопектин, так и к изменениям в локализации макромолекул амилозы в крахмальных гранулах. Показано, что различия в локализации амилозы в гранулах проявляются в изменениях термодинамических свойств пшеничных и картофельных крахмалов.

2. Супрессия фосфорилирующего фермента не оказывает заметного влияния на структуру и термодинамических свойства картофельных крахмалов.

3. Установлено, что уменьшение активности глюкан-ветвящего фермента приводит как к увеличению содержания амилозы в крахмале, так и к значительным изменениям в структурной организации гранул картофельных и гороховых крахмалов. Для высокоамилозных гороховых крахмалов впервые обнаружен новый тип структурной организации с неупорядоченным расположением частично-кристаллических структур в гранулах.

Практическая значимость работы. На основе полученных результатов можно предсказать изменения в структуре и термодинамических свойствах крахмалов, выделенных из новых линий растений с супрессией различных крахмал-синтезирующих ферментов, что открывает широкие возможности создания новых типов крахмалов с заданными свойствами путем направленных изменений в процессе биосинтеза крахмала. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях: 1. V международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2005 г.; 2. XIII International Starch Convention, Moscow (Russia), June 2123, 2005; 2. XIV International Starch Convention, Cracow (Poland), June 20-24, 2006; 3. XV International Starch Convention, Moscow (Russia), June 19-21,2007. Публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации опубликованы в 8 печатных работах, из них 3 статьи в зарубежных журналах (входящих в список ВАК), 1 статья в сборниках трудов научных конференций и 4 тезиса докладов.

Личный вклад диссертанта состоял в планировании и проведении экспериментов, обработке, анализе и трактовке полученных данных, формулировании положений и выводов работы. Исследования крахмалов методом высокоэффективной анион-обменной хроматографии с амперометрической детекцией были проведены в Центре молекулярной физиологии растений Университета Копенгагена (Дания) под руководством проф. Андреаса Бленноу.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 122 страницах, содержит 24 рисунка, 11 таблиц. Список литературы составляет 115 ссылок.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Козлов, Сергей Сергеевич

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ ПО РАБОТЕ

Исследованы физико-химические характеристики и структура гранул крахмалов, выделенных из новых линий и сортов пшеницы, картофеля и гороха с супрессией специфических ферментативных активностей, участвующих в биосинтезе полисахаридов крахмала (амилозы и амилопектина). Оценены размеры надмолекулярных структур на различных уровнях организации гранул крахмалов.

На примере крахмалов, выделенных из изогенных линий пшеницы было показано, что в зависимости от набора активных изоформ гранул-связанной крахмальной синтазы молекулы амилозы локализуются в различных областях крахмальных гранул. Для крахмала из линии с тремя нуль-аллелями в локусах Wx (линия wxABD) наблюдается отсутствие молекул амилозы в крахмальных гранулах. Если биосинтез амилозы контролируется одним ферментом (линии WxBD, WxAB, WxAD), молекулы амилозы локализованы преимущественно в аморфных ламелях и ориентированны параллельно кристаллитам. Если биосинтез амилозы контролируется двумя изоформами гранул-связанной синтазы (линии WxA, WxB, WxD), молекулы амилозы расположены как в аморфных ламелях параллельно кристаллитам, так и в кристаллических областях, образуя дефекты кристаллической упаковки двойных спиралей амилопектина -амилозные проходные цепи. Различия в локализации молекул амилозы влияют на скорость кислотного гидролиза пшеничных крахмалов и определяют их термодинамические свойства.

Супрессия гранул-связанной синтазы (GBSS) приводит не только к уменьшению содержания амилозы, но и уменьшению дефектности кристаллических структур в гранулах картофельных крахмалов. Более высокая активность фермента GBSS для линии с частичной супрессией этого фермента приводит к образованию двух типов кристаллических структур в гранулах, которые различаются температурами плавления и соответственно, дефектностью. Влияние локализации молекул амилозы на структурные и термодинамические свойства картофельных крахмалов в целом повторяют аналогичные закономерности, описанные для пшеничных крахмалов из близко-изогенных линий с различными комбинациями мутантных аллелей в локусах Wx. Супрессия фермента GWD практически не оказывает заметного влияния на структуру и термодинамических свойства картофельных крахмалов.

Установлено, что уменьшение активности двух изоформ глюкан-ветвящего фермента в картофеле приводит как к изменению молекулярной структуры амилопектина, так и к изменениям в структурной организации крахмальных гранул. Впервые показано, что для картофельных крахмалов с повышенным содержанием амилозы уменьшается число когерентно рассеивающих слоев в частично-кристаллических структурах, которые при этом располагаются упорядоченно (параллельно поверхности гранулы). Для высокоамилозных гороховых крахмалов впервые обнаружен новый тип структурной организации, характеризующийся неупорядоченным расположением частично-кристаллических структур в гранулах.

Таким образом, для крахмалов из различных источников были выявлены следующие общие закономерности:

1. Супрессия гранул-связанной крахмальной синтазы или изменение числа активных изоформ этого фермента (одна, две или три мутантные аллели) приводит как к изменению соотношения амилоза/амилопектин, так и к изменениям в локализации макромолекул амилозы в крахмальных гранулах. Показано, что физико-химические свойства пшеничных и картофельных крахмалов зависят не только от соотношения амилоза/амилопектин, но и от локализации молекул амилозы в крахмальных гранулах.

2. Установлено, что уменьшение активности глюкан-ветвящего фермента приводит как к увеличению содержания амилозы в крахмале, так и к значительным изменениям в структурной организации гранул картофельных и гороховых крахмалов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Козлов, Сергей Сергеевич, Москва

1. Buleon A., Colonna P., Planchot V., Bull S. Starch granules: structure and biosynthesis/Anternational Journal of Biological Macromolecules.-1998.-23-P. 85-112.

2. Swinkels, JJ.M. Composition and properties of commercial native starches// Starch/Starke.-1985.-3 7-P. 1-5.

3. Wang T.A., Bogracheva T.Ya., Hedley C.L. Starch: as simple as А, В, C?// Journal of Experimental Botany.-1998-49-P. 481-502.

4. Schwall G.P., Safford R., Westcott R.J., Jeffcoat R., Tayal A., Shi Y.-C., Gidley M.J., Jobling S.A. Production of very high-amylose potato starch by inhibition of SBE A and B//Nature Biotechnology.-2000.-18-P. 551-554.

5. Vandeputte G.E., Delcour J.A. From sucrose to starch granule to starch physical behaviour: a focus on rice starch//Carbohydrate Polymers.-2004.- 58 -P. 245-266.

6. Hizukuri, S., Takeda, Y., and Yasuda, M. Multi-branched nature of amylose and the action of debranching enzymes//Carbohydrate Research.- 1981.-94- P. 205-213.

7. Takeda, Y., Hizukuri, S., Takeda, C., and Suzuki, A.: Structures of branched molecules of amyloses of various origins, and molar fractions of branched and unbranched molecules//Carbohydrate Research.-1987.-165.-P. 139-145.

8. Hizukuri S., Takeda Y., Abe J., Hanashiro I., Matsunobu G., Kiyota H. In: Starch: Structure and Functionality. Frazier PJ., Richmond P., Donald AM. (Eds.); London: Royal Society of Chemistry, 1997.- P. 121-145.

9. Roger P, Colonna P. Molecular weight distribution of amylose fractions obtained by aqueous leaching of corn starch//International Journal of Biological Macromolecules. 1996 -19 - P. 51-61.

10. Morrison W.R., Tester R.F., Snape C.E., Law R., Gidley M.J. Swelling and gelatinisation of cereal starches. IV. Some effect of lipid-complexed amylose and free amylose in waxy and normal barley starches//Cereal Chemistry.- 1993. -70-P. 385-391.

11. Biliaderis C.G., Page C.M., Slade L., Sirett R.R. Thermal behavior of amylose-lipid complexes//Carbohydrate Polymers. 1985 - 5 - P. 367-371.

12. Thompson D.B. On the non-random nature of amylopectin branching// Carbohydrate Polymers.- 2000 43 - P. 223-239.

13. Morrison W.R., Karkalas, J. Starch. In: Methods in Plant Biochemistry; Academic Press Inc., New York, 1990.- p. 323.

14. Hizukuri, S. Polymodal distribution of chain lengths of amylopectins, and its significance//Carbohydrate Research.- 1986-147- P. 342-347.

15. Robin J. P., Mercier C., Charbonniere R., Guilbot A. Lintnerized starches. Gel filtration and enzymatic studies of insoluble residues from prolonged acid treatment of potato starch//Cereal Chemistry.- 1974. 51- P. 389-406.

16. Manners D.J. Resent developments in our understanding of amylopectin structure//Carbohydrate Polymers.- 1989.- 11 87-112.

17. Hizukuri, S. Starch: analytical aspects, In: Carbohydrates in Food. A.-C. Eliasson (Ed.), Marcel Dekker Inc., New York, 1996.- p. 147.

18. Bertoft E., Studies on structure of pea starches. Part 4. Intermediate material of wrinkled pea starch//Starch/Starke.- 1993.- 45-P. 215-220.

19. Bay-Smidt, A.M., Wischmann, В., Olsen, C.E., and Nielsen, Т.Н. Starch bound phosphate in potato as studied by a simple method from determination of organic phosphate and 3 lP-NMR//Starch.- 1994.-46 P. 167-172,.

20. French D. Organization of starch granules. In: Starch: chemistry and technology, BeMiller J.N., Paschall E.F. (Eds.). San Diego: Acedemic Press, 1984.-P. 183-247.

21. Jenkins P. J., Cameron R. E., Donald A. M. A universal feature in the structure of starch granules from different botanical sources//Starch/Starke. 1995. - 45 -P. 417-420.

22. Cameron R. E., Donald A. M. A small-angle X-ray scattering study of the annealing and gelatinization of starch//Polymer.- 1992.- 33 P. 2628-2635.

23. Imberty A., Chanzy H., Perez S., Buleon A., Tran V. The double helical nature of the crystalline part of A-starch//Journal of Molecular Biology.- 1988.- 201-P. 365-378.

24. Imberty, A., Perez, S. A revisit to the three dimensional structure of B-type starch//Biopolymers.- 1988.- 27- P. 308-325.

25. Hizukuri S. Relationship between the distribution of the chain length of amylopectin and crystalline structure of starch granules//Carbohydrate Research.- 1985.- 141-P. 295-306.

26. Imberty A., Buleon A., Tran V., Perez S. Recent advances in knowledge of starch stmcture.//Starch/Starke.- 1991.- 43- P. 375-384.

27. Waigh T.A., Kato K.L., Donald A.M., Gidley M.J., Clarke C.J., Riekel C. Side-chain liquid-crystalline model for starch//Starch/Starke.- 2000.- 52.- P. 450460.

28. Waigh T.A., Donald A.M., Heidelbach F., Riekel C., Gidley M.J. Analysis of the native structure of starch granules with small angle X-ray microfocus scattering/VBiopolymers. 1999.- 49.-P. 91-105.

29. Daniels D.R., Donald A.M. An Improved Model for Analyzing the Small Angle X-Ray Scattering of Starch Granules//Biopolymers.- 2003.- 69- P. 165— 175.

30. Fergason V. High Amylose and Waxy Corns In: Specialty Corns. Boca Raton, CRC Press.- 1994.- P. 63-84.

31. Gemat Ch., Radosta S., Anger H., Damaschun G. Crystalline parts of three different conformations detected in native and enzymatically degraded starches//Starch/Starke.- 1993.- 45- P. 309-314.

32. Jenkins P.J., Donald A.M. The influence of amylose on starch granule structure //International Journal of Biological Macromolecules.- 1995.- 17 P. 315-321.

33. Hedley C.L., Bogracheva T.Y., Wang T.L. A genetic approach to studying the morphology, structure and function of starch granules using pea as a model // Starch/Starke. 2002. - 54 - P. 235-242.

34. Regina A., Bird A., Topping D., Bowden S., Freeman J., Barsby Т., Kosar-Hashemi В., Li Z., Rahman S., Morell M. High-amylose wheat generated by RNA-interference improves indices of large-bowel health in rat //PNAS.- 2006 103- P. 3546-3551.

35. Smith A.M. The biosynthesis of starch granules/ZBiomacromolecules.- 2001- 2 -P. 335-341.

36. Smith A.M., Denyer K., Martin C. The synthesis of the starch granule//Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology.- 1997.- 48- P. 6787.

37. Ghosh H.P., Preiss J. Adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase: a regulatory enzyme in the biosynthesis of starch in spinach leaf chloroplasts. //Journal of Biological Chemistry.- 1966.- 241-P. 4491-4504.

38. Sikka V.K., Choi S.B., Kavakli I.H., Sakulsingharoj C., Gupta S., Ito H., Okita T.W. Subcellar compartimentation and allosteric regulation of the rice endosperm ADP glucose pyrophosphorylase//Plant Science.- 2001.- 161- P. 461^468.

39. Tetlow I.J., Morell M. K., Emes M.J. Recent developments in understanding the regulation of starch metabolism in higher plants//Journal of Experimental Botany.- 2004.- 55- P. 2131-2145.

40. Kossmann J., Lloyd J. Understanding and influencing starch biochemistry //Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology.- 2000.- 35- P. 141— 196.

41. Smith A.M., Zeeman S.C., Denyer K. The synthesis of amylose. In: Proceedings of Starch 2000. Starch. Advances in structure and function; Barsby T. L., Donald A. M., Frazier P. J. (Eds.); Cambridge: The Royal Society of Chemistry.- 2001. P. 150-163.

42. Commuri P.D., Keeling P.L. Chain-length specificities of maize starch synthase I enzyme: studies of glucan affinity and catalytic properties//The Plant Journal.- 2001.- 25- P. 475-486.

43. Imparl-Radosevich J.M., Gameon J.R., McKean A., Wetterberg D., Keeling P., Guan H. Understanding catalytic properties an functions of maize starch synthase isozymes//Joumal of Applied Glycoscience.- 2003.- 50- P. 177-182.

44. Nakamura Y. Towards a better understanding of the metabolic system for amylopectin biosynthesis in plants: Rice endosperm as a model tissue//Plant and Cell Physiology.- 2002.- 43 P. 718-725.

45. Guan H.P., Preiss J. Differentiation of the properties of the branching isozymes from maize (Zea mays)//Plant Physiology.- 1993.- 102- P. 1269-1273.

46. Rydberg U., Andersson L., Andersson R., Aman P., Larsson H. Comparison of starch branching enzyme I and II from potato/ZEuropean Journal of Biochemistry.- 2001.- 268 P. 6140-6145.

47. Vikso-Nielsen A., Blennow A., Jorgensen K., Kristensen К. H., Jensen A. Moller B. L. Structural, Physicochemical, and Pasting Properties of Starches from Potato Plants with Repressed rl-Gene//Biomacromolecules.- 2001. 2- P. 836-843.

48. Denyer K., Clarke В., Hylton C., Tatge H., Smith A.M. The elongation of amylose and amylopectin chains in isolated starch granules//The Plant Journal.-1996.- 10- P. 1135-1143.

49. Denyer К., Johnson P., Zeeman S., Smith A.M. The control of amylose synthesi s// Journal of Plant Physiology. 2001.- 158 - P. 479-487.

50. Graybosch R.A. Waxy wheats: Origin, properties and prospects. Trends in Food Science & Technology.- 1998.- 9- P. 135-142.

51. Nakamura Т., Yamamori M., Hidaka S., Hoshino Т. Decrease of waxy (Wx) protein in two common wheat cultivars with low amylose content//Plant Breeding.- 1993.- Ill-P. 99-105.

52. Nakamura Т., Yamamori M., Hirano H., Hidaka S. Identification of three Wx proteins in wheat (Triticum aestivum L.)//Biochemical Genetics.- 1993.- 31- P. 75-86.

53. Miura H., Wickramasinghe M.H.A., Subasinghe R.M., Araki E., Komae K. Development of hear-isogenic lines of wheat carrying different null Wx alleles and their starch properties/ZEuphytica.- 2002.- 123 P. 353-359.

54. Ball S., Guan H., James M., Myers A., Keeling P., Mouille G., Buleon A., Colonna P., Preiss J. From glycogen to amylopectin: a model for the biogenesis of the plant starch granule//Cell.- 1996.- 86- P. 349-352

55. Parker R., Ring S. G. Aspects of the Physical Chemistry of StarchZ/Journal of Cereal Science.- 2001.- 34 P. 1-17.

56. Danilenko A.N., Shtykova Ye.V., Yuryev V.P. Equilibrium and cooperative unit of the process of melting of native starches with different packing of the macromolecule chains in the crystallites//Biophysics (in Russian).- 1994.- 39-P. 427-432.

57. Hung P.V., Maeda Т., Morita N. Waxy and high-amylose wheat starches and flours characteristics, functionality and application//Trends in food science and technology.- 2006.- 17- P. 448-456.

58. Вундерлих Б. Физика макромолекул. Кристаллическая структура, морфология, дефекты; Москва, Мир. 1976. с. 411.

59. Yuryev V.P., Genkina N.K., Wasserman L.A. The influence of the growth temperature on structural and thermodynamic properties of starches//Zywnosc.-2002.- 9 (Supl.) P. 155-168.

60. Protserov V.A., Karpov V.G., Kozhevnikov G.O., Wasserman L.A., Yuryev V.P. Changes of thermodynamic and structural properties of potato starches (Udacha and Acrosil varieties during biosynthesis)//Starch/Starke.- 2000.- 52-P. 461-466.

61. Gibson T.S., Solali V.A., McCleary B.V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concovalin-A//Journal of Cereal Science.-1997.- 25 P. 111-119.

62. Shibanuma K., Takeda Y., Hizukuri S., Shibata S. Molecular structures of some wheat starches//Carbohydrate Polymers.- 1994.- 25 P. 111-116.

63. Kozlov S.S., Blennow A., Krivandin A.V., Yuryev V.P. Structural and thermodynamic properties of starches extracted from GBSS and GWD suppressed potato lines//International Journal of Biological Macromolecules.-2007.- 40- P. 449-460.

64. Hovenkamp-Hermelink J.H.M., De Vries J.N., Adamse P., Jacobsen E., Witholt В., Feenstra W.J. Rapid estimation of the amylose/amylopectin ratio of small amounts of tuber and leaf tissue of the potato/ZPotato Research.- 1988.31 P. 241-246.

65. Bay-Smidt A.M., Blennow A., Bojko M., Moller B. L. The effect of phosphate and amylopectin molecular size on peak viscosity of starch pastes//Annual Transactions of Nordic Rheology Society.- 1999.- 7 P. 31-38.

66. Рихтер M., Аугустат С., Ширбаум Ф. Избранные методы исследования крахмала; Пер. с нем. М.: Пищевая промышленность.- 1975.- с. 129-131.

67. Shiotsubo Т., Takahashi К. Differential Thermal Analysis of Potato Starch Gelatinization//Agricultural and Biological Chemistry. 1984.- 48(1) - P. 9-17,

68. Берштейн В. А., Егоров B.M. Дифференциальная сканирующая калориметрия в физикохимии полимеров; Ленинград, Химия.- 1990. с. 134-154.

69. Privalov P.L., Potekhin S.A., Scanning Microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins//Methods in Enzymology.- 1986.-131-P. 4-51.

70. Kiseleva V.I., Krivandin A.V., Fornal J., Blaszczak W., Jelinski Т., Yuryev V.P. Annealing of nornjial and mutant wheat starches. LM, SEM, DSC and SAXS studies//Carbohydrate Research.- 2005.- 340 P. 75-83.

71. Blennow A., Bay-Smidt A.M., Wischmann В., Olsen C.E., Muller B.L. The degree of starch phosphorylation is related to the chain length distribution ofthe neutral and the phosphorylated chains of amylopectin//Carbohydrate Research.- 1998.- 307- P. 45-54.

72. Franks A. Some developments and applications of microfocus X-ray diffraction techniques//British Journal of Applied Physics.- 1958.- 9 P. 349-352.

73. Васильев C.E., Донец Д.Е., Заневский Ю.В., Иванов А.Б., Смыков Л.П., Черемухина Г.А., Черненко С.П. Автоматизированный однокоординатный детектор рентгеновского излучение/Приборы и техника эксперимента.-1995.- 2.-с. 172-177.

74. Щедрин Б.М., Фейгин JI.A. Учет коллимационной поправки при рассеянии рентгеновых лучей под малыми углами. Случай конечных размеров щелей//Кристаллография. -1966.- 11-Р. 159-163.

75. Вайнштейн, Б.К. Дифракция рентгеновых лучей на цепных молекулах; Москва: Издательство АН СССР.- 1963.

76. Свергун Д.И., Фейгин JI.A. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние; Москва: Наука.- 1986.

77. Kilian H.G., Wenig W.A. Quantitative analysis of X-ray small-angle scattering of partially crystallized copolymer systems//Journal of Macromolecular Science, Part В.- 1974.- 9 P. 463 - 482

78. Pfannemuller В., Influence of chain length of short monodisperse amyloses on the formation of A- and B-type X-ray diffraction patterns//International Journal of Biological Macromolecules.- 1987. 9 - P. 105-108.

79. Miura H., Tanii S. Endosperm starch properties in several wheat cultivars preferred for Japanese noodles//Euphytica.- 1994.- 72- P. 171-175.

80. SS.Hayakawa К., Tanaka K., Nakamura Т., Endo S., Hoshino T. Quality characteristics of waxy hexaploid wheat (Triticwn aestivum): Properties of starch gelatinisation and retrogradation//Cereal Chemistry.- 1997.- 74- P. 576580.

81. Kohyama K., Matsuki J., Yasui Т., Sasaki T. A differential thermal analysis of the gelatinization and retrogradation of wheat starches with different amylopectin chain lengths//Carbohydrate Polymers.- 2004.- 58- P. 71-77.

82. Gidley M. J., personal communication, 1995, ссылка взята из работы 35.

83. Bertoft Е. Lintnerization of two amy lose-free starches of A- and B-crystalline types, respetively//Starch/Starke.- 2004.- 56 P. 167-180.

84. Gerard E., Colonna P., Buleon A., Planchot V. Order in maize mutant starches revealed by mild acid hydrolysis//Carbohydrate Polymers.- 2002.- 48 P. 131141.

85. Evers A.D., Juliano B.O. Varietal differences in surface ultrastructure of endosperm cells and starch granules of rice//Starch/Starke.- 1976.- 28 P. 160.

86. Maningat C.C., Juliano B.O., Properties of lintnerized starch granules from rice differing in an amylose content and gelatinization temperature//Starch/Starke.-1979.- 30, P. 5-11.

87. Mangalika W.H.A., Miura H., Yamauchi H., Noda Т. Properties of starches from near-isogenic wheat lines with different Wx protein deficiencies. Cereal Chemistry.- 2003. 80 - P. 662-666.

88. Biliaderis C.G., Grant D.R., Vose J.A. Structural characterization of legume starches. II. Studies on acidic-treated starches//Cereal Chemistry.- 1981 58 -P. 502-507.

89. Akuzawa S., Sawayama S., Kawabata A. Selectivity and thermal properties of various starches incorporating free fatty acids./ZBioscience, Biotechnology and Biochemistry.- 1995.- 59 P. 1605-1608.

90. Kuipers A. G. J., Jacobsen E., Visser R. G. F. Formation and Deposition of Amylose in the Potato Tuber Starch Granule Are Affected by the Reduction of Granule-Bound Starch Synthase Gene Expression//The Plant Cell.- 1994.- 6 P. 43-52.

91. Evans I.D., Haisman D.R. The effect of solutes on the gelatinization temperature range of potato starch//Starch/Starke.- 1982.- 34 P. 224-231.

92. Bogracheva T.Ya., Leontiev S.P., Genin Ya.V. The effects of solutes on the gelatinization of smooth pea starches//Carbohydrate Polymers.-1994.- 25- P. 227.

93. Matveev Y.I., Soest, J.J.G., Niemann C., Wasserman L. A., Protserov V. A., Ezernitskaja M., Yuryev V.P.//Carbohydrate Polymers.- 2001.- 44-P. 151-160.

94. Whittam M.A, Noel T.R., Ring S. Melting and glass/rubber transition of starch polysaccharides. In: Food Polymers, Gels and Colloids. E. Dickinson (Ed.), Royal Society of Chemistry, UK, 1991.- P. 277-278.

95. Karlsson M., Leeman A.M., Bjorck I.M.E., Eliasson A-C. Some physical and nutritional characteristics of genetically modified potatoes vaiying in amylose/amylopectin ratios//Food Chemistry.- 2007.- 100-P. 136-146.

96. Sanderson J.S., Daniels R.D., Donald A.M., Blennow A., Engelsen S.B. Exploratory SAXS and HPAEC-PAD studies of starches from diverse plant genotypes// Carbohydrate Polymers.-2006.- 64-P. 433-443.

97. Crist B. Small-angle x-ray scattering of semicrystalline polymers. Part I. Review of existing models//Journal of Polymer Science. Part B: Polymer physics.-1973.- 11-P. 635-661.

98. Gerasimov W. I., Tsvankin D. Ya., Высокомолекулярные соединения, Al.- 1969.- 1-P. 2652.

99. Cairns P., Bogracheva T.Y., Ring S.G., Hedley C.L., Morris V.J. Determination of the polymorphic composition of smooth pea starch// Carbohydrate Polymers.- 1997.- 32 P. 275-282.

100. Shamai K., Shimoni E., Bianco-Peled H. Small angle X-ray scattering of resistant starch type III//Biomacromolecules.- 2004.- 5 P. 219-223.

101. Hanashiro I., Abe J., Hizukuri S. A periodic distribution of the chain length of amylopectin as revealed by high-performance anion-exchange chromatography//Carbohydrate Research.- 1996.-283 P. 151-159.

102. Rindlav-Westling A., Stading M., Hermansson A. M., Gatenholm P.// Carbohydrate Polymers.-1998.- 36, P. 217.