Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный молекулярно-генетический анализ генов Wx у различных видов трибы пшеницевых

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный молекулярно-генетический анализ генов Wx у различных видов трибы пшеницевых"

На правах рукописи

Климушина Марина Вячеславовна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ \УХУ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫХ

Специальность 03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук *| [] [ 2013

Москва-2013

005534774

Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Карлов Геннадий Ильич

Официальные оппоненты:

Хавкин Эмиль Ефимович, доктор биологических наук, профессор, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией ДНК маркеров растений

Драгович Александра Юрьевна, доктор биологических наук, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, лаборатория генетики растений, главный научный сотрудник

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Защита состоится 23 октября 2013 г. в 14-30 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К А. Тимирязева по адресу 127550, г.Москва, ул.Прянишникова, д. 15, тел/факс (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан 23 сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета 'v Л.С.Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Мягкая пшеница (Triricum aestivum L.) - является ведущей зерновой культурой во многих странах мира, включая Россию. Основным компонентом зерновки пшеницы, определяющим большинство ее технологических свойств, является крахмал. Функциональные и физико-химические свойства крахмала, прежде всего, зависят от соотношения содержания амилозы и амилопектина. Пониженное или повышенное содержание амилозы в крахмале обусловлено различными аллельными вариантами генов Wx, кодирующих фермент Granule Bound Starch Synthase I (GBSSI). Данные гены локализованы у мягкой пшеницы на хромосомах: 7AS (Wx-Al), 4AL (Wx-Bl) и 7DS (Wx-Dl) (Chao et al., 1989). У мягкой пшеницы с одним или двумя нефункциональными генами Wx (так называемые нуль-аллели) синтезируется крахмал с пониженным содержанием амилозы (Yasui et al., 1996; Vrinten et al., 1999; Takeshi, 2006). Функциональные аллельные варианты генов Wx (Takeshi, 2006; Vanzetti et al., 2009; Guzmân et al., 2011) y мягкой пшеницы, как правило, не столь значительно, как нуль-аллели, изменяют содержание амилозы. В целом разнообразие аллельных вариантов генов Wx, выявленных у пшеницы по • всем трем генам, довольно низкое (Yamamori et al, 1994; Vanzetti et al., 2009). В связи с этим сейчас идет активный поиск и изучение различных генов Wx у дикорастущих сородичей пшеницы с целью их последующей интрогрессии в её геном (Monari et al.,2005; Yamamori et al., 2009; Huang X.Q et al., 2010; Guzmân et al., 2012; Alvarez and Guzmân, 2013). Кроме того, все более широкое распространение получает привлечение различных генов дикорастущих сородичей пшеницы для ее улучшения (Friebe et al., 1996; Давоян, 2006; Ji et al, 2012). Также немаловажное значение имеет изучение генов Wx у дикорастущих видов для понимания эволюции данных хозяйственно-ценных генов и видов в целом (Mason-Gamer et al., 1998; Shapter et al., 2005; Mahelka et al., 2011). Поэтому актуальным вопросом является получение нуклеотидных последовательностей генов дикорастущих злаков для их последующей молекулярно-генетической характеристики. Наконец, изучение генов Wx мягкой пшеницы и возможность идентификации их аллельных вариантов является важным этапом в селекции сортов с варьируемым, в зависимости от целей производства, содержанием амилозы без химической модификации крахмала.

Цель и задачи исследования. Цель работы - выполнить молекулярно-генетический анализ генов Wx у различных видов трибы пшеницевых.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить применимость существующих в настоящее время ДНК-маркеров на гены Wx пшеницы для скрининга коллекционного материала и селекции с помощью молекулярных маркеров (MAS-селекции).

2. Изучить аллельное разнообразие генов Wx у мягкой и твердой пшеницы отечественной селекции.

3. Дать молекулярную характеристику аллеля Wx-Ble мягкой пшеницы.

4. Исследовать аллельное состояния генов Wx среди аллоцитоплазматических гибридов пшеницы и оценить влияние типа цитоплазмы на формирование крахмальных гранул.

5. Клонировать и секвенировать нуклеотидные последовательности генов Wx у видов Thinopyrum intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum Pseudoroegneria stipifolia и Dasypyrum villosum.

6. Создать молекулярный маркер на гены Wx пырейного происхождения.

7. Изучить коллекции пшенично-пырейных гибридов на аллельное состояние генов Wx пырейного происхождения.

Научная новизна. Впервые проведена молекулярно-генетическая характеристика коллекций мягкой и твердой пшеницы сортов отечественной селекции по генам, отвечающим за синтез амилозы. На основе полученных результатов создан набор линий краснозерной мягкой пшеницы с различным аллельным составом генов Wx, который может быть использован как в изучении проявления данных генов, так и в качестве доноров в практической селекции. Выявлены недостатки ряда молекулярных маркеров, используемых для оценки мировых коллекций пшеницы. Секвенирован и охарактеризован аллель Wx-Ble мягкой пшеницы. Получены и охарактеризованы нуклеотидные последовательности генов Wx у видов Th. intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum Ps. stipifolia и D. villosum.

Практическая значимость работы. Результаты работы имеют важное теоретическое и практическое значение и могут быть использованы в селекции пшеницы. Разработаны рекомендации по использованию молекулярных маркеров для скрининга аллельного состояния генов Wx коллекций и MAS-селекции. На основе полученных нуклеотидных последовательностей дикорастущих видов разработан молекулярный маркер Wx-THl/HaeIII, позволяющий отличать гены Wx пырейного происхождения от генов Wx мягкой пшеницы. С помощью разработанного молекулярного маркера оценена коллекция пшенично-пырейных гибридов, которые могут служить селекционным мостиком для создания интрогрессивных форм пшеницы, несущих гены Wx пырея.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIX Международной научной конференции студентов,

аспирантов и молодых учёных Ломоносов-2011, секция «Биология» (Москва, 2011); XI Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии - 2011» (Москва, 2011); X съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров «Генетика и Биотехнология XXI века» (Минск, 2012); XII Международном симпозиуме по генетике пшеницы (IWGS) (Иокогама, Япония, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 5 из перечня рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 150 страницах машинописного текста и включают 51 рисунок, 25 таблиц. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список цитируемой . литературы включает 170 наименований, из них 155 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Материалом исследования служили 99 краснозерных сортов мягкой пшеницы и 22 сорта твердой пшеницы селекции КНИИСХ имени П.П. Лукьяненко, предоставленные академиком РАСХН Л.А. Беспаловой; 30 сортов и линий мягкой и твердой пшеницы, предоставленные проф. В.П. Нецветаевым (ГНУ БелНИИСХ); 30 образцов аллоцитоплазматических гибридов пшеницы, созданных проф. О.Г. Семеновым (РУДН); 5 дикорастущих видов злаковых (Th. intermedium (PI 383573), Th. ponticum (1158A/19), Th. bessarabicum (W6 21890), D. villosum (W6 21717) и Ps. stipifolia (W6 21759)); 100 образцов пшенично-пырейных гибридов, предоставлены В.П. Упелниеком, В.И. Беловым и Л.И. Глуховой (Отдел отдаленной гибридизации ГБС РАН им. Н.В. Цицина); набор дополненных линий по хромосомам Th. elongatum созданных проф. J. Dvorak (Университет Калифорнии, Дэвис, США).

Выделение ДНК. ДНК выделяли согласно методике Bernatsky & Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.

ПЦР-анализ. Оценку коллекций на аллельное состояние генов Wx осуществляли с помощью следующих праймеров: AFC/AR2 (Nakamura et al., 2002), Wx-Alb-F-MH/Wx-A 1 b-R-MH (Vanzetti et al., 2009), SunlF/SunlR (Sharoflou and Sharp, 1999), BDFL/BRD (Nakamura et al., 2002), 4F/4R (McLauchlan et al., 2001), BDFL/BRC1/BRC2/BFC (Saito et al., 2009), Wx-B1L/Wx-B1R (Vanzetti et al., 2009), Wx-DI-2F/Wx-Dl-2R (Shariflou et al., 2001), Wx-D 1-1 F/Wx-D 1 -1R (Vrinten et al., 1999), BDFL/DRSL (Nakamura et al., 2002).

Клонирование нуклеотидных последовательностей. Лигирование амплифицированной ДНК осуществлялось с помощью системы pGEM®-T Easy

Vector. Трансформацию осуществляли в штамм E.coli DH10B методом электропорации или теплового шока. Отбор клонов проводили с помощью бело-голубой селекции и праймеров М13.

Секвенирование. Для секвенирования нуклеотидных

последовательностей аллеля Wx-Ble и генов Wx дикорастущих сородичей пшеницы использовали праймеры WxVTIF, WxVTR, WxBAF, WxBAR, WxF3 и WxVTIR (Monari et al., 2005). На дикорастущих видах использовали так же праймеры, разработанные Huang и Brulé-Babel (2010) и Guzmán и Alvarez (2012). Секвенирование ПЦР-продуктов осуществляли на секвенаторе ABI 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) с помощью набора Big Dye v 3.1 в соответствии с рекомендациями производителя.

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения GenDoc (Ver. 2.6.002, copyright © by К. Nicholas); Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 5.2.; Lasergene ver.7.1, Comprehensive Software for DNA & Protein Sequence Analysis, «ClustalW2 Phylogeny» сервиса. Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытой . базе генетических данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Оценка коллекции сортов мягкой и твердой пшеницы на аллельное состояние генов Wx В связи с потребностью пищевой и непищевой промышленности в сортах, имеющих определенные технологические показатели крахмала, зависящие напрямую от содержания амилозы, был изучен полиморфизм по генам, контролирующим синтез амилозы, у сортов мягкой и твердой пшеницы на примере коллекций КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко и ГНУ БелНИИСХ.

1.1 Применимость ДНК-маркеров для идентификации аллелей генов Wx для скрининга коллекций и MAS-селекции

Тестирование ряда маркеров показало, что не все из них одинаково эффективны для задач селекции и использования в первичном скрининге коллекций.

1.1.1 Ген Wx-A 1. Vanzetti с соавт. (2009), Nakamura с соавт. (2002) и Sharoflou с соавт. (1999) были разработаны молекулярные маркеры, позволяющие отличать нуль-аллель гена Wx-A J от нормального (дикого) типа аллеля. Апробация и оптимизация условий ПЦР показала, что для использования в MAS-селекции и скрининге коллекции наиболее эффективным является молекулярный маркер, предложенный Nakamura с соавт. (2002). А для верификации полученных результатов при общем скрининге коллекции нами

рекомендуется дополнительно использовать маркер, разработанный УапгеШ с соавт. (2009).

1.1.2 Ген 1Ух-В1. По гену 1¥х-В1 было проанализировано четыре различных молекулярных маркера (рис. 1).

Wx-BIL и Wx-B1R (Vanzetti et. al, 2009)

BDFL и BRC1 (Salto et. al, 2009)

4F и 4R (McLauchlan et. ai„ 2001)

Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами: а - Wx-BIL и Wx-B1R (Vanzetti et al., 2009); б - BDFL и BRC1 (Saito et al., 2009); e - BDFL и BRD (Nakamura et al., 2002); г - 4F и 4R (McLauchlan et al., 2001)./ - образец Hokkai 252 (Wx-Ala; Wx-Blb; Wx-Dla); 2 - сорт Безостая 1 (Wx-Ala; WxBla; Wx-Dla); 3 - сорт Коротышка (Wx-Ala; Wx-Ble; Wx-Dla). Стрелкой отмечен бэнд. амплифицирующийся у дикого типа аллеля Wx-Bla

Vanzetti с соавт. (2009) было показано, что с помощью молекулярного маркера, разработанного McLauchlan с соавт. (2001), невозможно различить аллель Wx-Ble и нуль-аллель {Wx-Blb). После апробации и тестирования всех приведенных выше маркеров нами на сорте мягкой пшеницы Коротышка продемонстрировано, что это относится и к другому широко применяемому молекулярному маркеру, разработанному Nakamura с соавт. (2002). В обоих случаях у образцов, несущих Wx-Ble или Wx-Blb, наблюдается схожая амплификация, не позволяющая различить данные аллели между собой. При этом данные молекулярные маркеры наиболее часто использовались для оценки мировых коллекций мягкой пшеницы, что могло привести к неточным данным по распространению нуль-аллеля гена Wx-Bl. Например, среди сортов индийской селекции с помощью маркера Nakamura et al. (2002) было показано, что 60% сортов являются носителями этого аллеля (Ram and Sharma, 2013).

Маркер, разработанный Saito с соавт. (2009) позволяет идентифицировать нуль-аллель Wx-Blb, но отличить аллели Wx-Ble и Wx-Bla в агарозном геле с его помощью затруднительно (рис. 1, б).

При использовании маркера, разработанного Vanzetti с соавт. (2009), в случае нуль-аллеля амплификация отсутствует, что может приводить к ошибкам при некачественном выделении ДНК и ингибировании ПЦР в отдельных образцах.

Таким образом, не удалось выявить один наиболее подходящий маркер, как для МАБ-селекции, так и для оценки аллельного состояния (скрининга) генов РУх среди коллекции мягкой пшеницы. Нами была предложена схема использования нескольких комбинаций маркеров для различных случаев. В качестве маркера, используемого при первичном скрининге коллекции на аллельное состояние генов ¡Ух, мы рекомендуем молекулярные маркеры МсЬаисЫап с соавт. (2001) или Ыакагпига с соавт. (2002). Далее, на образцах, имеющих амплификацию, отличную от амплификации на аллелях дикого типа (1¥х-В1а), следует использовать молекулярные маркеры, разработанные Бако с соавт. (2009) и УалгеШ с соавт. (2009). При проведении МА8-селекции на поколениях, полученных от образцов с уже идентифицированными аллеями генов Шх, в случае селекции на нуль-аллель УУх-В1Ь мы рекомендуем использовать систему кодоминатных маркеров, разработанную 8ако с соавт. (2009). Данная система маркеров, в отличие от всех остальных, позволяет произвести четкую идентификацию гетерозиготных растений при наличии в их геноме \Vx-Bla и \Vx-Blb аллелей.

1.1.3 Ген \Vx-D 1. ЗИаНАои с соавт. (2001), Упгкеп с соавт. (1999) и Ыакашига с соавт. (2002) разработали молекулярные маркеры, выявляющие нуль-аллель по гену 1¥х-01. После апробации данных маркеров на нашем материале было обнаружено, что только молекулярный маркер, разработанный БЬапйои с соавт. (2001), дает четкую и воспроизводимую амплификацию на всех образцах. Во второй и третьей системах амплификация на Жх-И1а шла нестабильно.

1.2 Распределение аллелей генов \Ух в коллекциях мягкой и твердой пшеницы

Скрининг коллекций пшеницы КНИИСХ имени П.П. Лукьяненко и ГНУ БелНИИСХ на аллельное состояние гена 1¥х-А1 проводили с помощью молекулярного маркера, разработанного Иакашига с соавт. (2002). Для верификации полученных результатов на образцах, у которых продукты амплификации отличались от дикого типа, мы использовали молекулярный маркер, модифицированный УапгеШ с соавт. (2009). Выявлено, что из 129 проанализированных сортов мягкой пшеницы только два, Старшина и Сила, имеют нуль-аллель по данному гену. Все остальные сорта мягкой и твердой пшеницы несли аллель дикого типа гена \Vx-Al.

С использованием четырех различных систем молекулярных маркеров, выявляющих аллели гена Wx-Bl, было установлено, что ■ 3 сорта мягтсой пшеницы - Коротышка, Нота и Ласточка - несут в своем геноме аллель Жх-В1е. Сортов, несущих нуль-аллель в локусе 1¥х-В1, выявлено не было. Все сорта твердой пшеницы имели аллель только дикого типа.

С помощью молекулярного маркера, разработанного вЬапАои с соавт. (2001), было показано, что все сорта мягкой пшеницы исследуемой коллекции несли аллель \Vx-Dla.

Полученные результаты согласуются с работами, проводимыми на европейских коллекциях, также имеющих низкую вариативность по генам, отвечающим за синтез амилозы (Магсог-1^о1 еГ а1, 2000). Например, в сортах украинской селекции нуль-аллелей обнаружено не было (Петрова, 2007), в сортах селекции ТатНИИСХ 92,8 % сортов несли аллели дикого типа (Абдулина с соавт., 2012). В то же время в коллекциях азиатских и австралийских сортов обнаруживалось до двадцати процентов сортов, несущих нуль-аллели по генам \Vx-A 1 и \Vx-Bl (Ыакатига е/ а/., 1992; Уататоп еГ а/., 1994). Относительно высокую частоту встречаемости нуль-аллелей в азиатских коллекциях можно объяснить тем, что пониженное содержание амилозы оказывает выраженное положительное влияние на качество лапши удон, основного традиционного продукта. На основании полученных нами данных совместно с отделом селекции и семеноводства пшеницы и тритикале КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко созданы линии со следующими аллельными вариантами: 1¥х-А 1 Ь/\Ух-В1 Ы\Vx-DlЪ; \Ух-А1Ъ/\Ух-В1е11Ух-01Ъ; Жх-А1ЬЛ¥х-В1ЫПгх-01а; Шх-А1Ы\Ух-В1е /\Vx-Dla. Они могут быть использованы как для изучения проявления генов УУх у мягкой пшеницы в различных условиях и различном генетическом окружении, так и в качестве доноров аллелей генов ]¥х.

2 Молекулярная характеристика аллели \Vx-Ble мягкой пшеницы

С помощью молекулярных маркеров и одномерного электрофореза белков было показано, что сорт мягкой пшеницы Коротышка является носителем аллеля Жх-В1е. Известно, что различные типы аллелей генов 1Ух по-разному экспрессируются и влияют на содержание амилозы, поэтому изучение функционального аллеля Цгх-В1е представляет теоретический и практический интерес.

Для секвенирования полноразмерной последовательности аллеля Wx•Ble ген был условно поделен на три части и с помощью трех пар праймеров, разработанных Мопап с соавт. (2005), мы амплифицировали, клонировали и секвенировали каждую часть по отдельности. Общая длина секвенированной последовательности \Vx-Ble составила 2725 пн, она включает 11 экзонов и 10 интронов. Размер и структура полученной последовательности является типичной и консервативной для других генов \Ух пшеницы.

Сравнение полученной последовательности (ОепВапк КР305522) с последовательностью аллеля \Vx-Bla (ОепВапк АВ019623) показало, что размеры экзонов между №х-В1а и }¥х-В1е совпадают за исключением первого экзона (рис. 2).

Рисунок 2. Выравнивание ДНК последовательностей аллелей Wx-Ble -первая строка, Wx-Bla (EU719610.1) - вторая строка, мРНК аллеля Wx-Bl (EU719610.1) - третья строка. Стрелка указывает на границу между сигнальным пептидом и зрелым белком. Числами обозначены номера экзонов

В экзонной части Wx-Ble была выявлена инсерция-делеция по участку, который соответствует нуклеотидам 160-163 Wx-Bla (что соответствует глутамину-54); показано 43 однонуклеотидных замены, из которых 27 (62,8%) являются транзициями, а 16 (59,3%) - трансверсиями. При этом 12 из них привели к замене одних аминокислот на другие, синонимичные им.

Интронная часть Wx-Ble содержала следующие изменения по сравнению с аллелем Wx-Bla: первый интрон имел четыре однонуклеотидные замены и три инсерции-делеции, второй - семь и две, третий - двадцать и шесть, четвёртый - пятнадцать и восемь, пятый - десять и одну, шестой - три и одну, седьмой - семь и одну соответственно. В целом в интронной области нами было выявлено 85 однонуклеотидных замен и 29 инсерций-делеций.

Основываясь на результатах BLASTN анализа и построенного филогенетического дерева, можно предположить, что аллель Wx-Ble мог быть привнесен в мягкую пшеницу из Т. aestivum ssp. speit а или Т. turgidum ssp. durum в результате спонтанной или искусственной гибридизации.

3 Изучение генов Wx аллоцитоплазматических гибридов пшеницы

В настоящее время проф. О.Г. Семеновым создана коллекция самофертильных линий аллоцитоплазматической пшеницы Т. aestivum L., сочетающих ядерный геном различных сортов яровой и озимой пшеницы с цитоплазмой от Seeale cereale, Aegilops ovata, Т. timopheevii. Вследствие того, что крахмальные гранулы синтезируются в амилопластах, возможно, что на их формирование оказывают влияние пластидные гены.

Первоначально необходимо было выявить аллельные варианты генов Wx у АТТПГ. Для этого использовали несколько молекулярных маркеров,

тестированных нами ранее. Было обнаружено, что 17 образцов несут в своем геноме аллель 1Ух-А1а - аллель дикого типа. У 11 образцов отсутствовала амплификация фрагмента, свойственного гену ]¥х-А1. Внутренний полиморфизм по амплификации данного маркера показали 2 образца.

Для детекции аллельных вариантов гена Шх-В1 использовали четыре различных молекулярных маркера (рис. 3).

а б

41)7 im 455 гш 425 ми И 1 «И» тт **» "":;, i ■ ** /•""VES» "» 500 in «Jni ЯШ, —Щ шш - 778 им «smios пи

/ 2 3 4 5 6 7 М М 1 2 3 4 5 6 7

а 400 III 600 пи г

227 ш — - •» «¡5 •"» I« ... да» 300 IUI 2001Ш ........ 400 пи

1 2 J 4 5 6 ? М М / 2 3 4 5 6 7

Рисунок 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами: а - BDFL и BRD; б -BDFL, BRC1, BRC2, BFC; в - 4F и 4R; г - Wx-B1L и Wx-B1R. 1 - образец 14/09; 2 - образец 12/09; 3 - образец 17/08; 4 - Т. timopheevii; 5 - образец 12/10с; 6 - сорт Сила (Wx-Alb, Wx-Bla, Wx-Dla); 7 - Hokkai 252 (Wx-Ala, Wx-Blb, Wx-Dla)-, M - маркер длины фрагментов ДНК. Стрелками отмечены ампликоны генов Wx Т. timopheevii

Было выявлено, что 5 гибридов имеют нуль-аллели по гену Wx-Bl. Нуль-аллель по генам Wx встречается редко, а в случае получения аллоцитоплазматических гибридов в ходе насыщающих беккроссов возможны различные интрогрессии в ядерный материал, что может приводить к получению ложноположительных результатов при проведении ПЦР. В связи с этим нами был секвенирован продукт амплификации с праймеров BFC/BRC2 у образца 16/09, показавшего наличие нуль-аплеля по Wx-Bl. В результате полученная нами нуклеотидная последовательность полностью совпала с нуклеотидной последовательностью, фланкирующей делецию гена Wx-Bl (АВ426607.1). Таким образом, у пяти образцов АЦПГ присутствует истинный нуль-аллель Wx-Bl b.

С помощью праймеров BDFL/BRD и 4F/4R было выявлено, что у 11 линий отсутствует амплификация с гена Wx-Al мягкой пшеницы и они имеют фрагмент, идентичный по размеру ампликону с Т. timopheevii (рис. 3 а, в). Ген Wx-Al у Т. timopheevii (Wx-Ti), так же как и у мягкой пшеницы, локализован в 7А хромосоме. Мы предполагаем, что при получении данных линий произошла интрогрессия гена Wx-Ti в геном мягкой пшеницы. В исследованиях Трубачеевой с соавт. (2008) методом SSR-анализа показано предпочтительное

замещение хромосомы 7 на гомеологичные хромосомы ячменя Н. marinum subsp. gussoneanum у самофертильных аллоплазматических эуплоидных линий (2n = 40w + 2b). Таким образом, имеется тенденция замещения 7 гомеологичной группы при формировании самофертильных АЦПГ.

В результате проведенного анализа на аллельное состояние гена Wx- D1 в изучаемой коллекции АЦПГ не было выявлено нуль-аллелей.

Так как фракционный состав крахмальных гранул оказывает влияние на технологические свойства зерна, у образцов АЦПГ были проанализированы размеры и площадь гранул на микрофотографиях срезов зерновок, полученных А.С. Беэром на кафедре высших растений МГУ с помощью электронного микроскопа. В общей сложности было проанализировано 13 образцов с тремя типами цитоплазмы. Какой-либо статистически значимой связи между типом цитоплазмы образцов и размером крахмальных гранул выявлено не было. Таким образом, тип цитоплазмы не оказывает существенного влияния на размер формируемых крахмальных гранул. Также не было обнаружено значимых различий между крахмальными гранулами у образцов с разным типом аллелей.

4 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Wx некоторых представителей родов Thinopyrum, Dasypyrum и Pseudoroegneria

Как и в случае секвенирования аллеля Wx-Ble, получаемые нами нуклеотидные последовательности дикорастущих видов относились к трем различным частям генов Wx.

4.1 Часть I: экзоны 1-3, интроны 1-2

Для части I генов Wx были получены следующие нуклеотидные последовательности: 77г. bessarabicum — 617 пн; 77г. intermedium — 607 и 618 пн/ 77г. ponticum - 618 пн, Ps. stipifolia — 618 и 615 пн. Во всех полученных нами последовательностях не было выявлено стоп-кодонов и сдвига рамки считывания в экзонах. Интроны имели типичные начало и конец (GT/AG).

В целом нуклеотидные последовательности в области экзонов были консервативны и отличались высокой степенью сходства с последовательностями пшеницы. Имеющиеся однонуклеотидные замены, как правило, были синонимичными. Только у одной последовательности, полученной на Ps. stipifolia, была вьмвлена делеция триплета GGC. Интроны, как и следовало ожидать, были значительно вариативнее экзонов: выявлены как однонуклеотидные замены, так и делеции (от 1 до 7 пн), а так же ряд инсерций относительно генов мягкой пшеницы.

При сравнении потенциальных аминокислотных последовательностей, полученных в нашей работе, с известными последовательностями пшеницы

была выявлена вариативность, как в области сигнального пептида, так и в области гликозилтрансферазной группы 5, включающей в себя первые четыре экзона. В области высококонсервативного домена злаковых и предполагаемого активного центра синтеза амилозы замен не было (рис. 4).

Th.

SPseudoroe

6Pseudoroe

7WX-1-A

8WX-1-B

ЭИх-l-E

ITh.i 2Th.: 3?h. 4?h. 5Pseudorce 6Pseudoroe 7KX-1-A SWx-l-B SWx-l-D

№3 ^■l.VTSC I.AT SGTVlI ITC Щ 4 ЬГй! im ™ gv V* • 1 ЕЁ SASAA»: SPrl SR| F.Gf i]

^ til LAT LAT LAT SGTVlI SGTVlI SGTVlI ITC ITD ITD GFC| GFCl „J LRl b ft Vi crp! sfkI srk! Ш Bgs ! p cLsij;

№ ijj jTvj ITD GF cj ¿¡¡! 1« pftifi GASAAiljc 1 HI

LVTSG HU PFRRaGFCgfiRP ПРА1 - BSE , LGMRC GA3AAPkC EH2 L SRKa! leg Rr

IVFVGAEMAPW. IVFVGAEMAPW; IVFVGAEMAPW;

IVFVGAEMAPW;_

IVFVGAEMAPWS^H JVFVGAEMAFWS^H IVFVGAEMAPW. IVFVGAEMAPWI JVFVGAEMAPW^ MMLVFVGAEMAPW!

150 ISO ISO 150 150 145 154 153 153

¡SEIKVaCaYErVRYFHCYKRG

;TGGLGCVLGGLPpAMAANGHRVMV6SPRyECYkDA'

Рисунок 4. Выравнивание потенциальных аминокислотных последовательностей, полученных в нашей работе, с аминокислотными последовательностями мягкой пшеницы, экспрессируемых генами Wx. Красными стрелками отмечена область сигнального пептида. Желтая заливка - высококонсервативная область злаковых (Baldwin, 2001). Красная заливка - предполагаемый активный центр синтеза амилозы (Mason-Gammer et ей., 1998; Denyer et al., 2001)

4.2 Часть II: экзоны 3-6, интроны 3-5

Для части II генов Wx секвенированы следующие нуклеотидные последовательности: Th. bessarabicum - 949 и 959 пн/ Th. intermedium — 937, 935 и 937 пн; Th. ponticum - 946, 938 и 942 пн, Ps. stipifolia - 937, 937 и 937 пн, D. villosum - 973 пн.

У восьми из двенадцати последовательностей была выявлена делеция в 14 пн нуклеотидов в начале пятого экзона, приводящая к сдвигу рамки считывания, а соответственно получению нефункционального белка. Вследствие этого данные последовательности были отнесены нами к псевдогенам и анализ потенциальных аминокислотных последовательностей не проводился.

4.3 Часть III: экзоны 6-11, интроны 6-10

Для части III генов Wx были получены следующие нуклеотидные последовательности: Th. bessarabicum - 1152 пн; Th. intermedium - 1152 пн; Th. ponticum - 1160, 1181, 1163, 1167 и 1173 пн, Ps. stipifolia - 1177 и 1153 пн, D. villosum — 1157 пн.

Во всех последовательностях не было выявлено стоп-кодонов и сдвига рамки считывания в экзонах. Интроны имели типичные начало и конец. По данному участку генов ранее уже были секвенированы частичные

последовательности (Mason-Gamer et al., 1998; Mahelka et al., 2011). В области перекрытия полученные нами последовательности совпали с ранее секвенированными у Th. bessarabicum и D. villosum (с несколькими заменами). Секвенированная нами последовательность у Th. intermedium была высокогомологична последовательности Th. bessarabicum и таким образом может быть отнесена к субгеному J. В то же время полученные последовательности Ps. stipifolia отличались от секвенированных в других работах.

При выравнивании потенциальных аминокислотных последовательностей были выявлены ряд замен по сравнению с генами пшеницы (рис.5).

80 * 100

Рисунок 5. Выравнивание потенциальных АК последовательностей, полученных в нашей работе, с последовательностями генов мягкой пшеницы. Синяя стрелка — область гликозилтрансферазной группы 1. Желтая заливка - высококонсервативный С-конец (Dry et al, 1992). Зеленая заливка - мотив II (Baldwin, 2001). Красная заливка - мотив Ill/домен III потенциальный гликозилтрансферазный сайт (Baldwin, 2001; Denyer, 2001)

Следует отметить, что у одной последовательности, полученной из Ps. stipifolia, и одной из Th. ponticum присутствовали замены и в такой высококонсервативной для всех злаков области, как С-конец гликозилтрансферазной группы 1. Данные замены могут привести либо к синтезу нефункционального фермента, либо к существенному изменению его свойств (Shapter et al., 2005).

5 Филогенетический анализ

Филогенетический анализ проводился по каждой части гена отдельно. В настоящее время для первых трех экзонов получены последовательности лишь у относительно небольшого числа видов. Филогенетический анализ показал, что анализируемые последовательности формируют четыре клады, при этом 4 последовательности (1 Ps.stipifolia, 277г. intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum) кластеризуются вместе, что вполне

ожидаемо с учётом малого количества последовательностей, имеющихся в базе данных по данному региону. А субгеномы видов Ps.stipifolia (St) и Th. bessarabicum (J), либо близки друг к другу, либо являются донорами полиплоидных видов (Th. intermedium (JJsSt) и Th. ponticum (JJJJsJs)). Последовательность IPs.stipifolia образует вместе с Hordeum bogdanii отдельный кластер, самый отдалённый от остальных видов. Последовательность \Th. intermedium близка к Elymus scaber и попадает в кластер с последовательностями, принадлежащими видам пшеницы и эгилопса.

Для филогенетического анализа по второй части гена мы использовали участки полноразмерных последовательностей генов Wx, имеющихся в базе данных. Последовательности 3Th. ponticum, ITh. bessarabicum и 2Th. bessarabicum попали в одну кладу с T.aestivum Wx-Al и Е. scaber, что позволяет отнести полученную нами последовательность 377?. ponticum к J субгеному. Последовательность D. villosum кластеризовалась отдельно, что в целом соответствует модели происхождения субгенома V, который несет данный вид. Отдельным кластером, как и можно было ожидать, выделились последовательности с делецией в начале пятого экзона, отнесённые нами к псевдогенам (рис. 6).

По третьей части гена (экзоны 6-11, интроны 6-10) в филогенетическом анализе использовали порядка 100 известных последовательностей видов трибы пшеницевых. Последовательность, полученная нами для Th. intermedium была очень близка к последовательностям Th. bessarabicum, и в связи с этим была отнесена нами с субгеному J. Так же близко с ними кластеризовались последовательности, полученные нами для Th. ponticum. При этом последовательности для данного вида делились на две клады, одна из которых была ближе к последовательностям Th. bessarabicum и Secale sereale, а вторая -к последовательностям, полученным из субгенома D пшеницевых. Последовательность D. villosum попадала в отдельную кладу с частью последовательностей Th. intermedium, полученных в работе, посвященной изучению происхождения субгеномов Th. intermedium (Mahelka et а!., 2011). Особое внимание обращают на себя последовательности, полученные нами на Ps.stipifolia. Одна из них попадает в кластер с другими видами псевдорогнерии, несущими субгеном St, а вторая последовательность попадает в кластер с последовательностями, которые относились к видам S. sereale, Th. ponticum, Th. bessarabicum и Th. intermedium (lc и Зе), последние авторы интерпретировали, как относящиеся к субгеному J (Mahelka et al, 2011). Подобная картина так же встречается в построенном нами филогенетическом дереве для последовательностей D. villosum (Haynaldia villosumj AY556480.1 и AF079274.1. Два известных для него сиквенса кластеризуются с разными

видами, несущими различные субгеномы, а при этом сам вид является диплоидным с субгеномом V.

щ—

I JThmepyfum рдаЧюит

IThinopyrum ЬмыгаЫсит EU719603.il Tmicum aestmjm Wx-A1

-EF600W3.1J С1уяч1» sea b«r

I mnopyrum bessarabwum

i FJ431376.H Stcefe Cfftt*»

AF110373.il Trilrcvm monocoecum JN8S7937.1| Trittcum urartu

EU719$10.1 (Tnticum MSbvum Wx &1 — Д6Г3013 1!A»grf<»j» ff**OHJw

est

- ¿X6790U. If Aegdope tpAoUt*

- JX679012 \\ Atgfop* sewsii

- XCE79D09.1I Aegilop* nwltjrafii

-JXS79Q10 m«kgr»&

—.—JX£79008 t! A*flilop* emo*lhital«

— JXS2S135.11 Aeplop» сотом AF110375.1| Aagilopc Uusche »1 EU719612.1I Tiiticom MStrwm Wx-01 —— В Otsypyuun viSosum

103 j GU5S3883.1I Kortfcwn vulgar« «ubsp. wi»ga/i

.....I ¿8088761.11 Нояйит vulgar sut»p yuV}« •

---А81Ш57.1! Hoftfwm tmlbosum

—AB1543S8.1! Hordeum bogaanti

21— В ITftK

1-■ 2

%

ZTTsinopyrom intwmwtmm

■ 1ТЫрорутот mtefrnadkim

В 1PseiKfcruegr.»r« sl'pfrAa 2P*s«10rt*gMria I'ipAjlj — В 3Thinopynim inumwdram г ■ 2TNnopynim pontkum 5Э*— ■ 3Ps«Hjarof5neria stipiWm

Рисунок 6. Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия, для последовательностей экзоны 3-6, интроны 3-5. Квадратом отмечены . полученные в данной работе последовательности

В целом филогенетический анализ показал, что последовательности гена Wx D. villosum наиболее отдалены от всех остальных полученных последовательностей. Ряд последовательностей, полученных у Ps. stipifolia, кластеризовались с последовательностями Th. bessarabicum (а также Th. intermedium и Th. ponticum), что может свидетельствовать в пользу возникновения рекомбинантного субгенома Js еще у одного из предковых видов.

6 Разработка молекулярного маркера, позволяющего отличать гены Wx пырейного происхождения от генов Wx мягкой пшеницы

Моделирование возможного поведения получаемых у данных видов полипептидов и их потенциального влияния на формирования крахмала и • синтез амилозы с помощью только теоретических предпосылок представляется не совсем надежным. Хорошим объектом для предварительного изучения

влияния генов дикорастущих сородичей на признаки мягкой пшеницы являются пшенично-пырейные гибриды (ППГ). ППГ сочетают в своем геноме субгеномы мягкой пшеницы и пырея.

На основе полученных нуклеотидных последовательностей, нами были разработаны праймеры, позволяющие отличить гены Wx Th. ponticum и Th. intermedium от генов Wx мягкой пшеницы - WX-TH1F/WX-TH1R. Праймеры были подобраны таким образом, чтобы амплификация шла только с пырейного генома, а с генома пшеницы отсутствовала. При этом продукты амплификации у различных пыреев можно было отличить (рис. 7).

Рисунок 7. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами WXTH1F и WXTH1R: 1 - ППГ (ЗП26); 2 - ППГ (Ml69); 3 - Ps. stipifolia\ 4 - Th. bessarabicum; 5 - Th. intermedium; 6 - Th. intermedium; 7 -T. aestivum

С помощью набора дополненных линий по хромосомам Th. elongatum (субгеном J) с использованием маркера WX-TH1 была показана локализация гена Wx на седьмой гомеологичной группе.

С помощью данного молекулярного маркера была оценена коллекция из 100 образцов ППГ, которые могут служить селекционным мостиком для создания интрогрессивных форм пшеницы, несущих гены Wx пырея. Было показано наличие генов Wx пырейного происхождения в 73 образцах. Так как на всех образцах, имеющих гены Wx пырейного происхождения амплифицировались продукты близкого размера, незначительно отличающиеся друг от друга, для повышения эффективности выявления ДНК-полиморфизма мы преобразовали наш маркер в CAPS-маркер, используя эндонуклеазу рестрикции НаеIII. При скрининге коллекции пшенично-пырейных гибридов с помощью CAPS-маркера, было обнаружено, что у 40 образцов ППГ образуются два фрагмента (1 тип), у 20 образцов фрагменты отсутствовали (2 тип) - то есть ППГ не несли гены Wx пырейного происхождения, выявляемые с помощью разработанного нами маркера. У 18 образцов наблюдается 3 фрагмента, у 20 образцов ППГ образуются четыре фрагменты (4 тип) и у 2 образцов - три фрагмента (5 тип). При этом 20 образцов были гетерогенными в повторности. Таким образом, нами был выявлен полиморфизм по типу аллельных вариантов генов Wx пырейного происхождения среди коллекции образцов пшенично-пырейных гибридов, что открывает широкие перспективы по оценке влияния генов Wx пырейного происхождения на формирование крахмала методами ассоциативной генетики.

выводы

1. Проведена валидация ДНК-маркеров для идентификации различных аллелей генов Wx пшеницы. Показано, что для выявления аллельных вариантов генов Wx-Al, Wx-Bl и Wx-Dl наиболее подходят молекулярные маркеры, разработанные Nakamura с соавт. (2002), Saito с соавт. (2009) и Shariflou с соавт. (2001) соответственно. Маркеры, разработанные Nakamura и McLauchlan, не позволяют отличить аллели Wx-Ble и Wx-Blb (нуль-аллель) друг от друга.

2. Проведена оценка 129 сортов мягкой и 22 сортов твердой пшеницы на аллельное состояние генов Wx. Выявлено, что два сорта мягкой пшеницы (Сила, Старшина) имеют нуль-аллель по Wx-Alb и три сорта несут аллель Wx-Ble (Коротышка, Ласточка, Нота).

3. Секвенирована и охарактеризована последовательность аллеля Wx-Ble мягкой пшеницы размером 2725 пн. Наибольшую гомологию данная последовательность показала к видам Т. aestivum ssp. spelta, Т. turgidum ssp. durum.

4. Показано, что у 11 образцов аллоцитоплазматических гибридов произошло замещение гена Wx-Al мягкой пшеницы на ген Wx Т. timopheevii. У пяти образцов АЦПГ имеются нуль-аллели по гену Wx-Bl. Выявлено, что у проанализированных образцов тип цитоплазмы значимо не влияет на размер крахмальных гранул.

5. Получены нуклеотидные последовательности функциональных генов Wx для следующих видов: 77г. bessarabicum, Th. intermedium, Th. ponticum Ps. stipifolia и D. villosum и последовательности псевдогенов видов Th. intermedium, Th. ponticum, Ps. stipifolia. Показано, что область сигнального пептида гена Wx у дикорастущих сородичей пшеницы является наиболее вариативной с наибольшим числом несинонимичных замен. В области предполагаемого центра синтеза крахмала не было выявлено ни одной замены.

6. Филогенетический анализ показал, что последовательности гена Wx D. villosum наиболее отдалены от всех остальных полученных последовательностей. Ряд последовательностей, полученных у Ps. stipifolia кластеризовались с последовательностями Th. bessarabicum (а также Th. intermedium и Th. ponticum), что может свидетельствовать в пользу возникновения рекомбинантного субгенома Js у еще одного из предковых видов.

7. Создан CAPS маркер (Wx-Thl/ЯаеШ) на гены пырейного происхождения Wx Thinopyrum, позволяющий идентифицировать эти гены в геномном окружении субгеномов пшеницы и выявлять различные аллельные варианты генов Wx Thinopyrum.

8. Показан полиморфизм генов 1Ух ТЫпоругит среди образцов коллекции из 100 пшенично-пырейных гибридов с помощью маркера WX-ТНИНаеШ.

Благодарности.

Автор выражает благодарность академику РАСХН, д. с.-х.н., проф. Беспаловой Л.А., к.б.н. А.В. Васильеву (Краснодарский НИИСХ имени П.П. Лукьяненко); проф. Семенову О.Г. (РУДЫ); проф. В.П. Нецветаеву (БелНИИСХ РАСХН); к.б.н. В.П. Упелниеку, к.б.н. В.И.Белову, к.б.н. Л.И. Глуховой (Отдел отдалённой гибридизации учреждения Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН), проф. J. Raupp и B.Friebe (Cansas State University, USA).

Работа выполнена при частичной финансовой под держке Министерства образования и науки РФ, Соглашение № 8137 от 23.07.2012.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическая характеристика коллекции мягкой пшеницы по генам, отвечающим за хлебопекарные и технологические качества муки / М.В. Климушина, М.Г. Д и вашу к, Г.И. Карлов // Известия ТСХА. - 2009. - №3. - С.81-88.

2. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическая характеристика коллекции мягкой пшеницы по генам, отвечающим за хлебопекарные качества / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V Съезд вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. - 2009. - Ч. 1. - С. 244.

3. Климушина, М.В. Подбор и тестирование молекулярных маркеров, для их использования в селекции на хлебопекарные качества мягкой пшеницы качества / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Молодежь и инновации: Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых. В 2-х ч. / Гл. ред. А.П. Курдеко. - Горки: Белорусская государственная сельскохозяйственная академия. - 2009. — Ч. 1.-С. 95-97.

4. Об оптимизации систем молекулярного маркирования МУАХУ-геиов пшеницы для целей МАБ-селекции / М.В. Климушина, П.Ю. Крупин, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Сельскохозяйственная биология. -2010.- №5. -С. 36-41.

5. Гладких, Н.И. Оценка аллельного состояния генов 1¥х в коллекции мягкой озимой пшеницы / Н.И. Гладких, М.В. Климушина // Материалы II Международной конференции молодых учёных. Звенигород. - 2011. -С. 31.

6. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическое изучение аллеля 1¥х-В1е у мягкой пшеницы и возможность идентификации с помощью молекулярных маркеров / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Материалы XI Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии - 2011». Москва. - С.24-25.

7. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическое изучение аллеля \Vx-Ble и возможность его идентификации с помощью молекулярных маркеров / М.В. Климушина // Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2011, секций «Биология». - Москва. - С. 78

8. Дивашук, М.Г. Молекулярно-генетическая характеристика аллеля 1Ух-В1е мягкой пшеницы и применимость ДНК-маркеров для его

идентификации / М.Г. Дивашук, М.В. Климушина, Г.И. Карлов // Генетика. - 2011. - Т. 47. - № 12. - С. 1611-1615.

9. Климушина, М.В. Секвенирование и разработка ДНК маркеров генов Wx некоторых представителей родов Thinopyrum, Dasypyrum и Pseudoroegneria / М.В. Климушина // Материалы X съезда Белорусского общества генетиков и селекционеров. Международная научная конференция «Генетика и Биотехнология XXI века». - 2012. -Минск. — С. 71.

Ю.Распределение аллелей генов Wx в коллекции мягкой пшеницы краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко / М.В. Климушина, Н.И. Гладких, М.Г. Дивашук [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2012. - №1. - С. 187-191.

11 .Климушина, М.В. Анализ аллоцитоплазматических гибридов пшеницы на аллельное состояние генов Wx / М.В. Климушина // Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секций «Биология». - Москва. - С. 76.

12.Климушина, М.В. Секвенирование генов Wx некоторых представителей родов Thinopyrum, Dasypyrum и Pseudoroegneria / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Материалы XII Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии -2012». - Москва. С. 39-40.

13.Анализ аллельного состава генов, связанных с хлебопекарными качествами, у аллоцитоплазматических гибридов пшеницы / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Т.А.К. Мухаммед [и др.) // Генетика. -2013. - Т. 49. - № 5. - С. 617-625.

14. Molecular characterization and DNA markers development of Thinopyrum, Dasypyrum and Pseudoroegneria waxy genes / G.I. Karlov, M. Klimushina, M. Divashuk [et al.] // Материалы XII Международного симпозиума по генетике пшеницы IWGS (Япония). - Йокогама. - 2013. - С. 96.

15.Дивашук, М.Г. Секвенирование гаплотипов гена Wx пырея среднего (Thinopyrum intermedium) / М.Г. Дивашук, М.В. Климушина, Г.И. Карлов // Вестник Башкирского университета (в печати).

16.Молекулярная характеристика аллеля Wx-Ble у мягкой пшеницы / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, П.Ю. Крупин, Г.И. Карлов // Известия ТСХА (в печати).

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/]б. Усл. печ. л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ 439.

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12,977-26-90,977-40-64

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Климушина, Марина Вячеславовна, Москва

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ -

МСХА имени К.А. ТИМИРЯЗЕВА

04201361988

На правах рукописи

К ЛИМУ ШИН А МАРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ №ХУ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫХ

Специальность 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор Карлов Г.И.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................9

1.1 Производство мягкой пшеницы и значение пшеничного крахмала....9

1.1.1 Мягкая пшеница - ведущая зерновая культура.................................9

1.1.2 Направления использования крахмала пшеницы и его компонентов.... 10

1.1.2.1 Применение крахмала в пищевой промышленности...............10

1.1.2.1 Использование крахмала и его компонентов в непищевой промышленности..........................................................................11

1.2 Крахмал и его компоненты.......................................................12

1.2.1 Химическая структура и композиция крахмала...............................12

1.2.2 Структура крахмальных гранул..................................................14

1.2.3 Физико-химические свойства крахмала.........................................16

1.2.4 Пути синтеза амилозы и амилопектина у зерновых..........................17

1.3 Строение и функции генов, контролирующих синтез амилозы (^л:).19

1.3.1 Локализация генов И^х и их номенклатура....................................19

1.3.2 Молекулярная структура генов ¡Ух..............................................20

1.3.3 Аллельные варианты генов 1¥х, их номенклатура и распространение...22

1.3.3.1 Аллельные варианты генов \¥х......................................................

1.3.3.2 Распространение аллелей генов Жх......................................23

1.3.4 Нуль-аллели генов И^х..............................................................25

1.3.5 Идентификация аллелей генов И^х................................................27

1.4 Изучение нуклеотидных последовательностей генов .................28

1.4.1 Изучение нуклеотидных последовательностей генов ИЪс у

мягкой пшеницы и ее сородичей........................................................28

1.4.2 Изучение генов УУх у дикорастущих злаков...................................30

1.5 Пшенично-пырейные гибриды как инструмент для перенесения ценных генов от дикорастущих сородичей в мягкую пшеницу..............36

1.6 Аллоцитоплазматические гибриды пшеницы...............................37

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................40

2.1 Растительный материал............................................................40

2.2 Методы исследований............................................................42

2.2.1 Выделение ДНК из растительного материала.................................42

2.2.2 ПЦР-анализ...........................................................................42

2.2.3 Клонирование нуклеотидных последовательностей аллеля Wx-Ble

и генов Wx дикорастущих сородичей пшеницы.....................................44

2.2.4 Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей...........45

2.2.5 Выделение крахмала и электрофоретический анализ белков Wx..........45

ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................47

3.1 Оценка коллекции сортов мягкой и твердой пшеницы на аллельное состояние генов Wx.......................................................................47

3.1.1 Применимость ДНК-маркеров для идентификации аллелей генов Wx для скрининга коллекций и MAS-селекции............................................49

3.1.1.1 Ген Wx-Al...................................................................49

3.1.1.2 Ген Wx-Bl.....................................................................51

3.1.1.3 Ген Wx-Dl....................................................................56

3.1.2 Распределение аллелей генов Wx в коллекциях мягкой и твердой пшеницы......................................................................................57

3.2 Создание гибридов мягкой пшеницы с различным аллельным составом генов Wx........................................................................63

3.3 Молекулярная характеристика аллеля Wx-Ble мягкой пшеницы.....67

3.3.1 Анализ экзонов.......................................................................71

3.3.2 Анализ интронов......................................................................73

3.3.3 Филогенетический и BLASTN анализ аллеля Wx-Ble........................74

3.4 Изучение генов Wx аллоцитоплазматических гибридов пшеницы...75

3.4.1 Идентификация аллельных вариантов по генам Wx..........................75

3.4.2 Анализ фракционного состава крахмальных гранул.........................78

3.5 Секвенирование генов Wx некоторых представителей родов

Thinopyrum, Dasypyrum и Pseudoroegneria.......................................84

3.5.1 Подбор и апробация праймеров для амплификации участков генов

Wx у дикорастущих злаков...............................................................85

3.5.1.1 Праймеры для клонирования генов Wx (по Xiu-Qiang Huang)...85

3.5.1.2 Праймеры для клонирования генов Wx (по Monari)...............87

3.5.1.3 Праймеры для клонирования генов Wx (по Guzman)..............89

3.5.2 Анализ нуклеотидных последовательностей дикорастущих видов......90

3.5.2.1 Thinopyrum intermedium (PI 383573)...................................90

3.5.2.2 Thinopyrumponticum (1158A/19).......................................91

3.5.2.3Thinopyrum bessarabicum (W6 21890)...................................93

3.5.2.4 Pseudoroegneria stipifolia (W6 21759)..................................94

3.5.2.5 Dasypyrum villosum (W6 21717).........................................95

3.5.3 Сравнительный анализ полученных нуклеотидных

последовательностей.......................................................................96

3.5.3.1 Часть I: экзоны 1-3, интроны 1-2.......................................96

3.5.3.2 Часть II: экзоны 3-6, интроны 3-5......................................99

3.5.3.3 Часть III: экзоны 6-11, интроны 6-10.................................102

3.5.4 Филогенетический анализ.......................................................107

3.5.4.1 Экзоны 1-3, интроны 1-2................................................109

3.5.4.2 Экзоны 3-6, интроны 3-5................................................111

3.5.4.3 Экзоны 6-11, интроны 6-10.............................................114

3.5.5 Давление естественного отбора на гены Wx у дикорастущих

сородичей пшеницы......................................................................120

3.6 Разработка молекулярного маркера, позволяющего отличать гены

Wx пырейного происхождения от генов Wx мягкой пшеницы............123

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................128

ВЫВОДЫ..................................................................................130

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................133

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) - является ведущей зерновой культурой во многих странах мира. По оценкам ФАО мировое производство пшеницы продолжает расти, на 2011 год оно увеличилось на 7,2 % по сравнению с 2010 годом и на 2,6 % по сравнению с 2009 годом (http://faostat3.fao.org/home/index.htmn. Мягкую пшеницу выращивают на различные цели, и одним из направлений использования является получение пшеничного крахмала. Содержание крахмала в зерновке пшенице составляет 65-75 % на сухую массу. Крахмал и его основные составляющие, амилоза и амилопектин, широко используются в химической и пищевой промышленностях. Всегда существовала потребность в крахмале с регулируемыми функциональными свойствами в зависимости от направления его использования. Функциональные и физико-химические свойства крахмала, прежде всего, зависят от соотношения содержания амилозы и амилопектина. В связи с этим данному показателю уделяется большое внимание при получении новых линий растений с уменьшенной или увеличенной активностью основных ферментов, участвующих в биосинтезе амилозы. Пониженное или повышенное содержание амилозы в крахмале обусловлено различными аллельными вариантами генов Wx, кодирующих фермент, который контролирует синтез этого компонента крахмала. Данные гены идентифицированы и локализованы у мягкой пшеницы на хромосомах: 7AS ( Wx-Al), 4AL ( Wx-Bl) и 7DS (Wx-Dl) (Chao et al., 1989). У мягкой пшеницы с одним или двумя нефункциональными генами Wx (нуль-аллелями) синтезируется крахмал с пониженным содержанием амилозы (Yasui et al., 1996; Vrinten et al., 1999; Takeshi, 2006). Функциональные аллельные варианты генов Wx (Takeshi, 2006; Vanzetti et al., 2009; Guzmân et al., 2011), как правило, не столь значительно изменяют содержание амилозы в крахмале, и их влияние до конца не изучено, в том числе и из-за аллополиплоидной природы мягкой и твердой пшеницы. Но в целом следует отметить, что разнообразие аллельных

вариантов генов Wx, выявленных у пшеницы по всем трем генам, довольно низкое (Yamamori et al., 1994; Vanzetti et al., 2009). В связи с этим сейчас идет активный поиск и изучение различных генов Wx у сородичей пшеницы с целью их последующей интрогрессии в её геном (Monari et al.,2005; Huang X.Q et al., 2010; Guzman et al., 2012; Alvarez and Guzman, 2013). Все более широкое распространение получает привлечение различных генов дикорастущих сородичей пшеницы для ее улучшения (Knott, 1987; Friebe et al., 1996; Давоян, 2006; Ji et al, 2012). В основном это связано с различными генами устойчивости к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, но есть данные и об улучшении качества зерна пшеницы с помощью ряда генов пырея (Han et al., 2004; Zhao et al., 2010). Также немаловажное значение имеет изучение генов Wx у дикорастущих видов для понимания эволюции данных хозяйственно-ценных генов и видов в целом (Mason-Gamer et al., 1998; Shapter et al., 2005; Mahelka et al., 2011). Поэтому актуальным вопросом является получение нуклеотидных последовательностей генов дикорастущих злаков для их последующей молекулярно-генетической характеристики методами бионформатики. Наконец, изучение генов Wx мягкой пшеницы и возможность идентификации их аллельных вариантов является важным этапом в селекции сортов с варьируемым, в зависимости от целей производства, содержанием амилозы без химической модификации крахмала.

Цели и задачи работы. Цель работы — выполнить молекулярно-генетический анализ генов Wx у различных видов пшеницевых.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить применимость существующих в настоящее время ДНК-маркеров на гены Wx пшеницы для скрининга коллекционного материала и селекции с помощью молекулярных маркеров (MAS-селекции).

2. Изучить аллельное разнообразие генов Wx у мягкой и твердой пшеницы отечественной селекции.

3. Дать молекулярную характеристику аллеля Wx-Ble мягкой пшеницы.

4. Исследовать аллельное состояния генов Wx среди аллоцитоплазматических гибридов пшеницы и оценить влияние типа цитоплазмы на формирование крахмальных гранул.

5. Клонировать и секвенировать нуклеотидные последовательности генов Wx у видов Thinopyrum intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum Pseudoroegneria stipifolia и Dasypyrum villosum.

6. Создать молекулярный маркер на гены Wx пырейного происхождения.

7. Изучить коллекции пшенично-пырейных гибридов на аллельное состояние генов Wx пырейного происхождения.

Научная новизна. Проведена молекулярно-генетическая характеристика коллекций мягкой и твердой пшеницы сортов отечественной селекции по генам, отвечающим за синтез амилозы. На основе полученных результатов создан набор линий краснозерной мягкой пшеницы с различным аллельным составом генов Wx, который может быть использован как в изучении проявления данных генов, так и в качестве доноров при практической селекции. Выявлены недостатки ряда молекулярных маркеров, используемых для оценки мировых коллекций пшеницы. Секвенирован и охарактеризован аллель Wx-Ble мягкой пшеницы. Получены и охарактеризованы нуклеотидные последовательности генов Wx у видов Th. intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum, Ps. stipifolia и D. villosum.

Практическая значимость. Результаты работы имеют важное теоретическое и практическое значение и могут быть использованы в селекции пшеницы. Разработаны методические рекомендации по использованию молекулярных маркеров для скрининга аллельного состояния генов Wx коллекций и MAS-селекции. На основе полученных нуклеотидных последовательностей дикорастущих видов создан молекулярный маркер WX-ТН\-НаеШ, позволяющий отличать гены Wx пырейного происхождения от генов Wx мягкой пшеницы. Показано, что данный молекулярный маркер

подходит для идентификации генов РРх пыреев и может использоваться для оценки существующих коллекций пшенично-пырейных гибридов. С помощью разработанного молекулярного маркера оценена коллекция пшенично-пырейных гибридов, которые могут использоваться в качестве селекционного мостика для создания интрогрессивных форм пшеницы, несущих гены Жх пырея.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Производство мягкой пшеницы и значение пшеничного крахмала 1.1.1 Мягкая пшеница - ведущая зерновая культура

Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) была одним из первых окультуренных растений и основным пищевым продуктом в Европе, Западной Азии и Северной Африке. В настоящее время мягкая пшеница является ведущей зерновой культурой во многих странах мира. В мире пшеница занимает посевных площадей, больше чем какая-либо другая культура, уступая по валовому сбору только кукурузе и рису. По оценкам ФАО мировое производство пшеницы продолжает расти, на 2011 год оно увеличилось на 1,2 % по сравнению с 2010 годом и на 2,6 % по сравнению с 2009 годом (http://faostat3.fao.org/home/index.html). Российская Федерация является одним из лидеров по производству и экспорту данной культуры. Мягкая пшеницы стала самой распространенной сельскохозяйственной культурой, потому что обладает высокой адаптационной способностью, проста в хранении, а также богата питательными веществами, содержащимися в запасающем органе зерновки - эндосперме. Данную культуру выращивают на различные цели, и одним из направлений использования является получение пшеничного крахмала. Направление использования зерна зависит от нескольких факторов, таких как качество и количество белка, композиция крахмала и его качество, структура зерна (твердозерность и мягкозерность) и качество липидов (Morris, 1998). Зерно пшеницы состоит из зародыша, эндосперма и перикарпа. Эндосперм составляет 80% семени, и на 3А состоит из крахмала, поэтому крахмал играет значительную роль в определении направления использования зерна. Крахмал - это нерастворимый полисахарид, состоящий из двух полимеров глюкозы: амилопектина и амилозы. Основным потребителем крахмала и его составляющих является пищевая и химическая промышленности.

1.1.2 Направления использования крахмала и его компонентов

1.1.2.1 Применение крахмала в пищевой промышленности

Почти 35% населения мира употребляют пшеничный крахмал в качестве основного продукта питания (Braun et al., 1998). Пшеничный крахмал используют для изготовления таких пищевых продуктов, как печенье, торты и хлеб. Крахмал с нужными функциональными свойствами улучшает структуру и замедляет очерствение продукта.

Пищевая промышленность является основным потребителем крахмала, где он благодаря своим вязким свойствам и высокой способности удерживать влагу широко используется в качестве загустителя и стабилизатора. В процессе приготовления мясных продуктов крахмал применяют в качестве связующего для закрепления массы. Так как содержание крахмала в муке достигает 70%, он оказывает влияние на хлебопекарные качества муки и свойства конечного продукта. В кондитерской промышленности используют нативные и модифицированные крахмалы для производства конфет, карамели и других видов сладостей (Zeng et al, 1997; Graybosh, 1998).

Соотношение содержания компонентов крахмала (амилозы и амилопектина) является важным показателем, влияющим на физико-химические свойства крахмала, и определяет направление его использования. Пшеницы с пониженным содержанием амилозы требуются для производства лапши удон в азиатских странах. Крахмал пшеницы с нулевым содержанием амилозы имеет физические свойства, оптимальные для изготовления качественной • лапши, такие как более высокий уровень набухания и плотность суспензии крахмала, температура клейстеризации крахмала и энтальпии. Лапша, изготовленная из крахмала пшеницы с низким содержанием амилозы, лучше набухает, имеет повышенную эластичность и упругость, лучшие вкусовые качества и товарный вид (Graybosh, 1998). Также имеются данные, что сниженное содержание амилозы оказывает положительное влияние на хлебопекарные свойства (Martin and Smith, 1995;

Nakamura et al, 1995). Зерно пшеницы с безамилозным крахмалом способствует образованию пышных и хрустящих пшеничных хлопьев в утренних завтраках и хрустящих палочках, тогда как зерна с крахмалом, содержащим обычное количество амилозы, способствует ломкости и размельчению хлопьев, что является нежелательным параметром (Ma et al., 2013; Lan Guan et al, 2009). В процессе изготовления хлеба частичная замена муки нормальной пшеницы (15-30 %) на муку, изготовленную из низкоамилозной пшеницы, приводит к увеличению объема хлеба и содержанию крахмала в хлебном мякише (Shivananda et al, 2011).

Исследования показали, что тесто, изготовленное из безамилозных сортов пшеницы, лучше выдерживает режим замораживания - оттаивания. А это открывает перспективы для изготовления продуктов из замороженного теста, таких как круассаны, продукты из слоеного теста, вареники, пельмени, гамбургеры и другое (Graybosh, 1998). В пищевой промышленности из амилозы производят пленки, используемые для изготовления съедобных колбасных оболочек, и упаковки пищевых продуктов, таких как растворимый кофе, суп и чай (Powell, 1973).

1.1.2.2 Использование крахмала и его компонентов в непищевой промышленности

Основным направлением использования крахмала в непищевой промышленности является получение биотоплива. Это связано с тем, что крахмал относительно легко может быть преобразован в способный к брожению сахар (Smith, 2008). И в данной отрасли преимущество также имеет крахмал с низким содержанием амилозы, так как у такого крахмала снижена температура клейстеризации, что понижает расход энергии при обработке. При сравнении эффективности фермен