Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние структуры мРНК на уровень экспрессии генов в Е coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние структуры мРНК на уровень экспрессии генов в Е coli"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА и Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

РГБ ОД

/ ■ 18 ОПТ ГО

ЕСИПОВ Роман Станиславович

Влияние структуры мРНК на уровень экспрессии генов в Е. coli

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1999

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Ордена Трудового Крась Знамени Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. /

Овчинникова РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор А. И. Гуревич

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

член-корр. РАН, профессор С. Н. Кочетков кандидат химических наук И. В. Бонн

Ведущая организация: Государственный научный центр РФ

ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится «/3» ¿З^Р 1999 г. на заседании

Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва. В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

I

Автореферат разослан /О ШсЯрг^Я 1999 г. Ученый секретарь Специализированного совета

доктор химических наук

В. А. Несмеянов

Характеристика работы

Актуальность проблемы. Взаимосвязь структуры мРНК и эффективности гшпшши трансляции, определяющей уровень экспрессии генов, давно привлекала m мание исследователей. Были нсслслопанм многочисленные последовательности [ЧIK. особенно в области инициации трансляции генов, имеющих высокий уровень гспрессин. Определен ряд первичных детерминант. Сформулировано общее хлетаппение о механизме инициации трансляции. Созданы и удачно функционируют ногочпеленные системы для экспрессии гстсрологичных генов п Ii. coli. Но часто .тает пс вполне понятен молекулярный механизм этих взаимодействий. Остается ^решенной проблема выбора - какой именно участок на 16S РНК непосредственно ¡аимоденстпует с активным элементом в структуре мРНК. Комплементарные заимодсйствня этих элементов с соответствующими участками на 16S РНК, пределенные путем простого сравнения, часто не могут быть реализованы из-за гсрнчсских факторов. Кроме этого остается много вопросов, связанных с дальними занмолепствиями. когда на рибосом-связываюншй сайт оказывают влияние области, алско расположенные от инициирующего колона.

13 последние годы очень продвинулось направление компьютерного юделкропанпя рибосом, когда на основе обширного экспериментального мгггериала оздаются пространственные модели 30S и 70S субчастиц. Это позволяет с большей [остовсрностыо решать задачу обнаружения новых рибосом-связываюншх сайтов на iPHK и кроме этого оптимизировать положения уже известных трансляционных ■силителей в 5'-нетранслируемойобласти мРНК.

По пому актуальными являются работы, направленные па пмяснсннс дехашнмов функционирования этих элементов, оказывающих решающее влияние на |ффск1чвносгь инициации трансляции и на уровень экспрессии генов.

Цель работы заключалась в нахождении зависимости уровня экспрессии эяда генов в £ coli от структуры участка инициации трансляции (TIR), а также изучите 5ЛИЯ1ШЯ далытх взаимодействий на рибосом-связывающий сайт. В качестве модельных ~ei юн использовался ген человеческого шггерлейкина-З, а также ряда гибридных белков та его основе.

Кфкретные задачи состояли в следующем

- изучение зависимости уровня экспрессии гена or первичной ci руктуры

TIR;

- изучение влияния на уровень экспрессии геиа дальних взаимодействий в мРНК, приводящих к образованию участков вторичной структуры с участием TIR;

- создание новых илазмидных векторов с оптимальной ci руктурой TIR для достижения высокого уровня экспрессии генов'

Научна» ноинзна н нракирнчкам тин ос и, pafiou.i. H pafioie .ici алию проа шинированы влияние на экспрессию генов в h', coh сгрукту pu 5 -но ранелнруемои области мРНК и значение в этом процессе комплементарных взаимодействий м1'11К с 16S рРНК. Показано, что на комплементарные взаимодействия участка инициации трансляции с 16S рРНК и, следовагелыю, на его эффективность оказывает влияние вторичная структура mI'I IK, включающая диегальныеобласти mI'I IK

Это обеспечило создание серии новых векторов дня эффективной нрокарнотической экспрессии гетерологнчных генов, которая имеет очень важное практическое значение. При клонировании в этих новых векторах достигнут высокий уровень биосинтеза нескольких рекомбинантных белков.

Апробация работы. Основные результагы диссертационной работы были представлены на: 1-ой германо-российской летней школе по системам m viiro, Берлин, 1994 г.; Юбилейной научной сессии МИТХТ, посвященной 100-летшосо дня рождения проф. H.A. Преображенского, Москва, 1996г.;11-омсъездебиохпмпческоюобщества РАН, Москва, 1997 г.

Публикации. 11о материалам диссерт ации опубликовано 8 рабог

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, списка цитированной литерагуры ( 186 ссылок).

Работа изложена на 126 страницах, включает 5 таблиц и 43 рисунка.

Содержание работы DjiiiHime нераичной структуры участка шшшшцип трансляции на уровень экспрессии гена.

1. Размер mTIR и значение отдельных частей TIR для эффективной

трансляции.

Ранее в группе генетической инженерии лаборатории биотехнологии ИБХ РАН уже был осуществлен химико-ферментативный синтез прокснмалыюн части усилителя трансляции гена 10 фага Т7 (TE1J, всего ТЕ (ТЕ2) и его варианта с измененной нуклеитшшой последовательностью проксимальной част (ТЕЗ ) lice эти структуры расположены перед сайтом Ше\ плашмя серии р(е, несущих ген иитерлейкина-З (р1е2)13,см.рис. 1.).

fu (il tx.

PI7.153

I.J.'i

npä d'il 40J roc M vi4

• • -t.......-•• • .<■—-------a-.

B-C .„ I T

Рис. 1 Схема строения фрагментов плазмид р1е2ЦЗ и рСеЗиЗ^Ш. Указаны сайты ресгриктаз, положение промоторов (РТ7) и (Р8), £Г1'!Ш участков ив и ЭР, терминатора(Т)

134 - ¿/о* 1.642 транскрипции, гена интерлейкина-3

''"'"н^зее ищм.ш .'-н^'Лпкз № и™ '13а) и его стоп-кодона

д , J.-,.-.. ...,_,-jy-,.............г... g ,..,...... (stop)

..............'I

•tup

I IB SD ,, I

ttht

Кроме этих трех модификаций мы решили использовать структуру еще одного усилителя трансляции, а именно, ТЕ гена atpE Е. coli (TEE). На рис. 2. приведены структуры генов соответствующих mTIR.

s f. i GGATCCGCATGCTCTAGi^^TAATTTTGTTT^CTTTAAGAAGGP,GATATCATftTG. .

BS X RV N TE2 ! . .GGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTT.TAACTTTAAGAAGGAGMATCATMXi

BS X RV Ы

ТЕЗ (25N) . . .GGGAG ( 16N) TCTAGATTTTAAAACCGAAAACCGTTTTTAAGGAGATATCATATG

BS X RV H TEE (25N) ...GGGAG(ICH)TCTAGAACACTACTACGTTTTAACTGAAACAAACTGGAGATATCATATG

Рис. 2. Нуклеотидные последовательности различных участков ТЕ в экспрессионных плазмид ах, Подчеркнуты последовательности и инициирующий к од он. Указаны сайты рестриктаз (В - Ват Н1, - ЕсоНУ, N - ЛМе1, Э - 5рЛ1. X - ХйаЦ,

Для выяснения влияния элементов структуры ТЕ на эффективность трансляции мы сопоставили уровни экспрессии одного и того же гена, клонированного в плазмидах, структура которых различалась лишь в области, непосредственно предшествующей старту трансляции. В качестве такого гена мы использовали ген человеческого интерлейкина-З (И3), Сконструированными плазмидами трансформировались штаммы Е. coli XLI и [îl,21(DF.3), что позволило изучить в сравнимых условиях биосинтез белка при транскрипции, инициированной как с конститутивного промотора Р8, так и с индуцируемого промотора Pt7. В случае использования индуцированного синтеза, транскрипция осуществляется с двух промоторов одновременно. При этом мы показали, что уровень транскрипции не сказывается на уровне экспрессии гена. Таким образом, уровень экспрессии гена определяется именно на стадии трансляции.

Клетки продуцентов анализировали после культивирования в стандартных условиях путем гель-электрофореза тотальных лизатов с последующим сканированием гелей, прокрашенных кумасси R-25D.

Из полученхых нам» данных следует, что для обеспечения высокого уровня экспрессии целевого гена необходима полная лидерная последовательность гена 10 фага Т7, в которой имеет важное значение как проксимальная, так и днетальная часть ТЕ. Содержание IL3 в тотальном лизаге с плазмиды ptc2il3 составило более 25%. Эти данные позволяют предположить, что контакты мРНК с 30S частицей рибосомы на стадии образования иницизгорного комплекса охватывают существенно больший район, чем это предполагалось ранее. Таким образом, максимальный уровень экспрессии гена ИЗ достигается в нлазмндах, участки TIR которых характеризуются не только последовательностями вблизи инициирующего кодона ( в позиции до-30 н ), но н более отдаленным участком (до -60 н ), который влияет на уровень экспрессии.

2. Комплементарное соответствие частей мГИК участкам 16S рГНК и эффект этого соответствия на уровень экспрессии

Ранее было высказано предположение, что, возможно, усиление трансляции обусловлено наличием в проксимальной части ТЕ специфической нонануклеотидной последовательности (последовательность е или UBI ), комплементарной участку 458466 16S рРНК (airrnUB или AUB1 ).

После анализа структуры mTIR в мРНК на предмет обнаружения потенциального сайта связывания с последовательностью AUB 1 на 16S рРНК, во всех

1струкциях нами были обнаружены такие участки, способные комплементарно шмодействовать с петлей Н17 16S рРНК. Кроме сайта AUD1 компьютерный анализ ¡полил нам предположить, что на этой петле имеется еще один район (сайтЛиВ2), орый мог бы связываться с дисталыюй областью mTIR (сайт UB2). Полученные .(и экспернмсн гапьные данные хорошо укладывались в общую закономерность. Так, меньший уровень экспрессии гена ИЗ наблюдается в плазмидер1еН13 (3% белка в альном клеточном лизате), в которой, при наличии хорошего связывания рибосомы D и UBI, эффективность взаимодействия с UB2 мала.

Наивысший уровень экспрессии для гена i¡3 достигается с плазмидои pte2i!3 ?5% белка в тотальном клеточном лизате). Немного ниже уровень экспрессии для 7л i/З с нлазмнлами ple3¡13 и pteei!3, в которых связывание участков SD и UB1 с босомои слабее, расстояние между структурами UBI и UB2 уменьшено, но фаняегся тот же, что и в pte2il3, участок UI32 (13 и 15% белка в тотальном клеточном зате, соответственна).

Чтобы уточнить предположение об участках связывания мРНК с 16S рРНК в ициаторном комплексе, а также о возможной роли суммарной энергии такого пывания, мы сконструировали новую серию плазмид с использованным ранее геном . При конструировании новых плазмид мы заменили в исходной плазмиде pte2il3 асток между сайтами рестриктазЛи/П иЛМ, содержаншй структуру UB2 и участок, пержашин структуру UBI и SD между сайтами ХЬа\ и ЕсоЮ/, на синтетические игонуклеотндные дуплексы (А)-(Г), соответствующие фрагментам мРНК, которые в злнчной степени комплементарны участкам I6S рРНК (последовательность UJB2 -мплементарна AlJB2,aiUB2 - гомологична AUB2, aUHl - гомологичнаAUB1, aSD-Mo.iiorirnmASD). :e2¡13)

э/il ЛзиИ Xbal EcoRV Ncfel

0 CGAAATTAATACGACTCACTATAGGCGGGTAACGTCAATGAGCAAAGGT

IB2 TTTAATTATGCTGAGTGATATCCGCCCATTGCAGTTACTCGTTTCCAGATC

!) CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCCATTGCAGTTACTCGTTTCCT

UB2 TTTAATTATGCTGAGTGATATCCCGGGTAACGTCAATGAGCAAAGGAGACT

I) CTAGATTTATTAAAACAAATTGAAATTCAAGGAGAT

IB1 TAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGTTCCTCTA

') CTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGTTCCTGAT

ID TTTTATTAAAACAAATTGAAATTCAAGGACTA

Как мы и предполагали, наибольшее влияние на уровень экенрессин оказьшае, связывание mTIR с сайтом ASD, минимально необходимая свободная энергия котором должна быть не ниже-6.5 ккал/моль. Уровень экспрессии целевого гена с плазмндь pte7il3 (структура Г) был очень низким и составил менее одного процента белка i тотальном клеточном лизате. Неожиданно уровень экспрессии гена ИЗ i соответствующей шшзмвдер!е4|13 (структура А) оказался сущесгвенно шше (4% белк; в тотальном клеточном лизате), чем в исходной плазмиде pte2¡13 с природной ли дерне» последовательностью. Для объяснения 'л ого факта мы даже предположили что iUíí; связывается с AUB2 слишком прочно (значение ЛС! такого связывания должне составлять -45 ккал/иоль) и это препятствует перемещению мРНК для следующе! ступени связывания в иницнагорном комплексе. В то же время оказалось, что при замене структуры ШВ2 натрансвертированиую последовательность aiUB2 уровень эксирессш в плазмиде pte5il3 (структура Б) остается практически столь же высоким (20% белка i тотальном клеточном лизате), как в исходной плазмиде pte2il.1, хотя комплементарное связывание мРНК с участком AUB2 невозможно. Тем более результаты казалпа противоречивыми в случае плазмцды с трансвершровапной структурой UBI (структура В), экспрессия в которой, как мы предполагали, должна существенно снизится ш-з; невозможности комплементарного взаимодействия с последовательностью AUB1 16S рРНК. Содержание 1L3 в тотальном клеточном лизате продуцента с такой плазмндой составило не менее 20%. Таким образом, влияние структуры UB1 в составе mTIR на образование иницнаторного комплекса не существенно. Исходя из полученных выше данных комплементарное взаимодействие петли Н17 (сайты AUB1 и AUB2) с соответствующими сайтами UB 1 и UB2 в mTIR практически не реализуется.

Проведенный нами компьютерный анализ структур возможных сайтов связывания днетальной и проксимальной части последовательности ТЕ2 с петлями 16S рРНК выявил ряд потенциальных участков в днетальной части mTIR мРНК, способных к комплементарному взаимодействию. Наиболее важным результатом проведенного анализа является тот факт, что все эти участки mTIR, способные образовывать комплементарные структуры с экспонированными участками петель, расположены в днетальной части ТЕ, и это во многом объяснило наши результаты, когда наличие или отсутствие днетальной части определяло экспрессию целевою гена. При этом достаточно трудно выбрать, с какой именно петлей возникает предпочтительное связывание. Более того, мы даже предполагаем, что именно возможность многочисленных комплементарных взаимодействий в районе образования

инициирующего комплекса объясняет способность лндерного участка мРНК гена 10 работать в качестве усилителя трансляции.

Далее мы провели аналогичные расчеты для последовательности тТШ в плазмидах р1е4ПЗ и р1е5|13 с сайтами ¡1)В2 и аШВ2, соответственно. Из полученных данных следует, чт о возможных сайтов связывания в плазмцдер[е5Ш гораздо больше, чем в р1е4113, и именно существование таких взаимодействий, на наш взгляд, объясняет разницу, которую мы наблюдали при экспрессии гена ИЗ. При этом следует отметить, что структура дистальной части ТЕ в плазмиде р1е2ПЗ и р1е5¿13 имеет очень много различии, но при этом и, та и другая структура обеспечивает высокую экспрессию целевого гена (не менее 20% белка и тотальном клеточном лнзаге). Исходя нз этою нрслсгаш1яс1'Ся мало вероятным участие какого-либо рнбосомного белка в этой системе, поскольку любое РНК-белковое взаимодействие предполагает совершенно определенную паттерную последовательность на мРНК. Только 168 рРНК может обеспечить такое потенциальное многообразие возможных связей, но в этом случае совершенно не обязательно придерживаться какой-либо консенсусной последовательности в структуре т'Г1К. Важно иметь, пусть беспорядочный, но набор сайтов связывания с 16И рРНК. Это совсем не означает, что связывание с любой петлей 168 рРНК в равной степени влияет на экспрессию гена и расстояние потенциальных сайтов в т'ПКог инициирующего крдона является несущественным. Бее эти параметры имеют важное значение, но это очень сложная зависимост ь, поскольку один и тот тоже участок на тТ1Г< может связываться с разными петлями 165 рРНК и соответственно экспонированный участок петли, расположенный вблизи от инициирующего участка 305 субчастицы, может связываться с разными сайтами щЦЯ мРНК. Таким образом, все попытки создания идеальной лидерцон последовательности в мРНК обречены на провал, поскольку число потенциальных сайтов связывания в пей должно быть ограниченным (хорошее связывание с одной петлей приводит к ослаблению комплементарности к другим или к удалению от области образования инициирующего комплекса в случае нескольких потенциально сильных комплементарных сайтов).

С целью проверки вышеизложенной гипотезы, мы, с одной стороны, решили заменить в нативной структуре дистальной част и лидерной последовательности гена 10 небольшой фрагмент, уменьшив таким образом число возможных связываний с петлями (бБрРНК, ас другой стороны - полностью заменить всю дистальную часть на искусственную структуру, которая бы имела потенциальные сайты связавания с 168 рРНК. Для этого участок ТЕ2 в шшмцде р1е2ИЗ между сайтами Л л/11 и ХЬЛ был заменен синтетическими дуплексами (Д) и (Е1).

(Д) CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCCTCCGATTACCGCGGCTGCTGCT UB3

TTTAATTATGCTGAGTGATATCCCGGGAGGCTAATGGCGCCGACGACGAGATC

(El) CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGAAAGTGGT UB4

TTTAATTATGCTGAGTGATATCCCTCTGGTGTTGCCTTTCACCAGATC

Структура UB3 в транскрипте с плазмнды pte8i!3 имеет большое сходство с последовательностью a¡UB2 и полностью идентична участку 18-ой петли 16S рРНК , но сильно отличается от природной дисталыюй части ТЕ2. Последовательность UB4 в плазмиде pte9i!3 почти полностью гомологична дистальной части 'ГЕ2, за исключением шести оснований, расположенных перед сайтом ХЬа\. Выбор этих оснований объясняется тем, что они входили в ряд сайтов mTIR, способных связываться с I6S рРНК. Проксимальная часть в обеих этих конструкциях полностью идентична природной последовательности ТЕ2 (см. рис. 3). Как мы и предполагали, экспрессия гена ИЗ в клетках Е. coli с плазмидой pteSil 3 оказалась высокой, ас плазмидой ptc9il3 низкой (>25 и 5% белка в тотальном клеточном лизате, соответственно). Более того, использование последовательности UB3 в дисталыюй области mTIR мРНК гена ИЗ обеспечило даже большую экспрессию целевого гена, чем в случае ТЕ2.

( а ) GGAGACCACAACGGUUUCCCUCUAGAAAAUAAUUUUGUUUAACUUUAAGAAGGAG (О) GGAGACCACAACGGAAAGTJGUCUAGAAAAUAAUUUUGUUUAACUUUAAGAAGGAG ( В ) GGCCCUCCGAUUACCGCGGCUGCUGGCUAGAAAAUAAUUUUGUUUAACUUUAAGAAGGAG

Рис. 3. Структуры mTIR. (а) - лидерная последовательность гена 10 фага7( ТЕ2), (б) - mTIR с участком UB4. Отличающиеся гексануклеотнды выделены жирным шрифтом, (в) - mTIR с участком UB3.

Как мы уже показали ранее, Замена последовательности SD pte2il3 па трансвертированную в плазмиде pte6i!3 привела к очень сильному снижению уровня экспрессии юна //.'. и нам показалось шмерсспмм иопробошньпроиесш пнанш ичные замены в плазмиде ptc8il3, т.е. оставить неизменной носделов.иелышсп. UH3 в дистальной части TIR, но заменить последовательность SD и UBI на трансвертированные. При конструировании новых плазмид мы заменили в плазмндс pte8il3 участок, содержащий структуру UBI и SD между сайтами Xbal и EcoRV, на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, содержащие трансвертированные последовательности UBI и SD соответственно.

(Ж) CTAGATTTATTAAAACAAATTGAAATTCAAGGAGAT aUBl

TAAATAATTTTGTTTAACrTTAAGTTCCTCTA

(3) CrAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGTTCCTGAT aSD

TTTTATTAAAACAAATTGAAATTCAAGGACTA

Оказалось, что в структурах странсвертированными последовательностями (Ж) и (3) сохраняется высокий уровень экспрессии гена (9 и 12% белка в тотальном клеточном пшате).

Таким образом, суммируя все описанное в этом разделе, можно сделать вывод, что максимальный уровень экспрессии гена достигается в нлазмидах, участки TIR которых характеризуются не только последовательностями вблизи инициирующего кодона (в позиции до -30 п.), но и б/шее отдаленным участком (до -60 н ), который влияет на уровень экспрессии, и что контакты мРНК c30S частицей рибосомы па стадии образования инициагорного комплекса охватывают существенно больший район, чем это предполагалось ранее. Компьютерный анализ струкгур возможных сайтов связывания дна алыюн п проксимальной части последовательности mTIR с петлями 16S рРНК позволяет выявить ряд участков в днстальной части mTIR мРНК, способных к комплементарному взаимодействию. Рекомбинантные шшмиды с синтетическими участками mTIR, комплементарными рассчитанным сайтам в 16S рРНК, обеспечивают высокий уровень экспрессии гена.

Влияние вторичной структуры мРНК на эффективность трансляции и уровень экспресии гена. Дальние комплементарные взаимодействия ГШ с кодирующей частью mI'IIK.

Поскольку изученные нами сайта bTIR могут участвовать в комплементарных взаимодействиях не только с 16S рРНК, но также с дистальными частками мРНК в транслируемой области, общая вторичная структура мРНК может оказывать существенное влияние на эффективност ь инициации трансляции. Поэтому, с целью получеши дальнейших доказательств значения комплементарных взаимодейст вий для эффективности инициации трансляции и уровня экспрессии генов, мы продолжили наше исследование и изучили влияние удаленных участков кодирующей части мРНК, способных комплементарно связываться с участком RBS, включающим в себя последовательность SD и UB.

Ира! МпйШ

(а) ...ИТ ААСТТСТССТТСТТАААСТТАААССА • АССТТ...

...САА ТТСААСАССААСААТТТСААТТТССТТССА А...

Нра I Налс1111

(б) ...ОТТ ААСТТАОАССААСААТТТСАЛТТТСА АССТТ... ...САА ТТСААТСТССТТСТТАААСТТАААСТТССА А...

Нра! HiлdIII

(В) ..ЯТТ ААСТТСТССТТСТТАССССА АССТТ...

...САА ТТСААСАССААСААТССССТТССА А...

Шпат шпат

(Г) ..А АССТТТСТССТТСТТАААСТТАААСССССА АССТТ... ...ТТССА ААСАССААСААТТТСААТТТСССССТТССА А...

ЕссШ S3.il

(Л) ..С ААТТСТАТСТССТТСТТАААСТТАААСС ТССАС... ...СТТАА САТАСАССААСААТТТСААТТТССАССТ С...

ЕсоШ 5аЛ

(е) ААТТСТТТАСАССААСААТТТСААТТТС ТССАС...

...СТТАА САААТСТССТТСТТАААСТТАААСАССТ С...

ЕсоШ ЕсоИ1

{ж1) ...ТААТАС ААТТСАСААССАСААСТТААСССААСАСС ААТТС... ..АТТАТСТТАА СТСТТССТСТТСААТТСССТТСТССТТАА С...

Ее оЯ1 ЕсоК1

(ж2) ...СТТССв АЛТТСАСАЛССАСАЛСГТАЛСССААСАСС ААТТС... ...САЛСССТТЛА СТСТТССТСТТСААТТСССТТСТССТТАА С...

ЕсоШ ЕсоМ

(31) ...ТДАТА ААТГССГСТТСССТТАЛСТТСТССТТСТС ААТТС... ...АТТАТСТТАА ССАСААСССААТТСААСАССААСАСТТАА С...

Есо!и ЕсоШ

(з21...СТТССв ААТТССТСТТСвСТТААСТТСТССТТСТв ААТТС... ...СААСССТТАА ССАСААСССААТТСААСАССААСАСТТАА С...

НЬЫ

аJhЛpsJ

.Пйз

Ив5Г

ИЗ

Иерг

И 3

11ерв2

(и) .ПЛЬэерг

Ира! ШпНИ ЕсоШ ЕсоК!

...втт . ААСТТСТССТТСТАССССТА АССТТ..С ААТТСАСААССАСААСТТААСССААСАСС ААТТС ...САА. ТТСААбАССААСАТССССАТТССА Л..СТТАА СТСТТССТСТТСААТТСССТТСТССТТАА С

Рис. 4. Схема конструирования рскомбинатных плазмид (аНн/ Укатим саГпы рестриктаз, по которым в гены ИЗ или И За встраивались синтетические олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы, и обозначения полученных генов.

Для этой цели была сконструирована серия плазмид (я) - (и) со вставленными в ген человеческого интерлейкина-3 (¡13) участками, направленно определяющими элементы вторичной структуры в мРНК. В качестве исходных плазмид

были использованы полученные ранее плазмиды pte2il3 (ген il3) и pte2il3ghll (ген ИЗа), отличающиеся друг от друга только отсутствием в плазмиде pte2il3ghl 1 стоп-кодона в конце гена ¡13 и наличием полилинкерной последовательности. Частичная схема ст роения этих плазмид приведена на рис. 1.

Для конструирования плазмид (а) - (к) использовали вставки дуплексов синтетических олигодезоксирибоиуклеотидов, структура которых приведена на рис.4. Сайты соответствующих рестрнктаз, по которым встраивались эти дуплексы, и названия полученных геновврекомбннантиых плазмндах также показаны на рис.4.

Ii результате, на основе плазмиды pte2il3, были получены рекомбинантные плазмиды' (а)-(г), (ж!) и (зI), содержащие вставки (или замены) нуклеотндных последовательностей между сайтами 11/кЛ - ////¡dill (гены ilhhs, ilhhrii ilhhpsl), Wj/idlII (ген ilhs ) и EcoRl (ген ¡13). Плазмиды'(<), е, ж2 и з2), содержащие вставки (или замены) нуклеогидных последовательностей между сайтами EcoRiSall (гены iless и ilesr), EcoRl (гены ilepr и ileps2), получены на основе плазмиды pte2il3ghll. В сконструированных таким образом генах вставки расположены на расстоянии соответственно 48 н. (camHpal), 184н. (сайт Hmi\\\) или 408 н. (сайт EcoKY) от инициирующего кодона.

Полученные плазмиды образуют три группы. В первой группе (плазмиды а, в, г, й, з2) при транскрипции генов ilhhs, ilhs, iless образуются мРНК, содержащие участок размером 21 н. (структура s), комплементарный структуре в нетранслируемой ветви mTIR, включающей последовательности SDh UB; в случае генов ilhhpsl и ileps2 участки комплементарное™ (структуры psi и ps2) существенно меньше (12 н.) (см. рис. 5).

Вторую, контрольную, группу образуют исходные плазмиды с генами ИЗ (нлазмндар!е2ПЗ) и ¿У3д(1шазмпда pte2il3ghll), мРНК которых не содержит участков, способных комплементарно взаимодействоват ь с SD и UB. К этой группе относится также плазмида (6) с укороченным геном ИЗ (отсутствует фрагмент гена между сайтами НрсА и Hinû\\\), контрольная в отношении других плазмид с укороченным геном ИЗ (плазмиды а, в, и).

В третью группу входят плазмиды (о), (е) и (ж2) с генами ilhhr, ilesr и ilepr, которые содержат трансвертированные последовательности вставок (по сравнению с плазмидами а, д и з2)\ в мРНК таких генов также не содержится комплементарных TIR участков (см. структуры г 1,г2 ирг на рис. 5).

f 5 Г I. К L H IJIIOUClJUllUGUiaiGMJl (TJClJCOTKimUlGIlOUK (s)

Рис. 5. Схемы мРНК транскрибируемых с генов рекомбинаитных плазмид (а)-(и). Обозначен участкок SD, а также структуры участков (s) (straight, прямая, комплементарная), (г I) и (r2) (reverse, обращенная, некомплементарная), (ps I) и (ps2) (partial straight, частично прямая, комплементарная), (pr) (partial reverse, частично обращенная, некомплементарная). Указано расстояние между SD и участками мРНК, соответствующих синтетическим вставкам в плазмидах. Приведены аминокислотные последовательности, соответствующие участкам транслируемых мРНК.

Следует отметить, что на уровень экспрессии могло оказывать влияние разное количество целевого транскрипта в клетках продуцентов с разными плазмидами. Однако, когда мы сравнили количество мРНК, синтезированной после индукции транскрипции, оказалось, что оно для разных продуцентов остается примерно одинаковым. Таким образом, изменение в уровне экспрессии соответствующих генов зависит главным образом от эффективности процесса трансляции.

Мы полагали, что в мРНК генов первой группы может возникать вторичная структура, включающая комплементарное взаимодействие нетранслируемой ветви mTIR и дистальных районов транслируемой части, что должно приводить к снижению эффективности инициации трансляции. Следовательно, уровень экспресин первой группы генов должен быть существенно ниже уровня экспрессии контрольной второй группы генов.

Действительно, из приведенных в таблице дашзых видно, что уровень экспресии группы генов (плазмиды а, в, г, д) ниже, чем в контроле (плазмиды pte2il3, pte2ilghl 1 и б), хотя абсолютные значения уровней экспрессии для разных генов в пределах одной группы сильно отличаются. В общем, наблюдается ослабление влияния на уровень

scnpcccmi генов комплементарное™ участков в исследованных структурах мРНК ри увеличении расстояния между ними. Возможно, это происходит вследствие того, го при трансляции мРНК с достаточно удаленными друг от друга комплементарными часткамн рибосома успепает образовать иншшаторный комплекс с TIR в той части юлекул мР1 IK, транскрипция которых еще нечавершена.

'яблиня. Ицдунированнмн биосинтез белков на мРНК, инициированных с промотора

XI.

>кспрессионная плазмнда Ген Содержание белкового продукта (%) в тотальном лизате штамма-продуцента Е. coli BL21 (DE3)

(о) ilhhs <1

(б) ilhhr >25

(в) ilhhpsl <1

(г) JIM 5

(д) Hess 15

(е) ilesr -1

(ж1) ИЗ • 25

(ж2) ilepr <1

М) ИЗ 25

<з2) ileps2 25

(«) ilhhsepr

pte2H3 ИЗ 25

ple2H3ghU И3a 25

4w касается плазмид с генами третьей группы, то необходимо отметить, что ie все наблюдаемые эффекты могут найти простое объяснение только в отсутствии сомплементарности niTIR с дистальиыми участками мРНК. Так, если участок, товторяюшнй сайты UB и SD, находится в начальной части гена (плазмнда б), то жспрессия гена, как и ожидалось, очень высока. Однако, введение той же тослслогатсльности вблизи терминирующего кодона (плазмиды е и ж2) с появлением !рпппшиновых кодонов AGA и AGG (см. рис.5) приводит к резкому падению уровня жспрессии. В то же время, в плазмиде (ж1), содержащей тот же структурный элемент, по и плазмида (ж2), но находящийся после терминирующего кодона, уровень жспрессии гена ИЗ был очень высоким. Поэтому мы предполагаем, что ингабирующее влияние такой последовательности в дисталыюй области мРНК сказывается в первую эчередь на процессе элонгации, а не на инициации трансляции.

С целью использования найденных зависимостей для конструнрова! экспрессиоьных плазмнд, мы изучили возможность повышения уровня экспрес гена за счет конкурентного подавления в нем комплементарного взаимодейсп в структурной части гена и T1R. Для этого мы сконструировал» плазмнду (и), структура аналогична структуре плазмиды (в) с ограниченным участк комплеменгариости сTlR ( 12 н.) между сайтами рестрикгаз //pal и //miilil, но содерл после терминирующего кодона вставку но сайту EcoRl, способную комплементарному взаимодействию с участком размером 23 н., включающим в с«. 12-членный фрагм ситИра\-Иi/idl I1 (см.рис. 6).

Таким образом, в плазмиде (и) эффект комплементарного взанмодейств структурного гена с TIR'Mor бы конкурентно подавляться. Оказалось, однако, ч уровень экспрессии генов в этих плазмидах отличается лишь незначительно (с таблицу), что вновь указывает на ослабление комплементарных взаимодсйств>н удалением соответствуюшихучастков вмРНК

Таким образом, путем сравнения уровней экспрессии in vivo генов показа! что комплементарные взаимодействия TIR с удаленными участками кодирующей час мРНК влияют на процесс трансляции. При этом эффективность комнлементарш взаимодействий уменьшается с увеличением расстояния между взаимодействующш областями и районом RBS, а вторичная структура, образованная TIR и близ расположенным участком мРНК, оказывается более стабильной, несмотря на налмч вмРНК участков, способных образовывать энергетически более выгодные струкггу[ с этими элементами.

Комеipyiiponaiinc плязмндных векторов для достижения высокого уровня экспрессии i ciion, клоимропяниых в Escherichia coli

Изложенные выше результаты послужили основой для конструирования рпн илазмидных векторов, обладающих эффективными регуляторными элементами >анскрипшш и трансляции и обеспечивающих высокий уровень экспрессии генов .•комбинаггпшх белков в Е. coli.

В качестве исходных были использованы конструкцш тшмкдр(е2йЗ nptoteil3. плазм нде ptoleil3 транскрипция гена ИЗ находится под контролем нескольких томоторов (Р8 фага fd, Ptac и Pt7 гена 10 фага Т7), что позволяет использовать в 1ансляшш мРНК, инициированные с разных промоторов и, следовательно, гличающиеся по структуре нетранслируемоп области. Прн этом возможно выборочное :польчовапие конститутивного или индуцируемого синтеза в различных штаммах Е. ?//'. 11а основе нлазмцды p(o!eil3 нами была сконструирована плазмила pl3i!3, в которую качестве усилителя трансляции (по сайтам Asull и £eoRV) была вставлена структура Е с сайтом UB3. В наших конструкциях мы использовали также эффективный г-езависимый терминатор транскрипции фага fd.

С целью использования вплазмндерШЗ сайта рестрнктазмМ/е!, CATATG, ля введения п клонируемый ген инициирующего кодона, п структуре полученной из ее новой плазмиле pI3il3d второй сайт NdeI, содержащийся в области между сайтами естриктаз BglI и BglU, был удален. Для этой цели была проведена замена фрагмента 'glMBglU соответствующим фрагментом из ранее полученной плазмиды pfpcpll. В оследней в области за сайтом Bg/II был делегирован участок между сайтами рестриктаз 'deI и BglU, образовавшиеся липкие концы затуплены с помощью ДНК-полимеразы !ленова; в Полуниных после лигировання плазмидах регенерирован сайт Bgh\, но TCVTCTRyeT в смежной области сайг NdeI.

Конститутивный синтез мРИК п плазмидах ptc2il3, plotcil3 и pl3i!3 сушсствляется под контролем промотора Р8 фага fd. Еще одной конструкцией с онститутивным синтезом мРНК является получепный нами новый вектор с |ромсггорамиР1 и Р2 тепаггпВЕ. coli - плазмида ргтп¡13. Эта плазмида была получена результате рекомбинации плазмиды pte2il3 и плазмвды рпп2 и в ней также достигался ысокий уровень экспресии гена.

Использованные структурные особенности делают новые плазм ндные векторы, [рактичсски универсальными для достижения высокого уровня экспрессии

рекомбинантных белкой.

Для создания плазмидных векторов, пригодных для достижения высокого уровня экспрессии низкомолекулярных пептидов в составе гибридов с белком-носителем, мы использовали в качестве исходных плазмиды, в которых таким белком-носителем служил бы шп ерлейкин-З или его М-концевой фрагмент. С ч ти целыо была изменена структура С-концевой части гена ¡13 в шазмиде р!е2ПЗ так, чтобы устранить терминирующие кодоны перед сайтом рестриктазы £соШ:

рТЕ2И 3 pTE2.il Зд

Б I. А I Г ТегТег 3 Ь А I Г Е • Е'

...ТСТСТСССТАТСТТСТААТАСААТТС... ...ТСТСТСССТАТСТТССААТТС...

ЕсоК! /-',м[<1

В полученную таким образом плазмиду pte2il3g далее встраивали по сайту рестриктазы EcoRl олигопуклеотидный дуплекс (hi), имеющий одинаковые липкие концы. В полученных плазмидах вставка происходила в двух ориентациях н соотвегствуюшне векторы были названы pte2il3ghll и pte2il3gli!2

I) полученных векторах был клонирован ряд генов гибридных белков с высоким уровнем экспрессии. Ь'олее подробно схемы конструирования и клонирования этих гибридных генов изложены ниже.

Конструирование экспрессионных илазмид с генами рекомбинантных белков и

достижение высокого выхода биосинтеза этих белков. I. Гекомбннапшыебелки, включающие структуры ценен Л и В эктатомина.

Эктатомин - низкомолекулярный белок (А/г 7928 Да), выделенный в 1994 г. из яда муравья Ectatomma tuberculatum, отвечающий за основной токсически!! эффект яда для млекопитающих и насекомых. Он состоит из двух высокогомологичных иолипен гидных цепей, А и В, соединенных одной днеульфидной связью:

GVffKKIWETVCPTVHPWAKKCSODIATVlKRECGK I. (А)

WSTTVKLTXCPTLKSMAKKCEGSIATMIKKKCDK (В)

w: л \ а \т гт г.» •.глллгсг.ттегг г <;мччггт а ^

пт7ттл<, кп< rrrrt:t \.\\гх:<:г.ст<:г/ л «ттс-семтсс,\ттстп*гг.ас..\ссл<-го7аасс.аТпгатстаатттыгсТТагыг'СТТсг. \г;лтг. -1-1-1-1

ImR Tli

"СТГТАСТЛТГСГ TBl

У ГТ'-.'Г (f'TTV

КТЛ5

[ГС*Г.\Т( ( »ir.l.K ,

A'fil

-V СТТГГПАГ Ш~ГГ.ТГГ*ТТ<ГЛТ1:1.

КТВ5

1с. 7. Схема сборки искусственных генов 1охА и Ю.хВ из иптезокснрнбопуклсот1щовТЛ1-ТЛ8иТВ1-ТВ8 соответственно; приведены также 1аймеры. использованные для ПЦР, и указаны сайты узнавания рестриктаз.

л

Детальное исследование молекулярного механизма порообразования и 1анспорта через клеточную мембрану под воздействием токсина требует ¡пользования значительных количеств эктатомина, выделение которого из шродиого источника затруднено. В связи с этим мы предприняли разработку метода ¡лучения рекомбннантного эктатомина и ряда его структурных аналогов путем зкробиочогического синтеза.

С эти целью мы осуществили химико-фермеша! пвный сишсз ivhob непей и U эктатомина (ГохЛ и loxB) из олигодезоксирибонуклсотидов TAI-TA8 и ТВ1-В8, соответственно, как это изображено на схеме (рис. 7).

Для препаративного получения этих генов и введения различных сайтов •стринми и кош iéi>i.ienocjic;ioiiaicjii.Hociti проводили! IIII* с пирами npiiítMC|Kiii TA I, ТА 5 и ПИ, КТВ5 11оскольку аминокислотные последовательности цепей А и В етатомина не позволяют применять малоспецифичные протенназы для отщепления гих полниептндов от рекомбннантноп) белка, мы модифицировали векторные пазмиды. введя в них участки, кодирующие сайт специфической Протеиназы -ттсроиатишы, DODDK. В качсстпсвектора использовали плазчилу ptc2il3ghl2 с :иом интсрлеикнПа-З. Чтобы повысить долю целевого полипептида в гибридном елке, мы использовали в качестве белка-носителя только N-концевой 63-звенный рагмект человеческого ннтерлейкина-З. Ранее такой подход обеспечил высокий

уровень продукции гибридного белка ILÜX3, включающего триме) окситоциноиллизина. С этой целью в векторную плазмиду pte2il3ghl2 были встроен! (по сайтам НтИШКргЛ) синтетические адаптеры EL-Аи EL-B, в которых имеютс: также сайты узнавания рестриктазы Espi\, позволяющие присоединять сшггст ически гены так, чтобы кодоны N-концевых целевых полинентидов были свизат неносредствешю с кодоном лизина в сайге эшеропелтндаш.

/iinDIII D D D D К Esp3l КрпI

(EL-A) 5' AGCTTTTGACGATGACAAGGGTGAGAGACGGGTAC 3' AAACTGCTACTGTTCCCACTCTCTGCC

¡1 i ;/!> I I J D 1) D D К KspTI h'/wl

(ЕЛ.-Ii) V AGlirrnmCGATGACAAGTGGTGAGAGACGGGTAC (' AAACTGCTACTG'l'TCACGACTCTCTGCC

11рн вставке адаптеров EL-A и EL-B в плазмиду plei)3ghl2 по сайгам узнаванш рестриктаз Hindi 11 и Крп\ одновременно происходила деления последовательности кодирующей С-концевой участок шггерлейшна-З и были получены шешши.ш.к векторные плазмиды pteileA и pteileB.

В результате клонирования генов ЮхА и 1охВ в полученных векторах удалос1 выделить клоны, содержащие плазмиды piletoxA и piletoxB с желаемой структуроГ генов рекомбинантных белков 1LETOXA и 1LETOXB.

Однако в этих случаях нам не удалось получить продуценты с достаточно высоким уровнем экспрессии генов. Следует отметить, что при пересевах полученных штаммов продуцентов наблюдалось быстрое снижение уровня экспрессии - по-видимому, вследствие выброса плазмид или их рекомбинационных перестроек. Мы полагаем, что наблюдаемые явления связаны с токсичностью рекомбинантных белков для клеток Е. coli, если они не полностью агрегируют в тельца включения.

'Значительно более эффективным оказалось использование в качестве белк-, носителя полиоразмерной последовательности иитерлейкина-3. Для этого гены tox/l > toxB вместе с участком, кодирующим сайт эптеропептидазы, были амплифицировань пугем ПЦР с праймерами 1LTA1/1LTA2 и 1LTB1/ 1LTB2 на плазм идах piletoxA и piletoxE и клонированы в векторе pte2i!3ghl 1 по сайтам £со RI и Sali.

Лс-uRI

ILTA1 5' CCGGAATTCGACGATGATGACAAGGGTG 3' SulI

ILTA2 5' CCCGTCGACTACCTAGAGCTTCCCGCATTCCC 3' /:VoRI

ILTB1 5' CCGGAATTCGACGATGATGACAAGTGGT 3' Su/1

ILTB2 5' CCCGTCGAC1TATTTGTCGCATTTCTTC 3'

В результате были получены экспрессионные нлазмвды pil3etoxA и pil3etoxB, которые обеспечили высокий уровеньпродукции рекомбинантных белков IL3ETOX-A и IL3ETOX-B. Штаммы полученных продуцентов оказались устойчивыми при многократных пассажах.

2. Рекомбннантнын белок 1L3VKA со структурой антигенной детерминанты Plasmodium falciparum.

Малярия, в особенности вызываемая Plasmodium falciparum, является одним пз самых тяжелых паразитических заболеваний человека. Поиск вакцины против малярии был начат 60 лет тому назад, й настоящее время наиболее интересными представляются вакцины на основе антигенов бесполой стадии. Первой подобной вакциной, проверенной на человеке, явился химерный полипептид SPf66. Было показано, что SPf66 является эффективной вакциной против малярии. Мономерной единицей этого полнпептида является химически синтезированный пептид из 45 аминокислот (Л), который включает аминокислотные последовательности трех белков бесполой стадии (83, 55 и 35 кДа), соединенные последовательностями из circum-спорозоидного белка (85 кДа) Plasmodium falciparum.

CGDELEAETENVYAAPNANPYSLFEKEK.MVLPNANPPANKKNAGC (А)

В нашей разработке мы исходили из предположения, что более эффективными вакцинами могут явиться рекомбинантные растворимые белки, в которых последовательность мономерной структурной единицы SPf66 (иначе - pfa, Plasmodium falciparum antigen) может быть повторена несколько раз. Кроме того, в структуре рекомбинантных белков мы считали целесообразным использовать иммунологически компетентные эпитопы, которые могут стимулировать протекгивный иммунный ответ.

С этой целью мы осуществили конструирование рекомбинантных вакцин на основе человеческого интерлейкина-3. Поскольку активный центр, ответственный за взаимодействие с лейкоцитами, расположен в С-концевой половине шгтсрлейкина-3. для конструирования гибридов с рГа мы использовали векторную плата иду pteiBghl I, содержащую полную нуклеотидную последовательность гена интерлейкина-3 и полнлинкер, позволяющий присоединять к С-концу белка-носителя аминокислотные последовательности aimi генов.

EcoRI

5' CGGAATTCTGCGGTGACGAACTGGAAGC

5' TTCTGCGGTGACGAACTGGAAGCTGAAACTGAGAACGTTTACGCTGCTCCGAACGCT

CCGTACTCTCTGTTCGAGAAAGAAAAGATGGTTCTGCCGAACGCTAACCCACCGGCT AACAAAAAGAACGCTGGCTGCTAATAGTCGAC 3'

3' CTTGCGACCGACGATTATCAGCTGCG 5' Sail

Рис. 8. Последовательность синтетической матрицы pfa и праймеров для получения искусственного гена с помощью ПЦР. Структуры олигонуклеотидных праймеров расположены на схеме против шшгпршмх или комплементарных участков нуклеотидных последовательностей. Указаны сайты рестриктаз, использованных для расщепления и последующего клонирования.

Для получения гена pfa мы применили видоизмененный нами быстрый способ синтеза, который заключается в проведении ПЦР на однонитчатои матрице, содержащейся в смеси олнгодезоксирнбопуклеотидсв по окончании автоматического синтеза (рис. 8). При таком способе синтеза возникало знач1гтелыюе число мутационных изменений в синтетическом гене. Однако, после клонирования, мы смогли выделит!, клоны, содержащие искусственный ген с интактной нуклеотидноп последовательностью.

Полученный этим способом 156-членный дуплекс после расщепления рестриктазами £coRl и Sail мы клонировали в гътазмиде pteil3ghl 1. В результате была получена экспрессионная плазмида pteiBpfa и на ее основе - штамм-продуцент, в котором гибридный белок IL3PFA был получен с высоким выходом в тельцах включения. Очистка нерастворимых телец включения легко достигалась при отмывке буферными растворами с детергентом, и, после солюбилизацш! в присутствии смеси окисленного и восстановленного глутатионов, белок был реналурирован. Таким образом мы получили первый представитель семейства потенциальных вакцин, структура которого приведена на следующей странице:

1 МАРМТОТТБЬКТЗИУЫСБММЮЕИТНЬКОРРЬРЬЬОГЫМЬМСЕОООЬМЕМЫЬЯКРЫЬЁ 1 АГМНАУК5ЬОНА5А1Б51ЬКМЬЬРСЬРЬАТАЛРТКНР1Н1КОООЯЫЕГНККЬТГУЬКТЬЕ 1 КАОЛООТТЬ?1.А1ГЕГССПЕ1,ЕАЕТЕМУУАЛРЫАЫРУ5ЬГЕКЕКМУЬРНАНРРАНККНАСС

3. Рскомбипаитный белок 1ШХ4, содержащий тетрамериуго последовательность окситоциня.

Пептидный гормон окситошш вырабатывается в человеческом организме росекреторнымн клетками гипоталамуса н накапливается в задней доле гипофиза.

Су5-Туг-11е-01п-Л5П-Су5-Рго-1.еи-С1уЫН2 I \

Б 1 Я

Он стимулирует сокращение гладкой мускулатуры матки и секрецию молока точными железами. Благодаря этому окситошш находит широкое применение в шпине и ветеринарии.

Трудности выделения и очистки природного гормона делают его недоступным. Более перспективным является спо'соб получения гормона кробнологичсским синтезом. Ранее в лаборатории биотехнологии ИБХ уже был гтезирован геитримераскситошиюил-лизина, который был клонирован в плазмиде 1сИохЗ, и на ее основе был получен гибридный белок П.ОХЗ. При ферментативном (ролизе этого белка был получен окситошт. Однако выход гормона был недостаточно соким. Это делало обоснованной новую попытку использовать в биосинтезе Зрпдного белка измененную структуру гена окситошша. Такой ген содержится в тструпрованной нами плазмиде р1еПох4.

Ген теграмера окагтошша, фланкированного остатками лизина, мы получили соответствующих синтетических олигоиуклеотидов путем ферме1Ггативной швки с помощью ДНК-лш азы с векторными фрагментами в три этапа. Источником рвого векторного фрагмента служит плазмидная ДНК р!е2ПЗ, кодирующая повеческий ннтерленкин-3. Источником второго векторного фрагмента служит азмила р1е2]|3£Ь11.

Рекомбинантную плазм иду р1с2НЗ расщепляли эндонуклеазами НМ\ И и £соЮ, лученный фрагмент лигаровали с первым синтетическим //шс)111/ЕсоЯI-фрагментом, держащим ген лимера окситоцина (дуплекс А, рис. 9).

Hlíidlli (А) £оЫ

agctaaatgctacatccagaactgcccgctgggtaaatgttatattcagaattgtccgctgggcaaggtcg

tttacgatgtaggtcttgacgggcgacccatttacaatataagtcttaacaggcgacccgttccagcttaa

<D)

gctacatccagaactgccc

£coBI (B) SdJl

AATTCAAGTGrTACATCCAGAArrGCCCGCTGGGTAAATGCrACATCCAGAACTGCCCGCTGGGCAAGTAATAG

gttcacaatgtaggtcttaacgggcgacccatttacgatgtaggtcttgacgggcgacccgttcattatcagc1

(C)

gggcaaggtcgaattcaagtg

l'iic. 9. Синтетические олигопуклеотщшые дуплексы и зонды, исполь зованные ир

получении илазмид pleilox2 и pteil3ox2

Полученной лигазной смесыотрансформировали клетки Е. coli Hl.21 (Dili и клоны, содержащие ллазмидур1еЛох2, отбирали гибридизацией колоний insiiii с ,21 меченым олигонуклеитидом D. Г) результат была получена рекомбнпантная iuia змш pteilox2.

Вторую векторную плазмнду pte2i!3ghl I расщепляли эндонуклеазами ¿col и Sali, полученный фрагмент лигировали со вторым синтетическим EcoRl/Sal фрагментом, содержащим ген димераокситоцина (дуплекс В, рис. 9).

Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli BL21 (DE3 и клоны, содержащие плазмиду pte¡13ox2, отбирали гибридизацией колоний in situ "Р-меченым олигонуклеогвдом С. В результате была получена решмбшшгпш плазм и; pteiJ3ox2.

Обе рекомбинантные плазмидные ДНК, pteilox2 н pIe¡13ox2, расщеплял рестриктазами EcoRI и EcoKV и выделенные после электрофореза в агарозном rej фрагменты (из нлазмйды pteilox2-малый, 255 п о., из плазмиды pte¡I3ox2 - большо! 3058 и.о.) лш провали, В результаге была получена рекомбннантная плазмида pleilox Биосинтез белка 1LOX4 в клетках продуцента Е. coli BL21 (Dli3 ) pteilox протекал в равной степени эффективно как после шщукцин HI ГГГ, так и без индукшы и достигал уровня 30% тотального белка клетки.

]!ы иолы

1. 11оказано, что максимальный уровень экспрессии гена достигается в плазмидах, участки TIR которых характеризуются не только последовательностями вблизи шннинруюшего кодоиа (в позиции до-30 п.), но и более отдаленным участком (до-60 г), который влияет на уровень экспрессии, и что контакты мР11К с 30S частицей рибосомы ia стадии образования иншшагорного комплекса охватывают существенно больший район, тем это предполагалось ранее

Проведен компьютерный анализ структур возможных сайтов связывания цнсталыюй и проксимальной части последовательности mTlR с петлями 16S pl'l 1К и выявлен ряд участком в д неталы юн час™ mTIR мРНК, способных к комплементарному взаимодействию

Получены рекомбинантные плазмиды с синтетическими участками ш'ПК, комплементарными рассчитанным сашам в 16S рРНЬС, обеспечивающие высокий уровеш. экспрессии! сна.

2.I ¡оказано, что комплементарные взаимодействия T1R с удаленными участ ками кодирующей части мРНК непосредственно влияют на процесс трансляции. При этом эффективное!'т. комплемент арных взаимодейст вии уменьшается с увеличением расстояния между взаимодействующими областями и районом К В S. Вторичная структура, обраювапная II К и близко расположенным участком мР1 Доказывается более стабильной, несмотря на наличие в мРНК участков, способных образовывать энергетически более выгодные структуры с эшмн элементами.

3. Сконструирована серия нлазмидных векторов, обладающих универсальной конструкцией для достижения высокого уровня экспрессии в Е. coli клонированных генов.

4. Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в Е. coli искусственных ДНК, кодирующих гены цепей А и В токсина эктатомина, антигенной детерминанты малярийного плазмодия, тетрамера окситоциноил-лнзнна.

5. Получены штаммы-продуценты, обеспечивающие высокий уровень продукции следующих рекомбинаптных белков:

IL3ETOX-A и IL3TOX-B, представляющих собой гибриды человеческого интерлейкина-3 и цепей А и В токсина эктатомина;

Потенциальной искусственной противомалярийной вакцины IL3PFA, представляющей собой гибрид человеческого щггерлейкина-3 и антигенной детерминанты малярийного плазмодия;

1L30X4, представляющего собой гибрид N-концевого фрагмента человеческого интерлейкииа-3 и тетрамера окситоциноил-лизина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Гуревич А. И. , Р. С. Есипов, Т. А. Качалина, А. Л. Каюшин. Зависимость уровня экспрессии гена в Е. coli от структуры участка инициации трансляции (TIK) I. Первичная структура TIR. Биоорган. лгилшя(1995)т. 21, 117-123.

2. Гуревич А. И., Есипов Р, С, Качалина Т. А., Каюшин А. Л., Коростепева А/. Д.-Зависимость уровня экспрессии гена в Е. coli от структуры участка инициации трансляции (TIR). II. Вторичная структураTIR. Биоорган, химия (¡995), т. 21,282-288.

3. Гуревич А. II., Есипов Р. С, Каюшин A. JI. Подходы к получению биологически активных коротких рекомбинанпшх пептидов в Е. coli. Тезисы докладов научной сессии, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Н А.Преображенского. Москва, 1996. С.85.

4. Есипов Р.С., Качалина, Т. А., Гуревич А. И. Новые плазмияные векторы для получения высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia coli. Второй съезд биохимического общества РАН, тезисы стендовых сообщений, Москпа (1997), 496-497.

5. Есипов Р. С.. Гуревич А. И.. Каюшин А. Л., Коростепева М Д., Мироишнков А. И., Шевченко Л. R., Плужников К. А., Гришин Е. В.. Рекомбинантныс белки, содержанию аминокислотные последовательности двух цепей эктатомина Биоорган, химия (I997J, т. 23,949-952.

6. Гуревич А. И., Есипов Р.С., Качалина Т. А., Каюшин А. Л., Коростелева М. Д.. Зависимость уровня экспрессии гена в Е. coli от структуры участка инициации трансляции (TIR). Ш. Сайты комплементарного взаимодействия TIR с I6S рРНК. Биоорган, химия (1997) т. 23, 888-894.

7. Гуревич А. И., Есипов Р. С, Каюшин А. Л., Коростелева М. Д. Получение некоторых искусственных генов методом 11ЦР на синтетической матрице. Биоорган, химия (1997), т. 23,492-496.

8. Есипов Р. С.. Гуревич А. И., Каюшин А. Л., Коростелева М. Д., Белова М. А, Зависимость уровня экспрессии гена в Е. coli от структуры участка инициации трнсляшш (TIR). IV. Дальние комплементарные взаимодействия TIR с кодирующей частью мРНК. Биоорган, химия (1999) т. 25, 562-567.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Есипов, Роман Станиславович

Выводы

1. Показано, что максимальный уровень экспрессии гена достигается в плазмидах, участки TIR которых характеризуются не только последовательностями вблизи инициирующего кодона ( в позиции до -30 н.), но и более отдаленным участком (до -60 н.), который влияет на уровень экспрессии, и что контакты мРНК с 30S частицей рибосомы на стадии образования инициаторного комплекса охватывают существенно больший район, чем это предполагалось ранее.

Проведен компьютерный анализ структур возможных сайтов связывания дистальной и проксимальной части последовательности mTIR с петлями 16S рРНК и выявлен ряд участков в дистальной части mTIR мРНК, способных к комплементарному взаимодействию.

Получены рекомбинантные плазмиды с синтетическими участками mTIR, комплементарными рассчитанным сайтам в 16S рРНК, обеспечивающие высокий уровень экспрессии гена.

2. Показано, что комплементарные взаимодействия TIR с удаленными участками кодирующей части мРНК непосредственно влияют на процесс трансляции. При этом эффективность комплементарных взаимодействий уменьшается с увеличением расстояния между взаимодействующими областями и районом RBS. Вторичная структура, образованная TIR и близко расположенным участком мРНК, оказывается более стабильной, несмотря на наличие в мРНК участков, способных образовывать энергетически более выгодные структуры с этими элементами.

3. Сконструирована серия плазмидных векторов, обладающих универсальной конструкцией для достижения высокого уровня экспрессии в Е. coli клонированных генов.

4. Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в Е. coli искусственных ДНК, кодирующих гены цепей А и В токсина эктатомина, антигенной детерминанты малярийного плазмодия, тетрамера окситоциноил-лизина.

5. Получены штаммы-продуценты, обеспечивающие высокий уровень продукции следующих рекомбинантных белков:

1ЬЗЕТОХ-А и 1ЬЗТОХ-В, представляющих собой гибриды человеческого интерлейкина-3 и цепей А и В токсина эктатомина; потенциальной искусственной противомалярийной вакцины 1ЬЗРРА, представляющей собой гибрид человеческого интерлейкина-3 и антигенной детерминанты малярийного плазмодия;

1ЬЗОХ4, представляющего собой гибрид 1Ч-концевого фрагмента человеческого интерлейкина-3 и тетрамера окситоциноил-лизина.

Благодарности

Автор благодарен А. Л. Каюшину и М. Д. Коростелевой за синтез олигонуклеотидов, К. А. Плужникову и Л. В. Шевченко за иммуноблоттинг рекомбинантных белков 1ЬЗЕТОХ-А и ГЬЗТОХ-В, М. А. Беловой за помощь при проведении экспериментов, И. В. Бони и В. Г. Коробко за плодотворные обсуждения.

1П0

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Есипов, Роман Станиславович, Москва

1. Ochoa S., Mazumder R., Polypeptide chain initiation., in: Enzymes (ed. Boyer P), Acad. Press, N. Y . (1974) p 1-52.

2. Gouy M, Gautier C. Codon usage in bacteria: correlation with gene expressivity. Nucl.Acids Res. (1982) v.10, 7055-7074.

3. Sharp P.M., Li W.-H. An evolutionary perspective on synonymous codon usage in unicellular organisms. J.Mol.Evol. (1986) v.24, 28-30.

4. Sharp P.M., Li W.-H. The rate of synonymous substitution in enterobacterial genes is inversely related to codon usage bias. Mol.Biol.Evol. (1987) v.4, 222-230.

5. Shields X.C., Sharp P.M. Synonimous codon usage in Bacillus subtilis reflects both translational selection and mutational constraints. Nucl Acids Res. (1987) v.15, 8023-8040.

6. BulmerM. Are codon usage patterns in unicellular organisms determined by selection-mutation balance. J.Evol.Biol. (1988) v. 1, 15-26.

7. Post L.E., Strycharz G.D., Nomura M., Lewis H., Dennis P.P. Nucleotide sequence of the ribosomal protein gene cluster adjacent to the gene for RNA polymerase subunit P in Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1979) v.76, 1697-1701.

8. Sharp P.M., Devine K.M. Codon usage and gene expression level in Dictyostelium discoideum : highly expressed genes do «prefer» optiman codons. Nucl. Acids Res. (1989) v. 17, 5029-5039.

9. Grantham R., Gautier C., Gouy M. Codon frequences in 119 individual genes confirm consistent choices in degenerate bases according to genome type. Nucl.Acids Res. (1980) v. 8, 1893-1912.

10. Grantham R., Gautier C., Gouy M, Jacobzone M., Mercier R. Codoncatalog usage is a genome strategy modulated for gene expressivity.Nucl.Acids ^.(1981) v.9, 43-74.

11. Wang H., Omahony D.J., McConnel D.J., Qi S.Z. Optimization of thesynthesis of porcine somatotropin in Escherichia coli. Applied Microbiol Biotechnol. (1993) v. 39, 324-328.

12. Nassal M., Mogy Т., Kurnik S., Khorana H.G. Structure-finction studieson bacteriorhodopsin. J.Biol.Chem. (1987) v. 262, 9264-9270.

13. Ernst J. F., Kawashima E. Variation in codon usage are not correlated withheterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae and Eschericha coli. J.Bacteriol. (1988) v.7, 1-10.

14. Curland C.G. Codon bias and gene expression. Minirewiew. FEBS Lett.1991) v.285, 165-169.

15. Гурский Я.Г. Маримонт Н.Ю., Шевелев А.Я., Южаков А.А,

16. Бибилашвили Р.Ш. Редкие ко доны и экспрессия генов в Escherichia coll Мол.биол. (1992) т.26, 1063-1079.

17. Lang А., Fri.em.ert С., Gassen Н. G.On the role of the termination factor

18. RF2 and 16S RNA in protein synthesis. Eur. J. Biochem. (1989) v.180, 547-554

19. Brown C.M., Stockwell P. A., Trotman C.N.A., Tate W. P. The signal fortermination of protein synthesis in procariotes. Nucl. Acids ites\(1990) v.18, 2079-2086.

20. Freistroffer D.V., Pavlov M.Yu., MacDougall J., Buckingham R.H.,

21. Ehrenberg M. Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO/.(1997) v.16, 4126-4133.

22. Bjornsson A., Mottagui-Tabar S., Jsaksson L.A. Structute of the Cterminal end of nascent peptide influences translation termination. EMBO J. (1996) v. 15, 1696-1704.

23. Lang F., Gualerzi C.,, McCarthy J.E.G. Ribosomal affinity and translationinitiation in Escherichia coll In vitro investigations using translation initiation regions of differing efficiences rfom the atp operon. J.Mol.Biol. (1989) v.210, 659-663.

24. Ellis S., Conway T.W. Initial velosity kinetic analysis of 30S initiationcomplex formation in an in vitro translational system derived from Escherichia coli. J.Biol.Chem. (1984) v.259, 7607-7614.

25. Sampson L.L., Hendrix R.W., Huang W.M., Casjens S.R. Translationinitiation controls the relative rates of expression of the bacteriophage X late genes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1988) v.85, 5439-5443.

26. Ray P.H., Pearson ML. Functional inactivation of bacteriophage lambdamorphogenetic gene mRNA. Nature (1975) v.253, 647-650.

27. Witmann H.G. Structure, function and evolution of ribosome. Eur. J.

28. Biochem.(1916) v. 61, 1-9.

29. Dahlberg A.E. The functional role of ribosomal RNA in protein synthesis.

30. Cell (1989) v. 57, 525-529.

31. N oiler H.F. Ribosomal RNA and translation. Annu. Rev. Biochem. (1991)v. 60, 191-227.

32. Noller H.F., Woese C.R. Secondary structure of 16S ribosomal RNA.

33. Science (1992) v.212, 403-411.

34. Gutell R.R., Woese C.R. Higher order structural elements in ribosomal

35. RNAs pseudoknots and the use of noncanonical pairs. Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1990) v.87, 663-667.

36. Brimacombe R. RNA-protein interactions in the Escherichia-coliribosome. Biochimie (1991) v.3, 927-936.

37. Malhotra A., Harvey S.C. A quantitative model of the Escherichia coli16S RNA in the 30S ribosomal subunit. J.Mol.Biol. (1994) v.240, 308340.

38. Lata K.R., Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R., Zhu J., Frank J. Three-dimentional reconstruction of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit in ice. J.Mol.Biol. (1996) v.262, 43-52.

39. Eisenstein M., Sharon R., Berkovitch-Yellin Z., Gewitz H. S., Weinstein S.,

40. Pebay-Peyroula E., Roth M & Yonath A. The interplay between X-ray crystallography, neutron diffraction, image reconstraction, organo-metallic chemistry and biochemistry in structural studies of ribosomes. Biochimie (1991) v.73, 879-886.

41. Brimacombe R., Atmadja J., Stiege W. & Schuler D. A detailed model ofthe-dimentionalstructure of Escherichia coli 16S ribosomal RNA in situ in 30S subunit. J. Mol. Biol. (1988) v. 199, 115-136.

42. Moore, P. B. The ribosome returns. Nature (1988) 223-227

43. Tate W., Greuer B. & Brimacombe R. Codon recognition in polypeptidechain termination: site directed crosslinking of termination codon to Escherichia coli release factor 2. (1990) Nucl. Acids Res., v. 18, 65376544.

44. Dontsova O., Dokudovskaya S. Kopylov A., Bogdanov A., Rinke-Appel J.,

45. Junke N. & Brimacombe R. Three widely separated positions in the 16S RNA lie in or close to the ribosomal decoding region; a site-directed cross-linking study with mRNA analogues. EMBO J. (1992) v.l 1, 31053116.

46. Wollenzien P.L., Expert-Bezancon A. & Favre A. Sites of contact ofmessenger RNA with 16S rRNA ans 23S rRNA in the Escherichia coli. Biochemistry (1991) v. 30, 1788-1,795.

47. Olson H. M, Lasater L. S., Cann P. A. & Glitz D. G. Messeger RNAorientation on the ribosome. Placement by electron microscopy of antibody-complementary oligodeoxynucleotide complexes. J.Biol.Chem. (1988) v. 263, 15196-15204

48. Czworkowski J., Odom O. W. & Hadesty B. Fluorescence study of the topology of messenger RNA bound to the 30 S ribosomal subunit of Escherichia coli. Biochemistry (1991) v.30, 4821-4830.

49. Brimacombe R., Mitchell P., Obwald M, Stade K. & Bochkariov, D. Clustering of modified nucleotides at the functional center of bacterial ribosomal RNA. FASEBJ. (1993) v. 7, 161-167.

50. Steitz J.A. Biological Regulation and Development. V.l: Gene Expression. Ed. R.F.Goldberger . N.Y. Plenum Press. 1979. P.349-399

51. Shine J., Dalgarno L. Determination of citron specificity in bacterial ribosone Nature (1975). v. 254, 34-38

52. Walz A., Pirotta V., Ineichen K. Lambda repressor regulates the switch between Pr and Prm promoters. Nature (1976) v.262, 665-669.

53. Galie D. R., Kado C. I. A translational enhancer derived from tobacco mosaic virus is functionally equvalent to Shine-Dalgarno sequence. Proc.Nat.Acad.Sci. USA. (1989) v. 86, 129-132.

54. Loechel S., Inamine J.M., Hu P.-C. A novel translational initiation region from Mycoplasma genitalium that functions in Escherichia coli. Nucl.Acids Res. (1991) v. 19, 6905-6911.

55. Falscher H.P., Geisen R.M., Fuchs E. Only one out of three strong ribosomal binding sites of the early region of bacteriophage T7 exhibits high translational efficiency in fragments of about 30 base pairs. Eur.J.Biochem. (1988) v. 175, 461-465

56. Olsen M.K., Rockenbach S.K., Curry К. A., Tomich C.-S. С. Enhancement of heterogous polypeptide expression by alternations in the ribosme-binding-site sequence. J. Biotechnol. (1989), v. 9, 179-190.

57. Cheynet V., Verrier В., Mallet F. Overexpression of HIV-1 proteins in Escherichia coli by a modified expression vectors and their one-step purification, Prot.Express.Purif. (1993) v.4, 367-372.

58. Schoner В. E., Belagaje R. M., Schoner R.G. Tranlation of synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. (1986) v.83, 8506-8510.

59. Еуревич A.M., Скапцова H.B., Луценко С.В., Смирнов В.А., Куркин А.Н., Ажаев A.B. Химико-ферментативный синтез усилителя трансляции гена 10 фага Т7 и функция элементов его структуры. Биоорган.химия (1991) т. 17, 647-652.

60. Царева Н.В., Музыченко М.Л., Бони И. В. Анализ вторичной струуктуры регуляторной области мРНК гена rpsA Escherichia coli Биоорган.химия (1993) т. 19, 968-976.

61. Mahajna J., Oppenheim A.B., Rattray A., Gottesman M. Translation initiation of bacteriophage lambda gene ell requires integration host factor.J.Bacteriol. (1986)v.l65, 167-174.

62. McCarthy J.E D. Shairer H.U., Sebald W. Translation initiation frequency of atp genes from Escherichia coli: identification of an intercistronic sequence that enhances translation. EMBO ./.(1985) v.4, 519-526

63. McCarthy J.E. D., Sebald W., Gross G., Lammers R. Enhancement of translational efficiency by the Escherichia coli atpE translational initiation region: Its fusion with two human genes. Gene (1986) v.41, 201-206

64. Ol ins P. O., Devine C.S., Rangwala S.H., Kavka K.S. The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosomal-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene (1988) v.73, 227235

65. Suissa M., Altuvia S., Koby S., Giladi H., Oppenheim A. B. Translational signals of major head protein gene of bacteriophage lambda. Mol.Gen.Genet. (1988) v.214, 510-573.

66. Schauder B., McCarthy J. E. D., The role of bases upstream of the Shine-Dalgarno region and in the coding sequence in the control of gene expression in Escherichia coli: Translation and stability of mRNE invivo. Gene (1989) v.78, 59-72.

67. Olms P. O., Rangwala S. H. A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J.Biol Chem. (1989) v.264, 16973-16976.

68. Sprengart M. L., Fatscher H.P., Fuchs E. The initiation of translation in E.colv. apparent base pairing between the 16S rRNA and downsteam sequence of the mRNA. Nucl.Acids Res. (1990) v. 18, 1719-1723.

69. Gold L., Stormo G. Translation initiation. In: Escherichia coli and Salmonella typhimuruim. Edited by F.C.Neidhardt, J.L.Ingraham, K.B.Low, B.Magasanic, M.Schaechter, H.E.Umbarger. Cell.and Mol Biol., Vol.2. Washington (1987), 1302-1307.

70. Gold L., Stormo G., Saunders R. Escherichia coli translation initiation factor IF3: a unique case of translational regulation. Proc.Nat.Acad.Sci.USA (1984) v.81, 7061-7065.

71. Butler J.S., Springer M., Grunberg-Monago M. AUU-to-AUG mutation in the initiator codon of the translational initiation factor IF3 abolished translation autocontrol of its own gene (infC) in vivo. Proc Nat.Acad.Sci.USA (1987) v.84, 4022-4025.

72. Brombach M, Pon C.L. The unusal translational initiation codon AUU limits the exprassion of the infC (initiation factor IF3) gene of Escherichia coli. Mol.Gen.Genet.(\9S7) v.208, 94-100.

73. La Teana A., Falconi M., Pawlik R.T., Spurio R., Pon C.L., Gualerzi C.O. In: Post-Transcriptional Control of Gene Expression. Edited byus

74. J.E.G.McCarthy, M.F.Tuite. Springer-Verlag Berlin Heidelberg (1990), v. H49, 443-453.

75. Gualerzi C.O., Ron C.L. Initiation of mRNA translation in prokariotes. Biochemistry (1990) v.29, 5881-5889.

76. Reddy P., Peterkofsky A., McKenney K. Translational efficiency of Escherichia coll adenylate cyclase gene: mutating of the UUG initiation codon to GUG or AUG results in increased gene expression. Proc.Natl Acad.Sci.USA (1985) v.82, 5656-5660.

77. Kaplan R.,Apirion D. The involvement of ribonuclease 1, ribonuclease 2 and polynucleotide phosphorilase in the degradation of stable ribonucleic acid during carbon starvation in E.coli. J.Biol.Chem. (1974) v.249, 149151.

78. Kinscherf T.G., Apirion D. Polynucleotide phosphorilase can participate in decay of mRNA in E.coli in the absence of ribonuclease II. Mol.Gen.Genet. (1975) v.139, 357-362.

79. Gupta R.S., Schlessinger D. Differential models of chemical decay for early and late lambda messenger RNA. J.Mol.Biol. (1975) v.92, 311318.

80. Belasco J.G., Beatty J.T., Adams C., von Gabain A., Cohen S. Differential expression of photosynthesis genes in R.capsulata results from segmental différencies in stability within the polycistronic rxcA transcript. Cell (1985) v.40, 171-181.

81. Mott J.E.,Galloway J.L., Piatt T. Maturation of E.coli tryptophan operon mRNA: evidence for 3'-exonucleolytic processing after r/zo-dependent termination. EMBOJ. (1985) v.4, 1887-1891.

82. WongH.G., Chang S. Identification of a positive retroregulator that stabilizes mRNA m bacteria. Proc.Nat.Acad.Sci.USA (1986) v.83, 32333237.

83. Plamann M.D., Stauffer G. V. Escherichia coli. mRNA decay: The role of 3' secondary structure and the effects of pnp and rnb mutation?. Mol.Gen.Genet. (1990) v.220, 301-306.

84. Meyer B.J., Bartman A.E., Schottel J.L. Isolation of a mRNA instability sequence that is cis-dominant to the ompA stability determinant in Escherichia coll Gene (1996) v. 179, 263-270.

85. Cisneros B., Court D., Sanchez A., Montanez C. Point mutations in a transcription terminator, Xtl, that affect both transcription termination and RNA stability. Gene (1996) v. 181, 127-133.

86. Hirao /., Yoshizawa S., Miura K. Stabilization of mRNA in an Escherichia coli cell-free translation system. FEBS Lett. (1993) v.321, 169-172.

87. Khan I.M., Coulson J.M. A novel method to stabilize antisense oligonucleotides against exonuclease degradation. Nucl.Acids Res. (1993) v.21, 2957-2958.

88. Yamamoto T., Imamoto F. Differential stability of trp messenger RNA synthesized originating at the trp promoter and Pl-promoter of lambda trp phage. J.Mol.Biol (1975) v.92, 289-309.

89. Sandler P., Weisblum B. Erythromycin-induced stabilization of ermA messenger RNA in Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. J.Mol.Biol. (1988) v.203, 905-915.

90. Nilsson G., Belasco J., Cohen S., Gabain. Growth-rate dependent regulation of mRNA stability in Escherichia coli. Nature (1984) v.312, 75-77.

91. Emory S.A., Bouvet P., Belasco J.G. A 5'-terminal steam-loop structure can stabilize mRNA in E.coli. Genes and Development (1992) v.6, 135148.

92. Schlessinger D., Jacobs K., Gupta R., Kano Y., Imamoto F. Decay of individual E.coli messenger RNA molecules is sequentially ordered. J.Mol.Biol.(1911) v.l 10, 421-439.

93. Cannistraro V.J., Subbarao M.N., Kennel D. Specific endonucleolytic cleavage sites for decay of E.coli mRNA. J.Mol.Biol. (1986) v. 192, 257274.

94. Schmeissner U., McKenney K., Rosenberg M, Court D. Removal of a terminator structure by RNA processing regulates int gene expression. JMol.Biolf 1984) V.176-, 39-53.

95. Portier C.,Dondon L., Grunberg-Monago M., Regnier P. The first step in functional inactivation of the E.coli polynucleotide phosphorylase messenger is a ribonuclease III processing at the 5'-end. EMBO J. (1987) v.6, 2165-2170.

96. Robertson H. E.coli ribonuclease III cleavage sites. Cell (1982) v.30, 669-672.

97. Mudd E.A., Krisch H.M., Higgins C.F. RNAse E, an endoribonuclease, has a general role in the chemical decay of Escherichia coli mRNA: evidence that me and ams are the same genetic locus. Molec.Microbiol. (1990) v.4, 2127-2135.

98. Lundberg U., von Gabain O. Cleavages in 5' region of ompA and bla mRNA control stability and a novel endoribonuclease. EMBO J. (1990) v.9, 2731-2741.

99. Hall M .N., Gabay J., Debarbouille M., Schwartz M.A. A role of the mRNA secondary structure in the control of translation initiation. Nature (1982) v.295, 616-618.

100. Coleman J., Inouye M., Nakamura K. Mutations upstream of the ribosome-binding site affect translational efficiency. J. Mol. Biol. (1985) v.181, 139-143.

101. Munson L. M., Stormo G.D., Niece R.L., Reznikoff W.A. LacZ translation initation mutations. J. Mol. Biol. (1984) v. 177, 663-683.

102. Wikstrom P.M., Bjork G.R. A regulatory element within of ribosomal protein operon of Escherichia coli negatively controls expression by decreasing thetranslational efficiency. Mol. Gen. Genet. (1989) v.219, 381-389.

103. Nivinskas R., Vaiskunaite R. and Raudonikiene A. Expression of Bacteriophage T4 gene 25 is regulated via RNA secondary structure in translational initiation region. J. Mol. Biol. (1993) v.230, 717-721.

104. De Smit M. H. and. Van Duin J. Control of translation by mRNA Secondary Structure in Escherichia coli. J. Mol. Biol. (1994). 244, 144150.

105. McCarthy, J. E. G., Gualezi C. O. Translational control of procariotic gene expression. Trends in Genetics (1990), v. 6, 78-85.

106. Ganoza M., Kofoid E. C., Morliere P., Louis B.G. Potential secondary structure at translation initiation sites. Nucl. Acids Res. (1987) v. 15, 345360

107. Scherer G. F. E., WalkinshawM. D., Morre D. J. The ribosomal binding sites recognized by E.coli ribosomes have regions with signal character in both the leader and protein coding segment. Nucl. Acids Res (1980), 8, 3895-3907

108. Stormo G., Schneider T. D., Gold L, Characterization of translation initiation sites in E.coli.Nucl. Acids Res. (1982) v.10, 2971-2996.

109. Schneider T. D., Stormo G. D., Gold L., Ehrenfeucht A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol (1986) v.188, 415-431.

110. Dreyfus M., What constitutes the signal for the initiation of protein synthesis on Esherichia coli mRNA. J. Mol. Biol. (1988), 204, 79-94.

111. Гуревич А. И., Есипов Р.С., Качалина Т. А., Каюшин А. Л., Коростелева М. Д. Зависимосить уровня экспрессии гена в E.coli от структуры участка инициации трнсляции (TIR) I. Первичная структура TIR. Биоорган, химия (1995) т. 21, 117-123.

112. Boni I. V., Isaeva D. M., Musychenko M. L, Tzareva N. V. Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. Nucleic Acids Res. (1991), 19, 155-162.

113. Oppenheim D.S., Yanofsky C. Translational coupling during expression of the tryptophan operon of Escherichia coli. Genetics (1980) v.95, 785795.

114. Das A., Urbanowski J., Weiss bach H., Nestor J., Yanofsky C. In vitro synthesis of the tryptophan operon leader peptides of Escherichia coli, Serratia marcescens, and Salmonella typhymurium. Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1983) v. 80, 2879-2883.

115. Gerstel B, McCarthy J.E.G. Independent and coupled translation initiation of atp genes in Escherichia coli: experiments using chromosomal and plasmid-borne lacZ fusions. Molec.Microbiol. (1989) v.3, 851-859.

116. Lindahl L., Archer R.H., McCormick J.R., Freedman L.P., Zengel J.M. Translational coupling of the two proximal genes in the S10 ribosomal protein operon of Escerichia coli. J.Bacteriol. (1989) v.171, 2639-2645.

117. Little S., Hyde S., Campbell C.J., Lilley R.J., Robinson.M.K. Translational coupling in the threonine operon of Escherichia coli K-12. J.Bacteriol. (1989) v.171, 3518-3522.

118. Kastelein R.A., Berkhout В., van Duin J. Opening the closed ribosome binding site of the lysis cistron of bacteriophage MS2. Nature (1983) v.305, 741-743.

119. Adhin MR., van Duin J. Scanning model for translational reinitiation in eubacteria, J.Mol.Biol. (1990) v.213, 811-818.

120. Das A., Yanofsky C. A ribosome binding site sequence is necessary for efficient expression of the distal gene of a translationally coupled gene pair. Nucl.Acids.Res.(\9M) v. 12, 4757-4768.

121. Berkhout В., Kastelein R.A., van Duin J. Translational interference at overlapping reading frames in procanotic messenger RNA. Gene (1985) v.37, 171-179.

122. Schoner B.E., Belagale R.M., Schoner R.G. Translation of a synthetic two-cistron lnRNA in E.coh. Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1986) v.83, 85068510.

123. Spanjaard R.A., van Dyk M.C.M., TurionA.J., van DuinJ. Expression of the rat interferon-al gene in Escherichia coli controlled by the secondary structure of the translation-initiation region. Gene (1989) v. 80, 345-351.

124. Makoff A.J., Smallwood A.E. The use of two-cistron constructions in improving the expression of a heterologous gene in E.coli. Nucl.Acids Res. (1990) v. 18, 1711-1718.

125. O. Бирих K.P., Лебеденко E.H. Берлин Ю.А. Плазмидный вектор, содержащий энхансер трансляции, для экспрессии генов в прокариотической двуцистронной системе. Биоорган, химия (1993) т.19, 1234-1238.

126. Brimacombe R. The strucrure of ribosomal RNA: A three-dimensional jigsaw puzzle. Eur. J. Biochem. (1995) v.230, 365-833.

127. Stern S., Weiser В., Noller H.F. Model for the three-dimentional folding of 16S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. (1988) v.204, 447-481.

128. Hubbard J.M., Hearst J.E. Computer modeling 16S ribosomal RNA. J.Mol.Biol. (1991) v.221, 889-907.

129. Brosius J., Dull T. J., Sleeter D. D., Noller H. F. Gene organization and primary structure of ribosomal RNA operon from Escherichia coli. J.Mol.Biol. (1981) v.148, 107-127.

130. Noller H.F., Woese C.R. Secondary structure of 16S ribosomal RNA. Science (1981) v.212, 403-411.

131. Ramakrishnan V., White S. The strucrure of ribosomal protein S5 reveals sites of interaction with 16S rRNA. Nature (1992) v.358, 768-771.

132. Golden B.I., Hoffman D. W, Ramakrishnan V. White S. W. Ribosomal protein SI7: Characterization of three-dimensional structure by and 15N NMR. Biochemistry (1993) v. 32, 12812-12820.

133. Frank J., Znu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R., Lata R. K., Agrawal R. K. A model of protein syntesis based on cryo-electron microscopy of the E.coli ribosome. Nature (1995) v.376, 441-444.

134. Stark H., Mueller F., Orlova E.V., Schatz M., Dube P., Erdemir T., Zemlin F., Brimacombe R., van Heel M. The 70S Eschericia coli ribosome at 23A resolution: Fitting the ribosomal RNA. Structure (1995) v. 3, 815-821.

135. Fink D.I., Chen R.O, Noller H.F,. Altman R.B. Computatial methods for defining the allowed conformational space of 16S rRNA based on chemical footprinting data. RNA (1996) v. 2, 851-866.

136. Powers T, Noller H. Hydroxyl radical footprinting of ribosomal protein on 16S rRNA. RNA (1995) v. 1, 194-209.

137. Petersen C. Long-range translational coupling in the rpLJ-rpoBC operon of Escherichia coli. J.Mol.Biol. (1989) v. 206, 323-332.

138. Chiaruttini C., Mi let M., Springer M. A long-range RNA-RNA interaction forms a pseudoknot required for translational control of the IF3-L35-L20 ribosomal proteinoperon in Escherichia coli. EMBO J.1996) v. 15,4402-4413.

139. Mueller F., Brimacombe R. A New Model for Three-dimensional Folding of Escherichia coli 16S Ribosomal RNA. I. Fitting the RNA to 3D Electron Microscopic Map at 20 A. J. Mol. Biol. (1997) v. 271, 524544.

140. Mueller F., Brimacombe R. A New Model for Three-dimensional Folding of Escherichia coli 16S Ribosomal RNA. II. The RNA-Protein Interaction Data. J. Mol. Biol. (1997) v. 271, 545-565

141. Mueller F., Brimacombe R. A New Model for Three-dimensional Folding of Escherichia coli 16S Ribosomal RNA. III. The Topography of Functional Centre. J. Mol. Biol. (1997) v. 271, 566-587.

142. Montpetit A., Pay ant C., Nolan J., Brakier-Gigras L. Analysis of the conformation of 3' major dornen of Escherichia coli 16S ribosomal RNA using site-directed photoaffinity crosslinking. RNA (1998). v. 4, 1455-1466.

143. Lodmell J.S., Dahlberg A.E. A conformational Switch in Escherichia coli 16S Ribosomal RNA During Decoding of Messenger RNA. Science1997), v. 277, 1262-1267.

144. Stormo G. D. Translation initiation. Maximizing gene expression (eds. Reznikoff W., Gold L.) Butterworths, Boston (1986), p. 195-224

145. Dunn J. J., Studier F. W. Nucleotide seguence from the genetic left end of bacteriophade T7 DNA to the beginning of gene 4. J. Mol. Biol. (1983), v. 166, №4-5, 477-535.

146. Newbury S.,Smith N. H., Robinson E. C, Hiles I. D., Heggins C. F. Stabilisation of translationally active mRNA by prokaryotic REP-sequensies. Cell (1987), v.48, 297-310

147. Chem C.-Y.A., Beatty J. T., Cohen S. N. Belasco J.G., An intercistronic stem-loop structure functions as an mRNA dacayterminator necessary but insufficient for puf mRNA stability. Cell (1988), v. 52, 609-619.

148. Гуревич A.M., Есипов P.C., Качалина Т.А., Каюшин А.Л., Зависимость уровня экспрессии гена в E.coli от структуры участка инициации трансляции (TIR). II. Вторичная структура TIR. Биоорган, химия (1995), т. 21, 282-288.

149. Луценко С.В., Еуревич А.И., Птицын Я.Р., Рязанцева Л.А., Смирнов В.А. Системы экспрессии в E.coli рекомбинантных интерлейкина-3. Биоорган, химия (1992)), т. 18, 391-397.

150. Еуревич А.И.,Аваков А.Э.,Игошин А.В.,Колосов М.Н. Выделение промоторов rrnB Escherichia coli. Биоорган, химия (1982) т. 8, 557560

151. Есипов Р.С., Качалина, Т. А., Еуревич А. И. Новые плазмидные векторы для получения высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia coli. Второй съезд биохимического общества РАН, тезисы стендовых сообщений, Москва (1997), 496-497.

152. Studier F.W., Rosenberg А. Н., Dunn J.J. DubendorffJ. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. (1990), v. 185, 60-84.

153. Schoerfer R. The pSET family of t7 promoter expression vector for Escherichia coli. Gene (1993), v. 123, 83-85.

154. Гуревич А. К, Качалина Т. А., Каюшин А. Л., Коростелева М. Д., Мальцев КВ., Миргородская О. А., Мирошников А. И. Рекомбинантные белки, содержащие олигомерные последовательности окситоцина. Биорган. химия (1996), т. 22, 14-16.

155. Klein В.К., Feng Г., McWherter СИЛ, Hood W.F., Paik К., McKearn J.P. The receptor binding site of human interleukin-3 defined by mutagenesis and molecular modeling. J.Biol.Chem. (1997), v.272, 22630-22641.

156. Машковский М.Д. Лекарственные средства. M., Медицина (1972) т.2, с.72.

157. Гуревич А. И., Качалина Т. А., Каюшин А. Л., Коростелева М. Д., Мирошников А.И. Клонирование повторяющейся последовательности гена окситоцина. Биорган. химия (1993/ т. 19, 629-632.

158. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., Наука (1985).

159. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis Т. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).

160. Emory S.A., Belasco J.G. The ompA untranslated RNA segment functions in E.coli as a drowth-rate regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translation efficiency. J.Bacteriol.(1990), v.8, 4472-4481.

161. McCarthy J.E.G. Expression of the unc genes in Escherichia coli. J.Bioen.Biomemb. (1988), v. 20, 19-38.

162. Gallic D.R., Sleat D.E.,Watts J.W., Wilson T.M.A. The 5' leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcript in vitro and in vivo. Nucl. Acids Res. (1987), v. 15, 3257-3273.

163. Wilson T.M.A. Expression of the large 5'-proximal cistron of tobacco mosaic virus by 70S ribosomes during cotranslational disassembly in a procariotic cell-free system. Virology (1986), v. 152, 277-279.

164. Gallie D.R., Sleat D.E., Watts J.W., Turner P.C., Wilson T.M.A. A comparison of eucaryotic viral 5'-leader sequences as enhancers of mRNA expression in vivo. Nucl. Acids Res. (1987), v. 15, 8693-8711.

165. Towbin H., Stachelin T., Gordon J. Electrophoresis transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedures and some applications. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. (1979), v. 76, 4350-4354.

166. Sleat D.E., Gallie D.R., Jefferson R. A., BevanM.W., Turner P.C., Wilson T.M.A. Characterization of the 5'-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA as a general enhancer of translation in vitro. Gene (1987), v. 217,217-225.