Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние озонированного физиологического раствора на окислительные процессы головного мозга в норме и в раннем постреанимационном периоде

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние озонированного физиологического раствора на окислительные процессы головного мозга в норме и в раннем постреанимационном периоде"

На правах рукописи

ДУДИНА Екатерина Владимировна

ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА В НОРМЕ И В РАННЕМ ПОСТРЕАНИМАЦИОННОМ

ПЕРИОДЕ

03.00.13 - физиология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 2003

Работа выполнена в Военно-медицинском институте Федеральной пограничной службы России при Нижегородской государственной медицинской академии и в Центральной научно-исследовательской лаборатории Нижегородской государственной медицинской академии

Научные руководители:

Доктор биологических наук Мухина Ирина Васильевна

Доктор медицинских наук,

профессор Боаринов Геннадий Андреевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Перегягин Сергей Петрович

Доктор ветеринарных наук,

профессор Пахмутов Игорь Аркадьевич

Ведущее учреждение:

НИИ общей реаниматологии РАМН (Москва)

Защита диссертации состоится « 4 » ноября 2003 года в 1330 на заседании Диссертационного совета Д 220.047.01 при Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 603107, г.Нижний Новгород, пр-т Гагарина, 97.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 603107, г.Нижний Новгород, пр-т Гагарина, 97.

Автореферат разослан « 3 » октября 2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

Асафова Н.Н.

IS171

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Высокий уровень метаболизма наряду с минимальными резервами энергетических субстратов и относительно плохо развитыми механизмами антиокислительной защиты делают мозг очень чувствительным к любому изменению доставки и утилизации кислорода, что сразу же приводит к изменению его электрической активности и функции.

Методы окислительного воздействия, широко применяющиеся в настоящее время как в клинической практике, так и в экспериментальной физиологии, обладают комплексным воздействием на организм. В качестве окислителя используются гипербарическая оксигенация, ультрафиолетовое облучение аутокрови, лазерное излучение, гипохлорит натрия, перекись водорода, аэроионы воздуха, озон (Ефуни С.Н., 1986; Закс И.О. и соавт., 1994; Кондрашова М.Н., 1997, Rilling S., Viebahn R„ 1987).

Озон является одним из наиболее универсальных и легкодоступных окислителей. Известно, что парентеральное введение озона, улучшая транспортную функцию крови и облегчая отдачу кислорода, обеспечивает полноценную оксигенацию тканей (Rokitansky О., 1982, Viebahn R., 1985). Применение озонированных растворов с низкой концентрацией озона способствует активации аэробных путей окисления глюкозы, увеличению синтеза АТФ, улучшению микроциркуляции тканей (Зеленов Д.М., 1988; Бояринов Г.А., Соколов В.В., 1999). В низких концентрациях озонированные среды стимулируют механизмы антиоксидантной защиты клетки и организма в целом (Конгорщикова К.Н., 1995).

Однако несмотря на широкое применение озонотерапии (Rilling S., Viebahn R., 1987; Перетяган С.П., 1991; Бояринов Г.А., Соколов В.В., 1999; Turrent J., Menendez S., 2001), в том числе в неврологии (Котов С.А., 1999, Густов A.B. и др., 2000; Konrad Н., 2001), механизм действия озонированных сред на мозг остается во многом неизученным.

При этом действие озона на неповрежденный мозг, когда он не является органом-мишенью, является неисследованным. В связи с этим актуальным является рассмо1рение влияния озона на нормальный мозг.

Церебральная ишемия и гипоксия сопровождает очень многие патологические процессы, такие как тяжелая'

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.П1 09

острая дыхательная недостаточность, экзогенные отравления, сепсис, остановка системного кровотока с последующей реанимацией и является наиболее часто встречающимся осложнением в нейроанестезиологии и сердечно-сосудистой хирурпш (Неговский В.А., 1987, Семченко В.В. и др., 1999, Остапченко Д.А. и др., 2000).

Восстановление кровотока после периода ишемии вызывает в ткани мозга развитие окислительного стресса (Chan Р.Н., 1996; White B.C. et al, 1996). Наряду с этим вследствие вторичных нарушений микроциркуляции возникают очаги вторичной гипоксии. Такие разнонаправленные нарушения окислительного метаболизма делают особенно сложной задачу восстановления функций головного мозга в постреанимационном периоде и резко ограничивают возможности реанимации, ухудшают течение восстановительного периода и определяют развитие постреанимационных и постаноксических энцефалопатий (Пермяков Н.К. и соавт., 1986; Неговский В.А. и соавт., 1987; Семченко В.В. и др., 1999, Кожура B.J1., 1999).

Восстановление кислородного гомеостаза в этих условиях является первоочередной задачей, с этой целью используются средства с различным механизмом действия - вазодилататоры, вещества, повышающие кислородную емкость крови, антигипоксанты, методы окислительной терапии.

Антигипоксические свойства озона позволяют использовать его для коррекции метаболизма при состояниях, связанных с нарушениями кровоснабжения мозга. Однако вопрос об адекватности применения окислительных методов на фоне оксидантного стресса, часто сопровождающего критические состояния, остается актуальным.

Учитывая вышеизложенное, целью нашего исследования явилось изучить влияние озонированного физиологического раствора (ОФР) на состояние окислительного метаболизма в головном мозге животных в норме и в раннем постреанимационном периоде.

Задачи исследования

1. Изучить влияние однократного введения озонированного физиологического раствора на состояние аэробного энергетического метаболизма, про- и антиоксидантную систему головного мозга у интактных животных.

2. Исследовать влияние многократного применения озонированного физиологического раствора с различной концентрацией озона на состояние перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты головного мозга у шггактных животных.

3. Оценить нейропротекторное действие озонированной аутокрови и озонированного физиологического раствора на функциональную активность и метаболизм головного мозга крыс в раннем постреанимационном периоде.

Научная новизна

В работе впервые проведено сравнительное изучение влияния доз озона, приближающихся к терапевтическим, на процессы окислительного метаболизма в мозге в норме и на фоне окислительного стресса в раннем постреанимационном периоде.

В результате проведенного исследования показано, что применение озонированного физиологического раствора у интактных животных вызывает активацию аэробного метаболизма в ткани головного мозга за счет ускорения гликолиза и повышения утилизации кетоновых тел.

Показано, что в мозге интактных животных озонированный физиологический раствор вызывает значительную активацию супероксидцисмутазы (СОД) как при однократном, так и при многократном использовании. Применение ОФР на фоне исходного окислительного стресса, как и длительное введение высоких доз озона, вызывает снижение активности СОД и повышение активности каталазы.

Показано, что в раннем постреанимационном периоде применение озонированной аутокрови способствует лучшей сохранности пула адениловых нухлеотндов и скорейшему восстановлению уровня макроэргических фосфатов в мозге.

Введение ОФР в раннем постреанимационном периоде способствует улучшению кровотока в капиллярах, значительному снижению периваскулярного отека. В отличие от озонированного, оксигенированный физиологический раствор вызывает нарушения структуры капилляров, развитие сильного отека мозговой ткани в раннем постреанимационном периоде, что приводит к гибели животных.

В результате проведенного комплексного исследования показано, что применение ОФР вызывает активацию синтетических процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров в норме и раннем постреанимационном периоде.

Теоретическая и практическая значимость

Данное исследование представляет теоретический интерес для нормальной и патологической нейрофизиологии и нейрореаниматологии. Установленные факты существенно дополняют современные представления о механизмах действия озона на головной мозг.

Практическое значение результатов работы заключается в экспериментальном обосновании необходимости мониторинга изменений про- и антиоксидантых процессов, вызываемых озоном, при применении ОФР в клинике, как у больных без повреждения головного мозга, так и, особенно, при развитии в нем окислительного стресса.

Положения, выносимые на защиту

1. Однократное применение озонированного физиологического раствора с дозой озона 2,8 мкг/кг активирует аэробный энергетический метаболизм в ткани головного мозга у интактных животных, повышает активность СОД. При многократном введении ОФР с терапевтическими дозами озона интакгным животным наблюдается интенсификация процессов ПОЛ, увеличение активности СОД, в меньшей степени каталазы. При введении ОФР на фоне окислительного стресса (в постреанимационном периоде) активность СОД снижается, наблюдается активация каталазы.

2. Введение озонированного физиологического раствора и озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде улучшает микроциркуляцию, активирует аэробные пути окисления глюкозы и кетоновых тел, повышает уровень макроэргических фосфатов в головном мозге, в результате чего происходит более быстрое восстановление функциональной активности ЦНС.

3. Озонированный физиологический раствор вызывает усиление синтетических процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров в интактном мозге и в раннем постреанимационном периоде.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на III, IV и V Всероссийских научно-практических конференциях "Озон и методы эфферентной терапии в медицине" (Нижний Новгород, 1998, 2000, 2003); XV Международном конгрессе по озону (Великобритания, Лондон, 2001); I Международной научно-практической конференции "Мкцеве та парентеральне використання озонотсрапи в

медицин!" (Украина, Харьков, 2001), II и Ш Всероссийских конференциях "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1999, 2002); 8 Нижегородской конференции молодых ученых (2003), I Украинско-Российской научно-практической конференции "Озон в биологии и медицине" (2003).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 89 отечественных и 107 иностранных источников. Текст изложен на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирован 9 таблицами и 27 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы ■ методы исследования

Для решения поставленных задач были проведены экспериментальные исследования на 280 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г, содержащихся на стандартном рационе вивария.

Характеристика экспериментального материала

С целью изучения влияния озонированного физиологического раствора на окислительные процессы в нормальном мозге применялось однократное внутрибрюшинное (в/б) введение 1 мл ОФР с концентрацией озона в растворе 590 мкг/л (что соответствовало дозе озона 2,8 мкг/кг массы тела) интактным животным. В первой серии (интактные) животным в/б вводили 1 мл физиологического раствора, во второй серии (озон) - 1 мл озонированного физиологического раствора с дозой озона 2,8 мкг/кг. В третьей серии - в/б вводили 1 мл оксигенированного физиологического раствора. Через 60 мин после введения растворов наркотизированных нембуталом (35 мг/кг в/б) животных забивали, ткань мозга забирали для биохимических и электронно-микроскопических исследований.

Влияние курсового введения озонированного физиологического раствора с разными концентрациями озона на показатели перекисного окисления липидов и ферменты антиоксидантной защиты изучалось в четвертой-седьмой сериях опытов. Интактным крысам вводили I мл озонированного физиологического раствора б раз через дань, с концентрациями озона в растворе 250 (5 серия), 590 (6

серия) и 2500 мкг/л (7 серия), (что соответствовало дозе озона 1,2, 2,8 и 12 мкг/кг). Контрольным животным (4 серия) в/б вводили 1 мл неозонированного физиологического раствора 6 раз через день. Через сутки после последнего введения растворов животных декапитировали под нембуталовым наркозом, ткань мозга забирали для биохимических исследований.

Влияние озона на окислительные процессы в мозге на фоне исходного окислительного стресса изучали на моделях клинической смерти в результате острого кровопускания (Неговский В.А., 1943, 1987) и пережатия сердечнососудистого пучка (Корпачев В.Г. и соавт., 1982).

В восьмой (контроль), девятой (озон) и десятой (кислород) сериях наркотизированным нембуталом животным в период реанимации после 5-минутной клинической смерти в/б вводили соответственно 1 мл физиологического раствора, озонированного физиологического раствора с концентрацией озона в растворе 590 мкг/л (доза озона 2,8 мкг/г) или равный объем оксигенированного раствора. В случае модели клинической смерти в результате острого кровопускания в 8 и 9 сериях соответственно вводили интракаротидно 1 мл аутокрови или 1 мл озонированной аутокрови с концентрацией озона 0,08 мкг/мл. Через 60 мин реанимации ткань мозга забирали для биохимических и электронно-микроскопических исследований.

Методы исследования

Для получения озонированного физиологического раствора 50,0 мл апирогенного физиологического раствора барботировали озоно-кислородной смесью (1 л/мин) в стандартном (200,0 мл) флаконе в течение 10 мин с концентрациями озона на выходе озонатора 400, 1200 и 5000 мкг/л газовой смеси. Концентрация озона в растворе определялась йодометрическим методом (Варес А.Ю., Зайцев В.И, 1982).

В раннем постреанимационном периоде регистрировались время появления самостоятельного дыхания, роговичного, двигательного, болевого рефлекса (по двигательной реакции на механическое болевое раздражение). Определялась частота самостоятельного дыхания по импедансной кривой дыхания, регистрируемой с помощью 4-канального реографа РГ-4-01.

Количественное определение уровня лактата и пирувата проводилось эизиматическим методом с лактатдегидрогеназой (Асатиани B.C., 1965, Bergmeyer Н„ 1974).

Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию молекулярных продуктов ПОЛ - вторичных (диеновые и триеновые конъюгаты), и конечных (основания Шиффа). Также определяли индекс окисленности двойных связей - отношение диеновых коныогатов к общему количеству двойных связей. Определение диеновых и триеновых коныогатов проводили по методу (Панкин В.З. и соавт., 1979). Выделение липидов производили по Фолчу (Folch J. et al., 1957). Определение общих липидов проводили по методу Chromy V. et al. (1975) с использованием диагностических наборов фирмы «Лахема». Основания Шиффа определяли флуориметрическим методом (Fletcher D. et al., 1973).

Состояние антиоксидантной системы оценивали по степени активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы. Активность СОД определяли по методу Nischikimi М. et al. (1972), каталазы по методу Aebi Н. (1970).

Определение содержания макроэрги ческих нуклеотидов проводили путем разделения нуклеотидов методом ионообменной хроматографии на колонках с эктеола-целлюлозой (Иванова Т.И., Рубель Л.И., 1969). Количественно оценивали содержание АМФ, АДФ, АТФ, ГТФ и ГДФ и их соотношение.

Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), пируватдегидрогеназы (ПДГ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), НАДН-дегидрогеназы (НАДНДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл-6-фДГ), ß-оксибутиратдегидрогеназы (ß-обДГ) выявляли гистохимическими методами (Пирс Э., 1962; Берстон М.С., 1965; Лилли Р., 1969; Лойда С. и др, 1982) в сенсомоторной зоне коры головного мозга.

Для электронно-микроскопического исследования ткань сенсомоторной зоны коры головного мозга крыс фиксировали (Уикли Б., 1975). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме ULTRACUT (Reicher-yung), контрастировали по методу Reynolds (Reynolds E.S., 1963) и просматривали на электронном микроскопе ЭМ-100БР.

Полученные результаты были обработаны с помощью пакета программ Statistica 6.0 для Windows 95. Достоверные различия показателей средних между двумя исследуемыми группами определялась по критерию t - Стьюдента. Различия считали достоверными при уровня значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияний озонированного Физиологического раствора на окислительные процессы в ткани головного мозга интактных животных

Однократное в/б введение 1 мл озонированного физиологического раствора с дозой озона 2,8 мкг/кг крысам, предварительно наркотизированным нембуталом, на 60-й минуте наблюдаемого периода приводило к снижению болевого рефлекса при сохранении роговичного рефлекса и самостоятельного дыхания, углублению сна по сравнению с серией без ОФР.

При этом в ткани мозга не увеличивалось содержание лактата (табл.1) по сравнению с интактной серией, что свидетельствовало об отсутствии развития гипоксических процессов в головном мозге, несмотря на углубление наркоза. Содержание пиру вата в ткани головного мозга при введении ОФР возрастало на 35%, в результате чего соотношение лактат/пируват уменьшалось по сравнению с интактной серией.

Таблица 1

Влияние однократного в/б введения озонированного физиологического раствора на содержание лактата и пиру вата и их соотношение в ткани головного мозга интактных крыс (М±ш)_

Серия Лактат, мкмоль/г Пируват, мкмоль/г Лактат/пируват

Интактная 4,4±0,06 0,34±0,02 13±0,8

Озон 4,3+0,06 0,46±0,03 * 9,5±0,21 *

Примечание: * - достоверные различия с интактной серией (р<0,05)

Введение интахтным крысам озонированного физиологического раствора приводило к снижению активности ПДГ на 14% (рис.1), что, вероятно, также способствовало накоплению пирувата, так как пируватдегидрогеназная реакция в мозге является основным путем ввода метаболитов в цикл Кребса.

В то же время наблюдалось повышение на 25% активности (3-обДГ -фермента, обеспечивающего взаимопревращение ацетоацетата в Э-гидроксибутират.

Отмечалось увеличение активности первого фермента электрон-транспортной цепи - НАДНДГ на 32%, что свидетельствовало об усилении окисления в дыхательной цепи НАД-зависимых субстратов. Это также могло быть следствием

Баллы

ЛДГ ПДГ СДГ НАДНДГ Гв-ф-ДГ Р -об-ДГ □ Интакгн Я Озон

Рис. 1. Влияние однократного введения озонированного физиологического раствора на активность окислительно-восстановительных

ферментов в сенсомоторной зоне коры головного мозга интактных крыс

Примечание: * - достоверные различия с интактной серией (р<0,05).

повышения включения в окислительный метаболизм нехарактерного для мозга субстрата окисления - кетоновых тел, что подтверждается увеличением активности ß-обДГ. Известно, что усиление окисления кетоновых тел может приводить к активации ГАМК-шунта и повышению концентрации ГАМК в мозге (Daikhin Y., Yudkoff М., 1998). Возможно, этот механизм и лежал в основе наблюдаемого нами углубления действия наркоза при использовании озонированного физиологического раствора.

При однократном введении ОФР интактным крысам практически не менялось содержание адениловых нуклеотидов и снижался пул гуанилпвых нуклеотидов на 17% (р<0,05) в ткани мозга. Таким образом, несмотря на наблюдаемую активацию окислительного метаболизма при введении ОФР, накопления АТФ не происходило, видимо, вследствие ее усиленного потребления.

При электронно-микроскопическом исследовании ультраструктуры сенсомоторной зоны коры головного мозга интактных животных после введения ОФР в нейронах наблюдалось увеличенное по сравнению с интактной серией количество рибосом, полисом, в ядрах нейронов выявлялись ядрышки, плотная кариоплазма с эухроматином, встречались ядра с инвагинациями. Указанные изменения принято считать показателем увеличения белоксинтезирующей функции клетки (H.H. Боголепов, 1979). Следствием повышенного синтеза белка также могло

являться наблюдаемое снижение уровня гуаниловых нуклеотидов и отсутствие накопления АТФ на фоне активации аэробного метаболизма.

Использование же оксигенированного физиологического раствора в аналогичных условиях вызывало набухание эндотелия капилляров и ножек астроцитов в коре головного мозга, отмечалось меньшее количество эритроцитов в капиллярах.

Через 60 мин после однократного введения ОФР с дозой озона 2,8 мкг/кг интактным животным в ткани головного мозга отмечалось повышение уровня оснований Шиффа на 19,3% (р<0,05), при недостоверной разнице в содержании диеновых и триеновых конъюгатов. При этом наблюдалось адаптивное увеличение активности первого фермента антиоксидантной защиты - СОД - на 61,8%, активность катализы оставалась неизменной (рис.2). Таким образом, срочная адаптация к окислительному стрессу, вызванному однократным введением ОФР, реализовывалась за счет повышения активности первого фермента антиоксидантной защиты-СОД.

сод

Каталаза

«я.жт/гтк

«ДЛИТ /Г

Интакг

Озон

Интакг

Озон

Ряс. 2. Влияние однократного в/б введения озонированного физиологического раствора на активность антиоксидакгных ферментов в

головном мозге крыс

Примечание. * - достоверные различия с интактной серией (р<0,05).

Принимая во внимание полученные нами данные, и использование в клинике курсового введения озона и озонированных растворов, мы изучили влияние

многократного применения ОФР с разными дозами озона, на состояние перекисного окисления липидов и антиоксидангаой системы в головном мозге интактных животных. Выбранные дозы озона приближались к применяемым в клинике.

Проведенные исследования показали, что при многократном использовании ОФР с дозой озона 2,8 мкг/кг определялось повышение содержания оснований Шиффа в 3 раза, ДК на 41,7% (табл.2). На фоне повышения свободнорадикальных процессов наблюдалась выраженная активация СОД - на 74,5% (табл.3). Активность каталазы при этом увеличивалась на 19,3%.

Таблица 2

Влияние многократного введения озонированного физиологического раствора с различной концентрацией озона на содержание молекулярных

продуктов ПОЛ в головном мозге крыс (М±ш)

Серия ДК, ед.опт. пл/ мгОЛ ТК, ед опт. пл/ мгОЛ ОШ, отн. ед/ мгОЛ ДК/Двсв.

Интактные 0,92210,13 0,335±0,02 120,6± 3,6 0,722±0,06

"Озон 1,2" 1,18510,09 * 0,32810,016 0,76110,07

"Озон 2,8" 1,307±0,08 * 0,341 ±0,017 364,95±28,72 * 0,79510,07

"Озон 12" 1,146+0,100 ♦ 0,286±0,046 337,5±39,25 * 0,72610,07

Примечание. * - достоверные различия с интактной серией (р<0,05).

Таблица 3

Влияние многократного введения озонированного физиологического раствора с различной концентрацией озона на активность антиоксидантных

ферментов в головном мозге крыс (М±т)

Серия СОД, ед. акт/г тк. мин Каталаза, ед. акт/г тк. мин

Интактные 5,8±0,91 0,492 ±0,027

"Озон 1,2" 5,736 ±1,258 0,454 ±0,038

"Озон 2,8" 10,123 ± 0,655* 0,587 ± 0,029*

"Озон 12" 8,577 ± 1,093 * 0,558 ±0,025*

Примечание: * - достоверные различия с интактной серией (р<0,05).

Длительное применение меньшей дозы озона - 1,2 мкг/кг (пятая серия) приводило к повышению уровня ДК на 28,5%. Активность ферментов антиоксидантной защиты (СОД и каталазы) при этом не изменялась.

Многократное использование высокой дозы озона - 12 мкг/кг (7 серия) приводило к увеличению концентрации ДК на 24,3% уровень оснований Шиффа возрастал в 3 раза. Активность СОД увеличивалась на 48% каталазы - на 13,4%.

Таким образом, многократное введение ОФР с терапевтической концентрацией озона вызывало в ткани мозга интакгных животных активацию первого фермента антиоксидантной защиты - СОД, и в меньшей степени каталазы. При этом наибольшая степень активации СОД определялась при использовании дозы озона 2,8 мкг/кг. Однако установленное значительное накопление конечных продуктов ПОЛ - оснований Шиффа в сериях с дозой озона 2,8 и 12 мкг/кг являлось тревожным сигналом, свидетельствующим о высокой скорости протекания свободнорадикальных процессов и недостаточности механизмов антиоксидантной защиты. Снижение степени активации СОД в серии с высокой концентрацией озона также могло являться, следствием начала развития окислительного стресса и ингибирования СОД активными формами кислорода (Cadet J.L., Brannock С., 1998). Многократное применение озона в дозе 1,2 мкг/кг не вызывало стимуляцию антиоксидантных ферментов в ткани головного мозга интакгных животных.

Сравнительный анализ влияния однократного и многократного применения ОФР в дозе 2,8 мкг/кг ннтактным животным показал более значительное накопление продуктов ПОЛ при длительном применении ОФР - ДК на 31%, индекса окисленности (ДК/Дв.связи) на 24,5%, ОШ на 184%.

Антиоксидантные ферменты в мозге по-разному реагировали на воздействие озона при длительном применении. В то время как активность СОД повышалась сразу же при первом применении окислителя и незначительно изменялась при длительном использовании ОФР, уровень активности каталазы возрастал только при многократном воздействии окислителя (рис. 3).

Таким образом, однократное применение озонированного физиологического раствора с дозой озона 2,8 мкг/кг у интактных животных повышало содержание пирувата, возможно, вследствие небольшого снижения активности ПДГ, приводило к значительной активации НАДНДГ и р-обДГ в ткани головного мозга интактных животных. При этом не наблюдалось достоверных

%

«

200 " 180 160 -140 120 100 80 60

40 ■ 20 0 -

сод

Каталаза

СГЮзон (однократ) ■■ Озон (курс) -*-Интакт

Рис. 3. Изменение активности СОД и каталазы в тканн головного мозга

интактных животных при однократном и многократном введении ОФР

Примечание: * - достоверные различия с интактной серией (р<0,05)

изменений в спектре адениловых нуклеотидов головного мозга, несколько снижался уровень гуаниловых нуклеотидов. Наблюдалась незначительная активация перекисного окисления липидов и компенсаторная активация СОД. В нейронах было отмечены признаки повышения синтетической активности.

Многократное применение ОФР с дозой озона 2,8 мкг/кг вызывало повышение активности СОД и каталазы в ткани головного мозга у интактных животных.

Влияние озонированных аггокрови и Физиологического раствора на восстановление функционального состояния и метаболизма головного мозга крыс в раннем постреанимационном периоде

Применение озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде уменьшало в 2 раза время восстановления самостоятельного дыхания, роговичного и двигательного рефлексов по сравнению с контролем. При этом болевой рефлекс восстанавливался в те же сроки, что и в контрольной группе (табл.4).

Таблица 4

Влияние озонированной аутокрови на время восстановления самостоятельного дыхания и рефлексов в постреанимационном периоде (М±ш)

Серия Самостоятельное дыхание, мин Роговичный рефлекс, мин Двигательный рефлекс, мин Болевой рефлекс, мин

Контроль 12,2±1,2 18,8±2,3 21,7±1,4 19,35±1,57

Озон 5,7±0,15 »* 8,6±0,17** 13±0,98** 19,7±0,9

Примечание: ** - достоверность различий с контрольной серией (р<0,05).

При использовании озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде восстановление пула адениловых нуклеотидов в ткани головного мозга по сравнению с контрольной серией было более значительным (табл.5). Повышение уровня АТФ на 14% и АДФ на 15%, а также соотношения АТФ/АМФ на 35%, по сравнению с контрольной серией, свидетельствовало о преобладании процессов синтеза макроэргических фосфатов над процессами утилизации при применении озонированной аутокрови. Это, вероятно, было обусловлено меньшей функциональной нагрузкой на головной мозг в данный период.

Таблица 5

Влияние озонированной аутокрови на содержание и соотношение адениловых нуклеотидов (мкмолъ/г ткани) в головном мозге крыс в раннем постреанимационном периоде (М±т)_

Серия АМФ АДФ АТФ АдН АТФ/АМФ

Интакгные 0,65910,0927 0,790±0,083 1,43110,079 2,881Ю,07 2,17

Кл.смерть 1,75010,170« 0,74210,152 0,11910,026* 2,61210,092 0,06*

Контроль 0,728±0,053 0,73410,03 1,57210,017 3,03410,022 2,16

Озон 0,614Ю,045 0,842Ю,025 ** 1,792+0,071 * '* 3,24910,049* 2,92 * **

Примечание: * - достоверные различия с интактной серией; ** - достоверные различия с контрольной серией (р<0,05).

Пул гуаниловых нуклеотидов был несколько снижен - на 20% (р<0,05) по сравнению с контрольным уровнем. Учитывая достаточную степень восстановления аэробных дыхательных процессов, снижение уровня гуаниловых нуклеотидов, возможно, было связано с их повышенным потреблением, в частности, на биосинтетические процессы, либо со снижением их синтеза в реакции субстратного

фосфорилирования вследствие активации ГАМК-шунта (Кометиани П.А., 1980; ЯосЦсЬок Ь.Э., А1Ьеге ЯЖ, 1980).

Использование озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде приводило к уменьшению накопления лактата в ткани головного мозга на 23% по сравнению с контрольной серией (табл.6). В результате снижалось отношение лактат/пируват, что свидетельствовало о направленности окислительных процессов в ткани головного мозга в сторону аэробного гликолиза и снижении уровня лакгатацидоза в постреанимационном периоде. Подтверждением этому явилось и возрастание активности ЛДГ и ПДГ по сравнению с контрольной серией на 46% и 33% соответственно (рис.4). Вероятно, снижение уровня лактата после периода ишемии обеспечивалось высокой активностью ЛДГ, аэробные изоферменты которой преобладают в мозге.

Таблица 6

Влияние ОФР на содержание лактата и пнрувата (мкмоль/г ткани) в головном мозге крыс в раннем постреанимационном периоде (М±ш)_

Серия Лактат Пируват Лактат/пируват

Интактные 5,29±0,31 0,229±0,021 24,14±1,91

Кл.смертъ 21,49±1,16* 0,251*0,034 98,21±13,75*

Контроль 11,22±0,82* 0,388*0,045* 32,87±2,68

Озон 8,67±0,73* ** 0,312±0,049 » 27,80±1,62

Примечание * - достоверные различия с интактной серией; ** - достоверные различия с контрольной серией (р<0,05)

В отличие от контрольных животных, при применении ОФР в постреанимационном периоде в ткани мозга наблюдалось повышение активности Г-б-фДГ на 33,3%, свидетельствовавшее об увеличении активности пентозофосфатного пути синтеза энергии. Интенсификация ПФП в раннем постреанимационном периоде является одним их признаков усиления репаративных процессов и по данным Delgado-Esteban М. et al. (2000) может оказывать защитное действие на клетки головного мозга при накоплении нейротоксического глутамата.

Увеличение активности fi-обДГ на 36,6% при воздействии ОФР свидетельствовало о повышении метаболизма кетоновых тел в мозге, что является защитным механизмом в условиях метаболического стресса (Blazquez С. et al., 1999).

i

i

¡

Баллы * **

ЛДГ ПДГ СДГ НАДНДГ Г6-Ф-ДГ Р -об-ДГ

□ Интактн ■ Клин см. О ПР контр ВПРозон

Рис. 4. Влияние ОФР на активность окислетельно-восстановительных ферментов в сенсомоторной зоне коры головного мозга крыс в раннем постреанимационном периоде

Примечание * - достоверные различия с интаю?ной серией. ** - достоверные различия с контрольной серией (р<0,05)

Снижение активности СДГ и НЛДН ДГ в головном мозге при использовании ОФР по сравнению с исходным уровнем, было связано, возможно, с торможением скорости дыхательных процессов высоким отношением АТФ/АМФ в условиях достаточного снабжения мозга кислородом.

Введение ОФР в период восстановления после клинической смерти вызывало снижение относительно контроля содержания ДК (на 40%) и индекса окисленности двойных связей (на 18%), на фоне сохранившегося повышенного уровня ОШ в ткани головного мозга (табл.7).

Таблица 7

Влияние озонированного физиологического раствора на содержание продуктов ПОЛ в головном мозге крыс в постреанимационном периоде (М±ш)

Серия ДК, ед опт.плота/мг ОЛ ДК/Двсв тк, ед опт плотн/ мг ОЛ ОШ, отн ед/ мг ОЛ

Интакгные 0,33+0,021 0,56±0,029 0,055+0,008 58,0+3,2

Контроль 0,4210,027 0,79±0,03 * 0,126+0,01 * 84,1 ±5,01*

Озон 0,25±0,018 * ** 0,65±0,04 ** 0,142±0,01 * 87+5,1*

Примечание * - достоверные различия с интактной серией, ** - достоверные различия с контрольной серией (р<0,05)

Вместе с тем в серии с применением ОФР отмечалось значительное снижение активности СОД и повышение активности катализы по сравнению с контрольной серией (табл.8).

Таблица 8

Влияние озонированного физиологического раствора на активность антиоксцдантных ферментов в головном мозге крыс в постреанимационном периоде (М±ш)_

Серия СОД ед.акт. /г ткани мин Каталаза, ед.акт/г ткани с

Интактные 20,0±2,2 1,2±0,08

Контроль 16,0*2,13 1,4±0,09

Озон 9,2+2,1* 2,1±0,09 * **

Примечание' * - достоверные различия с интактной серией, ** - достоверные различия с контрольной серией (р<0,05)

При использовании ОФР в раннем постреанимационном периоде при зпектронно-микроскопическом исследовании структуры коры головного мозга выявлялось значительно меньшее количество сосудов с нарушенным кровотоком по сравнению с контрольной серией. Большая часть капилляров содержала эритроциты, электронноплотную плазму. Периваскулярный отек, свидетельствующий о нарушении сосудистой проницаемости, в отличие от контрольной группы наблюдался только в некоторых участках. Для эндотелиоцитов и нейронов были характерны признаки активации синтетических процессов в клетке - повышение количества рибосом и полисом, развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум, нейроны большей частью имели ядра с диффузным эухроматином, хорошо выраженным ядрышком с фибриллярной и гранулярной составляющей.

Учитывая то, что процентное содержание озона в составе озоно-кислородной смеси не превышает 0,01-0,001, с целью дифференцирования влияния озона и кислорода на состояние мозга в раннем постреанимационном периоде, была проведена серия экспериментов с изучением воздействия того же объема оксигенированного физиологического раствора без добавления озона. Результаты исследования показали, что применение оксигенированного физиологического раствора ухудшало течение восстановительного периода после клинической смерти

I !

и приводило к ранней гибели животных (до 30 мин). При электронно-микроскопическом исследовании ультраструктуры неокортекса у этих животных выявлялись нарушения кровотока и целостности стенки капилляров, ярко выраженный отек клеток эндотелия, астроцитов, хроматолиз нейронов, отмечались признаки снижения синтетической активности нейронов. Присутствие миелиноподобных структур, большого количества липофусциновых гранул свидетельствовало о значительной активации процессов перекнсного окисления липидов.

Таким образом, присутствие озона в очень малых количествах в составе озоно-кислородной смеси предупреждало токсическое действие кислорода в раннем постреанимационном периоде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основе всех специфических функций нервной системы лежат энергозависнмые процессы, а особенности метаболизма и функционирования клеточных элементов мозга определяют его высокую чувствительность к состояниям, связанный с нарушениями поступления и утилизации кислорода. В связи с этим функциональная активность головного мозга при различных воздействиях напрямую зависит от уровня и направленности окислительного метаболизма.

Анализируя полученные результаты, можно заключить, что однократное применение озонированного физиологического раствора у интактных животных вызывает активацию аэробного метаболизма в ткани головного мозга за счет ускорения гликолиза и повышения утилизации кетоновых тел. Вследствие этого увеличивается активность ферментов дыхательной цепи, однако накопления АТФ не наблюдается. Показанная при ультраструктурном исследовании коры мозга активация синтеза белка позволяет объяснить повышенный расход адениловых и гуаниловых нуклеотидов их участием в белоксингезирующих процессах.

Озонированный физиологический раствор с дозой озона, приближающейся к терапевтической (2,8 мкг/кг), вызывает умеренное повышение ПОЛ и адаптивную активацию СОД при однократном воздействии на интактных животных. Увеличение окислительного воздействия в ткани головного мозга способствует снижению

степени активации СОД и повышению активности каталазы. Введение ОФР на фоне окислительного стресса в раннем постреанимационном периоде не приводит к значительному ускорению процессов ПОЛ за счет повышения активности каталазы в ткани головного мозга.

Применение озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде вызывает увеличение окисления кетоновых тел и повышение активности пентозофосфатного пути в головном мозге животных, значительное снижение лактатацидоза за счет активации ЛДГ. Активация окислительного метаболизма под действием озона приводит к повышению уровня АТФ в ткани головного мозга, потребление которой замедляется, вероятно, вследствие снижения функциональной нагрузки на мозг в постреанимационный период. При этом наблюдается более быстрое восстановление неврологического статуса. Использование озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде способствует восстановлению микроциркуляции и значительному уменьшению отека ткани мозга, активации белоксингетизирующих процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров.

Сравнение применения озонированного физиологического раствора у интактных животных и в раннем постреанимационном триоде позволяет выделить некоторые общие механизмы действия ОФР на головной мозг в норме и при критических состояниях. Очевидно, одним из первых этапов реализации действия озона является улучшение кровотока в микроциркуляторном русле головного мозга животных. Применение озонированного физиологического раствора как у интактных животных, так и в реперфузионном периоде вызывает активацию аэробного метаболизма в ткани головного мозга за счет ускорения гликолиза и повышения утилизации кетоновых тел.

Озонированный физиологический раствор вызывает активацию белоксинтезирующих процессов в нейронах и эндотелиоцитах как у интактных животных, так и раннем постреанимационном периоде. Возможно, под действием продуктов озонолиза активируется синтез специфических белков, способных повышать резистентность мозга к последующим воздействиям. С обеспечением энергией синтетических процессов, вероятно, связано и повышенное окисление кетоновых тел как более энергетически выгодного субстрата.

( 1

Применение терапевтической дозы озона в составе ОФР (2,8 мкг/кг) вызывает умеренную активацию процессов ПОЛ в ткани головного мозга и адаптивное усиление активности антиоксидантных ферментов у интактных животных и в период восстановления после клинической смерти.

Действие озонированного физиологического раствора не объясняется наличием кислорода в составе озоно-кислородной смеси. Использование оксигенированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде приводит к ухудшению восстановления функций и ранней гибели животных вследствие ухудшения микроциркуляции, нарушения выработки энергии и некомпенсированной активации процессов ПОЛ.

Таким образом, продукты озонолиза, образующиеся в результате распада введенных в организм микродоз озона, обладают нейротропным действием, за счет активации энергетического метаболизма, изменения свободнорадикального статуса, улучшения микро циркуляции и усиления процессов биосинтеза в головном мозге животных. В раннем постреанимационном периоде выявленные механизмы обеспечивают нейропротекторное действие озонированных сред.

ВЫВОДЫ

1. Применение озонированного физиологического раствора у интактных животных повышает аэробный энергетический метаболизм в ткани мозга за счет усиления гликолиза и окисления кетоновых тел, что выражается в накоплении пирувата и увеличении активности Р-об-ДГ и НАДНДГ.

2. Озонированный физиологический раствор с дозой озона 2,8 мкг/кг при однократном и длительном применении повышают активность СОД в интактном мозге. Применение ОФР длительно с высокими концентрациями озона у интактных животных или однократно на фоне окислительного стресса вызывает снижение активности СОД и увеличение активности каталазы.

3. Введение озонированного физиологического раствора и озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде активирует аэробные пути окисления глюкозы и кетоновых тел в мозге, что проявляется в увеличении активности (3-об-ДГ и Гл-6-ф-ДГ, нормализации активности ЛДГ и ПДГ, способствует повышению содержания макроэргических фосфатов, в результате чего происходит более быстрое восстановление функциональной активности ЦНС.

4. При применении озонированного физиологического раствора у интактных животных и в раннем постреанимационном периоде отмечается увеличение количества полисом и рибосом в нейронах и клетках эндотелия капилляров, реактивные изменения формы ядер нейронов, присутствие развитого гранулярного эндоплазматического ретикулума и ядрышек в ядрах нейронов, что свидетельствует об усилении синтетических процессов при применении ОФР.

5. Введение озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде вызывает улучшение кровотока в микроциркуляторном русле головного мозга животных, что выражается в присутствии эритроцитов нормального вида в капиллярах, снижении степени набухания ножек астроцитов, улучшении состояния эндотелиоцитов, уменьшении числа капилляров с нарушенным кровотоком.

6. Применение оксигенированного физиологического раствора, в отличие от озонированного, вызывает нарушение структуры капилляров, развитие выраженного отека мозговой ткани, что приводит к ранней гибели животных в постреанимационном периоде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мухина И.В., Снопова Л.Б., Миронов A.A., Миронова Е.С., Лапшин Р.Д., Дудкна Б.В., Продавец H.H. Влияние озонированного физиологического раствора на функциональное состояние головного мозга крыс в норме и в условиях гипоксии // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. - Мат. II Всерос. конф. 5-7 октября 1999 г. -М., 1999. -с.22-23.

2. Мухина ИВ., Миронов A.A., Лапшин Р.Д, Дудина Е.В. Антигипоксические свойства озонированного физиологического раствора // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. - Мат. П Всерос. конф. 5-7 октября 1999 г. -М„ 1999.-c.52.

3. Мухина И.В., Снопова Л.Б., Дудина Е.В., Лапшин Р.Д., Проданец H.H. Влияние озона на активность окислительно-восстановительных ферментов мозга в норме и в постреанимационном периоде // Реаниматология и интенсивная терапия. Анестезиология: Приложение. - 2000. - № 4. - с.21-22.

4. Mukchina I.V., Snopova L.B., Dudina E.V., Lapshin R.D., Prodanetz N.N. The influence of ozone on the brain oxidation-reduction enzyme activity in normal condition and postresuscitation period // IS* Ozone world congress. - London, 2001.- p. 189-196.

24 Р 15 13 1 TsTJP"

5. Мухина И.В., Лапшин Р.Д., Дудииа Е.В., Яковлева Е.И. Нейрофизиологические механизмы действия озонированного физиологического раствора в норме и при гипоксии //1 Междунар. научно-практ. конф. "Micneee та парентеральне використання озонотерапп в медицина". - 21-22 мая 2001 г. -Тез.докл. - Харьков, 2001. - с.57-58.

6. Мухина И.В., Яковлева Е.И., Дудина Е.В. Лапшин Р.Д., Баландина М.В., Смирнова М.Л. Влияние озонированного физиологического раствора на ультраструктуру коры головного мозга у крыс в реперфузионном периоде // Мат. I Украинско-русской научно-практ. конф. "Озон в биологии и медицине". - 28-30 апреля 2003 г. - Одесса, 2003. - с.7-9.

7. Дудина Е.В. Влияние озонированного физиологического раствора на уровень перекисиого окисления лнпидов и активность ангиоксидаитных ферментов в головном мозге животных // Мат. 8 Нижегородской конференции молодых ученых. - Нижний Новгород, 2003. - с.65-66.

8. Мухина И.В., Дудина Е.В., Андреева H.H., Лапшин Р.Д. Экспериментальное изучение нейротропного действия озонированного физиологического раствора в норме и в посгашемическом периоде // Нижегородский медицинский журнал. - Озонотерапия: Приложение. 2003. - с.14-15.

9. Яковлева Е.И., Мухина И.В., Смирнова МЛ., Лапшин Р.Д., Дудина Е.В. Влияние озонированного физиологического раствора на ультраструктуру неокортекса и печени // Нижегородский медицинский журнал. - Озонотерапия: Приложение. 2003. - с. 16.

10. Андреева H.H., Соловьева Т.Н., Мухина И.В., Дудина Е.В. Действие озонированного физиологического раствора на фосфолшщцный состав и перекисное окисление липидов мозга в реперфузионном периоде // Нижегородский медицинский журнал. - Озонотерапия: Приложение. 2003. - с. 17-18.

Подписано в печать 01.10.2003. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Зак. 1198. Тир. 100.

Типография Нижегородского госунияерситета 603000, Н.Новгород, ул. Б Покровска*, 37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дудина, Екатерина Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности окислительных процессов в головном мозге в норме и при реперфузии

1.1.1. Окислительный метаболизм и процессы свободнорадикального окисления в мозге.

1.1.2. Основные механизмы повреждения нервной ткани при реперфузии.

1.2. Механизмы биологического действия озона.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Модели и схемы экспериментов

2.1.1 .Характеристика экспериментального материала.

2.1.2. Модель клинической смерти в результате острой кровопотери

2.1.3. Модель клинической смерти в результате пережатия сердечнососудистого пучка.

2.2. Методы исследований

2.2.1. Получение озонированного физиологического раствора и определение концентрации озона в растворе.

2.2.2. Определение неврологического статуса и основных показателей гемодинамики и дыхания крыс в постреанимационном периоде.

2.2.3.Определение субстратов углеводного обмена

2.2.3.1. Определение лактата.

2.2.3.2. Определение пиру вата.

2.2.4. Методы определения интенсивности процесса перекисного окисления липидов и ферментов антиоксидантной защиты

2.2.4.1. УФ-спектроскопия молекулярных продуктов ПОЛ.

2.2.4.2. Флуориметрический метод определения содержания оснований Шиффа.

2.2.4.3.Определение активности супероксиддисмутазы.

2.2.4.4. Определение активности каталазы.

2.2.5. Определение содержания макроэргических нуклеотидов.

2.2.6. Гистохимическое определение активности ферментов.

2.2.7. Электронно-микроскопическое изучение сенсомоторной области коры головного мозга.

2.3. Методы статистической обработки материала.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В МОЗГЕ КРЫС В НОРМЕ

3.1. Влияние ОФР на энергетические процессы в ткани головного мозга.

3.2. Влияние ОФР на ультраструктуру сенсомоторной зоны коры головного мозга

3.3. Влияние однократного введения ОФР на уровень перекисного окисления и активность антиоксидантных ферментов в головном мозге.

3.4. Влияние длительного применения озонированного физиологического раствора на содержание продуктов перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты в ткани мозга.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ОЗОНИРОВАННЫХ АУТОКРОВИ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И МЕТАБОЛИЗМА ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС В РАННЕМ ПОСТРЕАНИМАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ

4.1. Восстановление неврологического статуса животных в раннем постреанимационном периоде.

4.2. Изменения энергетического метаболизма головного мозга в раннем реперфузионном периоде.

4.3. Перекисное окисление липидов в головном мозге в раннем реперфузионном периоде.

4.4. Изменения ультраструктуры сенсомоторной зоны коры головного мозга в раннем реперфузионном периоде

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние озонированного физиологического раствора на окислительные процессы головного мозга в норме и в раннем постреанимационном периоде"

Актуальность проблемы

Высокий уровень метаболизма наряду с минимальными резервами энергетических субстратов и относительно плохо развитыми механизмами антиокислительной защиты делают мозг очень чувствительным к любому изменению доставки и утилизации кислорода, что сразу же приводит к изменению его электрической активности и функции.

Методы окислительной терапии, широко применяющиеся в настоящее время как в клинической практике, так и в экспериментальной физиологии, обладают комплексным воздействием на организм. В качестве окислителя используются гипербарическая оксигенация, ультрафиолетовое облучение аутокрови, лазерное излучение, гипохлорит натрия, перекись водорода, аэроионы воздуха, озон (Ефуни С.Н., 1986; Закс И.О. и соавт., 1994; Кондрашова М.Н., 1997, Rilling S., Viebahn R„ 1987).

Озон является одним из наиболее универсальных и легкодоступных окислителей. Известно, что парентеральное введение озона, улучшая транспортную функцию крови и облегчая отдачу кислорода, обеспечивает полноценную оксигенацию тканей (Rokitansky О., 1982, Viebahn R., 1985). Применение озонированных растворов с низкой концентрацией озона способствует активации аэробных путей окисления глюкозы, увеличению синтеза АТФ, улучшению микроциркуляции тканей (Зеленов Д.М., 1988; Бояринов Г.А., Соколов В.В., 1999). В низких концентрациях озонированные среды стимулируют механизмы антиоксидантной защиты клетки и организма в целом (Конторщикова К Н., 1995).

Однако несмотря на широкое применение озонотерапии (Rilling S., Viebahn R., 1987; Перетягин С.П., 1991; Бояринов Г.А., Соколов В.В., 1999; Turrent J., Menendez S., 2001), в том числе в неврологической клинике (Котов С.А., 1999, Густов А.В. и др., 2000; Konrad Н., 2001), механизм действия озонированных сред на мозг остается во многом неизученным.

При этом действие озона на неповрежденный мозг, когда он не является органом-мишенью, является неисследованным. В связи с этим актуальным является изучение влияния озона на нормальный мозг.

Церебральная ишемия и гипоксия сопровождает очень многие патологические процессы, такие как тяжелая травма мозга, массивная кровопотеря, острая дыхательная недостаточность, экзогенные отравления, сепсис, остановка системного кровотока с последующей реанимацией и является наиболее часто встречающимся осложнением в нейроанестезиологии и сердечнососудистой хирургии (Неговский В.А., 1987, Семченко В.В. и др., 1999, Остапченко Д.А. и др., 2000).

Восстановление кровотока после периода ишемии вызывает в ткани мозга развитие окислительного стресса (Chan Р.Н., 1996; White B.C. et al, 1996). Наряду с этим вследствие вторичных нарушений микроциркуляции возникают очаги вторичной гипоксии. Такие разнонаправленные нарушения окислительного метаболизма делают особенно сложной задачу восстановления функций головного мозга в постреанимационном периоде и резко ограничивают возможности реанимации, ухудшают течение восстановительного периода и определяют развитие постреанимационных и постаноксических энцефалопатии (Пермяков Н.К. и соавт., 1986; Неговский В.А. и соавт., 1987; Семченко В В. и др., 1999, Кожура В.Л., 1999).

Восстановление кислородного гомеостаза в этих условиях является первоочередной задачей, с этой целью используются средства с различным механизмом действия - вазодилататоры, вещества, повышающие кислородную емкость крови, антигипоксанты, методы окислительной терапии.

Антигипоксические свойства озона позволяют использовать его для коррекции метаболизма при состояниях, связанных с нарушениями кровоснабжения мозга. Однако вопрос об адекватности применения окислительных методов на фоне оксидантного стресса, часто сопровождающего критические состояния, остается актуальным.

Учитывая вышеизложенное, целью нашего исследования явилось изучить влияние озонированного физиологического раствора (ОФР) на состояние окислительного метаболизма в головном мозге животных в норме и в раннем постреанимационном периоде.

Задачи исследования

1. Изучить влияние однократного введения озонированного физиологического раствора на состояние аэробного энергетического метаболизма, про- и антиоксидантную систему головного мозга у интактных животных.

2. Исследовать влияние многократного применения озонированного физиологического раствора с различной концентрацией озона на состояние перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты головного мозга у интактных животных.

3. Оценить нейропротекторное действие озонированной аутокрови и озонированного физиологического раствора на функциональную активность и метаболизм головного мозга крыс в раннем постреанимационном периоде.

Научная новизна

В работе впервые проведено сравнительное изучение влияния различных доз озона на процессы окислительного метаболизма в мозге в норме и на фоне окислительного стресса в раннем постреанимационном периоде.

В результате проведенного исследования показано, что применение озонированного физиологического раствора у интактных животных вызывает активацию аэробного метаболизма в ткани головного мозга за счет ускорения гликолиза и повышения утилизации кетоновых тел.

Показано, что в мозге интактных животных озонированный физиологический раствор вызывает значительную активацию супероксиддисмутазы (СОД) как при однократном, так и при многократном использовании. Применение ОФР на фоне исходного окислительного стресса, как и длительное введение высоких доз озона, вызывает снижение активности СОД и повышение активности каталазы.

Показано, что в раннем постреанимационном периоде применение озонированной аутокрови способствует лучшей сохранности пула адениловых нуклеотидов и скорейшему восстановлению уровня макроэргических фосфатов в мозге.

Введение ОФР в раннем постреанимационном периоде способствует улучшению кровотока в капиллярах, значительному снижению периваскулярного отека. В отличие от озонированного, оксигенированный физиологический раствор вызывает нарушения структуры капилляров, развитие сильного отека мозговой ткани в раннем постреанимационном периоде, что приводит к гибели животных.

В результате проведенного комплексного исследования показано, что применение ОФР вызывает активацию синтетических процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров в норме и раннем постреанимационном периоде.

Теоретическая и практическая значимость

Данное исследование представляет теоретический интерес для нормальной и патологической нейрофизиологии и нейрореаниматологии. Установленные факты существенно дополняют современные представления о механизмах действия озона на головной мозг.

Практическое значение результатов работы заключается в экспериментальном обосновании необходимости мониторинга изменений про- и антиоксидантых процессов, вызываемых озоном, при применении ОФР в клинике, как у больных без повреждения головного мозга, так и, особенно, при развитии в нем окислительного стресса.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на III, IV и V Всероссийских научно-практических конференциях "Озон и методы эфферентной терапии в медицине" (Нижний Новгород, 1998, 2000, 2003); XV

Международном конгрессе по озону (Великобритания, Лондон, 2001); I Международной научно-практической конференции "Мюцеве та парентеральне використання озонотерапи в медицин!" (Украина, Харьков, 2001), II и III Всероссийских конференциях "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1999, 2002); 8 Нижегородской конференции молодых ученых (2003), 1 Украинско-Российской научно-практической конференции "Озон в биологии и медицине" (2003).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Однократное применение озонированного физиологического раствора с дозой озона 2,8 мкг/кг активирует аэробный энергетический метаболизм в ткани головного мозга у интактных животных, повышает активность СОД. При многократном введении ОФР с разными дозами озона интактным животным наблюдается интенсификация процессов ПОЛ, увеличение активности СОД, в меньшей степени каталазы. При введении ОФР на фоне окислительного стресса (в постреанимационном периоде) активность СОД снижается, наблюдается активация каталазы.

2. Введение озонированного физиологического раствора и озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде улучшает микроциркуляцию, активирует аэробные пути окисления глюкозы и кетоновых тел, повышает уровень макроэргических фосфатов в головном мозге, в результате чего происходит более быстрое восстановление функциональной активности ЦНС.

3. Озонированный физиологический раствор вызывает усиление синтетических процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров в интактном мозге и в раннем постреанимационном периоде.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Дудина, Екатерина Владимировна

выводы

1. Применение озонированного физиологического раствора у интактных животных повышает аэробный энергетический метаболизм в ткани мозга за счет усиления гликолиза и окисления кетоновых тел, что выражается в накоплении пирувата и увеличении активности |3-об-ДГ и НАДНДГ.

2. Озонированный физиологический раствор с дозой озона 2,8 мкг/кг при однократном и длительном применении повышают активность СОД в интактном мозге. Применение ОФР длительно с высокими концентрациями озона у интактных животных или однократно на фоне окислительного стресса вызывает снижение активности СОД и увеличение активности каталазы.

3. Введение озонированного физиологического раствора и озонированной аутокрови в раннем постреанимационном периоде активирует аэробные пути окисления глюкозы и кетоновых тел в мозге, что проявляется в увеличении активности (3-об-ДГ и Гл-6-ф-ДГ, нормализации активности ЛДГ и ПДГ, способствует повышению содержания макроэргических фосфатов, в результате чего происходит более быстрое восстановление функциональной активности ЦНС.

4. При применении озонированного физиологического раствора у интактных животных и в раннем постреанимационном периоде отмечается увеличение количества полисом и рибосом в нейронах и клетках эндотелия капилляров, реактивные изменения формы ядер нейронов, присутствие развитого гранулярного эндоплазматического ретикулума и ядрышек в ядрах нейронов, что свидетельствует об усилении синтетических процессов при применении ОФР.

5. Введение озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде вызывает улучшение кровотока в микроциркуляторном русле головного мозга животных, что выражается в присутствии эритроцитов нормального вида в капиллярах, снижении степени набухания ножек астроцитов, улучшении состояния эндотелиоцитов, уменьшении числа капилляров с нарушенным кровотоком.

6. Применение оксигенированного физиологического раствора, в отличие от озонированного, вызывает нарушение структуры капилляров, развитие выраженного отека мозговой ткани, что приводит к ранней гибели животных в постреанимационном периоде.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основе всех специфических функций нервной системы лежат энергозависимые процессы, а особенности метаболизма и функционирования клеточных элементов мозга определяют его высокую чувствительность к состояниям, связанным с нарушениями поступления и утилизации кислорода. В связи с этим функциональная активность головного мозга при различных воздействиях напрямую зависит от уровня и направленности окислительного метаболизма.

Анализируя полученные результаты, можно заключить, что однократное применение озонированного физиологического раствора у интактных животных вызывает активацию аэробного метаболизма в ткани головного мозга за счет ускорения гликолиза и повышения утилизации кетоновых тел. Вследствие этого увеличивается активность ферментов дыхательной цепи, однако накопления АТФ не наблюдается. Показанная при ультраструктурном исследовании коры мозга активация синтеза белка позволяет объяснить повышенный расход адениловых и гуаниловых нуклеотидов их участием в белоксинтезирующих процессах.

Озонированный физиологический раствор с дозой озона 2,8 мкг/кг, вызывает умеренное повышение ПОЛ и адаптивную активацию СОД при однократном воздействии на интактных животных. Увеличение окислительного воздействия в ткани головного мозга способствует снижению степени активации СОД и повышению активности каталазы. Введение ОФР на фоне окислительного стресса в раннем постреанимационном периоде не приводит к значительному ускорению процессов ПОЛ за счет повышения активности каталазы в ткани головного мозга.

Применение озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде вызывает увеличение окисления кетоновых тел и повышение активности пентозофосфатного пути в головном мозге животных, значительное снижение лактатацидоза за счет активации ЛДГ. Активация окислительного метаболизма под действием озона приводит к повышению уровня АТФ в ткани головного мозга, потребление которой замедляется, вероятно, вследствие снижения функциональной нагрузки на мозг в постреанимационном периоде. При этом наблюдается более быстрое восстановление неврологического статуса. Использование озонированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде способствует восстановлению микроциркуляции и значительному уменьшению отека ткани мозга, активации белок-синтетизирующих процессов в нейронах и клетках эндотелия капилляров.

Сравнение применения озонированного физиологического раствора у интактных животных и в раннем постреанимационном периоде позволяет выделить некоторые общие механизмы действия ОФР на головной мозг в норме и при критических состояниях. Очевидно, одним из первых этапов реализации действия озона является улучшение кровотока в микроциркуляторном русле головного мозга животных. Применение озонированного физиологического раствора как у интактных животных, так и в реперфузионном периоде вызывает активацию аэробного метаболизма в ткани головного мозга за счет ускорения гликолиза и повышения утилизации кетоновых тел.

Озонированный физиологический раствор вызывает активацию белоксинтезирующих процессов в нейронах и эндотелиоцитах как у интактных животных, так и раннем постреанимационном периоде. Возможно, под действием продуктов озонолиза активируется синтез специфических белков, способных повышать резистентность мозга к последующим воздействиям. С обеспечением энергией синтетических процессов, вероятно, связано и повышенное окисление кетоновых тел как более энергетически выгодного субстрата.

Применение терапевтической дозы озона в составе ОФР (2,8 мкг/кг) вызывает умеренную активацию процессов ПОЛ в ткани головного мозга и адаптивное усиление активности антиоксидантных ферментов у интактных животных и в период восстановления после клинической смерти.

Действие озонированного физиологического раствора не объясняется наличием кислорода в составе озоно-кислородной смеси. Использование оксигенированного физиологического раствора в раннем постреанимационном периоде приводит к ухудшению восстановления функций и ранней гибели животных вследствие ухудшения микроциркуляции, нарушения выработки энергии и некомпенсированной активации процессов ПОЛ.

Таким образом, продукты озонолиза, образующиеся в результате распада введенных в организм м икр о доз озона, обладают нейротропным действием, за счет активации энергетического метаболизма, изменения свободнорадикального статуса, улучшения микроциркуляции и усиления процессов биосинтеза в головном мозге животных. В раннем постреанимационном периоде выявленные механизмы обеспечивают нейропротекторное действие озонированных сред.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дудина, Екатерина Владимировна, Нижний Новгород

1. Аврушенко М.Ш., Саморукова И.В. Закономерности постреанимационных изменений мозга на уровне нейрональных популяций // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Мат. III Всерос.конф. Москва, 7-9 октября 2002. - С.4-5.

2. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М.: Наука, 1982.-151 с.

3. Асатиани B.C. Новые методы биохимической фотометрии. М.: Наука, 1965. - 541 с.

4. Ашмарин В.П., Стукалов П.В. Нейрохимия. - М., 1996. - 320 с.

5. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992. - 148 с.

6. Берстон М.С. Гистохимия ферментов: Пер. с англ.- М.: Мир, 1965.464 с.

7. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов (молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения). М.:Медицина,1989. 368 с.

8. Боголепов Н.Н. Ультраструктура мозга при гипоксии. М., 1979. —167 с.

9. Болдырев А.А. Введение в биомембранологию. М.: Изд-во МГУ,1990. 208 с.

10. Болдырев А.А., Куклей М.Л. Свободные радикалы в нормальном и ишемическом мозге // Нейрохимия. 1996. - № 4. - С.271-278.

11. Болдырев А. А. Окислительный стресс и мозг // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т.7. - № 4. - С.21-28.

12. Бояринов Г.А. Балыкин В.А., Медведев А.П. и соавт. Предупреждение гипоксических повреждений печени при искусственном кровообращении (ИК) озонированием перфузата // Тез. докл. X Всерос. пленума правления анест. иреаним.- Н.Новгород, 1995,- С. 87-88.

13. Бояринов Г.А., Пенкнович А.А., Мухина И.В., Селиверстов А.А. Коррекция антигипоксантами кислородотранспортной функции крови при черепно-мозговой травме // Тез. X Всерос. Пленума правления анест. и реаним. Н.Новгород, 1995. - с. 89.

14. Бояринов Г. А., Соколов В.В. Озонированное искусственное кровообращение. Н.Новгород. - Изд-во "Покровка", 1999. - 318 с.

15. Бурлакова Е.Б. Роль липидов в процессе передачи информации в клетке // Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. — М.:Наука, 1981. — С.23-34.

16. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты. // Успехи химии.- 1985,- Т.54, №9 -С.1540-1559.

17. Викторов И В. Некроз и апоптоз — основные типы гибели нейронов при ишемии // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Мат. II Всерос. конф. Москва, 5-7 октября 1999 г. - М., 1999. - С. 13-14.

18. Виленский Б.С. Неотложные состояния в невропатологии: (Руководство для врачей). — Л.: Медицина, 1986. — 304 с.

19. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. -1987. Т.32, вып.5. - С.830-841.

20. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

21. Вольнов И.И. Перекиси, надперекиси и озониды щелочных и щелочноземельных металлов. М., 1964. - 87 с.

22. Гусев В.А, Брусов О.С., Панченко Л.Ф.- Супероксиддисмутаза -радиобиологическое значение и возможности. // Вопр.мед.химии 1980,- №3.-С.291-301.

23. Густов А.В., Котов С.А., Конторщикова К.Н., Потехина Ю.П. Озонотерапия в неврологии. Н.Новгород: "Литера", 1999. — 179 с.

24. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса // Вопр.мед. химии. 2001. - Т.47, вып.6. - С.561-582.

25. Евстигнеева Р.П., Волков И.М., Чудинова В.В. Витамин Е как универсальный антиоксидант и стабилизатор биологических мембран // Биол.мембраны. 1998. - т. 15, №2. - С. 119-130.

26. Ефуни С.Н. Руководство по гипербарической оксигенации. Теория и практика. М., Медицина, 1986. - 416 с.

27. Ещенко Н.Д., Путилина Н.Ф. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Л: Изд-во Ленингр.ун-та, 1982. - 272 с.

28. Ещенко Н.Д. и др. // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. Мат. III Всерос.конф. Москва, 7-9 октября 2002. - С.48

29. Жемарина Н.В., Смирнов В.П. Влияние экстракорпорального озонирования крови на морфо-функциональные характеристики миокарда // Озон и методы эфферентной терапии в медицине: Мат. III Всерос. науч,-практ. конф. Нижний Новгород, 1998. - С. 17-18.

30. Журавлев А.И. // В кн.: Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М., Наука, 1982. - С.3-36.

31. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Оксидантный стресс — общий механизм повреждения при заболеваниях ЦНС // Ж. неврологии и психиатрии. 1996. — т.96, №2. - С. 111-114.

32. Зайцев В .Я., Разумовский С.Д. Озонидотерапия // Озон и методы эфферентной терапии в медицине: Мат. III Всерос. научно-практич. конф. -Нижний Новгород, 1998. С. 11-12.

33. Закс И.О., Богоявленский И.Ф., Мартынов А.К. Гипохлорит натрия в комплексной интенсивной терапии постреанимационных состояний // Анест. и реаниматол,- 1994 № 2- С. 22-24.

34. Зеленое Д.М. Влияние озонированного кислорода и гутимина на морфометаболические изменения в печени и почках при длительном искусственном кровообращении: Автореф. дисс. .канд. мед. наук. М, 1988,16 с.

35. Зенков Н.К. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика. Новосиб.: РАМН, Сибирское отделение, 1993. - 181 с.

36. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи совр. биологии. — 1993. -Т. 113, Вып.З. — С.286-296.

37. Иванова Т.И., Рубель Л.И. Разделение адениловых нуклеотидов методом колоночной хроматографии на эктеоле-целлюл озе. // Ж. эволюционной биохимии и физиологии.- 1965.- Т.5, №3.- С.279-287.

38. Идо в И.Э. Аспекты применения озона в медицине // Анестезиология и реаниматология. 1997. - № 1. - С. 90 - 94.

39. Калер Р.В. Взаимодействие озона с мембранами эритроцитов // Биол.мембраны- 1989,- №11- С.64-69.

40. Кендыш И.Н. Регуляция углеводного обмена.- М.: Медицина, 1985.272 с.

41. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи современной биологии. 1993. - Т. 113, Вып.4. - С.456-470.

42. Кожура В.Л. Актуальные проблемы нейробиологии массивной кровопотери // Реаниматология на рубеже XXI века: Мат. Между нар. симпоз. -М., 1996. С. 40-41.

43. Кожура В.Л. Апоптоз и некробиоз как механизмы дегенеративных изменений в ЦНС при массивной кровопотере // Теоретические и клинические проблемы современной реаниматологии: Мат. Междунар. симпоз., поев. 90-летию акад. В.А. Неговского. М., 1999. - С. 61.

44. Колесова О.Е., Фролова Т.М., Зайцев В.Я., Синегуб Г.А. Стимулирующий эффект озонированного физиологического раствора на антиоксидантную систему организма // Озон в биологии и медицине: Мат. I Всерос. научно-практ. конф. Н.Новгород, 1992. - С. 18-19.

45. Кометиани П. А. Биохимические аспекты ишемии головного мозга // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1980. - №5. - С.79-84.

46. Конев С.В., Матус В.К. Озонобиология: молекулярно-мембранные основы. // Озон в биологии и медицине: Мат. I Всерос. научно-практ. конф. -Н.Новгород, 1992. С.27-28.

47. Кондрашова М.Н. Антиоксидантное действие прооксидантов (Вс1-2, супероксид воздуха, янтарная кислота) // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Матер. Всерос. конф. М.: БЭБиМ, 1997. - С. 60.

48. Конторщикова К.Н. Перекисное окисление липидов при коррекции гипоксических состояний физико-химическими факторами: Автореф. диссдокт. биол. наук. Санкт-Петербург, 1992. — 30 с.

49. Конторщикова К.Н. Озон и перекисное окисление липидов. // Озон в биологии и медицине: Мат. I Всерос. научно-практ. конф. Н.Новгород, 1992. - С.50-54.

50. Конторщикова К.Н. Биохимические основы эффективности озонотерапии // Озон в биологии и медицине: Мат. II Всерос. научно-практ. конф. Н.Новгород, 1995. - С.8.

51. Корпачев В.Г., Лысенков С.П., Тель Л.З. Моделирование клинической смерти и постреанимационной болезни у крыс // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1982. - №3. - С. 78-80.

52. Котгрелл Д. Е. Защита мозга // Анестезиология и реаниматология. -1996. №2. - С. 81-85.

53. Лапшин Р.Д. Функциональная оценка состояния головного мозга крыс при действии озонированного физиологического раствора: Автореф.дисс. . канд. биол. наук. Н.Новгород, 2001. - 23 с.

54. Лебкова Н.П. Ультраструктурные аспекты озонотерапии // Озон и методы эфферентной терапии в медицине: Мат. III Всеросс. научно-практ. конф. Нижний Новгород, 1998. - С. 33.

55. Лил л и Р. Гистологическая техника и практическая гистохимия: Пер. с англ. М.: Мир, 1969. - 645 с.

56. Лойда С., Госфау Р., Шиблер Т. (Loyda S., Gosfay R., Schibler Т.) Гистохимия ферментов: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. - 272 с.

57. Лукьянова Л.Д. Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена / Сб.научн.тр. Пущино, 1987. - С.153-161.

58. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Гипоксия и оксид азота // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Мат. II Всерос. конф. М., 1999. — С.44-45.

59. Маслова Г.Т., Боборико Т.Л., Шамко Е.Н. Активность антиоксидантных ферментов в условиях дефицита кислорода. / В сб.: Кислородные радикалы в химии и биологии. Минск: Наука и техника, 1984,-С.45-51.

60. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи современной биологии. — 1993. -Т.113, вып.4. -С.442-456.

61. Молчанова Л.Е., Ершова З.Я. Активность сукцинат- и лактатдегидрогеназы в коре головного мозга крыс в восстановительном периоде после остановки сердца // В сб.: Терминальные состояния и постреанимационная патология организма. М., 1992. - С.42-48.

62. Мухина И.В. Влияние препаратов с антигипоксическими свойствами на функциональное состояние сердца и мозга в реперфузионном периоде: Автофер.дисс. . докт.биол.наук. — Москва, 1999. — 312 с.

63. Мчедлишвили Г.И. Микроциркуляция крови: общие закономерности регулирования и нарушений. Л.: Наука, 1989. - 296 с.

64. Неговский В.А., Гурвич A.M., Золотокрылина Е.С. Постреанимационная болезнь. М., 1987. - 480 с.

65. Никушкин Е.В. Перекисное окисление липидов в ЦНС в норме и при патологии // Нейрохимия. 1989. - Т. 8, № 1. - С. 124-146.

66. Остапченко Д.А., Шишкина Е.В., Мороз ВВ. Транспорт и потребление кислорода у больных в критических состояниях // Анестезиология и реаниматология. 2000. - №2. - С.68-71.

67. Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование озонотерапии постгеморрагического периода: Автореф.дисс.докт.мед.наук. Казань, 1991. -30 с.

68. Перетягин С.П. Механизмы лечебного действия озона при гипоксии // Озон в биологии и медицине: Мат. I Всерос. научно-практ. конф. -Н.Новгород, 1992. С.4-5.

69. Пермяков Н.К., Хучуа А.В., Туманский В.А. Постреанимационная энцефалопатия. М. .Медицина, 1986. — 240 с.

70. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. М.: Изд-во иностр. литературы, 1962. - 265 с.

71. Пылова С.И. Аденилатциклазная система ткани головного мозга при клинической смерти и в постреанимационном периоде // Нейрохимия. 1988. -Т.7, № 1. -С.39-46.

72. Разумовский С.Д., Заиков Г.Е. Озон и его реакции с органическими соединениями. М.: Наука, 1974,- 322 с.

73. Риллинг 3., Фибан Р. Практика озонокислородной терапии. — Изд-во медицинской литературы д-ра Э. Фишера, 1997. 152 с.

74. Рябов Г.А. Гипоксия критических состояний. М.: Медицина, 1988,288 с.

75. Семченко В.В., Степанов С.С., Алексеева Г.В. Постаноксическая энцефалопатия. Омск., 1999 г. - 448 с.

76. Смирнов А.В., Криворучко Б.И. Антигипоксанты в неотложной медицине // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1998. - №2. - С. 50-55.

77. Хачатрян Г.С., Казарян А.Р., Адамян М.Х. и др. Интенсиность пентозного цикла в мозгу при различных функциональных состояниях ЦНС и действии биологически активных веществ // Нейрохимия. 1988. - Т.7, № 3. -С.405-414.

78. Хватова Е.М., Сидоркина А.Н., Миронова Г.В. Нуклеотиды мозга. (Метаболизм и оценка при кислородном голодании). М.:Медицина, 1989. 298 с.

79. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. Т.2. М.: Мир, 1980.- С 536-541.

80. Шмидт Р.Ф., Тевс Г. Физиология человека: Пер. с англ. М.: Мир, 1985.-272 с.

81. Щербаков П.Н., Пилипенко Т.П., Семченко В.В. и соавт. Использование озонотерапии при черепно-мозговой травме // Тез.докл. VIII Всерос. съезда анестезиологов и реаниматологов. — Омск, 11-15 сентября, 2002. Омск, 2002. - с. 114.

82. Aebi Н. Methoden der enzymatischen analyses. Verlag Chemie. Academic Press Inc.-1970.- Bd.2,5.- P.636-647.

83. Avila-Costa M.R., Colin-Barenque L., Fortoul T.I. Memory deterioration in an oxidative stress model and its correlation with cytological changes on rat hippocampus CA1 // Neurosci. Lett. 1999. - Vol.30, No.2. - P. 107-109.

84. Beckman J.S. et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1990. - Vol.87. - P. 1620-1624.

85. Benuck M., Banay-Schwartz M., Lajtha A. Proteolytic activity is altered in brain tissue of rats upon chronic exposure to ozone // Life Sci. — 1993. Vol. 52(10).-P.877-881.

86. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie, Academic Press.Inc.- 1974 - Vol.3.- P. 1450-1451.

87. Berlett В., Stadtman E. Protein oxidation in aging, disease and oxidative stress / J. of Biol.Chem. 1997. - Vol.272, No.33. - P.20313-20316.

88. Blazquez C., Woods A., Ceballos M. et al. The AMP-activated Protein kinase is involved in the regulation of ketone body production by astrocytes // J. of Neurochem. 1999. - Vol.73. - P.1674-1682.

89. Blomgvist G., Thorell J., Ingvar M. et al. Use of R-betal-llC.hydroxybutirate in PET studies of regional cerebral uptake of ketone bodies in humans // Am. J. Physiol. 1995. - Vol.269, No 5, Ptl. - P.E948-E959.

90. Bocci V. Ozone as a bioregulator. Pharmacology and toxicology of ozonetherapy today // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 1996. - Vol. 10, No.2-3. -P. 31-53.

91. Bocci V., Luzzi E., Corradeschi F., Silvestri S. Studies on the biological effects of ozone: 6. Production of transforming growth factor 1 by human blood after ozone treatment // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 1994. - Vol. 8, No.4. - P. 108-112.

92. Bolanos J.P., Almeida A. Roles of nitric oxide in brain hypoxia-ischemia // BBA. 1999. - Vol. 1411. - P.415-436.

93. Busija D. Effects of ischemia on expression of cyclooxygenase and endothelial nitric oxide synthase in the cerebral circulation // Internat. Symp. "Ischemic blood flow in the brain". Tokyo, 1999. - P.48.

94. Cadet J.L., Brannock C. Free radicals and the pathobiology of brain dopamine systems // Neurochem.Int. 1998. - Vol.32, No.2. - P.l 17-131.

95. Chan P.H. Role of oxidants in ischemia brain damage // Stroke. 1996. -Vol.27.-P. 1124-1129.

96. Chan P.H. Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain // J. of Cerebral Blood Flow. 2001. - Vol.21. - P.2-14.

97. Chromy V., Kukla R., Hornakova M., Malimankova A., Belusa J. Diagn.Lab.- 1975,- Vol.11.- P.231.

98. Cottet-Emard J.M., Dalmaz Y., Pequignot J., Peyrin L., Pequignot J.M. Long-term exposure to ozone alters peripheral and central catecholamineactivity in rats // Pflugers. Arch. 1997. - Vol. 433, No.6. - P. 744-749.

99. Custodio-Ramirez V., Paz C. Ozone produces functional deficits in the rat visual pathway // Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 1997. - Vol. 104, No.3. - P. 269-273.

100. Daikhin Y., Yudkoff M. Ketone bodies and brain glutamate and GAB A metabolism // Dev.Neurosci. 1998. - Vol.20, No.4-5. - P.358-364.

101. Daikhin Y., Yudkoff M. Compartmentation of brain glutamate metabolism in neurons and glia // J.Nutr. 2000. - Vol.130. - P.1026S-1031S.

102. Darley-Usmar V., Stone D., Smith D., Martin J. Mitochondria, oxygen and reperfusion damage. // Ann.Med 1991.-Vol.23, No.5 - P.583-588.

103. Delgado-Esteban M., Almeida A., Bolanos J. D-glucose prevents glutathione oxidation and mitochondrial damage after glutamate receptor stimulation in rat cortical primary neurons // J. Neurochem. 2000. - Vol.75, No.4. -P.1618-1624.

104. Dienel G. et al. // J.Neurochem. 1986. - Vol.61, No.2. - P.1230-1239.

105. Dorstewitz H. Ozon- Sauerstoff Therapie. Eine Einfuhrung. // Atztez. Naturheilverfahr.- 1992 Vol.33, No. 11.- P.909-913.

106. Erecinska M., Nelson D, Daikhin Y, Yudkoff M. Regulation of GAB A level in rat brain synaptosomes: fluxes through enzymes of the GAB A shunt and effects of glutamate, calcium, and ketone bodies // J. Neurochem. 1996 . - Vol.67, No.6. - P.2325-2334.

107. Eschenko N., Zacharova L., Putilina F., Vilkova V. Glutamate metabolism in the rat brain under hypoxia // J.Neurochem. 1998. - Vol.71: Suppl. — P.18.

108. Faraci F., Heistad D. Regulation of the cerebral circulation: role of endothelium and potassium channels // Physiol.Rew. 1998. - Vol.78, No.l. -P.53-97.

109. Fletcher D., Dillared C., Tappel A. Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological system and tissues. // Anal.Biochem.- 1973.-Vol.52.- P.497-499.

110. Folch J., Less M., Stanley A. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J.Biol. Chem. 1957. - Vol. 226, No 2.-P. 497-509.

111. Gonzalez-Pina R., Paz C. Brain monoamine changes in rats after short periods of ozone exposure // Neurochem. Res. 1997. - Vol. 22, No.l. - P. 63-66.

112. Gow A.J., Chen Q., Gole M. et al. Two distinct mechanisms of nitric oxide-mediated neuronal cell death show thiol dependency // Am.J.Physiol. Cell. Physiol. 2000. - Vol.278. - p.C1099-Cl 107.

113. Graham J.A., Menzel D.B., Mole M.L. et al. Influence of ozone on pentobarbital pharmacokinetics in mice // Toxicol. Lett., 1985. — Vol.24, No.2-3. — P. 163-170.

114. Guzman M., Blazquez C. Is there an astrocyte-neuron ketone body shuttle // Trends in Endocrinology and metabolism. — 2001. — Vol.12, No.l. — P. 169-173.

115. Hallenbeck J.M. Blood-damaged tissue interaction in experimental brain ischemia // Acta Neurochir Suppl (Wien) 1994 - Vol.60. - P.233-240

116. Halliwell B. Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry and role in human disease // Am.J. of Medicine. 1991. - Vol.91, No.3C. - P. 14S-23S.

117. Heales S.J., Land J.M., Clark J.B. et al. Glutatione, mitochondria and neurodegeneration 11 J.Neurochem. 1998. - Vol.71: Suppl. - P.7.

118. Huitron-Resendis S., Custodio-Ramirez V., Escalante-Membrillo C. et al. Sleep alterations and brain regional changes of serotonin and its metabolite in rats exposed to ozone // Neurosci.Lett. 1994. - Vol. 177, Nol-2. - P. 119-122.

119. Islekel S., Islekel H., Guner G., Ozdamar N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion // Res. Exp. Med (Berl). 1999. - Vol.199, No.3. - P. 167176.

120. Juurlink B.H. Response of glial cells to ischemia: roles of reactive oxygen species and glutathione // Neurosci. Biobehav. Rev., 1997. — Vol.21, No.2. — P.151-166.

121. Kashiwaya Y., Takeshima Т., Mori N. et al. D-(3-hydrohybutirate protects neurons in models of Alzheimer's and Parkinson"s disease // PNAS. — 2000. Vol.97, NolO. - P.5440-5444.

122. Katz L., Callaway C., Kagan V., Kochanek P. Electron spin resonance measure of brain antioxidant activity during ischemia/reperfusion // Neuroreport. -1998. Vol.9, No. 7. - P.1587-1593.

123. Kawakami M., Okabe E. Superoxide anion radical-triggered Ca2+ release from cardiac sarcoplasmic reticulum through ryanodine receptor Ca2+ channel // Mol. Pharmacol. 1998. - Vol. 53, No 3. - P. 497-503.

124. Konrad H. Ozone Therapy for post-herpetic neuralgia // International ozone association, 15th world congress. London, 2001. - P. 172-176.

125. Kontos H.A. Oxygen radicals in cerebral vascular injury // Circ.Res. -1985. Vol.57. - P.508-516.

126. Kontos H.A. Oxygen radicals in cerebral ischemia // Stroke. 2001. -Vol.32.-P.27-39.

127. Korf J., Stevens H., Knollema S. et al. Food restriction and other factors leading to adaptation to hypoxia-ischemia // J.Neurochem. 1998. - Vol.71: Suppl. - P.32.

128. Kristian Т., Siesjo В.К. Calcium in ischemic cell death // Stroke. 1998.- Vol.29.-P.705-718.

129. Kuroda S., Nakai A., Kristian Т., Siesjo B. The calmodulin antagonist trifluoperazine in transient focal brain ischemia in rats. Anti-ischemic effect and therapeutic window // Stroke. 1997. - Vol.28, No. 12. - P.2539-2544.

130. Laskin DL, Laskin JD. Macrophages, Inflammatory Mediators, and Lung Injury // Methods. 1996. - Vol.10, No.l. - P.61-70.

131. Laszczyca P., Kawka-Serwecinska E., Witas I., et al. Lipid peroxidation and activity of antioxidative enzymes in the rat model of ozone therapy //Mater.Med.Pol. 1996. - Vol.28(4). - P. 155-60.

132. Lenaz G. Role of mitochondria in oxidative stress and ageing // BBA. — 1999. Vol.1366. - P.53-67.

133. Liu P., Hsu C., Dizdaroglu M. et al. Damage, repair and mutagenesis in nuclear genes after mouse forebrain ischemia-reperfusion // J. Neurosci. 1996. —- Vol. 16(21). P.6795-6806.

134. Llibre J., Samper J., Laucerique Т., Perez Z. Treatment of senile dementia Alzheimer type with ozone therapy and electromagnetic field // 2nd International symp. on ozone applicatios. — Havana, Cuba. 1997. — p.33.

135. Lopez-Barneo J., Pardal R., Ortega-Saenz P. Cellular mechanism of oxygen sensing // Annu.Rev.Physiol. 2001. - Vol.63. - P.259-287.

136. Marchall-Manifold T. Ozone as an oxidant and its influence on free radical activity and antioxidant levels in the human environment in disease and health // International ozone association, 15th world congress. London, 2001. -P. 315-323.

137. Martin L. Neuronal cell death in nervous system development, disease and injury (Review) // Int. J. Mol. Med. 2001. - May. - Vol 7(5). - P.455-478.

138. Massieu L., Gomez-Roman N., Montiel T. In vivo potentiation of glutamate-initiated neuronal damage after chronic administration of the glycolysis inhibitor iodoacetate // Exp. Neurol. 2000. - Vol. 165, No.2. - P.257-267.

139. Meldrum B.S. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology // J.Nutr. 2000. - Vol. 130. - P. 1007S-1005S.

140. Melov S., Coskun P., Patel M. et al. Mitochondrial disease in superoxide dismutase-2 mutant mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. -Vol.96, No.3.-P.846-851.

141. Menendes S. Biochemical Mechanisms present in medical ozone applications. //2nd International Symposium on Ozone Applications. Abstracts.-Havana, Cuba, 1997,-P. 15.

142. Mishenfelder D., Livingstone H. Anaesthesia and brain. London, 1988.-215 p.

143. Moraleda G. Ozone therapy in the functional recovery from diseases involving damage to central nervous system cells // 12th Ozone world congress. — Lille, France. 1995. - P. 111-123.

144. Nelson C.W., Wei E.P., Povlishock J.T. et al. Oxygen radicals in cerebral ischemia // Am.J.Physiol. 1992. - Vol.263. - P.H1356-H1362.

145. Nicholls D., Budd S. Mitochondria and neuronal glutamate excitotoxicity // BBA. 1998. - Vol. 1366. - P.97-112.

146. Nischikimi M., Rao A., Xagi K. The accurence of superoxide anion in the reaction of reduced phenahine metasulfate and molecular oxygen. // Biochem.Biophys.Res.Commun.- 1972,- Vol.146, No 2.- P.849-854.

147. Nogawa S.} Forster C., Zhang F. et al. Interaction between inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 after cerebral ischemia // Proc.Natl.Acad.Sci. 1998. - Vol.95. - P. 10966-10976.

148. Palmada M., Centelles J,J. Excitatory amino acid neurotransmission. Pathways for metabolism, storage and reuptake of glutamate in brain // Frntiers in Bioscience. 1998. - Vol.7. - P.701-718.

149. Pascual J., Carceller F., Roda J., Cerdan S. Glutamate, glutamine and GABA as substrates for the neuronal ang glial compartments after focal cerebral ischemia in the rat // J.Neurochem. 1998. - Vol.71. - Suppl. - P. 53.

150. Piantadosi C., Zhang J. Mitochondrial generation of reactive oxygen species after brain ischemia in the rat // Stroke. 1996. — Vol.27. - P.327-332.

151. Poitry-Yamate C., Poitry S., Tsacpoulos M. Lactate released by Muller glial cells is metabolized by photoreceptors from mammalian retina // J.Neurosci. -1995.-Vol. 15. P.5179-5191.

152. Rahman I., Massaro G., Massaro D. Exposure of rats to ozone: evidence of damage to heart and brain // Free Radic. Biol. Med. 1992. - Vol.12, No.4. — P.323-326.

153. Rao A., Hatcher J., Kindy M., Dempsey R. Arachidonic acid and leukotriene C4: role in transient cerebral ischemia of gerbils // Neurochem. Res. — 1999. Vol.24, No. 10. - P. 1225-1232.

154. Re L., Barocci S., Rinaldi et. al. Oxygen-ozone therapy in the prevention of the oxidative cellular damage: an antiageing hypothesis // International ozone association, 15th world congress. London, 2001. — P.324.

155. Richelmi P., Franzini M.,Valdenassi L. Ossigeno-ozono therapia.-Palvia Bergamo, 1995,- 80 p.

156. Rilling S., Viebahn R. The use of ozone in medicine. -New York: Haug, 1987. 180 p.

157. Rivas-Arancibia S., Vazquez-Sandoval R., Gonzalez-Kladiano D., Schneider-Rivas S., Lechuga-Guerrero A. Effects of ozone exposure in rats on memory and levels of brain and pulmonary superoxide dismutase // Environ. Res. -1998. Vol. 76, Nol. - P. 33-39.

158. Rodichok L.D., Albers R.W. The effect of y-aminobutyric acid on substrate level phosphorilation in brain mitochondria // J.Neurochem. 1980. -Vol.43.-P.808-212.

159. Rodrigues M., Garcia J., Menendes S., Devesa E., Cambara A. Ozone therapy in the treatment of the elderly patients suffering from Parkinson" s syndromes // 2nd International symp. on ozone applicatios. Havana, Cuba. - 1997. - p.34.

160. Rokitansky O. Klinik und biochemie der ozontherapie // Ozontherapie. -1982.-No 52.-S. 643-711

161. Rokyta R., Racek J., Holecek V. Free radicals in the central nervous system // Cesk Fysiol., 1996. Vol.45, No.l. - P.4-12.

162. Samouilidou E.C., Karli J.N., Levis G.M., Darsinos J.T The sarcolemmal Ca2+-ATPase of the ischemic-reperfused myocardium: protective effect of hypocalcemia on calmodulin-stimulated activity // Life Sci. 1998. - Vol. 62, №1. - P. 29-36.

163. Sartori H.E. Ozon the eternal purifier of the Earth and cleanser of all living beings. Life Science Foundation, 1994. - 556 p.

164. Schwartzkroin P.A. Mechanisms underlying the anti-epileptic efficacy of the ketogenic diet // Epilepsy Res. 1999. - Vol.37(3). - P.171-180.

165. Siesjo В., Rehncrona S. Механизмы повреждения клеток мозга при гипоксии и ишемии // Анест. и реанимат. — 1980. №6. - С. 16-19.

166. Siesjo В., Agardh С., Bengtsson F. Free radicals and brain damage // Cerebrovasc.Brain Metab.Rev. 1989. - Vol. 1. - P. 165-211.

167. Siesjo В., Katsura K., Kristian Т., Li P., Siesjo P. Molecular mechanisms of acidosis-mediated damage // Acta Neurochir Suppl (Wien). 1996. - Vol.66. -P.8-14.

168. Shiratori R., Kaneko Y., Kobayashi Y. et al. Can ozone administration activate the tissue metabolism A study on brain metabolism during hypoxic hypoxia // Masui. - 1993. - Vol.42, No. 1. - P.2-6.

169. Shulman R.G., Hyder F., Rothman D.L. Cerebral energetics and the glycogen shunt: neurochemical basis of functional imaging // PNAS. — 2001. — Vol.98, No. 11.-P.6417-6422.

170. Sunnen G.V. Ozone in Medicine: overview and future direction // Proc. 9th Ozone World Congress. New York, 1989. - Vol. 3. - P. 1-16.

171. Trabace L., Kendrick K. Nitric oxide can differentially modulate striatal neurotransmitter concentrations via soluble gyanylate cyclase and peroxynitrite formation // J. of Neurochemistry. 2000. - Vol.75, No.4. - P. 1664-1674.

172. Turrent J., Menendez S. Ozone Therapy: Experiences in Critically ill Patients // International ozone association, 15th world congress. London, 2001. -P.202-210.

173. Viebann R. The biochemical process underlying ozone therapy // Ozonachrichter. 1985. - No.4. - P. 18-30.

174. Wasser C. Additional therapy of cerebro-vascular disorder (here: acute brain stroke) by ozone therapy // 12th Ozone world congress. Lille, France. - 1995. - P.91-98.

175. Wei E., Kontos H., Beckman J. Mechanisms of cerebral vasodilatation by superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite // Am.J.Physiol. 1996. -Vol.271. - P.H1262-H1266.

176. White B.C., Grossman L.I., O Neil B.J. et al. Global brain ischemia and reperfusion //Ann. Emerg. Med., 1996. Vol.27, No.5. - P.588-594.

177. Wollf H. Das Medizinische Ozone. 1977. - 583 p.

178. Yang C.S., Tsai P.J., Lin N.N. et al. Elevated extracellular glutamate levels increased the formation of hydroxyl radical in the striatum of anesthetized rat // Free Radic. Biol. Med., 1995. Vol.19, No.4. - P.453-459.

179. Yendemiale G., Grattagliano I., Altomare E. An update of the role of free radicals ad antioxidant defense in human diseases // Int. J.Clin.Lab.Res. 1999. -Vol.29. -P.49-55.

180. Yermolaeva O., Brot N., Weissback H. et al. Reactive oxygen species and nitric oxide mediate plasticity of neuronal calcium signaling // PNAS. — 2000. — Vol.97, No. 1. P.448-453.

181. Yudkoff M, Daikhin Y, Nissim I, Lazarow A, Nissim I. Ketogenic diet, amino acid metabolism, and seizure control // J.Neurosci.Res. -2001. Vol.66, No.5. - P.931-940.

182. Zhang J. Role of apoptosis in cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage // Internal Symp. "Ischemic blood flow in the brain". Tokyo, 1999. — P.51-52.

183. Zhang J., Benveniste H., Klitzman В., Piantadosi C. Nitric oxide synthase inhibition and extracellular glutamate concentration after cerebral ischemia/reperfusion // Stroke. 1995. - Vol.26. - P.298-304.

184. Zlokovic B.V. Antithrombotic, procoagulant and fibrinolytic mechanisms in cerebral circulation: implications for brain injury and protection // Neurosurgical Focus. 1997. - Vol.2, No.6. - P.85-106.