Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние низких температур на протеолиз в зеленых проростках озимой пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние низких температур на протеолиз в зеленых проростках озимой пшеницы"

КШВСЬКШ УН1ВЕРСИТЕТ 1м. ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

на правах ^укопису

РГв п

ш

МАКАРЕНКО

Ольга Анатод11вна

ВПЛИВ НИЗЫШ ТЕМПЕРАТУР НА ПР0ТЕ0Л13 У ЗЕЛЕНЙХ ПРОРОСТКАХ ОЗИМО! ПШЕНИЦI.

03.00.04 - 6ЮХ1М1Я

АВТОРЕФЕРАТ дисертад!} на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

УДК 581.19:577.156

КШВ - 1994

Дисертащею е рукопис.

Робота виконана в лабораторп бюхми рослин Селекц1йно-ге-нетичного ¡нституту (м. Одеса) та в лабораторп б1ох»ш к Одеського 01отехнолог1чпого институту в 1988 - 1993 роках.

Науков! кер1вники: доктор бюлопчних наук

. ВОВЧУК Серий Володимирович,

доктор бюлопчних наук, професор, чл. -кор. УААН ЛЕВИЦЬКИЯ Анатол1й Павлович.

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор бюлопчних наук,

професор СУДЫНА Олена Григор1'вна,

кандидат 61 олончяи наук, науковий сшвробтик . ШГОР1ЛА Шна Фздор1вна •'

Пров 1 дна оргашзащя: Дн1 пропетровський державний ушверситет

Захист в1дбудеться 13 кв»тня 1994 р. ;о 14.00 годиш иа 8ас1данн1 спещал1зовано! вчено! ради Д 01.01.07 для аахисту ди'сертатй на б юлончноыу факультет! Шпвського ушвереитету 1м. Тараса Шевченка за адресокс 252601, м. Шив 17, вул. Володи-мироы>а,б4. ; . • ^

3 дисертащею южна ознайомитись в бюлютещ ун1верситету

Автореферат роз 1 слано "/«?" бе^гя^А.. 1994' р.

Вчонмя сэкретар спешат зова'"!! ради, ^____..

кандидат бюлопчних наук, професор БРайон

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнють проблеми. Внутршньоклиинний протеол^з е важ-ливим механизмом регуляцп обм!ну б!лк1в, оск!льки накопичення !' компонентний вмют б!лк!в визначаеться не пльки швидкютю !х бюсинтезу, але • ] величиною деградацп, шр залежить в-1д активном! пептидпдролаз (КФЗ. 4.), ям знайдено в зерш 1 р1зних ве-гетативних органах рослин, в тому числ! 1 листках злэкових культур СЛевицький, 1982; М!кс1а,1936].

.Особливо велике значения процеси протеол!зу мають при адап-тац) I рос лишки • кл1тини до несприятливих умов навколишнього сере-довища. Така адаптащя включае не тальки синтез нових б:лк!в, Б1дп0в1дних зм!неним потребам юитини, але 1 розпад, 1 виведення тих б!лк!в, ЯК1 не потр1бн1 для и нормального функщонування.

Однак, характер змши активности пептидпдролаз 1 мехашзм, що.регулюе внутР1®ньокл!тинний протеол^з при адаптацн до неспри-ятливого впливу вивчен! недостатньо. Значною м!рою це взноситься до формування стойкости рослин до низьких температур.

Морози та заморозки завдають економ1чних збитшв, викликаючи зр1дження пос!в!в озимо! пшениц! (ТгШсит аезиуит Ь.). Тому вивчення ф131олог1чних ! бюх1М1Чних процес!в при адаптацн озимих до низьких температур е важливим для виведення прлстосованних до холоду сорт 1 в, що мае велике значения для 01 льсысого господарства 1 виробництва продукт 1 в харчування.

Мета !_ основн! завдання досл!дження. У в1дпов!дност! з више-викладеним, метою роботи е вивчення активност! пептидпдролаз зе-лених проростов озимо! пшениц! у зв'язку з можливою участю даних ферментов у процесах кр^оадаптацп та використання показник!в !х активност! в селекц!! на морозост1йК1сть;

В задач! досл1дхення входило вивчення у проростках пшениц! при д!1 низьких температур

- сортових оеобливостей зм!ни активност1 резнях г'руп- пептидпдролаз;

- взаемозв'язку шж актившстю пептидпдролаз та б!лковим

ОбМ1НОМ;

- оснсвних механГзм^в регуляш! активности пептидг!, .ролаз;

- досл!дження О^олопчних властивостей проростк!в пшениц!, що зазнали впливу низьких температур.

Наукова новизна роботи. . Бстаиовлено, шр активтсть виЕчених пептидпдролаз у не Шдданих холодовому впливу проростках пшениц.

вксокоморозостшшх сорт 1б достоверно нижча в!дпов1дних показ-ник1в у проростках середньо- 1. олабоморозост!йких сортов.

Показано сортов! в! дмшюст! в змпп активности нейтральних протешаз та карбоксипептидази у проростках ■ пшенищ при дп низьких температур. /

Вперше встановлено, що б!льш висока карбокслпеп^дазна актив- . Н1сть у ыияиптияшй р^диш характерна для проростклв високоморо-зостШсих сортов у пор1ЕНлшп з середньо- 1 слабоморозосийкими.

Показано, щр основна к!льк1сть прол^ну, утворена в пророст- . ках високоморогост!йких сорт!в при дп низько5 температури, нако-пичуеться у ш мои тинному простор!.

Встановлено, що мехашзм активацп нейтральних проте!наь 1 карбоксипептидази у проростках пшенищ при холодовому загарту-ванн! в1дбуваеться за рахунок шдвищення активное? 1 в^ьних пеп-тидпдролаз 1 не мшяе вй!сту зв'язаних форм ферменив.

У чроростках пшенищ вперше знайдено активатор карбоксипел-тидаз, що в1дкривае перспективи у вивченн! механ1зм1В внутр!1Ш-тинного протеол1зу у тканинах рослин та. тварин.

Практичне значения роботи. Разроблено метод визначення моро-зост!йкост1 сорт 1в озимо! пшениц! за показником активност! пеп-тидпдролаз у вих:дних, не тдданих холодсвому впливу, проростках.

Запропоновано. метод ощнки ступеня моро"зост1йкост! сорпв озимох пшенищ за показником активност! нейтральних проте^наз та карбоксипептидази у проростках, тдданих впливу низ ь ко г темпера-тури. ,

На основ! . доол1даень бюлопчних властивостей проростк1в пшениц!, шдданих впливу хо:.,ду, запропоновано новий бюстимулятор з широким спектром ди "Бютр!т".

На основ! препарату з зелени* проростюв пшенищ розроблено спос!б вирошування хл!бопекарних др!эдлс1в Басс11аго,иусез сегеу!-Б^ае, що значно шдвищуе вих1Д та як!сть товарно! продукт 1 (заявка на винах1Д N В 3301551).

На захист виносяться так! положения:

1. В процес! чагартування в!дбуваеться зм!на активное^ пеп-тидг!дролаз у проростках озимо! пшенищ, ир можна розглядати як один з механ1зы!в адаптацп рослин до дп низьких температур.

2. Шдвищення активности нейтральних проте!наз ! карбоксипептидази при д!! низьких температур у проростках пшенищ корелюе

3 НШГОПИЧеННЯМ ВОДОРОЗЧИННИХ 61ЛК1В ! В1ЛЪНИХ ЭМ1НОКИСЛОТ.

- 3 - •

3. Шдвижения активности нейтральних протепгаз 1 карбокси-пептидази в проростках пиенищ при холодовому загартувашп в!дбу-ваеться за рахунок зб1льшення активност1 в!льних форм ферментов.

4. Одним з фактор1в регулювання внутр^ьоклтшного проте-ол!зу е низькомолекулярний активатор карбокспептидаз, який впер- . ше знайдено у проростках пшенищ.

5. Прсцес ццаптащ1 озимо! пшениц! до холоду супроводжуеться Шдвищгнням актив ноет! пелтидпдролаз в мияштиншй р1дин1, а також накопиченням у шлаштинниках в 1 ль них ашнокислот.

е. Адаптащя до низькотемпературно! да призводить до нако-пичення. у проростках пшенши бюлопчно акгивних речовин, шр доз-.воляе запропонувати новий бюстимулятор з широким спектром дп.

. Апробащя роботи. Основ!й положения дисертащйно! роботи бу-ло викладено на науково-техничшй конферешш молодих вчених у 1991 рощ (м. Одеса.Селекщйно-генетичний ¡нститут), на зас!данн1 Одеського В1ддиення товариства б!ох1М1К1В у 1992 роцк

ПубЛ!кацп. Результати дисертащ I опубликовано в 5 працях.

Структура обсяг роботи. Дисертащя складаеться 31 вступу, огляду литературных даних,' опису об'екпв 1 мэтодгв досл1дження, результаив власних досл1джень та !х обговорення (4 роздии), заключения, ВИСН0ВК1В, списку Л1тератури 1 додатклв. Роботу викладено на 109 сторшках машинописного тексту, наведено 14 таблиць 1 12 малюнк1 в. Список л1тератури мютить 164 джепела (серед них 101 публ!кащя заруб 1жних автор1в). ,.

МАТЕР I АЛИ I МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНБ.

ДосшджёШш були проведет на надзёшпй частин 1 проростов шести Шдикаторних' сорт1в озимо! м'яко! пшенищ (ТгШсит аези-уиш Ь.), яш В1др1зняються за ступенем морозостхйкост!: Одеська 16, Ульяшвка (¿исокоморозост1йк1); Безоста 1, Обр^й (середньомо-розост1йю); Сан-Пасторе 1 Русалка (слабоморозост 1 йк!). Тиунев 1 проростки, вироцен! в кл1матичшй шаф1 ВКШ - 73 при температур! вдень +22, вноч! +18°С 1 тривалост! дня 18 годин, Шддазалк дп ?емперзтуои +2°С при шлодобовому осв1тленн! на.протяз1 10 д>б (перша фа^а загартування), а поим шкшдовтй дп негативна* темп ратур -4, -6 °С (друга фаза загартування) в темряв1 на .

протяз! 2 д!б на кожний температурний режим.

Шжгштинну р!дину одержувзли 13 п;ойногр1"аних прорсстклв шляхом IX вакуумног ¡кф!льтраш! яа холодI при залишкогому илек/

20 кПа в 50 мМ трис-HCl буфера рН 8,0 з наетупним центрифугуван-ням [Va]k, Loon,1988]. • •

Екстракщю виьних форм фермент i в проводили is люфшзова-них i подрхбнених проростов ü',2 М NaCl на протяз! 30 хеклин при . температур! +4°С. Гомогенат центрифугували при 6 ООО об/хв, температур: +4°С на протяз! 15 хвилин. В надосадов i й р i динi визначали активнють пептидпдродаз за пдрол^зом козеiну при рН .6,0 (нейтрально протегнази), гемоглобину при рН 3,5 (кисл1 проте!нази), синтетичного субстрату N -d- бензо!л-И,-арг11Ш»-4-н1троаншну (БАПАази) [Еовчук. 1379]. Активность карбоксипептидази визначали за* пдр0Л130м синтетичного субстрату Кбз-1-фен1лалашн-1-алан1ну [Visuri et. al. ,1969].

Активнють ферментiв виражали в нанокаталах (для нейтральних i кислих проте!наз), м*крокаталах (для БАПАази) i «мшкаталах (для карбоксйпептидази)' на 1 кг люфшзованол маси проростк1в. За 1 -атал приймали млькють ферменту, ир каталозуе утворення 1 М тирозину (для нейтральних та кислих проте!наз) або 1 М аланíну (для карбоксипептидази), розщеплення .1 М субстрату (для БАПАази) за 1 с 1нкубацп.

Активнють зв'язаних (неекстракшйних) пептигiдролаз визначали в люфшзованих осадах шсдя со лево i екстракт i фермент ib. В цьому випадку до наважи осаду додаеться розчин субстрату í кла-деться на ¡.чкубац)Ю при постойному струшуваннь Пюля iHKy6auil реакшю зупиняли 10 % ТХУ (при визначешп активност! нейтральних проте!наз) або кип'htíhhhm з подальшим центрифугуванням (при виз-наченк* активное!i карбоксипептидази). Про активнють зв'язаних форм пептндпдролаз судили по зб^ьшонню в надосадовiй pi дин i продукт i в пдрол1зу. .

В]льн1 амг'нокислоти одержув-.ли з люфшзованих npopocTKiB 5% ТХУ. Легкорозчинн) б i лки екстраг ували з проростов водою. Биток визначали за методом Кьельдаля на анал1заторi бзлку "Ki&ltec Auto 1030" (Швешя), а такох колориметричним методом JIoypi лбо спектро-фотомс-тричко за поглинанням при 280 нк.

Колоночну хроматограф!ю 6i лклв та под ¡пептид i в проводили методом гель-ф1льтрацн на обладнанш ф1рми LKB (Швещя), викорис-тоьувчи сефадекси G-10, G-15, G-75.' Ашнокислотний- анал13 ¿1лк1в i В1льнкх аминокислот доел i давали на автоматичному анализатор! аминокислот "Hitachi - 835" (Яшшя). .

fiKiCHíifi аналгз дукр!в проводили методом газо-piдинно! хро-

матографы на газовому хроматограф! "ЗЫтасЬи КМбА" (Япошя). К1льк'1сний ем1ст цукр1в визначали антроновим методом, юшв калио - методом полум'яно* фотометры.

Для вивчення бюлопчних властиьостей проростков пшенищ го-тували водкий екстракт у сшвзодношетп 1:50 шляхом кип'ятоння на протяз! 5 хвилин, в якому в подальшому зизначали р1вень бюлопч-но! активности на дрьтджовому тест1 [Сисоев,1975], 1 адаптогенш якосто : прстивиразкове при моделюванн1 стресозих виразок шлунку у падюк1В, рад^протекторне при гострому ^ -опром!кюванн1 мишей 1 антитоксичне на стрихщновому тест1 [Соловйова,1975].

Результати в таблицях 1 граф!ках подан1 у вигляд1 середах арифметичних значень 13 трьох бюлощчних та трьох аналничних повторностеЯ для колщог пари сортов, ¡цо характеризуються однако-вим ступенем морозостойкость

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ Вплкв низьких температур на актчвность пептидг I дролаз в проростках озимо: пшенищ. Вивчення . пептидг 1 дролаз показало, що. змона активност1 фермент1в в проростках пшенищ залежить вод фази загартування рослин 1 значною морою визначасться р1Внем моро-зост1йкост1 сорту. .'

Перш за все звертае на себе ;~'агу той факт, шр активность вс 1х дослоджуваних пептидг ¡ дролаз у вих1дних, не подданих холодо-вой до о проростках високоморозостойких сортов, була достоворно нижча цих показников у середньо- 1 слабостойких сортов (мал. 1,2). Це мокна розглядати як своер1дний фактор захисту балкових молекул В1Д протеолотичноо деградаци, що призводить до шдвищеиого нако-пичення болку в вихшшх проростках високоморозост1йких сорт 1в [ Джанумов, 19891.В результата проведених доелодмень установили, до активность нейтральних протеоназ в першой фаз1 загартування починала зболь-шуватись (мал. 1А). Найболып виражгно зшни актпвност1 даних фер-меяпв булл водмочено в проростках вдсокоморозостоких сорт¡в, активность яких на четзерту добу збольшувалася у 2 - 4 пази. . Для середньо- 1 слабостойких сс^ив щ змши носили набагато менш ви-ражений характер. Другий подйом активносто нейтральних протеоназ був В1дм1чений при дп негативних температур.

Аналог очяо сортов 1 розницо спозтерт. гали для каре ксипептида-ри (мал. 1Б), достов!рнё зб1льшэиня активносто якоо (в 2-2,5 ра-

зи на сьому добу першо! фази) також було ^постережено у моро-зост1йких сорт!в. Але максимальних значень даний показник досягав у друий фаз! при температур1 -4°С. Менш виражене зб1льшення активное^ карбоксипелтидази (в 1,5 рази) було в1дм1чено у середньо-ст^йких сортов, в той час як у слабоспйких р1вень активност1 даного ферменту практично не зм-нювався.

Таким чином, активнють нейтральних проте 1 паз 1 ка'рбоксипеп-тидази Ч1тк^| корелюьала 31 станом загартованост1 проростов » шдвищувалась в б1лыв1й М1Р1 у високоморозосийких сорив, що сыдчить про адаптащйний характер збьиьшення активност! тег групи ферментов.

\

А

7 10 'А 14 16 18 сутки

+2° -2° -4° - 6° -10° темшратура

2

А

3300

I . 4

/

/

/ «•' гко*"'^'

2900

2600-

+2° +2° ' +2°. -1

4-п—ЙГ

#

-4° - 6° температура

"Й 16 18. сутки

Ыал.Д ЗМ1НИ активности нейтральних проте ¡ней (А) 1 • ..арбоксипептидази (Б) в проростках пшенищ при : загартуват. 1 високостпни, 2 - середньо-' СТ1ЙК1, 3 - слабосийк» сорти.

На в1дмшу шд нейтральних протешаз 1 карбоксипептидази, актившсть БАПАази на вс!Х етапах загартування була достов!рно' нижча в проростках високоморозост 1 йких сорт 1 в (мал. 2А).

А збиьшення активност! цього ферменту спостер^гали т!льки в перюд дп негагивних температур. Для проростов високоморо-зосийких сорт1в характерна 1 б!льш низька актившсть ки'слих про-те*наз (мал. 2Б). Висока актившсть БАПАази Гкислих протешаз в проростках слаботйких сорт!в на вс1х етапах хдлодового загартування св!дчить про те, шр дан! ферменти можуть виконувати дест-руктивну роль в рослишпй нштши, руйнуючи життево важлив! 01 лки

в проростках тенит при загартуванн!. .1- високз-ст!йк1, 2 - середньост!йк!, 3 - слабостям сорти:

Активн!сть пептидг:дролаь ^ компонентний оклад м>жкл1тин-но|. Р1дини проростк!в пшениц! при дп низьких температур. На сьо-годн1 встановлено, шр висока морозоот1йкость рослин досягаеться шляхом 1нтенсивнога В1Дтокуводй з клиин в м!лаштин-'ики, а та-КОЖ шихом накоиичення ниэькоиолекулярних речовга - крюгтротек-

тор1В, що знижують точку замерзания юптин и мшштинник!в [Туманов, 1979]. Тому в план* подальшого вивчення можливих бюхшчних мехашзм1в формування ст!йкост1 до низьких температур являе интерес вивчення продес1в протеод!зу 1 • компонентного складу 'мааштишюг р1дини гроросткав пшениц!. Оск1льки активнють нейтрально протешаз 1 карбоксипелтидази найб^льш чико корелюе з загартованим станом проростков пшениц!, в подальшому ми зулини-лись на вивченн! Т1льки цих ферментов.

Проведен 1 доошдження показали, що с ышштиншй р!дин1, одержан 1й з проростков ршшх сорт1в, булга зиявленс. актившсть нейтральних протешаз 1 карбоксипептидази (табл. 1).

Талиця 1

Нитома актизшсть нейтральних проте!наз 1 карбоксипептидази . в шжштиший р1дин1 1 проростках-пшенкщ.

Нейтрально протешази Карбоксипептидаза

мшштинна. проростки микштинна проростки

Р1дина родина

високо- вих. • 6,5+0,8 '2,2+0,2 . 16,2+1,7 11,5+1,2.

ст1йк1 +4°С 8,8+0,7 5,8+0,4 43,5+3,8 ' 12,8+1,3

р >• 0,05 р < 0,01 ■ р < 0,01 р > 0,1

сорти -4°С 9,6+1,1 5,6+0,5 92,5+9,0 25,6+1,7

Р - 0,05• р < 0,01 р <0,01 р < 0,05

середньо- - вих. 7,9+0,6 3,5+0,2 23,3+1,9 19,3+1,8

ст1йк1 +4° С 8,8+0,5 5,3+0,3 46,0+3,3 16,2+1,4

.р >0,05 р <0,05 Р < 0,01 р > 0,05

сорти -4°С 6,9+0,6 5,1+0,2 98,2+8,4 18,3+1,9

. р > 0,С5 р < 0,05 р < 0,01 . р > 0,05

.слабо- вих. 9,8+0,8 ' 3,5+0,1 . 34,6+3,7 , 15,8+1,2

ст!йк1' +4°С- 10,7+0,9 '4,2+0,2 52,3+4,4 10,6+0,9

р > 0,05 р'« 0,05 р » 0,05 р = 0,05

сорти ' -1°С 8,6+0,8 4,2+0,3 80,2+7,3 1- ,4+1,3

р > 0,05 р > 0,05 р < 0,05 р /0,0е"

р?- достоа1рч1сть по в1дношенню до вих1дно5 активност! фермент!в

Приди низьких температур питома активность нейтральни:: протепгаз микк^тинно! Р1дини середньо- 1 слабост1йких сорт!в змпповалася незначно, в той час як для високоморозост^йких сорт5 в цей показник 8б!льшувався в 2-1Й фаз! загартування в 1,5 рази (при р=0,05).

Набагато бьяьш вира-кет зшни епостер!гали для карбоксипептидази, питома активнють яко* в М1хкл!тинн1й р1дши при адапта-цп пшенищ до низьких температур р1зко зб1льшувалася. При одому СТуП1НЬ ИЗДВИЕМНЯЯ Р13НИЙ ДЛЯ сортов, ЩО В1ДР13НЯЛИСЯ за морозо-стзйкютю. Питома актившсть карбоксипептидази мшштинно! ради-ни високост)йких сорив зб!льшувалася в 2-Ш фазз загартування в 5,7 рази, тод! як для сер.едиьо- 1 слабоспйких ш зм1ни складали 4,1 ! 2,3 В1ДПОВ1ДНО. СЛ!Д ВЗДМ7ТИТИ, що у пор!ВНЯНН1 3 ЩЛ1СНИМИ проростками, виявлен! законом!рносгз проявлялися бзЛЬШ Ч1ТКО для карбоксипептидази м!жкл!тинно5 р!дини.

Зм1ни питомо! активност! пептидпдролаз при низькотемпера-турн!й д!! супроводжувалися зм1нами вмюту В1 льних г).п¡гакислот в мииштиннзй р!дин!:у високо- приблизно в 2 рази, у середньост!й-ких сортов - ь 1,5 рази. Шодо елабостзйких сорт!в, то вм!сг аминокислот в микюитинниках на 1-!й фаз! загартування дещо'зни.жався, а на 2-1й р1зко (в б раз!в) зб!льшувався, шр псяснюеться скор!ше всього поручениям проникност! плазматичноз мембрани, насл!дком чого е пасивний вих!д ам1нокислот !з кл!тин у гьчклзтрнники. Аналог 1чнз зм!ни були характер;?! 1 для !нших осмоткшэ' клзтини -цукр1В та !он!в кал1ю : вихзд даних речовин з кл1тин у мзжюптин-ники був найб!льш виражений у високостзйких сорт!в у поршшнн! з середньост!йкими, що мае адаптацзйнкй-характер, осю'льки ампго-кислоти та цукри форыують буферний шар 1 захишэють поверхню плаз-малеми [Тао.Ы,1986], а також знижуоть температуру замерзания мияштинно! рздини ЕСтаценко, 19923. В той т час витж осмотично активних речовин в микклзтинники проросткзв слабсст!йких сорт!в може в!Дбуватися через ¡нактивацш системи активного транспорту плазмалеми рослинно! кл!ткни СПалта.Ли, 1933].

При дп низьких температур в мзиштинному простор 1 -пророст;«в виростае вмзст виьного прол1ну (табл.?,): у високо- з 2 до 35 X, у середньо- з 3 до 8 а у слабоморозо'спйких сорт!в шдвюцу-. еться незначно. Зб!льшення р1вня пр0Л1ну в мзлтаитинниках мохе бути пов'язаяе з шдвищенням активност 1 карбоксипептидази 1 пдрол!-зсм пролт-багатих б!лк!в.

Таблиця 2

Вшст в1льного прол^ну в мипшташпй р1дин! проростмв пшениц! при дп низьких те>Щ(:оатур, % в! д суми ашнокислот

ВИСОКОСТ1ЙК! середньост1йк! слабост1йк1

сорти сорти сорти

вих. +2°С -4°С вих. +2°С -4°С вих. +2°С -4 °С

Про^н 2,0 28,0 35,0 3,1 10,0 8,3 2,9 4,2 3,8

»

Р1зке зростання р!вня п рол ту у шжштинниках морозост1йких сррпв мае адаптащйне значения, так як 81 а01льшенням концентра-Д11 прол1ну в!дносна в'язкють розчин1в значно шдвищуеться, до 1стотно зменшуе температуру замерзания СПеруанський,19813. Ме-хан1зм захиснг>! дп прол1ну 1нш1 автори пояс^юють збеременням на-тивного стану бюполшгр!в ЕСтаценко,1992]. • .-

Таким чином в процес! адаптаци до низьких температур для проростов високост 1 йких сорив е характерним шдвищення в М1ЖЛ1-тинн1й р1дин1 питомок активност1 нейтральних протегназ 1 карбокси-пептидази, а також збгльшення вмюту в!льних ам1нокислот 1, особливо, в1льного прол1ну, щр дозволяе розглядати шдвищення позакл1-тинного протеолазу як один ¡з мождивих механ1зм1в адаптаци роолин до низьких температур.

Моаиив! механ!зми регуляц!8 протеол!зу в проростках шдени-' П£И низьких температур. Двя Ейяснення цього питания нами було вивчено активность в1льних Г зв'язаних форм пептидпдролаз. Проведет досл)ДИ показали, щр при низькотемператури1й ли в проростках шдвищувалася активнють В1льних форм нейтральних проте!-наз 1 практично не змшювався р1вень активнэси зв'язаних 8 кл1тинними структурами фермент 1 в. При цьому для проростюв висо- .

коспйких сорпв було характерно б1льш високе зростання актив-

о

ност1 в)льиих протелназ. .

Аналог1чн1 дан! були одержан1 1-при вивченн1 В1льних 1 гв'я-заних форм карбоксипептидаз проростк!в пшенищ при низько'.'емпера-турнпЧ Д1!. Таким чином, зростання активносП нейтральних про-те!наз » карбоксипептидази у проростках пшениц! при дп низьких температур в!дбуваеться за рахунок шдвищення активност1 в!льних

пептидпдролаз. Одним э мехашзшв цього може бути шдсилечня синтезу даних фермент1в : Schafer i Fischer Г19883 показали, шр деям фракци бимв, як! синтезуються при да холоду у листках' томату, мають протеол!тичну активность i по своз'Л природ1 е тюловими протеоназами.

Одним з найефектисшших i епецифшних мехашзм1в регулящ 1 протеол1зу е регулящ я активност! фермент is- 5нг1б1торами б1лково». природи, дуле поширеними в рослинних i тваринних сб'ектах. 3 зв'язку з цим доитджувади вшст онпботоров ендогенких пеп-тидг.дролаз в проростках взятих для вивчення сортов птенищ. OcHOBHi öukobi фрскцп npopocTKiв були одержан! за допомогою гель-ф1льтрац!i на сефадекс1 G-75 i рехроматограф1i на сёфадекс! G-15. При цьому в хроматограф)чних фракцих в концентратi шсля гель-'фольтращ и i сп1"в1дношенн1 фермент/фракщя 1:1 не знайдено iHiriöiTopiB нейтральних протеiназ або карбоксипептидаси (мал.3).

Поряд з цим в низькомолекуляршй облаетi був знайденний активатор карбоксилептйдази, який знаходився як у вих!дних, так i у тдданих дп холоду проростках ycix вивчених сорт!в (мал. 3).

350

■250

150

к

X

X «

м-i>i ю к Ь а

60

фракип

Мал. 3. Гель-ф1льтращя активатора карбоксипептидази на сефадек-ci G-15. Колонка 1,6 X 90 см; швидкють 9,0 мл/смг. год; елющя 1 X МаС1; об'еы фракци б мл; нанесено 24 мг бi ,-ку. 1 - б1лок, А ; 2 - активування карбоксилелтидаяи,2; 3 -1нг]б1рування кзрбоксипептидази t нейтральних ярогетазД.

Вивчення специЗпчносп до о актлв^тора по водноиенню до кар-бокскпептидаз проростков пшениц-; по!саза;;о, то активуюча доя дано-го модификатора не залежала вод р-'вня морозосийкост! сорту 1 фа-зп загартування. В проростках також не змшовався загальний вмост активатора при Д11 холоду.

Однак знайдений активатор значно подвииував активность кар-боксипептидази'ендосперму зерна пшеницо 1 в мешпй м1ро - карбок-сипептидази У дрождж1в 1 подшлунковоо залози свинь У той же час на активность таких екдопептидаз як трипсин, хшотрипсин 1 папа!н активатор практично не впливав (мал. 4). Щ результат« св}дчать, шр модифжована дгя активатора залежить не В1д природи активного центру, а вод онших каталничних властивостей пептидгодролаз.

концентрат я активатору, % *

Мал. 4. Доя активатора з проростка на активность карбоксипеп-тидаз проростков пшенищ (1), ендосперму зерна пшениц1 (£., др1ждж1в (3), тдшлунково! залози свшп (.4), трипсину (5), х!мотрипсину 1 папашу (7).

4. Зм:на деякиу б1лкових фракцой в . проростка^ пшеницо при доI низьких температур. Оскольки об'ектом безпосередньо* доз пептидгодролаз е болки, то змона актизнбсто ще! групи фермент!в тосно зз'язана з бодковим метабол о змсм.

Проведено доелодження розних по стойкосто до морозу сортов показали, щс при до о низькоо позитивно! темпертури (+2°С) в1дбува-лосл значне змеигаення загального вмосту болку, р!вень якого про-

довгкав знижуватксь 1 при дп негативно? температуря (-6 С) (мал. 5А). Причому б1льы р!зке зменшення сумарно! к}лькост1 б!лку В1Дбувалося у слабостях сорт1 в пшениц!.

Зм)на вм!сту водорозчинних б^люв проросткгв ишениц1 носила протилежшй характер, тобно спостер^галось значне тдвищення IX к1лькост1 на протя?' першо1 фази 1 подальше зб!льшення при про-

ходмэнш-друго! фази загарту-вання (мал. 5Б). В даному ви-ладку зб1льшення млькост! во-ДОрОЗЧИННИХ 61ЛК1В б1ЛЬШ яск-раво було виражене у . ВИСОКОСА ЙКИХ СОРТ1Е, ДО СВ1ДЧИТЬ

про адаптащйний характер IX накопичення.

Г £вза

II фаза

10.

I фаза

II |^еэа

Мал. 5. Вм1ст загальних (А) 1 водороз-чинних (Б) бик1в у проростках пшенищ при загартуваннк

1 - високоморозост1йк!,

2 - середньоморозост!йК1,

3 - слабоморозост)йк1 сорти

Таким чином, . деяк1 б1лки рослинно* клтши при холодовому загартуванн! шддаються деградацп, причому цёй процес косить адаптащйних характер, оскыьки спостер*гаеться 1 в проростках високост)йклх сорт ¡в. Певну роль при цьому можуть в1д)гравати нейтрадып проте1нази та 'карбоксипептидаза, активнють яких зростала при дп низьких температур в бхльпий .\tipi в проростках ■ високосийких сорт ¡в.

Би.ы!! значне зкилдання ршш сварного бзлку в проростках сла-бостзйких сорт!в _моке бути зв'язале з бдльш високою актившстю кислих протешаз г БАПАаяи, шо може стати причиной деструкцп життево важливих бьта^в юитини 5 загибел! проростк!в цих ссрт1в.

Загартування озимих рослин супровод,чуеться зм1нами ряду бю-х!м1чних показник1в, шр ц1добрахають IX адаптащйн! зд1бност1. Дс захлсних механ^змгв'сл^д В1днести зростання р!вня ыльних ах,.,ю-

кислот [Стаценко,19923. Одною а причин таклго начопичення може бути эначне зб!льшення активное?! карбоксипептидази.

Таким чином, процеси реоргащзацп 01лкових молекул, дегра-даци складних бик1в на б1льш прост!, подвишэння 1х пдроф1ль-ност1, накопичення в!льних ам!нокислот в рослиних тканинах при дп низьких температур можуть рггулюватися р1внем протеол!зу.

5^ Е!олопчн! властивост1 проростк!в пшенищ, тдданих дп низьких температур. Ще у 1933 рощ академ!ком К П. Ф1латовим було висунуто гипотезу, зпддо з якою у тваринних т- рослинних орган! змах в процес! адаптацп до несприятливих фактор!в утворю-ються речовини, як1 мають виражену бюлопчну активнють 1 е продуктом активно: функщонаьно! д1яльност1 аахисних 1 пристосовних механизм)в лмвих систем. Враховуючи широк! пристосовн! можливостх озимоI пшенищ, як1 гёнетично детерм!новаш,, можна передбачити, що утворюващ при дп низьких температур' в проростках продукти метабол 1зму будуть мати високу бюлопчну активн!сть 1 загальну адаптогенну Д1ю по в!дн~шенню до !нших орган!зм!в.

Р!|е«ь б!олог!чно! активност1 бюстимулятор1в р!зного поход-ження ч1тко • визначаеться по др1ждж>вому тесту, щр базуеться на стимуляц!1 ц!ми препаратами розмножеяня др1жджевих кл1тин ЗассЬа-готусез сегеУ!з!ае, 1 е першим етапом перев1рки фармаколог1чноI дп б!остимулятор!в. Одержат результат« показали, щр екстракт проростов пшениц! аия^ляв вираже ну стимулюючу дно на рют др!ждж1в, яка в 2 - 4 рази поревершувала" цей . ефегег у 1нщих б!остимулятор1В (табл.3). •

Таблица 3

Порг'вняльний 'вплив бюстимулятор!в на р!ст ДР1ЖДЖ1В БассИагошусез сегеу1аеД

1!репар:'.г ' Бюлопчна актива!сть

1.00

266 + 18,'9 535 + 26','5

Экстракт плаценти 637+ 41,3

Екстракт проростков 1140 1 00,7

пшенищ; • ' ' .

Контроль (ф1зрозчин) Торфот . • • Екстракт-алое

Досл1Дження по вивченню р]вня бюлошчно! активност! екстрак-т!в з проросттв пшениц! високоморозосийкого сорту Одесыса 16, шдданих разним отрогам дп температур» +4°С, показали, що по ш-р! д!1 холоду ревень б10лог!чно! активности проростк1в зростав ! досягав максимальних значень на 5 - 7 добу низькотемиературного впливу. Анапошчш зм1ни були в!дм1чеш 1 для показника вмюту ' ам1нокислот.

Високий корелящйний зв'язок цих дзох процессе шдтвержуе, щр в 1 льн! аминокислот, можливою причиною накопичення яких е шдвищення активност! пептидпдролаз, вшграють визначну роль у ви-сокому р1 вн1 бюлопчно! активност! дроросттв. Одержат результа-ти узгоджуються ,з доел 1 дами 1.1. Чикало 1 А. В. Благовещенського С19753 , як! вважають що первинними б10х!м1чними процесами при дп низько! температури на бюлегччш об'екти е переважання проте-ол!зу ! накопичення в!льних ам!нокислот,' а вторинним подальше пе-ретворення цих амшокислот шляхом • дезам!нування у карбонов! кислоти, ЯК1 е активними метабол ¡тами.

Як було Естановлено вище, процеси протеол!зу ! накопичення В1 льних ам1Нокислот при дп холоду набагато ¡нтенсивлше прот1ка-ють у проростках високоморозост!йких сорт!в пшенищ 1 приймають участь у формуЕанш механ1зм!в адаптацп до цих умов. Поршня льне вивчення б!олог!чно! актвност! водних екстрагачв проросткав пшениш р!зних по ст^кост! до морозу ^орт1в показало, щр проростки високост 1 йких сортхв мали ! б1льш високий р1вень бюлопчно! активност! у процес! !х загартування.

Показник б1олог¡чно! активности екстракту проростк!в пшениц! на дрьжджовому тест] наст1льки великий, що цей ефект можна вико-ристовувати у' др!дджовому виробництв1. • Враховуючи цю обставину, нами був розроблений способ вирощування хл!бопекарних др!ждж1в, оснований на введенш в культуральне середовище для росту др 1 ждд!в стимулятора !з проростк!в, шдданих дп холоду.'

Враховуючи високий р1вень б!олог!чно! активност! екг-тракту проростк»в пшениш, виготивленого за методом Ф!латова, варто про-довжити дослан по фармаколог!чному направлению цього препарату.

Попередне на протяз1 14 дшв ентеральне введен! я пацюкам екстракту проростка в доз! 2 мл полереджуе виникнення стресових . виразок шлунку. 3 десяти пацкмв- виразки в!дсутн1 у чогирьох, а площа ураження слизово! шлунку лри введенн! препарату зменшуеться майже в 10 раз!в (табл.4).

Таблиця 4

Вшшв попереднього введения екстракту проростков пшенищ на експериментально Еиразки шлунку у б1лих пацкшв.

Умоби Колькють пацю- 'Загальна коль- Плоша ураження,

досл1ду ков з виразками кость виразок тг

контроль 10 13 22,0 ± 1,8

(п - 10)

дослод -6 6 2,4 + 0,5

(п =» 1 ■

Актитоксиччу дою екстракту проростов пшенищ доелоджували на стрихн1новому тест1, г.. ий заснований ' на ренстрацп проценту смертносто б1лих мишей при введенно отруйноо дози стрихнону на фояГпопереднох 1н'екщй препарату, шр виьчаеться, в розних дозах (мал.6). 3 анл!зу наведених даних випливае, -'¡до отруйна доя стрихн шу знижувалася по шро збольшення дози попередньо введено-

Мал. 6. Антнтоксична д!я екстракту проростк!в пшеницо

Оцонка радоозахиеноо ефективносто дослоджуваного экстракту по середина тривалосто життя мишей приведена на малюнку 7, з яки-го видно, що попередне ентеральне введения препарату в дозо 0,2 мл мало виражений радюзахисний ефект : виживання тварин складало 55 % (у 5,5 рази вище нож' у контроло). При полередньому шдшкорному введеныо екстракту подобного ефекту не було виявлено.

Ведомо, що оонозуюче Еипромонювання при дозо 1000 р 1 вище викликае' в органозмо кишечну форму променево! хвороби, при якой гине основна маса епотелою тонкоо кишки. Можна думати, щр "попередне ентералъне введения екстракту проростков подвищуе резистентность насамперед слизовоо оболонки кишечника, що о приводить в концевому результато до радоозахисного ефекту.

Мал. 7. Вплив попереднього введения екстракту проростков пшениц* на вижлвання мишей при гострому /- опромонеино 1 - контроль; 2 - шдшкорне введения екстракту; 3 - ентеральне введения екстракту.

Таким чином, проростки пшенищ цд впливом низьких температур накопичуют! метаболоти, що допомагають адаптацоо о виживашш рос-лин у з'моненних умовах. Певну роль при цьому'можуть в1Д1Грарати' пронеси протеолозу. Наши дослоджекня показали, що препарат, виго-товлений з таких проростков, мае високу боологочну активность ?

ч1тко вираженою фармаколог!чною направлен!стю - здаттстю стиму-лмвати захисш системи оргашзму.' Попередн! результата досл!джень передана фармакологам для биг.мг,- глибокого вивчення властивоотей проростглв пшенищ з метою створення препарату - адаптогена П1д назвою "Бютр1т". В сучасних еколончно несприятливих умовах жит-тя людини та тварин пошук 1 застосування препаратов, стимулюючих захисш системи. оргашзму, е гостро актуальним 1 необх1дним.

ВИСНОВКИ .

1. йшдн!, не п 1 ддан 1 дп холоду проростки високоморо- . зост!йких сорти, пшенищ характеризуются 61 льш низьким р!Бнем активност 1 пептидпдролаз у пор!внянн! з проростками середньо- 1 слабост!ких сорт1в.

2. При холодовому загартуванш в проростках Еисокоморочо-сийких сорпв в1дбуваеть'ся найб1льш значке зростання активност! нейтральних протептз та . карбоксипептидази. Для проростков середньо- 1 слгбоморозост1йких сорт1в низькттемпературний вплив супровожуеться б1льш високим р!внем БАПАази та кислих проте$наз.

3. Шдвищення активност! Нейтральних проте!наз 1 карбоксипептидази при Д11 низьких температур корелюе з р1внем водорозчинних б!ЛК1В 1 В1льних ам!нокислот.

■ 4. Вб1льшення активност1 нейтральних проте!наз 1 карбогеипеп-тидази в проростках пшенищ. при холодовому загартуванш В1дбу-ваеться за рахунок шдвищення активност! В1льних пептидпдролаз 1 не м!няе акттност1 -зв'язаних форм фэрменпв.

5. В проростках пшенищ вперше знайдений специф1чний низько-молекулярний активатор, який шдвищуС актившсть карбоксипептидаз ендосперму зерна . 1 проростк!в пшейищ, а також актившсть карбоксипептидази др1ждж1в та шдшгунково! залози свиш.

6. При уолодовому.загартуванш в м!юштинн1й р!дшп пророст- ■ К1В високоморозостайких сорив пшенищ в1ДбуЕаеться б!льш високе зростання питомо: активност! нейтральних проте!наз .! карбоксипептидази у пор!внянн! з в!дпов!дними показниками у середньо- та слабоморозоспких сортгв. . . а

7. В1!сока питома актившсть пептидпдролаз в м!жкл1тшгому простор! проростк!в морозост1йких сорпв при ДП низьких температур супроводхуеться !нтенсивн:ш накопиченням в!льних ам!нокислот 1, особливо, В!ЛЬНОГО ПрОЛ!Ну. -

8. Р:зке зб!льшення вмюту ■ виьних ам1нокислот, цукр!в та.

- 19 - .

ЮН1В калио в миюштинному простор! проростк!в слабост^йких сорт!в пшениц! при дП негативних температур вказуе на порувення проникност! плазмалеми в результат! !нактивацп системи активного транспорту.

9. В п!дданих д4Зг низько1 температури проростках пшениц! !!а- . копичуеться комплекс бюлопчно активних речовин, як! стимулюють•

Р!СТ Др!ЖДА!В.

10. Виявлено адаптогенш властивост! водних екстракт1в з.про-ростк!в пшениц , п'дданих дп холоду, що дозволяе запропонувати новий бюстимулятор з широким спектром дп.

СПИСОК ОПУБЛШОВАНИХ Р0Б1Т 3 ДИСЕРТАД1ЙН01 ТЕМИ

1. Активность пептидгидролаз и метаболизм белков в проростках озимой пшеницы при криоадаптащш // В сб.: Современные проблемы генетики и селекции сельскохозяйственных растений.- Одесса, ВСГИ, 1991. -С. 132 - 133

2. Активность пептидгидролаз в проростках озимой пшеницы при действии низких температур // Физиология и биохимия культурных растений.- 1991.- Т.23, N 2.-С.355 - 358. (в сп1вавторств1).

3. Изменение белковых' фракций проростков озимой пшеницы при закаливании , / В сб.: Генетико-физиологические основы селекции озимой пшеницы. - Одесса, ВСГИ, 1991.-С. 81 - 86 (в сшвавторств!).

4. Протеиназная активность и компонентный состав' межклеточной жидкости проростков озимой пшеницы при действии., низких температур // Физиология и биохимия- культурных растений. -1993. -Т. 25, N6. (в сп!вавторств1).

5. Биологическая активность проростков различии*-сортов пшеницы // Нау:юЕО - техн!чний оюлетень СГ1. - Одеса, СП, 1993.

С в сшвавторствО,