Влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца в различных сочетаниях и дозировках на развитие Drosophila melanogaster Mg.

Магулаева, Ася Альбертовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца в различных сочетаниях и дозировках на развитие Drosophila melanogaster Mg.
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца в различных сочетаниях и дозировках на развитие Drosophila melanogaster Mg."

005011870

На правах рукописи

МАГУЛАЕВА Ася Альбертовна

Влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца в различных сочетаниях и дозировках на развитие ОговорЫ/а melanogaster Мд.

03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАР 20(2

Ставрополь - 2012

005011870

Работа выполнена в ФПБОУ ВПО «Ставропольский государственный университет» и Южном научном центре Российской академии наук.

Научны» руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Мануйлов Игорь Михайлович.

Официальные опиопенты: доктор биологических наук, доцент

Джандарова Тамара Исмаиловна;

кандидат биологических наук Артюх Оксана Владимировна.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Кабардино-Балкарский государственный университет».

Защита диссертации состоится_4 0/7/0£>Л _2012 г.

в X? часон на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан_ ofO 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета j f\' , Ржепаковский И.В.

e-mail: labim@stavsu.ru

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Научно-технический прогресс привел к резкому росту загрязнения окружающей среды в связи с увеличением объемов промышленных отходов, сбрасываемых в биосферу, что усиливает негативное влияние токсикантов на развитие живых организмов, в том числе и человека. Особое место среди загрязняющих веществ занимают тяжелые металлы (ТМ), основными источниками которых являются карьеры и шахты по добыче полиметаллических руд, предприятия цветной металлургии, химическая промышленность, производство минеральных и использование органических удобрений и пр. Первичными аккумуляторами ТМ выступают растения, через которые по трофическим цепям они передаются животным и человеку.

Особенностью загрязнения окружающей среды ТМ является то, что они не изымаются и их концентрация постепенно возрастает, вследствие чего увеличивается их негативное воздействие на организмы, что вызывает возникновение нарушений в строении и функционировании органов и систем органов (Реутова Н.Б., 2008; Свинухова C.B., 2010; Xu Y., Wang Y., Zheng О., Li В. et al., 2008). Установлено, что наиболее чувствительными к действию ТМ являются ранние стадии развития живых существ (Барашнев Ю.И., Бахарев В.А., 2010; Pietrock M., Meinelt N., Marcogliese D.J., 2008 и др.). Тяжелые металлы оказывают мутагенное (Баянова М.Ф., Кулкыбаев З.К., Дюсенбаева Н.К., 2004; Pruski А.М., Dixon D.R., 2002; Bjerreqaard Н.Е., 2007 и др.) и канцерогенное (Абилев С.К., Тарасов А.В., Тарасов В.А., 2004; Коста М., Хек Дж.Д, 1993 и др.) действия.

При этом все живые организмы обладают определенной устойчивостью к действию тяжелых металлов. Она определяется способностью организмов при поступлении металлов вырабатывать специфические молекулы металлотионеи-нов (МТ). Благодаря наличию в тканевых белках тиоловых, карбоксильных и аминных групп происходит связывание ТМ и выведение их из организма.

Действие различных доз отдельных металлотоксикантов изучено на многих животных объектах как в природных условиях (Голованова Е.В., 2005; Langdon C.J., Pieaxce T.G., Feldmaim J., Semple K.T. et al., 2003), так и в лабораторных экспериментах (Слободан В.А. 1980; Lemarie A., Morzadec С., Mérino D., Micheau О. et al., 2006). Большинство работ, посвященных влиянию ТМ, касаются водных объектов. Менее всего исследованы представители типа Членистоногие, несмотря на колоссальное разнообразие видов и их важную роль в природе и в жизни человека. Что касается Drosophila melanogaster, являющейся одним из наиболее подходящих объектов для изучения онтогенеза, поскольку она характеризуется коротким циклом развития, высокой плодовитосью, простотой содержания в лабораторных условиях, малым числом хромосом (2п=8) и изученности характера наследования многих признаков (Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Бурыченко Г.М., Мяснянкина Е.Н. и др., 1975), то в известной нам литературе нет сведений о действии постепенно возрастающих доз отдельных ТМ и их комбинаций на данный вид. Поэтому нами была предпринята попытка проанализировать действие на развитие дрозофилы ионов четырех элементов (As3+, Cd2+, Hg2+, Pb2+), относящихся к группе приоритетных (Ильин

В.Б., 1991) - накапливающихся в окружающей среде высокими темпами - тяжелых металлов.

Цель исследования - изучение действия солей мышьяка, кадмия, ртути и свинца, взягых в различных концентрациях и сочетаниях на развитие D. melanogaster в течение трех поколений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца на продолжительность цикла развития от яйца до имаго.

2. Определить зависимость плодовитости дрозофилы от сочетания и дозы ТМ в питательной среде.

3. Установить характер расщепления по полу в трех поколениях в зависимости концентрации и сочетания металлов в среде.

4. Изучить изменчивость морфологических признаков, ведущих к падению жизнеспособности особей, подвергшихся влиянию солей тяжелых металлов.

5. Выявить действие ТМ на развитие крылового аппарата дрозофилы;

6. Установить влияние металлов на щетиночный аппарат дрозофилы.

7. Проанализировать характер наследования выделенных терат.

Новизна работы. Впервые проведено изучение токсического действия на

D, melanogaster арсенита натрия, нитратов кадмия, ртути и свинца в концентрациях от 1 до 10 ДУ (допустимого уровня содержания ТМ) в разных комбинациях (по одному, два, три и четыре элемента) на протяжении трех поколений.

Установлено, что содержание в питательной среде тяжелых металлов практически не влияет на продолжительность стадии яйцо—»личинка и, главным образом, удлиняет личиночную и куколочную фазы развития.

Плодовитость дрозофил резко снижается относительно контроля уже при действии 1 ДУ, наблюдается изменение соотношения полов в основном в сторону преобладания особей женского пола. При этом наименьшая степень совпадения теоретически ожидаемого и практически наблюдаемого расщепления по полу зафиксирована в большинстве случаев при высоких дозах ТМ в независимости от комбинации элементов.

Изученные ТМ оказывают и тератогенное действие на объект исследования. Однако бблыпая часть этих аномалий оказалась ненаследственной. О мутагенном эффекте использованных металлов свидетельствует обнаружение особей с аномальными крыльями (vestigial, vestigial-strap, vestigial-notched, новый аллель small wing — small wing-3), тораксом (Krüppet) и с измененным ще-тиночным узором {Humeral, polychaetoid, polychaetous, аутосомно-доминантный ген с неполной пенетрантностью, определяющий редукцию задней супрааляр-ной макрохеты).

Теоретическая и практическая значимость. Данные о влиянии тяжелых металлов на онтогенез D. melanogaster существенно расширяют представления об их токсическом и мутагенном действии на организмы. Тяжелые металлы отрицательно сказываются на всех биологических показателях дрозофилы: удлиняют продолжительность развития, снижают плодовитость, вызывают формирование уродств, приводящих к снижению жизнеспособности мушек. Дрозофила является одним из модельных объектов биологии развития, поэтому полу-

ченные в эксперименте результаты могут быть экстраполированы на другие организмы.

Результаты исследований показывают, что дрозофила может быть использована для мониторинга окружающей среды путем сравнения биологических показателей природных популяции и лабораторных линий.

Материал диссертации используется в учебном процессе кафедры общей биологии Ставропольского государственного университета, Ставропольского филиала Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, кафедры биологии и химии Карачаево-Черкесского государственного университета им. У.Д. Алиева, кафедры физиологии человека и животных Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х.М. Бербекова в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам биологического цикла.

Основные положения, выносимые на защиту:

- мышьяк, кадмий, ртуть и свинец оказывают токсическое действие на биологические показатели Drosophila melanogaster. вызывают удлинение продолжительности цикла развития за счет затягивания, главным образом, стадий личинка—»куколка, куколка—>тшаго, снижение плодовитости и приводят к нарушениям в соотношении нолов в сторону численного преобладания особей женского пола;

-тяжелые металлы обладают тератогенным действием: вызывают наследственные и ненаследственные аномалии в строении головы, крыльев, торакса, брюшка. Некоторые из них обладают летальным или полулетальным эффектом. Наиболее часто наблюдаемой аберрацией является количественное изменение макрохет;

- тяжелые металлы приводят к мутациям отдельных генов дрозофилы: Krüppel - аутосомно-доминантная мутация с неполной пенетраптностью, small wing-Ъ -Х-сцепленная рецессивная мутация, vestigial - аутосомно-рецессивная мутация, polychaetoid и polychaetous - аутосомно-рецессивные мутации, Humeral - аутосомно-доминантная мутация.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 50-й, 53-й, 54-й, 55-й и 56-й научных конференциях «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2005, 2008, 2009, 2010, 2011 гг.), на ежегодной международной научно-практической конференции «Проблемы экологической безопасности и сохранение природпо-ресурсного потенциала» (Ставрополь, 2007, 2009, 2010, 2011 гг.); на шестой международной научно-практической конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразпообразия При-каспия и сопредельных территорий» (Элиста, 2008г.); на XIV международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2009г.); на второй Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки» (Россия, Тамбов, 27 сентября 2011 г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 169 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсужде-

ния, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 269 источников, в том числе 93 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 10 рисунками.

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 15 научных статьях, в том числе в 3 изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы выполнена на кафедры общей биологии Ставропольского государственного университета и на базовой кафедре иммунологии и микробиологии Южного научного центра Российской академии наук при СГУ в течение 2005-2011 годов. Объектом исследования послужила лабораторная линия дикого типа Berlin вида Drosophila melcmogaster Mg., полученная из Ленинградского педагогического института имени А.И. Герцена (ныне Российский государственный педагогический университет имени А.И. 1 ерцена) и поддерживаемая в условиях массового разведения на кафедре общей биологии Ставропольского государственного университета. Предметом исследование явилось действие некоторых приоритетных тяжелых металлов на индивидуальное развитие D. melanogaster.

Для постановки эксперимента были взяты растворы натриевой соли мышьяковистой кислоты [Na3As03], нитратов кадмия [Cd(N03)2x4H20], ртути [Hg(N03)2x2H20] и свинца [Pb(N03)2] в концентрациях от 1 до 10 допустимых уровней (ДУ). В соответствии с «Гигиеническими требованиями безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (Санитарно-эпидемиологические правила ... , М., 2002) допустимые уровни содержания этих металлов во фруктах и овощах соответственно составляют 0,2, 0,03, 0,02, 0,5 мг/кг. Нами были взяты ДУ для фруктов и овощей, поскольку дрозофила питается продуктами их брожения. Растворы солей готовили с таким расчетом, чтобы содержание в питательных средах металла было 1-10 ДУ, а в контроле использовали дистиллированную воду. Поскольку соли, за исключением арсенита мышьяка, были взяты в виде нитратов, действие анионов на объект исследования нивелировалось.

Главными составными частями практически всех рекомендуемых сред являются углеводы и дрожжи. Последние участвуют в сбраживании субстрата и предохраняют среду от поражения плесенью (Медведев H.H., 1966). Взрослые мухи питаются продуктами брожения углеводов, а личинки - самой средой. Для придания среде желеобразной консистенции используют агар-агар. За основу приготовления питательной среды нами была взята одна из методик, приведенных H.H. Медведевым (1966), с внесением некоторых изменений в соотношение компонентов. Состав использованный среды следующий:

раствор соли (или вода).......50 мл сахар.............................. 15,500 г

картофель........................34 г агар-агар..........................0,500 г

Сахар и агар-агар растворяли при кипячении в отмеренном количестве жидкости. После их полного растворения в колбы вносили хорошо растолченный вареный картофель и кипятили на водяной бане в течение полутора часов. Готовую среду разливали по предварительно стерилизованным пробиркам, ка-

ждая объемом 50 мл. В каждую пробирку с таким объемом вливали около 10 мл готовой смеси. Через 30^10 минут после застывания среды на ее поверхность при помощи кисточки наносили дрожжи (2-3 г дрожжей на 50 мл воды) и оставляли на сутки.

Действие каждого металла было исследовано в отдельности (Аз31, С(12\ Н82+, РЪ2+), попарно (А83ЧС(12+, Аз3++Н82+, Аз3ЧрЬ2+, са2ЧрЬ2+, СсР+Нв2', Не2++РЬ2^, по три (Аз3++Сс!2++Нё2+, Аз3++Сс12++РЬ2+, ^ А83++Нё2++РЬ2+, С(12++Нв2++РЬ2+) и всех четырех одновременно (АБ^+Сё^+Нд^+РЬ^). Каждый вариант опыта закладывали в 10-кратной повторности. Наркотизацию мушек проводили с помощью серного диэтилового эфира, после чего их рассматривали под бинокуляром при 8- и 28-кратном увеличении, располагая мух на матовом стекле. Для изучения действия каждого значения ДУ брали по 50 двух-трехдневных самок и самцов, которых до постановки опытов содержали в отдельных пробирках на нормальной питательной среде. На сухую стенку пробирки (во избежание прилипания мушек к среде) помещали по 5 пар обездвиженных особей. 11о окончании действия эфира пробирки ставили вертикально. При этом подсчитывали число отошедших от наркотизации дрозофил для учета их плодовитости. Опыт проводили при температурном режиме 25-27°С. Ежедневно вели наблюдение за циклом развития дрозофилы. Появление новой стадии развития мушек (первая личинка, первая куколка, первый вылет) отмечалось записью в журнале. На следующий день после появления первой куколки родительских особей удаляли из пробирок. В течение 10 дней после первого вылета ежедневно вели учет имаго. Особи разных полов три раза в сутки (в 6.00, 14.00, 22.00) рассаживали в разные пробирки с тем, чтобы для получения мух второго поколения использовать девственных самок. То же самое проделывали и с мушками второго поколения. Таким образом действие ТМ на дрозофилу изучали в трех поколениях. На основе этих данных определяли плодовитость.

Но мере вылупления, помимо количественного подсчета самок и самцов, фиксировали все видимые аномалии, касающиеся морфологии крыльев, головы, груди и брюшка. Кроме того, часть особей каждого поколения (100-150 самок и самцов по всем вариантам эксперимента) подвергали подробному анализу на наличие морфологических изменений: формы, местоположения и количества макрохет, характера жилкования крыльев, пигментации тела, глаз. Всего в ходе эксперимента было детально изучено около 53 тысяч особей, которые в дальнейшем не вовлекались в скрещивания для получения следующего поколения, поскольку часть особей с отклонениями использовали для приготовления препаратов и/или для определения генетической природы аберраций. В последнем случае применяли функциональный тест на аллелизм. Для получения большого количества потомков от одной пары родительских особей их пересаживали на новую среду сразу после появления личинок в первой пробирке. При отсутствии тестерных линий проводили скрещивания аберрантов с особями такого же фенотипа и с диким типом с дальнейшим анализом потомства в грех поколениях. Это позволило отличить наследственные тераты от ненаследственных.

Экспериментальные данные обработаны статистически (Рокицкий П.Ф., 1967; Магулаев А.Ю., 2007), с использованием компьютерной программы Вю-

stat. Фотографии сделаны в 20- и 80-кратном увеличении с использованием комплекса визуализации изображения, состоящего из стереомикроскопа МС-2 (JIOMO) и цифровой фотокамеры OLIMPUS-5060 (производство Япония). Графическая часть выполнена с использованием программ Microsoft Word 2000 Microsoft Excel 2000, 2009.

3. ВЛИЯНИЕ МЫШЬЯКА, КАДМИЯ, РТУТИ И СВИНЦА НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ П. MELANOGASTER

3.1. Влияние солей As. Cd, Hg н Pb на жизненным цшгл дрозофилы

Во всех вариантах эксперимента откладку яиц дрозофил наблюдали в день начала эксперимента. Появление личинок было затянуто на сутки при действии мышьяка и кадмия по отдельности (1-5 ДУ, F2). В остальных случаях первые личинки вылуплялись на 2 день после закладки опыта.

Более существенное влияние изученные I'M оказали на продолжительность стадий личинка—>куколка и куколка->имаго. При действии солей металлов по отдельности максимальная продолжительность личиночной стадии составила 5 дней. В некоторых случаях (1-10 ДУ As3""; 1, 2, 4, 5, 9 ДУ Cd2+; 1, 2, 5, 6, 8 ДУ РЬ +) окукливание начиналось, как и в контроле, на 3 сутки после появления первых личинок. Совместное нахождение в питательной среде нескольких ТМ привело к более длительному течению фазы личинка—»куколка. Так, в отдельных вариантах эксперимента (10 ДУ Cd2++Hg2+, Fr, 6 ДУ Hg2++Pb2+ F3-8-10 ДУ As3++Hg2++Pb2+, F,; 9 ДУ 4TM, F2; 10 ДУ 4TM, F3) первые куколки зафиксированы на 7 сутки после выхода личинок из яиц. Стоит отметить, что попарные сочетания мышьяка с другими ТМ привели к наименьшему удлинению данной стадии, которая в большинстве случаев продолжалась, как и в контрольном опыте, 2-3 дня.

Вылет первых имаго во многих опытах с использованием металлов по отдельности не затягивался: его наблюдали на 3-5 сутки после появления первых куколок. При действии солей ртути (3 ДУ, F3; 8-10 ДУ, F,) и свинца (10 ДУ, F3) данная фаза продолжалась до 7 дней. Столько же эта стадия продолжалась'при содержании в среде ТМ по 2 элемента (10 ДУ Cd2++Pb2+ Fr 3-5 ДУ Cd2f+Hg2+ случае воздействия ТМ по 3 (7 ДУ Cd2++Hg2++Pb2+, F3) и всех 4 элементов (6ДУ, F3) максимальный срок развития от куколки до имаго составил 8 дней.

Вследствие удлинения отдельных фаз развития дрозофилы наблюдали увеличение продолжительности всего жизненного цикла от яйца до имаго. Если в контроле этот показатель составил 8-9 дней, то при действии ТМ по отдельности он продолжался до 13 суток, при сочетании ТМ по 2 и 3 элемента - до 14 дней, а при одновременном воздействии всех 4 ТМ - до 15 дней. Высокая зависимость между концентрацией токсиканта и длительностью жизненного цикла (0,95>г>0,70) установлена в опытах с использованием свинца, ртути, мышьяка и свинца, кадмия и ртути, кадмия и свинца, кадмия, ртути и свинца, мышьяка, кадмия и свинца, мышьяка, кадмия и ртути, мышьяка, ртути и свинца, 4 ТМ.

Факт, что ТМ в целом не изменяют продолжительность фазы яй-цо—»личинка, можно объяснить тем, что развивающийся в яйце зародыш не испытывает непосредственного действия металлов. Личинки же питаются этой

средой. В дальнейшем это проявляется в некотором торможении скорости развития последующих стадий. Отсутствие в нашем эксперименте существенной разницы в реакциях дрозофилы на кратность воздействия ТМ свидетельствует о несущественно накоплении металлов в организме дрозофилы, чтобы оказывать токсическое действие на последующие поколения.

3.2. Влияние солей Ав. Сс1, и РЬ на плодовитость дрозофилы

Соли использованных в эксперименте ТМ, взятые в любой комбинации и в любой концентрации, оказывают существенное токсическое действие на Бгово-рЫ1а melanogaster, снижая ее плодовитость (рис. 1). Так, если в контрольном опыте этот показатель колебался в пределах 30,57-32,92, то при содержании в среде мышьяка, кадмия, ртути и свинца в отдельности в концентрации 1 ДУ он упал до 19,30, 15,97, 14,70 и 12,02 мушек соответственно. Минимальное количество особей, вылупившихся на одну самку при действии ТМ по одному элементу, составило 7,87 (3 ДУ Сс12+, Е3). В случае совместного действия двух ТМ также наблюдали значительное падение плодовитости.

Так, в вариантах эксперимента Аз3++Сс12+, Аз3++1^2+, Аз3++РЬ2+ число потомков на одну самку колебалось в пределах 7,01-27,44, 12,02-25,96, 14,42— 27,12 соответственно. В варианте с одновременным использованием кадмия и ртути максимальное и минимальное количество мушек на одну самку вывелось в первом поколении при действии 1 и 4 ДУ и составило 22,31 и 12,5 соответственно. Под влиянием смесей солей кадмия со свинцом и ртути со свинцом наибольшее число потомков вылупилось при 5ДУ Сс12++РЬ2+ в Р2 (20,38) и 4 ДУ Н§2++РЬ2+ в Бз (23,48), а наименьшее - при 8 ДУ Сс12++РЬ2+ в Р, (12,06) и 9 ДУ 1^2++РЬ2+ в Бг (11,24).

Самая высокая плодовитость дрозофил (23,84) при действии солей ТМ в смеси по три элемента зафиксирована в варианте с использованием А53++Нб2++РЬ2+ (4 ДУ, И,), а минимальная (9,70) - при действии Аз3++Сс12++Р^2+ (5 ДУ, Р2). Наличие в питательной среде всех четырех металлов также вызвало падение плодовитости дрозофилы: в Р; этот показатель колебался в пределах от 14,29 (6 ДУ) до 21,38 (4 ДУ), в Р2 - от 13,92 (3 ДУ) до 21,40 (4 ДУ), а в Р3 - от 9,63 (10 ДУ) до 16,51 (2 ДУ).

Таким образом, А83+, Сс12+, Щ2+ и РЬ2+, взятые в любой комбинации и концентрации, оказывают существенное токсическое действие, снижая плодовитость дрозофилы в течение трех поколений. Во всех случаях зависимость плодовитости от концентрации ТМ в среде носила отрицательный характер.

3.3. Влияние солей Ах, Н§ и РЬ на соотношение полов

Использование в различных комбинациях мышьяка, кадмия, ртути и свинца привело к нарушениям в соотношении самок и самцов. При этом в большинстве случаях повышение дозы ТМ сопровождалось более значительным сокращением количества особей одного из полов, чаще самцов, чем самок. Почти во всех вариантах эксперимента, в том числе и в контроле, вероятность совпадения теоретически ожидаемого и практически наблюдаемого расщеплений по полу не превышала 90%. Максимальная степень соответствия полученного расщепления

л и 35 -|

Ё 30 1

о ?5 -

20 -

15 -

10 -

5 -

0 -

Ав

В 35

г зо о 25

20 15 10 5 0

са

0 1 2 3 4 5

7 8 9 10

1 Ду

| — П • * ■ РЗ

0123456789 10 ДУ

■ И— (=2- -ЯЗ

Й 35

£ 30

РЬ

— Р2 - А - РЗ

0123456789 10 ДУ

К 35

1? 30

Я 25

* Аэ+са

Аэ+Нд

0 1 2 3 4 5

7 8 9 10 ДУ

I — Р2 - * - РЗ

Рис. 1. Зависимость плодовитости О. melanogaster от концентрации и сочетания тяжелых металлов в среде: а - Аб, Ь - С4 с - Н§, с1 - РЬ, е - Ав+Сс1,/- As+Hg, г-Ав+РЬ, A-Cd+Hg.

Окончание рисунка 1

Ав+СсІ+РЬ

АБ+СсІ+Нд

са+Нд+РЬ

Аэ+Нд+РЬ

Ав+СсІ+Нд+РЬ

9 10

7Т Ду

Рис. 1. Зависимость плодовитости Г>. melanogaster от концентрации и сочетания тяжелых металлов в среде: ; - С(1+РЬ,_/ - 1-^+РЬ, к - As+Cd+Hg, I - Аэ+Сё+РЬ, т -Ав+Ня+РЬ. п - Cd+Hg+Pb, о - Аэ+Сё+^+РЬ.

соотношению 1:1 (0,90>р>0,75) обнаружена при использовании невысоких концентрациях тяжелых металлов (1 ДУ Hg2+, Fi; 3 ДУ Hg2+, F2; 5 ДУ As3++Hg2+, F3; 2 ДУ As3++Cd2++Hg2+, F3; 1 ДУ As3++Hg2++Pb2+, F,).

4. ТЕРАТОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ МЫШЬЯКА, КАДМИЯ, РТУТИ И СВИНЦА

4.1. Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на жизнеспособность дрозофилы

В эксперименте были обнаружены дрозофилы, которые характеризовались грубыми морфологическими аномалиями, ведущими к снижению жизнеспособности. Так, при воздействии As3++Hg2+ (1 ДУ в Fi) была выделена самка с сильно редуцированной левой половиной груди, на которой отсутствовали все щетинки, а на щитке развилась только одна макрохета. У этой особи не наблюдали обоих жужжалец, левого крыла, левой передней конечности (рис. 2, а, Ь).

Аналогичные особи были получены в потомстве двух самок с зачаточными крыльями, выделенных при воздействии 2 ДУ кадмия во втором поколении. У части из них так же, как и у описанной выше дрозофилы, наблюдали сильную редукцию одной из сторон груди с нарушениями в щетинковом узоре, аномально расположенные щиток и голову (рис. 2, с, ё). Крыло со стороны аномально сформированной половины тела и оба жужжальца, как правило, отсутствовали. У других же дрозофил на одной или на обеих сторонах торакса наблюдали выросты (рис. 2, d), которые могли формироваться на плечевых бугорках, у основания крыльев или в области посталярных и задней супраалярной щетинок. В случае развития дополнительных выростов число и расположение микро- и макрохет на груди и щитке были нарушены, а сами выросты нередко разделены неглубокой бороздой. При этом на самом выросте наблюдали волоски и несколько щетинок, расположенных по кругу. Жужжальца у некоторых таких особей отсутствовали.

Результаты скрещиваний показали, что данный признак наследуется как аутосомно-доминантная полулетальная мутация с низкой пенетрантностью. По литературным сведениям известна лишь одна мутация, приводящая к формированию подобных отклонений у D. melanogaster, - мутация Krüppel (Кг), локализованная во второй хромосоме (Lindsley D.L., Grell E.H., 1968). Гомозиготные особи KrIKr погибают до вылупления, гетерозиготные - полулетальны с пенетрантностью около 10 %.

Одной из наиболее часто встречаемых в эксперименте летальных аномалий явилось вздутие брюшка, формирующееся вследствие заполнения гемоцеля гемолимфой. Степень выраженности данного признака сильно варьировала. В большинстве случаев наблюдали равномерное увеличение в объеме всего брюшка (рис. 2,/). Все мушки с данной аномалией погибали в первые сутки после вылупления, не оставив потомство.

Аберрация «вздутое брюшко» встречалась среди самок и самцов (всего 120 самок, 52 самца) во всех трех поколениях как при действии ТМ по отдельности, так и при их различных сочетаниях. Наибольшее число мух с вздутым брюшком (35) обнаружено среди особей, подвергшихся влиянию ионов ртути. Частота их составила 1,25x10"3, что достоверно выше, чем в остальных вариантах

эксперимента (р=0,9999). Немало таких аберрантов обнаружено при избыточном содержании в среде Сс12+, Сс12++РЬ2+, Аб3++Сс12++Н§2+ и 4 ТМ. Реже всего такие мушки встречались при действии свинца, кадмия с ртутью, кадмия со свинцом и ртутью, мышьяка с ртутью и со свинцом, мышьяка с кадмием и со свинцом. В контроле выявлен лишь один самец со вздутым брюшком.

Помимо описанной аномалии брюшка к летальному эффекту в течение первых суток после вылупления приводили и некоторые другие морфологические отклонения. Например, такие, как закрученное брюшко (ЗДУ са2++щ2+, Бз), наличие опухолей на теле (10 ДУ Лб3"", Е3> 2ДУ Сс12+, Р3; 5 ДУ, Аз3++РЬ2+, Р3), развитие лишнего глаза (9 ДУ 4ТМ, Рз) и другие.

a b

v i

ШшЖ ЛШ

Рис. 2. Летальные и сублетальные тераты: a, b - мутация Krüppel (1 ДУ As +Hg ); с-е -мутации vestigial, Krüppel (2 ДУ Cd2+);/- вздутое брюшко (4 ДУ Hg"+)

4.2. Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на развитие крылового аппарата дрозофилы

Распрямление крыльев только что вылупившихся особей происходит благодаря поступлению и движению по жилкам крыла гемолимфы. В случае, когда транспорт гемолимфы по каким-либо причинам затруднен, крылья дрозофил могут остаться плохо раскрывшимися, слипшимися или пузырчатыми.

Наиболее часто встречающейся в эксперименте аномалией крыла было плохое раскрытие вследствие недостаточного поступления гемолимфы. В результате крылья оставались сложенными вдоль или поперек, скрученными или «скомканными», часто направленными в разные стороны, вплоть до 90° к телу. Довольно часто встречались мушки со слипшимися по всей длине или кончиками, с прилипшими к телу одним или обоими крыльями и одновременно с плохо раскрытыми крыльями. Характер жилкования крыльев у таких особей изучить не удается.

Частоты мушек с плохо раскрытыми и слипшимися крыльями колебались в широких пределах, и большей частью наличие в среде ионов ТМ значительно повышало количество аномальных особей. Так, в случае с плохо раскрытыми (2

ДУ А53++Сс12+), в Т2 до 10,62x10"1 (2 ДУ Аз3 +РЬ2+) и в Р3 - до 19,ЗЗх10"3 (8 ДУ Hg2+). Исключительно редко (0,20х 10"3) особей с плохо раскрытыми крыльями обнаруживали в контроле и только в первом поколении. Максимальные частоты мушек со слипшимися крыльями в эксперименте составили: в Р] - 19,90х 10"3 при нахождении в среде солей кадмия и свинца в концентрации 8 ДУ; вР2-15,00ХЮ'3 при совместном действии 5 ДУ мышьяка и свинца; в Р3 - 17,17х10"3 при 7 ДУ мышьяка. В контрольной закладке также были обнаружены дрозофилы со слипшимися крыльями в трех поколениях (0,20х10"3, 0,34ХЮ~\ 0,59х 10"3 соответственно).

Во всех вариантах опыта, за исключением контроля, обнаружены особи с пузырчатыми крыльями. Чаще всего пузыри располагались в дистальной части крыла в районе первой и второй задних и субмаргинальной ячеек, обычно по одному на одном или на обоих крыльях. Иногда вздутие занимало все крыло. У особей с малопузарчатыми крыльями не наблюдали изменений в жилковании. В случае, когда формировался один большой пузырь, оно было нарушено.

Максимальная частота дрозофил с пузырчатыми крыльями установлена во втором поколении при действии ионов свинца (0,98 % при 2 ДУ). При действии мышьяка больше всего таких особей обнаружено в концентрациях 4 и 8 ДУ (0,46 и 0,37 % соответственно). При совместном действии этих двух металлов частота данной аномалии низка: в первом поколении встречаются только при 3 ДУ (0,09 %), в третьем - при 2, 7 и 9 ДУ (от 0,10 до 0,14 %). Аналогичную картину наблюдали при совместном действии мышьяка с кадмием, мышьяка с ртутью и кадмия со свинцом. Обращает на себя внимание низкая встречаемость особей с пузырчатыми крыльями в вариантах опыта с участием ртути. Редко встречались пузыри на крыльях при наличии в среде комбинации из трех элементов (А83++Сс12++Н§2+ и Аз3++С(12++РЬ2+). В случае совместного действия кадмия, ртути и свинца частота таких особей в третьем поколении достигало 0,37 % при 1 ДУ. Промежуточная картина наблюдалась в варианте опыта с участием мышьяка, ртути и свинца. Ожидалось, что наибольшее отклонение вызовет влияние четырех металлов одновременно. Аберрантные особи здесь обнаружены при 1, 2, 5-8 и 10 ДУ. Однако частоты аномальных мушек оказались не выше, чем в других вариантах эксперимента: максимальное значение (0,29%) зафиксировано в Р2 при действии 8 ДУ.

Результаты скрещиваний особей с пузырчатыми крыльями друг с другом и с диким типом свидетельствуют о ненаследственной природе этой аномалии. Лишь в двух случаях во втором поколении наряду с нормальными были обнаружены самки исамцы с пузырями на крыльях, что, по-видимому, связано с тем, что использованные в гибридизации особи были мутантными по разным аутосомно-рецессивным генам.

В вариантах эксперимента по изучению совместного действия ТМ (2, 3 ДУ А$3'+Сс12г, Р2; 7 ДУ Сс12++Н§2++РЬ2+, Р3) было выделено 12 самцов с укороченными крыльями (рис. 3, с,/). Результаты проведенных скрещиваний свидетельствуют о рецессивной природе и сцепленности полученной мутации с X-хромосомой.

Длина крыльев полученной константной линии составила около 80 % от нормы. Крылья были матовыми, края их овальными, жилкование нормальным. У многих особей на крыльях имелись пузыри, заполненные гемолимфой, при лопании которых поверхность крыльев становилась морщинистой, а крылья узкими и растопыренными. Глаза мутантных мушек оказались большими и грубоватыми. Плодовитость была значительно ниже, чем у особей дикого типа, и составила 3,27 мушек на одну самку. Это можно объяснить ранней гибелью дрозофил, не успевающих оставить потомство, и нередкими случаями прекращения развития мушек на стадии личинки. Особи этой линии характеризовались удлиненным циклом развития от яйца до имаго (до 19 дней).

Рис. 3. Крыловой аппарат: а - дикий тип; b - vestigial (2 ДУ Cd2+); с - vestigial-strap\ d-vestigial-notched; e,f-small wing-3 (2 ДУ As3++Cd2+)

Сравнение полученного нами мутанта с ранее известными, гены которых локализованы в ^-хромосоме и вызывают укорочение крыльев, позволяет отнести данную мутацию к мутации гена small wing (si). При этом в нашем случае мутация, по-видимому, представляет собой фенотипическое выражение еще одного аллеля гена small wing, отличающегося от ранее описанных s/' и s/2 нормальными жилками и от si34 - большими глазами. Новый аллелеморф si3 отличается от остальных еще и матовыми крыльями.

В эксперименте были получены две самки с зачаточными крыльями, выделенные при действии ионов кадмия в концентрации 2 ДУ (рис. 3, Ь). Аллель-ность полученной аномалии с рецессивной мутацией гена vestigial (vg) была установлена при скрещивании одной из этих самок с самцами из типичной константной лабораторной линии vgvg. Вторая самка была подвергнута гибридизации с особями дикого типа. В ее потомстве была выделена гомозиготная линия с зачаточными крыльями. В ходе наблюдения за полученной константной линией vgvg были обнаружены особи с крыльями, длина которых существенно превышала крылья типичного мутанта. При этом у одних мушек кончик крыла был уже, а основание шире (рис. 3, с). У других ширина и длина крыльев были аналогичны крыльям мух дикого типа, однако их терминальные края были словно «выгрызены» (рис. 3, d). Такие морфологические отклонения крыла му-

тантных по гену vg дрозофил характерны для аллелей этого гена vestigial-strap (vgs) и vestigial-notched (vg"°) соответственно.

4.3. Влияние солей As, Cd, Hg и Pb на щетиночный узор дрозофилы

У дрозофилы, как и у других насекомых, щетинки (макрохеты) и волоски (микрохеты) выполняют роль сенсорных органов. Число и локализация макро-хет на теле D. meianogaster строго фиксированы (рис. 4), а многочисленные микрохеты расположены правильными рядами вдоль тела.

При действии различных комбинаций и доз мышьяка, кадмия, ртути и свинца одним из наиболее часто встречающихся отклонений от нормы явилось изменение количества макрохет за счет формирования добавочных и/или полной редукции типичных щетинок. Как правило, дупликацию и элиминацию макрохет чаще наблюдали с одной стороны тела. В эксперименте не было зафиксировано случаев удвоения нотоплевральных, задних супраалярных, оцел-лярных, задних скутеллярных макрохет и редукции оцеллярных и задних по-сталярных щетинок.

Рис. 4. Расположение и название щетинок нормальной мухи (Медведев Н.Н., 1966). А - голова: a or, т or, рог - передние, средние и задние орбитальные; ос - оцеллярные;/ V, о v - внутренние и наружные вертикальные; р v -поствертикальные. Б - грудь (торакс): uh,l И- верхние и нижние гуморальные; а пр, рпр- передние и задние нотоплевральные; ps - презу-туральные; a sa, р sa- передние и задние супраалярные; a pa, р ра-передние и задние посталярные; а dc, р dc~ передние и задние дорзо-центральные. В - щиток (скутел-люм): a sc, р sc- передние и задние скутеллярные.

Наиболее часто наблюдали дупликацию передних дорзоцентральных щетинок (а с!с) - 33,04 % (1 ДУ Сс12++^2++РЬ2+). Мушки с дополнительной а с1с щетинкой обнаружены и в контрольной закладке, однако их частота составила около одного процента. В ряде случаев (С<1~+ Р2; Н§ +, Р3; Аб +Н§' , Р,; Нё2++РЬ2+, Р2; 4ТМ, Р3) прослеживалась довольно четкая зависимость между частотой встречаемости этой аномалии и дозой ТМ (0,70<г<0,90). Частота особей с дополнительной задней дорзоцентральной макрохетой (р йс) была значительно ниже и доходила до 3,39 % при действии 7 ДУ Аз3++Н£2+ (Р2).

a or •м да*

9рвг.О.ж

О V *PV

Во многих вариантах эксперимента встречались особи с добавочными гуморальными щетинками, достигая в отдельных случаях 30 % (3 ДУ Лу^+Сс!2'). В контроле частота таких особей составила около 1 %. В некоторых вариантах опыта установлена довольно высокая зависимость между концентрацией в среде ТМ и частотой особей с добавочными гуморальными щетинками: /=0,74 (Аз3++Нё2+, Р2) и г = 0,79 (СсР, Р3).

Наибольшее число дрозофил с дуплицированными презутуральными р$ щетинками (4,90 %) обнаружено в потомстве мушек Р2, подвергнутых воздействию смеси ионов мышьяка и ртути в концентрации 10 ДУ. Максимальная частота особей с дополнительной передней посталярной а ра макрохетой составила 2,56 % (1 ДУ А53++1^2~+РЬ2+, Р3). В единичных случаях зафиксировано удвоение задней посталярной (р ра) и передней супраалярной (а sa), а также передней скутеллярной (а 5а) щетинок. Дупликация головных щетинок чаще касалась наружной вертикальной (о V) макрохеты. Максимальная частота этой аберрации составила 3,7 % (8ДУ РЬ2', Р2). Помимо мушек, характеризовавшихся появлением дополнительной щетинки рядом с одной из типичных, зафиксированы и такие, различных макрохеты которых были дуплицированы одновременно. Наиболее часто встречались особи с одновременным удвоением передней дорзоцентралыюй и гуморальных щетинок.

Распространенной аномалией, касающейся полной редукции макрохет на теле дрозофилы, стало отсутствие одной из супраалярных щетинок. При этом элиминация задней супраалярной макрохеты р за встречалась чаще (43,64 %), чем передней а ¿а (7,62 %). При использовании 4 ТМ одновременно особи с редукцией щетинки р м были обнаружены во Р2 и Р3 (~20 %). Полная редукция передней супраалярной макрохеты (а ¿а) была установлена лишь при использовании смесей ^2ЧР1г , Ли3"+С(12ЧрЬ21 и 4 ТМ. Отсутствие гуморальных щетинок наблюдали при действии ионов всех металлов по отдельности и в различных их сочетаниях, за исключением комбинации свинца с кадмием. Наибольшее число дрозофил с редукцией щетинки и А выявлено при содержании в питательной среде смеси ионов четырех ТМ (3 % при 7 ДУ в Р2), а с редукцией IИ - при действии мышьяка с ртутью (2,70 % при 4 ДУ в Р^. Частота мушек с выпадением передней дорзоцентралыюй щетинки (а с!с) колебалась в пределах от 0,69 (10 ДУ Аз3++СсГ+РЬ2+, Р3) до 2,40 % (9 ДУ Аз3ЧСс12++РЬ2+,

Из 52812 изученных особей всего лишь три, выделенные при воздействии свинца (1 ДУ, Р2), свинца, ртути и кадмия (ЗДУ, Р,; 4 ДУ, Р3), характеризовались выпадением задней дорзоцентралыюй щетинки (р Ас). У восьми мушек (Сс12+, Щ2+, А83^Сс12+, Аз3++РЬ2+, Аэ^+Щ^+РЬ24) отсутствовала одна из пары передних (а пр), а у четырех (Аэ3', Аз3++1к2+, 1^2'+РЬ ) - одна из пары задних нотоплевральных щетинок (р пр). Встречались такие особи, у которых были редуцированы нрезутуральная или передняя посталярная щетинки.

Практически во всех вариантах.опыта наблюдали отсутствие средней орбитальной (т ог), внутренней и наружной вертикальных (/' V и о у) макрохет с частотой около 2 %. Изредка встречались особи с редукцией передней задней орбитальных [а ог и р ог) и поствертикальных (ру) щетинок. Кроме того, обна-

ружены особи с элиминацией передней и задней скутеллярных щетинок (a se и р se) с частотой 1 и 2,59 % соответственно в отдельных вариантах эксперимента.

Во многих опытах обнаружено по одной-две особи, у которых наблюдали выпадение одновременно 2-4, изредка большего числа щетинок. Так, например, у одного самца, полученного при однократном воздействии ртути в концентрации 4 ДУ, с правой стороны тела не развились щетинки и /г, a se, а с левой - р ог, 1 h, a de, р de, а ра, а пр, a sa, a se и р se. При воздействии ртути в концентрации 9 ДУ в третьем поколении выделена мушка, у которой не развились все щетинки торакса, за исключением правых дорзоцентральных. На щитке этой дрозофилы сформировалась только левая передняя скутеллярная.

Во всех вариантах опыта, за исключением совместного действия 4 ТМ и контроля, наблюдали появление особей, в фенотипе которых удвоение передней дорзоцентральной макрохеты сочеталось с выпадением задней супраалярной. Всего было обнаружено 218 таких мушек, что составило около 0,41 % от изученных особей. Меньше всего таких особей зафиксировано при действии мышьяка и при попарном его сочетании с другими элементами. В большинстве вариантов эксперимента обнаружены особи, у которых одновременно с полной редукцией задней супраалярной щетинки наблюдали, появление добавочной макрохеты на плечевых бугорках.

Всего в эксперименте получено около 4 тысяч дрозофил с добавочными макрохетами и около 5 тысяч - с отсутствием тех или иных щетинок. Для установления генетической природы аномалий были проведены попарные скрещивания части особей с однотипными аномалиями друг с другом и с диким типом. По совокупности признаков и результатам скрещиваний появление дополнительных наружных вертикальных, презутуральных, передних дорзоцентральных, супраалярных и скутеллярных щетинок на теле дрозофилы могут быть отнесены к мутациям polychaetoid и/или polychaetons. Развитие добавочных мак-рохет на плечевых бугорках в нашем случае наследуются по аутосомно-доминантному типу с неполным доминированием. Это дает возможность предположить, что данный фенотип определяется доминантным геном Humeral. Что касается типа наследования элиминации задней супраалярной щетинки, то результаты скрещиваний позволили установить, что данная аберрация наследуется по аутосомно-доминантному типу с неполной пенетрантностью.

Анализ частоты выпадения и дупликации щетинок на теле дрозофилы в зависимости от варианта эксперимента показал, что меньший процент особей с нарушениями в числе макрохет зафиксирован в контроле (1,34 и 3,13 % соответственно). При действии металлов в отдельности и в сочетаниях по 2 элемента практически во всех случаях частота удвоения щетинок была выше частоты их редукции, а исключением вариантов с использованием мышьяка, смесей кадмия с ртутью и ртути со свинцом. При содержании в питательной среде по 3 ТМ, наоборот, чаще встречались особи с элиминацией макрохет, чем с их удвоением (15,04 и 12,96 % соответственно). Наибольшая суммарная частота аномалий в числе макрохет на теле D. melanogaster характерна для особей, подвергшихся совместному действию кадмия, ртути и свинца (28,00 %).

Таким образом, соли мышьяка, кадмия, ртути и свинца, использованные в различных сочетаниях и дозировках, оказывают тератогенное действие на дрозофилу, выражающееся в развитии летальных и сублетальных аберраций, в нарушениях формирования крыльев и изменением числа макрохет на теле мушек.

ВЫВОДЫ

1. При наличии в питательной среде солей мышьяка, кадмия, ртути и свинца в различных комбинациях и концентрациях зафиксировано удлинение продолжительности сроков развития от яйца до имаго за счет затягивания, главным образом, стадий личинка—»куколка, куколка—>имаго. При действии металлов по отдельности продолжительность жизненного цикла составила 8-13, при совместном действии ТМ по 2 элемента - 7-14, по 3 элемента - 10-14, а под влиянием всех 4 ТМ -10-15 дней (в контроле - 8-9 дней).

2. Установлено токсическое действие мышьяка, кадмия, ртути и свинца на репродуктивную функцию дрозофилы, проявляющееся в снижении плодовитости. Уже при содержании в среде токсикантов в дозе 1 ДУ произошло значительное сокращение числа потомков на одну самку. Минимальное количество особей, полученных от одной самки при действии ТМ в 4 раза меньше, чем в контроле. Во всех случаях зависимость плодовитости от дозы металлотокси-кантов носила отрицательный характер.

3. Под действием мышьяка, кадмия, ртути и свинца зафиксировано нарушение в соотношении самок и самцов, чаще за счет количественного превалирования особей женского пола. Исключение составили варианты эксперимента с использованием As3+, As3++Cd2+, Cd2++Hg2++Pb2+, где число самцов оказалось выше числа самок. Увеличение концентрации ТМ привело к снижению совпадения фактически наблюдаемого расщепления с теоретически ожидаемым.

4. Под влиянием солей мышьяка, кадмия, ртути и свинца на дрозофилу зафиксировано развитие летальных и полу летальных терат. В вариантах эксперимента с использованием кадмия и мышьяка с кадмием была выявлена ауто-сомно-доминантная мутация с неполной пенетрантностью Krüppel, ведущая к формированию уродств на груди вследствие аномальной сегментации среднего отдела тела эмбриона. К легальному исходу в первые сутки после вылупления привела, к примеру, аберрация «вздутое брюшко», при которой полость гемо-целя оказывается заполненной гемолимфой. С наибольшей частотой (1,25х10"3) такие особи обнаружены при содержании в среде нитрата ртути.

5. Во всех возможных вариантах использования солей мышьяка, кадмия, ртути и свинца выявлены особи, крылья которых оказались слипшимися, плохо раскрытыми или пузырчатыми вследствие нарушения циркулящш гемолимфы в крыле.

6. При действии смесей солей мышьяка с кадмием (2, 3 ДУ в F2) и кадмия с ртутью и со свинцом (7 ДУ в F3) обнаружены самцы с укороченными крыльями. Анализ типа наследования данного признака позволил отнести его к мутации ^-сцепленного рецессивного гена small wing-3 (si3). При содержании в среде кадмия (2 ДУ в F2) обнаружены самки с зачаточными крыльями, оказавшиеся, как подтвердили результаты скрещиваний с особями тестерной линии, му-тантными по гену vestigial (vg). В потомстве линии vgvg выделены две аллеле-

морфные формы - с ремневидными (vestigial-strap - vgs) и зубчатыми (vestigial-

notched - vgm) крыльями.

7. Соли приоритетных металлов (мышьяка, кадмия, ртути и свинца) вызывают изменения щетиночного узора - дупликацию и редукцию макрохет. Наиболее часто удвоение затрагивало гуморальные и передние дорзоцентральные щетинки, а выпадение чаще затрагивало заднюю супраалярную макрохету. Развитие добавочных передних дорзоценгральных щетинок регулируется рецессивными аутосомными генами polychaetoid и polychaetous, дополнительная гуморальная - доминантным аутосомным геном Humeral, а полная элиминация задней супраалярной щетинки -аутосомно-доминантным геном с неполной пенетрантностью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты диссертационного исследования показывают, что Drosophila melanogaster может быть использована при изучении влияния токсикантов на индивидуальное развитие организмов и для мониторинга окружающей среды путем сравнения биологических показателей природной популяции и лабораторной линии.

2. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в процессе преподавания биологии размножения и развития, эмбриология, общего курса генетики, экологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Магулаева, А.А. Влияние ионов мышьяка на плодовитость Drosophila melanogaster I А.А. Магулаева // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Материалы научной конференции «Университетская наука -региону». - Ставрополь: СКГТУ, 2004. - С. 125-126.

2. Магулаева, А.А. Влияние ионов свинца на жизненный цикл и плодовитость Drosophila melanogaster / А.А. Магулаева // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Материалы 50-й научной конференции «Университетская наука - региону». - Ставрополь: СГУ, 2005. - С. 186-187

3. Магулаева, А.А. Терато- и мутагенное действие ионов свинца на Drosophila melanogaster / А.А. Магулаева // Актуальные проблемы современной биологии: Тезисы Российской студенческой конференции. (20 апреля 2005 г.). -Астрахань: Астраханский университет, 2005. - С. 186-188.

4. Магулаева, А.А. Соотношение полов у Drosophila melanogaster при действии некоторых тяжелых металлов / А.А. Магулаева // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Материалы 53-й научной конференции «Университетская наука - регион)'». - Ставрополь: СГУ, 2008. - С. 105-107. ^

5. Мануйлов, И.М Методические подходы к изучению генотоксического действия тяжелых металлов на Drosophila melanogaster / И.М. Мануйлов, А.А. Магулаева // Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных территорий: VI международная научно-практическая конференция (20-23 окг. 2008 г.). - Элиста: КалмГУ, 2009. - С. 100-101.

6. Мануйлов, И.М Летальные тераты у Drosophila melanogaster при избыточном содержании в среде некоторых тяжелых металлов / И.М. Ма-

нуйлов, A.A. Магулаева // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2009. - Да 2. - С. 53-56.

7. Мануйлов, И.М Жизненный цикл Drosophila melanogaster при совместном действии избыточных доз кадмия, мышьяка, ртути и свинца / И.М. Мануйлов, A.A. Магулаева // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Материалы 54-й научной конференции «Университетская наука - региону». - Ставрополь: СГУ, 2009. - С. 166-172.

8. Мануйлов, И.М. Аномалии крыльев у Drosophila melanogaster при действии мышьяка, кадмия, ртуги и свинца / И.М. Мануйлов, A.A. Магулаева, АЛО. Магулаев // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки» - 2010. - ЛЬ 1. - С. 36-41.

9. Магулаев, A.IO. Генетика. Дрозофильный практикум / А.Ю. Магулаев, A.A. Магулаева. - Ставрополь: СГУ, 2010. - 40 с.

10. Магулаева, A.A. Нарушение циркуляции гемолимфы в крыльях Drosophila melanogaster при содержании в среде некоторых тяжелых металлов ! A.A. Магулаева // Проблемы экологической безопасности и сохранение природно-ресурсного потенциала: Материалы международной научно-практической конференции. - Ставрополь, 2010. - С. 63-65.

11. Магулаева, A.A. Формирование добавочных макрохет у Drosophila melanogaster как результат воздействия солей тяжелых металлов / A.A. Магулаева, И.М. Мануйлов // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье региона: Материалы 55-й научно-методической конференции «Университетская наука -региону» (6-30 апреля, 2010 года). - Ставрополь: СГУ, 2010. - С. 160-170.

12. Магулаева, A.A. Мутагенный эффект кадмия: мутация «зачаточные крылья» у Drosophila melanogaster / A.A. Магулаева II Проблемы экологической безопасности и сохранение природно-ресурсного потенциала: Сборник трудов VII научно-практической конференции с международным участием. - Ставрополь, 2011.-С. 205-207.

13. Магулаева, A.A. Синхронная дупликация разных макрохет у Drosophila melanogaster при действии тяжелых металлов / A.A. Магулаева // Биоразнообразие, биоресурсьг, новые материалы и здоровье региона: Материалы 56-й научно-методической конференции «Университетская наука - региону» (7-30 апреля, 2011 года). - Ставрополь: СГУ, 2011. - С. 207-209.

14. Магулаева, A.A. Одновременная редукция и дупликация макрохет у Drosophila melanogaster при действии тяжелых металлов / A.A. Магулаева // Актуальные проблемы науки: Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции (27 сентября 2011 г.). - Тамбов, 2011.-Ч. 5.-С. 91-93.

15.Мануилов, И.М. Выпадение макрохет у Drosophila melanogaster при дсйсгвш! тяжелых металлов / И.М. Мануйлов, A.A. Магулаева // Вестник Ставропольского государственного университета. - 2011. - № 6. — Ч. П. - С. 237-242.

Подписано в печать 10.02.2012 г. Формат 60х84І/іб- Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 3,2. Тираж 120 экз. Заказ № 15. Отпечатано в ООО "Ставропольбланкиздат" 355035, г. Ставрополь, пр. Октябрьской Революции, 32, тел/факс 26-70-47; E-mail-.sbi2001ns@yandex.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Магулаева, Ася Альбертовна, Ставрополь

61 12-3//«и

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ НАУКИ РОССИИ ФГБОУ ВПО «СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ЮЖНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правахрукбписи

Магулаева Ася Альбертовна

ВЛИЯНИЕ МЫШЬЯКА, КАДМИЯ, РТУТИ И СВИНЦА

В РАЗЛИЧНЫХ СОЧЕТАНИЯХ И ДОЗИРОВКАХ НА РАЗВИТИЕ ОРЮЭОРНИА МЕЬАМОвАЭТЕИ Мв.

03.03.05 - биология развития, эмбриология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор И.М. Мануйлов

Ставрополь - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................3

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................4

ГЛАВА 1. ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ КАК ЭКЗОГЕННЫЙ ФАКТОР НАРУШЕНИЯ РАЗВИТИЯ ОРГАНИЗМОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).........9

1.1. Тяжелые металлы в окружающей среде.....................................9

1.2. Особенности влияния тяжелых металлов на разных ступенях онтогенеза животных..........................................................17

1.2.1. Токсическое действие тяжелых металлов...........................17

1.2.2. Мутагенный эффект тяжелых металлов..............................28

1.2.3. Механизмы устойчивости организмов к тяжелым металлам.. ..33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................39

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ МЫШЬЯКА, КАДМИЯ, РТУТИ И СВИНЦА НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ!). МЕЬАЖ)ОА8ТЕК......................43

3.1. Влияние солей Аб. Сё, Щ и РЬ на жизненный цикл дрозофилы......43

3.2. Влияние солей Аб. Сс1, Яg и РЬ на плодовитость дрозофилы.........57

3.3. Влияние солей Аб, Сё, Щ и РЬ на соотношение полов.................64

ГЛАВА 4. ТЕРАТОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ МЫШЬЯКА, КАДМИЯ,

РТУТИ И СВИНЦА НА В. МЕЬАМОвАБТЕК.......................................70

4.1. Влияние солей Аб, Сс1, Яg и РЬ на жизнеспособность дрозофилы.. .70

4.2. Влияние солей Аб, Сё, Щ и РЬ на развитие крылового

аппарата дрозофилы............................................................77

4.3. Влияние солей Аб, Сё, Щ и РЬ на щетиночный узор дрозофилы.....92

ВЫВОДЫ..................................................................................122

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................................125

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................126

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................I57

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДУ - допустимый уровень содержания металла в мг/кг среды МТ - металлотионеин

ПДК - предельно-допустимая концентрация в мг/м3 воздуха, мг/л воды,

мг/кг почве

ТМ - тяжелый металл

ВВЕДЕНИЕ

Особенностью загрязнения окружающей среды ТМ является то, что они не изымаются и их концентрация постепенно возрастает, вследствие чего увеличивается их негативное воздействие на организмы, что вызывает возникновение нарушений в строении и функционировании органов и систем органов (Реутова Н.В., 2008; Свинухова C.B., 2010; Xu Y., Wang Y., Zheng О., Li В. et al., 2008). Установлено, что наиболее чувствительными к действию ТМ являются ранние стадии развития живых существ (Барашнев Ю.И., Баха-рев В.А., 2010; Pietrock M., Meinelt N., Marcogliese D.J., 2008 и др.). Тяжелые металлы оказывают мутагенное (Баянова М.Ф., Кулкыбаев З.К., Дюсенбаева Н.К., 2004; Pruski A.M., Dixon D.R., 2002; Bjerreqaard H.E., 2007 и др.) и канцерогенное (Абилев С.К., Тарасов А.В., Тарасов В.А., 2004; Коста М., Хек

Дж.Д, 1993 и др.) действия.

При этом все живые организмы обладают определенной устойчивостью к действию тяжелых металлов. Она определяется способностью организмов при поступлении металлов вырабатывать специфические молекулы металлотионеинов (МТ). Благодаря наличию в тканевых белках тиоловых, карбоксильных и аминных групп происходит связывание ТМ и выведение их из организма.

Действие различных доз отдельных металлотоксикантов изучено на многих животных объектах как в природных условиях (Голованова Е.В., 2005; Ьапёёоп СЛ., Р1еагсе Т.О., ГеШшапп I., 8ешр1е К.Т. е1 а1., 2003), так и в лабораторных экспериментах (Слободян В.А. 1980; Ьешапе А., Моггаёес С., Метаю В., М1сЬеаи О. е1 а1., 2006). Большинство работ, посвященных влиянию ТМ, касаются водных объектов. Менее всего исследованы представители типа Членистоногие, несмотря на колоссальное разнообразие видов и их важную роль в природе и в жизни человека. Что касается ВгозорШа те1апо8а81ег, являющейся одним из наиболее подходящих объектов для изучения онтогенеза, поскольку она характеризуется коротким циклом развития, высокой плодовитосью, простотой содержания в лабораторных условиях, малым числом хромосом (2п=8) и изученности характера наследования многих признаков (Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Бурыченко Г.М., Мяснян-кина Е.Н. и др., 1975), то в известной нам литературе нет сведений о действии постепенно возрастающих доз отдельных ТМ и их комбинаций на данный вид. Поэтому нами была предпринята попытка проанализировать действие на развитие дрозофилы ионов четырех элементов (Аз3+, Сс12+, Щ +, РЬ ), относящихся к группе приоритетных (Ильин В.Б., 1991) - накапливающихся в окружающей среде высокими темпами - тяжелых металлов.

Цель исследования - изучение действия солей мышьяка, кадмия, ртути и свинца, взятых в различных концентрациях и сочетаниях на развитие В.

melanogaster в течение трех поколений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца на продолжительность цикла развития от яйца до имаго.

2. Определить зависимость плодовитости дрозофилы от сочетания и

дозы ТМ в питательной среде.

5. Выявить действие ТМ на развитие крылового аппарата дрозофилы;

6. Установить влияние металлов на щетиночный аппарат дрозофилы.

7. Проанализировать характер наследования выделенных терат.

Новизна работы. Впервые проведено изучение токсического действия

на A melanogaster арсенита натрия, нитратов кадмия, ртути и свинца в концентрациях от 1 до 10 ДУ (допустимого уровня содержания ТМ) в разных комбинациях (по одному, два, три и четыре элемента) на протяжении трех поколений.

Установлено, что содержание в питательной среде тяжелых металлов практически не влияет на продолжительность стадии яйцо-^личинка и, главным образом, удлиняет личиночную и куколочную фазы развития.

в независимости от комбинации элементов.

Изученные ТМ оказывают и тератогенное действие на объект исследования. Однако большая часть этих аномалий оказалась ненаследственной. О мутагенном эффекте использованных металлов свидетельствует обнаружение особей с аномальными крыльями {vestigial, vestigial-strap, vestigial-notched, новый аллель small wing - small wing-3), тораксом (Krüppel) и с измененным щетиночным узором {Humeral, polychaetoid, polychaetous, ауто-сомно-доминантный ген с неполной пенетрантностью, определяющий редукцию задней супраалярной макрохеты).

Теоретическая и практическая значимость. Данные о влиянии тяжелых металлов на онтогенез D. melanogaster существенно расширяют пред-

ставления об их токсическом и мутагенном действии на организмы. Тяжелые металлы отрицательно сказываются на всех биологических показателях дрозофилы: удлиняют продолжительность развития, снижают плодовитость, вы-зывют формирование уродств, приводящих к снижению жизнеспособности мушек. Дрозофила является одним из модельных объектов биологии развития, поэтому полученные в эксперименте результаты могут быть экстраполированы на другие организмы.

Материал диссертации используется в учебном процессе кафедры общей биологии Ставропольского государственного университета, Ставропольского филиала Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, кафедры биологии и химии Карачаево-Черкесского государственного университета им. У .Д. Алиева, кафедры физиологии человека и животных Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х.М. Бербекова в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам биологического цикла.

Основные положения, выносимые на защиту:

- мышьяк, кадмий, ртуть и свинец оказывают токсическое действие на биологические показатели ОгозорЫЬ те1апо8^ег: вызывают удлинение продолжительности цикла развития за счет затягивания, главным образом, стадий личинка—»куколка, куколка->имаго, снижение плодовитости и приводят к нарушениям в соотношении полов в сторону численного преобладания особей женского пола;

- тяжелые металлы приводят к мутациям отдельных генов дрозофилы: Krüppel - аутосомно-доминантная мутация с неполной пенетрантностью, small wing-3 - Х-сцепленная рецессивная мутация, vestigial - аутосомно-рецессивная мутация, polychaetoid и polychaetous - аутосомно-рецессивные

мутации, Humeral - аутосомно-доминантная мутация.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 50-й, 53-й, 54-й, 55-й и 56-й научных конференциях «Университетская наука -региону» (Ставрополь, 2005, 2008, 2009, 2010, 2011 гг.), на ежегодной международной научно-практической конференции «Проблемы экологической безопасности и сохранение природно-ресурсного потенциала» (Ставрополь, 2007, 2009, 2010, 2011 гг.); на шестой международной научно-практической конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных территорий» (Элиста, 2008г.); на XIV международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2009г.); на второй Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки» (Россия, Тамбов, 27 сентября 2011 г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 169 страницах

компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 269 источников, в том числе 93 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 10 рисунками.

ГЛАВА 1. ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ КАК ЭКЗОГЕННЫЙ ФАКТОР НАРУШЕНИЯ РАЗВИТИЯ ОРГАНИЗМОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Тяжелые металлы в окружающей среде

В настоящее время одним из факторов загрязнения окружающей среды являются тяжелые металлы, которые не выводятся из биогеоценозов и накапливаются до концентраций, опасных для живых организмов на всех стадиях развития. Понятие «тяжелые металлы» применяют к химическим элементам с плотностью более 4,5 г/см3 (Алексеев Ю.В., 1987; Акимова Т.А., Хаскин В.В., 2000). В биологии к ТМ относят элементы с атомной массой более 40 у.е. (Ильин В.Б., 1991; Пинский Д.А., Орешкин В.Н., 1991).

Некоторые ТМ в зависимости от их концентрации выполняют как микроэлементы важную физиологическую роль (Алексеев Ю.В., 1987; Ильин В.Б., 1991; Мартин Р., 1993; Орлов Д.С., 1998), однако при высоких концентрациях они оказывают токсическое действие на развитие живых организмов (Алексеев Ю.В., 1987; Мартин Р., 1993), подавляя активность ферментов, вступая в химическое взаимодействие с сульфгидрильными группами различных белков (Стрельников В.В., Хмара И.В., 2004; Каменев О.Ю., 2008). К высокотоксичным элементам Дж. Вуд (Wood J.M., 1974) относит Be, Со, Ni, Cu, Zn, Sn, As, Se, Te, Rb, Ag, Cd, Au, Hg, Pb, Sb, Bi, Pt. Отдельные ТМ - Hg, Pb, Cd, Zn, As - накапливаются в среде высокими темпами, и их называют приоритетными (Ильин В.Б., 1991). Некоторые авторы к этому списку добавляют Cr, Cu, Ni (Будников Г.К., 1998; Акимова Т.А., Хаскин В.В., 2000).

Различные формы одного металла могут иметь разную силу токсического эффекта. Примером таких соединений являются органические и неорганические формы ртути. Особенно токсичными являются органические производные этого металла вследствие их летучести (Мартин Р., 1993), легкого поглощения и трудного выведения из организма. Так, полупериод элиминации ртути, поглощенной шиловидным скатом Raja clavata с кормом, составил 61,6 дня для неорганической формы и 323 дня для органической (Реп-treath R.J., 1976). Превращение свободной ртути в метилированную форму

производят микроорганизмы (Мартин Р., 1993; Стрельников В.В., Хмара

И.В., 2004; Doney S.C., 2010).

Некоторые тяжелые металлы (Cd, As, Cr, Ni, Pb, Hg) ряд авторов относят к канцерогенным элементам (Коста М., ХекДж.Д., 1993; Нибовр Э., Рос-сетто Э., Менон K.P., 1993; Хэммонд П.Б., Фолкс Э.К., 1993; Скальный A.B., Рудаков H.A., 2004) или потенциально опасным для здоровья животных и человека (Спозито Г., 1993). Канцерогенность соединений отдельных металлов доказана в экспериментальных исследованиях. Так, ацетат свинца вызывает раковое перерождение клеток у крыс с частотой 1 % (Абилев С.К., Тарасов

A.B., Тарасов В.А., 2004).

В земной коре тяжелые металлы обычно встречаются в виде рассеянных химических элементов (Прохорова Н.В., Матвеев П.М., 1996). Так, например, мышьяк представлен в составе различных химических соединений (сульфидов, сульфоарсенидов, арсенидов и др.) и редко в металлическом состоянии (Рцхиладце В.Г., 1969), кадмий и свинец - чаще всего в форме сульфидов (Щербов Д.Г., Матвеец М.А., 1973; Добровольский В.В., 1987). Ртуть в основном находится в соединениях, образуя ртутные минералы (киноварь, амальгама золота, амальгама серебра), но встречается и в самородном состоянии (Гладышев В.П., Левицкая С.А., Филиппова Л.Н., 1974). Цинк содержится в железных рудах, накапливается в пыли колошниковых газов при доменных выплавках, наиболее распространены окись, карбонат, сульфат цинка (Живописцев В.П., Селезнева Е.А., 1975). Содержание в земной коре мышьяка, кадмия, ртути и свинца составляет 1 *10"4 - 1 хЮ"3 вес% (Давыдова В.И., 1989), 0,1 мг/кг (Гигиенические критерии состояния окружающей среды 135: Кадмий - экологические аспекты, Женева, 1994), 0,0016 вес% (Добровольский В.В., 1987), 5х10"6 - 7,7хЮ"6 % (Гладышев В.П., Левицкая Е.А., Филиппова Л.Н., 1974), 1,5x10"3 % (Живописцев В.П., Селезнева Е.А., 1975).

Выделяют две основные группы источников загрязнения окружающей среды: естественные и антропогенные (Грушко Я.М., 1986; Остроумов С.А., 1986; Пинский Д.А., Орешкин В.Н., 1991; Гигиенические критерии состояния

окружающей среды 86: Ртуть - экологические аспекты, Женева, 1992; Гигиенические критерии состояния ... , Женева, 1994; Прохорова Н.В., Матвеев П.М., 1996). К естественным источникам относят горные породы, продукты выветривания которых участвуют в формировании почвенного покрова (Адамян А.З., Григорьев C.B., Морозова В.М., 1987; Ильин В.Б., 1991; Прохорова Н.В., Матвеев П.М., 1996). Кроме того, в эту группу входят термальные воды и вулканические газы, рассолы, космическая и метеоритная пыль

(КовдаВ.А., 1985).

Антропогенными источниками являются:

- карьеры и шахты по добыче полиметаллических руд (Ильин В.Б., 1991; Новиков A.B., Чуйков Ю.С., 2009; Робертус Ю.В., 2009);

- предприятия цветной металлургии (Будников Г.К, 1998; Реутова Н.В., Джамбекова П.М., 2006; Макоев Х.Х, 2009; Янин Е.П., 2009);

- электростанции, сжигающие уголь и нефтепродукты (Захаров И.А., 1984; Николенко М.Г., Мезенцева И.А., 2010);

- химическая промышленность (Кубанцев Б.С., 1976; Грушко Я.М., 1986; Алексеев Ю.В., 1987; Сает Ю.Е., 1987; Акимова Т.А., Хаскин В.В.,

2000; Дегтярева Т.В., 2004; Harkov R., 1986);

- пылевые выбросы предприятий (Акимова Т.А., Хаскин В.В., 2000;

Куимова Н.Г., Радомская В.И., 2008; Янин Е.П., 2009);

- использование органических удобрений (Сает Ю.Е., 1987);

- автотранспорт (Смит У.Х., 1985; Сает Ю.Е., 1987; Мальчуковский П.Б., Данилов С.Р., Ганенков В.Д., Муравлева P.E. и др.,2009; Никифорова E.H., Кошелева Н.Е., 2009; Новиков А.В, Чуйков Ю.С., 2009; Harkov R.,

1986);

- табачный дым (Геппе H.A., 2007; Harkov R., 1986).

Одной из характеристик качества окружающей среды является фоновое (нормальное) содержание ТМ, под которым понимают содержание загрязняющих веществ в экологиче

Информация о работе

Магулаева, Ася Альбертовна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2012
ВАК 03.03.05

Диссертация

Влияние мышьяка, кадмия, ртути и свинца в различных сочетаниях и дозировках на развитие Drosophila melanogaster Mg. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы