Влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с биологически активными субстанциями на фагоцитирующие клетки in vitro

Зайковская, Мария Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с биологически активными субстанциями на фагоцитирующие клетки in vitro
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с биологически активными субстанциями на фагоцитирующие клетки in vitro"

На правах рукописи

Зайковская Мария Владимировна

ВЛИЯНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-НАНОСОМАЛЬНЫХ ГИБРИДНЫХ КОМПОЗИЦИЙ С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ СУБСТАНЦИЯМИ НА ФАГОЦИТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ IN VITRO

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2008

003456534

Работа выполнена в Государственном учреждении Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

кандидат медицинских наук

Архипов Сергей Алексеевич

Ильинских Николай Николаевич Солонский Анатолий Владимирович

Ведущая организация: Государственное учреждение НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Защита диссертации состоится « » ф^^Ы^лЛ^ 2008 г.

в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.03 при

Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Автореферат разослан 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ' А.В. Герасимов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тема работы посвящена актуальной проблеме -разработке и изучению новых молекулярно-наносомальных гибридных композиций в качестве эффективных средств направленной доставки биологически активных веществ и лекарственных средств, обладающих высокой собственной биологической активностью. В настоящее время к одному из перспективных направлений разработки и создания новых лекарственных форм относят синтез композиций адресного действия с заданными фармакокинетическими свойствами и гармоничным содержанием в них субстанций, не только не оказывающих побочных действий, но и обладающих биоактивными свойствами, повышающими их эффективность (Шкурупий В.А. и др. 2000, 2007; Dutt М, Khuller et al., 2001; Fenske D.B. et al., 2008). Такие терапевтические лекарственные системы направленной доставки лекарственных веществ к клетке или органу как наноразмерные носители являются перспективным лечебным средством нового поколения (Матвиенко П.В., 2004; Кузякова Л.М., 2005; Nie S. et al., 2006). Конструирование эффективных лекарственных средств предполагает необходимость не только разработки, но и изучения наноразмерных композиционных материалов, гибридных наноразмерных композиций, обладающих высокой биосовместимостью, биотропностью, заданной биологической активностью, а также средств и способов их доставки, контроля адресности и регистрации производимых биологических эффектов.

Цель исследования. Изучить биологические эффекты молекулярно-наносомальных гибридных композиций с различными физико-химическими свойствами, содержащих биологически активные субстанции, на фагоцитирующие клетки in vitro.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние окисленных декстранов с молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа (декстраналя-35 и декстраналя-60) и их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты (декстразида-35 и декстразида-60) на показатели жизнеспособности перитонеальных клеток, показатели адгезивной активности перитонеальных макрофагов и плотность клеточного монослоя перитонеальных клеток для оценки свойств их биосовместимости.

2. Исследовать влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций на изменение показателей жизнеспособности перитонеальных клеток, показателей адгезивной активности перитонеальных макрофагов и плотности клеточного монослоя перитонеальных клеток в зависимости от вариантов физико-химических параметров молекулярно-наносомальных гибридных композиций, определяемых размерами нанолипосом (в диапазоне 150-800 нм) и молекулярной массой входящих в их состав окисленных декстранов (35 кДа и 60 кДа) и их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты, для оценки свойств их биосовместимости.

состав окисленных декстринов (35 кДа и 60 кДа), а также их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты, на изменение показателей фагоцитозной активности макрофагов для оценки свойств их биотропности по доле макрофагов, фагоцитирующих нанолипосомальные композиции, и интегрального показателя количества нанолипосомальных композиций, поглощаемых отдельными макрофагами.

4. Исследовать адгезивную способность молекулярно-наносомальных гибридных композиций с размером нанолипосом 200-450 нм, содержащими окисленные декстраны с молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа, конъюгированные с гидразидом изоникотиновой кислоты, в отношении перитонеальных макрофагов для оценки биотропных свойств композиций.

5. Изучить влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с размером 200-450 нм, содержащими окисленные декстраны с молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты, на показатели фагосомно-лизосомного слияния в отношении тестируемого корпускулярного агента (гранул зимозана) для оценки биостимулирукяцих свойств композиций.

6. Изучить влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с размером 200-450 нм, содержащими окисленные декстраны с молекулярной массы 35 кДа и 60 кДа, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты, на показатели продукции макрофагами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-СБР) и антиапоптотиче'ского белка Вс1-2, экспрессии кластера дифференцировки СЭ25 на мембранах макрофагов, в качестве маркеров активации макрофагов, для оценки их биостимулирующих свойств.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение свойств, характеризующих биосовместимость, биотропность и биологическую активность новых молекулярно-наносомальных гибридных композиций липосомальной формы, полученных на основе окисленных декстранов, в зависимости от физико-химических параметров композиций для разработки средств адресной доставки биологически активных веществ и лекарственных средств.

Впервые установлено, что окисленные декстраны с различной молекулярной массой и молекулярно-наносомальные гибридные композиции липосомальной формы, полученные на основе окисленных декстранов и их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты, обладают высокой биосовместимостью в отношении перитонеальных клеток.

Впервые установлено, что биосовместимость, биотропность и биологическая активность, исследуемых молекулярно-наносомальных гибридных композиций зависит от их физико-химических параметров: размеров нанолипосом, молекулярной массы окисленных декстранов и их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты, входящих в состав композиций.

веществ в клетки системы мононуклеарных фагоцитов на примере гидразида изоникотиновой кислоты — противотуберкулезного препарата), следует отнести композиции с размерами нанолипосом 200-450 нм на матрице-носителе - окисленном декстране с молекулярной массой 60 кДа - по параметрам биосовместимоста, бнотропности и высокой биостимулирующей активности в отношении макрофагов.

Впервые показано, что свойства биосовместимости, биотропности и биостимуляции в отношении макрофагов определяются не только суммой соответствующих свойств компонентов, входящих в состав молекулярно-наносомальных гибридных композиций, а представляют собой новое качество, формирующееся при конструировании нанолипосомальных композиций, зависящее от их физико-химических характеристик, задаваемых размерами нанолипосом и молекулярной массой окисленных декстранов, входящих в их состав.

Обоснована вероятная эффективность применения изучаемых молекулярно-наносомальных гибридных композиций в качестве средств направленной доставки биологически активных веществ.

Научно-практическая значимость работы. Исследование выполнено в рамках гранта Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развитая научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы" в соответствии с государственным контрактом № 02.513.11.3183 от «23» апреля 2007 года «Разработать технологию конструирования молекулярно-наносомальных гибридных биосовместимых композиций для адресной доставки биологически активных веществ в клетки и клеточные системы».

Результаты исследования могут быть использованы при разработке средств направленной доставки биологически активных веществ или лекарственных средств с заданными биологически активными свойствами в клетки и органы-мишени, в частности, для лечения ряда заболеваний, в основе которых лежит гранулематозное воспаление.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Окисленные декстраны с молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа (декстраналь-35 и декстраналь-60) обладают высокой биосовместимостью в отношении перитонеальных клеток.

2. Конъюгаты окисленных декстранов с гидразидом изоникотиновой кислоты (декстразид-35 и декстрзид-60) обладают более низкой биосовместимостью по сравнению с декстраналем-35 и декстраналем-60.

3. Молекулярно-наносомальные гибридные композиции, включающие окисленные декстраны или их конъюгаты с гидразидом изоникотиновой кислоты, обладают высокой биотропностью в отношении клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Биотропность молекулярно-наносомальных гибридных композиций возрастает при уменьшении размеров нанолипосом.

биостимулирующими свойствами в отношении клеток системы мононуклеарных фагоцитов: стимулируют процесс фагосомно-лизосомного слияния, продукцию гранулоцитарно-макрофагального колониести-мулирующего фактора GM-CSF и внутриклеточного антиапоптотического белка Вс1-2, повышают экспрессию кластера дифференцировки CD25 на мембранах макрофагов.

5. Молекулярно-наносомальные гибридные композиции с размерами нанолипосом 200-450 нм, содержащие окисленные декстраны с молекулярной массой 60 кДа, обладают более высоким биостимулирующим действием по сравнению с композициями, содержащими окисленные декстраны с молекулярной массой 35 кДа.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в отчетах НИР по гранту Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы» (в отдельных главах отчетов по 1, 2, 3, 4 этапам) в соответствии с государственным контрактом № 02.513.11.3183 от «23» апреля 2007 года «Разработать технологию конструирования молекулярно-наносомальных гибридных биосовместимых композиций для адресной доставки биологически активных веществ в клетки и клеточные системы». Материалы диссертации обсуждались на межлабораторных семинарах отдела общей патологии Государственного учреждения Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (2007, 2008). Основные идеи диссертации нашли отражение в 3 опубликованных журнальных статьях. Работа была обсуждена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ Сибирского государственного медицинского университета Росздрава 10 октября 2008 г. и рекомендована к защите.

Публикации. По материалам научного исследования опубликовано 5 научных работ, из них 3 статьи в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикации материалов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав "Результаты исследования" и "Обсуждение результатов", выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 151 странице машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 5 таблицами. Список литературы включает 237 источника (69 отечественных и 168 зарубежных).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы получения и культивирования перитонеальных клеток.

Работа выполнена на 90 самцах мышей линии BALB/c (возраст 2 мес., масса тела 21-22 г., из вивария Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск). В каждом эксперименте in vitro для посадки клеток в культуры использовали пулированные транссудаты перитонеальных клеток (от 6-12 мышей в зависимости от количества посадок клеток в культуры, из расчета не менее 1 животного на три культуры). Животных умерщвляли

методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Перитонеальный транссудат получали путем введения в брюшную полость 3,5 мл среды RPMI 1640 («Биолот», С.-Петербург), содержащей гентамицин (50мкг/мл), по стандартной методике (Конки Д., 1989). Перитонеальные клетки культивировали на покровных стеклах (106 клеток в 2 мл культуралыюй среды RPMI 1640), содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров и гентамицин (50мкг/мл), в стеклянных флаконах при температуре 37° С.

Методы исследования структурно-размерных параметров мол скул ярно-наносомальнмх гибридных композиций (МНГЮ.

Исследовали МНГК липосомальной формы, разработанные и полученные в группе биохимии биосовместимых наночастиц и наноматериалов отдела общей патологии ГУ НЦКЭМ СО РАМН. В качестве источников декстрана М.м. 35 кДа использовали плазмозамещающий раствор «Реополиглюкин». В качестве источника декстрана М.м. 60 кДа использовали плазмозамещающий раствор «Полиглюкин». Для получения образцов окисленных декстранов использовали перманганатный способ окисления. Получение МНГК на основе фосфатидилхолина (Sigma, USA), содержащих окисленные декстраны и их конъюгаты с гидразидом изоникотиновой кислоты (ГИНК), осуществляли методом механического диспергирования и микрофильтрационного фракционирования (вортексирования). Образцы МНГК разводили в дистиллированной воде в 5 раз и заключали под покровное стекло на предметном стекле для последующего микроскопического исследования. Исследование проводили методом фазового интерференционного контраста на микроскопе Axiolmager ZI (Zeiss) с использованием цифровой камеры AxioCam MRc и программного обеспечения AxioVision V. 4.5. Цифровые изображения нанолипосом бинаризировали по яркости, автоматический анализ и измерение изображений проводили при помощи программы ВидеоТест Морфо 3.2 с последующим транспонированием и статистической обработкой в программе Statistica V.6.

Методы оценки биологических свойств МНГК и их компонентов.

МНГК и их компоненты.

Опытные образцы МНГК представляли собой суспензии нанолипосом (НЛ), содержащие декстранали (DX) или конъюгаты DX (М.м. 35 или 60 кДа) с ГИНК декстразиды (DXZ), заключенные в НЛ, в трис-фосфатном буфере, содержащим соответствующие DX или DXZ в концентрации 2,5%. По данным исследования структурно-размерных параметров МНГК исследуемые образцы содержали НЛ, находящиеся в 3-х наноразмерных диапазонах: 150-200,200-450 и 450-800 нм.

Методы оценки биосовместимости МНГК и их компонентов.

Степень биосовместимости МНГК и их компонентов оценивали по количеству адгезированных перитонеальных клеток, числу макрофагов (МФ) с высокой степенью распластывания и показателю жизнеспособности клеток в культурах. МНГК, а также их компоненты (DX и DXZ) вносили в культуры

перитонеальных клеток на 2-й час культивирования (в конечном разведении 1:200). Оценку всех параметров клеточных культур, характеризующих их биосовместимость с исследуемыми образцами МНГК или их компонентами, проводили через 24 часа после внесения в культуры клеток.

Показатель жизнеспособности оценивали при помощи витальной окраски клеток трипановым синим. После окрашивания клетки фотографировали на микроскопе Axiostar Plus (Zeiss) при помощи цифровой фотокамеры Nicon Coolpix 5000 при увеличении объектива х20. В 5-х полях зрения подсчитывали общее количество всех типов перитонеальных клеток, количество живых клеток (не окрасившихся трипановым синим), количество распластанных МФ. Показатель жизнеспособности (ПЖ) рассчитывали по формуле:

ПЖ = (N жив. кл. / N всех кл.) * 100%; где N жив. кл. - количество живых клеток; N всех кл. - количество всех клеток

По аналогичной формуле рассчитывали среднюю величину плотности клеточного монослоя (среднего числа адгезированных перитонеальных клеток в одном поле зрения) и среднюю величину (долю в %) числа МФ с высокой степенью распластывания.

Методы оценки параметров, характеризующих биотропность МНГК.

Методы оценки фагоцитозной активности МФ в отношении МНГК.

Для определения биотропных свойств МНГК и их компонентов оценивали фагоцитозную активность перитонеальных МФ в отношении МНГК, а также адгезивную способность нанолипосом МНГК в отношении мембран МФ. Оценку фагоцитозной активности МФ, проводили через 24 часа после внесения в культуры клеток МНГК. После инкубации с МНГК клеточные культуры фиксировали в 4% растворе формальдегида (4% раствор в фосфатном буфере). Для выявления нанолипосом клетки окрашивали липофильным красителем Суданом черным (C29P24N8, 0,25% раствор в 70% этаноле), отмывали дистиллированной водой и окрашивали сафранином (1% водный р-р). Далее окрашенные препараты помещали на предметное стекло «клетками вниз». Между предметным и покровным стеклами вносили раствор фосфатного буфера. Клетки фотографировали на микроскопе Axiolmager Z1 (Zeiss) при помощи цифровой камеры высокого разрешения AxioCamHr при установленных увеличениях объектива х40 и хЮО. При увеличении объектива х40 в 10-ти полях зрения подсчитывали общее число МФ и количество МФ, содержащих в цитоплазме окрашенные нанолипосомы. Рассчитывали индекс фагоцитоза (ИФ) по формуле:

• ФИ = (N фагоцит. МФ / N всех МФ) х 100%; где N фагоцит. МФ - количество макрофагов, фагоцитирующих МНГК;

N всех МФ -количество всех МФ.

Оценку условного показателя количества МНГК, фагоцитированных МФ, проводили методом компьютерной морфометрии при помощи программы ВидеоТест-Морфо 3.2. Цифровые изображения клеток (при увеличении об.

хЮО) бинаризировали по цвету Судана черного, а среднее значение суммы площадей (pixel2) бинарных изображений МНГК, окрашенных Суданом черным, принимали за условный показатель их суммарного содержания в одном МФ (при анализе клеток в 10-ти полях зрения).

Методы оценки адгезивной способности МНГК к мембранам МФ.

Адгезивные свойства МНГК оценивали по показателю адгезии НЛ к перитонеальными МФ. Образцы МНГК с размерами 200-450 нм, включающие DXZ-35 и DXZ-60, вносили в культуры перитонеальных клеток на 3-й час культивирования. Оценку адгезивной способности МНГК в отношении МФ проводили через 1, 3, 5, 10, 15 и 20 минут после внесения МНГК в культуры клеток. Для выявления НЛ на поверхности МФ фиксированные клетки окрашивали липофильным красителем Суданом черным, отмывали дистиллированной водой и окрашивали сафранином (1% водный раствор). Окрашенные препараты помещали на предметное стекло «клетками вверх» в растворе фосфатного буфера и заключали под второе покровное стекло. Клетки фотографировали на микроскопе Axiolmager Z1 (Zeiss) с помощью цифровой камеры AxioCamHr при установленных увеличениях объектива х40 и хЮО с использованием модуля оптического сканирования Z-staker программы AxioVision v. 3.5 (Zeiss), позволяющего делать фотографии «оптических срезов» исследуемых объектов заданной «толщины». Для оценки адгезивной способности НЛ использовали фотографии 2-х верхних оптических «срезов» клеток (шаг - 200 нм), на которых регистрировались адгезированные на клетках НЛ. Рассчитывали количество (долю в %) МФ с адгезированными на них НЛ, а также индекс адгезивной способности - условный показатель количества НЛ, адгезирован-ных на одной клетке-мишени (МФ), пропорциональный их числу на поверхности МФ. Оценку индекса адгезивной способности МНГК проводили методом компьютерной морфометрии при помощи программы Видео Тест-Морфо 3.2. Цифровые изображения клеток бинаризировали по цвету судана черного, а среднее значение суммы площадей (pixel2) бинарных изображений НЛ, окрашенных Суданом черным, принимали за условный средний показатель суммарного их содержания на поверхности МФ (при анализе клеток в 5-ти полях зрения, при увеличении об. х40).

Методы определения биоактивных свойств МНГК.

Метод оценки влияния МНГК на процессы фагосомно-лизосомного слияния в МФ.

Для оценки влияния МНГК на процессы фагосомно-лизосомного слияния в МФ использовали следующую экспериментальную модель. Исследуемые МНГК размерами 200-450 нм, содержащие DXZ-35 или DXZ-60, вносили на 3-й час после посадки клеток в культуру. Клетки инкубировали с МНГК в течение 24 часов (в конечном разведении 1:300). Далее инкубационную среду, содержащую МНГК, заменяли на аналогичную по составу среду для культивирования, содержащую гранулы зимозана (лиофилизированные дрожжеподобные грибки Saccharomyces cerevisiae). Через 0,5 час после

инкубации клеток с гранулами зимозана, в культуры вносили среду, содержащую лизосомотропный краситель акридиновый оранжевый (10 мкг/мл). Количество образующихся в фагоцитах фаголизосом определяли по числу гранул зимозана, окрашенных в оранжево-красный цвет (Булычев А.Г., 1991; Kielian M., Cohn F.A., 1982; Travers M.A., 2008). По количеству неокрашенных акридиновым оранжевым гранул зимозана, фагоцитированных МФ, оценивали число фагосом, не слившихся с лизосомами. После окрашивания клетки исследовали при помощи микроскопа Axiolmager ZI в режиме флуоресцентного анализа клеток. Окрашенные клетки фотографировали при увеличении объектива хЮО. Рассчитывали среднее количество МФ с относительно высоким уровнем фагосомно-лизосомного слияния (долю МФ в %, в которых количество фаголизосом > 5) и условный показатель уровня фагосомно-лизосомного слияния в МФ (среднее число фаголизосом в МФ с высоким уровнем фагосомно-лизосомного слияния, к которым относили МФ при наличии > 5 фаголизосом на клетку) при анализе 10-ти полей зрения.

Иммуноцитохимнческие (ИЦХ) методы выявления внутриклеточной продукции фактора GM-CSF и антиапоптотического белка Вс1-2, экспрессии кластера дифференцировки CD 25 на мембранах МФ.

Для изучения биологической активности МНГК использовали непрямой ИЦХ-метод оценки экспрессии цитокинов и кластеров дифференцировки. Анализ проводили через 24 часа после внесения исследуемых композиций в первичные культуры перитонеальных клеток (МНГК в конечном разведении 1:200 вносили на 3-й час после посадки клеток в культуру). Клетки фиксировали в 4% растворе формальдегида (в фосфатном буфере), демаскировку антигенов проводили при инкубировании с тритоном Х-100 (0,3% раствор в фосфатном буфере). Далее препараты клеточных культур инкубировали с «первыми» антителами к соответствующим антигенам/маркерам: GM-CSF (Rat Anti-Mouse GM-CSF; Isotype: Rat IgG2a), CD 25 (Biotin Rat Anti-Mouse CD 25; Isotype: Rat IgM4), Bcl-2 (Hamster Anti-Mouse Bcl-2; Isotype: Armenian Hamster IgG) во влажной камере. Препараты, обработанные небиотинилированными крысиными антителами, дополнительно инкубировали с антикрысиными биотинилированными антителами овцы (biotin-conjugated goat anti-rat Ig specific polyclonal antibody) во влажной камере. Препараты, обработанные небиотинилированными Hamster Anti-Mouse Bcl-антителами, дополнительно инкубировали с биотинилированными антителами Mouse Anti-Hamster (Isotype: Mouse BALB/c, IgG) во влажной камере (30 мин). Все препараты, инкубированные с биотинилированными антителами, инкубировали со стрептавидин-пероксидазным комплексом. Далее окраску препаратов проводили в растворе диаминобензидина (DAB) с субстратом, содержащим Н2О2, (использовали стандартный BD DAB Kit). Клетки отмывали от свободного DAB дистиллированной водой, препараты высушивали и докрашивали водным 1% раствором метилового зеленого. Все процедуры ИЦХ-окраски клеток проводили при комнатной температуре. Зоны клеточных мембран или

цитоплазмы, содержащие выявляемые маркеры, окрашивались в «специфический» темно-коричневый цвет. Интенсивность такой окраски прямо пропорциональна количеству экспрессируемого маркера. Биоактивные свойства МНГК оценивали по количеству (доле в %) клеток, экспрессирующих оцениваемый маркер. Дополнительно оценивали уровни продукции соответствующего маркера по условному показателю, оцениваемому в баллах (1 - низкий уровень продукции, 2 - средний уровень продукции, 3 - высокий уровень продукции). Рассчитывали среднюю величину этого показателя в каждой экспериментальной группе культур.

Вероятность достоверности различий между средними величинами исследуемых показателей в экспериментальных группах культур оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Вычисляли стандартную величину (М), стандартную ошибку среднего (ш). Данные представлены в виде М±т. Различия считали достоверными при Р<0,05. Полученные данные были статистически обработаны с помощью лицензированных пакетов программ «Statistica V. 6» и Excel (2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Конструирование МНГК представляет собой процесс подбора составных компонентов, каждый из которых имеет индивидуальные характеристики и способен оказывать определенное воздействие на клетки. Размеры НЛ могут определять интенсивность их захвата МФ. Однако в зависимости от размеров МНГК характеризуются различной внутриклеточной стабильностью и могут либо активировать фагоциты, если компоненты МНГК обладают таким действием, либо подавлять жизнедеятельность клеток, если в процессе внутриклеточного разрушения МНГК образуются компоненты с деструктивно-цитотоксическим действием. При создании МНГК с заданными параметрами, предназначенных для модуляции свойств клеток и клеточных систем, необходимо определить и учесть биологические эффекты их компонентов в отдельности. Для определения биологических эффектов МНГК и их компонентов на клетки и клеточные системы была проведена оценка свойств их биосовместимости, биотропности и биоактивности.

Результаты исследования структурно-размерных параметров НЛ. На основании результатов испытаний было установлено, что примененный метод получения МНГК позволяет получать HJI в диапазоне размеров 150 -800 нм. Установлено, что при этом в зависимости от диаметра пор фильтра, используемого для вортексирования, получается суспензия НЛ, более 90% которой обладают следующими характеристиками: при использовании фильтра с диаметром пор 0,8 мкм размер получаемых НЛ находится в пределах 450-800 нм (М=640,7 ± 7,9); при использовании фильтра с диаметром пор 0,45 мкм размер получаемых НЛ находится в пределах 200 -450 нм (М=302,4 ± 3,1); при использовании фильтра с диаметром пор 0,2 мкм размер получаемых НЛ находится в пределах 150 - 200 нм (М=174,2 ± 2,1).

Оценка свойств биосовместимости МНГК и их компонентов.

Изучение свойств биосовместимости компонентов МНГК.

Для сравнения свойств биосовместимости DX-35 и DX-60 были проанализированы показатели плотности клеточного слоя, жизнеспособности всех перитонеальных клеток (% живых клеток) и показатели адгезивной активности перитонеальных МФ (% МФ с высокой степенью распластывания). Не было выявлено различий в показателях биосовместимости DX-35, DX-60 по сравнению с контрольной группой. Показатель адгезивной активности МФ максимален для DX-35, показатели жизнеспособности всех перитонеальных клеток сравнимы для DX-35, DX-60 и контрольной группы (таблица 1). Отсутствие влияния DX на жизнеспособность клеток в культуре, без нарушений адгезивной активности МФ, свидетельствует о высокой степени их биосовместимости.

Таблица 1.

Влияние декстранов, окисленных химическим способом (декстраналей), на перитонеальные клетки in vitro в зависимости от их молекулярной

массы (М±щ).

Опытный образец Плотность клеточного монослоя Показатель жизнеспособности всех перитонеальных клеток (%) Показатель адгезивной активности перитонеальных МФ (%)

декстраналь-35 617,0±114,8 91,5± 1,8 33,4±7,7*

декстраналь-60 591,5±62,1 88,1±2,7 21,5±2,3

Контроль 861,9±54,7 90,7±1,4 16,7±4,9

Примечание: Р - вероятность достоверности различий между средними величинами исследованных показателей в опыте (внесение декстраналей) и контроле (интактная культура перитонеальных клеток): *Р<0,05 (количество культур в каждой группе опыта - 5, в контроле - 7).

Сравнительный анализ показателей плотности клеточного слоя, показателя жизнеспособности всех перитонеальных клеток (% живых клеток) и показателя адгезивной активности перитонеальных МФ (% МФ с высокой степенью распластывания) выявил снижение биосовместимости ОХ2-35 и БХг-бО по сравнению с ОХ-35 и БХ-бО. Плотность клеточного монослоя и показатель жизнеспособности перитонеальных клеток с 0X2-35 и БХ2-60 снижены. Однако показатели адгезивной активности МФ при воздействии ВХ2 сравнимы с таковыми в контроле. Снижение плотности клеточного монослоя перитонеальных клеток при инкубации с характеризовалось уменьшением количества (доли, в %) лимфоцитов в культурах и, соответственно, увеличением доли МФ в составе монослоя Вероятно, этот эффект обусловлен снижением адгезивной активности лимфоцитов при наличии в культуральной среде (таблица 2).

Таблица 2.

Влияние декстразидов на перитонеальные клетки in vitro в зависимости _от молекулярной массы окисленных дексгранов (М±го)._

декстразид-35 386,6±30,0* 69,9±6,4** 17,6±2,8*

декстразид-60 351,3±12,4* 66,6±8,3** 35,8±5,6

Контроль 675,0±9,7 91,2±7,0 65,1±29,1

Примечание: Р - вероятность достоверности различий между средними величинами исследованных показателей в опыте (внесение декстразидов) и контроле: *Р<0,05;**Р<0,01 (количество культур в каждой группе опыта - 5, в контроле - 7).

Изучение свойств биосовместимости нанолипосомальных форм МНГК трех размеров, содержащих DX и DXZ с М.м. 35 и 60 кДа.

Были проанализированы показатели биосовместимости МНГК, содержащих декстранали М.м. 35 и 60 кДа, в трех размерных диапазонах HJI: 150-200 нм, 200-450 нм и 450-800 нм (таблица 3).

Таблица 3.

Влияние МНГК на перитонеальные in vitro в зависимости от размеров нанолипосом и М.м. декстраналей (М±ш).__

Опытный образец МНГК Плотность клеточного монослоя Показатель жизнеспособности всех перитонеальных клеток (%) Показатель адгезивной активности перитонеальных МФ (%)

МНГК 150-200 нм с декстраналем-35 492,4 ±32,4* 79,8±1,6* 27,0±14,6***

МНГК 150-200 нм с декстраналем-60 509,8±25,4* 81,5±5,5 36,9±12,0***

МНГК 200-450 нм с декстраналем-35 470,5±43,4* 75,3±2,8* 84,3±9,8

МНГК 200-450 нм с декстраналем-60 527,8±21,9* 68,6±5,7** 15,1±7,7***

МНГК 450-800 нм с декстраналем-35 445,8±45,3 76,7±9,0 19,1±4,1***

МНГК 450-800 нм с декстраналем-60 667,6±75,3 79,7±9,0 19,1±4,1***

Контроль 681,0±13,3 91,1±4,0 | 97,7±24,3

Примечание: Р - вероятность достоверности различий между средними величинами показателей в опыте (внесение МНГК) и контроле: *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 (количество культур в каждой группе опыта - 5, в контроле - 7).

Внесение в культуру перитонеальных клеток МНГК с ОХ М.м. 35 или 60 кДа снижало плотность клеточного монослоя, за исключением МНГК с размерами НЛ 450-800 нм и БХг с М.м. 60 кДа. Максимальные показатели жизнеспособности перитонеальных клеток при оценке МНГК с ИХ М.м. 35 и 60 кДа в НЛ 450-800нм и с 0X7,-60 в НЛ 150-200 нм. Показатель адгезивной активности перитонеальных МФ снижался при внесении в культуральную среду МНГК с 0X7 М.м. декстрановых матриц 35 и 60 кДа (таблица 3).

При сравнении показателей биосовместимости МНГК с 0X2 М.м. 35 и 60 кДа с размерами НЛ 150-200 нм, 200-450 нм и 450-800 нм были отмечены следующие особенности. Плотность клеточного монослоя с МНГК, содержащих OXZ М.м. 35 и 60 кДа с размерами НЛ 150-200 нм, 200-450 нм и 450-800 нм, не снижалась относительно контроля. МНГК с ОХ7-35 и размерами НЛ 450-800 нм уменьшали плотность клеточного монослоя. Показатели жизнеспособности всех перитонеальных клеток в большинстве опытных группах культур оставались высокими, кроме культур при воздействии МНГК с ОХг-бО и размеров НЛ 450-800 нм. Большинство образцов МНГК с ОХ7 М.м. 35 и 60 кДа с размерами НЛ в диапазоне 150-800 нм снижали показатели адгезивной активности перитонеальных МФ по сравнению с контролем, кроме МНГК с ОХ2-35 кДа и размерами НЛ 150-200 нм (таблица 4).

Таблица 4.

Влияние МНГК на перитонеальные клетки in vitro в зависимости от размеров МНГК и М.м. декстраналей, конъюгированных с ГИНК (М±ш).

МНГК 150-200нм с декстразидом-35 584,4±48,8 67,9±19,2 44,7±22,4

МНГК 150-200 нм с декстразидом-60 890,5±25,2 95,2±4,2 3,3±0,7***

МНГК 200-450 нм с декстразидом-35 521,8±82,8 72,8±9,б 16,4±21,9**

•МНГК 200-450 нм с декстразидом-60 517,1±77,2 70,1±9,7 18,0±6,0**

МНГК 450-800 нм с декстразидом-35 389,1±85,5* 85,4±3,4 9,1±4,0***

МНГК 450-800 нм с декстразидом-60 615,5±6,2 65,4±10,9* 35,4±11,2**

Контроль 675,0±9,7 91,2±7,0 65,1±9,1

Оценка свойств биотропности МНГК, содержащих декстранали, конъюгированные с ГИНК.

Одним из главных условий, которое необходимо учитывать при разработке наноразмерных материалов для направленной доставки и воздействия на биологические мишени является обладание ими биотропных свойств, а также возможность их визуализации при мониторинге их направленной доставки в биологические мишени. Поэтому на втором этапе исследования была проведена оценка поглощения разрабатываемых МНГК фагоцитирующими клетками - МФ, а также адгезивная способность липосомальной формы МНГК в отношении мембран МФ.

Оценка фагоцитозной активности перитонеальных МФ в отношении МНГК, содержащих декстранали, конъюгированные с ГИНК.

Для оценки свойств биотропности МНГК, содержащих с М.м.

декстрановых матриц 35 и 60 кДа, с размерами НЛ в диапазоне 150-800 нм были проведены сравнения индекса фагоцитоза (ИФ) МФ по % МФ, содержащих в цитоплазме фагосомы, и сравнения условного показателя количества фагоцитированных липосом МФ (таблица 5).

Таблица 5.

Фагоцитозная активность перитонеальных МФ в отношении нанолипосом, входящих в состав МНГК, в зависимости от размеров нанолипосом и М.м. окисленных декстранов, конъюгированных с

Экспериментальная группа Количество МФ, фагоцитирующих нанолипосомы (%) Условный показатель количества нанолипосом, поглощенных фагоцитирующим МФ (Pixel2)

МНГК 150-200нм с декстразидом-35 99.2±0.5** 7700.5±65.4**

МНГК 150-200 нм с декстразидом-60 98.0±0.7** 7010.0±53.2**

МНГК 200-450 нм с декстразидом-35 98.1±0.6** 7100.3±70.4**

МНГК 200-450 нм с декстразидом-60 95.0±3.2** 6920.9±60.8**

МНГК 450-800 нм с декстразидом-35 82.5±2.58 5150.0±55.4

МНГК 450-800 нм с декстразидом-60 70.6±6.6 3350.5±70.8

Примечание. Р - вероятность достоверности различий между средними величинами показателей в группе с МНГК НЛ 450-800 нм и декстразидом-60 и аналогичными показателями в других экспериментальных группах культур: **Р<0,01 (количество культур в каждой группе эксперимента - 5).

При сравнении экспериментальных групп было выявлено, что ИФ МФ, культивированных с МНГК в размерном диапазоне нанолипосом 150-450 нм, выше ИФ МФ при оценке НЛ форм МНГК с размерами 450-800 нм не зависимо от М.м, ОХ2, входящих в состав МНГК.

Таким образом, наиболее эффективное поглощение МНГК МФ отмечали при использовании в составе МНГК НЛ в размерном диапазоне 150-450 нм. При этом к главному фактору, определяющему биотропность МНГК в отношении МФ, отнесен размер частиц. Биотропность МНГК, оцениваемая по фагоцитозу, возрастала при их уменьшении. М.м. входящего в МНГК, существенно определяла биотропность исследуемых композиций при размерах частиц в диапазоне 450-800 нм. При этом следует принимать во внимание, что согласно технологии получения МНГК конъюгат ГИНК с окисленным декстраном находится не только внутри наносом, но и на их поверхности. Это, наряду с размерами НЛ, могло модифицировать их биотропные свойства, определившие как количество фагоцитированных НЛ, так и количество клеток, участвующих в процессе фагоцитоза при изменении физико-химических параметров исследуемых МНГК.

Оценка способности к адгезии нанолипосом МНГК, содержащих декстранали, коньюгированные с ГИНК, на мембранах МФ.

Одним из главных свойств, которое необходимо учитывать при разработке наноразмерных материалов и молекулярно-наносомальных гибридных биосовместимых композиций для направленной доставки и воздействия на биологические мишени, в том числе основанных на эндоцитозной активности клеток, является обладание ими адгезивной активности при их взаимодействии с биологическими мишенями. При контакте с биологическими мембранами различных типов клеток адгезивная активность МНГК может определяться как минимум двумя составляющими -неспецифическим связыванием МНГК с поверхностью клеток, зависящим от физико-химических свойств мембран наносом, и мембран клеток (наличие различных молекул адгезии, мембранного электрического потенциала и др.), так и от «специфических» взаимодействий МНГК и клеток, обусловленных рецептор-опосредованным связыванием наносом с клеточными мембранами.

При оценке количества НЛ, адгезированных на поверхности МФ, было установлено, что уже через 10 мин после внесения НЛ в культуры клеток, более 70% МФ содержали НЛ в цитоплазме, что указывало не только на высокую скорость процесса адгезии НЛ на поверхности МФ, но и высокую скорость проникновения НЛ в МФ, очевидно обусловленную их высокой фагоцитозной активностью в отношении исследованных МНГК. Через 20 минут инкубации доля МФ, фагоцитировавших НЛ, превысила 90%. Таким образом, было установлено, что адгезивную способность НЛ в отношении МФ следует оценивать в более короткие временные интервалы, чем в предварительном эксперименте.

Для более точной оценки адгезивной способности исследуемых МНГК были исследованы образцы суспензий МНГК с БХ2-35,0X2-60 в размерном

диапазоне 200-450 нм. Оценку проводили через 1, 3 и 5 минут после внесения исследуемых композиций в культуры перитонеальных клеток (на 3-й час после посадки клеток в культуру). Оценивали количество НЛ, адгезированных на поверхности МФ (после окраски нанолипосом Суданом черным). Для визуализации ядер МФ использовали окраску сафранином. Черным цветом (окраска Суданом черным) окрашивались только МНГК, структурной основой которых являются нанолипосомы.

Было установлено, что МНГК активно адгезируются на всех МФ, о чем свидетельствовало большое количество окрашенных НЛ на поверхности МФ.

Было выявлено, что через 5 минут после внесения нанолипосом в культуры перитонеальных клеток индексы адгезивной способности МНГК (отражающие количество нанолипосом, адгезированных на поверхности клеток), включающих БЖ-35, были больше по величине, чем у МНГК, включающих [)Х1-60. При этом наиболее выраженные различия в адгезивной способности НЛ (эта активность определяется взаимодействием мембран НЛ с клеточной мембраной МФ) выявлены при ее оценке через 1 минуту после внесения МНГК в клеточные культуры (Рис. 1).

1200

охг-зз охг-ео

Виды декстразидов, заключенных в нанолипосомы

Рис. 1. Адгезивная способность МНГК с размером нанолипосом 200-450 нм с 0^-35 и ОХ/-60 в отношении перитонеальных МФ.

Вероятно, это детерминировано физико-химическими взаимодействиями наружной мембраны НЛ, и интегрированными в её состав ОХ2, с клеточными стенками, что косвенно подтверждается различиями в адгезивной способности НЛ с Т)Х£ различной М.м., включенными в их состав.

Оценка влияния МНГК, содержащих декстразиды, на процесс фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах, в зависимости от молекулярной массы декстрановых матриц.

Учитывали МФ с количеством фаголизосом >5 для оценки доли (%) МФ, обладающих относительно высоким уровнем фагосомно-лизосомного слияния, так как единичные фаголизосомы были выявлены в большинстве МФ контрольной группы (в качестве объекта фагоцитоза использовали гранулы зимозана).

В большей степени стимуляция процесса фагосомно-лизосомного слияния проявилась при воздействии МНГК с ОХЁ-бО. Это выразилось в увеличении доли МФ с относительно высоким уровнем фагосомно-лизосомного слияния (рис. 2).

Р - вероятность достоверности различий между средними величинами исследованных показателей в опыте (внесение МНГК) и контроле (внесение буферного раствора): *Р<0,05; **Р<0,01.

* 9 л 5

§■ о 8 £ и

5 ° ^ 7

* * - с ш с; ю ь - о

о I- н 5

о те ф ° v- -е. га ,

« 3 А

f S з ,

2 ь m J

3" ° ® я 11 = к 5

g ° О

et DXZ-35 DXZ-60 Контроль

Виды декстразидов, заключенных в нанолипосомы

Рис. 2. Количество макрофагов с относительно высоким уровнем фагосомно-

лизосомного слияния при воздействии МНГК (HJI размерами 200-450 нм) с декстразидом-35 и декегразидом-60 (в конечном разведении образцов 1:300) на процесс фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах (М±ш). Аналогичные результаты были получены при оценке среднего числа фаголизосом в МФ, отнесенных к фагоцитам с относительно высоким уровнем фагосомно-лизосомного слияния (как показатель активности этого процесса в «отдельных» макрофагах) (Рис. 3).

1 1

о й Е

g I х

11 ?

2 о 8

S s 5

w л с

О О о

5 u г

* s £

у п О

«1 ¡5 о

* f ¡5 Ja«

_ 16

$ 14

5 12

те

f 10

**_Т_

it - -

Р - вероятность

достоверности различий между средними величинами

исследованных показателей в опыте (внесение МНГК) и контроле (внесение буферного раствора): **Р<0,01.

° s DXZ/-35 DXZ-60 Контрол

Виды декстразидов, заключенных в нанолипосомы

Рис. 3. Условный показатель уровня фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах при воздействии МНГК (НЛ размерами 200-450 нм) с декстразидом-35 и декстразидом-60 (в конечном разведении образцов 1:300) на уровень фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах (М±ш). В большей степени процесс фагосомно-лизосомного слияния стимулировали МНГК, содержащие DXZ-60. Это выразилось в увеличении

количества фаголизосом в МФ (учитывали МФ, в которых количество выявленных фаголизосом было не менее 5).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что МНГК с НЛ 200-450 нм, содержащие DXZ-35 и DXZ-60, активируют процесс фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах при использовании в качестве объектов фагоцитоза гранул зимозана. К наиболее оптимальным по эффекту стимуляции отнесены МНГК, содержащие DXZ-60.

Оценка свойств биоактивности МНГК, содержащих декстразиды в зависимости от М.м. декстрановых матриц.

Для оценки биоактивных свойств были выбраны МНГК с размером 200450 нм. В качестве показателей активации МФ были выбраны уровни экспрессии следующих маркеров: кластера дифференцировки CD25 (выполняющего функции рецептора к IL-2), как активационного маркера МФ, принимающего участие в регуляции иммунного ответа; GM-CSF, продуцируемого активированными МФ и способствующего росту и дифференцировке полипотентных гемопоэтических клеток-предшественников гранулоцитов и МФ; Вс1-2, антиапоптотического внутриклеточного белка-регулятора.

Анализ эффектов исследуемых МНГК показал увеличение экспрессии CD25 на мембранах МФ при воздействии МНГК с DXZ-35 и DXZ-60, а также PolyI:PolyC (активатор МФ) относительно соответствующего показателя в контроле (рис.4).

S3 - МНГК с DXZ-35 И - МНГК с DXZ-60 □ - Контроль (интактная культура)

«положительный контроль» (Ро1уГ.Ро1уС)

Примечание; Вероятность достоверности различий Р между средними величинами показателей экспрессии CD25 в контроле (интактная культура) и в опыте (культивирование с МНГК, PolyI:PolyC): **Р<0,01. Вероятность достоверности различий Р между средними величинами показателей при воздействии МНГК с декстразидом-ЗЗ и декстразидом-60: ##Р<0,01.

Рис. 4. Количество макрофагов, экспрессирующих CD25, при воздействии МНГК (находящихся в наноразмерном диапазоне 200-450 нм) с декстразидом-35 и декстразидом-60 (М±т).

Наибольшую экспрессию CD25 индуцировали МНГК с DXZ-60 по сравнению с МНГК, содержащими DXZ-35. Внесение в среду для культивирования PolyI:PolyC в конечной концентрации 25 мкг/мл (рассматривался как «положительный» контроль с точки зрения ожидаемого эффекта активации макрофагов в ответ на указанный стимул) не изменило доли МФ, экспрессирующих CD25, по сравнению контрольной группой.

При оценке уровня экспрессии кластера дифференцировки СП25 на мембранах отдельных МФ был отмечен активационный эффект Ро1у1:Ро1уС -повышение экспрессии С025 в 2 раза относительно контроля (рис. 5).

» л 25

гч -о-

Q й

О §■ s 2 2

X 2

о 5

ф О .. с

Q. I 1.5

С X

о я ü о г> О ,

0 о- 1 г s

dl m и s

1 £ 0.5

Л я ш

ЕЯ - мнгксохг-35 ЕЗ - мнтк с -гаг-во

[П - Контроль (интактная культура) Щ "«положительный контроль»(Ро1у1:Ро1уС)

Примечание; Вероятность

достоверности различий Р между средними величинами индекса экспрессии СШ5 в контроле (интактная культура) и в опыте (культивирование с МНГК или Ро1у1:Ро1уС): **Р<0,01.

Рис, 5. Уровни экспрессии CD25 в активированных макрофагах при воздействии МНГК (находящихся в наноразмерном диапазоне 200-450 нм) с декстразидом-35 и декстразидом-60 (М±ш).

Аналогичное повышение активности отмечено при оценке МНГК, содержащих DXZ-60. Культивирование МФ с МНГК, содержащими DXZ-35, не изменяло уровня экспрессии CD25 на мембранах МФ (рис 6).

Таким образом, по результатам оценки количества МФ, экспрессирующих кластер дифференцировки CD25, и экспрессии активационного маркера CD25 на мембранах отдельных МФ, наиболее выраженная активация МФ наблюдается при воздействии на клетки МНГК, содержащих DXZ-60.

Внесение в культуру леритонеальных клеток МНГК, содержащих DXZ-35 и DXZ-60, значительно увеличило долю МФ, экспрессирующих GM-CSF по сравнению контрольной группой и культурами, в которые вносили PolyP.PoiyC. При воздействии МНГК с DXZ-35 доля МФ, продуцирующих GM-CSF, возросла в 26,1 раз относительно показателя контрольных культур. А внесение в культуральную среду МНГК с DXZ-60 увеличило продукцию GM-CSF более чем в 30 раз в сравнении с показателями контрольной культуры и оказалось выше количества продуцирующих GM-CSF МФ, инкубированных с PolyI:PolyC и с МНГК, содержащих DX2-35. (рис. 6).

И - МНГК с ОХ7-35 И - мнгксохг-бо

П - Контроль (интактная культура) (рд "«положительный кошроль»(Ро1у1:Ро1уС)

Примечание: вероятность

достоверности различий Р между средними величинами исследованных показателей в контроле (интактная культура) и в опыте (культивирование с МНГК или Ро1у1:Ро1уС): *Р<0,05, **Р<0,01.

Рис. 6. Количество макрофагов, продуцирующих GM-CSF, при воздействии МНГК (находящихся в наноразмерном диапазоне 200-450 нм) с декстразидом-35 и декстразидом-60 (М±ш).

Культивирование с Polyl.PolyC стимулировало продукцию GM-CSF в меньшем количестве МФ - их доля в 5 раз меньше по сравнению с числом МФ, инкубированных МНГК, содержащих DXZ-35 (составила в среднем 6,6%). При дополнительной оценке уровней экспрессии GM-CSF в отдельных МФ было отмечено, что внесение в культуральную среду как PolyI:PolyC, так и МНГК, содержащих DXZ, достоверно повышает величину продукции GM-CSF (рис. 7).

К - МНГК с 0X2-35

Ш - мнгксохг-бо

Г~1 - Контроль (интактная культура) ¡рц "«положительный контроль»{Ро1у1:Ро1уС)

Примечание. Вероятность достоверности различий Р между средними величинами исследованных показателей в контроле (интактная культура) и в опыте (культивирование с МНГК, Ро1у1:Ро1уС): **Р<0,01. Вероятность достоверности различий Р между средними величинами исследованных показателей при воздействии МНГК, содержащих декстразид-35 идекстразид-60: #Р<0,05; №<0,01.

Рис. 7. Уровни продукции GM-CSF в активированных макрофагах при воздействии МНГК (находящихся в наноразмерном диапазоне 200-450 нм) с декстразидом-35 и декстразидом-60 (М±т). При сравнении влияния DXZ-35 и DXZ-60 в составе МНГК на МФ наиболее выраженный активационный эффект наблюдался при воздействии МНГК с DXZ-60. Также более высокий уровень продукции GM-CSF в МФ

наблюдался при воздействии ОХХ-6() в составе МНГК в сравнении с показателями активации группы «положительного» контроля с Ро1у1:Ро1уС.

Таким образом, по результатам оценки продукции СМ-СБК в МФ наиболее выраженный эффект активации МФ наблюдался при воздействии на клетки МНГК, содержащих 0X2-60.

При ИЦХ-анализе способности МФ продуцировать антиапоптотический белок Вс]-2 в контроле было установлено, что 95% МФ в той или иной степени продуцируют указанный антиапоптогенный фактор. При оценке уровня продукции Вс1-2 в отдельных МФ, отмечено возрастание величины, отражающей количество продуцируемого Вс1-2, при внесении в культуральную среду МНГК с 0X2-35 и 0X2-60 (рис. 8).

К - мнгкссхг-35 И - мнгксохг-бо

□ - Контроль (интактная культура) [д "«положительный кошроль»(Ро1у1:Ро1уС)

Вероятность достоверности

различий Р между средними величинами исследованных показателей в контроле (интактная культура) и в опыте (культивирование с МНГК или Ро1уГ.Ро1уС):**Р<0,01.

Рис. 8. Уровни экспрессии белка Вс1-2 в макрофагах при воздействии МНГК (находящихся в наноразмерном диапазоне 200-450 нм) с декстразидом-35 и декстразидом-60 (М±т).

При этом наибольшее увеличение уровня продукции Вс]-2 отмечено при воздействии МНГК с DXZ-60. Менее выраженное возрастание уровня продукции Вс1-2 в «Bcl-2-положительных» МФ выявлено при внесении в культуральную среду МНГК, содержащих DXZ-35. Аналогичная по величине активация МФ в отношении исследуемого показателя выявлена при внесении в культуральную среду PoIyI:PolyC.

Таким образом, по результатам всех оценок влияния исследуемых форм МНГК (в размерном диапазоне НЛ 200-450 нм) на перитонеальные МФ наибольший эффект активации МФ был отмечен при воздействии МНГК, содержащих DXZ-60.

ВЫВОДЫ

1. Окисленные декстраны (декетраналь-35 и декстраналь-60) обладают свойством биосовместимости: не снижают жизнеспособность перитонеальных клеток в культуре и адгезивную активность перитонеальных макрофагов.

2. Высокой биосовместимостью обладают молекулярно-наносомальные гибридные композиции с диаметром нанолипосом 150-200 нм, содержащие декстраналь-60, и с диаметром нанолипосом 450-800 нм, содержащие декстраналь-35 и декстраналь-60.

3. Высокой биосовместимостью обладают молекулярно-наносомальные гибридные композиции с диаметром нанолипосом 150-200 нм, содержащие декстразид-35 и декстразид-60, с диаметром нанолипосом 200-450 нм, содержащие декстразид-35 и декстразид-60, и с диаметром нанолипосом 450800 нм, содержащие декстразид-35.

4. Высокой биотропностью по показателям фагоцитозной активности в отношении нанолипосомальных композиций обладают молекулярно-наносомальные гибридные композиции с диаметром нанолипосом 150-450 нм, содержащие декстразид-35 и декстразид-60.

5. Нанолипосомы, входящие в состав молекулярно-наносомальных гибридных композиций в размерном диапазоне 200-450 нм с декстразидом-35 обладают более высокой адгезивной активностью в отношении перитонеальных макрофагов по сравнению с нанолипосомами, содержащими декстразид-60.

6. Молекулярно-наносомальные гибридные композиции, содержащие декстразид-60, обладают более высокой биостимулирующей активностью в отношении макрофагов по сравнению композициями, содержащими декстразид-35, по показателям фагосомно-лизосомного слияния в отношении тестируемого корпускулярного агента - гранул зимозана.

7. Молекулярно-наносомальные гибридные композиции в размерном диапазоне 200-450 нм с декстразидами обладают биостимулирующими свойствами в отношении фагоцитирующих клеток по показателям продукции макрофагами колониестимулирующего фактора GM-CSF и антиапоптотического белка Вс1-2, экспрессии кластера дифференцировки CD25 на мембранах макрофагов. Молекулярно-наносомальные гибридные композиции, содержащие декстразид-60, обладают более высокой биостимулирующей активностью в отношении макрофагов по сравнению композициями, содержащими декстразид-35.

Рекомендации по практическому применению.

Результаты работы могут быть использованы при разработке научных основ технологии получения принципиально новых наносомальных композиций оптимальной формы и размеров с контролируемым сродством к биологическим структурам.

Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий и семинаров на кафедрах патологической анатомии, цитологии, гистологии и патологической физиологии.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Зайковская, М.В. Влияние окисленных декстранов на перитонеальные клетки in vitro. В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, А.В.Троицкий, Н.Г. Лузгина, М.В. Зайковская, Т.Н. Гуляева, Е.Г. Уфимцева, Д.А. Ильин, Е.С. Ахраменко //

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Приложение № 1. -С. 120-122.

2. Зайковская, М.В. Сравнительная оценка влияния нанолипосом с окисленными декстранами на перитонеальные клетки in vitro. В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, А.В.Троицкий, Н.Г. Лузгана, М.В. Зайковская, Т.Н. Гуляева, Е.Г. Уфимцева, Д.А. Ильин, Е.С. Ахраменко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Приложение № 1 - С. 123 - 126.

3. Зайковская, М.В. Эффекты молекулярно-наносомальных гибридных композиций с окисленными декстранами, конъюгированными с гидразвдом изоникотиновой кислоты, на перитонеальные макрофаги in vitro. В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, В.О. Ткачев, A.B. Троицкий, Н.Г. Лузгана, М.В. Зайковская, Е.П. Гуляева, Т.Н. Быстрова, Е.Г. Уфимцева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -№11.- 2008. - С. 563 - 566.

4. Зайковская, М.В. Оценка влияния нанолипосом с различными физико-химическими характеристиками, содержащих окисленные декстраны, на некоторые параметры их биосовместимости и биотропности в культурах перитонеальных клеток in vitro / В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, A.B. Троицкий, Н.Г. Лузгана, М.В. Зайковская, Т.Н. Гуляева, Е.Г. Уфимцева, Д.А. Ильин, Е.С. Ахраменко. Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 55-летию ЧГМА. -1-2 окт. 2008 г.: Мат. конф. - Чита: ИМЦ ЧГМА. - 2008. - С. 230 - 231.

5. Зайковская, М.В. Сравнительная оценка влияния декстранов с различной молекулярной массой, окисленных химическим и радиационно-химическим методами, на перитонеальные клетки in vitro / В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, A.B. Троицкий, Н.Г. Лузгана, М.В. Зайковская, Т.Н. Гуляева, Т.Н. Быстрова, Е.Г. Уфимцева, Д.А. Ильин, Е.С. Ахраменко. Успехи современного естествознания. -№8. -2008. -С. 109.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БАВ - биологически активное вещество

ГИНК - гвдразид изоникотиновой кислоты

ИФ - индекс фагоцитоза

ИЦХ - иммуноцигохимия

М.м. - молекулярная масса

МФ.- макрофаги

МНГК - молекулярно-наносомальная гибридная композиция НЛ - нанолипосомы

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор DAB - диаминобензидин

DX - химически окисленный декстран (декстраналь)

DXZ - химически окисленный декстран, коньюгированный с ГИНК (декстразид) Poly I :Ро1у С - полиинозин - полицитидиловая кислота

Соискатель

Зайковскяя Мария Влядимировня

Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 12.11.2008. Заказ № 104. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайковская, Мария Владимировна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.1. Проблема разработки новых средств адресной доставки биологически активных веществ и лекарственных препаратов в органы-и клетки-мишени.

1.1.2. Перспективы применения лекарственных препаратов адресной доставки для лечения заболеваний с внутриклеточной персистенцией возбудителя.

1.2 Л. Современные средства адресной доставки биологически активных веществ и лекарственных препаратов.

1.2.2. Применение нанотехнологий для разработки лекарственных средств направленного адресного действия.

1.3. Полимерные системы как матричный субстрат для иммобилизации биологически активных веществ, предназначенных для направленной доставки в клетки и клеточные системы.

1.3.1. Свойства полимерных систем, используемых в конструировании композиций для направленного транспорта биологически активных веществ.

1.3.2. Биологические эффекты полимерных систем.

1.3.3. Искусственные и природные полимерные системы в конструировании композиций для направленного транспорта биологически активных веществ.

1.3.3.1. Бактериальные полисахариды как перспективные матрицы для иммобилизации лекарственных веществ.

1.3.3.2. Активационные свойства бактериальных полисахаридов.

1.3.3.3. Декстраны как перспективные полисахаридные матрицы для иммобилизации лекарственных веществ.

1.3.4. Новые формы лекарственных препаратов, полученных с применением технологий иммобилизации на полимерах.

1.4. Проблемы и перспективы разработки носителей лекарственных препаратов и биологически активных веществ направленного транспорта в клетки системы мононуклеарных фагоцитов. Особенности системы мононуклеарных фагоцитов как акцептора лекарственных средств адресного действия.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методы получения и культивирования перитонеальных клеток.

2.2. Методики получения окисленных декстранов и молекулярно-наносомальных гибридных композиций.

2.3. Методы исследования структурно-размерных параметров нанолипосом.

2.4. Методы изучения биологических свойств молекулярно-нано-сомальных гибридных композиций и их компонентов.

2.4.1 Молекулярно-наносомальные гибридные композиции и их компоненты.

2.4.2 Методы оценки степени биосовместимости молекулярно-наносомальных гибридных композиций и их компонентов.

2.4.3 Методы оценки параметров, характеризующих биотропность молекулярно-наносомальных гибридных композиций.

2.4.3.1. Методы оценки адгезивной способности молекулярно-нано-сомальных гибридных композиций в отношении мембран макрофагов.

2.4.3.2. Методы оценки фагоцитозной активности макрофагов в отношении молекулярно-наносомальных гибридных композиций. <

2.4.4. Методы оценки биоактивных свойств молекулярно-наносомальных гибридных композиций.

2.4.4.1. Метод оценки влияния молекулярно-наносомальных гибридных композиций на процесс фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах.

2.4.4.2. Иммуноцитохимические методы выявления внутриклеточной продукции фактора вМ-СБР, антиапоптотического белка Вс1-2 и экспрессии кластера дифференцировки С025 на мембранах макрофагов.

2.5. Методы статистической обработки.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Результаты исследований структурно-размерных параметров нано липосом.

3.2. Результаты исследований биологических свойств молекулярно-наносомальных гибридных композиций и их компонентов. л

3.2.1.Оценка свойств биосовместимости молекулярно-наносомальных гибридных композиций и их компонентов.

3.2.1.1. Изучение свойств биосовместимости компонентов молекулярно-наносомальных гибридных композиций.

3.2.1.2. Изучение свойств биосовместимости молекулярно-наносомальных гибридных композиций, содержащих окисленные декстраны (декстранали) с молекулярной массой 35 и 60 кДа, находящихся в различных наноразмерных диапазонах.

3.2.1.3. Изучение свойств биосовместимости молекулярно-наносомальных гибридных композиций, содержащих конъюгаты окисленных декстранов с молекулярной массой 35 и 60 кДа с гидразидом изоникотиновой кислоты (декстразиды), в нанолипосомах различного размера. /

3.3.2. Результаты оценки свойств биотропности молекулярно-наносомальных гибридных композиций и их компонентов.

3.3.2.1. Оценка адгезивной способности нанолипосом, входящих в состав молекулярно-наносомальных гибридных композиций, содержащих окисленные декстраны с М.м. 35 и 60 кДа, конъюгированные с гидразидом изоникотиновой кислоты (декстразиды), в отношении мембран макрофагов.

3.3.2.2. Оценка фагоцитозной активности макрофагов в отношении нанолипосом молекулярно-наносомальных гибридных композиций, содержащих окисленные декстраны, конъюгированные с гидразидом изоникотиновой кислоты.

3.3.3. Оценка свойств биоактивности молекулярно-наносомальных гибридных композиций, содержащих окисленные декстраны с различной молекулярной массой, конъюгированные с гидразидом изоникотиновой кислоты.

3.3.3.1. Оценка влияния молекулярно-наносомальных гибридных композиций, содержащих окисленные декстраны, конъюгированные с гидразидом изоникотиновой кислоты, на процесс фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах, в зависимости от молекулярной массы окисленных декстранов.

3.3.3.2. Оценка свойств биоактивности молекулярно-наносомальных гибридных композиций, содержащих окисленные декстраны, конъюгированные с гидразидом изоникотиновой кислоты, с молекулярной массой декстрановых матриц 35 и 60 кДа.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с биологически активными субстанциями на фагоцитирующие клетки in vitro"

Актуальность темы. Тема работы посвящена актуальной проблеме -разработке и изучению новых молекулярно-наносомальных гибридных композиций в качестве эффективных средств направленной доставки биологически активных веществ и лекарственных средств, обладающих высокой собственной биологической активностью. В настоящее время к одному из перспективных направлений разработки и создания новых лекарственных форм относят синтез композиций адресного действия с заданными фармакокинетическими свойствами и гармоничным содержанием в них субстанций, не только не оказывающих побочных действий, но и обладающих биоактивными свойствами, повышающими их эффективность (Шкурупий В.А. и др. 2000, 2007; Dutt М., Khuller et al., 2001; Fenske D.B. et al., 2008). Такие терапевтические лекарственные системы направленной доставки лекарственных веществ к клетке или органу как наноразмерные носители являются перспективным лечебным средством нового поколения (Матвиенко П.В., 2004; Кузякова Л.М., 2005; Nie S. et al., 2006). Конструирование эффективных лекарственных средств предполагает необходимость не только разработки, но и изучения наноразмерных композиционных материалов, гибридных наноразмерных композиций, обладающих высокой биосовместимостыо, биотропностью, заданной биологической активностью, а также средств и способов их доставки, контроля адресности и регистрации производимых биологических эффектов.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние окисленных декстранов с молекулярной массой 35 кДа и 60 кДа (декстраналя-35 и декстраналя-60) и их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты (декстразида-35 и декстразида-60) на показатели жизнеспособности перитонеальных клеток, показатели адгезивной активности перитонеальных макрофагов и плотность клеточного монослоя перитонеальных клеток для оценки их свойств биосовместимости.

2. Исследовать влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций на изменение показателей жизнеспособности перитонеальных клеток, показателей адгезивной активности перитонеальных макрофагов и плотности клеточного монослоя перитонеальных клеток в зависимости от вариантов физико-химических параметров молекулярно-наносомальных гибридных композиций, определяемых размерами нанолипосом (в диапазоне 150-800 нм) и молекулярной массой входящих в их состав окисленных декстранов (35 кДа и 60 кДа) и их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты, для оценки их свойств биосовместимости.

3. Изучить влияние физико-химических параметров молекулярно-наносомальных гибридных композиций, задаваемых размерами нанолипосом (в диапазоне размеров 150-800 нм) и молекулярной массой входящих в их состав окисленных декстранов (35 кДа и 60 кДа), а также их конъюгатов с гидразидом изоникотиновой кислоты, на изменение показателей фагоцитозной активности макрофагов для оценки свойств их биотропности по доле макрофагов, фагоцитирующих нанолипосомальные композиции, и интегрального показателя количества нанолипосомальных композиций, поглощаемых отдельными макрофагами.

6. Изучить влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с размером 200-450 нм, содержащими окисленные декстраны с молекулярной массы 35 кДа и 60 к Да, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты, на показатели продукции макрофагами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р) и антиапоптотического белка Вс1-2, экспрессии кластера дифференцировки СЭ25 на мембранах макрофагов, в качестве маркеров активации макрофагов, для оценки их биостимулирующих свойств.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное изучение свойств, характеризующих биосовместимость, биотропность и биологическую активность новых молекулярно-наносомальных гибридных композиций липосомальной формы, полученных на основе окисленных декстранов, в зависимости от физико-химических параметров композиций для разработки средств адресной доставки биологически активных веществ и лекарственных средств.

Впервые при комплексном анализе полученных результатов установлено, что к наиболее оптимальной форме молекулярно-наносомальных гибридных композиций (в качестве средства адресной доставки биологически активных веществ в клетки системы мононуклеарных фагоцитов на примере гидразида изоникотиновой кислоты - противотуберкулезного препарата), следует отнести композиции с размерами нанолипосом 200-450 нм на матрице-носителе - окисленном декстране с молекулярной массой 60 кДа - по параметрам биосовместимости, биотропности и высокой биостимулирующей активности в отношении макрофагов.

Научно-практическая значимость работы.

Исследование выполнено в рамках гранта Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 — 2012 годы" в соответствии с государственным контрактом № 02.513.11.3183 от «23» апреля 2007 года «Разработать технологию конструирования молекулярно-наносомальных гибридных биосовместимых композиций для адресной доставки биологически активных веществ в клетки и клеточные системы».

Основные положения, выносимые на защиту.

4. Молекулярно-наносомальные гибридные композиции с размерами нанолипосом 200-450 нм, включающие окисленные декстраны или их конъюгаты с гидразидом изоникотиновой кислоты, обладают биостимулирующими свойствами в отношении клеток системы мононуклеарных фагоцитов: стимулируют процесс фагосомно-лизосомного слияния, продукцию гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора ОМ-СББ и внутриклеточного антиапоптотического белка Вс1-2, повышают экспрессию кластера дифференцировки СБ25 на мембранах макрофагов.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Зайковская, Мария Владимировна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенного исследования установлена взаимосвязь физико-химических параметров разрабатываемых МНГК со свойствами их биосовместимости, биотропности и биостимуляции при оценке некоторых параметров, характеризующих изменение их функциональной активности. В перспективе, результаты исследования могут быть использованы при планомерном, целенаправленном создании средств направленной доставки биологически активных веществ и лекарственных препаратов в клетки-мишени, а также при разработке новых фармацевтических препаратов, иммуномодуляторов и биологически активных добавок с заданными биологическими свойствами. Результаты работы могут послужить научно-практической основой для дальнейшего поиска новых форм биорегуляционных и лекарственных воздействий на организм не только при развитии в организме патологических процессов, но и при некоторых функциональных нарушениях.

113

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайковская, Мария Владимировна, Томск

1. Архипов С. А. Эпителиоидная клетка. Новая концепция происхождения и дифференцировки.- Новосибирск. Наука. - 1997. - 83 с.

2. Архипов С.А. Роль активации макрофагов и их взаимодействия с лимфоцитами в механизмах индукции эпителиоидно-клеточного формообразования in vitro // Бюллетень СО РАМН.- 2000.- № 3-4.- С. 123-127.

3. Афанасьев Ю.И., Юрина H.A., Котовский Е.Ф. Гистология, цитология и эмбриология. 1989. - 274 с.

4. Басел A.A., Петров В.Е., Балабаньян В.Ю., Гельперина С.Э. Транспорт прозерина в головной мозг при помощи поли(бутил)-цианоакрилатных наночастиц, покрытых полисорбатом-80 // Росс. Мед. Журн. 2006.- №1. - С. 28-33.

5. Березин И.В., Клесов A.A., Швядас В.К. Инженерная энзимология.- М.: Высшая школа. 1987. - 143 с.

6. Быков B.JI. Цитология и общая гистология.- С.Пб.: Сотис. -2001. 526 с.

7. Валуев И.Л., Сытов Г.А., Валуев Л.И., Валуева Т.А., Ульянова М.В., Платэ H.A. Ингибиторы протеолитических ферментов в терапии сахарного диабета // Вопросы медицинской химии.- 2001.- Т. 47. № 1.-С. 132-139.

8. Валуев Л.И., Валуева Т.А., Валуев И.Л., Платэ H.A. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных соединений // Успехи биологической химии. 2003. - Т. 43. - С. 307-328.

9. Валуев Л.И., Зефирова О.Н., Обыденнова И.В., Платэ H.A. Водорастворимые полимеры с нижней критической температурой смешения для направленного транспорта лекарственных препаратов и других веществ //Высокомол. соед.- 1993.- Т. 35. №1.- С. 83-86.

10. Васильев А.Е. Химия и технология высокомолекулярных соединений // Итоги науки и техники. 1981. - Т. 16. - С. 113-119.

11. Вилсон Э. Культура животных клеток. Методы. Пер. с англ. под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир. - 1989. - 333с.

12. Вирник А.Д., Хомяков К.П., Скокова И.Ф. Декстран и его производные // Успехи химии. 1975. - Т. 44. - № 7. - С. 1280-1307.

13. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии с атласом микрофотограмм.- Томск: Изд-во Том. ун-та. 1989.- 468 с.

14. Гюнтер Е.А. Полисахариды из каллусной культуры Lemna ininir L // Химия растительного сырья. 2001. - № 2. - С. 63 - 67.

15. Дедов И.И., Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Современные аспекты трансплантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете // III всероссийский диабетологический конгресс. 2004.- С. 101.

16. Ефимов A.C., Бездробный Ю.В. Структура и функции инсулиновых рецепторов.- Киев.: Наукова думка.- 1987. С. 104.

17. Каплун А.П., Jle Банг Ш., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы медицинской химии. 1999. - № 1. - С. 16-21.

18. Kapp Ян. Макрофаги: ультраструктура и функции.// М.- 1978. -188 с.

19. Козинер В.Б., Федоров H.A. Механизм действия полиглюкина // М: Медицина. 1974.- С. 190-197.

20. Конки Д., Эрба Э., Фрешни Р., Гриффите Б., Хэй., Ластнитски И., Мауэр Г., Мораска Л., Вилсон Э. Культура животных клеток. Методы.- Пер. с англ. под ред. Р. Фрешни.- М.: Мир.- 1989. 333с.

21. Короленко Т.А. Биохимические аспекты лизосомотропизма.-Новосибирск: Наука. 1983. - 117с.

22. Кропачев В.А., Маркелоза Т.Н., Трухманова Л.В. Сополимеризация кротоновых производных гидразида изоникотиновой кислоты с винилпирролидоном // Высокомолекулярные соединения. -1970. Т. 112. - № 5. - С. 1091-1096.

23. Кузнецов Р.Л. Химиотерапия в противомалярийных программах // Хроника ВОЗ. 1979. - Т. 33. - № 5. - С. 230-233.

24. Кузякова Л.М. Конструирование транедермальных липосомальных препаратов с заданными свойствами // Вестн. моек, ун-та: химия. 2005. - № 1. - Т. 46. - С. 74 - 79.

25. Кулаков В.Н., Пименова Г.Н., Матвеев З.А. Фармако-кинетическое изучение лекарственных полимеров. Модели на основе декстрана // Хим. фарм. журн. 1985. - Т. 19. - № 4. - С. 407-412.

26. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. Вузов // М.: Высш. Шк. 1990. - 352 с.

27. Лепахин В.К., Белоусов Ю.Б., Моисеев В.Ф. Клиническая фармакология с международной номенклатурой лекарств.- М.: Ун-т дружбы народов. 1988. - 431 с.

28. Лозовик Ю.В., Попов A.M. Образование и рост углеродных наноструктур фуллеренов, наночастиц, нанотрубок и конусов // Усп. Физ. Наук. - 1997. - Т. 167. - № 7.- 151 с.

29. Матвиенко П.В. Липосомы — «скафандры» для лекарств.// Провизор. 2004. - № 15. - 20-24 с.

30. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Руководство.- М.: Медицина. 1993. - 144 с.

31. Маянский Д.Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов.- Новосибирск: Наука. 1981. - 169с.

32. Маянский Д.Н., Виссе Э., Декер К. Новые рубежи гепатологии. Новосибирск. - 1992. - 264с.

33. Мехтиханов М.С., Краснопольский Ю.М., Давиденко В.Б. Экспериментальное изучение эффективности и токсичности липосомальных форм антибиотиков // Эксп. клин, медицина. 2002. - № 2. - С. 22-24.

34. Министерство Здравоохранения СССР: Приказ от 12 августа 1977 г. № 755 о мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных

35. Наджимутдинов Ш., Содиков Э.С., Казаков К.С., Гошина Г.И., Каримджанова Х.К., Нурмухамедов Ш., Алимов Ш.А. Синтетические полимеры медицинского назначения.- Ташкент: Фан. 1973. - 26 с.

36. Неженцев М.В., Данилов А.Р. Основные фармакологические свойства биоактивных полимеров // Новые биологические активные полимеры и иммобилизованные ими стероиды (Сб. науч. тр.). 1988. - С. 4-7.

37. Ничитайло М.Е., Медвецкий Е.Б. Принципы антибиотико-профилактики и антибактериальной терапии при панкреонекрозе // Острые и неотложные состояния в практике врача. 2006. - № 5. - С. 1214.

38. Новицкий В.В., Козлов Ю.А., Лаврова B.C., Шевцова Н.М. Гемопоэз, гормоны, эволюция.-Новосибирск: Наука, Сиб. пр. Ран. -1997. 432 с.

39. Панин JI.E., Маянская H.H. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении.- Новосибирск: Наука. 1987. - 197 с.

40. Персина И.С. Клетки Лангерганса — структура, функция, роль в патологии // Арх. патол. 1985. - Т. 47. - № 2. - С.86.

41. Платэ H.A., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры // М.: Химия. 1986. - С. 13-128.

42. Покровский A.A., Тутельян В.А. Лизосомы.- М.: Наука. 1976. -382 с.

43. Пригожий Е.А., Парлагашвили Ю.Ю. Структурные изменения некоторых внутренних органов при лечении геморрагического шока реополиглюкином // Сб. научн. Трудов "Механизмы патологических процессов ". Ташкент. - 1984. - С. 67-69.

44. Рабинович И.М. Применение полимеров в медицине // М.-Л.: Медицина, 1972. 197 с.

45. Ройт А., Бростофф Дж. Иммунология. 2000. - 186 с.

46. Российский электронный журнал (нанотехнологии и их применение) Нанобиотехнологии за рубежом: взгляд экспертов. 2008. -№ 8.

47. Селиванов Е.В. Красители в биологии и медицине: Справочник.- Барнаул: Азбука. 2003. - 40 с.

48. Сергеев П.В. Системы "узнавания" лекарственных веществ: Актовая речь.- М. Рос. мед. ун-т. 1993. - 24-35с.

49. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов // Антибиотики и химиотерапия.- 1998. -№ 2.- 20-23 с.

50. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - № 4. - С. 39-43.

51. Торчилин В.П., Рейзер И.Л., Смирнов В.Н., Чазов Е.И. Иммобилизация ферментов на биосовместимых носителях // Биоорганическая химия. -1976. Т. 2.-№ 9.-С. 1252-1257.

52. Угрюмов М.В., Ермаков А.С., Попов А.П., Жданов Р.И. Генная и генно-клеточная терапия и нейродегенеративные заболевания // Вопросы медицинской химии. 2000.- № 3. - С. 21-23.

53. Усов А.И. Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатированных полисахаридов красных водорослей // Журнал Химия растительного сырья. 2001. - № 2. - С. 7-20.

54. Ушаков С.М. Полимерные лекарственные средства // Медицинская промышленность СССР. 1963. - № 8. - С. 5-13.

55. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты: Руководство для врачей.- СПб.: НТФФ "Полисан". 1998. - 113 с.

56. Харкевич Д.А. Фармакология.- М.: Медицина. 1993. - 140 с.

57. Хоменко А.Г. Химиотерапия туберкулеза легких.- М: Медицина. 1980. - 60 с.

58. Шкурупий В.А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адреная терапия // М.: Издательство РАМН. 2007. — 536 с.

59. Шкурупий В. А., Коржуков Г.П., Белов Г.Ф. Экспериментально-клиническое исследование эффектов введения реополиглюкина на печень животных и людей, больных вирусными гепатитами // Бюлл. СО АМН СССР. 1989. - № 5. - С. 56-58.

60. Шкурупий В. А., Курунов Ю.Н., Яковченко H.H. Лизосомотропизм проблемы клеточной физиологии и медицины.-Новосибирск: НГМА. - 1999. - с.289.

61. Шкурупий В.А., Ауслендер В.Л., Троицкий A.B. Изодекс -новое противотуберкулезное средство: современные проблемы науки (Материалы научной сессии 25-26 ноября) // Новосибирск. 2004. - С. 127-134.

62. Шкурупий В.А. Структурные преобразования в гепатоцитах при введении мышам реополиглюкина и последующем воздействии стресса // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1988. - № 5. - С. 613616.

63. Шкурупий В.А. Избирательное накопление реополиглюкина и латекса в клетках печени и характер ответа ее паренхимы на острое отравление CCL-4 // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1986. - № 9. - С. 362-365.

64. Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Яковченко H.H., Троицкий A.B., Архипов С.А., Козяев М.А., Пупышев А.Б., Филимонов П.Н., Чернова Т.Г. Цитофизиологические аспекты адресной терапии туберкулеза // Бюлл. СО РАМН. 2000. - С. 62-67.

65. Шкурупий В.А., Курунов Ю.Н., Архипов С.А. Антибактериальная эффективность пролонгированной лекарственной формы изониазида в эксперименте // Пробл. туберкулеза. 1997. - С. 5456.

66. Abashev I.M., Kozlova A.I., Ivanova L.N. Results of treatment in patients with destructive pulmonary tuberculosis without consideration of drug sensitivity in Mycobacterium tuberculosis // Probl. Tuberk. Bolezn. Legk. -2008.-V. 1.-P. 33-35.

67. Adinarayana K., Ellalah P. Production of alkaline protease by immobilized cells of alkalophilic Bacillus // J. Science Ind. Res. 2003. - V. 9. - № 6. - P. 589-592.

68. Agrawal R.V., Anjali M., Manek W.M., Koiling and Steven H.N. Studies on the Interaction of Water with Ethylceliulose: Effect of Polymer Particle Size // J. Pharm. Science 2003. - V. 4. - № 4. - P. 60-80.

69. Ahn J.S., Krishnadas D.K., Agrawal B. Dendritic cells partially abrogate the regulatory activity of CD4+CD25+ T cells present in the human peripheral blood // Int. Immunol. 2007. - V. 19. - №. 3. - P. 227-237.

70. Alberts В., Johnson A., Julian L., Martin R., Keith R., Walter P. Molecular Biology of the Cell.- Fifth Edition. 2007. - 350 p.

71. Allison A. Cellular immunity to malaria and babesia parasites: a personal viewpoint // Adv. Inflam. Res. 1984. - V. 7. - P. 463-490.

72. Anrather D., Smetazko M., Saba M., Alguel Y., Schalkhammer T. Supported membrane nanodevices // J. Nanosci. Nanotechnol.- 2004.- № 4.-V.1-2.-P. 1-22.

73. Armstrong J.A., Hart P.D. Response of cultured raacropnages to Mycobacterium tuberculosis, with observations of fusion of lysosomes with phagosomes // J. Exp. Med. 1971. - V. 134. - P. 713-740.

74. Arshady R. Biodegradable microcapsular drug delivery system // J. Bioactive Compatible Polym. 1990.- Vol. 5.- P. 316 - 342.

75. BD Pharmingen™ technical data sheet purified rat anti-mouse GM-CSF monoclonal antibody (ELISA Capture) Rev. 05/26/06 P. 1.

76. BD PharMingen™ technical data sheet antibody diluent for IHC, Rev. 004 11/09/04 P. 1.

77. BD PharMingen technical data sheet, 550880 Rev. 1- P. 1.

78. BD Pharmingen technical data sheet, biotin rat anti-mouse CD25 (IL-2 receptor a chain/ p55) antibody for immunohistochem. Rev. 12/05/05, -P. 1-3.

79. Belfiore A., Pandini G., Vella V., Squatrito S., Vigneri R. Insulin/IGF-I hybrid receptors play a major role in IGF-I signaling in thyroid cancer // Biochim.- 1999. V. 81. - №. 4. - P. 403-407.

80. Bodrneier R., McGinity J.W. Solvent selection in the preparation of poly-(DLiactide) microspheres prepared by the solvent evaporation method // Int. J. Pharai. 1988. -V. 43. - P. 179-186.

81. Bonina P.P., Montenegro L., Scrofani N., et al. Effects of phospholipid based formulations on in vitro and in vivo percutaneous absorption of methylnicotinate // J. Control Release. 1995. - V. 34. - P. 5363.

82. Bourke S.L., Al-Khalil F., Briggs T., Michniak B.B., Kohn J., and Poole-Warren L.A. A Photo-Crossimked Poly (vinyl Aiconoi) Hydrogei Growth Factor Release Vehicle for Wound Healing Applications // J. Pharm. Science. 2003. - V. 5. - № 4. p. 33-36.

83. Boxall A.B., Tiede K., Chaudhry Q. Engineered nanomaterials in soils and water: how do they behave and could they pose a risk to human health? // Nanomed. 2007. - V. 2. - №. 6. - P. 919-927.

84. Cavusoglu C., Karaca-Derici Y., Bilgic A. In-vitro activity of rifabutin against rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates with known rpoB mutations // Clin. Microbiol. Infect. 2004. - V. 10. -№. 7. - P. 662-665.

85. Chan O.H., Schmid H.L., Stiigeiibaaer L.A., Howson W., Horwell D.C., Stew S.A. Evaluation of a targeted prodrug strategy to enhance oral absorption of poorly water-soluble compounds // J. Pharm. Res. 1998. - V.15. P. 1012-1018.

86. Chang T., Macintosh F., Mason S.G. Semipermeable aqueous microcapsules: I. Preparation and properties // Can. J. Physiol. Pharmacol. -1966.- Vol. 44.- P. 115-128.

87. Chang T.M. Artificial cells for cell and organ replacements // Artif. Organs. 2004. - V. 28. - № 3. - P. 265-270.

88. Chang T.M. Artificial cells: 35 years // Artif. Organs. 1992. - №16. -V. 1. P. 8-12.

89. Chang T.M. Artificial cells in medicine and biotechnology // Appl. Biochem. Biotechnol. 1984. - V. 10. - P. 5-24.

90. Chang T.M. Artificial cells with emphasis on cell encapsulation of genetically engineered cells // Artif. Organs. 1998. - № 22. - V. 11.- P. 958965.

91. Chang T.M. Artificial cells, encapsulation, and immobilization // Ann.N. Y. Acad Sci. 1999. - № 18. - V. 875. - P. 71-83.

92. Crowther J.R. Elisa: theory and practice. Methods // Mol. Biol. -1995.-V. 42. P. 1-218.

93. De Duve Ch., de Barsy T., Pooie B. Lysosomotropic agents // Biochem. Pharmacol. .1974. -V. 23. - P. 2495-2531.

94. De Jaeghere F., Kübel F., Galii B., Doelker E., Gumy R. pH-Sensitive microparticles as oral delivery systems for antiinfective agents of poor waier solubility // In: Proc. World Meeting APGI/APV. 1998. - V. 2.-P. 559-560.

95. Derossi D., Joliot A.H., Chassaing G., Prochiantz A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 10444-10450.

96. Dev V., Eigler X., Fisnbem M.C. Sustained local drug delivery to the arterial wall via biodegradable microspheres // J. Cathet. Cardiovasc. Diagn. 1997. -V. 41. - P. 324-332.

97. Doherty T.M. T-cell regulation of macrophage function // Current Opinion in Immunology. 1995. - V. 7. - P. 400-404.

98. Drejer K. The bioactivity on insulin analogues from in vitro receptor binding to in vivo glucose uptake // Diabetes metabolism reviews. -1992.- V. 8. № 3. - P. 259-286.

99. Dutt M., Khuller G.K. Liposomes and PLG microparticles as sustained release antitubercular drug carriers an in vitro-in vivo study // Int. J. Antimicrob.Agents. - 2001. - V. 18. - № 3. - P. 245-252.

100. El-Kamel A., Sokar M., Naggar V., Gamal S. Chitosan and sodium alginate-based bioadhesive vaginal tablets // J. Pharm.Science. 2002. - V. 4. -№4. - P. 44-63.

101. Elzaini A.M., Xiaochen G.F., Simons E.R., Simons K.J. Liposomal Formulations: Evaluation of Peripheral Antihistarninic Activity and Systemic Absorbtion in a Rabbit Musse // J. Pnarrn. Science. 2003. - V. 5. -№ 9.-P. 208-212.

102. Esposito E., Ebiovi N., Rasl S., Drechsler M., Di Gregorio G.M., Menegatti E., Cortesl R. Lipid-cared suprareticular systems for topical application: a preformuiatcry study // J. Pharm. Science. 2003. - V. 5. - P. 430.

103. Fedorov N.A., Gusenova F.M., Afonin N.I., Akhsianov U.U., Kontuganov N.N. Hematopoiesis in the dog in experiments with acute blood loss replaced by a PFC emulsion combined with polyglucin // Patol. Fiziol. Eksp. Ter. 1994. -V. 5. - P. 3-7.

104. Felt 0., Gurny R. Delivery of Antibiotics to the Eye Using a Positively Charged Polysaccharide as Vehicle // Pharm. Science. 2001. - V. 3. -N4. - P. 34-37.

105. Fenske D.B., Cullis P.R. Liposomal nanomedicines // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. - V. 5. - №. 1. - P. 25-44.

106. Fernindez-Urrusuno R., Fattal E., Porquot E., Feger J., Couvreur P. Influence of surface properties on the inflammatory response to polymeric nanopartieles // Pharm. Res.- 1995.- Vol. 12.- P. 1385-1387.

107. Florkiewicz R.Z., Anchin J., Baird A. The Inhibition of fibroblast growth factor-2 export by cardenolides implies a novel function for the catalytic subunit of Nal,Kl-ATPase // The Journal of Biological Chemistry.-1998. V. 273. - №. 1. - P. 544-551.

108. Fornusek L., Vetvika V. Polymeric microspheres as diagnostic tool for cell surface marker tracing // CRC Crit. Rev.Therap. Drug Carrier Syst. 1986. - Vol. 2.- P. 137 - 174.

109. Forssen E., Willis M. Ligand-targered liposomes // Adv. Drug Deliv. Rev. 1998.- V. 29.- P. 249-271.

110. Garza M., Wong H. Pharmacokinetic comparison of intravenous earbendazim and remote loaded carbendazim liposomes in nude mice // J. Pnann. Biomed. Anal. 2002. - V. 28. - P. 65-72.

111. Gasco M.R., Gasco P. Nanovector // Nanomed. 2007. - № 2. - V. 6. - P. 955-960.

112. Gibbs B., Gumy R., Doelker E., Pep-Das N.A. Effect of polymeric network structure on drag release from cross-linked poly-(vinyl-alcohol) micromatrices // Pharm. Res. 1989. - V. 6. - №. 7. - P.578-584.

113. Gogoiewski S., Mainil-Varlet P. Effect of thermal treatment on sterility, molecular and mechanical properties of various polyparticles // J. Biomaterials. 1997. - V. 18. - P. 251-252.

114. Goodman L.S., Gilman A. Pharmacological Basis of Therapeutics. 1990.-V. 4 -P .236-238.

115. Gregoriadis G. Liposome Technology // CRC Press. 1984. - Vol. 1.- P. 120.

116. Grown A. Ofloxacin versus tobramycin for the treatment of external ocular infections // Arch. Ophthalmol. 1992. - V. 11. - P. 1234-1237.

117. Gupta M., Vermani K., Garg S. Hydrogels: from controlled release to pH-responsive drug delivery // Drug Discov. Today. 2004. - V. 7. -№ 10. - P. 569-579.

118. Horowitz A.T., Barenholz Y., Gabizon A.A. In vitro cytotoxicity of liposome-encapsulated doxorubicin: dependence on liposome composition and drug release //Biochim. Biophys. Acta. 1992. - Vol. 109. - P. 203-209.

119. Hsu M.J., Juliano R.L. Interactions of liposomes with the reticuloendothelial system. II: Nonspecific and receptor-mediated uptake of liposomes by mouse peritoneal macrophages // Biochim. Biophys. Acta. -1982. V. 22. -№ . 720(4). -P. 411-419.

120. Hug P., Sleight RG. Review: liposomes for transformation of eukaryotic cells //Biochem. Biophis. Act. 1991. - P. 1097.

121. Hui S.W., Langner M., Zhao Y.L., Ross P., Hurley E., Chan K. The role of helper lipids in cationic liposome-mediated gene transfer // Biophys. J. 1996. - V. 71. -№ 2. - P. 590-599.

122. Ide T., Ichikawa T.A. Novel method for artificial lipid-bilayer formation // Biosens Bioelectron. 2005. - № 15.- V. 21. -№ 4. - P. 672-677.

123. Isaacs C.E., Litov R.E., Thormar H. Antimicrobial activity of lipids added to human milk, infant formula and bovine milk // J. Nutr. Biochem. 1995. - V. 6. - P. 362-366.

124. Jabr-Milane L.S., Vlerken L.E., Yadav S., Amiji M.M. Multifunctional nanocarriers to overcome tumor drug resistance // Cancer Treat. Rev. 2008. - V. 4. - P. 422-436.

125. Juiius M., Maroun C., Haughn L. Distinct roles for CD4 and CD8 as co-receptors in antigen receptor signalling // Immunology Today. 1993. -V. 14. - P. 177-182.

126. Kaittanis C., Naser S.A., and Perez J.M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation // Nano Lett. 2007. -Vol. 7. -№ 2. - P. 380-383.

127. Kamps J., Morselt H., Swart P., Scherphof G. Massive targeting of liposomes, surface-modified with anionized albumins, to hepatic endothelial // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 1997,- V. 94. № 21. - P. 11681-11685.

128. Kelly K.A., Allport J.R., Tsourkas A., Shinde-Patil V.R., Josephson L., Weissleder R. Detection of vascular adhesion molecule-1 expression using a novel multimodal nanoparticle // Circ. Res.- 2005.- Vol. 96. -№3.-P. 327-336.

129. Kelly K.A., Waterman P., Weissleder R. In vivo imaging of molecularly targeted phage // Neoplasia. 2006.- V. 8. - № 12.- P. 134-140.

130. Kircheis R., Kichler A., Wallner G. Coupling of cellbinding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery // Gene Ther. 1997. -V. 4. - P. 409-418.

131. Ko J.A., Park H.J., Hwang S.J., Park J.B., Lee J.S. Preparation and characterization of chiiosan microparticles intended for controlled drug delivery // J. Pharm. 2002. - V. 2. - № 2. - P. 165-174.

132. Kockx M.M., Knaapen M.W.M. The role of apoptosis in vascular disease // J. Pathol. 2000. -V. 190. - P. 267-280.

133. Kristmundsdottir T., Amadottir S.G., Bergsson G., Thormar H. Development and evaluation of microbicidal hydrogeis containing monoglyceride as the active ingredient // J. Pharm. Science. 1999. - V. 88. -№ 10. - P. 11-15.

134. Kuikarni A.R., Aminabhavi T.M. Crosslinked chitosan microspheres for encapsulation of diclofenac sodium: effect of crosslinking agent // J. Microencapsul. 2002. - V. 19. - № 2. - P. 173-180.

135. Kumbar S.G., Kuikarni A.R., Aminabhavi T.M. Crosslinked chitosan microspheres for encapsulation of diciofenac sodium: effect of crosslinking agent // J. Microencapsul. 2002. - V. 19. - № 2. - P. 173-180.

136. Kuruma Y. Question 7: biosynthesis of phosphatidic acid in liposome compartments toward the self-reproduction of minimal cells // Orig. Life Evol. Biosph.- 2007.- V. 37 - № 4-5.- P. 409-413.

137. Labhaseiwar V., Song C., Levy R.I. Nanopartide drug delivery system for restenosis // Adv. Drug D. Reviews. 1997. - V. 24. - P. 63-85.

138. Lanzavecchia A. Mechanisms of antigen uptake for presentation // Current Opinion in immunology. 1996. - P. 348-354.

139. Leslie R.G. Immunoglobulin and soluble immune complex binding to phagocyte Fc receptors // Recent Develope of Clinical Immunology. 1984. - P. 77.

140. Leventis R., Silvius J.R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles // Biochim Biophys. Acta. 1990. - V. 30. - № 1023(1). - P. 124-132.

141. Liu Y., Miyoshi H., Nakamura M. Nanomedicine for drug delivery and imaging: a promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles // Int. J. Cancer. 2007. - V. 15. - № 120. -P. 2527-2537.

142. Lowrie D.B., Jacket P.S., and Ratcliffe N.A. Mycobacterium microti may protect itself from intracellular destruction by releasing cyclic AMP into phagosomes // Nature. 1975. - V. 254. - P. 600-602.

143. Luisi P.L. Chemical aspects of synthetic biology // Chem Biodivers. 2007. - V. 4. -№ 4. - P. 603-621.

144. Luisi P.L., Chiarabelli C., Stano P. From Never Born Proteins to Minimal Living Cells: two projects in synthetic biology // Orig. Life Evol. Biosph. 2006. - V. 36. - № 6. - P. 605-616.

145. Luisi P.L., Souza T.P., Stano P. Vesicle Behavior: In Search of Explanations // J. Phys. Chem. 2008. - V. 8.- P. 27.

146. McCarthy J.R., Perez J.M., Brickner C., Weissleder R. Polymeric nanoparticle preparation that eradicates tumors // Nano Lett.- 2005. Vol. 5. -№ 12. - P. 2552-2556.

147. Miaczynska M., Stenmark H. Mechanisms and functions of endocytosis// JCB. 2008. - V. 180. - № 1. - P. 7-11.

148. Ming T., Chang S. Artificial cells, blood substitutes and biotechnology // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002. - V.30 - P. 457 - 468.

149. Ming T., Chang S. Artificial cells, encapsulation, and immobilization //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1999. - V. 875 - P. 71 - 83.

150. Montet X., Weissleder R., Josephson L. Imaging pancreatic cancer with a Peptide-nanoparticle conjugate targeted to normal pancreas // Bioconjug. Chem. 2006. - V. 17. - № 4. - P. 905-911.

151. Moody M.A., Haynes B.F. Antigen-specific B cell detection reagents: Use and quality control // Cytometry A. 2008. - V. 8. - P. 22-24.

152. Moos T., Morgan E.H. Restricted transport of anti-transferrin receptor antibody (OX26) through the blood-brain barrier in the rat // Neurochem. 2001. - V. 79. - P. 119-129.

153. Mosbach K., Anderson B. Magnetic ferrofluid for the preparation of magnetic polymer and their application for affinity chromatography // Nature. 1977. - V. 270. - P. 259 - 260.

154. Murtas G. Question : construction of a semi-synthetic minimal cell: a model for early living cells // Orig. Life Evol. Biosph. 2007.- V. 37.-P. 419-422.

155. Murty S.B., Goodman J., Thanoo B.C., and Deluca P.P. identification of chemically modified pepiide from gly(d,l-lactide-co-glycopeptide) microspheres under in vitro release conditions // L. J. Pnarni. Science Tech. 2003. - V. 4.- № 4. p. 50-75.

156. Nie S., Shin D.M. Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery // Mol. Cancer Ther. 2006. -V. 5. - №. 8. - P. 1909-1917.

157. Novozhylova I.O. The efficacy of treating patients with destructive pulmonary tuberculosis with liver involvement // Lik. Sprava. -1998. -V. 7. P. 121-123.

158. Oganesian E.A., Bud'ko A.P., Stukalov I.V., Liubimov I.I., Biketov S.F., Sveshnikov P.G., Kheifets L.B., Gel'perina S.E. Development and estimation of nanosomal rifampicin // Antibiot. Khimioter. 2005. - V. 50. - P. 15-19.

159. Oussoren C., Magnani M., Fraternale A., Casabianca A., Chiarantini L., Ingebrigsten R., Underberg W.J., Storm G. Liposomes as carriers of the antiretroviral agent dideoxycytidine-5'-triphosphate // Int. J. Pharm.- 1999.- V. 180'. № 2. - P. 261-270.

160. Pantarotto D., Singh R., McCarthy D. Functionalised carbon nanotubes for plasmid DNA gene delivery // Angew. Chem. Intern. Edition. -2004. V. 43.-P. 5242-5246.

161. Papetti M., Herman I.M. Mechanisms of normal and tumor-derived angiogenesis // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2002. - V. 282. - №. 5. -P.947-970.

162. Papisov M.I. Theoretical consideration of RES-avoiding liposomes: molecular mechanics and chemistry of liposome interaction // Adv. Drug Deliv. Rev. 1998. V. 32. - P. 119-138.

163. Park J.W., Benz C.C. Anti-HER/2 Immunoliposomes: Enhanced Efficacy Attributable to Targeted Deliver // Clinical Cancer Research. 2004. -Vol. 8. -№4. - P. 1172.

164. Park Y.J., Lee Y.M., Lee J.Y., Seol Y.J., Chung C.P., Lee S.J. Controlled release of platelet-derived growth from chondroitin sulfate-chitosan sponge for guided bone regeneration // Control Release. 2000. - V. 67. - №. 2-3. - P. 385-391.

165. Patel P.D., Dand N., Hirlekar R.S., Kadam V.J. Drug loaded erythrocytes: as novel delivery system // Curr. Pharm. Des.- 2008.- № 14.- V. l.-P. 63-70.

166. Peltonen L., Koistmen P., Karjalainen M., Hakkmen A., hirvonen j. the effect of cosolvents on the formulation of nanoparticles from low-molecular-weight poly (1) lactide // J. Pharm. Science Tech. 2002. - V. 3. -№ 4.-P. 32-38.

167. Perugini P., Genta I., Conti B., Modena T., and Pavanetto F. Long-term Release of Clodronate from Biodegradable Microspheres // J. Pharm. Science. 2001. -V. 2.-№ 3.-P. 10-20.

168. Pieriqe F., Serafini S., Rossi L., Maqnani M. Cell-based drug delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. - V. 2. - № 60. - P. 286-295.

169. Pohorille A., Deamer D. Artificial cells: prospects for biotechnology // Trends Biotechnol. 2002. - V. 3.- № 20. - P. 123-128.

170. Qin D., He X., Wang K., Zhao X.J., Tan W., Chen J. Fluorescent nanoparticle-based indirect immunofluorescence microscopy for detection of Mycobacterium tuberculosis // J. Biomed. Biotechnol. 2007. - V.7. - P. 8993.

171. Quinti L., Weissleder R., Tung C.H. A fluorescent nanosensor for apoptotic cells // Nano Lett. 2006. - Vol. 6. - № 3. - P. 488-490.

172. Robb R.J., Munck A., Smith K.A. T cell growth factor receptors, quantitation, specificity, and biological relevance // J. Exp. Med. 1981. - V. 154. - P. 1455-1474.

173. Rani Y., Yalkowsky S.H., Halothane A. novel solvent for the preparation of liposomes containing 2-4'-amino-3'-methylphenyl benzothiazole ampb), an anticancer drug: a technical noie // J. Pharm. Science Tech. 2003,-V. 4.- № 2.-P. 20-40.

174. Rappolee D.A., Werb Z., Wang A., Mark D. Novel method for studying mRNA phenotypes in single or small numbers of cells // J. Cell Biochem. 1989. -V. 39 -N 1. - P. 1-11.

175. Richman J., Zolezio H., Tang-Liu D.D. Comparison of orloxacin, gentamicin, and tobramycm concentrations in tears and in vitro MICs for 90% of test organisms // Antimicrob. Agents Chemother. 1990. - V. 4. - P. 602604.

176. Rossi L., Serafini S., Pieriqe F., Antonelli A., Cerasi A., Fraternale A., Chiarantini L., Maqnani M. Erythrocyte-based drug delivery // Expert Opin. Drug Deliv.- 2005.- № 2.- V. 2.- P. 311-322.

177. Salem I.I., Flasher D.L., Nejat D. liposome-encapsulated antibiotics // Methods In Enzymology. Elsevier Inc. 2005. - V. 391. - P. 261291.

178. Santra S., Zhang P., Wang K., Tapec R., Tan W. Conjugation of biomolecules with luminophore-doped silica nanoparticles for photostable biomarkers // Anal. Chem. 2001. - V. 73. - №. 15(20). - P. 4988-4993.

179. Schaefer T.M., Fahey J.V., Wright J.A., Wira C.R. Innate immunity in the human female reproductive tract: antiviral response of uterine epithelial cells to the TLR3 agonist poly(I:C) // J. Immunol. 2005. -V. 15. -P .992-1002.

180. Schindowski K., Leutner S., Muller W.E., Eckert A. Age-related changes of apoptotic cell death in human lymphocytes // Neurobiol. Aging. -2000. V. 21. - P. 661-670.

181. Schwendener R.A., Lagocki P.A., Rahman Y.E. The effects of charge and size on the interaction of unilamellar liposomes with macrophages // Biochemica et Biophysics Acta. 1984. - V. 172. - P. 93-101.

182. Severin S.E., Moskaleva E.Y., Posypanova G.A., Koromyslova

183. Shaniwaiai A., Iviisra A. Pulmonary Absorption of Liposomal Levonorgestrel // J. Pharm. Science Tech. 2003. - V. 1. - № 13. - P. 10471056.

184. Shao J., DeHaven J., Lamm D., Weissman D.N., Runyan K., Malanga C.J., Rojanasakul Y. A cell-based drug delivery system for lung targeting: I. Preparation and pharmacokinetics // Drug Deliv.- 2001.- № 8.- V.2.-P. 61-69.

185. Shkurupiy V.A., Chernova T.G., Kurunov Iu.N. Effect of a complex preparation of isoniazide on mononuclear cells in tuberculous // Bull. Exp. Biol Med. 1996. - V. 121. - №. 5. - P. 559-561.

186. Shkurupiy V.A., Chernova T.G., Kurunov Iu.N. Changes in the granuloma in the experimental treatment of tuberculosis with aprolonged form of isoniazid // Probl. Tuberk. 1993. - V.l. - P. 38-41.

187. Shkurupiy V.A., Troicky A.V., Machneva T.V., et all. Production of new anti-tuberculosis drug and other medical preparations by electron beam treatment // Radiation Physics and Chemistry. 2002. - V. 63. - № 3 - P. 691695.

188. Sinha R., Kim G.J., Nie S., Shin D.M. Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery // Mol. Cancer Ther. 2008. - V. 5. - № 8. - P.1909-1917.

189. Srinivasulu B., Kunarnneni A., Hllaiah P. Investigations on neomycin production with immobilized cells of streptomyces marinensis nuv-5 in calcium aiginate matrix // J. Pharm. Science. 2003. - V. 4. - P. 57-78.

190. Stauber D.J., Debler E.W., Horton P.A., Smith K.A., Wilson I.A. Crystal structure of the IL-2 signaling complex: Paradigm for a heterotrimeric cytokine receptor //PNAS. 2006. -V. 103. - № 8. - P. 2788-2793.

191. Sun E.Y., Josephson L., Kelly K.A., Weissleder R. Development of nanoparticle libraries for biosensing // Bioconjug Chem. — 2006. — V. 17. -№ l.-P. 109-913.

192. Sznol M., Holmlund J. Antigen-specific agents in development // Semin. Oncol. 1997. - V. 24. - P. 173-186.

193. Tanaka Y., Brecher G., Bull B. ferritin localization on the erythroblast cell membrane and ropheocytosis in hypersiderotic human bone marrows // Blood. 1966. - V. 28. - № 5. - P. 758-769.

194. Thanoo B.C., Sunny M.C., Jayakrishnan A. Cross-linked chitosan micro-spheres: preparation and evaluation as a matrix for the controlled release of Pharmaceuticals //J. Pharm. Pharmacol. 1992. - V. 44. - P. 283-286.

195. Tian P., Ball J.M., Carl Q., Zeng Y., Estes M.K. the rotavirus nonstructural glycoprotein nsp4 possesses membrane destabilization activity // Journal of virology. 1996. - Vol. 70. - № 10. - P. 6973-6981.

196. Tomasi T. The discovery of secretory IgA and the mucosal immune system//Immunology Today. 1992. -V. 13. - P. 416-421.

197. Tresco P.A., Winn S.R., Tan S., Jaeger C.B., Greene L.A., Aebischer P. Polymer-encapsulated PC12 cells: long-term survival and associated reduction in lesion-induced rotational behavior // Cell Transplant. -1992.-V. l.-P. 255-264.

198. Truhin R., Figueiredo J.L., Pittet M.J., Weissleder R., Josephson L., Mahmood U. Fluorescent nanoparticle uptake fo

199. Tsung M.J., Burgess D.J. Preparation and Characterization of Gelatin Surface Modified PLGA Microspheres // J. Pharm. Science. 2001. -V. 3. -№ l.-P. 10.

200. Ungel A.L. In vitro absorption studies and their relevance to absomtion from the Gl-tract // Drug Dev. Ind. Pharm. 1997. - V. 23. - P. 879892.

201. Uvarov V.Yu., Ivanov Yu.D., Romanov A.N., Gallyamov M.O., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Scanning tunneling microscopy study of cytochrome P450 2B4 incorporated in proteoliposomes // Biochemic. 1996. -V. 78. - P. 780-784.

202. Vereshagin E.L., Korolenko T.A., Arkhipov S.A. L-proteinase inhibition and resistance to acute blood lost during injection of ß-1,3-carboxymethylglucan // J. Agents and Actions. 1992. - V. 38. - P. 198-202.

203. Walde P., Ichikawa S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications // Biomol. Eng. 2001. - № 31.- V.18(4).- P. 143177.

204. Ward P.A., Warren J.S., Johnson K.J. Oxygen radicals, inflammation, and tissue injury // Free Rad. Biol. Med.- 1988.- V. 5.- № 5.- P. 405-409.

205. Ward P.F., Gannon D.E., Varani J., Phan S.H., Kaplan J., Till G.O., Simon R.H., Ryan U.S. Source of iron in neutrophil-mediated killing of endothelial cells // Lab. Invest. 1987. - V. 57. - № 1. - P. 37-44

206. Weils W.W., Collins C.A., Kurtz J.W. Metabolic regulation of lysosome activity. In: Lysosomes and lysosornai storage diseases. Advances in pediatric research. - 1988. - P. 17-37.

207. Weissleder R., Kelly K., Sun E., Shtatland T., Josephson L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules //Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 1418-1423.

208. Xiong X.B., Huang Y., Lu W.L., Zhang H., Zhang X., Zhang Q. Enhanced intracellular uptake of sterically stabilized liposomal Doxorubicin in vitro resulting in improved antitumor activity in vivo // Pharm. Res. 2005. -V. 22. - №. 6. - P. 933-939.

209. Youson J.H., McMillan D.B. The opisthonephric kidney of the sea lamprey of the great lakes, Petromyzon marinus L. II. Neck and proximal segments of the tubular nephron // American Journal of Anatomy. 2005. - V. 127. -№ 3. -P. 233 - 257.

210. Рис. 1.П. Строение декстрана.

Информация о работе

Зайковская, Мария Владимировна
кандидата биологических наук
Томск, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с биологически активными субстанциями на фагоцитирующие клетки in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние молекулярно-наносомальных гибридных композиций с биологически активными субстанциями на фагоцитирующие клетки in vitro - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы