Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА РЕГУЛЯЦИЮ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО РН В ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА РЕГУЛЯЦИЮ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО РН В ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ"

госагропром ссср

всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии

На правах рукописи

ПЁРИШВИЛИ

Гурам Васильевич

удк 577.391 :591.81

ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕИ РАДИАЦИИ НА РЕГУЛЯЦИЮ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО рН В ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Специальность 03.00.01 — радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск — 1989

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики кафедры биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова,

Научный руководитель —

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук И. М. Пархоменко

доктор апологических наук И. Л. Пелевина

кандидат биологических наук А. С. Шевченко

Ведущая организация — Центральный рентгено-радио-

логическин институт Минздрава СССР, (г. Ленинград),

Защита диссертации состоится «

г

в . /7 . , часов на заседании Специализированного совета Д 120.81.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии Госагропрома СССР по адресу: г. Москва, ул, Белинского, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии.

Отзывы просьба направлять по адресу: 249020, г. Обнинск, Калужской области, ВНИИСХР, Специализированный совет Д 120,81.01.

Автореферат разослан «

1989 г.

Ученый секретарь специалг.чш^

к;т;;чда1 ■ Н. И. Санжарова

Актуальность исследована. В связи с широким применением

источников ионизирующего излучения в медицине, сельском хозяйстве, технике и энергетике и опасностью глобального загрязнения окружашей среды радионуклидами возрастает роль исследований, направленных на изучение механизмов биологического действия малых доз ионизирующей радиации, находящихся в интервале от значений естественного радиационного фона до 0,25 Гр. Актуальность этих исследований определяется в первую очередь тек, что практически отсутствуют методы индикации первичных изменений, индуци-■ руешх в клетке и организме малыш дозами ионизирующих излучений, и для оценки последствий биологического действия малых доз используется экстраполяция результатов экспериментов по облучению в существенно больших дозах (В вн.: Радиация. Дозы, эффекты.

зи радиации оказывают стимулирупцее действие на рост и развитое, плодовитость, неспецифический иммунитет, сопротивление к неблагоприятным условиям внешней среды (Кузин, 1977; 1мск»у _ ,1902).

При действии малых доз осуществление биологических, главным образом, стимулирувдих эффектов возможно лишь с помощью триггвр-ных механизмов (Кузин, 1986). Эти триггерные механизмы работает, .как предполагается, на уровне регуляторных, мессенджерных систем клетки. Эти системы - циклического А№>, внутриклеточного рН (рЙ£> и Са2+ - месоенджерная система - тесно взаимосвязаны* Квк-показано в настоящее время, одной из важных систем регуляции функциональной активности клетки является .система ее рН-регуля-ции. Показано, что изменение функционального состояния клетка в большинстве случаев сопровождается сдвигом внутриклеточной

риск, 1988)

В большинстве работ, выполненных на вирусах, бактериях,простейших, насекомых, растениях и животных показано, что малые до-

и'У»!-« С! л я и те* а

концентрации ионов водорода (виза, Buccitein, 1934). .

Имеются экспериментальные данные о важной роли система циклической ¿Ш в реализации биологических эффектов шлых доз иони-зирупщей радиации ( Raev et al. , 1963), визкоинтенсивного лазерного излучении я монохроматического водимого света tearu at al., 1987). В то же вреыя'данные по другим мессенджердам системам, в том числе системе внутриклеточной рН-регуляции практически от- = сутствуют, Проведение таких исследований позволяет ве только выяснить механизм«, биологических эффектов малых доз, но и дает в руки исследователей достаточно-, надежный метод тестирования ранних изменений в клетке о организме при облучении малыми дозами.

Объектом исследования были кулькгафуемие фибробласты китайского хомячка и нвЗтрофилы из шритонеальной жидкости беспородных мышей. Выбор объектов обусловлен тем, .что в этих модельных системах in vitaeo можно анализировать эффекты, индуцированные облучением на клеточном уровне, не опосредованные усиливающими или компенсаторными влияниями организма. В то же время использование нейтро^ялов, облученных in vitro и in vivo позволяет провести сравнение процессов, индуцированных облучением в клетке и протекающих в ней в результате лучевого поражения организма.

ГГель и основные заядчу работа. . Целью нестоящей работы являлось исследование действия малых доз рентгеновского излучения на клетки млекопитающих, выявление участия и возможных механиков ответных реакций системы внутриклеточной рН-регулящш в ее роли в реализации ответа клетки на это воздействие. Исходя из этого бшш сформулированы следующие конкретные задачи:

I. Изучить влияние малых доз рентгеновского излучения на рН внутриклеточного содержимого фибробяастов и ввйтрофалов.

2. Провести экспериментальное сравнение действия больших и (¿алых доз облучения на системе рН гоместаэа в клетках млекопитающих. *

3. Установить взаимосвязь изменений внутриклеточного рН и биохимически*, показателей клеток при облучении.

4. Выяснить возможность использования исследуемых показателей для оценки изменений» индуцируемых малыми дозами на уровне организма.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспериментальные данные о двухфазных изменениях внутриклеточного рН изолированных клеток млекопитающих, после облучения малыми дозами. . *

2. Экспериментальные данные об участии систеш На+/Н+' - обмена в реализации набдодаедах изменений рН^ , мщуцированнык малыми дозами.

3. Экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что пострадиационное изменение внутриклеточного {Н. приводит х изменениям синтетической и функциональной активности клетки*

Научная новизна исследования. Обнаружено определенное сходство процессов, инициированных в клетке облучением в малых дозах и действием ростовых факторов, в том числе'промотора канцерогене- -за форболового эфира. Полученные данные об участии системы.внутриклеточной рН-регуляции имеют важное теоретическое значение для понимания механизмов стимулирующего действия- малых доз.

Показано, что используемые в работе флуоресцентные методы оценки рН и метаболической активности клетки могут бить использованы как основа для создания комплексного метода индикации

ранних эффектов» индуцированных малыми дозами радиации. В частности, использование эти методов дозволило выявить сезонные колебания чувствительности исследованных клеток - культивируешь фибройластов к действию малых доз.

С помощью использованных методов были заре гистрированы ранние пострадиационные изменения внутриклеточного рЭ в метаболите схой активности перитонвальшх нейтрофштов ве только при их облучения in vitro, но и при общей облучении животных.

Практическая ценность -работы. Разработаны экспериментальные полсоды к ццдикация ранних пострадиационных изменений при лей— - ствии малых доа радиации, которые могут быть использованы как основа для создания комплексного метода такой индикации.

Подученные данные об определенном сходстве процессов« лежащих в основе стимулируыцего действия ц»™т доз радиации и биологического действия ростовых факторов, включая проиоторы канцерогенеза» по-видимому, могут быть использованы при оценке " биологических рисков малых доз.

ДхйдВЕИЮ* Основные наложения диссертации опубликованы в 3-х печатных работах.

»шийятц работы. Материалы диссертации были доложены на конференции "Биофизика'раковой клетки" (Черноголовка, 1987); конференции стран-членов СЭВ и СФН) "Механизмы биологического

__4

действия физических факторов" (Москва, 1987), УШ Международном

г

конгрессе по радиационным исследованиям (Эдинбург, 198Г7), НУ Гревской конференции-да малым дозам (Оксфорд, 1988), на оле-нуме Научного совета АН СССР по проблема "Радиобиология" (Цу-щино, 1988).

Диссертация рассмотрена ва научном семинаре кафедры биофизики биологического факультета МГУ и семинаре физико-химического

отдела ШИЖЙСР.

Объем и структура дясеарташш. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержат 4 таблицы, 17 рисунков и состоит вз введения, литературного обзора, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения и выводов. Список использованной литературы содержат 185 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАЩЕ РАБОШ Обзор лятетаттш

В обзоре литературы рассмотрены современные представления влияния «алых доз ионизирущей радиацаина биологические объекты, возможные механизмы их действия, а также регуляторная роль внутриклеточного рН в физиологических процессах, его взаимосвязь с другими мессанджярными системами и возможность участия этой системы в реализации биологических эффектов малых доз.

- Материалы и методы исследования-

Эксперименты проводились на культуре фебробхастов китайского хомячка линии в-и-<5.-11-рар-23 , клон 431, любезно предоставленной ИБР АН СССР, и на нейтрофвлах перитонеадыкй жидкости белых беспородных мышей-самцов весом 20-22 г.

С целью получения гоиогенной фракции нейтрофвяов, яа 3 часа до извлечения пернтонеальной жидкости мышам проводила внутри-брьшшную инъекции пептона в концентрации 50 мг/мл из расчета по 2 од на мышь. Фибробласты культивировали при 37°С в средах Игла и 199 (в соотношении 1:1) о.добавлением сыворотки крупного рогатого скота в конечное концентрации ВДЕ,

Облучение проводили при комнатной температуре на реятговов-ской установке РУМ-П. Облучение в дозах 0,08-0,2 Гр - щд мод-

hoctu 0,05 Гр/ман, a в лозах J-8 Гр, при -I Гр/дкш.

' С прдаепенке;л флуоросцвлнткэцатата ( J^A) мдасрофлуор;слетри-ческим методом ^¡итинская и др., I0Ô4) регистрировали внутриклеточный рН СрН^) в одиночных клетках.

Содержание ATS в клетках определяли Оиолшанесцентным методом с использованием иммобилизованной лвциферазы светляков (Угарова а др.. 1987).

Уровень синтетической активности клеток (параметру) определяли с применением флуоресцентного зонда акридинового оранжевого (Карнаухову 1978).

Реакция восстановления ни греющего тетразолия нейтрофила-мн (НСТ-тест) , была использована для оценки их функциональной активности (МаянскяЙ я др., 1977).

Результаты экспериментов обрабатывались статистически. Достовераость различий оценивали 'по критерию Стыщента.

; ^?у^д.тата и их обсуждение

Облучение изолированных клеток млекопитающих в дозах 0,02 до 0,2 Гр приводит к фазовым изменениям рН£.

В культивируемых фибробластах китайского хомячка лишил B-li-d-ii-FAF-28, клон 431 после облучения в доза 0,05 1*р (рис.1, кривая 2) уже к 20 мин pi^ достоверносдвигается в кислую сторону, подкисленив нарастает к 40-^60 'минутам после облучения на 0,16 единицы рН, затем начинается возрастание рН и к 120 икн рн^ возвращается к контрольному'уровню/а н'150-200 мин превышает контрольный уровеяьна 0,16-0,18 единицы рН.

' По литературный данным, в подавлящем большинстве клеток системой активного транспорта протонов из клетки в среду, обеспечивающей сохранение рН внутри клетка близким к нейтральному, является амилорид-чувствительный элеятровейтрадышй ка+/н+ -ан-

Рис." II Изменение уровня внутриклеточного АТФ (I) и-рН клеток С2} после облучения фибробластов в дозе 0,05 Гр._

типорт. При замене перед облучением НаС1 на л:олян-хлорид .в

среде, окружающей клетки, наблюдается понижение р^ аа 0,18_____

единиц рН и изменений этого уровня при рентгеновской облучения в малых дозах не происходит' на протяжении трех часов ваСлипания.

При действии стимулятора опуходеобразования форболового эфира (ФЭ) и сыворотки, клетки в результате активация К а* /К*1- . -обмена защелачивавтся;' ФЭ в концентрация 250 мг/ыл за-&-10 иш, вызывает возрастание рн± примерно на 0,2 «линици 1«. Оаоротха крупного рогатого скота в концентрации 2$ и за Ю мин выза-вает сдвиг * щелочную сторону, примерно на 0,16 «Цщнинн рН. Важно отметить, что дополнительных изменена» р% при облучении в мали дозах клеток-, обработанных ФЭ или сывороткой, ае вайлю-

дается. Сыворотку (в концентрации 10%) добавляли также к предварительно облученным клеткам в процессе регистрация пострадиационных изменений р% . Добавления проводили через 40-60, 120 и 160-180 мин после облучения и через 15 мин после добавления сыворотки регистрировали рВА • Конечное значение облученных клеток, достигаемое через 15 мин инкубации, равно рн1 неснЗлучек-шх клеток в присутствии сыворотки, но подъем к этому уровню осуществляется как от сниженных значений ри^ через 40-60 мин после облучения и, соответственно ¿рн^ составляет 0,3 ед. рН, так и от контрольного уровня рн±, характерного для 120 мин после облучения ( Арн^ » 0,16), а при повыиенном уровне рНд через 160-180 мин после облучения *рн1 составляет всего 0,03 ед, ГЙ Стабл.1).

Таблица I

Влияние сыворотки и ионофора ыояенсина на внутриклеточный рН (рН^) облученных фибробластов в дозе 0,05 Гр

Время после! 'рн, оодучения.мкн ___________1 Ц-да м.

Исмтгиый I После добавки I Шсле добавки | снвороуял ; моневсина

Контроль 7,05±0,04 7.21±0,05 7,36±0.03

60 6,89+0,05 7,19+0,06 7,37+0.00

120 7,06+0,06 7,21+0,05 . * 7,36+0.03

16£> 7,18+0,05 7,2Х±0,06 . 7,36+0,03

Вызванный сывороткой сдвиг рн^, по-вщувдоьу, не лимитирован величиной трансмембраквых Ка+ и Н* градиентов, так жак рнА ног быть увеличен еще на 0,15 ед. рН добавлением яафУЙ+-яоно-фора моаеясяна (табл.1).

Гаким образом, с использованием ростовых факторов (сыворот-

ка, SO) я безватркевой среда было показано, что сдвиги pH¿ после рентгеновского облучения в малых дозах связаны с изменениями функционирования системы NaVH^-oúMeBa.

Следует отметить, что при облучении$мбробдастов в дозах _ 2-8 Гр, вызывающих их репродуктивную гибель, в указанные сроки изменений pHj мы не наблвдали.

Изменения р% после облучения в малых дозах сопровождается находящимися в сротнвофезе изменениями внутриклеточного уровня АТФ- (АТФ^. Как вюно из' рисунка I, кривая I, через SO минут после облучения фибробластов в дозе 0,05 Гр количество AT$¿ достоверно увеличивается, во сравнении с контролем. Максимум достигается через 80 минут к составляет. I405Í. После этого происходит постепенное падение уровня АТФ1, Уровень контроля достигается через IZO минут после облучение* а к 200 минуте содержание АТФа составляет 70$ от контроля.

Интересно отметить, что изменения рнА' я АТФ^". после облучения регистрируются на фоне сезонных колебаний (рис.2), которые ш наблвдали с сентября 1986 г. но ишь 1988 года. Ори атом радиочувствительность клеток тем выше, чем ниже рнА. Из рис.3 видно, что весной максимальный эффект увеличения AT$¿ , ва 80 минуте после облучения наблюдается при дозе 0,06 Гр. Снижение или повышение дозы приводит к меньшей выраженности аффекта как для закисления рН^ так и для увеличения АТФ^. В осенний период аналогичные изменения рн^и. АТФ^ во времени юксишльно выражены при облучении в дозе 0,12 Гр.

Были проведены параллельные измерения уровня внутриклеточного АТФ и pH культивируемы! фибробластов при действии форбохо-вого эфира в концентрации 250 нг/нл. Результаты измерений представлены на рис.4.' Как видно из рисунка, при действии ФЭ реги-

Рас. 2* Сезонные изменения внутриклеточного рН в клетках китайского xowrBta. Клетки ^суспензии: А - 1986 г., • - 1387 г., 4 ~ 1983 г.; клетки, прикрепленные'к стеклу: Д - 1986 г., о - 1987 г., 0 - 1988 г.

■ ■ !*'■:■■ TftV ' ■ v '¿рз: в'.м , * в(аэ о,и ..

■Рис, 3.: Изменение внутриклеточного рЦ (I) и уровня АТФ (2) _ . при облучении фибробластов в разных дозах.,

стрировали задержку задала члвашит цитоплазмы пршлзрно на 3-5 млн. В ход® латентного периода насшвдали небольшое снижение ^н^ . Изменения уровня АТ51 сходны с теш, которые вызывают облучение в малых дозах, однако развиваются за более короткое время. Важно отметать, что дополнительных изменений внутриклеточного АТФ^ как и рн1 пря облучении в малых дозах клеток, обработанных ФЭ, не нэблвдается. Нами также получены данные о динамике уровня АТФ^. при облучении в малых до'зах клеток, обработанных сывороткой в конечной концентрации 1<#» и при замене ЯаС1 на холинхло-рид в среде, окружающей клетки. В обоях случаях изменений АТФ в фибробластах после облучения не навлекается.

Рис. 4. Действие форболового эфира на внутриклеточный 1« (X) и уровень АТФ (2) в фибробластах.

Для оценки функциональной и синтетической активности фвбро-бластов помимо АТФА мы использовали параметр о£. (соотношение РНК/ДНК, оцениваемое по связыванию с ними акридинового оранже-

во го).

Изменение параметра и рн1 для фибробластоз,

облученных в малых дозах, приведено в таблице 2.

Таблица 2

Влияние облучения в дозе О,С© Гр на внутриклеточный рй (рНд), содержание АТФ (АТФ^) и синтетическую активность (ос -параметр) фибробластов

Время после облучения, мин ! ! т ! ! 1 1 Г <£ , %

Контроль 7,0(^0,05 100*5 ,100*4

60 6,83*0,03 135+5 80+5

80 .7 6,84*0,04 139*5 75*5

100. 6,91*0,06 133*5 96*6

120 7,01+0,07 100*4 J0I*7

160 7,13*0,04 74*6 120*6

180 7.15*0,04 66*5 175*5

200. ' ?;16*0,04 64*5 154+7

Как видно из таблицы, в фазе зачисления клеток, которая сопровоадается увеличением уровня АТФ, значение параметра <С меньше по сравнению о необдученными клетками. Минимальное значение «С принимает на 80 минуте (75% от контроля), именно в то время, когда уровень АТФ{ имеет максимальное значение. Потом, к 2 часам, значение «¿выходит на контрольный уровень, а затем, начиная с 2,5 часов, наблюдается достоверное увеличение параметра «С , которое к 3 часам достигает максимального значения (175£ от контроля).

" Мы предположили, что в облученных »алыми дозами фоброблао-тах изменения параметра <С , характеризующего функциональную -и

синтетическую активность клеток, как и изменения АТФ1 в значительной степени определяются сдвигами внутриклеточного рН. Дня проверки данного предположения ш изменяли внутриклеточный рН путей смещения рН среды инкубации (рН0) и оценивали параметр и уровень АТ01 . Результаты данных экспериментов представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние рН среды (рН0) и форболового эфира (ФЭ) на рн1, уровень АТФ1 н параметр сС в фибробластах китайского хомячка

РНо | РН, | ATíi, % j %

7,20 6,99*0,06 100+5 10р*4

6,70 6,78±0,06 I32±4 79±2

8,00 7,21±0,06 69+7 I8I±9

7,20 + «9 7,15±0,04 82*3 198*3

(Время инкубация 60 мин).

Как видно из этой таблицы, при изменении рН^ на 0,5 единицы pH в кислую сторону, pH¿ уменьшается на 0,21 единицы, при этом значение <С также уменьшается'на 20, а уровень АТЗ^ увеличивается на 32£ по сравнению с контролем. При смещении рН0 в щелочную сторону на 0,8 единиц рн^ увеличивается на 0,22 единицы pH, значение d при этом также увеличивается на 8IÍ, а уровень AT$¿ уменьшается на 3IÍ по сравнению с контролем.

Нами также получены данные об увеличения параметра с£ (193£ от контроля) при действии на фибробласты стимулятора оцухолеоб-раэования форболового эфира в концентрации 250 т/на (табл.3).

Эти данные находятся в согласии с данными литературы о снижении метаболической активности, в т.ч. и расходования АТФ, при ■»

дадкислеиии содержимого клетки и ее' усилении при подщелачивашш (ИГеЪЪ, Huccitelli, 1981} ШЪе, Epel, 1936).

Обращает на себя внимание определенное сходство изменений рн1,2вдуцарованных облучением в малых дозах и таким мощным стимулятором опухолеобразования как форболошй эфар. Так, сходен характер фазовых изменений рнх и АТФА (хотя при действии ФЭ они развиваются значительно быстрее, чаи при облучении). Кроме того, ФЭ вызывает увеличение синтетической активности клетки, как и пострадиационное поддедачивание,

Аналогичная серия экспериментов была проведана на перито-неальных нейтрофялах. Отработанный нами метод позволяет получить перитонеальную жидкость, обогащенную нейтрофилами (до 80^ всех клеток). При их инкубации в среде Хэккса они сохраняют жизнеспособность и постоянный уровень р% не менее 3 часов.

Шло обнаружено, что на облучение в малых дозах (0,050,20 1^») in vitro нейтрофилы реагируют практически так же, как и культивируемые фибробласты китайского хомячка, однако у

Ч-

нейтрофллов фазовые изменения е% происходит за более короткий срок, чем у фкбробластов: у нейтрофшгов повышение pHi по сравнению с необлученныы контролем, обнаруживается уже при.измерении

через 40 минут, через I час оно достигает максимального значе-*

ния, которое остается далее постоянным в течение 2 часов. Под-ки слеше имело место в ранние сроки, с максимумом на 10 минуте после облучения.

Для того чтобы оценить связь изменений рн1 с функционированием на+/н* обменника мы использовали прием, аналогичный применению ростовых факторов на фибробластах китайского хомячка: ней-

Трофилы обрабатывали FilPiL (fогщу1-те thiooyl-leueyl-phenylala — пыс ) — фактором, который вызывает стимуляцию иммунного ответа. Он, как и облучение, вызывает подкисленпе, а затем подщелачиваете внутриклеточного содержимого, причем, по литературным данным, за счет модификации работа Ка+/Н+ обменника ( ulva'ail at al.,1982). При облучении клеток, предварительно обработанных бмьр , в которых pHj_ превышает контрольный, уровень на 0,16 едшшц, снижения или дополнительного повышения уровня р% не происходит, т.е. я в нейтрофшвх индуцируете облучением изменения р% зависят от на+ /Н^-обменника.

Представлялось Интересным выяснить, вызывает ли аналогичные изменения в нейтрофилах облучение целого животного.

Животных-самцов белых беспородных мышей облучали в малой дозе 0,05 Гр и в полулетальной дозе 7 Гр. , '

Были обнаружены изменения рн^ в нейтрофилах в разные сроки после облучения - 3.24,48,72 часа и 7 суток.

Облучение в стимулирующих и в повреждающих дозах вызывает фазовые изменения pHt , однако их ход во временя и величина различаются (рис.5 и 6). При действии малых доз, через 3 часа нейтрофилы подщелачиваются на 0,05 единиц, л 24 часам рН^ возрастает до 0,09 единиц. Через 48 часов наблюдается подкисле-кие на 0,17~единиц, через 72 часа - подщелачивание на 0,17 единиц. К 7-ым суткам после облучения этот параметр возвращается к норме (рис.5, хривая I). Ори действии повреждающей дозы, под-киолеяие развивается быстрее, достигает 0,05 единицы уже через 3 часа, к 24 часам возрастает до 0,15 единиц и до 48 часов сохраняется на уровне О,II единиц. К 72 часам, как и у клеток, облученных стимулирующими дозами, наблкщается подщелачивание, но оно составляет лишь 0,10 единиц по сравнению с 0,17 единиц

'3 24 48 72 " 144 168™

Рис. 5. Изменение внутриклеточного рН (I), эффективности восстановления НСТ С2) и синтетической активности (3) нейтрофвлов при облучении мышей в дозе 0,05 Гр.

Рис. 6. Изменение внутриклеточного рН (I), эффективности восстановления ЮТ (2) и синтетической активности (3) нейтрофолов при облучении мышей в дозе 7,0 Гр.

для клеток, облученных малыми дозами. А к 7 суткам после облучения яейтрофклов практически не отличается от нормы (рис.6, кривая I).

Во многих исследованиях„было показано, что важнейшие функции нейтрофилов фагоцитоз, хемотаксис, образование суперксцщюго радикала и дегрануляция, - являются р%-зависимыми (кхетрпог, Ь'1угЬ , 1963; а!тсЬол!гг , 1985, 1986; Сгаеое , Х9В6>. Поэтому представляло интерес выяснить, как менялись функциональная и синтетическая активность нейтрофилов на фоне пострещгацконных-изшнений рн^ Для этой цели мы использовали метод окраски клеток акридиновым оранжевым (АО) и реакцию восстановления нейтро-филами' нитросинего тетразоляя (НСТ-тест). В целом, НСТ-тест отражает степень активации кислород - зависимого метаболизма, прежде всего функцию гексозо-монофосфетного тцунта"- и связанную с ним наработку свободных радикалов (Иаянский, Шннский, Т983). НСТ-тест выявляет малые концентрации суаерокснд-анионов, которых практически нет в покоящихся нейтрофялах.

Через 3 часа после облучения мышей в дозе 7 Гр. все три параметра (рН1 , параметр <£ и уровень НСТ-теста) меньше, чем в контроле. Через 24 часа после облучения, когда рн^- нейтрофа-лов уменьшается.по сравнению с контролем на 0,15 единиц,.оС-параметр растет на 37% и процент клеток, восстанавливающих НОТ, на Ь7% больше, чем в контроле (рис.6). Изменения, инициируемые поврездавдей дозой, по-видимому, связаны с тем, что в ответ на раздражение, связанное с лучевыми и другими воздействиями, когда в организме возникает особая потребность в нейтрофолах, палочко-яцерные формы и даже метамиелоциты. быстро выходят в кровоток. У »тих форм <С-показатель существовавшие, чем у зрелых нейтрофи-

лов. Об мере развитая лучевого поражения к 72 часам после облучения °С-нокаэатель падает ниже контрольного уровня, падает по сравнению с начальными изменениями и функциональная активность нейтрофалов.

Ход кривых изменений синтетической и функциональной активностей нейтрофилов после. облучения в малых дозах заметно отличается, оба этих вида активности коррелируют с уровнем р% -повышаются при его росте (3,24 и 72 часа после облучения) и снижаются при уменьшении (48 часов после облучения (рис.5). Через 7 суток после облучения все три параметра выходят на уровень -контроля.

Таким образом, в ранние сроки после облученая.в ловраздао-ией дозе, когда ёще отсутствуют признаки развития лучевой болезни, измеряя одновременно рн1 , сС-параметр и НСТ-гест у нейтрофалов, мы можем зарегистрировать вызванные облучением изменения, причем «ни отличаются от тех, которые были зарегистрированы нами при облучении в малой дозе. .

Заключение

г

В нем обсуждаются полученные-результаты; Подчеркнуто, что используемые флуометрическиа методы позволяют регистрировать изменения,. индуцированные малыми дозами, в ранние сроки после , облучения. Обсуждается взаимосвязь изменений изученных параметров, влияние рн^ на уровень метаболической, в,том числе синтетической активности клетки, проявления специфической активности, нейтрофалов. Приводятся и обсуждаются данные о возможности использования предложенных подходов для регистрации достаточно ранних (часы и сутки) изменений при облучении малыш дозами ,

целостного организма, а таете сходство действия малых доз радиации и некоторых активаторов - промотора канцерогенеза © . на фибробластах, ЖЬР на нейтрофшгах.

Оцениваются перспективы использования клеточных моделей и предложенного набора методов для определения характера (сти- • мулирующего или поражающего) лучевого воздействия в ранние сроки после облучения.

ВЫВОДЫ

X. Показано, .что облучение культивируемых фпбробластов рентгеновским излучением в дозах от 0,02 до 0,20 Гр приводит к двухфазному изменению рН]. Первоначально внутриклеточное содержимое подкисляется, к 2 часам после облучения возвращается к контрольному уровню, а затем подщелачивается. В реализации наблюдаемого эффекта участвует система NaVH*—обмена. Установлено, что действие малых доз приводит также к антибатным о рнА изменениям уровня АТФ в фибробластах.

2. Указанные изменения наблюдаются на фоне сезонных колебаний р% . Обнаружена связь радиочувствительности с сезонными изменениями р%, она максимальна при наименьших значениях рн^ приходящихся на весенний период.

3. На фоне изменения ^¿и AT®t обнаружено изменение синтетической активности фабробластов. При закислении цитоплазмы

и одновременной увеличении уровня АТ^ синтетическая активность клеток, определяемая соотношением РНК/ДНК снижается на 255?, а при защелачивании и снижении уровня АТФ повышается на 75? по сравнению с контролем.

4. При облучении перктонеалышх нейтрофилов"- мышей in vitro

в малых дозах наОлцдаотся входные, ко более быстро протекающие изменения Получены данные, позволякдае предположить, что

эти сдвиги связаны с изменением системы Sa+/H+-oûMeHa.

5. Облучение мышей в малых (0,05 Гр) и больших (7 Гр) до-* зах приводит к фазовым изменениям рн^ в перитонеальных нейтро-филах, отличающимся по.динамике и величине развития эффекта. Облучение шшй в малых дозах приводит к симбатнын с pf^ изменениям синтетической и функциональной активности нейтрофи-лов, а при облучении в больших дозах*наблюдается антибатный ход изменений синтетической активности и асинхронный ход изменений функциональной активности нейтрофилов.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Пархоменок И.М., Перишвили Г.В., Туровецкий В.Б,, -Колесникова А.Л., Бровко Л,Ю, Микрофлуоресцентннй анализ изменений, индуцированных стиыулируицим и повреждающим действием иони-зирупцих излучений в клетках китайского хомячка//Тез.докладов Всесоюз, симпоэ. "Биофизика раковой клетки". Черноголовка. 1987. - С.II. "

2. Деришвили Г.В.. Пархоменко И.Ы., туровецкий В.Б., Колес-' никовз А.Л., Бровко Л.Ю. Микрофлуоресцентный анализ изменений, индуцированных стимулирующим и повреждающим действием ионизирующих излучений в клетках китайского хошгчка//Доклада ЮШ. Общая биология. Биохимические я биофизические аспекты функционирования живых систем. М,: Наука, 1989. - С.13-16.

3. Перишвили Г.В., Туровецкий В.Б., Пархоменко И.Ы., Абрамян Л.Г., Скокова Т.В. Влияние малых доз ионизирующей радиации на функциональную активность нейтрофолов мышей//Ветери-

пария. - 1988. - л 4. - С.46-49

: 4. Перитвили Г.В., Еуджиашвили Д.Ц., Пархоменко И.Н., ' Туровещшй В.Б. Действие рентгеновского излучения на функциональную активность нейтрофилов мышей //Твэ.докладов I Всесоюз. радиобиологического съезда. - 1989. - в печати.

5. Пархоменко И.М., Перишвшш Г.В., ТУровецкиЙ В.Б., Броако Л.Ю., Кудрягаэв Ю.Б., Буданашвили Д.М. Влаяние малых доз рентгеновского излучения на систему внутриклеточной рН-регуляции у изолированных клеток млекопитащих // Тез. докладов I Всесоюз. радиобиологического съезда. - 1989. - в печати.

ТБ-02557 Подписано в печать 6.03.89 г. Заказ 1562 Объем 1,5 п. л. Тираж 100

Обнинская городская типография Управления издательств, полиграфии и книжной торговли Калужского облисполкома г. Обнинск, ул. Комарова, 6