Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние лиганда опиатных рецепторов даларгина на процессы клеточного деления различных видов эпителия

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние лиганда опиатных рецепторов даларгина на процессы клеточного деления различных видов эпителия"

Министерство здравоохранения РС5СР ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи ПАНЬКОВА Татьяна Дмитриейна

УДК 611-018.7 : 616-003.725

. ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДА ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ДАЛАРГИНА НА ПРОЦЕССУ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ВДОВ ЭПИТЕЛИЯ

03.00.11 - эмбриология,гистология И цитология

Автореферат диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук

'Владивосток 1992

? - • '

Работа выполнена в ЦНИЛ Хабаровского ордена Трудового Красного Знамени Государственного медицинского института

Научный руководитель: прорессор,доктор медицинских наук С.С.Тимошин

Официальные оппоненты:• . профессор,доктор медицинских наук Б.Н.Рдаавский кандидат биологических наук А.А.Вараксин

Ведущее учереждение: 2ой Московский ордена Ленина Государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова

Защита состоится " с1" •'р/^-и'ч -..У / .1992 Г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 084.24.CI. Владивостокского медицинского института по адресу: 690600, г.Владивосток ГСП пр.0стрякова,2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " 1$ " . 1;'<(-0 У 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Г.М.Холоденко

-. Актуальность проблемы. Изучение процессов клеточного деления является одной из ключевых "проблем биологии и медицины. Митоз - важнейшее событие в :кизни клетки, обеспечивающей равноценное распределение в организме генетического материала между клетками. Нарушения пролифератипьых процессов являются существенным звеном патогенеза многих заболеваний: онкологических, иммунных, гастроэнтерологических, дерматозов. Исследованиями последних лет установлено, что эндогенная опиатная система принимает участие практически во всех процессах жизнедеятельности организма. Сведения об участии опиатов п регуляиии процессов клеточного деления носят единичный и противоречивый характер ( По^Зко«" Я. et п1.Д985; 2г.Еоп г. еЧ п1,1989). Прогресс в области пептидной химии сделали возможным синтез регуляторщпс пептидов в достаточно больших количествах для их использования в качестве лекарственных средств. Более того, оказалась реальной возможность целенаправленного изменения структуры эндогенных пептидов, то есть создание их синтетических аналогов с заданными свойствами, что является базой для изготовления новых высокоэффективных средств терапии ряда заболеваний.

Актуальность настоящего исследования определяется в частности тем, что на момент начала рабоТЕ! в литературе отсутствовали сведения о характере влияния синтетического аналога лей-энкефалина даларгина на процессы клеточного деления. Наряду с тьзретическим, решение этого вопроса имеет прикладное значение. В настоящее время даларгин является официнальным противоязвенным препаратом. Изучение характера влияния этого препарата на процессы клеточного деления монет расширить показания для его клинического применения.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования бы-чо пояснение характера влияния лиганда опиатных рецепторов даларгина на процессы клеточного деления эпителиальна тканей.

Д'Н достижения этой цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить характер непосредственного влияния даларгииа на синтез ДНК в культуре клеток мышиных фибробластов и на процессы клеточного деления эпителия роговицы белых крыс.

2. Выяснить влияние этого препарата на пролиферативные про -ц°ссы эпителия роговицы белых крыс при парентеральном введении.

3. Изучить влияние различных доз даларгина на процессы деления клеток эпителия роговицы белых крыс.

Изучить влияние даларгина на процессы клеточного деления различных эпителиальных тканей.

5. Проанализировать роль опиатных рецепторов в осуществлении эффекта даларгина.

Научная новизна и научно-практическая ценность работы. В результате проведенного исследования впервые изучено-влияние даларгина на процессы клеточного деления эпителиальных тканей. Установлен стимулирующий характер влияния препарата в широком диапазоне доз на пролиферативные процессы эпителия роговицы будьте крыс. Показано, что это происходит в результате ускорения поц влиянием даларгина темпов самого митоза, сокращения длительности премитотического периода, в результате повышения скорости синтеза ДНК, а таюке благодаря увеличению обще!; проли-ФеративноЙ фракции за счет перехода части клеток из баллотирующегося пула'в лролиферативный.

Впервые установлен однотипный характер реакции различных эпителиальных тканей под влиянием даларгина.

С помощыэ различных экспериментальных подходов показано, что стимулирующий эффект даларгина на пронесен клеточного деления реализуется через опиатные рецепторы.

■ Полученные данные, свидетельствующие о вовлеченности спиат-ной системы в регуляция проли^еративных процессов, расгиртп' представление о механизмах регуляции клеточного деления. Установленная в работе способность даларгина стимулировать проли-фератизные процессу в различных эпителиальных тканях в "„'проком диапазоне доз, служит основанием для расширения показаний к использования препарата. Данные о реализации митогенного эЬТпктп даларгина через опиатные рецепторы будут использованы для синтеза новых аналогов с заданными свойствами.

Апробация диссертации. Основные материалы диссертации были доложены на совместном заседании кафедр гистологии, патофизиологии,. ЦНМ (г.Хабаровск,1988), на итоговой научной конЬеренпни по'некоторым актуальным медико-биологическим проблемам (^.Хабаровск,1989), на 4-ом Всесоюзном съезде патофизиологов (г.Кишинёв, 1989), на научной конференции по проблеме "Экспериментальное и клиническое применение нейропептидов" (г.Хабаровск,1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, 4 из которых в центральной печати.

Объем работы. Материал диссертации изложен на ПО страницах машинописного текста,.иллюстрирован 3 рисунками и 10 таблицами. Диссертация состоит из следующих разделов, введение , обзор литературы, материал и методы исследования, полненные результаты, обсуждение результатов исследования, выводы. Список цитируемой литературы состоит из 285 названий работ.

Материал и методы исследования Опыты проводили на беспородных белых крысах-самцах массой

1с30-2£0 граммов. Эвтаназию осуществляли посредством декапита-шш. Н опытах было использовано 699 животных. Изучение процессов клеточного деления осуществляли в эпителии роговицы, языка, фунцального отдела желудка и коркового слоя тимуса. Один энук-леированный глаз фиксировали в течение 2 часов в охлажденной жидкости Карнуа,. Тотальные препараты роговиц окрашивали гематоксилином Лили-Майерп, Подсчет, митозов осуществляли дифференцированно по фазам с помощью светооптическпго бинокулярного микроскопа БИОЛАМ. В качедом препарате определяли число митозов в 100 полях зрения и общее количество клеток. Митотицеский индекс (1/1И) выражали, в %0 .

Для получения радиоавтографоо правые роговицы инкубирорали при ЗУ°С в ультротермостате в среде .£99 с 3Н-тимидином (удельная радиоактивность 87 кюри/моль) в течение 60 минут (О,И.Епифанова и соавт.,1977). В ряде опытов осуществляли внутрибрю-щинное введение эЦ-тимидина за час до. забоя животных из расчета 0,6 мккюри/г, на роговицу при этом наносили 2 мккюри 3Н-ти-мидина трижды в течение часа с интервалом 20 минут (0.И,Епифанова, 1965). После проведения инкубации бцоцтаты отмывали в трех сменах среды 199, фиксировали в жидкости Карнуа. Приготовление препаратов и обработку радиоавтографов проводили по стандартным методикам как в опыте, так и в контроле. Мечеными считались ядра, над которыми'было не менее пяти зерен восстановленного серебра. Индекс меченых ядер (ЙШ) определяли путем отнесения числа меченых ядер к общему количеству клеток в этих полях. При этом просматривали не менее 2,5 тысяч ядер. ИМЯ выражали в процентах. Об интенсивности метки (ИМ) судили по среднему количеству зерен серебра над ядром, которое определяли на осцо- , иании подсчета числа зерен над 50 ядрами в каждом препарате.

В качестве лиганда опиатных рецепторов был взят синтетический аналог лейцин-энкефалина даларгин со структурной фор.г/лоС Тир-Д-Ала-Гли-^ен-Лей-Арг. Препарат синтезирован в лаборатории синтеза пептидов ЗКНЦ АМН СССР (зав.лаб. доктор химических наук Титов М.И.). В настояшее время даларгин оценивается как один из наиболее эффективных противоязвенных препаратов (В.А.Виноградов, В.М.ПолонскиГ., 1936; В.Г.Смагин и соавт , 1987). и решением фармкомитета разрешен для клинического применения. Благодаря высокой устойчивости по отно-лени.э к разрушающим ферментам* селективности воздействия, высокой биологической эффективности, даларгин представляется удачным препаратом для изучения влияния лигандов опиатных рецепторов на пролйферативные процессы.

Для характеристики взаимодействия даларгина с рецепторами использовали в качестве антагониста опиатных рецепторов налок-сон (фирма "Endo Koch Laboratorien ,С1Ш, который вводили в дозе 10 мкг/кг и 200 мкг/кг. Синтетические аналоги лей-энке-фалина, близкие по химической структуре к даларгину, были использованы для анализа роли опиатных рецепторов в осуществлений эффекта даларгина. Два пептида являются агонистами опиатных рецепторов,'их структурные формулы:. Тир-ЛеЯ-Гли-'£ен-Лей--Арг (А); Тип-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арггта-С2Н5 (Б). Два других пептида, структурные формулы которых: ¿еч-Д-Ала-Гли-Фен-Лей--Арг (В); Тир-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг (Г), не обладают свойствами агонистов опиатных рецепторов. Вещества синтезированы в лаборатории синтеза пептидов ВКНЦ АМН СССР. Все пептиды вводили в дозе 10 мкг/кг в 14 "асов.

Для оценки непосредственного действ/я даларгина служила культура клеток мьтаиных фибробластов Даларгин (100 нг/мг)

ó

ьносили на четвертые сутки после пересева клеток. В контрольную культуру добавляли эквиобъемное количество изотонического раствора повареной соли. Через 21 часа после культивирования с даларгином клетки фиксировали в жидкости Карнуа. За час до фиксаиии в среду вносили 3Н-тимидин - I мкк'-ори/мл.

При изучении непосредственного действия лигандов опиатных рецепторов в системе in vivo даларгин и налоксон наносили на роговицу с помощью микродозатора из расчета 0,02 мл I иг% раствора. На левый глаз, служивший контролем, наносили эквиобъемное количество изотонического раствора иовареной соли. Аппликаций препаратов проводили с интервалом 20 минут трижды в 13-II часов. -Для оценки повторных эффектов процедуру проводили на протяжении 5 cvtok.

Для изучения системного влияния препарата даларгин вводили внутриброшинно в дозе 10 мкг/кг однократно и повторно (5 раз на протяжении 5 суток) в 14 часов. Контрольные животные получали внутрибрюшинно эквиобъемное количество изотонического раствора повареной соли. Наряду с этой дозировкой дополнительно изучали xapt .{тер влияния других доз препарата на клеточное деление.

Полученные данные подвергали статистической обработке по методу Стьюдента (Н.Г.Зайцев, 1973). Различия считали достоверными при Р<С,05.

РЕЗУЛЬТАТА СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ '

Непосредственное влияние даларгина на синтез ДНК в культуре клеток мышиных фибробластов и на процессы клеточного деления эпителия роговицы белых крыс.

Для того, чтобы решить вопрос о возможности влияния даларгина на процессы клеточного деления в системе in vitro были

проведены исследования на культуре клеток. Опыт,л с культурой клеток позволяют исключить участие интегративньтх систем в реализации эффекта даларгина.

экспериментальные данные свидетельствуя'!1 о том, что инкубация с даларгином вызвала стимуляции синтеза ДНК в культуре клеток мышиных фибробластов. ИМЯ под влиянием даларгина увеличился в 1,7 раза, №1 в 1,4 раза. ■

Другой модельной ситуацией для из,учения непосредственного влияния даларгина на процессы клеточного деления послужили опыты с эппликацией препарату на роговицу. Такой способ воздействия на одну роговицу и сопоставление показателей процессов клеточного деления со второй - контрольной,, на которую ап-плицировали изотонический раствор повареной соли, позволяет судить'о'непоередсчвенном влиянии препарата на пролифератив-кые процессы in vivo . Участие интегративньтх систем в регуляции клеточного деления в данном случае не исключается. Да-ларгин апплицйровали на правый глаз с интервалом 20 минут трижды в ¿3-14 часов. На левый глаз, служивший контролем, наносили эквиобъемное количество изотонического раствора повареной соли.. Для оценки эффектов повторных воздействий процедуру повторяла на протяжении 5 суток. Клеточное деление изучали через 4, 12 и 2i-4aca после нанесение препарата. Полученные данные свидетельствуот, что однократная аппликация даларгина не вызвала изменений процессов клеточного деления в эпителии роговины через 1 часа-после воздействия. Через 12 часов после нанесения препарата имело место достоверное возрастание величины ИМ в 2,2 раза, что оценивается нами как свидетельство увеличения скорости синтеза ДНК. Возрастания ИМ сопутствовало увеличение МИ у подопытных животных н 1,5 раза по

сравменил с контролем. Количество ДНК-синтезирующих ядер не претерпевало достоверных изменений. При повторных аппликациях даларгина имела место выраженная стимуляция синтеза ДНК через 1 часа в 1,8 раза, через 12 часов в 1,5 раза. Адекватного возрастания МИ мы не наблюдали на этих сроках исследования. Возможно, это связано с увеличением скорости самого митоза.

Представленные данные могут оцениваться как свидетельство непосредственного воздействия даларгина На процессы клеточного деления. В пользу этого свидетельствуют и данные С.Е.Спе-вака и соавторов (1987), Yíomsley J.K. et al(I982) о наличие опиатных рецепторов в различных тканях глаза. Данные о стимуляции пролиферативных процессов при непосредственном воздействии даларгина на клетки описаны нами впервые (С.С.Тимошин, Т.Д. Панькоьа, 1987). Установленная нами способность даларгина стимулировать процессы размножения клеток при местн<эм воздействии расширяет сферу потенциального применения препарата и ставит вопрос о получении новых лекарственных форм даларгина.

Влияние внутрибрюшинного введения даларгина на процессы клеточного деления эпителия роговицы белых Крьтс.

Стимуляция клеточного деления при введении опиоидных пептидов может осуществляться как за счет'непосредственного влияния, так и опосредованно через интегративные системы, участвующие в регуляции пролиферативных процессов. Для выяснения возможности влияния даларгина на процессы клеточного делений in vivo были проведены опыты с парентеральным введением препарата. Даларгин вводили внутрибрюшинно из расчета 10 мкг/кг в 8 часов. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили эквиобъем-но° количество изотонического раствора повареной соли. Клеточное деление изучали через каждые 4 часа после введения препа-

рата на протяжении 24 часов. Полученные данные свидетельствуют, что внутрибрюшинное введение даларгина индуцировало выраженную стимуляцию синтеза ДНК в эпителии роговицы во все сроки исследования на протяжении 24-х часов после вьецення препарата (рис.1). ИМЯ под влиянием даларгина увеличился в 1,73,5 раза, ИМ в 2,1-3,5 раза. Возрастание МИ наблюдали только через 4,8 и 12 часов после воздействия даларгина в 1,4-1,7 раза. В последующие сроки изменения МИ были недостоверны. Отсутствие стимуляции митотической активности через 1о, 20 и 24 часа после введения препарата фактически исключало временное рассогласование между синтезом ДНК и выходом клеток в митоз. Следует отметить, что соотношение фаз митоза, в частности содержание профаз в подопытной группе через 16, 20 и 24 часа, не претерпевало.существенных изменений по сравнению с контролем. Это косвенно свидетельствовало против ускорения самою митоза, которое могло нивелировать.увеличение числа делящихся клеток. Однако, окончательный ответ на поставленный вопрос нам дали результаты опытов с колхицином исключающим изменение скорости митоза в контроле и опыте. йивотним за 2 часа до забоя вводили вн.утрибрюшинно колхицин иэ расчета 0,2 мг на 100 г массы животных. Одновременно с внутрибрюшинным введением животным апплицировали 0,1 мл Ораствора колхинина на оба глаза. Опыты с колхицином-осуществляли- через 4, 12 и 21 часа после введения даларгина. При этом определяли митотичес-кий индекс заблокированных колхицином метафаз (МШШ. Внугри-брю'пинное введение колхинина выявило выраженную стимуляцию митотической активности п 1,8-2,7 раза. Среднесуточный МИКХ увеличивайся в 2,1 раза. Среднесуточный 1Ш гюд влиянием даларгина также увеличился в 2,1 раза. Эти данные объясняют при-

О/

ми! т

/о о

/5 12,5 10

7,5 5 2 5

12 т\ 8 Б ч

г

у

гэ £

п

и

£

Рис.1. Влияние однократного парентерального введения даларгина на клеточного деления эпителия роговицы белых крыс.

ЧАСЫ ПОСЛЕ

-воздействие

чину отсутствия адекватного возрастания Ж через 16-24 ч«са после введения даларгина. Она заключается з ускорении протекания самого митоза, маскирующим уьеличение числа делщихсп клеток.

Таким образом, один из механизмов стимуляции процессов клеточного деления псд влиянием даларгина заключается в ускорении темпов сзмого митоза. Кроме того, даларгин ускоряет прохождение клетками премитотического периода. Согласно данным литературы (М.Г.Чумак, 1953;■ С.С.'Химозин, 1У32), минимальная продолжительность Gg -периода в роговице крыс в утренние часы составляет 4-5 часов. Поэтому, увеличение МИ через 4 часа после введения даларгина обусловлено, по-видимому, сокращением длительности о2 -периода или.выходом клеток из Q¿ -покоящейся фракции. Увеличение интенсивности метки, имел-шее место во все сроки исследований, начиная с 8 часов после введения препарата,;является свидетельством повышения скорости синтеза- ДНК, а двухкратное возрастание среднесуточного ИМЯ отражает общее увеличение пролиферативной фракции.

' В опытах с пятикратным внутрибрхгаинным введением даларгина препарат вводили из расчета 10 мкг/кг 5 раз на протяжении 5 суток в 14 часов. Клеточное деление изучали через 24 часа после введения даларгина. Пятикратное внутрибрюшинное введение даларгина зызьало стимуляций синтезз ДНК в эпителии роговицы. Об этом свидетельствует возрастание ИМЯ в 2 раза по сравнения с контролем.- Hsi, косвенным образом характеризующая скорость синтеза .ДНК, не претерпевала достоверных изменений. Изменения МИ. - подопытной группе по сравнения с контролем носили недостоверный характер. Возможно, это объясняется, как и з предыдущих наших исследованиях,ускорением самого

митоза.

'1аким образом, результаты экспериментов указывают на од-исчаправленность характера изменений процессов клеточного деления при парентеральном введении даларгина, при аппликации его на роговицу и при добавлении в культуру клеток, что можно расценивать как свидетельство прямого стимулирующего действия препарата на клеточное деление.

К моменту разработки лекарственных форм даларгина в литературе' имелись данные о стимулирующем влиянии препарата на регенерационные процессы (И.М.Шейман и соавт., 1985). Авторы лишь предполагали о возможном влиянии препарата на процессы клеточного деления. Способность даларгина стимулировать пролиферативные процессы in vivo описана нами Впервые (Т.Д. Панькова и соавт., 1988).

Влияние различных доз даларгина на процессы клеточного деления эпителия роговицы белых крыс.

При изучении влияния различных доз даларгина на процессы клеточного деления было установлено, что стимуляция синтеза ДНК и Ш имела место в широком диапазоне доз препарата, от 0,1 мкг/кг до I мкг/кг (рис^2). Максимальная активация синтеза ДНК и МЛ (через 12 часов после введения даларгина) наблюдалась в дозе IÜ0 мкг/кг. После превышения оптимальной дозы, эффект даларгина уменьшался вплоть до полного исчезновения в дозе 10 мг/кг. Но данным ряда авторов (В.¿.Виноградов, В.М.Полонский, 1986), именно в этих дозах даларгин начинает про.шкать через гематоэнцефалический барьер, взаимодействуя с оииатными рецепторами мозга. Представляет интерес тот факт, что в наашх опытах даларгин проявил стимулирующий эфрект в ничтожно малой дозе (0,1 мкг/кг), когда зарегистрировать не-

% к контролю 180

160

140

120 100 80

уровень контроля

МИ — ИМЯ—

4 чпг'п

0,1 с контролю

10

100

1000 юооо

1000 10000

Рис.2. Влияние различных доз даларгина на процессы клеточного деления эпителия рогоптш бчлнх крыс.

специфическое взаимоде/ствие в какой-либо форме практически невозможно.

Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в эпителиоцитах языка, фундального отдела желудка и тимуса.

Для проверки закономерности изменений пролиферативных процессов под воздействием даларгина изучалось влияьие препарата на эпителий языка, фундальногч отдела желудка и тимуса. Даларгин вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг в 14 часов. Контрольные животные получали эквиобъемное количество изотонического раствора повареной соли. Эвтаназию подопытных и контрольных животных осуществляли через 2i часа после введения препарата. Полученные данные свидетельствуют, что однократное вну-трибрюшинвое введение даларгина индуцировало увеличение содержания ДНК-синтезирующих ядер в языке в 3,3 раза, в желудке в 1,4 раза, в тимусе в 2,? раза. Наши данные о стимуляции даларгином синтеза ДНК в эпителии желудка нашли подтверждение в клинических исследованиях, проведенных в нашей лаборатории. Даларгин стимулировал пролиферативные процессы в слизистой желудка и двенадцатиперстной кишке у больных с дуоденальной язвой (С.С.Тимошин и соавт.,1991). Способность даларгина активировать синтез ДНК в тимусе объясняет иммуномодулирующие свойства препарата (В.А.Бейко, Е.М.Васильченко, 1985; E.H. Александрова и соавт.,1988).

Таким образом, нами было установлено, что даларгин стимулирует процессы клеточного деления в широком диапазоне доз и б различных эпителиальных тканях.

Диализ роли опиатных репепторов в реализации действия даларгина на процессы клеточного деления.

Представлялось целесообразным провести оценку роли опиатных

рецепторов в стимуляции клеточного деления. Блокада опиатных рецепторов с 'помощью антагонистов является одним "э методов оценки роли этих структур в том или ином процессе (Р.Реттиг и соавт., 1983). Проведение экспериментов с аппликацией налок-сона на роговицу било осуществлено для оценки возможности непосредственной блокады опиатных рецепторов эпителия роговицы и выключения эффекта эндогенных лигандов. Можно было предполагать, что если даларгин, как аналог эндогенных лигандов опиатных рецепторов, вызвал стимуляцию пролиферативных процессов, то налоксон, как антагонист опиатных рецепторов, должен инги-бировать процессы клеточного деления. Однако, результаты опытов свидетельствовали, что однократная аппликация налоксона вызвала стимуляцию синтеза ДНК в эпителии роговицы на всех трех сроках исследования. Это подтверждается возрастанием ИМ через 4 часа после нанесения препарата в 2 раза. Через 12 и 21 часа наряду с возрастанием ИМ имело место достоверное увеличение ДНК-синтезирующих ядер в 1,6-1,8 раза. Достоверное уменьшение МИ через 12 и 24 часа может быть обусловлено ускорением митоза. При повторных аппликациях налоксона мы не наблюдали достоверных изменений показателей процессов клеточного делег-шя на всех сроках исследования.

Внутрибрюшинное введение налоксона в дозе 10 мкг/кг также вызвало стимуляцию пролиферативных процессов в эпителии роговицы как при однократном так и при пятикратном воздействии препарата. При введении налоксона в дозе 200 мкг/кг наблюдалось достоверное уменьшение числа делящихся клеток в эпителии роговицы п 2 раза. ИМИ при этом уменьшился в 1,4 раза (таб.1).

Таким образом, введение налоксона в дозе 200 мкг/кг вызвало угнетение процессов клеточного делении в эпителии роговицы.

Таблица I

Влияние внутрибрюшинного введения налоксона в дозе 200 мкг/кг на процессы клеточного деления эпителия роговицы ( М ~ м)

Исследуемые МИ, ИМЯ, ИМ

группы % %

Контрольная 9,5±1,08 5,7-0,32 17,3-1,54

Подопытная 4,6±0,39х 4,1±0,14х 14,1±1,15

х - различия статистически достоверны по отношению к контролю."

По-видимому, блокада опиатных рецепторов н^локсоном делает клетку нечувствительной к стимулирующему действию эвдогенньтх лигандов опиатных рецепторов. Это является одним из свидетельств вовлеченности опиатных рецепторов в регуляцию процессов клеточного деления. Следует отметить, что этот факт находит косвенное подтверждение в исчезновении стимулирующего эффекта налоксона при повторных аппликациях препарата, что оценивается нами как эффект увеличения дозу.' Возможные причины различий, наблюдаемые при низких й высок-тх дозах налоксона, могут расцениваться как свидетельство неодйнаковой роли популяций и суЗ-популяций рецепторов в регуляции клеточнсго деления. Объясняя стимулирующее влияние блокатора опиатных рецепторов-налоксона * в ряце экспериментальных ситуаций» Вгиегоп- М.Е. » Магие1о Е. т. (1988) выдвигают предположение, что в тех случаях, когда эффект опиатов реализуется Через дельта-рецептор, налоксон, блокируя мю-рецептор, демаскирует дельта-рецептор, делает его белее доступным для опиатов. По-видимому, этим тсе можйо объяснить стимуляцию клеточного деления под влиянием низких доз на-

локсона в первой серии опытов, тогда как в дозе 200 мкг/кг на-локсон блокировал и дельта-рецепторы, вызывая торможение клеточного деления.

Для подтверждения роли опиатных рецепторов в осуществлении митогенного эффекта даларгина были проведены эксперименты с предварительным введением налоксона. Результаты исследования свидетельствуют, что блокада опиатных рецепторов налоксоном предотвратила стимуляцию процессов клеточного деления далар-гином: изменения показателей МИ, ИМЯ, ИМ нйсили недостоверный характер (таб.2).

Таблица 2

Влияние даларгина на процессы клеточного деления эпителия роговицы при блокаде опиатных рецепторов налоксоном (М*м)

Исследуемые МИ, • ИМЯ, . ИМ

группы ' 1 %

Контрольная 2,3-0,47 . 6,2*0,16 14,6*0,99

Введение даларгина 5,9*1,43х II,2*0,54х 24,4*0,99х

Контрольная 12,0-0,80 5,7*0,17 14,7*0,46

Введение да-

ларгина и налоксона 12,1-0,81 6,0*0,22 16,7*0,93

храэличия статистически достоверны по отношению к контролю. Ьведение даларгина,как и в предыдущих сериях опытоз, стимулировало митотическую активность и синтез ДНК в эпителии роговицы.

Полученные данные служат свидетельством того, что даларгин осуществляет свое стимулирующее влияние через специфические ониатнне рецепторы.

Подтверждением этого вывода послужили результаты опытов с группой синтетических аналопов лей-энкефалина, близких по хи-мйческому строению к даларгину. Два пептида, являющихся агонис-тами опиатных рецепторов, также как и даларгин, вызывали увеличение числа делящихся клеток и активировали.синтез ДНК. Через 24 часа после введения исследуемых пептидов Ш и МИКХ увеличивались в 2,2 раза, ИМЯ - в 1,5 раза. Интенсивность метки, косвенным образом свидетельствующая о повышении скорости синтеза ДНК, возросла в 1,7 раза. В то же время пептиды, не являющиеся лнгандами опиатных рецепторов, не вызывали достоверных изменений числа делящихся клеток и уровня синтеза ДНК.

Результаты настоящей гртапы исследований позволяют сделать заключение, что в реализации стимулирующего действия даларгина на пролиферативные процессы важным фактором является его взаимодействие с опиагными рецепторами.

ВЫВОДИ

1. Лиганд опиатных рецепторов даларгин оказывает выраженное стимулирующее воздействие на процессы синтеза ДНК й культуре клеток мышиных фибробластов.

2. Аппликация даларгина на роговицу белых крыс вызывает стимуляцию пролиферативных процессов в эпителии как при однократном так и при повторных воздействиях.

3. При вн.утрибрющинном введении препарата в дозе 10 мкг/кг наблюдается стойкая активация синтеза ДНК на протяжении 24х часов в эпителии роговицы белых крыс. Это происходит е результате ускорения темпов самого митоза, сокращения длительносьи премнтотическогс периода, в результате возрастания скорости синтеза ДНК, а также увеличения общей пролиферативной фракции.

4. Даларгин также оказывает стимулирующее воздействие на

процессы клеточного деления в эпителии рогорипы при повторных введениях.

5. Даларгин активирует пролифергтивнге пронесся з -»пителии роговицы в широком диапазоне доз от 0,1 мкг/кг до 1 к^/кг. Максимальная стимуляция наблюдается в дозе 100 мкг/кг. При повышении этой дозы имеет место постепенное "ускользание" эффекта.

6. Стимуляция синтеза ДНК под влиянием цаларгина нчбл-щя^т ■ ся таэте в эпителии языка, фундального отдела желудка и коркового вещества тимуса.

7. Реализация митогенного эффекта даларгина опосредуется через его взаимодействие с опиагными рецепторами.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вчияние лигандов опиоидных рецепторов на процессы клеточного деления эпителия роговицы белых крыс // Бял.эксперич. биологии и медицины. - 1987 - Т.104, V-8. - С.229-230.

Совместно с С.С.Тимошиным и М.И.Титовым.

2. Влияние стабильного аналога лей-энкефалина даларгина на процессы клеточного деления эпителия роговины белых крнс // Бил.эксперим.биологии и медицины. - 1988. - T.Í05, '"7. -С.97-98.

Совместно'с С.С.Тимэшиным.М.И.Радивозом и Н.ИЛитсвым.

3. Экспериментапьное и клиническое изменив механизмов адаптационного действия нейропептидов // Годовая итоговая научная конференция. - Хабаровск:1989. - С.46.

■ Совместно с А.Г.Александровичем,С.А.Алексеенкф,O.A.Аносовой.

4. Механизмы адаптационного действия опиоидных пептидов // Тез.докладов 4го Всес.съезда патофизиологов. -' Кишинев:198Э.-

'1. - С.о-Ю.

Совместно с С.С.Тимошиным.С.И.Швецом.Н.Б.Мурзиной и Г.Г.Суховой.

Ь. Доказательства реализации стимулирующего эффекта далар-гина на процессы клеточного деления через опиатные рецепторы // Б )л.л;сперим.биологии и медицины. - 1990. - Т.НО, №7. -С.96-98. Совместна с С.С.Тимошиным.,