Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние инокуляции чистыми и смешанными культурами диазотрофов на трансформацию азота в ризосфере растений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние инокуляции чистыми и смешанными культурами диазотрофов на трансформацию азота в ризосфере растений"

На правах рукописи

СКВОРЦОВА Наталия Геннадьевна

Влияние инокуляции чистыми и смешанными культурами диазотрофов на трансформацию азота в ризосфере растений

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1998 г.

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета Почвоведения Московского Государственного Университета им.М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор М.М.Умаров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.Т.Емцев кандидат биологических наук, доцент В.С.Егоров Ведущее учреждение: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Защита диссертации состоится "26" мая 1998 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета К.053.05.86 в МГУ им.М.В.Ломоносова.

Адрес: 199899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет Почвоведения, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Почвоведения МГУ.

Автореферат разослан "а'//" (Л/'^ал.йИ 1998 г. Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета, а отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направить по адресу: 199899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет Почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.П.Бабьева

Актуальность темы. Наличие доступного растениям азота является важнейшим фактором продуктивности агроэкосистем. Одним из перспективных путей обеспечения сельскохозяйственных растений азотным питанием является фиксация атмосферного азота при инокуляции культурами диазотрофных бактерий. Важность этой проблемы подтверждается ее обсуждением на различных постоянно проводящихся конгрессах и международных симпозиумах.

К настоящему времени получены многочисленные данные о достоверном положительном влиянии на небобовые растения инокуляции чистыми культурами бактерий pp.Aquaspirillum, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus и др. (Умаров, 1986; Govedarica, Milosevic, 1997; Okon, 1998), причем увеличение урожая в производственных условиях достигало 30%. Однако основным препятствием для широкого использования чистых культур остается низкая воспроизводимость результатов. Одним из способов решения этой проблемы может быть использование смешанных культур, поскольку имеющиеся данные подтверждают эффективность инокуляции такими культурами (Kammas, Kaiser, 1997; Tchebotar, 1997). Смешанные культуры могут быть как естественными, если они выделены из почвы, так и искусственными, когда смешиваются чистые культуры азотфиксирующих микроорганизмов. Последние мы использовали в своей работе.

Широко распространено мнение, что инокуляция всегда имеет

положительный эффект на рост растений и на азотный баланс в почве.

Но, согласно современным представлениям, процессы азотфиксации и

денитрификации могут протекать одновременно даже в одном

биологическом объекте, и, тем более вероятно, в ризосфере и ризоплане

растений (Werner, Kilian, 1995). Поэтому очевидно, что эффективность

1

инокуляции может прямо определяться соотношением активности этих процессов в прикорневой зоне. Несмотря на это, в известной нам литературе нет сведений о комплексной оценке результатов инокуляции.

Целью работы явилось изучение влияния инокуляции чистыми и смешанными культурами диазотрофных бактерий на основные звенья азотного цикла в ризосфере - азотфиксацшо, денитрификацию и нитрификацию.

В задачи исследования входило:

1. Выделить коллекцию почвенных диазотрофов, широко распространенных в ризосфере растений.

2. Изучить эту коллекцию в отношении процессов азотфиксации, денитрификации и нитрификации в чистых культурах, в ассоциации со стерильными растениями и при внесении в почву под растения.

3. Изучить влияние инокуляции смешанными культурами, созданными на основе бактерий рода Pseudomonas и Bacillus polymyxa, на азотфиксацию, денитрификацию и нитрификацию в ризосфере растений.

4. Изучить способность исследуемых штаммов к выделению физиологически активных веществ и фунгистатических соединений.

5. Оценить и сравнить влияние инокуляции чистыми и смешанными культурами на баланс азота и урожай сельскохозяйственных растений.

Научная новизна. Впервые проведено сопряженное изучение

азотфиксации и денитрификации у чистых и смешанных культур

азотфиксирующих микроорганизмов. При развитии в ризосфере

стерильных растений коллекция бактерий рода Pseudomonas четко

2

разделилась на три группы по способности преимущественно проводить процесс азотфиксации или денитрификации; эта закономерность сохранилась и в вегетационных опытах. Подтверждено, что инокуляция растений смешанными культурами микроорганизмов имеет больший уровень воспроизводимости результатов, чем инокуляция чистыми культурами. Показано, что инокуляция смешанными культурами из группы активных азотфиксаторов обеспечивает не только увеличение урожая, но и прирост содержания общего азота в растениях.

Практическая ценность. Получега1ые данные свидетельствуют о перспективности использования смешанных культур диазотрофных микроорганизмов для инокуляции небобовых растений. Результаты работы позволят проводить целенаправленный отбор культур бактерий для инокуляции растений. Полученные данные используются в курсе лекций по биологии почв, читаемых на факультете Почвоведения МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, тезисы (3).

Апробация работы. Основные положения работы доложены на VIII Восточно-Европейском симпозиуме по биологической фиксации азота Nitrogenfix-92 (Саратов, 1992) и X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 130 стр. машинописного текста, список литературы из 147 названий, из них 61 - зарубежные.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования явилась коллекция из 140 штаммов

бактерий рода Pseudomonas, выделенных нами из ризосферы ячменя,

з

пшеницы и клевера. Кроме того, для создания смешанных культур мы использовали штамм N17 Bacillus polymyxa, выделенный и апробированный в нашей лаборатории ранее.

Чистые культуры псевдомонад выделяли на безазотной среде Козера с различными источниками углерода и 4% глицерина, в дальнейшем поддерживали на среде CS-7 для Pseudomonas (Бонарцева, Мышкина, 1989), а чистые культуры Bac.polymyxa поддерживали на среде Федорова-Калининской (Калининская, 1967).

Активность азотфиксации во всех опытах определяли ацетиленовым методом в модификации кафедры биологии почв МГУ (Методы..., 1991) на газовом хроматографе CHROM-4-1 с пламенно-ионизационным детектором (длина колонки 2,2 м, диаметр 3 мм, наполнитель Spherosil+10% ЫазРС>4, давление газа-носителя (Ar) - 2,5 атм, давление водорода - 0,8 атм, воздуха — 0,4 атм).

Определение активности денитрификации проводили по накоплению закиси азота. Газы анализировали на газовом хроматографе Московского опытного завода "Хроматограф", модель 3700/4, длина колонки 2 м, наполнитель "Полисорб-1".

В модельных опытах изучали азотфиксацию и денитрификацию в

ассоциациях бактерий со стерильными растениями рапса (Brassica

napus L.). Семена рапса стерилизовали концентрированной Н2О2 в

течение 30 минут, отмывали стерильной водой и проращивали на

чашках Петри с агаризованной средой Федорова-Калининской. Через

одни сутки отбирали стерильные проростки, переносили в пробирки

объемом 60 мл со стерильной смесью Гельригеля без азота и

инокулировали 2 мл суспензии микроорганизмов, отмытых от среды

роста и стандартизированных путем разведения до конечной

концентрации 106 кл/мл. Культивирование растений вели в

4

климатической камере типа Рое1гоп 3001-01 при температуре днем 25°С, ночью - 18°С, влажносги 60%, освещенности 20 клк. На 14-ые сутки измеряли активность ацетиленредукции и нитратредукции и учитывали зеленую массу растений. Повторность опыта 10-кратная. По результатам этих опытов производили отбор культур бактерий для дальнейших исследований.

Вегетационные опыты проводили совместно с кафедрой агрохимии на нестерильных растениях ячменя, редиса и злаковых трав (тимофеевка луговая, ежа сборная, овсяница полевая). Для инокуляции использовали трехсуточные культуры бактерий, отмытые от среды роста и ресуспендированные в стерильной водопроводной воде. Семена ячменя и редиса перед посевом замачивали на 1 час в суспензии микроорганизмов; кроме того, во время посева в почву дополнительно вносили эту суспензию из расчета 1 мл/семя. Инокуляцию злаковых трав производили после первого укоса из расчета 3 мл на растение. Растения выращивали в вегетационных сосудах на 5 и 32 кг почвы на открытом воздухе в сетчатом павильоне кафедры агрохимии. Почва -дерново-подзолистая среднемощная легкосуглинистая. Повторность опытов 3-6 кратная.

Процесс нитрификации изучали, измеряя в динамике концентрацию ионов МН4+ и ЫОз" в ризосфере инокулированных и контрольных растений с помощью ионселективных электродов и иономера И-120.1.

Приживаемость внесенных в прикорневую зону бактерий исследовали, используя стрептомицинустойчивые штаммы, полученные методом градиентного агара (Герхард, 1984).

Способность исследуемых бактерий выделять физиологически активные вещества (ФАВ) определяли по методике Института

5

физиологии растений: калиброванные по размеру семена рапса и редиса замачивали в суспензии микроорганизмов (опыт) и в стерильной воде (контроль), проращивали в течение 5 суток и затем измеряли длину стеблей, корней и массу проростков. Наличие ауксинов и гиббереллинов в культуральной жидкости определяли при помощи биотестов с эпикотилями фасоли сорта "Сакс" и гипокотилями салата сорта "Берлинский" (Кефели с соавт., 1982).

Фунгицидное и фунгистатическое действие культур определяли методом агаровых блоков.

Содержание нитратов в корнеплодах редиса измеряли ионометрическим методом.

Общий азот в растениях определяли по Кьельдато.

Статистическую обработку проводили стандартными методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1 .Характеристика чистых культур псевдомонад

Коллекция бактерий р.РяеисЬтопаз была выделена из ризосферы ячменя, пшеницы и клевера. По результатам изучения морфологических и физиолого-биохимических признаков она была отнесена к видам Рэ.сагуорЬуШ, Рэ.аепцрпоза и РБ.АиогеБсеш.

Изучение коллекции псевдомонад в чистых культурах показало, что все изучаемые штаммы проявили способность к денитрификации, и 116 из 140 - проявили способность к азотфиксации. Активность денитрификации у большинства псевдомонад была высокой (0,02 до 35 мкмоль ИгОЛЭа/час), а активность азотфиксации изменялась в пределах 0,09 - 9,0 нмоль СгНДЭа/час, что является невысокими значениями. Какой-либо корреляции между этими показателями у одних и тех же культур не было обнаружено.

В то же время при инокуляции ими стерильных проростков рапса выявились существенные отличия от чистых культур: у некоторых штаммов псевдомонад наблюдалась преимущественная активность только одного из процессов, тогда как активность другого оставалась низкой. По результатам этого опыта коллекцию разделили на три группы (табл.1):

1. Штаммы, проявляющие высокую активность азотфиксации (1329 нмоль СгН^растение/час) и не проводящие процесс денитрификации (группа «активные азотфиксаторы» - "ААФ"). Инокуляция культурами из этой группы увеличивала биомассу проростков по сравнению с контролем на 50-100% (№№ 56, 57, 61, 66,93,96,106, 115-117,120,123).

2. Штаммы, проявляющие высокую активность денитрификации (100-200 мкмоль ЫгО/растение/час) и обнаруживающие очень слабую способность к ацетиленредукции («активные денитрификаторы» - "АДН"); прирост биомассы проростков составил в среднем 25% (11, 13, 15-22).

3. Штаммы третьей группы, которые характеризовались невысокими значениями азотфиксации и денитрификации (0,5-8 нмоль этилена; 2-60 мкмоль закиси азота). Прирост биомассы растений составил примерно 35%.

Ранее некоторые исследователи отмечали подобную неоднородность проявления азотфиксации при взаимодействии диазотрофных бактерий с растениями или с растительными экстрактами (Чумаков и др., 1992; Эль-Коми, 1992). Согласно этим данным, штаммы с высокой активностью азотфиксации незначительно увеличивали ее в присутствии растительного экстракта, а бактерии с низкой активностью ацетиленредукции существенно повышали ее. В отличие от этих работ,

7

разделение нашей коллекции происходило по результатам активности двух процессов - азотфиксации и денитрификации.

Табл.1

Активность азотфиксации, денитрификации и прирост биомассы проростков рапса при инокуляции бактериями р.Р8еи<1отопа&

I груши "активные азотфиксаторы" (ААФ) II группа "активные дснитрификаторы" (АДН) III группа "штаммы с промежуточной активностью"

Количество 8% коллекции 7% коллекции 85% коллекции

Прирост биомассы проростков 50-100% 20-30% 30-40%

Активность азотфиксации 13-29 нмоль СгН^растение/час "следы" 0,5-8 нмоль С2Н.4/растение/час

Активность денитрификации не обнаружена в пределах чувствительности прибора 100-200 мкмоль КгО/растение/час 2-60 мкмоль Ы20/растение/час

Таким образом, сравнительно однородная по показателям активности азотфиксации и денитрификации коллекция чистых культур псевдомонад оказалась гетерогенной при взаимодействии с растениями.

Можно полагать, что различия по показателям активности азотфиксации и денитрификации, выявленные в этих опытах, отражают наиболее общие свойства поведения природных популяций псевдомонад при взаимодействии их с растениями. Однако более точно судить об этом можно только по результатам, полученным в условиях, максимально приближенных к естественным. С этой целью были проведены вегетационные опыты с растениями злаковых трав, ячменя и

редиса. Схема опытов приведена в табл.2.

8

Схема вегетационных опытов

Табл.2

Злаковые травы

Объем сосуда - 32 кг Повторность - 3

Условия: на открытом воздухе, сетчатый павильон.

Варианты инокуляции: контроль без инокуляции инокуляция А АФ- i

ААФ-1 + Bac.polymyxa (жидкая культура) ААФ-1 + Bac.polymyxa (адсорбированная на торфе) инокуляция ААФ-2

ААФ-2 + Bac.polymyxa (жидкая культура) ААФ-2 + Bac.polymyxa (адсорбированная на торфе) инокуляция АДН-1

АДН-1 +- Bac.polymyxa (жидкая культура) АДН-1 + Bac.polymyxa (адсорбированная на торфе) инокуляция АДН-2

АДН-2 + Bac.polymyxa (жидкая культура) АДН-2 + Bac.polymyxa (адсорбированная на торфе) инокуляция штаммом промежуточной группы Промежуточная гр. + Bac.polymyxa (жидкая культура) Промежуточная гр. + Bac.polymyxa (адсорбированная на торфе) инокуляция Bac.polymyxa (жидкая культура)

инокуляция Bac.polymyxa (адсорбированная на торфе)_

Ячмень

Удобрения (во всех вариантах): СаНР04(40 кг/га д.в.), КС1 (60 кг/га д.в.) Варианты азотных удобрений (NH4NO3): нет, 70 кг/га, 150 кг/га Объем сосуда - 5 кг Повторность - 4

Условия, на открытом воздухе, сетчатый павильон.

Варианты инокуляции: контроль без инокуляции инокуляция ААФ-1 инокуляция АДН-1

инокуляция штаммом промежуточной группы инокуляция ААФ-1 + Вас polymyxa (жидкая культура)

инокуляция ААФ-1 + Bac.polymyxa (адсорбированная на торфе)_

Редис

Варианты азотных удобрений (KNO3): нет, 90 кг/га Объем сосуда - 32 кг Повторность - 6

Условия: на открытом воздухе, сетчатый павильон.

Варианты инокуляции: контроль без инокуляции инокуляция ААФ-1

инокуляция АДН-1_

9

2. Азотфиксация, денитрификация и нитрификация в ризосфере при

инокуляции растений редиса, ячменя и злаковых трав чистыми и смешанными культурами бактерий p.Pseudomonas и Bacillus polvmyxa Для вегетационных опытов из каждой группы псевдомонад выбрали по одному-два наиболее типичных штамма и использовали их в серии вегетационных опытов по инокуляции растений (табл.3). В опытах использовали Ps.caryophylli 120 и 123 из 1-й группы штаммов, Ps.fluorescens 11 и Ps.aeruginosa 19 из П-ой группы штаммов; Ps.caryophylli 131 из Ш-ей группы. Для инокуляции использовали как чистые, так и смешанные культуры псевдомонад с Bac.polymyxa. Использовали два варианта внесения смешанных культур: в жидком виде и адсорбированном на стерильном торфе. Опыты проводили на растениях злаковых трав (тимофеевка лутовая, ежа сборная, овсяница полевая), ячменя и редиса.

Табл.3

Культуры, использованные в опытах по инокуляции растений

Название культур Условное название

Ps.caryophylli №120 "ААФ-1"

Ps.caryophylli №123 "ААФ-2"

Ps.aeruginosa №11 "АДН-1"

Ps.fluorescens №19 "АДН-2"

Ps.caryophylli №131 "промежуточная группа (пр.)"

Bac.polymyxa №17 (жидкая) "Вр"

Bac.polymyxa №17 (на торфе) "Врт"

Как и в опытах со стерильными растениями, штаммы чистых

культур из 1-й группы наиболее существенно повышали активность

азотфиксации в ризосфере злаковых трав: в 5-6 раз по сравнению с

контролем (рис.1). Активность азотфиксации у штаммов чистых

10

200 -I и 180 и) ........................

| макс. дов. иит.

о о) . . :

% 3 120 -о 2

- • - ' ■ - ■ !

и —

н о - -

Й 8 20 -в ; га п г-1

П п • п П Пп.п и

Рис. 1. Максимальная активность азотфиксации в ризосфере злаковых трав при инокуляции чистыми и смешанными культурами бактерий

редис

ячмень

Рис.2.Максимальная активность азотфиксации в ризосфере ячменя и редиса при инокуляции чистыми и смешанными культурами бактерий

140 120

100 80 60 40 20 0

1 т

.1 мате. див. ШГГ.

-+СЦ

+ .,:..,И,||.)ЕЗ,|13.| +СЦ-—|-1 И 1 гл 1 — 1 гп1

/»V ^ //

/> ^ // ^ //

Без азотных удобрений

Доза азота 70 кг/га

Доза азота 150 кг/га

Рис 3. Максимальная активность азотфиксации в ризосфере ячменя при использовании азотных удобрений

без азотных удобрений

доза азота 90 кг/га

Рис.4, Максимальная активность азотфиксации в ризосфере редиса при использовании азотных удобрений

культур из Н-ой группы находилась на уровне контроля. Штаммы из Ш-ей группы повышали активность ацетиленредукции в 2,5 раза в ризосфере злаковых трав.

При инокуляции ячменя и редиса чистыми культурами псевдомонад наблюдалась аналогичная картина (рис.2) - штаммы чистых культур из I группы увеличивали активность азотфиксации в ризосфере растений в 2 раза по сравнению с контролем без инокуляции.

Инокуляция редиса чистыми культурами микроорганизмов на вариантах с внесением 90 кг/га азотных удобрений приводила к снижению активности ацетиленредукции по сравнению с вариантом опыта без внесения удобрений (рис.4).

Таким образом, разделение нашей коллекции на функциональные группы по активности азотфиксации сохранилось и в условиях вегетационных опытов: инокуляция повышала активность ацетиленредукции в ризосфере растений по сравнению с неинокулированным контролем.

Выявленные закономерности повторились и при смешивании исследуемых штаммов псевдомонад с Вас.ро1утуха. В целом активность азотфиксации при инокуляции смешанными культурами бактерий была выше, чем при инокуляции чистыми культурами. При этом псевдомонады из I группы в смеси с Вас.ро1утуха обеспечивали существенное повышение активности азотфиксации в ризосфере инокулированных растений.

Так, в ризосфере злаковых трав эта смесь повышала активность

азотфиксации примерно в 26 раз (рис.1), а в ризосфере ячменя на

вариантах опыта без применения азотных удобрений - в 16 раз (рис.2).

Смешанная культура псевдомонад из второй группы с Вас.ро1ушуха

практически не оказывала влияния на активность ацетиленредукции в

13

ризосфере растений. Штаммы промежуточной группы в смеси с Bac.polymyxa повышали активность азотфиксации в 3 раза по сравнению с контролем без инокуляции. В опыте по инокуляции ячменя с внесением азотных удобрений нами были получены следующие результаты (рис.3): внесение азотных удобрений в количестве 70 и 150 кг/га нивелирует разницу в активности азотфиксации между вариантами опыта и контролем при общем снижении активности азотфиксации в 1,5-2 раза по сравнению с вариантами опыта без внесения удобрений. Заметное исключение составила та же смешанная кулыура псевдомонад из 1-й группы (ААФ-1) с Bac.polymyxa, при инокуляции которой активность азотфиксации в ризосфере растений возрастала примерно в 7-8 раз по сравнению с контролем без инокуляции.

Активность денитрификации в ризосфере растений в условиях вегетационных опытов была обнаружена только на вариантах с использованием минеральных азотных удобрений. Динамика процесса денитрификации такова, что его максимум приходится на те моменты, когда содержание нитрат-иона в почве максимально. Обычно это начальный период развития растений сразу после внесения удобрений.

На рисунке 5 приведены максимальные значения активности денитрификации в серии опытов с использованием минеральных азотных удобрений.

При инокуляции редиса чистыми культурами псевдомонад только одна культура - активный денитрификатор - достоверно (в 2 раза) увеличивала активность денитрификации в ризосфере растений.

Инокуляция ячменя чистыми и смешанными культурами на

вариантах опытов с внесением умеренных доз азотных удобрений не

влияла на активность денитрификации в ризосфере. В то же время на

вариантах с внесением повышенных доз (150 кг азота на гектар) чистые

14

СИ

к К -в-8

250 200 150 100 50

■чакр, дед. ИНТ.

Ид

л.

д

/ « / *

>. л

ф ^

К

_гз_

^ 8

N

I

„ и <? *

и

^ с?" V4 £

70 кг/га

150 кг/га

ячмень

90 кг/га редис

Рис.5. Максимальная активность денитрификации в ризосфере ячменя и редиса при инокуляции чистыми и смешанными культурами бактерий

и смешанные культуры из группы активных денитрификаторов достоверно повышали активность денитрификации в ризосфере (в 2 раза и 6 раз соответственно), а штаммы двух других групп не влияли на данный параметр.

Следующее изученное нами звено азотного цикла - процесс нитрификации. Влияние инокуляции на динамику концентрации подвижных соединений азота проявлялось в том, что в ризосфере инокулированных растений регистрировалось достоверно больше как ионов аммония (в 2 раза выше контроля без инокуляции), так и нитрат-ионов (в 3 раза больше контроля). Однако корреляции между группами штаммов по этому показателю не обнаружено. В целом, изменение активности процесса нитрификации в вегетационный период не имело закономерного характера: периоды увеличения активности сменялись ее снижением без какой-либо связи с динамикой других процессов.

3 .Динамика численности чистых и смешанных культур

микроорганизмов в ризосфере растений

Для доказательства того, что внесенные в прикорневую зону штаммы сохраняются и приживаются, изучалась динамика численности внесенных популяций в опытах по инокуляции ячменя, редиса и злаковых трав. Она в целом была сходной для всех групп внесенных в почву бактерий. Показано, что штаммы из всех трех групп успешно приживались в ризосфере и ризоплане, их численность стабилизировалась на уровне 107 кл/г корня, тогда как вдали от корней численность внесенной популяции составляла 104-105 кл/г почвы, что косвенно свидетельствовало о возможности активного влияния микроорганизмов на процессы трансформации азота в почве.

Изучение динамики численности внесенных культур также показало, что активнее размножались в прикорневой зоне псевдомонады и их количество стабилизировалось на уровне 10' кл/г корней, тогда как численность бацилл была на порядок ниже.

4.Влияние инокуляции на урожайность растений и качество растительной продукции

Окончательный вывод о результатах инокуляции был сделан на основе оценки полученного урожая. Как можно видеть на рис.6 и 7, при инокуляции растений чистыми культурами псевдомонад из I группы урожай злаковых трав увеличился на 37-41% по сравнению с неинокулированным контролем; ячменя - на 5-15%; зеленая масса редиса возросла на 41-43%, а урожай корнеплодов - на 19-37%. Штаммы из второй группы незначительно увеличивали урожай редиса, но повышали урожай ячменя на 10% и злаковых трав - на 52% (АДН-1). Штаммы Ш-ей группы увеличивали урожай растений в среднем на 12%. Следует отметить, что, хотя практически все микроорганизмы достоверно повышали урожай растений, псевдомонады из 1-ой группы влияли и на качество урожая (рис.8), так как они увеличивали содержание общего азота в растениях злаковых трав и редиса на 0,20,5%, в то время как бактерии из других групп практически не влияли на этот параметр. В то же время инокуляция чистыми культурами псевдомонад из всех трех групп не изменяла содержания общего азота в зерне ячменя (рис.9).

В отличие от чистых культур инокуляция смешанными культурами бактерий р.РзеисЬтопаз с Вас.ро1утуха дала наибольшую прибавку урожая (рис.10): 25-77% - для I группы, 13-56% - для II

Рис.6. Урожай злаковых трав при инокуляции чистыми культурами бактерий

контроль ААФ-1 АДН-1 юштроль ААФ-1 АДН-1

без азотных удобрений доза азота 90 кг/га

Рис.7. Урожай редиса при инокуляции чистыми культурами бактерий

>3

я Н ю О

2.1,

2 -

1

1.7; 1.6: 1.5; 1.4Ь

макс. дов. 1ПГГ.

> ^ о А

„¿•'в' в' ^ ^

^ *-» /5? > >

злаковые травы

редис

без удобр. 90 кг/га азота

Рис. 8. Общий азот в растениях злаковых трав и редиса при инокуляции чистыми культурами бактерий

>х

5

3

1.9 1.85] 1.8 1.75 1.7 1.65 1.6 1.55] 1.5

макс. дов. гагг.

1

Щ

о? > . по N

V!

т г V V

Э Г" > 1 ¿л и

и

4! Г- \ '2 5

?! И

[Г V» II

Р. -- 4! £

Г; С»' -

4-, [' ->!

? л! п«"

Л лЛ

<8

без азотных удобрений

70 кг/га азота

150 кг/га азота

Рис.9. Общий азот в зерне ячменя при инокуляции чистыми культурами бактерий

Рис.10. Урожай злаковых трав при инокуляции смешанными культурами бактерий

2.2 2.1 2 ь 1.9 О г» 03 ж 1.8 § 1.7 1.6 1.5 1 а |'' макс. дов. шгг. дж _И к .У

У ч^У У«/ У У / / / / / / / / * *

Рис.11. Общий азот в растениях злаковых трав при инокуляции смешанными культурами бактерий 20

группы. Наряду с увеличением урожая, культуры из 1-ой группы при внесении с Вас.ро1ушуха обеспечивали и прирост содержания общего азота в растениях по сравнению с контролем (рис.11) - на 0,5% в злаковых травах. Смешанные культуры, псевдомонадным компонентом которых являлись бактерии из И-ой группы, не только не увеличивали, но и на 0,05% снижали содержание общего азота в растениях. Инокуляция ячменя псевдомонадами из I группы в смеси с Вас.ро1утуха в отличие от инокуляции чистыми культурами вызывала увеличение общего азота в зерне ячменя на 0,2% (рис.12).

Табл.4

Содержание нитратов в редисе

Вариант ЫОз" мг/кг

Без инокуляции 590 ± 55,6

Без инокуляции+удобрения 848 + 107,1

Активный азотфиксатор, ААФ-1 256 ± 35,3

ААФ-1 + удобрения 454 ± 34,2

Активный денитрификатор, АДН-1 333 ±74,5

АДН-1 + удобрения 268 ± 55,7

Одним из важных показателей действия инокуляции на овощную продукцию является содержание нитратов в урожае. Определение нитратов в корнеплодах редиса (табл.4) показало, что инокуляция в 2-3 раза уменьшает концентрацию нитратов в корнеплодах по сравнению с вариантами без инокуляции. При этом инокуляция чистыми культурами из 1-й группы дает большее увеличение содержания общего азота по

сравнению с прибавкой общего азота, которая обусловлена внесением азотных удобрений в количестве 90 кг/га (рис.8).

5.Биосинтез физиологически-активных веществ культурами, выделение ими фунгицидных и фунгистатических соединении

В изученной нами литературе имеются многочисленные указания о других возможных механизмах положительного влияния инокуляции на растения - биосинтез физиологически-активных веществ (ФАВ), фунгицидные и фунгистатические эффекты.

Известно, что благоприятное влияние микроорганизмов на растения определяется не только снабжением их азотом, но и другими факторами. Многие активные азотфиксаторы выделяют ФАВ типа ауксинов, гиббереллинов, а также сидерофоры и другие соединения, подавляющие рост фитопатогенных бактерий и микромицетов (Воронин, Кочетков, 1989; Чеботарь, 1995).

С целью выяснения действия этих факторов в культуральной жидкости исследованных нами штаммов определяли присутствие ФАВ типа ауксинов и гиббереллинов с помощью биотестов.

Согласно полученным данным (табл.5), в культуральной жидкости штаммов №120 (ААФ-1) и №11 (АДН-1) обнаружены ФАВ типа гиббереллинов, причем их действие на гипокотили салата было немного ниже действия стандартного раствора гибберелловой кислоты в концентрации 0,5 мкг/мл.

Кроме этого, установлено, что штамм №17 Bacillus polymyxa выделяет в культуральную жидкость ФАВ типа ауксинов, причем действие этих веществ на эпикотили фасоли соответствовало действию 0,5 мкг/мл ИУК.

н о

1.95 1.9 1.85 1.8 1.75 1.7 1.65 1.6 1.55

/у #

макс. дов. шгг.

4? ч*

/Vе /

/у /

без удобрений 70 кг/га 150 кг/га

Рис. 12. Общий азот в зерне ячменя при инокуляции смешанными культурами бактерий

% проросших спор

□ Mucor plumbeus □ Aspergillus ustus

Рис. 13. Фунгицидное и фунгистатическое действие псевдомонад. 23

Табл.5

Влияние ФАВ штамма №120 (ЛАФ-1) на длину гипокотилей салата сорта "Берлинский"

Зона Зона

хроматограммы п* хроматограммы п

Контроль Н20 1 III 1,3

ГК АЗ 0,5мкг/мл 2,1 IV 2

I 1,48 V 1, 06

II 1, 47 VI 0, 97

Влияние ФАВ штамма № 11 (АДН-1) на длину гипокотилей салата сорта "Берлинский"

Зона Зона

хроматограммы п хроматограммы п

Контроль Н20 1 III 1, 93

ГК АЗ 0,5мкг/мл 2,1 IV 1,12

I 1,02 V 0,96

II 1,82 VI 0,98

Влияние ФАВ Вас.ро1утуха на длину эпикотилей фасоли сорта "Сакс"

Зона Зона

хроматограммы п хроматограммы п

Контроль Н20 1 IV 2,35

ИУК 0,5мкг/мл 2, 64 V 2,7

I 3,13 VI 3,23

II 0,51 VII 2,06

III 1,6 VIII 0,57

II* - отношение длины опытных гипокотилей (эпикотилей) к контрольным

Третий тип воздействия инокуляции на растения связан с подавлением роста фитопатогенных микроорганизмов. Фунгицидное и фунгистатическое действие 70 штаммов бактерий изучали методом агаровых блоков. В опыте использовали фитопатогенные грибы, наиболее характерные для прикорневой зоны растений: Мисог рЫшЬеиэ,

Aspergillus ustus, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Pénicillium funiculosum.

Результаты для штаммов, использованных в вегетационном опыте, представлены на рис.13. Как видно из диаграммы, псевдомонады в основном ингибировали прорастание спор гриба Mucor plumbeus: штаммы №120 и 131 обладали фунгицидным, а №№11, 19 и 123 -фунгистатическим действием по отношению к микромицету. Штаммы №120 и №11 ингибировали также прорастание спор гриба Aspergillus ustus. Все остальные псевдомонады не проявили фунгицидного и фунгистатического действия в отношении проверенных штаммов грибов.

Согласие полученным данным, штаммы №120 (ААФ-1) и №11 (АДН-1) выделяют гиббереллины примерно в одинаковом количестве и обладают практически одинаковыми фунгицидными и фунгистатическими свойствами. Поэтому можно утверждать, что штаммы, дающие наибольшую прибавку урожая, обеспечивают ее благодаря повышению азотфиксации, и в меньшей степени - выделению ФАВ.

Итак, по полученным результатам можно сделать общее заключение: для инокуляции небобовых растений наиболее перспективным является использование смешанных культур микроорганизмов с высокой активностью азотфиксации, не проявляющих денитрифицирующую активность. Так, в нашей работе наиболее интересной культурой по всем показателям оказалась искусственно смешанная культура псевдомонад из 1-ой группы (штамм №120) с Bacillus polymyxa. Инокуляция этой смешанной культурой приводила к увеличению активности азотфиксации в ризосфере в 16-26 раз, урожай растений повышался на 25-40% по сравнению с

25

неинокулированным контролем, а содержание общего азота в растениях увеличивалось на 0,5%. Кроме того, один из компонентов этой смеси ингибировал прорастание грибов Mucor plumbeus и Aspergillus ustus и выделял ФАВ типа гиббереллинов. Положительный эффект по всем показателям воспроизводился в двух вегетационных периодах.

ВЫВОДЫ

1. По результатам модельных опытов по инокуляции растений однородная коллекция псевдомонад четко разделилась на три группы по активности процессов азотфиксации и денитрификации.

2. При изучении чистых и смешанных культур микроорганизмов в вегетационных опытах по инокуляции ячменя, редиса и злаковых трав нами установлено, что закономерность разделения на три группы по способности проводить процессы азотфиксации и денитрификации сохранилась.

3. Инокуляция растений смешанными культурами бактерий в большей степени повышает активность азотфиксации в ризосфере по сравнению с инокуляцией растений чистыми культурами. Так, смешанная культура, псевдомонадным компонентом которой были бактерии из 1-й группы, дает значительное, до 26 раз, повышение активности азотфиксации в ризосфере злаковых трав и до 16 раз - в ризосфере ячменя, уменьшающееся при увеличении доз азотных удобрений.

4. Смешанные культуры из группы активных азотфиксаторов не только повышали урожай растений, но и во всех вегетационных опытах

обеспечивали прирост содержания общего азота в растениях по

26

сравнению с контролем на 0,2 - 0,5% в злаковых травах и редисе и на 0,2% в зерне ячменя, что свидетельствует об улучшении качества растительной продукции. Полученный эффект сопоставим с внесением азотных удобрений в количестве 150 кг/га.

5. Инокуляция смешанными культурами бактерий имеет больший уровень воспроизводимости эффектов, которые она вызывает, чем инокуляция чистыми культурами.

6. Повышение урожая и прирост общего азота в растениях при инокуляции активными азотфиксирующими микроорганизмами связаны, главным образом, с усилением азотфиксации в ризосфере растений, в меньшей степени - с выделением ФАВ и фунгистатических соединений.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Умаров М.М., Бурлуцкая Г.Р., Давидович О.Г.-, Матвеева (Скворцова) Н.Г. Влияние инокуляции бактериями рода Pseudomonas на процессы азотного цикла в ризосфере небобовых растений //Микробиология,- 1994. Т.63. Вып.2. С. 326.

2. Скворцова Н.Г., Умаров М.М., Костина Н.В. Влияние инокуляции смешанными культурами Bacillus polymyxa-Pseudomonas на трансформацию азота в ризосфере многолетних злаковых трав //Микробиология,- 1998. Т.67. №2. С. .

3. Umarov М.М., Burlutskaya G.R., Davidovitch O.G., Matveeva (Skvortsova) N.G. Influens of nitrogen fixing Pseudomonas on higher plants //VIII-th Eastern Europe Symposium on biological fixation "Nitrogenfix-92". Saratov, 22-26 September 1992. P.28

4. Umarov M.M., Glagoleva O.B., Matveeva (Skvortsova) N.G. Nitrogen transformation in rhizosphere of plants inoculated with diazotrophs //10-th International congress on nitrogen fixation. Kluwer Academic Publishers, New-York. P.779.

5. Umarov M.M., Glagoleva O.B., Matveeva (Skvortsova) N.G. Nitrogen transformation in rhizosphere of plants inoculated with diazotrophs //Proceeding on the 10-th International congress of nitrogen fixation. Saint-Peterburg, Russia, May 28 - June 3,1995. P.637.

6. Skvortsova N.G., Umarov M.M., Kostina N.V. Inoculation of non-legumes with pure and mixed cultures of Bacillus and Pseudomonas. 11-th World Fertilizer Congress. Belgium, 7-13 September, 1997. P. 138.