Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние инкубационной среды скелетных мышц на утомление и синаптическую передачу в нервно-мышечном препарате лягушки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние инкубационной среды скелетных мышц на утомление и синаптическую передачу в нервно-мышечном препарате лягушки"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Романовский Дмитрий Юрьевич

ВЛИЯНИЕ ИНКУБАЦИОННОЙ СРЕДЫ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ НА УТОМЛЕНИЕ И СШШТТИЧЕСКУЮ ПЕРЕДАЧУ В НЕРВНО-ШВЕЧНОМ ПРЕПАРАТЕ

ЛЯГУШКИ

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически): наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в научно-исследовательском институте физиологии им. А.А.Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

Д.П. Матюшкин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Г.А. Наследов

кандидат биологических наук И.А. Шабунова

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия

Защита состоится " ** " ХХТ1996 г. в М час, на заседании Диссертационного совета К 063.57.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " 1996 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Р.И.Коваленко

ВВЕДШИЕ

Актуальность исследования. Процесс прогрессирующего снижения работоспособности скелетной мышцы в ходе длительной ритмической активности известен как феномен утомления. В настоящее время общепризнано, что утомление имеет периферическую природу: лимитирующим звеном является мышца. Падение силы сокращений при утомлении объясняется функциональными нарушениями в сократительном аппарате мышечных еолокон и/или электро-механическом сопряжении в результате накопления в миоплазме и межклеточных щелях продуктов метаболизма, продуцируемых мышечными волокнами во время ритмических сокращении. Этим определяется возрастающее в последние годы количество исследований механизмов утомления на уровне процессов активации сократительного аппарата и электромеханического сопряжения (Allen et al., 1989; Westerblad et al., 1990, 1991; Renaud, Light, 1991; Edman, Lou, 1992). Однако при работе даже такой относительно простой системы, как изолированный нервно-мышечный препарат, утомление представляет собой сложный физиологический процесс, механизмы которого до конца не ясны и не сводятся только к нарушениям функции мышцы. Как современные, так и более ранние данные показывают, что в развитии утомления играют роль и процессы, связанные с передачей сигнала с нерва на мышцу (Krnjevic, Mi-ledi, 1958, 1959; Stephens, Taylor, 1972; Никольский, Полетаев, 1977; Kerneil, Monster, 1982; Murali et al., 1984; Sieck, Pra-kash, 1995). Особенно наглядно это демонстрируется на примере одной из форм утомления, наблюдаемого в опытах на изолированных нервно-мышечных препаратах в ходе продолжительной стимуляции нерва с частотой 1-2 с-1. Главной причиной падения силы мышечных сокращений при такой форме утомления является обратимый блок нервно-мышечной передачи, опосредованный накоплением в синапти-ческой щели мышечных факторов, имеющих отрицательное пресинапти-ческое действие, и выражающийся в снижении квантового состава потенциалов концевой пластинки (ПКП) (Никольский, Полетаев, 1977). Подобный блок не является результатом "утомления" пресинаптичес-кой функции как таковой: известно, что в отсутствие мышечных сокращений интактный нервно-мышечный синапс, в частности, у амфибий, функционирует в указанном режиме длительное время без заметного снижения уровня секреции медиатора.

- г -

Более того, есть все основания полагать, что процесс утомления сопряжен с функциональной регуляцией, направленной на поддержание работоспособности системы, и что в этой регуляции участвуют различные синаптические и несиналтические механизмы (Кибяков, 1935; Матюшин, 1989; Драбкина, 1994, Кривой и др., 1994; >М.уиз-Мап а1., 1995).

В этом аспекте проблема механизма утомления смыкается с другой фундаментальной проблемой, разрабатываемой в лаборатории нервно-мышечной физиологии ФНИИ им. А. А. Ухтомского СПбГУ под руководством проф. Д.П.Матюшкина - проблемой антидромной регуляции пресинаптической функции посредством химических факторов постси-наптического (мышечного) происхождения (Матюшкин, 1975; 1977; 1980; 1989). Предполагается, что в числе таких факторов с положительным действием могут быть неидентифицированные гистидин-содержащие соединения, предположительно образующиеся при метаболизме мышечного дипептида карнозина.

Дель и задачи исследования. Целью проведенного диссертационного исследования являлось изучение влияния инкубационной среды (далее - инкубат) скелетных мышц (как источника эндогенных мышечных метаболитов) на процесс утомления нервно-мышечного препарата и на вызванную секрецию ацетилхолина из нервных окончаний скелетной мышцы лягушки. Исходя из этого ставились следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать динамику утомления нервно-мышечного препарата лягушки в опытах с раздражением нерва и с прямой стимуляцией мышцы при длительной (3 часа) ритмической (1 с-1) активации.

2. Осуществить экстракцию мышечных метаболитов в раствор Рингера путем инкубирования покоящихся изолированных скелетных мышц лягушки. Определить количественные характеристики освобождения в инкубационную среду белка и гистидин-содержащих соединений, а также оценить молекулярную массу компонентов инкубата.

3. Исследовать действие инкубата и его фракций на процесс утомления нервно-мышечного препарата лягушки.

4. Исследовать действие инкубата и его фракций на параметры квантовой секреции медиатора нервным окончанием в нервно-мышечном препарате лягушки.

Научная новизна. Показано, что в условиях прямой активации

мышцы развивается более глубокое утомление, чем в условиях ее раздражения через нерв.

Впервые изучено влияние инкубационной среды интактных мышц (как источника эндогенных мышечных метаболитов) на утомление при продолжительном непрямом и прямом раздражении мышцы с частотой 1 с-1. Показано, что инкубационная среда мышц содержит компоненты, способные частично снимать утомление нервно-мышечного препарата. Этот эффект имеет синаптическую природу, так как он отсутствует при утомлении, вызванном прямой стимуляцией мышцы. Установлено, что компоненты, ответственные за эффект снятия утомления, содержатся главным образом в относительно ниэкомолекулярной фракции мышечного инкубата (< 10 кДа). Эффект частичного восстановления работоспособности утомленной мышцы имеет неадренергическую природу, так как он сохраняется при блокаде «-ив -адренорецепторов нервно-мышечного препарата. Обнаружено сильное негативное действие высокомолекулярной фракции инкубата (>10 кДа) на мышцу, утомленную ее прямой стимуляцией. Это указывает на то, что в состав инкубата входят компоненты (вероятно, белки), негативно действующие на чисто мышечные мишени. Таким образом, иккубат содержит набор веществ, влияющих на различные мишени с разнонаправленным физиологическим действием.

Впервые обнаружено асимметричное пресинаптическое действие мышечного инкубата и его фракций в неутомленном препарате: повышение квантового состава ПКП в нервно-мышечных синапсах с исходно низким уровнем вызванной секреции медиатора и снижение квантового состава ПКП в синапсах с относительно высокой исходной эффективностью синаптической передачи. Как повышение, так и снижение квантового состава ПКП факторами мышечного инкубата в этих условиях является результатом соответствующего изменения биномиального параметра п. Стимулирующее действие инкубата на квантовый состав ПКП может определять восстановление передачи в нервно-мышечных синапсах, ослабленных в ходе утомления, и приводить к обнаруженному нами частичному восстановлению работоспособности утомленной мышцы.

Положения, выносимые на защиту:

1. В условиях прямой активации мышцы развивается более глубокое утомление, чем в условиях ее раздражения через нерв.

2. Инкубационная среда скелетных мышц лягушки содержит зндо-

генные химические факторы, способные модулировать активность нервно-мышечного препарата в ходе утомляющей стимуляции. Компоненты инкубата действуют на разные клеточные мишени и. опосредуют физиологические эффекты различного знака. Вещества, стимулирующие работу утомляемого нервно-мышечного препарата,. сосредоточены главным образом в низкомолекулярной (менее 10 кДа) фракции инкубата.

3. Мышечный инкубат содержит вещества. (возможно, это гисти-дин-содержащие соединения), повышающие остаточную работоспособность утомляемой мышцы посредством восстановления передачи в нервно-мышечных синапсах, ослабленных в ходе утомляющей активности.

4. Стимулирующее пресинаптическое действие компонентов инкубата опосредуется повышением бинймиального параметра п, что указывает на усиление процесса мобилизации квантов медиатора в моторной нервной терминали.

Научно-практическая ценность:

Впервые исследовано влияние мышечных метаболитов, входящих в состав инкубационной среды скелетных мышц, на состояние нервно-мышечного аппарата в ходе утомляющей активности. Впервые показано, что мышечный инкубат может вызывать эффект частичного снятия утомления путем повышения уровня вызванного освобождения медиатора из моторных нервных окончаний. Полученные новые данные развивают представления о механизмах саморегуляции синаптической функции при утомлении, что имеет ценность для фундаментальной науки и может иметь прикладное значение.

Апробация работы;

Основные результаты диссертации доложены на II Всесоюзной конференшй по нейронаукам (Киев, 1988); внутривузовской конференции "Доминантные механиймы поведенческих адаптации .(клеточный и системный уровни физиологических адаптации)" (Ленинград, ЛГУ, 1990); V Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиатор-ных процессов", посвященной 90-летию со дня рождения академика АН Армянской ССР, члена-корреспондента АН СССР Х.С. Коштоянца (Москва, 1990); I съезде физиологического общества РФ (Пушино, 1993); Международном симпозиуме "Биологическая подвижность", посвященном памяти академика Г.М. Франка (Пущино, 1Э94); на заседании

Санкт-Петербургского общества физиологов биохимиков и фармакологов им. И.М. Сеченова (Санкт-Петербург, 1990, 1994); на конкурсе научных работ молодых ученых СПбГУ (Санкт-Петербург, 1595).

Реализация результатов исследования;

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы, обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Перечень датируемой литературы включает ?0"> источника, из них ffo иностранных. Работа иллюстрирована 1 ^рисунками и 10 таблицами.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Инкубационную среду мышц получали, используя препараты портняжных мышц самцов травяной лягушки. Изолированные мышцы укладывали поштучно в плексигласовые камеры объемом 5 мл, заполненные раствором Рингера для холоднокровных (состав в ммоль/л: NaCL -116; КС1 - 2; СаС1г - 1,8; ИаНСОз - 2,9; рН 7,4) И выдерживали в течение 2 часов при температуре 18-20°С.

Проводили гель-фильтрацию инкубатов на колонке диаметром 16 мм и длиной 250 мм (LKB), заполненной сефадексом G-25 fine (Sigma) , или ультрафшштрацию на миллипоровых фильтрах DIAFL0 серии РМ10 (Amicon) с размером пор 10 кДа. В инкубатах и полученных фракциях определяли концентрацию белка (по реакции Лоури) и гис-тидиновых остатков (по реакции Паули и реакции с диэтилпирокарбо-натом).

В физиологических экспериментах использовали высоко- и низкомолекулярные фракции (BKffi и НМФ), полученные в результате ультрафильтрации.

Исследование динамики утомления и ее изменения при действии инкубата и его фракций проводили на препаратах седалишный нерв -портняжная мышца лягушки. Утомление вызывали стимуляцией нерва (непрямая стимуляция) или мышцы (прямая стимуляция) сверхмаксимальными стимулами с частотой 1 с-1 в течение 3-х часов. В опытах с прямой стимуляцией мышцы использовали кураризацию мышцы. Напряжение, развиваемое мышцей, регистрировали с помощью механотрона в изометрическом режиме. Запись вели с помощью самописца.

Исследуемые растворы (инкубат и его фракции) подавали через

час после начала утомляющей стимуляции в контрольном растворе Рингера. После часа действия исследуемого раствора препарат отмывали контрольным раствором. Стимуляция не прекращалась в ходе всего эксперимента (3 часа).

Исследование влияния инкубата и его фракций на параметры секреции медиатора проводили на синапсах кожно-грудинной мышцы лягушки. Для предотвращения мышечных сокращений при раздражении нерва квантовый состав ПКП уменьшали добавлением MgCl2 (10-15 ммоль/л) в контрольный и исследуемый растворы. Концентрацию Са2+ не изменяли. Внутриклеточными микроэлектродами регистрировали спонтанные миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и потенциалы концевой пластинки (ПКП), вызванные раздражением нерва с частотой 0,5 с-1. В промежутках между регистрациями ПКП нерв не раздражали. Рассчитывали квантовый состав ПКП (ш), а также биномиальные параметры р и п (соответственно, вероятность выброса кванта и доступный запас квантов).

Результаты экспериментов обрабатывали статистически. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t-тест). В тексте приведены средние значения с их ошибками.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ М ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИНКУБАТОВ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ЛЯГУШКИ.

В результате исследования 37 инкубатов установлено, что из 100 мг мышц в течение двух часов инкубации выделяется 0Д5± 0,02 мг белка. Гистидиновые остатки освобождаются в количестве 3,5± 0,1 нмоль на 100 мг сырого веса мьшшы.

Фракционирование инкубата методом гель-фильтрации показало, что инкубат разделяется на две фракции: высокомолекулярную (>5 кДа) и относительно низкомодекулярную (<5 кДа). В низкомолекулярной фракции содержатся практически все гистидин-содержащие соединения инкубата (92 % от их общего количества).

При фракционировании методом ультрафильтрации инкубат также разделялся на две фракции: высокомолекулярную (ВМФ), содержащую белки, и относительно низкомолекулярную (НМФ; <10 кДа). Качество ультрафильтрационного разделения проверяли, пропуская НШ и ВМФ через гель-фильтрационную колонку. В результате каждая фракция

давала только один четко выраженный пик на профиле элоции. При этом в НМФ попадало 84% от внесенных в ячейку гистидин-содержащих веществ и 132 белка. В ВШ> задерживалось 73% белка и 12% гисти-дин-содержащих соединений. Таким образом, ультрафильтрация достаточно надежно разделяет высоко- и низкомолекулярные компоненты инкубата. Выборочный контроль с использованием ион-селективных микроэлектродов показал, что в отличие от гель-фильтрации ультрафильтрация не приводит к изменению концентрации неорганических ионов в полученных фракциях по сравнению с исходным раствором Рингера. Это позволяет использовать полученные фракциии в физиологических экспериментах без дополнительной обработки.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ УТОМЛЕНИЯ НЕРВНО-МЫШЕЧНОГО ПРЕПАРАТА.

Поставлены 20 опытов с непрямым и 15 с прямым раздражением мышцу. Исходная сила сокращений неутомленной мышцы при этих двух способах активации достоверно не различалась и составляла 14,12± 1,19 г при стимуляции нерва и 15,23+ 1,35 г при прямом раздражении мьшшы (Р>0,05).

При обоих способах стимуляции мышцы кривая изменения амплитуды сократительных ответов имела 3 фазы: 1) кратковременная начальная потенциация силы мышечных сокращений ("феномен лестницы"; в течение первых 30-120 е.); 2) быстрое падение амплитуды ответов в течение 10-15 минут (до -10 %); 3) плато (15-180 мин), характеризующееся дальнейшим очень медленным падением сократительных ответов.

При прямой активации шлшы глубина утомления на стадии плато была достоверно большей, чем при раздражении нерва.

Это различие отражает разные механизмы блокирования утомляемой мышцы при двух способах активации. В условиях стимуляции нерва периодический пресинаптический блок, вызванный накоплением в синаптической щели продуктов мышечного метаболизма, приводит к временному "отключению" отдельных двигательных единиц. Следствием такой блокады должно быть снижение концентрации блокирующих факторов в синаптических щелях "молчащих" мышечных волокон и периодическое разблокирование синаптической передачи с восстановлением сократительной активности двигательных единиц. Такой механизм пресинаптического блока может играть роль отрицательной обратной связи, защищающей от перегрузки наиболее уязвимые элементы

(мышечные волокна) и сохраняющей их остаточную работоспособность более высокой, чем при утомлении, вызываемом прямой активацией мышцы.

3. ВЛИЯНИЕ ИНКУБАТА НА УТОМЛЕНИЕ НЕРВНО-МЫПЕЧНОГО ПРЕПАРАТА.

Инкубат и его фракции предъявляли на стадии плато утомления (через 1 час после начала стимуляции) в опытах с непрямой или прямой стимуляцией мышцы. Исходная сила сократительных ответов во всех экспериментах достоверно не различалась (Р>0,05).

В опытах с раздражением нерва инкубат и обе его фракции вызывали эффект частичного снятия утомления. Наблюдалось отчетливое замедление развития утомления по сравнению с контролем (3 часа утомления в нормальном растворе Рингера) или даже частичное восстановление амплитуды сокращений по сравнению с уровнем плато, достигнутым перед подачей исследуемых растворов. Этот эффект был наиболее выражен при действии НМФ (рис. 1. а).

В опытах с прямым раздражением мышцы ни инкубат, ни его фракции не оказывали положительного действия на утомленный препарат. Напротив, наблюдалось углубление утомления, наиболее выраженное при действии ВМФ (рис. 1,6).

Таким образом, обнаруженный нами эффект частичного снятия утомления нервно-мышечного препарата имеет синалтическую (а не мышечную) природу. Вместе с тем в состав инкубата входят вещества, прямо действующие на мышцу и вызывающие противоположный эффект. : - . ' !

Так как эффект снятия утомления можно было бы связать с феноменом Орбели-Гинецинского - восстановлением работоспособности утомленного препарата под действием катехоламинов (возможно, присутствующих в инкубате), нами была поставлена небольшая серия опытов (4 для исходного инкубата, 4 для НМФ и 2 для ВМФ), в которой оценивалось действие ; инкубата и его фракций на фоне блокады и в- адренорецепторов тестируемого препарата. Использовали «1-блокатор празозин, «2-блокатор иохимбин и 01. 2-блокатор проп-ранолол. Все три блокатора добавляли вместе в контрольный й исследуемый растворы в концентрации 10 ыкмоль/л каждый. Выяснилось, что блокада адренорецепторов не устраняет эффект частичного снятия утомления факторами мышечного инкубата.

Для оценки диапазона концентраций факторов, ответственных за

80-

40 -1 I | | I I { | | I I г | I I | ) I I 1 | | I | | I | | I | | | | | | | |

0 60 50 120 150 180 210

МИН

% 100-

20-

'III 1 I I ' I I | I I I I I | I 1 I I '!■ I I I I 1 < Г 60 90 120 150 180

Рис. 1. Влияние- мывечного инкубата и его фракций на предварительно утомленную портняжную мыацу лягуаки. А - непрямое раздражение мыицы! Б ■»- прямое раздражение мышцы. По, осям абсцисс - время от начала раздражения, мин; по осям ©рдина'т - сила напряжения мышцы (амплитуда изометрического ответа). процент к величине, зарегистрированной через 60 ' мин после начала раздражения. 1 - контроль; г - инкубат; 3 - НМ4>; 11 - ВМ*. Приведены средние значения и ооиёки средних для 7-8 (А) или 3-й (В) опытов, стрелки вниз - смена контрольного раствора на инкубат или его Фракцию; стрелки вверх - отмывание.

эффект снятия утомления, при раздражении нерва исследовали действие разбавленных (в 5 раз) и "концентрированных" (в 4 раза) ин-кубатов. Для получения "концентрированных" инкубатов было увеличено в два раза количество мышц, подвергавшихся инкубации в том же объеме жидкости; время инкубации было также увеличено на один час. Концентрация белка и диазореагирующих соединений в этих ин-кубатах и их фракциях возрастала в 4 раза по сравнению с обычными. Было проведено по 2 опыта с "концентрированными" Разбавление инкубата и его фракций устраняло стимулирующий эффект. "Концентрированный" инкубат и его фракции вызывали резкое (и обратимое) ускорение утомления.

Полученные результаты позволяют предположить, что мышечный инкубат содержит набор факторов, имеющих разные (синаптические и несиналтические) и, возможно, разнопороговые мишени с противоположными знаками действия.

4. ВЛИЯНИЕ МЫПЕЧНОГО ИНКУБАТА И ЕГО ФРАКЦИЙ НА (ШНАПТИЧЕСКУЮ ПЕРЕДАЧУ В НЕУТОМЛЕННОЙ МЫШЦЕ. .

Исходные параметры квантовой секреции медиатора (то, Ро и по), зарегистрированные в контрольных растворах, значительно варьировали как в силу естественной вариации состояния препаратов, так и в силу того, что в разных опытах использовались различные концентрации М^+2 (10-15 ммоль/л).

Учитывая, что пресинаптические эффекты многих агентов зависят от состояния аппарата секреции медиатора в тестируемом синапсе, при анализе действия инкубата и его фракций величину наблюдаемых эффектов оценивали не только в среднем для всей неоднородной популяции исследованных синапсов, но и для субпопуляций синапсов, различающихся исходными значениями параметров квантовой секреции медиатора. С этой целью исследованные выборки синапсов разделяли на примерно равные по объему подгруппы условно "ниэкоквантовых" (6,4 -?,9) и условно "высококвантовых" синапсов (22,12 - 30,4), а также на подгруппы синапсов с исходно низкими (7,8 - 13,8) и высокими значениями биномиального параметра п (16,2 - 33,1). Разделения синапсов по параметру ро не производилось, так как этот параметр в исследованных синапсах варьировал незначительно.

Было выявлено асимметричное пресинаптическое действие инкубата и особенно его фракций в зависимости от исходного состояния

ИНКУБАТ

---

вреа* (юш)

НИЭКОМОЛЕКУЛЯРНАЯ ФРАКЦИЯ

200-3

время (икв)

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНАЯ ФРАКЦИЯ

Б

»рмл <««>Ч

Рис. . Влияние мышечного инкуба-га и его фракций ни параметры квантовой секреции медиатора из нервных терминале» ко*но-гру-динной мыяиы лягушки.

А - квантовый состав ПКП (и)) 1 - синапсы С НИЗКИМИ ИСХОДНЫМИ значениями квантового состава (<15): 2 - синапсы с относительно высокими исходными значениями квантового состава (>15). По оси абсцисс! время от начала смены растворов) по оси ординат: ш X к контролю.

В - средние (сглаженные) значения биномиального параметра п за вое время действия в X к контролю; 1 - синапсы с низкими исходными значениями п (<60)| 2 - синапсы с относительно высокими исходными значением п (>60 5.

Звездочка - достоверное отличие от 100Х (Р<0.05).

синапса. В "низкоквантовых" синапсах НМФ и ВМФ вызывали повышение квантового состава ПКП; в относительно "высококвантовых" синапсах инкубат и обе его фракции вызывали снижение квантового состава ПКП (рис. 2 а). Аналогичное асимметричное действие наблюдалось в отношении биномиального параметра п в подгруппах синапсов, различающихся по величине по (рис.. 2 6). Положительное действие было наиболее выражено при предъявлении НМФ, отрицательное - при предъявлении неразделенного инкубата и ВМФ.

Для инкубата и обеих его фракций было характерно то, что вызываемые ими изменения квантового состава ПКП (как увеличение, так и уменьшение) определялись соответствующими изменениями биномиального параметра п. ■ Коэффициенты корреляции между относительными значениями т и п (в 7. к контролю) для инкубата, НМФ и ВМФ составляли соответственно 0,59 (15 синапсов, Р<0,05); 0,60 (15 синапсов, Р<0,05) и 0,83 (12 синапсов, Р<0,01). Корреляция мевду изменениями тир отсутствовала.

При действии НМФ относительные значения квантового состава ПКП (в 7. к контролю) были тем больше, чем выше концентрация гис-тидин-содержащих соединений в этой фракции. Такая корреляция наблюдалась как во всей выборке исследованных синапсов (г=0,5; 19 синапсов; Р<0,05), так и в подгруппе синапсов с низкими значениями по (г-0,87; 7 синапсов; Р<0,05).

Инкубат и обе его фракции не влияли на потенциал покоя мышечного волокна, а также на амплитуду и временные характеристики МПКП, что свидетельствует об отсутствии влияния компонентов инкубата на электрогенез мышечной мембраны и постсинаптическую рецепцию медиатора в неутомленной мышце.

Полученные результаты позволяют предположить, что стимулирующее пресинаптическое действие факторов инкубата на синапсы с низким квантовым составом ПКП может быть причиной обнаруженного нами эффекта частичного снятия утомления, который, как было показано имеет синаптическую природу и наиболее отчетливо выражен при действии НМФ. Тот факт, что размах вызываемых факторами инкубата колебаний квантового состава (от повышения к снижению) относи-

тельно невелик, возможно, объясняет и относительно небольшую величину эффектов, наблюдаемых в опытах с утомлением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших экспериментов показывают комплексный характер действия мышечных метаболитов, содержащихся в исследуемом ин-кубате, на лресиналтическую функцию и на мышечные элементы в условиях утомления. Установлено, что инкубационная среда скелетных мышц (и особенно НМФ) оказывается способной частично снимать утомление нервно-мышечного препарата при стимуляции нерва, наряду с этим в условиях прямого раздражения мышцы ВМФ инкубата вызывает углубление утомления. При исследовании действия инкубата на параметры секреции медиатора в неутомленной мышце показано, что инкубат и его фракции повышают квантовый состав ПКП в "низкоэффективных" синапсах и снижают его в более "высокоэффективных" синапсах. В обоих случаях действие опосредовано через соответствующие изменения биномиального параметра п, что указывает на модуляцию процесса мобилизации квантов. Стимулирующее действие инкубата на квантовый состав ПКП может определять восстановление передачи в нервно-мышечных синапсах, ослабленных в ходе утомления. Видимо, этот механизм лежит в основе обнаруженного нами эффекта частичного снятия утомления. Небольшие колебания, сдвигающие в ту шш иную сторону гарантийный фактор нервно-мышечной передачи, могут стабилизировать функцию утомленной мышцы на более высоком остаточном уровне, чем в условиях прямой стимуляции мьшшу. Предполагается, что подобное стимулирующее пресиналтическое действие метаболитов, освобовдающихся из мышечных волокон в ходе ритмйчейкой нервно-мышечной активности in vivo и усиливающих процесс мобилизации квантов медиатора, может быть одной из основ синаптической тренировки, развивающейся параллельно утомлению.

На основании наших данных мы не можем однозначно утверждать, что гистидин-содержащие компоненты низкомолекулярной фракции мышечного инкубата определяют обнаруженные нами физиологические эффекты, хотя подученные данные косвенно подтверждают это предположение. Вместе с тем, гистидин-содержащие соединения, их концентрация и ее вариации могут служить своеобразным простым маркером низкомолекулярных мышечных метаболитов, освобождающихся в межклеточное пространство и инкубационную среду мышц. ,,Как мы показали,

величина некоторых стимулирующих физиологических аффектов инкубата коррелирует с концентрацией в нем гистидин-содержащих соединений . Это является еще одним указанием на то, что физиологические эффекты инкубата опосредуются если и не этими соединениями, то какими-то другими низкомолекулярными мышечными метаболитами, освобождение которых в межклеточное пространство и инкубационную среду мышцы коррелирует с освобождением гистидин-содержащих веществ. На основании результатов нашей работы можно предложить относительно простую модель - утомляемый нервно-мышечный препарат -для дальнейшего анализа природы этих веществ и поиска клеточных мишеней их действия.

ВЫВОДЫ

1. Мышца, утомляемая раздражением нерва, сохраняет более высокую остаточную работоспособность, чем в условиях ее прямой активации.

2. Инкубат покоящихся скелетных мышц и особенно его низкомолекулярная фракция (<10 кДа) частично восстанавливают изометрические сокращения портняжной мышцы лягушки, утомленной стимуляцией нерва. Этот эффект имеет синаптическую природу, так как отсутствует при прямой стимуляции мышцы. Стимулирующее действие инкубата не имеет адренергической природы, так как не устраняется блокадой адренорецепторов.

3. В условиях утомления прямой стимуляцией мышцы инкубат и особенно его высокомолекулярная фракция углубляют утомление. Это указывает на то, что мышечный инкубат, кроме синаптотропных веществ, содержит факторы (вероятно, белки), негативно действующие на саму мышцу.

4. Инкубат и его фракции модулируют параметры квантовой секреции медиатора в синапсах неутомленной кожно-грудинной мышцы (в условиях частичного Ме2+-блока). Квантовый состав ПКП и биномиальный параметр п снижаются в синапсах с относительно высокими исходными значениями квантового состава и п и повышаются в синапсах с исходно низкими значениями этих параметров. Последнее может определять повышение гарантийного фактора передачи в нервно-мышечных синапсах, ослабленных в ходе утомления, и приводить к частичному восстановлению работоспособности утомленной мышцы (эффект частичного снятия утомления).

5. При действии инкубата и его фракций изменения квантового состава потенциалов концевой пластинки (как увеличение, так и уменьшение) определяются соответствующими изменениями биномиального параметра п (характеризующего доступный запас квантов).

6. Величина стимулирующего пресинаптического эффекта, вызываемого низкомолекулярной фракцией инкубата, положительно коррелирует с концентрацией гистидин-содержащих веществ в этой фракции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Драбкина Т.М., Кубасов И.В., Матюшкин Д.П., Романовский Д. Ю., Юркянец Е.А. Некоторые биохимические характеристики мышечного перфузата и его влияние на освобождение медиатора в нервно-мышечном синапсе// Бюдл. эксперим. биол. и мед. -1988. -Т.105, N 4. -С. 388-391.'

2. Драбкина Т.М., Матюшкин Д. П., Радзюкевич В.К., Романовский Д.Ю. Стимулирующее влияние мышечного перфузата на вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки// II Всесоюзная конференция по нейронаукам. Тез. докл. -1988, Киев. -с.28

3. Драбкина Т.М., Радзюкевич В.К., Романовский Д.Ю. Модуляция нервно-мышечной передачи факторами мышечного происхождения// Y Всесоюзная конференция " Физиология и биохимия медиаторных процессов" М., окт. 1990 г. тез. докл., с. 98.

4. Драбкина Т.М., Радзюкевич В.К., Романовский Д.Ю. Роль эндогенных физиологически активных веществ в модуляции синаптичес-кой передачи. Тез.докл. Доминантные механизмы поведенческих адаптации (Клеточный и системный уровни физиологических адаптаций). Внутривузовская конференция 15-17 октября. 1990, с.33.

5. Драбкина Т.М., Радзюкевич В.К., Романовский Д.Ю. Мышечный перфузат содержит факторы, стимулирующие вызванную секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний// Проблемы физиологии двигательного аппарата/ Казань, из-во казанского университета, -1992. -С. 29-40.

6. Драбкина Т. М., Романовский Д.Ю., Радзюкевич В.К. Влияние инкубационной среды скелетных мышц на утомление и синаптическую передачу в нервно-мышечном препарате лягушки. Успехи физиол. наук. -1994. -Т.25, N 1. -С.128.

7. Drabklna Т.М., Matyushkin D.P., Krivoi 1.1., Kubasov I. V., Lopatina E. V., Radzjukevich V.K., Romanovsky D.Yu, Sei T.P. Regulation of efficiency of fatigued muscles mediated by substances of nervous and muscular origin// Biological Motility. Int. symp.Pushchino 25 sept.-l oct. 1994. Abstracts. Pushchino. 1994. P. 110-111.

8. Drabkina T.M., Matyushkin D.P., Radzjukevich V. K., Romanovsky D.Yu. The influence of skeletal muscle incubation medium on fatigue of neuromuscular preparation and on transmitter release at neuromuscular junctions in the frog// Gen. Physiol. Biop-hys. -1995. -V.14, N 2. -P.1-18.

9. Романовский Д.Ю., Драбкина T.M. Выход некоторых мышечных метаболитов в инкубационную и перфузионную среду из скелетной мускулатуры лягушки// Вестник СПбГУ, сер.З. -1995, вып. 1. -С.75-80.