Влияние гравитационной разгрузки и тренировки на характеристики кальций-механической связи в изолированных волокнах скелетных мышц

Литвинова, Карина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние гравитационной разгрузки и тренировки на характеристики кальций-механической связи в изолированных волокнах скелетных мышц
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние гравитационной разгрузки и тренировки на характеристики кальций-механической связи в изолированных волокнах скелетных мышц"

На правах рукописи

ЛИТВИНОВА

Карина Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ГРАВИТАЦИОННОЙ РАЗГРУЗКИ И ТРЕНИРОВКИ НА ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЬЦИЙ-МЕХАНИЧЕСКОЙ СВЯЗИ В ИЗОЛИРОВАННЫХ ВОЛОКНАХ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

03.00.13 - физиология 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН

Научные руководители: доктор биологических наук

Борис Стивович Шенкман

Защита диссертации состоится «_» декабря 2005 года в_часов на заседании диссертационного

совета К002.111.01 в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д.76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан «_» ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук И.П. Пономарева

доктор физико-математических наук Андрей Кимович Цатурян

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Оганов Виктор Сумбатович

доктор медицинских наук, профессор Никольский Евгений Евгеньевич

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М. Сеченова РАН

06'f ¿</70*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Пребывание в условиях реальной или моделируемой гравитационной разгрузки приводит к значительным изменениям сократительных характеристик мышечных волокон млекопитающих (Mounier et al., 2000, Stevens et al., 1993, Widrick et al., 1998-2000). Некоторые авторы связывают изменение сократительных свойств с изменением объёма миофибриллярного аппарата (Mounier et al., 2000, Stevens et al., 1993). В то же время, показано, что изменение силы изолированных волокон оказывается более глубоким, чем изменение их структурных параметров (Widrick et al., 1998-2000). Итак, сократительные свойства отдельных мышечных волокон могут зависеть от: объёма сократительного аппарата; качественного и количественного состава миофибриллярных белков; от параметров системы электромеханического сопряжения (в том числе, от кальциевой чувствительности миофибрилл); жесткости мышечных волокон.

Роль каждого из этих факторов в процессе снижения сократительных свойств мышечных волокон и клеточные механизмы такого снижения при гравитационной разгрузке в значительной степени остаются неизученными.

В мышечном волокне кальций не только участвует в регуляции метаболических процессов, но и выполняет основную роль в электромеханическом сопряжении, обеспечивающем передачу сигнала о мышечном сокращении на миофибриллы. Согласованная работа кальциевых каналов и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума обеспечивает тонкую регуляцию сократительной активности мышечных волокон.

О чувствительности миофибрилл к ионам кальция обычно судят по характеристикам кривой «кальций-сила», отражающей зависимость изометрического напряжения изолированных, как правило, скинированных волокон от концентрации кальция в растворе (Goblet et al., 1987). При этом, сдвиг кривой вправо (в сторону меньших значений рСа и соответственно больших значений концентрации ионов кальция) свидетельствует о снижении чувствительности миофибрилл к ионам кальция. Известно, что, как у животных (крыс и обезьян), так и у человека после космического полета наблюдается снижение Са-чувствительности миофибрилл (Mounier et al., 2000, Stevens et al., 1993, Widrick et al., P98). Такой же сдвиг кривой «Са-сила» впразо был выявлен и в условиях моделирования действующих факторов невесомости на Земле: в экспериментах с вывешиванием крыс (McDonald et al., 1995) и в условиях антиортостатической гипокинезии в исследованиях с участием добровольцев (Widrick et al., 1998). В то же время, механизмы внутриклеточной сигнализации, зависимые от сократительной активности волокна in vivo, и запускающие цепь событий, ведущую к снижению Са-чувствительности миофибрилл до сих пор неизвестны.

Цель работы состояла в изучении закономерностей и механизмов изменений сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц человека и животных при гравитационной разгрузке и тренировке.

: НАЦИОНАЛЬНАЯ

ВИБЛИОТЕКА j

Задачи работы:

- исследовать сократительные свойства изолированных мышечных волокон, а также характеристики клеточных маркеров электромеханического сопряжения у человека и животных, подвергнутых воздействию реальной и моделируемой гравитационной разгрузки;

- оценить роль системных и клеточных механизмов в изменении сократительных характеристик волокон познотонических мышц в условиях гипогравитации;

- исследовать сократительные свойства и кальциевую зависимость сокращений изолированных мышечных волокон при физической тренировке у человека.

Научная новизна работы;

- впервые обнаружено, что гравитационная разгрузка приводит к перераспределению экспрессии изоформ белков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, а именно увеличивается SERCAI типа (быстрого типа);

- впервые установлено, что в 3-х и 7-дневный период возвращения к опорной нагрузке после 14-дневной гравитационной разгрузки не происходит восстановления сократительных возможностей одиночных мышечных волокон;

- впервые показано, что в группах реадаптации как в течение 3, так и 7 дней увеличилась доля гибридных волокон, экспрессирующих SERCA медленного и быстрого типа (I и И);

- впервые выявлено, что стимуляция опорного входа стопы позволяет предотвратить уменьшение сократительных возможностей волокон т. soleus человека;

- впервые показано и доказано, что опорная стимуляция предотвращает уменьшение чувствительности миофибрилл к свободным ионам кальция;

- впервые обнаружено, что применение кальций-связывающего агента позволяет полностью предотвратить снижение кальциевой чувствительности миофибриллярного комплекса в условиях гравитационной разгрузки;

- впервые показано, что внутрибрюшинное введение ЭГТА на фоне гравитационной разгрузки приводит к предотвращению процессов изменения экспрессии кальциевых помп саркоплазматического ретикулума;

- впервые установлено, что 4-недельная тренировка в интервальном режиме приводит к увеличению удельной силы одиночных мышечных волокон т. vastus lateralis человека.

Научная и практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления о роли некоторых факторов, влияющих на сократительные свойства одиночных волокон скелетных мышц в условиях гравитационной разгрузки и тренировки. Эти результаты имеют большое практическое значение, поскольку исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения в мышцах человека при моделируемой и реальной гравитационной разгрузке позволяет оценить эффективность подходов, направленных на уменьшение или предотвращение негативного влияния невесомости на мышцы.

Результаты исследования используются в учебном процессе аспирантов ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Снижение максимальной силы скинированных волокон т soleus в условиях гравитационной разгрузки обусловлено устранением опорного стимула.

2. Снижение сократительных возможностей мышечных волокон при гравитационной разгрузке связано с накоплением ионов кальция в миоплазме.

3. Тренировка на велоэргометре в интервальном режиме, которая часто используется в подготовки спортсменов разных специализаций, приводит к увеличению удельной силы единичных волокон.

Апробапия работы

Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на 32-ой и 34-ой Европейских мышечных конференциях (Монпелье, Франция, 2003; Дебрецен, Венгрия, 2005); 24-ом, 25-ом и 26-ом Международных гравитационных физиологических съездах (Санта-Моника, США, 2003; Москва, 2004; Кельн, Германия, 2005); 5-м Конгрессе Итальянской ассоциации миологии (Неаполь, Италия, 2005); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2004); 2-ой и 3-ей Международных конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2004, 2005); Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню космонавтики (ИМБП, Москва, 2002-2005).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая биология и физиология» 27 сентября 2005 года

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания организации экспериментов, изложения результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 123 страницах печатного текста, включает 24 рисунка, 9 таблиц и список литературы из 129 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный материал. В работе были использованы биопсийные образцы мышечной ткани крыс (линия Вистар) и биопсии человека, взятые после пребывания в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки и интервальной тренировки. Для создания условий микрогравитации применялась модель вывешивания задних конечностей крыс в течение 14 суток (Morey-Holton & Globus, 2002) и модель 7-суточной «сухой» иммерсии человека (Шульженко и Виль-Вильямс, 1975).

Все добровольцы дали согласие на участие в исследованиях в соответствии с нормами Хельсинкской Декларации. В экспериментах с животными использовали половозрелых самцов крыс линии Wistar в возрасте 2 месяцев выращенных в питомнике ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Животных содержали в стандартных условиях. Все процедуры были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Забор и хранение экспериментального материала. В экспериментах с участием человека пробы мышечной ткани забирали из m soleus и m vastus lateralis методом игольчатой биопсии по Бергстрему (1962) У крыс m soleus выделяли целиком из обеих задних конечностей крысы. Мышцу взвешивали и из центральной ее части вырезали кусочки длиной 0,5 см. Для иммуногистохимического анализа полученные кусочки ткани ориентировали поперечно, фиксировали на бумажной подложке с помощью Tissue-Tek® (OCT™ Compound 4583) и замораживали в жидком азоте Мышечные пробы хранили при температуре -80°С вплоть до обработки.

Для анализа сократительных свойств пучки мышечных волокон диаметром 0,1-0,3 мм немедленно помещали в скинирующих раствор, содержащий ЭГТА Методика химического скинирования, при котором происходит частичное разрушение клеточной мембраны, была раннее описана Stevens и соавт (1993). Затем пробу перемещали в раствор для хранения при -20°С.

Анализ сократительных свойств проводили на единичных волокнах (7-10 волокон из каждой пробы мышцы), изолированных из скинированный мышцы. Перед каждым экспериментом изолированный сегмент волокна длиной 0,5-2 мм помещали на 10 мин. в раствор, содержащий 0,5% детергента Triton Х-100. Затем сегменты единичных волокон переносили в камеру с расслабляющим раствором (раствор R) Один конец волокна прикрепляли к датчику силы (модель FORT 10, Word Precision Instruments, США, уровень шума <3 мкН) с помощью шелковой нити. Другой конец жестко крепили к пассивному плечу - пинцету.

Механическое напряжение регистрировали 2-канальным высокочастотным аналого-цифровым преобразователем, который был специально разработан Д.Д. Мациевским (Институт общей патологии и патофизиологии РАМН) Продолжительность записи сокращения каждого сегмента волокна в среднем составляла 20-30 г.:ин, брали 8 точек (уровень силы при каждой концентрации Саг+ записывали в течение 1 мин). Данные записывали в память персонального компьютера. Программа управления экспериментом и цифровой регистрации сигналов датчика была разработана в ИМБП РАН. Для анализа данных экспериментов использовали программный пакет, предоставленный Лилльским технологическим университетом (Франция), и собственно разработанную программу, работающую в среде Microsoft Excel.

Длину саркомеров измеряли в растворе R с использованием дифракционного паттерна света Не-Ne лазера (длина волны 633 им, мощность 4 мВт). Под контролем дифракции устанавливали длину саркомеров 2,6iO,I мк - для крыс и песчанок и 2,4±0,1 мк - для человека и обезьяны, что позволяло стандартизировать данные при измерении максимальной силы (Р0). Диаметр волокна измеряли с помощью бинокуляра, имеющего микрометр (х80). Все манипуляции проводили при температуре 17+1°С.

В начале каждого эксперимента тестировали Р0 (максимальную силу сокращения) при концентрации Са2+, соответствующей рСа 4,2, что позволяло полностью насытить Са2+ все участки связывания ТпС.

Рассчитывали взаимосвязь сила - концентрация Са2+. Каждая амплитуда силы сокращения, полученная для соответствующих растворов с различными концентрациями Са2+, была нормализована на величину от максимальной силы Ро (соответствующие величины, Р/Ро, были отнесены к рСа). Экспериментальные результаты обрабатывали с использованием уравнения Хилла: P/Po = ([Ccf'j/Kdf /1+([Сс?*])/Кфл, где п - коэффициент Хилла (величина наклона кривой); Kd - постоянная Хилла (pKd=-logKd=pCaso); Са2+- концентрация кальция; Р - сила, с которой сокращается волокно при данной концентрации Са2+; Ро - сила максимального сокращения волокна в растворе с насыщающей концентрацией Са2+.

Растворы (pH 7,0, ионная сила 0,2М). В скицирующем растворе содержалось (в мМ): 2,5 АТР, 20 MOPS, 2.5 Mg ацетат и 5 Kj-EGTA. Для экспериментальных процедур были использованы следующие растворы: промывочный раствор W состоял из (в мМ): 2,5 АТР, 20 MOPS, 2.5 Mg ацетат. Расслабляющий раствор R был такой же, как и скинирующий. Для поддержания высокой концентрации АТФ в клетке использовали систему, содержащую 20-30 мМ креатинфосфата и 1 -1,5 мг/мл креатинфосфокиназы. Активирующие растворы состояли из промывочного раствора (W), содержавшего различные концентрации Са2+ (свободные ионы из СаСОз), с добавлением буфера EGTA. Раствор, содержащий 0,5 % детергента Triton Х-100, был приготовлен на основе расслабляющего раствора.

Иммуногнстохнмнческий анализ мышечных срезов. Готовили криостатные поперечные срезы толщиной 10 цм при -20°С. Срезы монтировали на предметные стекла и окрашивали антителами против быстрой и медленной изоформ SERCA (I и 10 Анализ срезов проводили на световом микроскопе фирмы Leica модель DC 300F. Измерения проводили с помощью системы компьютерного анализа изображения QUANTIMET-500 (Leica) с цветной цифровой видеокамерой JVC ТК-1280Е. Разрешение видеокамеры 720x512 пикселей с 8 бит/пиксель. Подсчитывали долю мышечных волокон, содержащих соответствующие изоформы SERCA. Распределение волокон было выражено как отношение числа волокон, экспрессирующих SERCA I или SERCA II на срезе к общему количеству волокон. В обработку включали все волокна на каждом срезе.

Статистическая обработка полученных данных выполнена на персональном компьютере с использованием программ "Stat:stica-6.0" и "Ехсе1-7.0". Различие средних значений показателя в сравниваемых выборках считали значимым при уровне значимости /»<0,05. Результаты представлены в виде М+ш.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Часть I. Эффекты гравитационной разгрузки 1.1. Исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц космонавтов до и после длительного космического полета

Прямые данные, касающиеся эффектов гравитационной разгрузки можно получить при исследовании мышц космонавтов до и после длительного космического полета. Исследование мышечной ткани проводили у 3-х членов экипажей МКС (А, В, С) в длительных космический полетах (МКС - 6, 7 и 8) в рамках бортового эксперимента «МИОН». Космонавты А, В и С провели на станции 6 месяцев. Пробы мышечной ткани забирали из т хо/евд дважды: в предполетном периоде и к концу 0-х суток после посадки Космонавты в ходе полета выполняли профилактические физические тренировки по бортовой программе. В основу тренировок было положено выполнение беговых (на бегущей дорожке) и велоэргометрических нагрузок в повторном режиме Дважды во время полета была проведена запись объема и интенсивности выполняемых нагрузок в течение стандартного микроцикла. Полученные значения объема и интенсивности нагрузок сопоставляли с теми значениями, которые были предварительно рекомендованы космонавтам.

Анализ сократительных свойств одиночных скинированных волокон т. ¡о1еи5 двух космонавтов (А и С). После длительного космического полета у космонавтов А и С значения диаметра мышечных волокон и максимальной силы, были значительно ниже, чем до полета (табл. 1.1). Достоверное, хотя и менее выраженное, уменьшение диаметра и изометрической силы волокон т Бо1еи$ было ранее выявлено в работах и^пск. и соав1 (1999-2001) при исследовании эффектов 18-суточного космического полета. Согласно их данным, уменьшение диаметра волокон и максимальной силы составило соответственно 5% и 13%. При исследовании эффектов длительной гипокинезии УатавЪиа-ОоЮ (2001) обнаружил более существенное снижение как диаметра, так и силы волокон т. $о1еш человека. После 60 и 120 суток гипокинезии диаметр волокон уменьшился, соответственно, на 8% и 36%, а изометрическая сила - на 38% и 76%, соответственно. Глубина изменений, полученных в настоящем исследовании больше, чем при кратковременном космическом полете (табл. 1.1.). Однако следует заметить, что космонавты провели 6 месяцев на борту орбитальной станции. В таком случае, на полученные изменения сократительных свойств одиночных волокон т. хо/еия обоих космонавтов А и С следует взглянуть с другой стороны. После 120 суток постельной гипокинезии диаметр волокон уменьшился на 36%. В нашем случае, длительное пребывание космонавтов на борту МКС привело к уменьшению этого показателя на 47%. Если разделить период пребывания на три равные части, то получится, что за 40 дней гравитационной разгрузки диаметр одиночных волокон т. во1еив уменьшался в среднем на 15%. Однако, уменьшение диаметра у космонавтов после космического полета было больше, чем изменение абсолютной силы изолированных волокон. За 120 дней гравитационной разгрузки максимальная сила одиночных волокон т хс>1еи$ в среднем снизилась на 38%, чем до полета, т.е. за 40 дней снижение этого показателя составило всего 12%. После 60 суток постельной

гипокинезии изометрическая сила волокон снижалась на 38%, после 120 суток гипокинезии - 76%.

Таблица 1.1

Значения диаметра волокон (D), изометрического напряжения волокон- абсолютной (Р0) и удельной (Т,„) силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (М±т).

Параметры космонавт А космонавт С

до полета (10 волокон) после полета (7 волокон) до полета (7 волокон) после полета (6 волокон)

D, (мкм) 92,5±3,01 85,6± 1,37* 90,0±2,12 81,2±1,90*

Po, (мН) 0,55±0,02 0,37±0,04* 0,72±0,03 0,49+0,02*

РуЛ, (кН/м*) 82,8±3,21 63,7±3,11* 113,03±6,15 95,10+4,26*

рСатп 6,95+0,03 6,7±0,01* 6,85+0,03 6,65±0,02*

pCaso 5,83±0,01 5,7±0,03* 5,78±0,02 5,66±0,01*

•достоверное отличие от исходного уровня при р<0,05

Результаты проведенного анализа свидетельствуют о том, что стандартные бортовые нагрузки и система профилактики космонавтов А и С оказали заметное коррекционное воздействие на сократительные свойства одиночных волокон скелетных мышц в условиях длительного пребывания в реальной невесомости.

Снижение удельной максимальной силы мышечных волокон m soleus ранее показали Fitts и соавторы (1998) после космических полетов человека MacDonald (1995) получил аналогичное снижение удельной силы в экспериментах с вывешиванием крыс. Группа же французских авторов, как в реальной, так и в условиях моделируемой невесомости не обнаружила такого эффекта (Mounier et al, 1997) В настоящем исследовании у обоих космонавтов после 120 суток космического полета обнаружено достоверное снижение удельной силы на 25%

Интересно и то, что длительное пребывание в условиях гравитационной разгрузки приводит также и к уменьшение чувствительности миофибрилл к свободным ионам Са2* Так, кривая, отражающая зависимость относительной силы волокон от концентрации Са + в растворе, после длительного космического полета у космонавтов А и С сдвигается вправо, что свидетельствует об I увеличении концентрации, необходимой для той же силы сократительного ответа волокна, т.е. о снижении чувствительности миофибрилл к Са2+ (рис 111). Количественным отражением этого сдвига является достоверное уменьшение порогового рСа и рСа50. Этот эффект был впервые обнаружен при исследовании волокон m soleus крыс, находившихся в условиях невесомости на борту советских биоспутников серии «Космос» (Mounier et al, 1991). В дальнейшем, уменьшение чувствительности миофибрилл к Са2+ было обнаружено в экспериментах с человеком после пребывания в условиях, как космического полета, так и гипокинезии (Yamashita-Goto et al, 2001)

I 50 î

0В-»

7 6,6 6,2 5,8 5,4 5 _рСа_

7 6,6 6,2 5,8 5 4 5

PC»

4,6

космонавт А

космонавт С

Рис. 1.11 Зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон m soleils космонавтов А и С Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла (см раздел «Методы обработки и анализа материала») Показаны средние значения P/Pgtm Синяя кривая - до полета, красная кривая - после полета.

Этот феномен имеет очевидное функциональное значение, указывая на снижение сократительных возможностей волокна в диапазоне субмаксимальных нагрузок (Macintosh, 2003). Изменение чувствительности миофибрилл к Са1+ может быть следствием изменения паттерна изоформ тропонинов Т и С в сторону увеличения доли изоформ, характерных для волокон быстрого типа (Stevens, 2002). Не исключено также, что уменьшение сократительного ответа на заданную концентрацию Са2+ обусловлено уменьшением вероятности образования необходимого количества акгомиозиновых мостиков (Riley, 1998) в результате количественных или конформационных изменений миофиламентов (например, деформации или дезинтеграции тонких нитей).

Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) ль soleus у космонавтов. Гравитационная разгрузка приводит к перераспределению экспрессии изоформ белков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, а именно увеличивается SERCA I быстрого типа (Kandarian et al., 1996). Эти белки являются важнейшими звеньями системы электромеханического сопряжения и в значительной степени определяют характеристики сократительных ответов волокна. Процент содержания SERCA I достоверно выше в разгруженных мышцах у обоих космонавтов. Впервые были получены данные, свидетельствующие об изменении медленной изоформы Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума мышечных волокон т. soleus при гравитационной разгрузке (рис. 1.1.2). По нашим данным процент волокон, экспрессирующих SERCA И, уменьшается: на 22% у космонавта В, на 30% у космонавта С. Однако такое уменьшение не согласуются с данными S. Kandarian. В ее работах при гравитационной разгрузке не наблюдалось уменьшение SERCA И типа Возможно, такое расхождение данных связано с экспрессией в мышечных волокнах еще одного типа SERCA. В работах Martin и соавт. (2001) была обнаружена изоформа SERCA III в волокнах человека, а потом и в волокнах крысы. В наших экспериментах окрашивали препараты антителами только против SERCA I и SERCA II. Следует заметить, что при гравитационной разгрузке многократно наблюдался сдвиг соотношения медленных и быстрых

изоформ миозина в бысфую сторону у крыс после космическою почета и ашиорюс1а1ическою вывешивания (Ogano\ et al 1981) У чечовска после космическою полета и антиорюстшической ¡илокинезии признаки анало!ичных изменений не были значимыми fOhira et al. 1999)

В нашем эксперименте профилактические физические упражнения на борту космического аппарата не предотвратили изменения белков Са-АТФазы саркопла;мач ического peí и кул ум а у космонавтов В и С Этот фаю можно связать со снижением чувствительности миофибрилл к Са2" и смешением вправо кальциевой кривой Сравнивая процент увеличения днух белков можно сделать вывод, что Са-АТФаза саркоплазма!ическою ретикучуча быстрых волокон более лабильна, те более чувствительна к понижению мышечной активности в условиях опорной разгру ¡ки

Рис 112 Cooi ношение мышечных волокон, содержащих SERC А I, SERCA II типа, а также SERCA I/II типа в т wleus двух космонавтов (%, Mt m) Первые лва столбика до и после полета - данные космонавта В. вюрые два столбика данные космонавта С *досюверное отличие от предполетных данных каждо! о космонавта (/;<().05)

BSERCA II PSFRCA 1/11 типа BSERCA I типа

1.2. Исследование сократительных характеристик единичных волокон т. soleus крыс в период 3-х и 7-дневного восстановления после 2-недельного снятия опорной нагрузки

Выявление существенных изменений сократительных свойств одиночных волокон в условиях Iравитационной разгрузки стиму тировало исследования этих же показателей после выведения из состояния гипокинезии.

В эксперименте использовали половозрелых самцов крыс линии Wistar в возрасте 2 месяцев выращенных в пиюмнике ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Животных содержали в стандартных условиях Они получачи корм в соответствии с рационом для лабораторных животных и воду ad libitum Все процедуры с животными был!" одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП PAII Животные были разделены на 4 группы (п - количество животных в группе) группа № I -«Контроль»; группа № 2 - «Вывешивание»: группа № 3 «Вывешивание + восстановление 3 дня», группа № 4 - «Вывешивание + восстановление 7 дней»

Группу № 1 - «Контроль», составили 7 крыс, которые находились в клетках в течение 14 дней Животные группы № 2 - «Вывешивание» (я=7). в течеиие 14 дней находились в положении антиортостатического вывешивания Животных группы X" 3 - «Вывешивание + восстановление 3 дня» и группы № 4 - «Вывешивание + восстановление 7 дней» (л=б), после 14-ти дней

вывешивания помещали в клетки и забивали через 3 и 7 дней восстановительного периода соответственно.

Анализ сократительных свойств одиночных волокон т. крыс. Уменьшение массы

мышечной ткани является обязательным следствием гравитационной разгрузки. 14-дневное вывешивание крыс привело к достоверному снижению сырого веса мышцы на 38% по сравнению с животными контрольной группой (табл. 1.2). 3-суточное восстановление крыс практически не повлияло на изменение этого показателя. Однако, через 7 дней сырой вес мышцы т. ,ю!еиз практически полностью восстанавливается. По данным серии работ группы МивассЫа и соавторов (1983), в которых сравнивали вывешивание крыс с другими моделями микрогравитации, масса мышц задних конечностей нормализуется через 1-2 недели после 7-, 14-, и 18-суточного вывешивания крыс.

Таблица ¡.2.

Значения веса т зо!еш (№), диаметра волокон (И), изометрического напряжения волокон: абсолютной (Ра) и удельной (Руд силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (рСа$о, рСат„), (М-'т)._____

Параметры Контроль (40 волокон) Вывешивание (50 волокон) Восстановление 3 дня (33 волокна) Восстановление 7 дней (41 волокно)

Вес т^о/еия, (мг) 109,7±!,3 71,1±6,3*5 76,2+8,6*' 101,8+7,7

А (мкм) 79,6+1,6 60,1±2,1* 62,14+1,8* 63,6±3,0*

Ро, (мН) 0,47+0,02 0,26±0,05* 0,25+0,06* 0,24+0,01*

/V (кН/м2) 100,0+7,0 91,2+7,3 81,20+16,7 77,10+6,4*

рСатШ 7,02±0,05 6,69+0,02* 6,7±0,03* 6,8+0,02*

рСа;о 5,85+0,06 5,68+0,01* 5,7±0,02* 5,76+0,01*

* достоверное отличие от контрольного уровня при /?<0,05;5 отличия от группы восстановления 7 дней.

Как и следовало ожидать, пребывание в условиях моделируемой действии микрогравитации привело к значительным изменениям сократительных характеристик мышечных волокон т 5о1еш у крыс. Диаметр волокон уменьшился на 15%, абсолютная сила - на 32%. удельная - на 5%. Ни 3-суточное, ни 7-суточное восстановление не привело к увеличению ни одного из приведенных показателей (табл. 1.2).

Атрофия т $о1еиз при вывешивании задних конечностей крыс происходит за счет уменьшения размеров мышечных волокон, а не их количества (Пютгшоп а1, 1990) Следовательно, вес мышцы и диаметр отдельных волокон должны восстанавливаться вместе Но в нашем эксперименте вес мышцы полностью восстановился через неделю возобновления мышечной нагрузки, а диаметр волокон - нет Одним из феноменов, сопровождающих кратковременное пребывание в условиях гравитационной разгрузки (иммерсия, космический полет), является дегидратация (Григорьев и др., 1978), очевидно, затрагивающая как объем циркулирующей плазмы и внеклеточную воду, так и внутриклеточную воду (Лобачик и др., 1998). Таким образом, редукция площади поперечного сечения мышечных волокон может быть обусловлена, как

уменьшением объема белкового, так и небелкового (главным образом, водного) компонентов. Учитывая особенности техники первичной обработки при анализе скинированных волокон, следует принимать во внимание, что для проникновения ионов кальция волокна применяется метод скинирования сарколеммы В процессе скинирования в мембране появляются поры, через которые уходит часть небелкового компонента В нашем эксперименте восстановление сырого веса мышц крыс может бьггь связано с интенсивной гипергидратацией волокон в период 7-дневной реадаптации после двухнедельного снятия опорной нагрузки В таком случае, оценивая изменения диаметра изолированных волокон мышц животных группы «Восстановление 7 дней», мы не могли наблюдать восстановления этого показателя Снижение удельной максимальной силы мышечных волокон т soleus при вывешивании крыс ранее показали (McDonald et al, 1995) Это может свидетельствовать, прежде всего, о том, что снижение абсолютной силы волокна не может быть следствием лишь уменьшения объема сократительного аппарата (атрофии), но должно быть обусловлено также и действием других внутриволоконных механизмов. Такими механизмами могут быть как изменения качественной структуры миофибрилл, включая избирательный распад белков саркомерного цитоскелета (Toursel et al, 2002), так и изменения кальциевой реактивности миофибриллярного аппарата, которые неоднократно наблюдались при исследовании волокон т soleus после пребывания в условиях микрогравитации (Stevens et al., 2002). В нашем исследовании, кривая, характеризующая зависимость относительного изометрического напряжения от концентрации кальция, у животных трех экспериментальных групп (вывешивание, восстановление 3 и 7 дней) была смещена вправо (рис 12 1) Аналогичный сдвиг кривой вправо был выявлен как в условиях моделирования действующих факторов невесомости на Земле (Kischel et al., 2001), так и после космического полета крыс (Mounier et al., 1991).

Рис 121 Зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон т. soleus крыс. Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла Показаны средние значения P/Pgtm. Черная кривая

- контрольная группа; красная кривая -вывешивание; светло-серая кривая -восстановление 3 дня; темно-серая кривая

- восстановление 7 дней.

В работах группы Моишег (2001) показано, что снижение чувствительности миофибрилл к кальцию при вывешивании крыс сопровождается изменениями паттерна изоформ тропонинов I и С. Авторы этого цикла работ полагают, что изменения паттерна тропонинов являются структурной основой изменений чувствительности миофибрилл к кальцию при гравитационной разгрузке Не

исключено также и то, что уменьшение сократительного ответа на данную концентрацию Са2+ обусловлено уменьшением вероятности образования необходимого количества актомиозиновых связей в результате количественных или конформационных изменений миофиламентов (Riley, 1998). Также было показано, что относительное содержание титина и небулина при вывешивании крыс значительно снижается (Shenkman, Podlubnaya, 2003). Следует отметить, что уменьшение относительного содержания небулина, который является важнейшим скелетным компонентом тонких миофиламентов, может обусловить их дезинтеграцию и соответствующее снижение вероятности образования актомиозиновых связей. А это в свою очередь может снизить Са2+ чувствительность миофибрилл.

Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) т. soleus у крыс. Поскольку идентифицированы различные изоформы Са-АТФазы, специфические для быстрого и медленного типов волокон скелетных мышц, а также показана более высокая активность Са-АТФазы для быстрых волокон по сравнению с медленными (Peters et al., 1999), можно предположить, что в ходе вывешивания в медленных волокнах синтезируется быстрая Са-АТФазы при подавлении синтеза медленной изоформы фермента. У крыс, подвергнутых 14-дневному антиортостатическому вывешиванию, обнаружено 40±3% волокон, содержавших быструю (SERCA I типа) изоформу Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, против 27±1% у контрольных животных (Рис. 1.2.2). Восстановление не приводило к определенной стабилизации распределения изоформ быстрой и медленной SERCA по мышечным волокнам. Однако, в группах восстановления как в течение 3, так и 7 дней увеличилась доля гибридных волокон, экспрессируюших SERCA обоих типов (I и II) и составила 17% и 14% соответственно. По-видимому, в период адаптации к возобновлению опорной нагрузки в медленных волокнах т. soleus, подвергнутых трансформации во время вывешивания, происходит постепенные процессы деградация синтезированных в ходе вывешивания быстрых изоформ Са-АТФазы и синтеза медленной Са-АТФазы, характерной для этого типа волокон в норме.

100%

80% -

40%

60%

20%

Рис 12 2 Соотношение мышечных волокон, содержащих SERCA I, SERCA И типа, а также SERCA I/II типа о т. soleus у крыс (%, M-fcm) 'достоверное отличие от контрольной группы (р<0,05).

Контроль Вывешивание Восстановление 3 Восстановление 7

■ SERCA II □ SERCA 1/11 типа

дня

дней

■ SERCA I типа

1.3. Роль опорного стимула. 7-ми суточная «сухая» иммерсия

В эксперименте приняли участие 8 добровольцев мужского пола: средний возраст 26,5013,16 лет, рост - 178,30+3,95 см, вес - 77,90+11,09 кг, которые прошли специальный медицинский отбор. Испытуемые были полностью информированы обо всех процедурах, применяемых в эксперименте, и дали письменное согласие на участие в нем. Эксперимент был одобрен Физиологической секцией Российской национальной комиссии по биологической этике.

Испытуемые были разделены на две группы. Контрольную группу составили 4 человека, в течение 7-ми суток находившихся в условиях «сухой» иммерсии без дополнительных воздействий. Испытуемого помешали в горизонтальном положении в специальную ванну, покрытую водонепроницаемой пленкой, изолирующую его от жидкости - воды. Размеры пленки значительно превосходят площадь поверхности воды, благодаря чему осуществляется свободное и практически полное погружение тела человека в воду. При этом достигается равномерное давление воды на всю поверхность тела, что моделирует полное отсутствие опорных стимулов, характерное для невесомости. Температуру воды автоматически поддерживали на уровне 33°С в течение всего времени воздействия. Во второй группе из 4-х человек, дополнительно к условиям иммерсии проводили искусственную стимуляцию глубоких рецепторов давления опорных зон стопы с помощью компенсатора опорной разгрузки. Разработанный в ИМБП совместно с НПО «Звезда» компенсатор опорной разгрузки представляет собой специальный ботинок, в подошву которого вмонтированы пневматические подушки, обеспечивающие давление на опорные зоны стопы в заданном режиме. Стимуляцию проводили ежедневно. Стимулы (0,2±0,15 кг/см2) подавали в течении 10 минут с частотой, соответствующей 75-ги шагам в минуту, и в течении 10 минут с частотой, соответствующей 120-ти шагам в минуту, в начале каждого часа в течение 6-ти часов

За неделю до начала иммерсии и в первый день после ее окончания из т soleus левой ноги забирали пробы мышечной ткани.

Анализ сократительных свойств одиночных волокон т. soleus человека. В эксперименте у всех испытуемых контрольной группы наблюдали уменьшение, как диаметра мышечных волокон в диапазоне от 15% до 34%, так и максимальной изометрической силы в диапазоне от 28% до 57% (табл. 1.3). Ранее было выявлено менее выраженное уменьшение этого показателя при исследовании эффектов 18-суточной АНОГ и 18-суточного космического полета (Yamashita-Goto et al, 2001, Fitts et al , 1998) После АНОГ снижение силы волокон составило соответственно 13%, после космического полета - 21% Таким образом, глубина изменений, полученных в настоящем исследовании, оказывается значительно большей, чем после кратковременной АНОГ и сопоставимой лишь с эффектами 18-дневного космического полета и длительной АНОГ Согласно данным более ранних исследований многие другие характеристики двигательного аппарата (изокинетическая сила мышц, показатели сухожильных рефлексов) при иммерсии претерпевают более глубокие изменения, чем в условиях гипокинезии (Григорьева, Козловская, 1987). Если считать, что степень безопорности при использовании иммерсионной модели значительно больше, чем при гипокинезии, и сопоставима со степенью безопорности, характерной для реальной невесомости, то можно предположить, что как размеры, так и сила мышечных волокон зависят в большей степени от опорного воздействия, чем от действия других биомеханических факторов

Исходя из этого предположения, целесообразно оценить эффекты иммерсии, сочетанной с прямой стимуляцией опорных зон стопы

Данные, полученные у испытуемых этой группы значительно отличались от данных основной группы У них было выявлено небольшое снижение диаметра волокон от 8% до 18% и отсутствие достоверных изменений максимального изометрического напряжения (табл 1.3) Таким образом, применение опорной стимуляции в значительной степени предотвратило снижение диаметра и силы отдельных мышечных волокон т salens у человека В более ранних экспериментах нашей лаборатории применение опорной стимуляции стопы предотвращало уменьшение размеров мышечных волокон т soleus и трансформацию медленных волокон в быструю сторону при вывешивании крыс (Shenkman, Nemirovskaya, 2000) Интересно, что выраженность этого эффекта была значительно менее выражена при иммобилизации т soleus. Эти данные были подтверждены в экспериментах DeDoncker и др (2001) и Clarke и др. (2005) с механостимуляцией опорных зон стопы у вывешенных крыс В нашем исследовании стимуляция опорного входа позволила предотвратить уменьшения сократительных возможностей волокон т soleus человека

Таблица 1.3.

Значения диаметра волокон (D), изометрического напряжения волокон абсолютной (Pö) и удельной (Р„,) силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (М±ш).

Параметры группа «Иммерсия» группа «Иммерсия + Опора»

до иммерсии (30 волокон) после иммерсии (27 волокон) до иммерсии (29 волокон) после иммерсии (29 волокон)

Д (мкм) 98±3,34 75,4+2,75* 91,31+5,13 81,2±3,5

Ро, (мН) 0,49 ± 0,01 0,34 ±0,03* 0,44+0,03 0,52+0,04*

Pvd, (кН/м') 65,25+3,4 70+3,8 67,2+4,9 91,2+9,96

рСат1„ 6,83 ± 0,02 6,64 + 0,02* 6,79 + 0,01 6,73 ±0,01

рСа50 5,78 + 0,02 5,66 + 0,01* 5,77 + 0,04 5,70 ±0,01*

•достоверное отличие от исходного уровня (р<0,05)

Интересно и то, что опорная стимуляция предотвращает также и уменьшение чувствительности миофибрилл к свободным ионам кальция, как правило, наблюдаемое при разгрузке. Так, кривая, отражающая зависимость относительной изометрической силы волокон от отрицательного логарифма концентрации ионов Са2+, после пребывания в условиях иммерсии сдвигается вправо, что свидетельствует о снижении чувствительности миофибрилл к ионам Са2+ (рис. 1.3.1). У испытуемых, применявших стимуляцию опорного входа на фоне иммерсии, не было обнаружено достоверных изменений этой кривой. В настоящем исследовании впервые получены прямые свидетельства влияния изменений опорной афферентации на сократительные характеристики мышечных волокон т $о1еш человека Не исключено, что это влияние опосредовано активностью двигательных единиц т. Это предположение вполне согласуется с результатами

экспериментов Ьаупе и соавторов (1998), обнаруживших увеличение электромиографической активности т. у космонавтов, применявших стимуляцию опорных зон стопы

7 6.6 6,2 5,8 5,4 рСа

4,6

группа «Иммерсия»

группа «Иммерсия+Опора»

Рис 1.3 I Зависимости напряжения от концентрации кальция сканированных единичных волокон т $о1еи$ человека. Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла Показаны средние значения Р/Рцкт. Синяя кривая - до иммерсии, красная кривая - после иммерсии.

Изменение сократительных свойств волокон под влиянием изменений активности опорного входа может быть опосредовано изменением активности двигательных единиц Киренская и др. (1986) показали, что уже после трех суток пребывания в сухой иммерсии субмаксимальная произвольная механическая активность разгибателей голени обеспечивается за счет активности быстрых, а не медленных (как в норме) двигательных единиц. Миллер, Саенко и др (2003) показали, что в ходе иммерсии происходит достоверное снижение электрической активности от. яокив, а при использовании опорного стимулятора на фоне иммерсии, такого уменьшения активности не наблюдается.

Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического регикулума (SERCA) в группе «Иммерсия». В настоящем исследовании впервые показано, что 7 дней «сухой» иммерсии привели к перераспределению экспрессии изоформ Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, а именно к увеличению SERCA I быстрого типа у всех испытуемых группы «Иммерсия» (рис. 1.3 2). Изменение содержания SERCA медленного типа в волокнах т soleus человека не было достоверным. Результаты, полученные в настоящем исследовании, полностью согласуются с данными, полученные в лаборатории S Kandarian (Peters et al, 1998) в экспериментах с вывешиванием крыс Таким образом, устранение опоры, обусловливая инактивацию медленных мотонейронов спинного мозга, вероятно, приводит к снижению механической активности медленных волокон т soleus. Накопление Са + в таком разгруженном мышечном волокне могло повлиять на структуры саркомерного цитоскелета, приводя к снижению максимальных силовых характеристик и Са-чувствительности миофибрилл.

Рш 112 (оотношение мышечных волокон содержащих SERCA I. StRCA II типа, а также SERCA I'll imia в т snlcus \ испытуемых группы «Имчермия» (% М-m) "доетвериое оыичие от исходных значений (/к0,05)

до иммерсии

после иммерсии

■SERCA И типа OSERCA1/11 типа ■ SERCA I типа

1.4. Накопление ионов кальция в разгруженном волокне. Вывешивание крыс в сочетании с внутрибрюшинным введением ЭГТА

В -эксперименте использовали 20 половозрелых самцов крыс линии \Vistai Животные были разделены на 4 группы но 6 крыс в каждой (и - количество животных в группе) !руппа I -«Контроль ■+ физраствор, фунпа № 2 «Контроль ЭГТА», группа № 3 «Вывешивание •4-физраствор». 1 рунна № 4 - «Вывешивание + ЭГТА».

Животные группы X" 1 - «Контроль + физраствор», находились в клетках в течение 14 дней каждые 48 часов им внуфибргашинно вводили 0,3 мл физиологического раствора Животным группы № 2 - «Контроль х ЭГТА» каждые 48 часов вводили 0.3 мл раствора ЭГТА (30 ЭГТА на 0,3 мл физио Ю1 ическою раавора) Животные фупны № 3 «Вывешивание + физраствор» в течение 14 дней находились в положении ашиортоста!ическою вывешивания, каждые 48 часов им внуфибрюшинно вводили 0.3 ч! физиоло!ичсского раствора Животные фуппы № 4 «Вывешивание 4 ЭГТА» также в течение 14 дней находились в положении антиортостатическою вывешивания, но им каждые 48 часов вводили 0,3 мл раствора ЭГТА (30 м! ЭГТА на 0,3 мл физиологического раствора) Забой животных проводили путем гильотинирования, после чет о из обеих задних конечное!ей крысы выделяли т ло/еш

Анализ сокраштсльных свойств одиночных волокон т. %о1еич крыс. Применение стандартной модели антиорюстатического вывешивания крыс приводило к достоверному снижению веса мышцы и диаметра изолированных волокон (табл 1 4) Эти данные находятся в полном соответствии с результатами, полученными ранее другими авторами при использовании аналогичной экспериментальной модели (Птошавоп е( а1, 1990) В этой экспериментальной серии нам не удалось обнаружив различий в степени развития гинофавитационной атрофии т чоки* между вывешенными животными, получавшими и не получавшими кальций-связывающий агент В нашем более раннем исследовании (Григорьев и др , 2002), выполненным с использованием друюю хелатора двухвалентных катионов (ЭДТА), 1акой »ффект был выявлен (хотя и на фоне глубоких нарушений гистологической структуры ткани) Возможно, такое расхождение

результатов связано с природой применяемого агента, и вопрос требовал последующего экспериментального разрешения. В настоящем исследовании обнаружено достоверное и значительное снижение максимальных значений абсолютной изометрической силы волокон в обеих группах вывешенных животных по сравнению с животными виварного контроля. Такое снижение также было ранее зарегистрировано рядом авторов (McDonald et al., 1995, Stevens et al., 1998). В то же время, в группе вывешенных животных, не получавших кальций-связывающий агент, снижение силы волокон было более глубоким, чем уменьшение их диаметра. При этом, естественно, удельная максимальная сила в этой группе животных оказывалась достоверно уменьшенной. Уменьшение удельной силы в аналогичных условиях гравитационной разгрузки было ранее отмечено в работе McDonald и др. (1995).

Таблица 1.4

Значения диаметра волокон (£>), изометрического напряжения волокон: абсолютной (Рд) и удельной (Р>й) силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (М±т).

Параметры Конгроль+физраствор (33 волокна) Контроль+ЭГТА (40 волокон) Вывешивание+физрасгаор (37 волокон) Вывешивание+ЭГТА (41 волокно)

D, (мкм) 75,6±1,84 78,5±2,05 60,0+3,10« 62,1+2,75*

Рв.(мН) 0,46 ± 0,01 0,48 ±0,03 0,26±0,03* 0,35+0,04*

Рул, (кН/м2) 100,2+3,1 109+4,5 90,3±6,8 105±9,77$

рСат,п 7,02 + 0,05 7,00 ±0,03 6,69 + 0,02* 7,10 + 0,05$

рСа50 5,86 + 0,02 5,85 + 0,01 5,67 ±0,02 6,05 ± 0,04s

•достоверные отличия от контрольной труппы (/><0,05); 'достоверное отличие от группы «Вьгвешивание+физра створ»

В условиях реальной и моделируемой микрогравитации, как правило, выявляется снижение кальциевой чувствительности миофибрипл (Mounier et al, 1991). В настоящей работе также наблюдался сдвиг кривой «кальций-сила» у животных, получавших инъекции плацебо на фоне гравитационной разгрузки, что свидетельствует о снижении чувствительности волокон т. soleus к ионам кальция (рис. 1.4.1). Известно, что волокна, содержащие быстрые изоформы тяжелых цепей миозина, обычно демонстрируют более низкую чувствительность к ионам кальция (Stevens et al., 1998). Поэтому можно вслед за рядом авторов интерпретировать снижение кальциевой чувствительности, как феномен, сопутствующий общей тенденции к трансформации мышечного фенотипа в «быструю» сторону в условиях разгрузки (Stevens et al., 2001, Bastide et al, 2002). Мы предположили, что повышенная базальная концентрация ионов кальция может быть одним из стимулов, обусловливающих снижение чувствительности миофибриллярного комплекса к кальцию в условиях гравитационной разгрузки. Если это предположение верно, то хроническое воздействие кальций-связывающим агентом, позволит полностью или частично предотвратить снижение кальциевой чувствительности миофибрилл у вывешенных животных. В настоящем исследовании пороговые значения рСа для животных, получавших инъекции ЭГТА, оказались выше ^соответственно пороговые концентрации ионов кальция - ниже), чем даже у группы виварного контроля. При этом кривая «Са-сила» у этих животных оказалась несколько смещенной влево от кривой группы виварного контроля (хотя значительное смещение наблюдается лишь для нижней части кривой). Таким образом, в полном соответствии с первоначальной гипотезой,

применение кальций-связывающего агента позволило полностью предотвратить снижение кальциевой чувствительности миофибриллярного комплекса в условиях гравитационной разгрузки Результаты эксперимента ясно указывают на то, что повышенная базальная концентрация ионов кальция в мышечных волокнах у вывешенных животных может быть одним из важных элементов механизмов внутриклеточной сигнализации, обусловливающих развитие глубоких функциональных изменений сократительного аппарата.

Рис 1.4.1. Зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон т зо!еш крысы. Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла. Показаны средние значения Р/РрЬт. Черная кривая -объединенная кривая групп № 1 и 2; красная кривая - группа № 3; голубая кривая - группа №4.

(I 05

Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (8ЕКСА). В

настоящем исследовании получены данные, позволяющие ответить на вопрос- «Влияет ли применение кальций-связывающего агента в условиях разгрузки на систему кальциевых каналов саркоплазматического ретикулума?»

У крыс, подвергнутых вывешиванию с введением физиологического раствора обнаружено достоверное увеличение (47%) волокон, содержавших быструю изоформу (ЯЕЯСА I типа) Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума (рис 1.4.2) При вывешивании животных, получавших инъекции ЭГТА. содержание волокон, содержавших ЭГЯСА I, составило 29+3%, что достоверно отличается от показателей группы вывешенных животных, получавших инъекции физиологического раствора и оказывается даже ниже значений, характерных для животных контрольной группы Таким образом, мы показали, что действие кальций-связывающего агента позволяет полностью предотвратить увеличение экспрессии быстрой изоформы кальциевой помпы саркоплазматического ретикулума. Этот результат позволяет высказать предположение о значимости накопления внутриволоконного кальция при гравитационной разгрузке для изменения важного звена системы электромеханического сопряжения в мышечных волокнах.

Итак, данные, полученные в настоящем исследовании, свидетельствуют о том, что применение кальций-связывающего агента (ЭГТА) приводит к уменьшению степени снижения максимального изометрического напряжения отдельных скинированных волокон /к. зо1ви5 у крыс, подвергнутых антиортосгатическому вывешиванию, полностью предотвращает снижение чувствительности миофибрилл к кальцию в отдельных скицированных волокнах т. зо!еш у крыс, подвергнутых антиортосгатическому вывешиванию, а также приводит к предотвращению процессов изменения экспрессии кальциевых помп саркоплазматического ретикулума.

I I I I!

60% fPP

Рис 1.4 2. Соотношение мышечных волокон, содержащих SERCA I, SERCA II типа, а также SERCA I/II типа в т soleus крыс (%, М±ш) Достоверное отличие от исходных значений.

□ SERCA И О SERCA l/ll HSCRCA I I

Часть II. Эффекты интервальной тренировки на велоэргометре

В исследовании приняли участие 7 практически здоровых мужчин 23-29 летнего возраста, вес 68,1±3,5 кг. Тренировочные занятия проводили 5 раз в неделю: с понедельника по пятницу в течение месяца. Они включали разминку, основную часть и «заминку».

Разминка состояла из 3-минутной работы на велоэргометре с мощностью аэробного порога (АэП), которая составляла 102-157 Вт. Основная часть состояла из непрерывной работы постоянной мощности или работы переменной мощности. В зависимости от фазы тренировочного цикла соотношение между тренировочными занятиями с нагрузками постоянной и переменной мощности менялось. С 1-ой по 4-ую неделю оно составило 2.3, а с 5-й по 9-ю неделю 1.4. Во время тренировочного занятия с нагрузкой постоянной мощности испытуемые выполняли работу на велоэргометре с мощностью на уровне ниже порога анаэробного обмена (ПАНО) - 175-210 Вт в течение 50 минут (лактат на 10-30 мин работы 3-3,5 ммоль/л). Тренировочное занятие с нагрузкой переменной мощности состояло из чередующихся 2-минутной пиковой нагрузки мощностью выше mol- аости ПАНО (218-274 Вт), и 4-минутной нагрузки с мощностью на уровне АэП (102-157 Вт). «Заминка» для обеих групп состояла из 2-минутной работы на велоэргометре с мощностью АэП (102-157 Вт) и растягивания мышц сгибателей и разгибателей коленного сустава и разгибателей тазобедренного сустава (отдельно левой и правой ноги) в статическом режиме в течение 1 мин. Коррекцию мощности тренировочных нагрузок проводили на 2 и 4 неделе.

Пробы мышечной ткани забирали из т. vastus lateralis дважды: до начала эксперимента и через 5 дней после окончания силовой тренировки и проведения всех тестов.

Анализ сократительных свойств одиночных волокон волокон т, vastus lateralis человека. Тридцатисуточная тренировка на велоэргометре в интервальном режиме привела к достоверному приросту удельного напряжения одиночных волокон т vastus lateralis на фоне 3%-ного увеличения диаметра мышечного волокна, и 5%-ого увеличения максимальной силы. Показатели кальциевой чувствительности (рСат„ и рСа») после такой тренировки достоверно увеличились

Это повлекло за собой смещение кривой зависимости относительного изометрического напряжения скинированных волокон от концентрации кальция, выраженной в величине рСа, влево (рис. 2)

Табл. 2

Значения диаметра волокон т vastus lateralis (D). изометрического напряжения волокон- абсолютной (Р0) и удельной (Руд) Силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (М±т)

Параметры до тренировки (38 волокон) после тренировки (46 волокон)

D, (мкм) 97,23±0,59 100,77±0,50

РоХ мН) 1,58±0,05 1,65±0,06

Руъ (кН/м2) 203,78±6,12 215,62+5,23*

рСатт 7,00±0,04 7,11 ±0,05*

pCaso 5,73+0,07 5,95+0,05*

* достоверное отличие от исходного уровня (р<0,05).

100 т

t 50

6.6

5,8 PC«

5,4

4,6

Рис. 2 Зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон т. vastus lateralis человека Кривые получены

аппроксимацией данных уравнением Хилла. Показаны средние значения Р/Р^кт. Черная кривая - до тренировки; красная кривая -после тренировки

Аналогичные результаты были получены ранее при исследовании эффектов силовой тренировки (Plant et al., 2003) При спринтерской тренировке приросты произвольной силы достигались преимущественно за счет оптимизации системы центрального управления движениями, при этом изменений сократительных характеристик отдельных волокон не было обнаружено (Harber et al., 2003). В настоящем исследовании интервальная тренировка, часто используемая в практике подготовки спортсменов самых разных специализаций, оказалась достаточно эффективной в отношении изменений как удельной силы, так и показателей, характеризующих сократительные свойства волокна в субмаксимальном диапазоне.

ВЫВОДЫ:

1. Уменьшение диаметра, максимального изометрического напряжения, а также показателей кальциевой чувствительности миофибрилл единичных скинированных волокон т. soleus является закономерным следствием пребывания в условиях гравитационной разгрузки.

2 Гравитационная разгрузка приводит к увеличению доли волокон, содержащих быструю изоформу Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA I), в т. soleus.

3. Применение механической стимуляции опорных зон стопы на фоне 7-суточной «сухой» иммерсии у человека предотвращает снижение силы одиночных мышечных волокон т. soleus и уменьшение чувствительности миофибрилл к ионам Са2+.

4 Введение кальций-связывающего агента на фоне антиортостатического вывешивания крыс приводит к уменьшению степени снижения максимального изометрического напряжения отдельных скинированных волокон m soleus, а также предотвращает снижение чувствительности миофибрилл этих волокон к кальцию и изменения экспрессии изоформ кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума

5 Интервальная тренировка на велоэргометре приводит к увеличению удельного изометрического напряжения и кальциевой чувствительности миофибрилл в т. vastus lateralis человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Методы и аналитические технологии для анализа механических характеристик скелетных мышц животных применительно к задачам космической биологии и медицины. // I Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню космонавтики. Тезисы докладов. Москва. - 2002. - С.20.

2. Методы и аналитические технологии для анализа механических характеристик скелетных мышц животных применительно к задачам космической биологии и медицины. // 7-ая международная конференция «Системный анализ и управление космическими комплексами». Тезисы докладов. Евпатория. - 2002. - С.61.

3. Эффекты кальций-связывающего агента в m.soleus крыс на фоне моделируемой гравитационной разгрузки. // Доклады Академии Наук. - 2002. - Т.284, - С.833-836. (соавт Григорьев А.И., Шенкман Б.С., Белозерова И.Н., Немировская ТЛ., Матвеева O.A., Безымянный A.C.)

4. Effects of Са2+- binding agents on unloaded rat soleus: muscle morphology and sarcomeric titin content. // J. Grav. Physiol. - 2002. - V.9(l). - P.139-140. (coauthors Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L., Belozerova I.N., Vikhlyantsev I.M., Matveeva O.A., Podlubnaya Z.A.)

5. Сократительные характеристики отдельных скинированных волокон m.soleus крысы в условиях гравитационной разгрузки: кальциевые механизмы. // II Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню космонавтики. Тезисы докладов. Москва. - 2003. - С.27. (соавт. Шенкман Б.С., Немировская T. JI.)

6. Сократительные характеристики одиночных скинированных мышечных волокон крысы при действии кальций-связывающего агента на фоне гравитационной разгрузки. П Международная конференция по физиологии мышц и мышечной деятельности. МГУ

им. М В. Ломоносова Тезисы докладов. Москва - 2003. - С 37-38 (соавт Шенкман Б.С., Немировская Т. Л.)

7. Сократительные характеристики одиночных скинированных волокон m. soleus крысы в условиях гравитационной разгрузки: эффекты кальций-связывающего агента. // Биофизика

- 2003, - Т.48. - С.905-910. (соавт Козловская И.Б., Немировская Т.Л., Шенкман Б С )

8. Effect of artificial support stimulation on soleus single fiber characteristics in men exposed to 7-day "dry" immersion. // 24th Annual International Gravitational Physiology Meeting Abstracts. Santa Monica California. - 2003. (coauthors Nemirovskaya T.L., Gasnikova N.M, Kozlovskaya I.B., Shenkman B.S.)

9 Effect of Ca2+-binding agent on contractile characteristics of single skinned soleus fibers in hindlimb suspended rats. // 24th Annual International Gravitational Physiology Meeting Abstracts. Santa Monica California. - 2003. (coauthors Nemirovskaya T.L., Shenkman B.S.)

10. Effects of artificial support stimulation on soleus single fiber characteristics in men exposed to 7-day dry immersion // J Muscle Res. Cell Motil. - 2003. - V.24. - P.374. (coauthors Nemirovskaya T.L., Gasnikova N.M., Kozlovskaya I.B., Shenkman B.S.)

11. Сократительные характеристики волокон и белки саркомерного цитоскелета m soleus человека в условиях гравитационной разгрузки. Роль опорного стимула. // Биофизика. - 2004

- Т.49. - С 881-890 (соавт. Шенкман Б.С., Подлубная З.А., Вихлянцев И М , Удальцов С Н., Немировская Т.Л., Лемешева Ю.С , Мухина A.M., Козловская И.Б.)

12 Effects of artificial support stimulation on fiber and molecular characteristics of soleus muscle in men exposed to 7-day dry immersion. // J. Grav. Physiol. - 2004. - V.l 1. - P 131-133. (coauthors Vikhlyantsev I.M., Kozlovskaya 1.В., Podlubnaya Z.A , Shenkman)

13 Afferent and peripheral control of muscle fiber properties during gravitational unloading. // J. Grav. Physiol. - 2004. - V.ll. - P.111-114. (coauthors B.S. Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L., Podlubnaya Z.A., Vikhlyantsev I.M., Kozlovskaya I.B.)

14. Эффекты накопления базального кальция миоплазмы в условиях гравитационной разгрузки. // IV Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню космонавтики. Тезисы докладов. Москва. - 2005. - С 28. (соавт. Мухина A.M.)

15. Креатин как метаболический модулятор свойств мышечных волокон человека в условиях силовой тренировки // Физиология мышц и мышечной деятельности. Материалы П1 Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности. Москва. - 2005. - С.35. (соавт. Б.С. Шенкман Б.С., Гасникова Н.М., Таракин П.П., Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Немировская Т.Л., Хотченков В.П., Стеханова Т.Н., Попов Д.В., Нетреба А.И., Виноградова О.Л.)

16. Effects of Cai+-biding EGTA on content of sarcomeric cytoskeletal proteins and fiber contractility in hindlimb suspended rats. // 9th European Symposium on Life Sciences Research in Space. 26* Annual International Gravitational Physiology Meeting. Abstracts. Cologne, Germany. - 2005.

- P. 147. (coauthors Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A., Shenkman B.S.)

17. Effect of Ca2+-biding agent EGTA on fiber contractility and sarco(endo)plasmatic reticulum Ca-ATPase isoform distribution in hindlimb suspended rats // Basic Appl. Myol. - 2005. - 15 (2).

- P. 103-104. (coauthors Moukhina A.M., Shenkman B.S.)

Исследование поддержано грантами РФФИ №№ 99-04-48961, 01-04-48617, 02-04-50025, 03-0406691, 03-04-48487, 04-04-49044, 04-04-48617 и Программой фундаментальных исследований Российской академии наук и Министерства промышленности, науки и технологии РФ.

»2276 5

РНБ Русский фонд

2006-4 ^

24708

Подписано в печать 15.11.2005. Формат 84x108/32. Тираж 100 экз. Заказ №1564.

Отпечатано в печатном салоне «Р-Принт»: '

125015, г. Москва, ул. Б. Новодмитровская, д. 14, оф. 517 Тел. (095) 730-74-05 доб. 156,257.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Литвинова, Карина Сергеевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

Is,, 2.1. Сокращение мышечных волокон. 2.2. Сократительные свойства одиночных волокон млекопитающих.

2.3. Эффекты гравитационной разгрузки.

2.3.1. Снижение сократительных свойств. 2.3.2. Уменьшение мышечной массы и размеров мышечных волокон.

2.3.3. Изменения миозинового фенотипа и системы электромеханического сопряжения в условиях микрогравитации.

2.4. Факторы гравитационной разгрузки, влияющие на снижение сократительных свойств.

V 2.5. Сократительные свойства в условиях тренировки.

3. Методы обработки и анализа материала.

3.1. Забор и хранение экспериментального материала.

3.2. Обработка экспериментального материала.

3.2.1. Анализ сократительных свойств единичных скинированных мышечных волокон.

I 3.2.2. Иммуногистохимический анализ мышечных срезов, окрашенных моноклональными антителами против SERCA I и SERCA II.

3.2.3. Измерение базальной концентрации ионов кальция в миоплазме мышечных волокон т. soleus.

3.3. Статистическая обработка результатов.

4. Организация исследований, результаты.

4.1. Видовая специфичность сократительных характеристик одиночных волокон млекопитающих.

4.2. Эффекты гравитационной разгрузки.

4.2.1. Исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц космонавтов до и после длительного космического полета.

4.2.2. Исследование сократительных характеристик единичных волокон ^ т. soleus крыс в период 3-х и 7-дневного восстановления после 2недельного снятия опорной нагрузки.

4.2.3. Системные механизмы. 7-ми суточная «сухая» иммерсия.

4.2.4. Клеточные механизмы. Накопление ионов кальция в разгруженном s волокне. у 4.3. Эффекты тренировки. Аэробная тренировка на велоэргометре в интервальном режиме.

5. Обсуждение.

5.1. Видовая специфичность сократительных характеристик одиночных волокон т. soleus млекопитающих.

5.2. Эффекты гравитационной разгрузки. 5.2.1. Исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц космонавтов до и после длительного космического полета.

5.2.2. Исследование сократительных характеристик единичных волокон т. soleus крыс в период 3-х и 7-дневного восстановления после 2-недельного снятия опорной нагрузки.

5.2.3. Системные механизмы. 7-ми суточная «сухая» иммерсия.

5.2.4. Клеточные механизмы. Накопление ионов кальция в разгруженном волокне.

5.3. Эффекты тренировки. Аэробная тренировка на велоэргометре в интервальном режиме.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние гравитационной разгрузки и тренировки на характеристики кальций-механической связи в изолированных волокнах скелетных мышц"

Пребывание в условиях реальной или моделируемой гравитационнойразгрузки приводит к значительным изменениям сократительныххарактеристик мышечных волокон млекопитающих [1,2,3,4]. Некоторыеавторы связывают изменение сократительных свойств с изменением объёмамиофибриллярного аппарата [1,2]. В то же время, показано, что изменениесилы изолированных волокон оказывается более глубоким, чем изменение ихструктурных параметров [3,4]. Итак, сократительные свойства отдельныхмышечных волокон могут зависеть от:1. объёма сократительного аппарата;2. качественного и количественного состава миофибриллярных белков;3. от параметров системы электромеханического сопряжения (в том числе,от кальциевой чувствительности миофибрилл);4. жесткости мышечных волокон.Роль каждого из этих факторов в процессе снижения сократительных свойствмышечных волокон и клеточные механизмы такого снижения пригравитационной разгрузке в значительной степени остаются неизученными.В мышечном волокне кальций не только участвует в регуляцииметаболических процессов, но и выполняет основную роль вэлектромеханическом сопряжении, обеспечивающем передачу сигнала омышечном сокращении на миофибриллы. Согласованная работа кальциевыхканалов и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума обеспечивает тонкуюрегуляцию сократительной активности мыщечных волокон.О чувствительности миофибрилл к ионам кальция обычно судят похарактеристикам кривой «кальций-сила», отражающей зависимостьизометрического напряжения изолированных, как правило, скинированныхволокон от концентрации кальция в растворе [5]. При этом, сдвиг кривойвправо (в сторону меньших значений рСа и соответственно больших значенийконцентрации ионов кальция) свидетельствует о снижении чувствительностимиофибрилл к ионам кальция. Известно, что, как у животных (крыс и обезьян),так и у человека после космического полета наблюдается снижение Сачувствительности миофибрилл [1,2,3]. Такой же сдвиг кривой «Са-сила»вправо был выявлен и в условиях моделирования действующих факторовневесомости на Земле: в экспериментах с вывешиванием крыс [6] и в условияхантиортостатической гипокинезии в исследованиях с участием добровольцев[3]. В то же время, механизмы внутриклеточной сигнализации, зависимые отсократительной активности волокна in vivo, и запускающие цепь событий,ведущую к снижению Са-чувствительности миофибрилл до сих порнеизвестны.При анализе физиологических механизмов пластичности жизненноважных функций обычно сочетают исследования с участием человека,позволяющие описать основные процессы, развивающиеся при хроническомизменении режима функционирования системы в реальной экологофизиологической обстановке, разработать и применить основные принципыстратегии управления этими процессами с исследованиями на биологическихмоделях. Экспериментальные исследования на животных нозволяют не толькопровести детальный анализ описываемых процессов, но и изучить глубинныемеханизмы структурно-функциональных перестроек, что невозможно безприменения более жестких, чем это возможно для человека методоввоздействия. Кроме того, действие этических норм не позволяет оставитьчеловека в неблагоприятной среде обитания без соответствующих мерпрофилактики и коррекции, что в свою очередь затрудняет корректныйэкспериментальный анализ физиологических механизмов. Все вышесказанноеимеет непосредственное отношение к исследованиям в областигравитационной физиологии скелетных мышц. Более того, использованиефизических упражнений в условиях космического полета как наиболееоптимального средства профилактики неблагоприятных измененийбольшинства физиологических систем, делает абсолютно необходимымработу на экспериментальных животных для исследования реальныхпроцессов, происходящих при гравитационной разгрузке, без дополнительныхвоздействий.Цель работыИзучение закономерностей и механизмов изменений сократительныхсвойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряженияволокон скелетных мышц человека и животных при гравитационнойразгрузке и тренировке.Задачи исследования1. исследовать сократительные свойства изолированных мышечныхволокон, а также характеристики клеточных маркеровэлектромеханического сопряжения у человека и животных,подвергнутых воздействию реальной и моделируемой гравитационнойразгрузки;2. оценить роль системных и клеточных механизмов в изменениисократительных характеристик волокон позно-тонических мышц вусловиях гипогравитации;3. исследовать сократительные свойства и кальциевую зависимостьсокраш;ений изолированных мышечных волокон при физическойтренировке у человека.8Научная новизна работы:- внервые обнаружено, что гравитационная разгрузка нриводит кнерераснределению экспрессии изоформ белков Са-АТФазы5-^ сарконлазматического ретикулума, а именно увеличивается SERCA Iтина (быстрого типа);- внервые установлено, что в 3-х и 7-дневный период возвращения копорной нагрузке после 14-дневной гравитационной разгрузки непроисходит восстановления сократительных возможностей одиночныхI мышечных волокон;- впервые показано, что в группах реадаптации как в течение 3, так и 7дней увеличилась доля гибридных волокон, экспрессирующих SERCAмедленного и быстрого тина (I и II);- впервые выявлено, что стимуляция опорного входа стоны позволяетпредотвратить уменьшение сократительных возможностей волокон>«; т. soleus человека;- впервые показано и доказано, что опорная стимуляция предотвраш;аетуменьшение чувствительности миофибрилл к свободным ионам кальция;- впервые обнаружено, что применение кальций-связываюп];его агентапозволяет полностью предотвратить снижение кальциевойчувствительности миофибриллярного комплекса в условияхгравитационной разгрузки;* - впервые показано, что внутрибрюшинное введение ЭГТА на фонегравитационной разгрузки приводит к предотвраш;ению процессовизменения экспрессии кальциевых помп саркоплазматическогоретикулума;- впервые установлено, что 4-недельная тренировка в интервальномрежиме приводит к увеличению удельной силы одиночных мышечныхволокон т. vastus lateralis человека.Научная и практическая значимостьПолученные результаты расширяют представления о роли некоторыхфакторов, влияюш;их на сократительные свойства одиночных волоконскелетных мышц в условиях гравитационной разгрузки и тренировки. Этирезультаты имеют большое практическое значение, поскольку исследованиесократительных свойств и некоторых нараметров системыэлектромеханического сопряжения в мышцах человека при моделируемой иреальной гравитационной разгрузке нозволяет оценить эффективностьподходов, направленных на уменьшение или предотвраш;ение негативноговлияния невесомости на мышцы.Результаты исследования используются в учебном процессе аспирантовГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН. Основные положения, выносимые на защиту:1. Снижение максимальной силы скинированных волокон т. soleus вусловиях гравитационной разгрузки обусловлено устранениемопорного стимула.2. Снижение сократительных возможностей мышечных волокон пригравитационной разгрузке связано с накоплением ионов кальция вмиоплазме.3. Тренировка на велоэргометре в интервальном режиме, которая частоиспользуется в подготовки спортсменов разных специализаций,приводит к увеличению удельной силы единичных волокон.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Литвинова, Карина Сергеевна

ВЫВОДЫ:

2. Гравитационная разгрузка приводит к увеличению доли волокон, содержащих быструю изоформу Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA I), в т. soleus. ■

4. Введение кальций-связывающего агента на фоне антиортостатического вывешивания крыс приводит к уменьшению степени снижения максимального изометрического напряжения отдельных скинированных волокон т. soleus, а также предотвращает снижение чувствительности миофибрилл этих волокон к кальцию и изменения экспрессии изоформ кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума.

5. Интервальная тренировка на велоэргометре приводит к увеличению удельного изометрического напряжения и кальциевой чувствительности миофибрилл в т. vastus lateralis человека.

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить своих научных руководителей Б.С. Шенкмана и А.К. Цатуряна за постоянную помощь и поддержку. Также автор хотел бы поблагодарить сотрудников лаборатории 0-063 за помощь в проведении экспериментов на животных, особенно Гасникову Н.М., сотрудников лаборатории 0-061 и лаборатории J1-3, принимавших участие в организации эксперимента с сухой иммерсией, интервальной тренировкой и силовой тренировкой мышц разгибателей коленного сустава на фоне применения креатина, испытателям-добровольцам.

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные настоящего исследования позволили сформировать ряд наиболее '' общих представлений о сократительных характеристиках изолированных волокон мышц в условиях гравитационной разгрузки и тренировки.

Двигательная система наземных животных и человека развивается в условиях гравитации и организована применительно к действию гравитационных сил. Переход к невесомости сопровождается глубокими ф изменениями сократительных характеристик мышечных волокон т. soleus человека. В исследованиях на космонавтах в условиях реального космического полета обнаружено уменьшение диаметра волокон и изометрической силы одиночных волокон т. soleus. При этом уменьшение диаметра у космонавтов после полета было больше, чем изменение развиваемой ими абсолютной силы. Таким образом, гравитационная разгрузка приводит и к снижению удельной силы волокон.

В настоящем исследовании впервые показано, что гравитационная разгрузка приводит к перераспределению экспрессии изоформ белков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума в т. soleus человека, а именно увеличивается процент волокон, экспрессирующих SERCA I типа и уменьшается процент волокон, экспрессирующих SERCA II.

Пребывание в условиях гравитационной разгрузки приводит также к уменьшению чувствительности миофибрилл к свободным ионам Са2+.

Однако стандартные бортовые нагрузки и система профилактики космонавтов оказали заметное коррекционное воздействие на сократительные свойства одиночных волокон скелетных мышц в условиях длительного пребывания в реальной невесомости, но не предотвратили изменения экспрессии белков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума. Этот факт можно связать со снижением чувствительности миофибрилл к кальцию и смещением вправо кальциевой кривой.

Исследования сократительных свойств одиночных волокон т. soleus после пребывания человека в условиях невесомости были дополнены исследованиями в условиях 14-суточного антиортостатического вывешивания животных. Как и после космического полета, пребывание в условиях моделируемой микрогравитации привело к значительным изменениям сократительных характеристик мышечных волокон т. soleus у крыс. Наблюдали уменьшение диаметра, абсолютной и удельной силы изолированных волокон. Недельное восстановление не привело к увеличению ни одного из приведенных показателей. Кривая, характеризующая зависимость относительного изометрического напряжения от концентрации кальция, у животных трех экспериментальных групп (вывешивание, восстановление 3 и 7 дней) также была смещена вправо.

По данным многолетних исследований, проведённых в ИМБП, одним из ведущих факторов в развитии изменений силы скелетных мышц является отсутствие опорной афферентации. При устранении опорных нагрузок в эксперименте 7-дневной «сухой» иммерсии наблюдали снижение сократительных свойств мышечных волокон человека.

Раздражения опорных рецепторных зон играют существенную роль в организации тонических реакций мышечного аппарата [34,54,56]. Впервые показано, что применение опорной стимуляции полностью предотвратило снижение силы отдельных мышечных волокон т. soleus у человека. Более того, у испытуемых группы «Иммерсия+Опора» было обнаружено достоверное повышение уровня максимального изометрического напряжения волокон на 18%. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что снижение максимальной силы скинированных волокон т. soleus в условиях гравитационной разгрузки обусловлено устранением опорного стимула.

В настоящем эксперименте было не только впервые обнаружено уменьшение чувствительности миофибрилл к Са2+ для волокон т. soleus в условиях сухой иммерсии, но и показано полное предотвращение этого эффекта при использовании стимулятора опоры. Аналогичный феномен был обнаружен нами в эксперименте с вывешенными крысами, которые одновременно подвергались воздействию Са-связывающего агента (ЭГТА) [70,76]. Известно, что гравитационная разгрузка приводит к избыточному увеличению концентрации Са2+ в покоящемся волокне [24,71,72]. Поскольку хроническое воздействие Са-связывающего агента не только привело к полному предотвращению сдвига кривой «кальций-сила» вправо, но и обусловило достоверное повышение чувствительности миофибрилл к Са2+, нами был сделан вывод о важной (если не решающей) роли накопления ионов Са2+ в миоплазме в изменении кальциевой чувствительности миофибрилл при гравитационной разгрузке. Возможно, что активация опорных афферентов у испытуемых группы «Иммерсия+Опора», повышая механическую активность волокон т. soleus, нивелирует пассивное накопление Са , что в свою очередь предотвращает изменение Са-чувствительности миофибрилл.

Какие же клеточные механизмы обусловливают развитие атонических и атрофических изменений мышечных волокон при их инактивации в результате устранения опоры?

Нами впервые показано, что повышенный уровень ионов кальция в миоплазме в условиях разгрузки является одним из пусковых стимулов к развитию изменений клеточных факторов, определяющих механические характеристики мышечных волокон.

Амплитуда этих изменений будет снижена при хроническом связывании ионов кальция в условиях разгрузки. Нами впервые показано, что применение кальций-связывающего агента (ЭГТА) приводит к уменьшению степени снижения максимального изометрического напряжения отдельных скинированных волокон т. soleus у крыс, подвергнутых антиортостатическому вывешиванию, полностью предотвращает снижение чувствительности миофибрилл к кальцию в этих волокнах, а также приводит к предотвращению процессов изменения экспрессии изоформ кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума.

Последняя проблема, которой мы занимались - это исследование сократительных характеристик изолированных волокон в условиях силовой тренировки.

Результаты, полученные в настоящем исследовании, однозначно свидетельствуют об увеличении силовых характеристик, размеров волокон и кальциевой чувствительности миофибрилл одиночных волокон т. vastus lateralis после 4 недель велоэргометрической тренировки в интервальном режиме. Прием креатина на фоне силовой тренировки влияет на сократительные характеристики в диапазоне субмаксимального уровня активации - кальциевую чувствительность. В настоящем исследовании впервые обнаружено, что кривая, отражающая зависимость относительной изометрической силы от отрицательного логарифма концентрации ионов Са , после силовой тренировки на фоне применения креатина сдвигается влево. Это означает, что чувствительность миофибрилл к ионам Са достоверно увеличивается.

Таким образом, изучение сократельных свойств волокон т. soleus человека и млекопитающих в условиях реальной и моделируемой микрогравитации помогает оценить эффективность подходов, направленных на устранение негативного влияния гравитационнои разгрузки на мышцы. Полученные результаты являются основой для дальнейшего поиска наилучших подходов к снижению или предотвращению атрофии мышц у человека в условиях реальной невесомости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Литвинова, Карина Сергеевна, Москва

1. Mounier Y, Stevens L, Shenlcman BS, Kischel P, Lenfant AM, Montel V,

2. Catinot MP, Toursel T, Picquet F. Effect of spaceflight on single fiber function of triceps and biceps muscles in rhesus monkeys. J Gravit Physiol. 2000. 7: 51-52.

3. Stevens L, Mounier Y, Holy X. Functional adaptation of different rat skeletal muscles to weightlessness. Am J Physiol. 1993. 264(4): 770-776.

4. Widrick JJ, Knuth ST, Norenberg KM, Romatowslci JG,Bain JL, RileyШ

5. DA, Karhanek M, Trappe SW, Trappe ТА, Costill DL, Fitts RH. Effect of a 17-day spaceflight on contractile properties of human soleus muscle fibres. J Physiol. 1999. 516: 915-930.

6. Mounier Y, Holy X, Stevens L. Compared properties of the controctile system of skinned slow and fast rat muscle fibers. Pflugers Arch. 1989. 415: 136-141.

7. McDonald KS and Fitts RN. Effect of hindlimb unweighting on single soleus fiber maximal shortening velocity and ATPase activity. J Appl

8. Ф Physiol. 1993. 74(6): 2949-2957.

9. Мак-Комас А.Дж. Скелетные мышцы. К: «Олимпийская литература». 2001.

10. Гистология. Под редакцией Афанасьевой Ю.И., Юриной Н.А. М.: < «Медицина». 1999.

11. Маилян Э.С., Коваленко Е.А. Влияние космического полета на биоэнергетику скелетных мышц крыс. В кн. «Влияние динамическихфакторов космического полета на организм животных». М. Наука. 1979.109-111.

12. Юганов Е.М., Касьян И.И., Черепахин М.А., Горшков А.И. О некоторых реакциях человека в условиях пониженной весомости. Проблемы косм. биол. 1962. 2: 206-214.

13. Fitts RH, Brimmer CJ, Heywood-Cooksey A, Timmerman RJ. Single muscle fiber enzyme shifts with hindlimb suspension and immobilisation. Am J Physiol. 1989. 256(5 Pt 1): 1082-1091.

14. Galler S, Hilber K, Gohlsch B, Pette D. Two functionally distinct myosin heavy chain isoforms in slow skeletal muscle fibres. FEBS Lett. 1997. 410: 150-152.

15. Galler S. Ca2+-, Sr2+-force relationships and kinetic properties of fast-twitch rat leg muscle fibre subtypes. Acta Physiol Scand. 1999. 167: 131141.

16. Kozlovskaya I, Dmitrieva I, Grigorieva L, Kirenskaya A, Kreydich Yr. Gravitational mechanisms in the motor sistem. Stydies in real and simulated weightlessness. In: Stance and Motion. J Massion Plenum. New York. 1988. 37-48.

17. Киренская A.B., Козловская И.Б., Сирота М.Г. Влияние иммерсионной гипокинезии на характеристики ритмической активности двигательных единиц камбаловидной мышцы. Физиол. Человека. 1986. 12(1): 617-632.

18. Оганов B.C. Исследование влияния невесомости на сократительные свойства скелетных мышц различного функционального назначения. Нервный контроль структурно-функциональной организации скелетных мышц. Л". Наука. 1980. 142-162.

19. Григорьева Л.С., Козловская И.Б. Влияние невесомости и гипокинезии на скоростно-силовые свойства скелетных мышц человека. Косм. биол. и авиакосм. мед. 1987. 21(1): 27-30.

20. Kozlovskaya IB, Grigoriev AI, Stepanzov VI. Countermeasure of the negative effects of weightlessness on physical systems in long-term space flights. Acta Astronautica. 1995. 36(8-12): 661-668.

21. Оганов B.C., Скуратова С.А., Мурашко JI.M. Сократительные свойства скелетных мышц крыс после космического полета на искусственном спутнике Земли "Космос-1887". Косм. биол. авиакосм, мед. 1991.25(2): 44-47.

22. Holy X, Oganov V, Moimier Y, Scuratova S. Cosmportement des proteines contractiles de fibres musculaires de rats soumis a la microgravite. CR AcadSc Paris. 1986. 303(6): 229-234.

23. Oganov VS. Results of biosatellite studies of gravity-defendent changes in the musculo-sceletal system of mammals. The Physioligist. 1981. 24(6): 55-58.

24. Oganov VS. Functional plasticity of skeletal muscles of mammals in space flight. The Polish J of Medicine and Pharmacy. 1990. 22(4 Pt 76): 251254.

25. Widrick Д Romatowski JG, Norenberg KM, Knuth ST, Bain JL, Riley DA, Trappe SW, Trappe ТА, Costill DL, and Fitts RH. Functional properties of slow and fast gastrocnemius muscle fibers after a 17-day spaceflight. JAppl Physiol. 2001.90: 2203-2211.

26. Arutyunyan RS, Kozlovskaya IB, Nasledov GA, Nemirovskaya TL, Radzyukevitch TL, Shenkman BS. The Contraction of Unweighted Fast and Slow Rat Muscles in Calcium-Free Solution. Basic and Appl Myology. 1995. 5(2): 169-175.

27. Yamashita-Goto К, Okuyama R, Honda M, Kawasaki K, Fujita K, Yamada T, Nonaka I, Ohira Y, Yoshioka T. Maximal and submaximal forces of slow fibers in human soleus afiter bed rest. J Appl Physiol. 2001. 91:417-424.

28. Yoshioka T, Takuhiko S, Tazoe T, Yamashita-Goto K. Ultrastructural and metabolic profiles of single muscle fibers of different types afiter hindlimb suspension in rats. Acta Astronautica. 1996. 38(3): 209-212.

29. Musacchia XJ, Steffen JM, Fell RD, Dombrovski MJ. Skeletal muscle response to spaceflight, wholebody suspension and recovery in rats J Appl Physiol. 1990. 69(6):2248-2253.

30. Thomason DB, Booth FW. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 1990. 68(1): 1-12.

31. Оганов B.C., Скуратова СЛ., Мурашко JI.M., Ширвинская M.A., Силади Т., Сер А., Рапчак М., Оганесян С.С., Давтян Ж.С. Изменения состава и свойств сократительных белков после космического полета. Биофизика. 1982. 27(1): 26-29.

32. Desplanches D, Mayet МН, Sempore В, Flandrois R. Structural and functional responses to prolonged hindlimb suspension in rat muscle. J Appl Physiol. 1987. 63(2): 558-563.

33. Riley DA, Slocum GR, Bain JL, Sedlak FR, Sowa ТЕ, Mellender JW. Rat hindlimb unloading: soleus histochemistry, ultrastructure, and electromyography. J Appl Physiol 1990. 69(1): 58-66.

34. Ohira Y, Jiang B, Roy RR, Oganov V, Ilyina-Kakueva E, Marini IF, Edgerton VR. Rat soleus fiber responses to 14 days of spaceflight and hindlimb suspension. J Appl Physiol. 1992. 73(2): 51-57.

35. Shenkman BS, Kozlovskaya IB, Kuznetsov SL, Nemirovskaya TL, Desplanches D. Plasticity of skeletal muscle fibres in space-flown primates. J Gravit Physiol. 1994. 1(1): 64-66.

36. Рохленко К.Д., Савик З.Ф. Влияние факторов космического полета на ультраструктуру скелетных мышц. Косм. биол. авиакосм. мед. 1981. 15(1): 72-77.

37. Поздняков О.М., Бабакова Л.Л., Деморжи М.С., Ильина-Какуева Е.И. Изменение ультраструктуры поперечно-полосатых мышц и нервномышечных синапсов крыс под влиянием 13-суточного космического полета. Косм. биол. авиакосм. мед. 1990. 24(5): 38-42.

38. Shenkman BS, Kozlovskaya IB, Tolokolnikov AV, Nemirovskaya TL, Stepantsov W, Kuznetsov SL. Skeletal muscle fiber type alterations and ultrastructural plasticity in space-flown rhesus monkeys. J Appl Physiol. 1999. 87(5): 1237-1238.

39. Krippendorf BB, Riley DA. Distinguishing unloading-versus reloading induced changes in rat soleus muscle. Muscle Nerve. 1993. 16(1): 99-108.

40. Krippendorf BB and Riley DA. Temporal changes in sarcomere lesions of rat adductor longus muscles during hindlimb reloading. Anat Rec. 1994. 238: 304-310.

41. Bodine-Fowler SC, Roy RR, Rudolf W, Haque N, Kozlovskaya IB, and Edgerton VR. Spaceflight and growth effects of muscle fibres in the rhesus monkey. J Appl Physiol. 1994. 73(2): 82-89.

42. Desplanches D, Kayar SR, Sempore B, Flandrouis R, Hoppeler H. Rat soleus muscle ultrastructure after hindlimb suspension. J Appl Physiol. 1990.69(2): 504-508.

43. Taillander D, Bigard X, Desplanches D, Attaix D, Guezennec GY, Arnal M. Role of protein synthesis and fiber distribution in the unweighted soleus muscle. J Appl Physiol. 1993. 75(3): 1226-1232.

44. Riley DA, Bain JW, Tompson JL, Fitts RH, Widrick JJ, Trappe SW, Trappe ТА, Costill DL. Disproportionate loss of thin filaments in human soleus muscle after 17-day bed rest. Muscle Nerve. 1998. 21: 1280-1289.

45. Riley DA, Bain JLW, Thompson JL, Fitts RH, Widrick JJ, Trappe SW, Trappe ТА, Costill DL. Thin filament diversity and physiological properties of fast and slow fiber types in astronaut leg muscles. J Appl Physiol. 2002. 92: 817-825.

46. Bastide B, Kischel P, Puterflam J, Stevens L, Pette D, Jin JP, Mounier Y. Expression and functional implications of troponin T isoforms in soleusmuscle fibers of rat after unloading. Pflugers Arch Eur J Physiol. 2002. 444: 345-352.

47. Kischel P, Bastide B, Stevens L, Mounier Y. Expression and functional behavior of troponin С in soleus muscle fibers of rat after hindlimb unloading. JAppl Physiol. 2001. 90: 1095-1101.

48. Stevens L, Bastide B, Kischel P, Pette D, Mounier Y. Time-dependent changes in expression of troponin subunit isoforms in unloaded rat soleus muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 2002. 282: 1025-1030.

49. Архипенко Ю.В., Попова И.А., Степанова B.B., Сазонтова Т.Г.,1. О4

50. Меерсон Ф.З. Транспорт Са саркоплазматическим ретикулумом скелетных мышц крыс при весовой разгрузке задних конечностей. Бюлл. эксп. биол. мед. 1993. 116(9): 253-256.

51. Stevens L, Mounier Y. Са2+ movements in sarcoplasmic reticulum of rat soleus fibers after hindlimb suspension. J Appl Physiol. 1992. 72(5): 17351740.

52. Козловская И.Б., Григорьева JI.С., Гевлич Г.И. Сравнительный анализ влияния невесомости и ее наземных моделей на скоростно-силовые свойства и тонус скелетных мышц человека. Косм. биол. авиакосм. мед. 1984. 18(6): 22-26.

53. Шульженко Е.Б., Виль-Вильямс И.Ф. Имитация детренированности организма методом "сухого" погружения. В кн.: X чтения К.Э. Циолковского, секц. Пробл. косм. мед. биол. 1975. 39-47.

54. Козловская И.Б., Киренская А.В. Механизмы нарушений точностных движений при длительной гипокинезии. Росс. Физиол. Журнал. 2003. 89(3): 247-258.

55. Laine CS, Mulavara AP, Pruett CJ, McDonald PV, Kozlovskaya IB, ф Bloomberg JJ. The use of in-flight foot pressure as a countermeasure toneuromuscular degradation. Acta Astronautica. 1998. 42(1-8): 231-246.

56. Popov DV, Sayenko IV, Vinogradova OL, Kozlovskaya IB. Mechanical stimulation of foot support zones for preventing unfavorable effects of gravitational unloading. J Gravit Physiol. 2003. 10(1): 59-60.

57. Шенкман B.C., Немировская Т.П., Чеглова И.А., Белозерова И.Н., Козловская И.Б. Морфологические характеристики m. vastus lateralisф человека в безопорной среде. Докл. Акад. Наук. 1999. 364(4): 563-565.

58. De-Doncker L, Picquet F, Falempin M. Effects of cutaneous receptor stimulation on muscular atrophy developed in hindlimb unloading condition. J Appl Physiol. 2000. 89: 2344-2351.

59. Nemirovskaya TL, Shenkman BS. Effect of support stimulation on unloaded soleus in rat. Eur J Appl Physiol. 2002. 87: 120-126.

60. LeBlanc A, Lin C, Shackleford L, Sinitsyn V, Evans H, Belichenko O, ^ Shenkman B, Kozlovskaya I, Oganov V, Bakulin A, Hedrick T, Feeback

61. D. Muscle volume, MRI relaxation times (T2), and body composition after space flight. J Appl Physiol 2000. 89: 2158.

62. Hauschka EO, Roy RR, Edgerton VR. Periodic weight support effects on rat soleus fibers after hindlimb suspension. J Appl Physiol. 1988. 65(3): 1231-1237.

63. Talmadge RJ, Roy RR, Edgerton VR. Distribution of myosin heavy chain isoforms in non-weight-bearing rat soleus muscle fibers. J Appl Physiol. 1996.81(6): 2540-2546.

64. Zhou MY, Kiltgaard H, Saltin B, Roy RR. Myosin heavy chain isoforms of human muscle after short-term spaceflight. J Appl Physiol. 1995. 1740 -1744.

65. Macintosh BR. Role of calcium sensitivity modulation in skeletal muscle performance. News Physiol Sci. 2003. 18: 222-225.

66. Rassier DE, Macintosh BR. Sarcomere length-dependebce of activity-dependent twitch potentiation in mouse skeletal muscle. BMC Physiology. 2000.2:19.

67. Toursel T, Stevens L, Granzier H, Mounier Y. Passive tension of rat skeletal soleus muscle fibers: effects of unloading conditions, properties, skeletal muscle fibers develop passive tension. J Appl Physiol. 2002. 92(4): 1465-1472.

68. Shenkman BS, Nemirovskaya TL, Belozerova IN, Vikhlyantsev IM, Matveeva OA, Staroverova KS, Podlubnaya ZA. Effects of Ca2+-binding agent on unloaded rat soleus: muscle morphology and sarcomeric titin content. J Gravit Physiol. 2002. 9(1): 139-140.

69. Clarke MS, Caldwell RW, Feeback DL. Modulation of sarcoplasmic reticulum cholesterol content during mechanical unloading-induced muscle atrophy. In: Abs XIIIIAA "Human in Space" Symp, Santorini, Greece. 2000. 241-244.

70. Ingalls C, Gordon L, Armstrong R. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. J Appl Physiol. 1999. 87(1): 386-390.

71. Tischler ME, Henriksen EJ, Munoz KA, Stump CS, Woodman CR, Kirby C.R. Spaceflight on STS-48 and earth-based unweighting produce similar effects on skeletal muscle of young rats. J Appl Physiol. 1993. 74(5): 21612165.

72. Tatsumi R, Maeda K, Hattori A, Takahashi K. Calcium binding to an elastic portion on connectin/titin filaments. J Muscle Res Cell Motil. 2001. 22: 149-162.

73. Duan C, Delp MD, Hayes DA, Delp PD, Armstrong RB. Rat skeletal muscle mitochondrial Ca . and injury from downhill walking. J Appl Physiol. 1990. 68(3): 1241-1251.

74. Gollnick PD, Armstrong RB, Saubert CW IV, Piehl K, Saltin B. Enzyme activity and Jiber composition in skeletal muscle of untrained and trained men. J Appl Physiol 1972. 33(3): 312-319.

75. Harber MP, Gallagher PM, Creer AR, Minchev KM, Trappe SW. Single muscle fiber contractile properties during a competitive season in male runners. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2004. 287: 1124-1131.

76. Gollnick PD, Armstrong RB, Saubert CW IV, Piehl K, Saltin B, Shepherd RE. Eject of training on enzyme activity andjber composition of human skeletal muscle. J Appl Physiol 1973. 34(1): 107-1 11.

77. Коряк Ю.А. Тренировочный эффект высокочастотной электрической стимуляции на быструю переднюю большеберцовую мышцу учеловека. Сообщение II. Влияние на скороетно-еиловые свойства и работоспособность. Физиолчел. 1993. 119(3): 115-122.

78. Harridge SDR, Bottinelli R, Canepari M, Pellegrino M, Reggiani C, Esbjomsson M, Balsom PD, Saltin B. Sprint training, in vitro and in vivo muscle function, and myosin heavy chain expression. J Appl Physiol. 1998. 84(2): 442^149.

79. Brown JM, Cotter MA, Hudlicka O, Vrbova G. The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles. Pflugers Arch. 1976. 361(3): 241-250.

80. Caiozzo VJ, Baker MJ, Baldwin KM. Modulation of myosin isoform expression by mechanical loading: role of stimulation frequency. J Appl Physiol. 1997. 82(1): 211-218.

81. Carroll S, Nicotera P, Pette D. Calcium transients in single fibers of low-frequency stimulated fast-twitch muscle of rat. Am J Physiol. 1999. 277(46): 1122-1129.

82. Lindstedt SL, Reichl ТЕ, Keim P, LaStayo PC. Do muscles function as adaptable locomotor springs? J Exp Biol. 2002. 205: 2211-2216.

83. Kreider RB. Effects of creatine supplementation on performance and training adaptations. Molec and CellBiochem. 2003. 244: 89-94.

84. Volek JS, Kraemer WJ, Bush JA, Boetes M, Incledon T, Clark KL, Lynch JM. Creatine supplementation enhances muscular performance during high-intensity resistance exercise. J Am Diet Assoc. 1997. 97: 765.

85. Urbanski RL, Vincent WJ, Yaspelkis BB. Creatine supplementation differentially affects maximal isometric strength and time to fatigue in large and small muscle groups. Int J Sport Nutr. 1999. 9: 136.

86. Tarnopolsky MA, MacLennan DP. Creatine monohydrate supplementation enhances high-intensity exercise performance in males and females. Int J Sport Nutr ExercMetab. 2000. 10: 452.

87. Skare ОС, Skadberg HD, Wisnes AR. Creatine supplementation improves sprint performance in male sprinters. Scand J Med Sci Sports. 2001. 11: 96.

88. Mujika I, Padilla S, Ibanez J, Izquierdo M, Gorostiaga E. Creatine supplementation and sprint performance in soccer players. Med Sci Sports Exerc. 2000. 32: 518.

89. Theodorou AS, Cooke CB, King RF, Hood C, Denison T, Wainwright BG, Havenetidis K. The effect of longer-term creatine supplementation on elite swimming performance after an acute creatine loading. J Sports Sci. 1999. 17: 853.

90. Preen D, Dawson B, Goodman C, Lawrence S, Beilby J, Ching S. Effect of creatine loading on long-term sprint exercise performance and metabolism. Med Sci Sports Exerc. 2001. 33: 814.

91. McKenna M, Morton S, Selig S, Snow R. Creatine supplementation increases muscle total creatine but not maximal intermittent exercise performance. JAppl Physiol. 1999. 87: 2244.

92. Gilliam JD, Hohzorn C, Martin D, Trimble MH. Effect of oral creatine supplementation on isokinetic torque production. Med Sci Sports Exerc. 2000. 32: 993.

93. Deutekom M, Beltman JG, de Ruiter CJ, de Koning JJ, de Haan A. No acute effects of short-term creatine supplementation on muscle properties and sprint performance. Eur J Appl Physiol. 2000. 82: 223.

94. Vandenberghe K, Goris M, Van Hecke P, Van Leemputte M, Vangerven # L, Hespel P. Long-term creatine intake is beneficial to muscle performanceduring resistance training. J Appl Physiol. 1997. 83: 2055-2063.

95. Volek JS, Duncan ND, Mazzetti SA, Staron RS, Putukian M, Gomez AL, Pearson DR, Fink WJ, Kraemer WJ. Performance and muscle fiberadaptations to creatine supplementation and heavy resistance training. Med

96. Sci Sports Exerc. 1999. 31:1147-1156.

97. Moura IM, Santos FFD, Moura JAA, Curi R, Fernandes LC. Creatine supplementation induces alteration in cross-sectional area in skeletal muscle fibers of wistar rats after swimming training. J Sports Sci Med. 2002. 1:87-95.

98. Vierck JL, Icenoggle DL, Bucci L, Dodson MV. The effects of ergogenic compounds on myogenic satellite cells. Med Sci Sports Exerc. 2003. 35(5): 769-76.

99. Willoughby DS, Rosene JM. Effects of oral creatine and resistance training on myogenic regulatory factor expression. Med Sci Sports Exerc. 2003. 35(6): 923-926.

100. Bolster DR, Crozier SJ, Kimball SR, Jefferson LS. AMP-activated protein kinase suppresses protein synthesis in rat skeletal muscle through down-regulated mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling. J Biol Chem.2002. 277(27): 2377-2380.

101. Stevenson SW, Dudley GA. Dietary creatine supplementation and muscular adaptation to resistive overload. Med Sci Sports Exerc. 2001. 33: 1304.

102. Fabiato A. Computer programs for calculating total from specified free or free from specified total ionic concentrations in aqueous solutions containing multiple metals and ligands. Methods Enzymol. 1974. 157: 378417.

103. Clarke MSF, Caldwell RW, Chiao H, Miyake K, McNeil PL. Contraction-induced cell wounding and release of fibroblast growth factor in heart. Circ res. 1995. 76: 927-934.

104. Clarke MSF, Pritchard KA, Medows MS, McNeil PL. An atherogenic level of native LDL increases endothelial cell vulnerability to shear-inducedplasma membrane wounding and consequent FGF release. Endothelium. ф 1995. 4: 127-139.3

105. Закс JI. Статистическое оценивание. М. 1976. « 112. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка1.данных медицинских исследований. СПб.: В Мед А. 2002.266.

106. Morey-Holton ER, Wronski TJ. Animal models for simulating weightlessness. Physiologist. 1981. 24: 45-48.

107. Yamashita-Goto, Katsumasa, Ryoko Okuyama, Masanori Honda, ^ Kensuke Kawasaki, Kazuhiko Fujita, Talcahiro Yamada, Ikuya Nonaka,

108. Yoshinobu Ohira, Toshitada Yoshioka. Maximal and submaximal forces of slow fibers in human soleus after bed rest. J Appl Physiol. 2001. 91: 417424.

109. Widrick JJ, Bangart JJ, Karhanek M, Fitts RH. Soleus fiber force andjmaximal shortening velocity after non-weight bearing with intermittent activity. J Appl Physiol. 1996. 80: 981-987.

110. Fitts RH, Riley DR, Widrick JJ. Physiology of a microgravity ^ environment. J Appl Physiol. 2000. 89: 8283-8289.

111. Kishel P, Bastide BL, Stevens L, Mounier Y. Expression and functional behavior of troponin С in soleus muscle fibers of rat after hindlimb unloading. J Appl Physiol. 2001. 90: 1095-1101.

112. Peters DG, Mitchell-Felton H, and Kandarian SC. Unloading induces transcriptional activation of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca-ATPase 1 gene in muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 1999. 276: 1218-1225.

Информация о работе

Литвинова, Карина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Влияние гравитационной разгрузки и тренировки на характеристики кальций-механической связи в изолированных волокнах скелетных мышц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы