Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние генотипа на процессы взаимодействия иммунной системы и иммунотропных лекарственных препаратов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние генотипа на процессы взаимодействия иммунной системы и иммунотропных лекарственных препаратов"

РГб 00

О глдп 10по

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

МЕДИКО-ГЕНТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ПУХАЛЬСКИЙ Александр Лэонидоеич

ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА НА ПРОЦЕССЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ИШУНОТРОПНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ.

03. ОС. 15 - генетика 14. 00. 36 - аллергология у. иммунология

Научный доклад на еоисг-ание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена г Кгдгко-генгтйчгскол На^чноа Ushïfs F«?IH

О^'шътг оппонента." дсхтор кгдгзгнокг! на?:-: nf3{escop ñ-e. aíekccssi .доктор йгднзгггкЕ! надх

EpOtêCCO? Е'А' ñíitíKKOi

доктор баодзггчаст sasx

Згдкез знрЕхденге! Рсссггскви Государственный Кедгдйнокга 5Sïbc?2ïïT8T

Зацгта coctoïtcï " "__ 1993 r. в " " ч.

sa ззседзнаг Спецяадгзгрззанного Coserá Д.00Ы6«01 прг йздгко-гиетвчэсзсог Надчноз Центре РАХН (Еаеква» 1154701 зд. йаокгоречье! д-1)

С' дгзогртзцгей eozeo озаахоагтьсг в 6¡5¿zü7£-¿e Кедмо-гезетеческого Научного Центра РАКН-

йзто?е*Е?5т разослан " " _ 1993 г.

5ísek2 секретарь Скщалазгроганаого Совета» доктор бзодогвчесхи sags ■

npciêcco? A-Ç' KSF2¿0

Организм современного человека постоянно сталкивается с воздействием разнообразных веществ, обладающих иммунотронной активностью. Это могут быть лекарственные препараты, вакцины, производственные вредности, вещества, загрязняющие среду обитания. С этой точки зрения изучение ззаимодействил иммунной системы и ксенобиотиков, а также вклада в это взаимодействие генетически детерминированных факторов, представляет существенный интерес. Исследования в этой области икеят особое значение для клинической медицины, располагающей сегодня широким арсеналом средств, способных с той или иной степенью сгтегцгфич-ности подавлять иммунные реакции. Сюда могут быть отнесены вещества гормональной природы (глюкокортикоиды), природные вещества (например циклоспорин А), а тагсхе разнообразные химические иммунодепрессанты. Бее эти препараты, влияя на разные иммунные реакции, способны оказывать тот или иной иммуномоду-лирующдй эффект.

При планировании работы, результаты которой представлены в настоящем докладе, мы исходили из следуюплх нрлдпосчлок:

(1) практически любой иммуномодулирующий препарат мчл^т ока-зывть влияние на разные звенья сложной цепи иммуногенез;*;

(2) каждое звено этой цепи, по-видимому, обладает п'онм порогом чувствительности, в связи с чем нетрудно пгедгт'^гжтгь, ч-.'о по мере снижения дозы количество точек прнложоьнч гл'м\ нотроп-ного препарата будет уменьшаться, а специфичность его действия, соотнетстпенно, возрастать; (3) пороги чувприг^лъносги для одних и тех же звеньев такой цепи у особей с рааннм генотипом могут быть различными.

Хотя вопрос о вкладе генетически детермкипрс ргшчнзг фг.кто-рои в действие и;/.мунотропных агентов изучен пока еще очень мало, накопленный клинический опыт, свидетельствует о различной эффективности применения такого рода препаратов у разных Сольных, что заставляет думать о генетической природе этого клинического феномена. Эта мысль находит подтверждение в ряде работ, проведенных на лабораторных животных (Пэвкицкий, 1974; Шркепз е! а1., 1981; Реуп^эку а1. , 1385). К сожалению, исследования а этом направлении носят весьма ограниченный характер, что, вероятно, может быть объяснено тем, что при иду

чении тонких механизмов действия какого-либо препарата на иммунную систему, как правило, возникают вопросы, связанные с новой или слабо изученной иммунологической феноменологией, исследование которой отвлекает силы от изучения генетически детерминированных различий чувствительности иммунной системы к действия лекарствс-нных веществ. Тем не менее исследования в атом напрасл^ник необходимы, а опит нашей работы показывает, что генетический подход к решению вопросов иммунофармакодогии может быть достаточно эффективным.

Исходя из приведенных выше предпосылок, мы изучали процессы взаимодействия лекарственного препарата и иммунной системы, используя модели, содержащие два произвольно меняемых параметра: дозу и генотип. Возможности, отбывающееся при использовании такого рода моделей демонстрируют результаты представленных ни*а зксперитментов.

ОВДАЯ ХАРАКТКРКСГШСА КАПОТЫ

Актуальность. Вариабельность эффекта применения лекарственных препаратов, обладающих иммуподепрессиЕНой и цитостати-ческой активностью, заставляет думать, что одной на причин агого явления могут быть различия в индивидуальной чувствительности больных к действию иммунодепрессантов. Справедливость такого предположения подтверждают результаты экспериментальных исследований на мышах разных линий, проведенных ранее под руководством профессора Л. А. Певницкого в лаборатории имму-ногенетики Института медицинской генетики АМН СССР. В то же время современная клиника не располагает методами оценки индивидуальной чувствительности больных к действию иммунодепрес-сантов. Наличие таких методов позволило бы врачу производить оценку индивидуальной чувствительности больного к действию им-мунодэпрессантов на основании результатов лабораторного исследования, а не ех }Ш/апиЬиз, как это имеет место в современной терапевтической клинике.

йэ менее важным направлением исследований современной иммунофармакологии является вопрос о механизмах индивидуальной чувствительности больных к терапии глюкокортикоидными гормонами. Знать заранее или хотя бы предполагать, какой будет чувствительность Сольного к этим препаратам, означало бы избежать

многочисленных побочных эффектов от приема глякокортикоидов. Решение этой сложной задачи зависит от понимания механизмов их иммунодепрессивного действия.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение вклада различных факторов в определение индивидуальной чувствительности к действию ряда иммуномодулирувщих агентов, а также изучение механизмов такой чувствительности.

Для достижения поставленной цели в ходе исследования решались следующие задачи:

1) разработка и экспериментальное обоснование количественного метода оценки индивидуальной чувствительности к препаратам с антипролиферативной активностью; ,

2) исследование различий чувствительности лимфоидных fure^ ток к антипролиферативному действию некоторых иммунодепрессан-тов у мышей разных генотипов;

3) изучение механизмов генетических различий в чувствительности клеток к антипролиферативному действию иммуясдепрес-сантов;

4) количественная оценка вклада различных генетически обусловленных факторов в индивидуальную чувствительности к им-мунодепрессивноку действии препаратов;

Б) разработка метода оценки индивидуальной чувствительности здоровых доноров к антипролиферативному действию д-экса-метазона (Дм);

6) научение эффективности связывания глякокортикоидов специфическими цитоплазматическими рецепторами в завнсшссти от принадлежности донора к той или иной группа чувствительности;

7) изучение распределения частот встречаемости антигенов HLA среди доноров, относящихся к различным группам чувствительности.

8) определение уровня продукции ИЛ-2 лимфоцитами с разным типом чувствительности к Дм;

9) исследование изменения прдукции ИЛ-2 при воздействии широкого диапазона доз Дм;

10) праведешэ сравнительного анализа мэяду результатами

лечения различных форм гломерулонефрита алкилируюдами препаратами и данными по определению чувствительности лимфоцитов пе-

риферической крови к антипролифератявному действии этих препаратов.

Научная, новизна.

В ходе проведенных исследований применен оригинальный подход к решению вопросов иммунофармакологии, основанный на использовании экспериментальных моделей, включающих два переменных параметра: генотип животного и дозу изучаемого иммунот-. ропного агента.

Предпринята попытка дать количественную оцекику разным генетически детерминированным факторам, вносящим вклад в определение чувствительности мышей данного генотипа к иммунодеп-рессивному действию циклофосфамида (1Ы.

Разработан метод количественной оценки чувствительности лимфоидных клеток к антилролиферативному действию иммунодеп-рессактав. Предло/нно уравнение, удовлетворительно описьшакщее кривую накопления в крови и выведения из крови элкилируюадга метаболитов Цф- Отличительной особенностью этого уравнения является его способность учитывать нелинейные фармзкокикетичес-кие процессы. С помощью предложенной, фармакокинетической модели установлено, чго форма фармакокинетической кривой при изменении доэы кативного препарата может претерпевать столь существенные изменения, что обнаруживаемое в крови суммарное количество алкилирукщих метаболитов при введении одной дозы препарата мажет быть Сальсе для животных одной из сравниваемых инбредных линий, а при изменении дозы это количество может оказаться большим для животных уие другой линии.

Впервые с помощью гибридологического анализа проведено изучение генетического контроля продукции интерлейкина-2 у мышей инбредных линий.

Впервые получены данные, свидетельсгаущие в пользу того, что мидге-нью действия мафосфамидз (синтетический аналог алкили-рующего метаболита Цф) при использовании ого in vitro в относительно низких, но достаточных для подавления пролкферативно-го ответа, дозах в первую очередь оказывается тяжелая цепь (р75) рецептора для интерлейкина-2. Показано, что этот механизм является ведузцим в определении межлинэйных различай! чувствительности лимфоцитов к антипролиферативному действии мафос-фамида.

Впервые показана возможность оценки в тесте in vitro ин-

дивидуальной чувствительности больных гломерулонефрктсм к терапии алкилкругагцими препаратами.

- Предложен новый метод оценки индивидуальной чувствительности лимфоидкых клеток здоровых доноров к антипролпфератинно-му действию дексаметазона. С учетом наличия корреляции ме.лду высотой пролиферативного ответа и степенью подавления этого ответа дексзметазоноы удалось выявить 3 типа чувствительности: чувствительный, промежуточный и резистентный. Л-жаопко, что это разделение косит не случайный характер, а связано с механизмами антипролифератипного действия глюкокортикондов - эффективностью их рецепции и интенсивностью продукции интерлей-кина-2. Выявлены ассоциации типов чувствительности с антигенами системы HLA: резистентность к антипролпфератигному действию дексаметазона ассоциирована с антигенами HLA-B7, В12 и DR2, а чувствительность - с антигеном HLA-B18.

Впервые обнаружен феномен стимуляции прдукции ИЛ-2 малыми дозами глюкокортикоидов.

Показано, что сочетанное- действие на лимфоидные клетки дексаметазона и мзфосфаиида (циклоспорина А) мо.чет приводить к резкому угнетения пролифератнвногц ответа, которое i:«••">ет место даже в тех случая;:, когда указанные препараты, применочные по отдельности окаэквакя очень слабый эффект пли не окаэы^'ьог его вовсе.

Научно-практичес кя я значимость работы.

В ходе проведенных исследований на примере цжлофосфзми-да продемонстрированы возмохкости иммунофармакогенетического подхода для аттаяляз вклада отдельных фзкгерсз в определение типа чувствительности к действий иммунод^пре осиных препаратов. Разработаны методы оценки чувствительности лнмфоидннх клеток к антипролиферативному действию алкилируюшцх препаратов, циклоспорина А и глюкокортикоидных гормонов.

Изучено распределение типов чувствительности к актилроли-фератизному действию указанных иммунотролкых агентов среди по- . пуляции здоровых доноров и мьпк-й разных ккбредных линий. Установлено, что характер распределения по типам чувствительности к антипролифератизному действию хлорбутина среди здоровых . лиц не отличался от такового среди больных ревматоидным артритоим и гломерулонефритом.

Установлена высокая степень соответствия (р<0,05) между эффективностью лечения хлорбутином различных форм гломеруло-нефрита у детей и чувствительностью in vitro лимфоидных клеток больных к антипролифс-ративнэму действию этого препарата. Эти результаты свидетельствуют в пользу принципиальной возможности выявления больных, резистентных к лечении данным препаратом, с помощью лабораторных тестов, а не ex juvantibus.

Положения, аыноеиша на задцггу.

1. Проведенные исследования демонстрируют возмо.таости генетического подхода для решения вопросов иммунофармакологии.

2. На основа разработанного метода количественной оценки чувствительности лимфовдных клеток к анхилролиферативному действию алкилируюаднх агентов, а также с помощью усовершенствованной фармакокинетичаокой модели накопления в крови и выведения из крози алкилирующих метаболитов циглэфосфзшда, исследованы механизмы различий чувствительности мышей разных ик-бредкых лшлА к иымунодэпрессивному действию циклсфосфамида и предложена модель взаимодействия циклофосфамида и иммунной система

S. Проведен генетический анализ межликейных различий продукции и акцепции иигерлейкина~2. Исследовано значение этих механизмов для определения типа чувствительности к антипрсли-феративному действию алкилирующих агентов.

4. Разрабстан метод оценки чувствительности лимфоцитов периферической крови Сольных к антипролиферативному действию алкилирующих препаратов in vitro и показано удовлетворительное совпадение таких исследований с результаты« лечения этими пре-паратми глоиерулолефрита у детей.

5. Разработан метод оценки чувствительности лимфоцитов периферической кроаи к антзтролифератквнсму действии глюкокор-тигаидных гормонов. ГЬкааако, что разделение здоровых доноров на группы чувствительности, проведенное по этому методу носит неслучайный характер. Это разделение связано кза с генетическими маркерами (ассоциации с антигенами Н1.А), Taj; и с механизмами аитипролиферативного действия глазнокортикоидов (эффективность рецепции и интенсивность продукции интерлейкина-2).

6. Обнаружен феномен стимуляции продукции ин?ердейкииа-2

малыш дозами глюкокортикоидов. Установлен диапазон доз, в котором происходит переход от стимуляции продукции интерлейки-на-2 к ее угнетению.

'Внедрение результатов работы.

Разработанный в ходе проведенных исследований метод количественной оценки чувствительности? лимфоцитов периферической крови к антипролиферативному действию алкилируюцих препаратов внедрен в практику в Отелении нефрологии Института педиатрии РАМН.

Апробация работы.

Материалы диссертации обсуждены на II Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека (Еб-28 ноября 1985 г., Цущно), на Республиканской конференции "Механизмы иммуностимуляцяи" (Киев, 1985 г.), на Есосо.такой конференции по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 12-15 окт. 1989г.), на I Всесоюзном съезде иммунологов (1969 г), на Всесоюзном симпозиуме "Проблемы изучения наследстзониз^ти человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии" (КЬск-ва, 1989 г.), на симпозиуме Международной ассоциации по биологической стандартизации (Франция, Аннеси, 1391 г.), на 5-й Международной конференции по иммукофармакологки (СМ, Тампа, Флорида, 1991), на I Съезде иммунологон России (Новосибирск, 1992 г.), на конференции Отдела иммунологии Опиталь Кэкер (франция, Париж, 1991 ), на Ученом ссгете 1ТНЦ РЛ1.!Н (1901, 1992 г. г.), на Международном симпозиуме "Биологические функции белков острой фазы и регуляция их синтеза" (Польша, Краков, 1992).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И ЬЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ■

Работа прсведена на мышах инбредных линий, а также на лимфоцитах периферической крози здоровых добровольцев и больных, получавших иммунодепрвссивную терапию.

В работе были использованы мыш-самцы массой 20-24 г четырех инбредных линий: ЕАЬВ/сЛЬасЗ^, 0ЕА/2^1:о, СС57Вй/ШНар,

C57BL/6JSto, а также гибриды F1 и F2. Животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барака в дозе 5x1О8. Через 24 ч после иммунизации «квотным опытных групп внутрибрюшинно вводили цик-лсфосфамид ("цкклофосфан", Саранский ззвод мэдпрепаратов) в разных дозах. Интенсивность иммунного ответа оценивали по числу антителосбразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза в геле (Jerne and Wordin, 1953). Антипроли-феративное действие ЦФ исследовали в культуре клеток селезенки мышей тех яе лтглй, стимулированных фитагемагглютинином (ФГА) или конканавалином А (Ко.чА). 3 качестве анткпролкфоративнызс агентов использовали сыворотку мьпэй SAL.B/c, содержащую активные метаболиты ЦФ, стабильный аналог активного метаболита ЦФ Asta Z 7654 (мафосфамид, Asta-Vorke, ФРГ), хлорамбуцил ("хлор-Сутин" без наполнителя Ленинградское химт:о-фармацевтическое объединение "Октябрь"), неалкилируииций природный иммунодепрес-сант циклоспорин А (Дс-А) ("Sar.dimun", "Sendos", Швейцария), а re гаке дексаметааон (Si¿.та, США), которые вносили в культуру в разных дозах. После часовой инкубации с препаратом (кроме опытов с дексаметаэоном, который прсутетвовал в течение всего срока культивирования) клетки отмъшалк и добавляли митоген. Интенсивность лролифэрации оценивали по включению 3К-тимидкна, который вносили за 4 ч до окончания культпвировання. Обцэя продол-гительность культивирования составляла 72 ч.

Для определения интенсивности продукции ютерлейкина-2 (ИЛ-2) лимфоцитами мьдшй разных линий в лунки 24-луночной панели помещали по б ш клеток селезенки, добавляли Кон А и инкубировали при 37" С в течение 3 ч. Затем клетки отмывали от митогена к вновь инкубировали в течение 18 ч. Далее надосадки собирали и хранили при -70° С. Содержание КЯ-2 в образцах определяли по их способности поддерживать рост ИЛ-2-зависимой цитстоксической клеточной линии (CTLL-2) (Gillis et al, 1978). Полученные титроиочные кривые для надосздочной жидкости и ре-комбинантного ИЛ-2 анализировали с помощью метода пробитов (Погожев, 1962; Пухалъский и Топтыгина, 1989) с последующим вычислением активности ИЛ-2, содержаться в цельном суперка-танте.

Эффективность утилизации ИЛ-2 оценивали по способности ракомбинантногс ИЛ-2 оказывать комктогэнноэ действие на тиш-цяты иышей рааньсс линий, культивируемых в присутствии ФГА (IV-

хальский и Топтыгина, 1889).

Концентрацию алкилирухпцгх метаболитов в сызоротке мышей определяли с помощью МБР-теста (Friedœn ar.d Ecser, '1361-, Кириенко и др., 1976), результаты которого вя-рздплп к молях, используя в качестве стандарта 6ис(2-хлорэтил)амг.ног;гдрохлорид.

Определение Н-2 гаплотипа у мышей-гибридов осуществляли с помощью микролимфоцитотсксического теста в модификации (МГН, Бэтезда, США). Сыворотки дет тшироэзния были получены в результате многократной перекрестной взаимной иммунизации мыоай линий BALB/c и C57BL/6.

Определение HLA-актигенов проводили с помотаю стандартного микролимфоцитотоксического теста (Terasaki, Maclelland, 1964) в модификации Национального института здоровья (США) , используя специфические HLA-антисыворотки к 28 антигенам -I класса и 8 антигенам II класса. В-лимфоциты для определения HLA-DR антигенов (II класс) получали с помощью удаления Е-роэеткообра-эутацих клеток из общего пула лимфоцитов.

■ Индукция цитотоксических лимфоцитов осуцэстивляля в семн-аллогенной системе. Upí* использовании а качестве дснороз отвечающие клеток мыяэй C57HL/6 и D3A/2 клеткп-сткмулятсрь: полагали от мьглей (C57EL/6 " DBA/2)F1. Если .чэ в качестве 01"'ечэхж>;х клеток использовались лимфоциты №шей BALB/o и СОУВЯ, то клетки-стимуляторы ползали, от килей (BALB/c х CC57BR)Fi.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИОСЛЕДОЕЛН;:Я

2.1. Вклад различных факторов в определение тигд-чувс-

твительности мъгяей различных линий к га.{муиодесресспрно>.у действию ц< тклофо с ф ?..'.;: ira ( Цф).

2.1.1. Влияние различных доз ГГФ на иммунный отает in vivo мышей разных линий. Были исследованы 4 кнбредные линии мятей: BALB/c, DBA/2, CCS72R и C57BL/6. В четырех независимых экспериментах были. покзаны статистически значимые различия а чувствительности мышей разных линий к иммуноделрессиьнэму действию Цф (рис. 1).

io»K циклофосфаиива

а ваш/с с. lea/2 xcca/br + сь7ы/6

Рис. 1. Ладзвление трупного ответа яз ЭБ у разных

линий при введении р2г.иг-1них доз Цф.

Так, мыпи линии DSA/2 оказались более чувствительны}.« (ED50=5,88 кг/кг), чем м^пги BAL3/c -и CC57BR (ьеличины ED50 соответственно еостззилк 13,25 и 13,56 .мг/кг). ^узствигельнссть C57EL/6 была определена как промежуточная (ED50» 8,96 мг/кг), однако согласно критерии U Еллкокаэна-^ннг-Ух-.тни эта величина статистически значимо но отличалась от соответствующего показателя для мклей СЕД/2, в сэязи с чем мьпии линии C57EL/6 были отнесены к чувствительному типу. Следует заметить, что при введении Цф в различных дозах межлинейные различия в угнетении продукции антителообраэугщих клеток были разными (см. рис. 1).

Поскольку нативный Цф не обладает алкилируюшрй активностью, а его иммунодепрессивный эффект при введении in vivo обеспечивается за счет алкидируюздга метаболитов, образующихся.

преимущественно, в печени, можно предполагать, что указанные выше различия связаны либо с особенностями метаболической активации Цф, либо с различиями в чувствительности клеток-мишеней. В исследованиях, проведенных ранее (Pevnitsky et al., 1985), было показано, что оба эти фактора могут играть роль в определении типа чувствительности генотипа к иммукодепрессив-ному действию Цф, однако, каков вклад каждого из них оставалось неясным.

2.1. 2. Особенности кинетики алкилируницих метаболитов в зависимости от генотипа жипотного и дозы препарата. Было проведено сравнение фармакокинетических параметров содержания ал-килирующих метаболитов Цф у мышей исследуемых генотипов. К сожалению полученные экспериментальные данные не удалось описать с помощью известной фармакокинетической модели (Brook & Hohorst, 1971):

где: Y - концентрация алкилирующих метаболитов в крови;

1С

А " V • Y " начальная концентрация алкилирующих

метаболитов; k1- уровень, при котором метаболиты переходят из печени в кровь; уровень, при котором начинаеться элимина-

ция метаболитов иэ крови; t - время.

В результате анализа, проведенного совместно с В. В. Викторовым, в основе которого лежало паредполокенне о том, что процессы накопления алкилирующих метаболитов в крови и выведения их иэ крови могут носить нелинейны* характер, и применив статистический аппарат теории надежности (Hahn & Shapiro, 1976), удалось предложить уравнение, удовлетворительно описывающее результаты наших экспериментов:

V-А [е - е ] (2)

где: г) - параметр формы; А - коэффициент пропорциональности; остальные обозначения те же, что и для уравнения (1).

Очевидно, что при 1)1-1)2-1» уравнение (2) становится ^ идентичным уравнению (1). Таким образом, можно констатировать, что уравнение (1) является частным случаем уравнения (2).

- 12 -

В результате были получены новые данные о фармакокинетике Цф у мышей четырех исследованных линий. Низке мы' приводим результаты, касакциеся двух оппозитных по чувствительности к им-ыунодепарессиЕНОму действию Цф линий мышей - ВАЬВ/с и ОБА/2.

Так, при введении дозы 12,5 мг/кг фармакокинетические кривые для указанных линий мышей практически не отличались друг от друга (рис. 2).

Чип Ihr)

Рис. г. Амкилирущвя активность (НВР) сыворотки крови ш-шей BALB/c (сплошная линия и авездрчки) и DBA/2 (пунктирная линия и крестики) после знутрибрюшиннсго введения Цф в дозе 12, S иг/иг.

При введении Цф в дозе 25 мг/кг (рис. S) кривая, описывающая уровень алкилирующпх метаболитов в крови мышей линии BALB/c, характеризовалась острым пиком и быстрым снижением количества метаболитов к 15-й минуте от момента введения препарата. Площадь под кривой, характеризующая общее количество ад-килирушдо метаболитов в крови за период наблюдения для шлей BALB/c оказалось существенно меныае, чем для DBA/2.

о.оъ

о OU 0.4 Об Oft • 1 1.2 1.4 l.e-

time (hr)

Рис. 3. Апкидирующая активность (ИВР) сыворотки крови мышей ВАШ/с я 0В/1/2 после внутрибрюшинвого введения Цф в дозе 25 иг/кг (обозначения те же, что и на рис. 2).

Различил такого же характера наблюдались и при азедекии Цф в дозе 50 мг/кг (рис. 4).

о и

О 02 . 0.1 0.0 ,0.Я ] I.Z 1.» 16

Util«' {hr)

Рис. 4. Алкилирующзя активность ( МВР) сыворотки крови мышей BALB/c и DBA/2 после внутрибрюшинного введения Цф в доае 50 иг/кг (обозначения те же, что и на рис. 2).

При введении Цф в дозе 100 мг/кг кривые вновь практически совпадали (рис. 5). При этом кривая, соответствующая уровеню

алкилируквдпс метаболитов з крови мышей ВАЬВ/о, теряла такие характерные признаки, как острый пик и резкое снижение.

-oca L------------,---------,-------¡

О »2 0.4 0.6 0.0 I . 1,2 1.4 " ;

lime (Ы) ' I

Рис. Б. Ахкитрукщзя активность (ЫВР) сыворотки крови мышей BALB/c и DBA/2 после вяутрибрашааюго введения Цф в дозе 100 «г/кг (обозначения те хе, что и ни рис. 2).

Рис. 6. Алкилирующая активность (ЫВР) сыворотки крови ш-шей ВА[*В/с и ОВА/2 после внутриЗртинного введения Цф в дозе 200 иг/кг (обозначения те хе, что и на рис. 2).

При введении Цф в дозе 200 мг/кг формы кривых были такими же, как и в случае введения препарата в дозе 100 мг/кг, однако

площадь под кривой для мышей BALB/c оказалась больше, чем для мышей DBA/2 (рис. 6).

Полученные наш кривые, описывающее фармакокинетику алки-лирующих метаболитов ЦФ в крови, являются отражением двух разнонаправленных првоцессов - поступления метаболитов в кровь и элиминации их из кровотока. Эти процессы также обусловлены сложением нескольких факторов. Так, например, интенсивность поступления алкялирующих метаболитов в кровь мохет зазисеть от скорости их образования в печени, которая у мышей лин:ш EALB/o выше, чем у мышей DBA/2 (Телегин и др., 1981; Hipkens et al, 1931; Fevnitsky et al, 1935). С другой стороны, скорость выведения метаболитов из крови зависит от интенсивности почечной фильтрации. Последняя, в свою очередь, может быть связана с высотой систолического давления, которое у мышей линии EAL8/o выше, чем у мышей DBA/2 (Bernstein, 1966). Однако перечисленные выше факторы обуславливают линейные изменения интенсивности процесса. В то же время, можно предполагать, что существуют факторы, вмешательство которых может приводить к нелинейным изменениям. К та!сого рода факторам, влияющим на накопление ал-килирующих метаболитов в крови, можно отнести включение при повышении дозы препарата альтернативных путей мета5олн;лм-1 ЦФ. Нелинейность процессов выведения метаболитов из крови монет быть связана, например, с отравлением ферментативных систем, ответственных за элиминацию, токсическими продуктами метаболизма ЦФ. Существование таких нелинейных процессов способно учитывать предложенное нами уравнение. Можно думать, что механизмы, определяющие межлинейные различия в форме кривых, играют существенную роль лишь при введении относительно низких дог ЦФ. При увеличении дозы препарата до 100 мг/кг и выге эти различия становятся менее существенными. Такое нивелирование форм кривых, возможно, связано с тем, что количество неметзболиэи-рованного субстрата (интактного ЦФ) возрастает до таких величин, что несмотря на большую скорость метаболизма, время активации препарата у мышей линии BALB/c становится соизмеримым с временем его активации у мышей D8A/2. В то же время, нет оснований полагать, что при введении использованных в данной работе доз ЦФ происходит насыщение ферментативных систем, так как в интервале 100-200 мг/кг общэе количество алкилирующих метаболитов у мышей всех четырех линий продолжает нарастать.

- 16 -

2.1. 3. Мэжлинейные различия в чувствительности клеток селезенки к антипролкферативному действию иммунодепрессивных агентов in vitro. Как. угке упоминалось вьше нативный препарат Щ) преобретает алкилируюшую, а следовательно и биологическую, активность, только после метаболической активации в печени при участки цитохром-Р-450-зависимой терминальной оксидаэы. Это обстоятельство заставляет использовать для исследований in vitro либо его активные метаболиты (АЩФ), содержащиеся в сыворотке мышей (метаболическая активация in vivo; см. раздел 1), либо синтетические аналоги алкшшруюцгас метаболитов Цф. В настоящем исследовании мы изучали сравнительную чувствительность клеток селезенки мышей разных линий к антипролифератив-ному действию таких препаратов как АМЦФ, мафосфамид (Мф), хлорбутин (Хб) и неалкилирукщэго природного иммунодэирессанта циклоспорина-А (ЦсА). Результаты этих исследований приведены в таблице 1.

В проведенных исследованиях удалось выявить два типа чувствительности клеток селезенки мьпдэй изучаемых линий к ан-типролифератиЕНОму действие алкилируюзцк агентов. Так, клетки мышей DBA/2 и C57EL/6 отличаются существенно более высокой чувствительностью к алки-кгрующим агентам, чем клетки мышей BALE/c и CC57ER (табл.2). При оценке по кьпараметрическому критерию Вилкоксона указанные различия статистически значимы во всех случаях, когда в клчостпе митогеиа был использован Кон А. При стимуляции СГА различия в чувствительности КС мытей DBA/'2 и СС57ВЯ к №3, а также меаду CC57BR и C57EL/6 к ХБ статистически недостоверны. Хотя интенсивность про.диферагивного ответа на митсгены у мышей разных линий различна, нам не удалось обнаружить связи между высотой про.теферативного ответа и чувс-вктелькостьв к алкилпрующим препаратам (коэффициент ранговой корреляции г—0,3). Обнаруженныз межлдаейные различия ив зависят ки от мнтогена, ни от того, катай конкретно алкилирую-щие агенты были применены. Тип чувствительности также, по-видимому, не зависит от гаплотипа Н-2. Так, мыши линий, имеющих гаплотип H-2d, могут быть как чувствительными, так и резистентными. То ле касается и линий, имеющих гаплотип Н-2Ь (см. табл. 1).

Несколько иноа распределений в чуготакте^ьност» кяэток селезенки было получено нами при исследовании кеалкилирущего

1¿шлица £

► Чувствительность клеток, селезенки мышей разных линий к антипролиферативному действию иммуноде-

прессивных агентов

Величина Е050 для клеток, обработанных разными препаратами в условиях стимуляции ФГА

или КонА

линия Гапло- АМЦФ (х 10 М) У.ф (мкг/мл) Хб (ют/мл) ЦсА (мкг/мл)

мышей тип н-2 _

ФГА КонА <1-ГА КонА ФГА КонА КонА

4,02 3,98 5,23 4,98 4,59 0,074

ВАЬВ/с Н- 2 3,03 3,61* 2,51 4,65 4,20* 4,51 4,47* 4,64 4,67* 4,71 5,75* 0,114 0,084*

5,06 3,47 ',0,53 4,41 6,53 0,088

2,75 4,85 3,56 - 6,42 0,053

1,13 1,64 1,88 2,41 2,50 0,186

БВА/2 Н- ■2 0,77 1,22* 1,77 2,90 2.С4* 3,96 2,79* 0,68 1,64* 3,28 2,78* 0,125 0,128*

1,33 2,01 2,93 2,68 2,73 0,107

1,91 2,79 2,68 0,094

4,15 3,47 '5,67 2,84 6,51 0,091

СС57В1? Н- ■2 2,34 3,11* 2,51 3,14 3,28* 5,87 5,49* 2,26 2,51* 5,56 6,53* 0,068 0,061*

3,11 2,46 4,91 2,09 6,47 0,022

- 4, аз 5,55 3,00 7,77 0,062

0,85 0,78 3,76 2,12 3,42 0,058

С57ВЬ/6 Н- ■2 1,31 1,17* 1 оо 1 , ио 0,69 1,С5* 1,42 2,01* 1,66 1,93* 3,36 3,70* 0,060 0,063*

1,45 1,95 1,66 2,76 4,42 0,046

• 2,01 1,44 0,088

Примечание: (*) средняя 4гесметричеек&г. '.гдольних определений.

иммунодепрессанта ЦсА. При этом резистентными оказались мыши DBA/2, чувствительными - мьши линий CC573R и C57BL/6, а мыши линии BALB/c заняли прог.ге»уточное положение (см. табл. 1). Еозмокао, что различия в распределении чувствительности КС in vitro к алкилирующим и неалкилирущим препаратам у мьшей указанных 4 линий связано с точками приложения их действия. Одним из таких универсальных звеньев могут Оьггь процессы продукции интерлэйкина-2 (ИЛ-2) и его акцепции.

2.1.4. Генетический контроль продукции ИЛ-2 и влияние на нее иммунодепрессантов. В таблице 2 приведены результаты оценки продукции ИЛ-2 клетками селезенки мышей исследуемых линий на иятерлейкин-2 зависимой цитотоксической клеточной линии (CTLL-2).

Таблица 2

Продукция ИЛ-2 клетка;.»! мышей разных линий (КЕ/мд)

Гаплотип Линия Продукция ИЛ-2 в разных опытах Средняя ариф-

Н-2 метическая

1 2 3 4 5

H-2d BALB/c 40 28 БЗ 59 37 43

PEA/2 - - - 24 БО 37

H-2b CC57ER - - - 6,3 14 10

C57BL/6 15 11 - 15 26 17

H-2b/d CB6F1 20 40 - 24 - 28

Из таблицы видно, что клетки селезенки мышей с гаплотипом

Н-2с1 являются хорошими продуцентами ИЛ-2, а КС мышей с гапло-типом Н-2Ь продуцируют Ю1-2 в значительно меньшем количестве. При этом продукция ИЛ-2 клетками мышей с гаплотипом Н-2с1 статистически значимо выше, чем у мышей с гаплотипом Н-2Ь (р < 0,01). Гибриды С86Р1 занимали промежуточное положение. На основании полученных данных естественно было предположить, что высокая продукция ИЛ-2 ассоциирована с Н-2с1 гаплотипом, а низкая - с К-2Ь гаплотипом. Для проверки этой гипотезы был проведен гибридологический анализ с использованием мьппей двух контрастных линий: ЕАЬВ/с (Н-2Й) и С57ВЬ/6 (Н-2Ь) И их гибридов П и Р2. Однако результаты проведенных экспериментов не подтверж-дили первоначальное предположение. Проверка гипотезы о наличии связи гаплотипа Н-2 с различной степенью интенсивности продукции ИЛ-2 показала, что эти признаки у гибридов К2 сегрегируют независимо друг от друга (рис. 7).

Н-2

Ui

i-2. 2,1-3 >3

8 7 2 17 XZ=3,466 25 npi<d{=4 Р>0,05 8

6 И 8

3 3 2

17 ¿1 12 50

Рис. 7. Сегрегация признака интенсивности продукции ИЛ-2 и гаплотипа Н-2 у зибрядов F2,

Анализ полученных результатов, проведенный по Mather и Jinks (1977) показал, что гибриды F2 по интенсивности продукции ИЛ-2 могут быть разбиты на 3 значимо отличающкся друг от друга группи(рис. 8). фи этом результаты, 'полученные для групп гибридов F2 с низкой и высокой продукцией м-2, практически не отличались от доответствующх результатов высоко- и шгакоотявчащих родительских линий. Шлучзнныэ данные укладываются в гипотезу о наличии одного гена, контролирующего ин~

тенсивность продукции ИЛ-2, не связанного с Н-2 комплексом. Построения графика соотношения ваприансы и ковариансы, расчи-танных по методу Mather и Jinks, показало, что доминирующим признаком является низкий уровень продукции ИЛ-2 (рис. 9).

Ряс. 8 Шкала распределения гибридов по интенсивности продукта! ИЛ-2. АА - готзиготы с вшокой продукцией ЯЛ-2; аа - гомозиготы с низкой продукций ИЛ-2; Аа - готероз иготы; ш -средняя; Ь - расстояние от средней до гетероаигот; с! - расстояние от средней до гомозигот. Цифры над шкалой соответствуют интенсивности продукций ИЛ-2 (в отн. од.). Сплошная линия -доверительные интервалы при р < 0,05. Цифры в скобках - число гибридов Р2.

¿¿И-Ь)

Рис. 9. График соотношений вариансы (Уг) и ковариансы (Уг) для гибридов Е2. Расположение аа на линии регрессии ниже, чей АА, свидетельствует в пользу того, что аа является доминирующий аллелей.

- 20 -

Результаты оценки влияния Ш> на продукцию ИЛ-2 приведены в таблице 3. Из таблицы хорошо видно, что, несмотря на существование некоторых различий в действии Ш на продукцию ИЛ-2, абсолютные значения ЕС50 на порядок больше соответствующих доз препаратов, подавляющих пролиферацию клеток в культуре на 50%.

Таблица 3

Влияние мафосфамида на продукцию ИЛ-2 в разных опытах. Величины Е050 (мкг/мл)

Линия 1 2 3 Средняя арифм.

ВАЬВ/о 30 21 . 41 30,6

ОВА/2 30 2Б 28 27,3

СС57В1? 30 43 37 36,3

СБ7ВЬ/б 30 25 40 31, б

Что касается чувствительности продукции ИЛ-2 к действии ЦсА, (табл. 4) то здесь можно выделить 2 типа чувствительнести. Так, мыши линии ВАЬВ/с, ОВА/2 и С57ВЬ/6 оказались более резистентными, чем мыши линии СС57ВЯ. Однако и в этом случае величины Е050, характеризующие степень подавления продукции ИЛ-2, оказались в 2-3 раза больше доз ЦсА, обеспечивающих 60-процентное подавление пролкферативной реакции. -

- Е1 -

Таблица 4

Влияние циклоспорина А на продукцию ИЛ-2 в разных опытах. Ъелтта Е050 (икг/ид)

Линия 1 2 3 Средняя арифм.

ВАЬВ/о 0,25 0,27 0,27 0,25

ОВА/2 0,1В 0,24 0,25 0,22

СС57В5? 0,15 0,14 0,13 0,14

С5?В1-/6 0,25 0,23 0,25 0,24

Таким образом, представленные результаты показывают, что угнетающее действие Щ и ЦсА на продукцию ИЛ-2 не играет роли в определении меллинейных различий в чувствительности ликвидных клеток к актипролиферативному действию этих препаратов.

2.1.Б. Влияние МЬ и ЦсА на утилизацию ИЛ-2 тимоцитами мышей разных линий. Изучение влияния Мф и ЦсА на утилизация КЛ-2, проведенное ка модели коьзстогенного действия рексмби-нантного ИЛ-2 на мышипыо ткмоциты, поглпало, что клетки мдоюй рааных линий пс-равному р^&гируют на эти препараты. Так, из четырех исследованных линий наиболее чувствительными к действию Щ оказались мыши линии РВА/2, а наиболее реэисте-нтными -С57ВЬ/6 (соответственно, наиболее низкие и наиболее высокие значения величин Е050) (рис. 10а). Напротив, ЦсА сильнее всего угнетает процессы утилизации ИЛ-2 у мышей, СБ7ВЬ/б к слабее ' всзго у мудей линии РЭД/2 (рке. 10Ь).

а в

Рис. 10. Ответ на ИЛ-2 тююцитов мышей, обработанных Мр (к) и ЦсА (В).

Обнаруженные межлинейные различия могли быть связаны с различиями в экспрессии JUI-2-рецептора (ИЛ-2р). При проверке этого предположения мы исходили из того, что пролиферация ти-моцитов в ответ на разные дозы ИЛ-2 без ФРА отражзет наличие конститутивных ИЛ-2р, а разница меяду ответом на ¡11-2 а при-

Рис. 11. Ответ тшюцитов на ИЛ-2 и субмитогенкые дозы ФГА у мышей BALB/c (q), DBA/2 (д), CC57BR (Q) И C57BL/6 (X).

сутствии субмитогенных доз ФГА и ответом только на ИЛ-2-ин-

Аудированных рецепторов (р55). Результаты выражали в виде площади под кривой (рис. 11) и для удобства сопоставления подвергали нормализации по формуле:

ХГ

тГпОД

где тт(Х) - варианта с наименьшим абсолютным значением.

шшщ^щь

С£7[-1/й СС57ПР В-13/с Г?у2

С57Е1/6 СС57СК ВАШ/с 0Еу'2

Рис.12. Экспрессия конститутивных (А) и СГА-индуцированных (В) ИЛ-2р клэгкаш: мыкей различных линий (способ нормализация результатов описан в тексте).

Полученные результаты показывают, что конститутивные рецепторы наилучшим образом представлены у мышей ОВА/2 и ВАЬВ/о и существенно слабее у мыьей С57Ви/6 и СС57ЕЯ (ряс. 12а). Самую высокую способность к индукции 1Ш-2-рецепторов обнаружили мыш С57БЬ/б, а самую низкую - ОВА/2 (рис. 12Ь).

2.1. Б. Влияние и на цитотоксичес^те лимфоциты.

Изучение влияния Щ> и ЦсА на цитотоксическке лимфоциты (ЦТЛ), индуцированных в семиаллогеннсй системе показало, что интенсивно подавляет пролиферативный ответ ЦТЛ на ИЛ-2. Щ действует на ЦТЛ приблизительно в том же диапазоне доз, что и на клетки селезенки, стимулированные КонА. На модели ЦТЛ вьиг-

ляются те же межлинейные различия, что и при изучении чувствительности свэневыделенных клеток селезенки к антипролифе-ративному действию Иф (рис. 13а). фи исследовании чувствительности ЦТЛ к ЦсА значимого подавления пролпфгративного ответа ЦТЛ на ИЛ-2 получить не удалось. В то же время, ЦсА в существенно Солее низких дозах интенсивно подавлял пролифератив-ный ответ КС на КонА (рис. 13Ь).' л

7.00

6.00

5.00 -

4.00

3.00 -

ы 2.00 -

1.00

0.00

Ж

I

Ж

SL

'Ж

1

С57В1/6 СС573Я BALB/c DEV'2

атз-ьегккшмки - агаи-итл

0.40 -0.35 0.30 g 0.25 ? 0.20

Я °-151

О u)

0.10 0.05

0.00

>30

I

щ

>30

>30

>30

f

%

шп/i

ш

C575Í./6 CC57SP ем-3/с dea/2 ст"яа-1г«ткн«л»зс11»ги- [ШУУ- цTit

Рис. 13. Веяние &!ф (А) я ЦсА (В) на пролиферацию с веже и-аолированных клеток селезенки, стшулирг.? ванных КонА, и цито-токсических лимфоцитов, стимулированных ИЛ-2.

?.. 1. 5. Свидетельство в по льду того, что и goA действуют на разные цепи й.1-2р. Полученные наш результаты заставляют думать, что по мере сни.жения дозы алкилирующгго препарата специфичность его действия на клетку повышается. Как указывалось выие, чувствительность клеток селезенки мышей к антипрплифера-тивному действию алкилирующих метаболитов циклофосфамда in vitro вносит существенный вклад в определение ме«линейных различий в чувствительности к иммунодепрессивному дейетв:по цикло-фосфамида in vivo. Эти различия могут быть выявлены при использовании лишь относительно ниеких доз алкштрущшс препаратов, причем точка приложения их действия не установлена. При-

веденные нами данные показывают, что такой точкой приложения не может быть продукция ИЛ-2, так как для ее подавления необходимы существенно более высокие дозы алкидирутацих агентов, чем дозы, необходимые для заметного угнетения пролиферативного ответа. Аналогичные данные получены и для ЦсА, способность которого подавлять продукции ИЛ-2 также обнаруживается лишь в относительно высоких дозах. Для ЦсА это также подтверждается тем фактом, что добавление экзогенного ИЛ-2 не восстанавливает пролифератиный ответ (Reed et al., 1586; Gelfand et al., 1987; Kumng&i et cii. , 1358).

Приведенные вьшн данные, полученные нз модели комитоген-ного действия ИЛ-2 на мышиные ткмоциты, показывают наличие корреляции между экспрессией КЛ-2р и чувствительностью клеток данного генотипа к антипролиферативному действию ЦсА. Известно, что ЦсА подавляет легкую цепь (р55) ИЛ-2р как на уровне мРНХ, так и клеточной мембраны, и не влияет на тяжелую цепь того же рецептора (Caillat-Zucman et al. , 1989). Сопоставление чувствительности клеток мышей разных линий к антипролиферативному действию ЦсА с .экспрессией ИЛ-2р, индуцированных митоге-ном, показывает, что клетки мышей с наиболее высокой чувствительностью (C57BL/6) обнарухизают саый высокий уровень экспрессии индуцируемого ИЛ-2р, а гсгеткл мышей с минимальной чувствительностью (DBA/2), напротив, показывают самый низкий уровень его экспрессии (см. рис. 8а и 10а). Создается впечатление, что отЕет тимоцитов, обработанных ЦсА, который, как указывалось выше, термозит цепь р55 ИЛ-2р, зависит от уровня экспрессии цепи р75 (конститутивный рецептор), так как клетки мышей, чувствительных к ЦсА, обнаруживают низкий уровень, а клетки мышей резистентных к ПоА - высокий уровень его экспрессии (см. рис. 10Ь). Сравнение тех же линий мышей по чувствительности тимоцитов к антитпролифертБивному действию Щ показывает, что наиболее чувствительными оказались мыли линии DEA/2, а наиболее резистентными - C67EL/6 (см. рис. 8а). Соответственно, мыши DEA/2 обнаруживают высокий уровень экспрессии конститутивных (см. рис. 10а) и низкий уровень индуцированных (см. рис. 10Ь) рецепторов. У мышей линии C57EL/6 наблюдается обратная зависимость: низкий уровень конститутивных и высокий уровень индуцированных ргцэпторов (су- рис Л 0 sub).

Таким образом, можно предположить, что тип чувствитель-

ности тимоцитов к антипролиферативному действии ЦсА зависит от того, в какой степени подавление рецептора р55 мотет быть компенсировано уровнем экспрессии рецептора р7Б. Если такая же зависимость существует для !/4), то можно думать, что точкой приложения этого препарата является тяжелая цепь IUI-2р. Эту гипотезу подтверждают эксперименты, проведенные на модели ци-тотоксических лимфоцитов. Известно, что лимфоциты, стимулированные в смешанной культуре лимфоцитов, после недельного культивирования экспрессируют на мембране преимущественно рецепторы средней аффинности (р7Б). Действительно, наши эксперименты показывают, что такие клетки дают ваыраленный пролиферативный ответ на относительно высокую (10 МЕ/мл) дозу ИЛ-2, который может быть подавлен МФ в том же диапазоне доз, что и ответ лимфоцитов селезенки на КонА. При этом сохраняются те же межлинейные различия (см. рис 13а). С другой стороны циклоспорин А, подавляющий синтез рецептора р55, не вляет на ответ ЦТЛ на ИЛ-2 (см. рис. 13Ь).

Таким образом, наши данные свидетельствуют в пользу того, что мишенью для Мф при использовании его in vitro в относительно низких, но достаточных для подавления пролг.^ртивного ответа, дозах в перцуго очередь оказывается тяжелая цепь рецептора для ИЛ-2. Остается, однако, неясным осуществляется ли это действие только на уровне мембраны в виде алкилнроЕ?~ч;:я готового рецептора или блокада происходит так же на уровне РНК.

2.1.7. Анализ механизмов межликейных различий в чувствительности к иммунодепрессивному действию Цф. i Результаты оценки чувствительности мышей разных генотипов к км!.!унг!депрессиБ-кому действию Цф были сопоставлены с данными по чувствительности лимфоцитов к антипролифератизному действию активных метаболитов Цф, а также с суммарным количеством алкшшрухщнх метаболитов в крови мышей исследуемых четырех линий после введения им Цф в дозе 25 мг/кг. Результаты такого сопоставления представлены в таблице б. Из таблицы видно, что мыши линии BALB/o отличаются резистентностью к иммунодепрессивнсму действию Цф. При этом их спленоциты обнаруживают in vitro низкую чувствительность к АМЦФ, а.содержание алкилирующих метаболитов в крови не высоко. Таким образом, мы имеем дело с действием двух однонаправленных параметров, результатом которого являет-

ся низкая чувствительность к иммунодепрессивнсму действию Цф. У мышей линии ОВА/2 мы сталкиваемся с обратной ситуацией: высокая чувствительность клеток и значительное количество алки-лирующпс метаболитов б крови. Результат - высокая чувствительность к действию препарата 1п VIуо. Чувствительность мышей

Таблица Б

Вклад различных факторов в определение чувствительности мышей разных линий к пммунодэлресскапому действию Цф. Относительные единицы

Линия Чувствительность Содержание в кропи АЩФ Эффективность супрессии

иммун. ответа кл. селезенки

ВАЬВ/с 0,44 0,32 0,38 0,36

ОВА/2 • 1,00 0,96 0,35 0,96

СС57ВЯ 0,42 0,38 1,00 0,69

С57В1./б 0,66 1,00 0,80 0,93

Примечание: показатель эффективности супрессии является средней арифметической величин, представленных в двух средних колонках.

С57ЕЬ/6 может быть охарактеризована как промежуточная. Е этом' случае мы сталкиваемся с двумя разнонаправленными составляющими: относительно низким содержанием алкклируюцих метаболитов при высокой чувствительности клеток-мишеней.

Если бы мы располагали данными, касающимися только этих трех генотипов, то легко могли бы сделать вывод о том, что чувствительность к иммунодепрессивнсму действия такого мета-болизируемого алкшшруюцего препарата, каким является Цф, определяется двумя факторами: чувствительностью лимфоидных кле-

ток к антипролиферативному действию алкилпрующнх агентов и содержанием этих агентов в периферической крови. Однако анализируя данные, касающиеся мышей линии СС57ЕИ, мы столкнулись с ситуацией, которая не укладывается в приведенную выше схему. Здесь мы также имеем дело с ярко выраженными разнонаправленными факторами: низкой чувствительностью клеток и очень высоким содержанием алкилирующих метаболитов в крови. Теоретически этот генотип должен относиться к промежуточному типу, однако на деле мы сталкиваемся с высокой степенью резистентности (см. рис. 4 и табл. 5). Чтобы разрешить это противоречие был изучен ряд характеристик иммунного статуса исследуемых животных.

Показатели иммунного статуса мышей исследуемых линий представлены в таблице 6.

Таблица 6

Показатели иммунного статуса мышей разных линий

Линия Иммунный ответ Ответ КС на ИЛ-2 Содержание Эффектив-

на ЭВ . на ПОД Кон А Продукция Утилизация Лф в селезенке ность иммунной системы

ВАЬВ/о 1,00 0,89 1,00 1,00 1,00 0,76 0,94

ОВА/2 0,57 0,01 0,74 0,86 0,39 0,95 0,59

ССБ7ВЙ 0,90 1,00 0,42 0,23 0,43 1,00 0,66

СБ7В1./б 0,23 0,11 0,55 0,40 0,64 0,58 0,42

Таким образом, если оценивать функцию иммунной системы как результат синергического действия отдельных звеньев, характеризуемых исследованными показателями, то наиболее эффективно она функционирует у мышей линии ВАЬВ/о, а с наименьшей, эффективностью - у мышей С57ВЬ/6. Исследование параметров, ха-

растеризующих состояние Т-клеточного иммунитета, показывает, что к слабоотвечаю!?ш могут Сыть также отнесены мыши линии СС57ЕЯ. Клетки мышей этой линии отличает крайне слабый ответ на Т-клеточные митогены (ФГА и Кон А), они очень слабо продуцирует такой важный медиатор иммунных реакций так ИЛ-2. Если же в культуру добавлять экзогенный ИЛ-2, то клетки этого генотипа очень плохо его утилизируют. В то же время, животные этой линии хорошо отвечает на иммунизацию эритроцитами барана и исключительно сильно на иммунизацию полпсахаридкым антигеном менингококков сврогруппы к (ГОА), который, как известно, относится к ткмуснегаЕисимым антигенам (см. табл.8). Можно, таким образом, думать, что та парциальная недостаточность иммунной системы, которуя нам удалось обнаружить, изучая параметры Т-клеточного иммунитета у мышей СС57ЕН, компенсируется исключительно мощной реакцией В-клеток на антигенное раздражение.

На основе приведенных выше результатов мы предприняли попытку исследовать вопрос о взаимоотношении между чувствительностью организма к иммунэдепрессивному действии циклофосфамида и иммунным стагусом, характерным для данного генотипа. С этой целью з системе осей координат, где ось абсцисс соответствовала показателя) эффективности супрессии, а ось ординат - показатели эффективности иммунной системы, для каждой линии мышей были нанесены точки, положение которых удовлетворяло этим двум

Рис. 14. Корреляция между показателем эффективности супрессии и показателем эффективности юмунхой системы.

параметрам. Из графика видно (рис. 14), что положение этих точек удовлетворительно описывается уравнением линейной регрессии (г - -0,93), из чего можно заключить, что между показателем эффективности супрессия и иммунным статутом животных данного генотипа прослеживается связь, имеющая неслучайный характер.

Опираясь на это заключение мы можем теперь вернуться к вопросу резистентности иммунного ответа к действию Цф у мышей линии СС57ВИ, котру» мы не могли объяснить, исходя из модели,

учитывающей только такие параметры, как чувствительнееть клеток-мишеней к антипролиферативному действию активных метаболитов Цф и содержание алкилирующих метаболитов в крови исследуемых животных. Как уже сообщалось выше, у животных этого генотипа обнаружена низкая чувствительность клеток-мишеней я высокий уровень алкилирующих метаболитов Цф в крови. При таком сочетании факторов животные этой линии по чувствительности к имиунодепрессивному действию Цф должны были бы занимать промежуточное положение. Мы уже упоминали, что относит-л>.ко низкая реактивность Т-клеток у животных этого генотипа, компенсируется очень высокой реактивностью В-клеток. Ранее было показано (Ким Нам Ир и др. , 1984), что чувствительность к алкилиручшнм агентам пролиферирующего пула Т-клеток выше, чем у такого же пула В-клеток, и что межлинейные различия обусловлены, главным образом, различиями в чувствительности Т-клето1С В то же время, исходя из данных, приведенных в табл. О, можно думать, что в ответе на эритроциты барана у мышей линии СС57В(? существенную роль играют В-лимфоциты, чья низкая чувствительность к действию алкилирующих агентов компенсирует Еыеокое содержание последних в сыворотке крови.

Таким образом, можно сделать вывод, что чувствительность к иммунодепрессивному действию Цф обусловлена чувствительностью клеток-мишеней, уровнем алкилирующих метаболитов в крови, а также особенностями иммунного статуса организма. Важно отметить, что чувствительность клеток-мишеней достаточно точно отражает чувствительность лимфоидных клеток, стимулированных митогенами, к антипролифертаивному действию алкилирующих агентов. Этот параметр поддается строго количественному измерению и может быть использован в условиях клиники. Изучение особен-

ностей фармакокинеткки алкилирущик метаболитов Цф у мышей разных линий показало, что они завися? кат. от генотипа дивот-ного, так и от дозы введенного препарата. Бот почему сравнительную оценку суммарного уровня алкилирукадих метаболитов у животных разных генотипов целесообразно проводить, используя Цф в той дозе, которая дает выраженные межлинейные различия в опытах ín vivo.

2. ?.. Антипролиферативное действие хлорбутина и чувствительность больных гломерулонефритом к терапии этим препаратом.

В исследованиях, проведенных на мышах инбредных линий (см. вше) было показано, что существенный вклад в спреде-лниэ типа чувствительности к иммукодепрессивному действию алкшшру-юапт-т агентов вносят различия в чувствительности клеток-мишеней, в частности, различия е чуасхвкгелыгости лимфоидкых клеток к анткпролифэратйвному действию этих соединений. В связи о этим представлялись обоснованными попытки разработать метод оцекгаг индивидуальной чувствительности больных к действию им-мукодепрессактов на основании результатов лабораторного исследования, а не ex juvantibus, как .что имеет место в современней терапевтической клинике-.

Целью настоящего раздела работы было проведение сравнительного анализа мкгжду результатами лечения различных фо; м г ломе рулоне фрита (Г Я) у детей алкилирукцим препаратом хлорбу-тином (505) и данными по определению чувствительности лимфоцитов периферической крови тех же больных к антипролиферэтивному действию Хб in vitro. Эта часть работы выполнена совместно о сотрудниками Института педиатрии РАМН профессором В. К. Наумовой, д, м. н. IL А. Торубарозой и к. м. и. О. К. Дпломаиовой.

Ксследова.ч Й1 ребенок с различными формами гломирулинеф-рита. Данные, каеащнэся возраста, диагноза и результатов лечения представлены в таблице 8. Лечение по 4-компонентной схеме включало малые дозы преднизалона (10-15 мг в сутки), й-месячный курс терапевтической дозы (0,2 мг/кг) Ж с: последующим 2-месячным приемом поддерживаний дозы (0,1 от/кг), а также куранты: и айтикоагудйихы в течение 4, моо в индивидуальных дозировках. Все больныэ, по краалей мере, в течение 2 изо

- -

до качала терашчт ке получали цэтостатпков. В результате лечения хлорбутпнсм с различной частотой наблюдались полная (исчезновение клинических симптомов и нормализация лабораторных показателей) и частичная (уменьшение активности ГН) \ ~~:глсеии кли отсутствие эффекта, Эффективность лечения оценивали через о и более месяцев от начзла лечения хлорбутином.

Для сравнения иепользоьалиеь данные по чувствительности лимфоцитов периферической крови (ЛПК) к анткпролиферативноцу дейстыП» хлорбутика, полученные при обследовании Ж г-доровкх добровольцев и 2Е. детей, больных ревматоидным артритом. Оценку результатов лвч.-«кл и сценку чувствительности Л1К к а чти про ли-феративкому действия Ж проводили независимо друг ст друга двойным слепым методом.

На первом этапе работы было проведено изучение распределения типов чувствительности к антипролиферативному действии Хб среди больных гломерулонефритом и ревматоидным артритом (группа сравнения). Результаты этих исследований представлены ка рисунке 15, из которого видно, что внутри обследо-

Рио. 15. Р&г;прС'Х*£ёпт бэлъ:-тых з апяисиыоетл о-г тжм чувствительности к антияролифоратшшоху дэйстэк*} х&рбутжа. Сл.юсная линия - глоыерулйнс^ри?; пунктирная - ревматоидный артрит. По оси абсцисс от.погоны диапазоны доз Хб, в пределах которых колеблются значения Ь'П50 для данной группы Болта; по оси ордшм - число больных в ируппе.

- 32а -

Таблица 8

Резцльтаты лечения больных гломерулонефритои и чувствительность ЛПК к ан-типролифератизноыу действии хяорбутина.

Диагноз Дли- Зф- Чувстви-

Но Ф.И.О. Возраст Пол_тель- фект тельность

приме- от ЛПК

клинический морфологический нения лече- СЕ050

Хб ния мкг/мл)

1. Т.Г.

2. О.

3. С.И.

4. I.B.

5. И.О.

6. А.И.

7. Г.Л.

8. MX

14 К Хронич.ГН, сме- Мезангиокапилляр- 2/2 (-) 6,60 ванная форма, ный ГН с ТИК и актизная стадия ОПТ

14 У Тот ве 14 М Тот se

Тот же

1/0 (-) 4,64 2/2 (-) -9,24

6 U Хронич.ГН,ге- Мезангиокпиллляр- 2/2 (-) 6,75 катурическая ный ГН Форма, активная стадия.

6 Е Хронич.ГН.ге- Незначительные матурическая изменения клу-ФорнаСвариант бочков,перивас-Берае),актив- кулярный склероз, ная стадия. склероз интер-стиция.

2/2 С-) 4,93

14 Ii Тот зе .

Мезангиопролифе- 2/2 (-)♦ 8,99 ративный ГН с Ш

11 И Хронич.ГН,сме- Мезангиокапилляр- 2/2 (-) 4,11 иагаия форма, ный ГН с ТИК. активная стадия.

14 Е Хронич.ГН.не-фротическая форма, активная стадия.

9. Г.С. 8 М Тот se

2/0 (-) 2,21

Мембранозный/псев- 2/2 (+-)* 4,12 домембранозный ГН с ТИК.

10. K.M. 12 11 Тот ке

2/2 (+-)* 4,11

11. Г.К.

!2. Б.Н.

13. fi.fi.

14. Д.В.

15. Л.И.

16. К.З.

15 й Тот не

1?. О.

18. О.

19. Д.й.

20. С.С.

14 14

13 18

8 Тог те Ж Тот ве

Незначительные изменения клубочков с ТИК.

Мезакгкопролкфера-тиъкый ГН с ФПС

2/2 (+-)# 4.45

1/0 С*-)* б.61 2/5 (+-) 4,60

К СстрьА ГК за- Мезешгискагшлчрный 2/2 (+-)* 4.65 тякьпе течение, ГН с ФПС. смййнная форма, активная стадия.

¡1 Тот «е Тот ве

М Хронкч.ГН,смешанна,! форма, стадия полной клинико-лабо-раторноЛ ремиссии.

б М

13

13 н

Хронгч.ГН,неф-ротическал форма, активная стадия.

Хронич.1'К,не.?-Р')'|Ич1.'1.!ЛЧ форма, стадия частной КЛИНы.О-лабораторной римиссии.

Хрс;!ИЧ.П1 неф-ротическая форма, активная стадия.

Хронич.ГЯ,невротическая форма, стадия полной клкнико-ла-бораторной ремиссии.

2/2 (+-). 10,57 2/2 (+->* 5,69

2/2 (+) 9,01

2/2 (+) 2.85

2/2 < + >* 2,4/

2/2 (+)* 2,45

8

5

- 32В -

21. Г.Э. 13 .И Хронич.ГН,нефр- 2/2 (+) 2,83

отическая форма

активная стадая.

22. О. 8 К Хронич.ГН,нев- 2/2 (+)* 3.81

ротическая фор-

ма, стадия полной

клинико-лабора-

торной ремиссии.

23. Ч.Р. 23 I Хронич.ГН,неф- Незначительные 1.5/2 (+* 2.22

ротическая фор- изменения клубоч-

ка активная ков с ТИК.

стадия.

24. 5.0. 18 К Хронич.ГН.неф- 2/2 (+)* 2,39

ротическая фор-

ма, стадия

полной клинико-

лабораторной

ремиссии.

25. Б.А. 13 И Тот ве Фокально-сегмен- 1,5/2 (+)* 2,32

тарный ГН с ТЖ.

20. О. .12 и Тот «8 2/2 (+)* 1,99

27. Д.й. 18 И Тот «е 2/2 (+)# 2,20

28. С.И. . 18 к Тот не 2/2 (+)# 1.33

29. С.В. 18 к Тот яе 2/2 (+)* 1.28

30. Г.Е. 9 м Тот ве 2/2 (+* 3,12

31. Л.Н. 12 2 Хронич.ГН,неф- Незначительные 2/2 (+) 2,24

ротическая фор- изменения клана, активная бочков с ТИК. стадия.

Примечания: диагноз выставлен на момент проведения лабораторного исследования:

*) больные, у которых эффективность лечения Хб оценивалась по анамнезу.

ванных групп достаючно четко выделяется 2 подгруппы, условно отнесенные нами к двум разным типам чувствительности - высокому и низкому. Таблица 7, представляющая средние значения чувствительности для каждого типа, демонегрпрует статистичесга значимые различия между подгруппами с высокий и низко*'! чувствительность» к антипролиферативному действ™ Хб. Аналогичные различия наблюдаются и в группе здоровых взрослых добровольцев. В то же время, между подгруппам:! с одяяакозм* типом чувствительности статистически значима»: различий не обкаруте-гвает-сея.

Эти результаты свидетельствуют о то«-;, что распределение лиц с высокой и низкой чувствительностью внутри популяции в нашем случае не зависело от наличия или характера заболевания.

Таблица 7.

Чувствительность ЛПК к анткпролифертивному действию Хб у здоровых лиц и больных гломерулонефритсм (ГН) и ревматоидным артритом (РЛ)

Группа обследованных Тип чувствительности* £ Р

высокий низкий

Здоровые 2,63+0,2? (2,06-3,19) П-12 4,98*0,29 (4, 39-Б. БЗ) г>*-8 Б,83 <0,01

Больные РА 2, ?.1'-0,23 (1, 77-2,67) П-10 6,03+0,17 п«13 9,33 <.0,001

Больные VЯ 2,49+0,19 (2,08-2,39) п-15 6,00+0,48 (4, ¿6-7,03) п-*13 6,80 <0,001

Примечания: *) Значения ЕС50 (мкг/мя);

в скобках - доверительные интервалы (при р<0.05). На втором этапе работы в группе Сольных ГН было проведено сравнение результатов определения чувствительности к анти-

пролиферативному действию Ж с реаультатми проведенной терапии (табл. 8). У 8 больных, несмотря на лечение XS, активность ГН оставалась высокой, то есть эффект лечения отсутствовал. У 8 больных наблюдалась частичная ремиссия и у 15 больных - полная клинико-лабораторная ремиссия.

В группе больных ГН без эффекта от лечения 325 только в 1 случае была выявлена высокая чувствительность ЛПК к антипроли-феративному действию Хб. Лимфоциты остальных 7 детей отличались низкой чувствительностью к препарату. Лимфоциты 14 из 15 больных с полной клинико-лабораторной ремиссией, напротив, обнаружили высокую чувствительность к Хб и лишь у 1 больного -низкую чувствительность. Низкая чувствительность лимфоцитов к антипролиферативному действию Хб выявлена у всех больных с частичной ремиссией. Следует отметить, что среди детей, резистентных к терапии, у двух больных нэ удалось провести полный курс Хб (в одном случае из-за выраженной лейкопении, которая развилась несмотря на низкую чувствительность лимфоцитов к Хб тесте in vitro). Справедливость предположения о наличии связи между эффективностью лечения хлорбутиком и чувствительностью лимфоидных клеток больных ГН к антипролиферативному действию этого препарата подтверждена путем вычисления показателя соответствия (р<0,05).

Близкие результаты были получены при лечении 10 больных циклофосфаном (табл. Э). Здесь также в случаях полной ремиссии клетки больных отличались высокой чувствительностью к антипролиферативному действию а у больных с частичной ремиссией или у больных без аффекта от терапии чувсвительность лимфоцитов была, соответственно, ниже.

Таблица 9^

Результаты лечения циклофосфаном больных гломерулонефритсм и чувствительность ЛПК к антипролифератинному действию мафссфа-мида.

Чувтвительность

к действию Мф Средняя

Ф.И. 0. Рег-ультаты лечения in vitro (Е050) грифм.

Г-в Изгнал рзмпсспя 0,76 1

К-ва Полная ремиссия 3,33 2,71

Ар-в Полная ремиссия 3,75

Б-ва Частичная ремиссия 4,85

Г-нов Частичная ремиссия 4,71 4,81

К-с Частичная ремиссия 4,89

Д-ов Частичная ремиссия 4,69

М-ц . 4 Без эффекта 9,56

' Р-ва Без эффекта 5,18 э, 41

М-н Без эффекта 6,41

3. Чувотвитс льчссуь гй;м'Ьо',;1'гов к анттролнфч'зтпвиому дрйствил г л лко 4i т i г, ;п ; : ; ; ; i д гсрмокср a ?.t?'.;c;.."PT;î от г'-н.тгиг.з.

g. 3.1. Определение типов чуастзительпостн лим^цитов к антипрол^форат! у. к -¡..у до лет я::ы глякокертпкоидог- m vt i ■ о. Сте • пень подавления пролиферации лимфоцитов глккокортикондамн различных людей различна (Walksr et. al. , 19S7), однако до сих пор не существовало метода, позеслякы^го достаточно точно отнести конкретного донора к тему и.;:п иному типу ^уэстгигольнос-ти. Для оце.-нки степени угнетения лролгферьтивкого отпета стимулированных лимфоцитов в присутствии ДМ использовали серию доз гормона с последующим построением титровочных кривых и вычислением величины Е050.

Цри повторных обследованиях одних и тех л» доноров высота пролиферативного ответа в условиях использования постоянной

доэы ФГА существенно колебалась. Уровень подавления пролиферации дексаметаэоном (Дм) также существенно изменялся от опыта к опыту. Однако при сопоставлении данных о высоте пролифератив-ного ответа с данными об интенсивности подавления пролиферации дексаметаэоном в том же опыте позволило обнаружить . наличие между этими показателями прямой положительной корреляции (г -0,61 при с!Г - 98; Р < 0,01). На рис. 16 показана связь между чувствительностью лимфоцитов периферической крови к антипроли-феративному действию Дм (У) и высотой ответа на ФГА (X) для

Рис. 16. Оценка связи между чувствительностью лимфоцитов к антипролиферативному действию Дм и высотой ответа на ФГА (теоретическая линия регрессии). По оси абсцисс - натуральный логар1фм еысоты пролиферативного ответа в импульсах в1мин после вычитания фона (спонтанной пролиферации бе а ФГА); по оси ординат - показатель антипролифэративного действия гормона -логарифм средтной активной концентрации Дм (ЕД50).

41 здорового донора, описываемая уравнением: У - 0,447Х -4,339. Полученный коэффициент корреляции, хотя и свидетельствует о наличии достоверной связи между изучаемыми параметрами, сущэственно меньше единицы, о чем свидетельствует заметное рассеяние точек вокруг линии регрессии (см. рис. 14). Такое рассеяние отражает существование вариабельности индивидуальной чувствительности доноров к антипролиферативному действию Дм.

Основываясь на этих данных, нам удалось сгруппировать доноров по типу чувствительности их лимфоцитов к антипролифера-

тивному действию Дм. Для этого линия регрессии бшз принята за линию отсчета, и каждая точка, соответствуюп^я определенному эначеняюй Е050, была расположена на некотором условном - от нее расстоянии, причем все точки значений Ш50, относяг^ся к одному донору, были помешены на одной вертикальной линии (рис. 17). Таким образом, с помощью описанного метода гее обследованные доноры были разбиты на 3 группы; группа резистентных доноров (результаты всех определений ложатся выше линии регрессии), группа чуэс^вьтельь^х доноров (асе точки - ниже линии раграесии) и группа лиц я прсмлехухочиой чуйС!9а1№ег»8оет»в»

с II g OÙ[ □ р ч 3 » т Ч i s i > i 1 к 1 д

.. Г ï i i ь i — i Г—1 < П ; —i : 4 гп A i ?? ,6« 14 jl< Hj ïifh 1 1 | ' ■ < » ri—."г i гг i » i 1-т-г"т-т т-ч ' т тН

1 2 Ï ♦ S в 7 в Р l0111213U1Siei7lbie2O2l222J2«ai«272e29JO31JIAM4«jej7JC5e«{H1

F.4C. Использовать линт регрессии для p.icnp?,^0п^пг.я доноров по тайны чувствительности к энтипромрфератглу.сыу ¿vjïc-твию Дм. По оси абсцисс - номера доноров; по оаи ордчнзт - ае-личииа (Y-Y' ) - разность швду экс ne рулгенталь ньл/ и ожидаемым значение величины EDSO.

клетки которых в одних опытах обнаружили щеренную чувствительность, а в других - умеренную резистентность (тачки колеблются вокруг линии регрессии).

- SB -

2. 3.2. Принадлежность к току или иному типу чувствительности и антигены HLA. Определение фенотипа HLA было проведено у 41 здорового донора русской национальности (московская популяция) с известным типом чувствительности к антипролифератив-ному действию Дм. Обследованная группа сравнивалась с контрольной популяцией (266 человек - данные по распределению HLA-антигенов в контрольной выборке получены в Лаборатории им-муногенетики МГНЦ РАМН JL Г. Сибиряковой и Е. А. Калашниковой). В результате установлено, что в группе резистентных доноров частота встречаемости антигенов DR2 и В7 достоверно повышена как при сравнении с донорами чувствительного типа, так и с контрольной популяцией. Вычисления проводили с поправкой на число исследованных антигенов (Thomson, 1981) (Таблица 10). У

Таблица 10.

Частота встречаемости некоторых антигенов HLA у лиц с различным типом чувствительности к антипролиферативно-му действию дексаметаэона.

Группы HLA-DR2 HLA-B7 HLA-B18

Контрольная [13 - С 21 [33

23,57. 24,47. 13,2%

Резистентные С 4] СБ] • С 6]

доноры 84,6% 76,97. 0%

Чувствительные Г 73 С 83 [9.1

доноры 27,87. 5,6% 33,3%

Р 1,4 - 0,000013 (Ркорр. - 0,00093) Р 3,9 - 0,031 Р 4,7 - 0,0024 Р 6,9 - 0,0253

Р 3,6 - 0,192

Р 2,5 - 0,00016 (Ркорр. - 0,012) Р Б,8 - 0,000062 Р 2,8 - 0,047

В квадратных скобках даны номера групп.

доноров чувствительного типа частота антигена В18 при таком методе сравнения"оказывается повышенной недостоверно.

Следует отметить, что обследованные лица (41 «¿л. ) входят в число контрольной популяции (¿66 чел.). При ерав.-.ь-иш: частот встречаемости антигенов HLA в исследуемой выборке и в контрольной популяции различий обнаружено не было. В связи с этим мы полагали правомерным проьеоти сравнение распределения антигенов HLA по группам г.нутри обследоваьнсй г.ыбиркл:. В результате установлено, что у резистентных лиц, по сравнен™ со всеми остальными, достоверно повышена частота антигенов DR2, В7 и В12, а у чувствительных - антигена В18 (таблица 11).

Таблица И.

Частота встречаемости некоторых антигенов HLA среди обследованных доноров с разным типом чувствительности к ачгипролифе-ративному действию дексаметазона.

HLA антигены Типы чувствительности

резистентный промежуточный + чувствительный F

DR2 S7 84, 6% 73, 5i .~м, ь;*. 21,4', 14, 3*. Ci.iv. п - 0, 0 GX-2 С. 0017 00-U

• чувствительный промежуточный + Р^зпатентный

В18 33,3* 4,3?. й 020

2. 2. 3. Эффективности связывания глкс--.окортнкоидоя специфическими рецепторами ¿::ш.1>оцитсчз доы'ры; ¡2. чуп.'трп-тельности. Эта часть работы была выполнена ооб.л?С1НС с к. м. н. В. Н. Ляшко. Для оценки деаикосвяэи между типом чуьсгтгтольнос-ти лимфоидных клеток донора к антипродиферагивлому действию дексаметазона и особенностями атих клеток в отношении рецепции глекокортикоидов были обследованы 9 здоровых доноров. Параметры связывания гормона с лимфоцитами были определены по описал-

ному ранее методу (Ляшхо, Сухих, 1987), при этом вычисляли максимальное количество мест связывания (Вт), равновесную константу диссоциации (КЗ), а также показатель эффективности рецепции (Вт/Кф.

Таблица 12.

Параметры связывания дексаметаэона с лимфоцитами доноров

Ко Тип (Вт/Кб)

доноров чувствительности Вт (пМ) Кй (нМ) х 10'5

2 31,65 6,9 4,95

Б резистентный 20,21 5,4 3,75

7 (I) 17,72 4,1 4,32

13 промежуточный 15,19 2,5 6,08

14 (II) 40,51 4,9 8,27

24 19,62 3,1 6,33

25 чувствительный 63,29 5,5 11,27

26 (Ш) 22,78 3,0 7,Б9

29 34,81 5,0 6,96

Вт - количество глюкокортикоидных рецепторов (максимальное количество мест связывания в пересчете на 1 л клеточной суспензии в концентрации 10 кл/мл); К<3 - равновесная константа диссоциации; Вт/Кб - показатель эффективности рецепции. Номера доноров те же, что и на рис. 17.

Определение типов чувствительности лимфоцитов 9 обследованных доноров показало, что 4 донора могут быть отнесены к типу чувствительных, 3 донора - к типу резистентных и 2 донора - к промежуточному типу (табл. 12). Сопоставление типа чувствительности лимфоцитов к антипроякферативному действию Дм как с количеством рецепторов к ГК (Вт), так и с константой диссоциации (Кс1), не позволяет обнаружить какой бы то ни бьшо кор-

релятивной связи (см. табл. 11). Однако при введении в систему анализа таяого интегрального показателя, как эффективнссть рецепции (Егг/Kd), видно, в группе чувствительных доноров ве-личика этого покнрэтрля значимо выше, чем в группе рсзистент-нык дочоров (Р 1,111 < 0,05).

2. 3. 4. Чувствительность к ант ип ро р ат г в и р м/ действия дм и интенсивность продум'.ж /l1-s. сдш'м пэ м?\'зн;:?мг'2 злтип-ролиферативного действия ГК на лимфоциты человека является подавление синтеза одного из главных медиаторов про.ъгфзр-п'.чи " ИЛ-2, которое происходит за счет снижения накопления соответствующей м?НК в клетках. При добавлении ИЛ-2 в среду уг-не-тенная гормонами пролиферация может практически полностью восстановиться.- Моько предположить, что различия з чувствительности к тормозящеку действию ГК на пролиферацию связаны с различной способностью к продукции ИЛ-2. В связи с чтим мы исследовали в системе in vitro связь между способностью лимфоци-топ опр^д^л^ннь'я лиц сич г.-лирорит». РТЛ-? г; их ^унегип ■"льноотью к антипролифера1: ¡ганоку йстзпй Дм.

В ходе работы оРсл-допано 27 яд.-ровых доноров. i?;:rohck3-ность продукции VJ1-2 повторяя определена у Б ('е;>уль-

таты повторных исследований, а также соответстяуь-'глi данные литературы (Bonnard et al. , 1SS0 и др.) сзидет'-л^сти^ют о том, что уровень продукции м-2 представляет собой :тугоч.-:о с-га-Рилььый признак. 3 таблице 13 предстэзл-яиУ данное го продукции ИЛ-2 лимфоцитами лиц с различным типом чувствительное-;;: к антппроллферзткяному действие Дм. Оч^аигно, что в группе- ре-эистечт.чых доиор^п продукция пЛ-2 bi.ua о?нос:г?-?л>,я* эизекпй, в группе доноров с промежуточным типом чуво-гвитегьиоегк итог показатель был несколько ниже. В группе чувствительных доноров средние показатели продукции Ю1-2 были саши низкими (согласно критерию t Стьюдйнта t 1,111-2,43; Р - 0,022).

Таблица 13.

Интенсивность продукции ИЛ-2 лимфоцитами доноров с различными типами чувствительности к антипролиферативному действию глюко-кортикоидоа.

Тип N N Уровень М + ш

чувстви- группы доноров продукции и доверительные

тельности ИЛ-2 (1Е/мл) интервалы

1 г 3 4 5

1 14,83

2 14,11

Резистент- 4 10,15 10,85 + 1,75

ный I 5 16,99 (17,01)*

6 7,32 (6,57 т 15,12)

7 8,35

12 4,17

14 4,17

15 6,40

Промежу- II 16 • 8,00 (8,14)* 9,54 + 3,17

точный 19 13,11 (7,61)*

22 3,70 (1,40 т- 17,68)

23 24,54

(см. продолжение)

С 1 3 С Г7

1 3 4 п

26 4,10 (2,24; 2,90)*

£8 3,17 (1,23)*

£0 2,60

32 1,62

33 0,62

Чувстви- 24 64

тельный III 37 2,95

33 2,60 5,22 + 1,34

39 2,75

40 0,74 (2,32 - 8,12)

24 16,34

£5 10, 93

~ 1 3,57

1____ 13,43

rj 1,711 - Р II, III > 3,05; P 11,1 > 0,05.

*• - результата лг,2'л-риа:.ч исял<*доггый (при paowre .х-ох покл» аателей использовали средние знзчения интенсивности продукции

11Я-Й для каждого донор:»).

Номера доноров те äs, что и ка рис. 17.

2. 3. о. Анализ рлзл::'-:.г!й у.увс"Г1»:;-

г к р т'-т-'^гтг,г, i;-■ ггн-'. г trp'.'nv^nmut^llllngi

Ггзультаты, предстазл:hkü» в разделе ¿.3.1, демонстрируют метод, позволяющей разделить доноров по типу чувствительности их лимфоцитов к анткпродиферативному действии Дм in v:tro. Это разделение, однако, было сснозэно ка тесто статистических за-

кономеркостях и не было как-либо связано с имеющимися представлениями о механизмах действия глюкокортикоидов на клетку. Доведенные нами исследования показывают, что в определение типа чувствительности лимфоцитов к антипролиферативному действию Дм могут вность вклад по крайней мере два фактора: эффективность рецепции глюкокортикоидов специфическими клеточными рецепетора!ли и интенсивность продукции Ш1-2. Оба фактора генетически детерминированы, причем последний непосредственно связан с механизмами подавления глюкокортикоидами ответа лимфоцитов на мктогены. Обнаруженные наш ассоциации между типом чувствительности и некоторыми антигенами HLA также свидетельствуют о вкладе генетически детерминированных факторов в изучаемый феномен. Выявленные ассоциации (DR2, Б7 и В12 с резистентным типом; В18 с чувствительным) позволяют также высказать некоторые предположения относительно биологического смысла генетически детор:линированных различий в характере чувствительности лимфоцитов к антипролиферативному действии глюкокортико-идных гормонов. Так, по данным Коненкова с соавт. (1988), высокий уровень кортизола а плазме крови здоровых лиц ассоциирован с снтигеном Е7, а низкий - с антигеном В18. Таким образом, можно думать о существовании генетически детерминированного равновесия между фоновым уровнем глюкокортикоидов и чувстви-тельтксстью лимфоцитов к их антипролиферативному действию.

2. 4. Стимуляция продукции ИЛ-2 низкими дозами Дм.

Глюкокортикоидные гормоны являются физиологическими регуляторами деятельности иммунной системы. Активированные горомо-ном ГК-рецепторы изменяют транскрипцию многих генов, что влечет за собой модификацию иммунного ответа. При этом направленность действии ГК зависит от их концентрации в крови. При тяжелом стрессе или длительном воздействии умеренных стрессовых нагрузок, когда в крови оказывается поЕьшенное количество ГК, функции иммунной системы угнетаются (Brahmi et al., 1985; Mackinnon et al., 1987; Fitzgerald, 1988), в то же время, стрессовые сигналы средней интенсивности, действующие непродолжительное время (умеренные спортивные нагрузки), повышают иммунологическую резистентность организма (Fitzgerald, 1988).

Таким образом, глюкокортикоидные гормоны играют роль ис-

тинных имыуномодулятороз, способных кяк подавлять, так и усиливать ишуинш рТакого рода свойства были обнаружены нами и при изучении влияния декс?:'.«гээокз (Дм) на продукция интерлейкика-2 (ИЛ-2) лимфоцитами периферической Kposi:, стимулированными чокканазалином-А (Кон-А).

Выло исследовано влияние- широкого диапазона доё Дм -5 -11

(1С -1С ) на продукцию ИЛ-2 лк\:фоиктамк п-рпфгркческой грози здоровых лиц. Чтобы исключить fe05se»rae глнянпе зкаоро-.-очных факторов и дополнительного количества ГК, которые содержатся з сыгоротке, была использована бэееквороточная ср<:-дз. Хотя? ¿»ревень продукции Ю1-2 в ответ на стимуляцию Кон-А был чем при использовании среды, содержащей 271 человеческой сыворотки IV(AB) группы крояи, стимулирующее действ:;? малых дог» Дм проявлялось более отчетливо.

Всего было обследовано 10 доноров (ряс. 58}. Еч^жзнньгй эффект стимуляции освобождения ИЛ-2 в культурвльную среду наблюдался у 7 из них, менее отчетливый - у 2 (доноры - S.O. и С. Г.); э одно>.-: случае стимуляции не ьаблю-глзс-ь (С. 0.). Сущеет~ вование феномена егш.улдцш: продукции IUI-2 ;;гэач::

in vitro подтзеруд=.91с:1 статистическим»* расч-тзмм с ¡.лг-зо-ванием точного ютода Эпюра. Тук, ппетег-» о не»,::уч.-..'':»ом ка-ряк.тере пойшенил уровня продута?«« ИЛ-2 пр^дстагдле.й-?роят-кой, даж>- если прпчлтг 2 глу-rai с неогч-глкгей i -. i-чу.--яипей ( 3. С. и 0. Г. ) как (ГМ), IVi-ibl.

Следует откатить, что лимфоцит:.: кроаи,

стимулированные Кон-А в бессьгаороточной среде, н<г рс г.аьг з пролиферацию. ОбрзСоткя клеток э том числ® и в доза»:, сти-иулнруа:дк;с продукции ЯЛ-2, тзкжз не еопреглчззэтгя К-тимидикэ.

Хотя фэкт стимуляции продукции ИЛ-2 in vitro низкими дозам! Дм не- гнз:-~згт сочдекий, характер кркзой, отра^ле^й слияние Дм на интенсивность продрерги ИЛ-2, требует дог-..vn-rriявного анализа. Так, не ясно, почему дальнейшее сяи-.е«':«.- концентрации Дм после ст::1улнру;-;п.;его зффекта мечет у некоторых доноров вновь пругнетений продух.';:::: эгего ллфки-на (см. рис. 18, доноры P.C., С. Г. и КС.). Учитывая имеющиеся С9Г0ДКЯ данные о алиляат ГК на тфэщтэ клетки in vitro (.'.одно предположить, что прямое влияние на экспрессия гена №2 модифицируется опосредованным доэоэависимым действием РК-ияду-

-4 -{ -7 -5 -9 -10-11

-5 -4 -7 -г -9 -»-11

-5 -С -7 -8 -9 -10-11

-5 4-7-4-9 -10-И

-5 -7 -4 -9 -10-11

-5 4-7-4-9 -10-И

4 -7 -8 -9-10-11

-5-6-7-4-9 -10-11

*>»

сл р

Рис. 18. Влияние разных доз Дм на продукцию ИЛ-2 ЛПК 10 здоровых доноров. По оси ординат - содержание ИЛ-2 в иадоса-дочной жидкости (процент к контролю); по оси абсцисс - десятичные логаоиФмы юз Ш

цируемых белков. Так, например, можно думать, что наблюдаемые эффекты связаны с модификацией синтеза липокортиноз (Rolhhut ct al., 1983). Известно, что повьиэкке их синтеза к сяк-

хенип уровня простатландинсв, чье супрессоркое ДгГгствпе кз лимфоциты частично обусловлено тэдукцией cynpeccopr.'J'-: Факторов (Rogers et. al. , 198Ú). Нельзя тзюпе исключить вм?гзтэльства в этот процесс и других антипролиф^ратизных белков (Redondo et fi.1. , 1968: Lükie, 1989). Рсь это дает ссно^анг'е пр?дпол:':,ать| что подавление дексаметааоком (в разной степени у раэг.ва. доноров) продукции ИЛ-2 и, йдноврем-гнно, оупрессогных факторов, угнетающих продукцию ИЛ-2 (Lomnitzer et ai., 19вЗ; Shibata, Yamaroto, 1990), может приводить к повышению выхода ИЛ-2 в кэ-досадочную жидкость по сравнению с контролем. Так кзк соотношение степени подавления продукции ИЛ-2 и супресеорных факторов у разных лиц может быть различно, то и форма кривой высвобождения ИЛ-2 в среду может иметь разный характер.

2. 5. Клияяи^ на п р с л пфе р гт и у к ый ответ на КонА клеток селезенки мыпгеЛ рдэных линий.

С целью дальнейшего анализа мэхапкзмоз анткпрорлгф -ратнз-ного действия глюкокортикоид.чых гормонов было :1.:"!л-:дсвано

Таблица 14..

Чур с т в ит е ль н о г. т ь лимфои,рны?. клеток мыпей разных линий к актип-ролифретакзному действию дексамегаэ^н.

Линия мкпей

Бьличина EDSO (xlO' М) в разных опытах

II

III

IV

редняя

RALB/c D2A/2 CC57BR C57BL/6

16,8 22,8 Б,9 10,8

19,9 9,2 6,2 31,4

13.2

31.3 10,3 20,6

13.8 25,6

16.9

18,7 2ы,2 7,б 19,9

действие Дм на лимфоидные клетки мышей четырех икбредных линий: ВАЬВ/с, ОВА/2, СС57ВН и С57ВЬ/б. Результаты этих исследований представлены в таблице 14.

Из таблицы видно, чго лимфоциты мышей линии СС57ВЯ оказались почти в 3 раза чувствительнее, чем клетки животных трех других линий. При сопоставлении полученных цифр с обнаруженными нами ранее на мьаах тех же линий межлинейными различиями в отношении способности ЦсА подавлять продукцию ИЛ-2 (см. табл. 4) ясно видно, что линии животных по своей чувствительности распределяются одинаково. Это подтверждает мысль о том, что угнетение продукции ИЛ-2 является ведущим механизмом в определении чувствительности клеток того или иного генотипа к внтип-ролифератианому действию глюкокортикоидов.

2. б. Синергкческое действие на пролиферацию лимфоидных клеток кммунодэпрессантов, имэюшгпс разные точки приложения.

Исходя из представлений о том, что Дм, ЦсА и действуют на разные звенья одной и той ж- цепи (продукция-акцепция ИЛ-2), было исследовано совместно влияние различных доз указанных препаратов на пролиферативный ответ клеток селезенки мызей разных линий на КонА. Клеточная взвесь обрабатывалась сначала в течение 1 ч серией доз Щ (или ЦсА), затем клетки отмывали от препарата и инкубировали в течение 72 ч в пари-сутствии КонА и различных доз Дм. Б результате, протокол такого опыта напоминает таблицу результатов спортивного турнира: влияние каждой дозы одного препарата испьггывается во взаимодействии с каждой дозой другого препарата.

В результате при исследовании совместного действия К!ф и Дм установлено, что в большинстве случаев имело место усиление антипролиферативного эффекта. Это усиление могло колебаться от простой суммации эффектов до более выраженного синергизма, когда 15ф и Дм по отдельности либо очень слабо подавляли проли-феративньй отЕет, либо, напротив, его стимулировали (рис. 19). Синергичэское действие двух указанных препаратов зависело от дозы. Так, при дозах Дм и Щ, соответственно, 18, БхЮ-'^М и 3 мкг/мл усиление антилродиферативкого действия наблюдалось во всех опытах у всех четырех исследованных линий (ВАЬВ/о, БВА/2,

1 ид/т\ 3 ид/т1 10 ид/т1

177777) п* ЕШШ Р^ПРхШ

-1р

Рис. 19. Сочетайте действие Дм (1В,Бх10 ) и Ыф на иродя-фератгтный ответ лик.-фоцитоз мытой линии СС57ЁЯ. По оси эбсцнсс - дозы Ыф; по оси ординат - прошве ратпзяый ответ лл^Ъцотов

(X к ноктрэят).

СС57БЯ. С57Г.;./о). При снпм-лши долы До ДО С,17.\ЧО*<0М у-. „-нвгю-Г9-1Й аффект :а<ол мес-то у ливо-гны* трех »ин»!й, а у .1>?ртой (ССбУВК) он наблюдался непостоянно. При ^ннжгннп д-*н Кф до 1 мкг/мл сшергическое действие двух препаратов Нсолздзлос!. дипь в отдельная опытах.

Похожие результаты могут Сыть полуделы при комбинировании Дм с ЦсА. Однако в этом случае усиливаюцип эффект от их еоче-танкого действия наблюдали лтяа при использовании ЦсА а очень ьизкой дозе (0,01 мгк/мл). Это, по-видимому, оС1чгчя?тея тем, что при увеличении дозы ЦсА он не только может подавл.-.ть синтез рецептора для ЮТ-2 (р55), но и тормозить продукцию собственно лимфок«на. В этих условиях добавление Дм не может усилить а;:т1:иролпч»ратиякмй ЦсА.

При исаольггоаанкк к к-^'вехв-.- объекта исследования ЛИМФОЦИТОВ Периферической КрСРИ ЧвЛОВе:«! бЫЛИ ПОЛУЧЕНЫ ЬЯЗЛО^ИЧНЬМ

результаты. Сочеганное действие Дм и Щ также может приводить к глубокому угнетению пролиферативного ответа, тогда как обработка клеток этими препаратами по отдельности оказывалась сравнительно малоэффективной (рис. 20).

г" 0.3

ЕШЛОт tnn3Mf K230m+Uf

ШШЪт ЕШЗШ IZ23Dm+Mf

Рис. ВО. Сочетайте действие Цып Щ на пролифератизный ответ лимфоцитов периферической крови здорового донора. По оси абсцисс - дозы Мф; по оси ординат - пролифэра.ттный ответ лимфоцитов (X к контролю). А - Ди В дозе 0,62x1 о'3 М; В - в драе Б, БбхЮ'3 И

ЗАЮЙЦШШ

Результаты исследований, представленные в настоящей работе, демонстрируют возможности генетического подхода для решения вопросов иммунофармакологии. Сущность такого подхода основана прежде всего на сравнении реакций иммунной системы животных разных генотипов на фармакологическое воздействие. Другим переменным параметром в наших экспериментальных моделях была доза препарата. Действительно, только сочетание этих двух пере мнных факторов позволило сформулировать фармакокинетическую модель накопления в крови и выведения из крови алкшшрующих метаболитов циклофосфамида (Цф). То же условие оказалось необходимым для разработки метода количественной оценки чувствительности лимфондных клеток к антипролкфератквному действию различных иммунотропных агентов. Такая оценка основана на сравнении действия препарата в широком диапазоне доз, когда получаемые S-обрааные кривые сопоставлялся между.собой и, вычисляемая с помощью метода пробитов, срединная активная кон-

центрзция -(ЕС-Зи) гыступает е кгчгзтве ихтегратигн-Л характеристики ' каждой из анализ кру?мых коебых.

Таким образом, а результате пуонедек.ч-л: неследозэн;:.': удалось выявить фактора, определяв!» чз^т**« .-лчгл ч-т* -г.нпого генотипа к п.гмунод-»пГ'?сс1!зкск.у действии Нам преде г'¿в льется, что наиболее езк.-'1: по ни:-; .-гг.-: -^тсл л лете. л'--лг ':■.•:; ток к ант»¡прс^г» и V»у >.•->?='.•ол^л.'ог

Цф. Другой ва-сг^Л факте:.. - урог*нь в

крови - на практике, по-видимому, должен ¡гграть менее существенную рол:-. Действительно, юлы» у одной чэ четыре:-: »»•>:• л-?до-вакяьпе линий (Р-АЬВ/с) при введен.гл ЦР з д^сох, о Г о с " 1:: г г г^ л; г метликейлые рагллчия в степени тлумодепресспи. форма фзрмато-кинетической кризой алкклируто'х к.- гзСолчгой имела нулл леннк-» с-тличия и, как результат, еуцестнен.чо более сум-

марный уровень указанных метаболитов в крови. Ксс2енкьп< подтверждением зтой мысли могут служить и результаты, полулл-чно в клинике, когда чувствительность ли&фэцстов периферической кро-

ескл л>л. с гь^.:..«. •. I,-л л лл л. л .•-.-о .-.л .у , .лелл-

гпчно тс:>-:у, как ¿то тляс >.-сто для не:а"аГол• .Vх-о •¿.•л--:;-лноущего ярллчр^ г« у л >р(.утлнгЛ .

•Гес:М'. трй ьл р-л'улл. л л пл. ;лл л;-'..- ' - ль-

нул г^олгрулолли-. ;л л:, гЛп;со о лсл::: л;::, . разра-

ботанного мето.г~. лл:. ллл^-лч чуьс'?клте.*;:-._.',т': л:л л.л-;л: с; г-л-

тппрелнф^ртивнзьу алкллллулл'лс л

результатов их клинического пр;:мене.-»:я в кастолщгй ?г.л-'л; к:о>лт был- регея одч^зттачне. Это связано прежде всего с тем, что у нп-С нет ,гло тл'-'сч- л <л-гкллл г^-длл..: .. ■•:..: с ; ■ _л • лох вмешательства км^нод^ЕрелопЕчого агглтл а л л: ^-.-.т.-мункых заболеваний. ь.э:-:.~м лтпзь предположительно судить о

тем, в каких случаях иммунодепрессзнт действует яр?имуществен-нг; "о р-л-оочлллллл, а г - нч

торное звено имл/ннсто огс^тз. Ге, и^ось:? легллд, дост-: гэч-но уЗгдитэлааие результаты, которые мы получили у Оольякх глэ-мгрулок«фрктом, ¡¿огут -:-:- подтзерд::т;ся щ п гогл.л не л.лелл ^о-вать ту же схему клинического эксперимента л усл;:л:л:с ¿руго:; нозологии. Нельзя исключить, что при лечении больных глсмеру-лонефритом алмикруЕзм! препаратами последние действует :ю столько как класскчесюта ктоунодепрессанты, подвллго^ге ответ

организма на аутоантигены и/или синтез иммунных комплексов, • а в большей степени как антипролиферативные агенты, главной мишенью которых являются процессы воспаления in situ. Ответ на этот вопрос может быть найден путем тщательного сопоставления результатов определения in vitro чувствительности лимфоцитов к антипролифертаивному дейстивю препарата, его эффективности в клинике и уточненного морфологического диагноза. Мы, к сожалению, пока не располагаем достаточным в этом отношении материалом.

Обнаружение.у мышей межлинейных различий в чувствительности к антипролиферативному действию алкилирующих агентов поставило вопрос о том, какие механизмы несут ответственность за такого рода вариабельность. Существующие представления. об универсальном действии алкилирующих соединений, согласно которым их цитсстаткческое действие связано с образованием внугри-и межмолэкулярных сшивок ДНК-ДНК (Suria et al. , 1978), а также со вступлением в реакцию алкилирования аминокислотных остатков, в результате чего нарушается вторичная и третичная структура белковой молекулы и меняются гидрофобные взаимодействия (Утешев, Бабичев, 1374), не объясняют причины таких различий. По-видимому, указанные явления действительно играют роль при подавлении пролиферации малигнизированных клеток, когда единственной альтернативой злокачественному росту является необратимое повреждение механизмов клеточной репродукции. В тех же случаях, когда алкилирующий препарат выступает не как грубый цктосгатик, или как иммунодепрессант, призванный полностью подавить иммунный ответ, а как некий регулятор нарушенных процессов иммуногенеза, следует искать иные существенно более специфичные механизмы. При решении этого вопроса наш подход также продемонстрировал свои высокую эффективность. Сравнительное Иоученпе влияния различных доз мафосфамида и циклоспо-рина-А на разные званья цепи событий, разворачивающихся в клетке в результате митогенной стимуляции у животных разных генотипов, позволило получить свидетельства в пользу того, что мишенью действия минимальных доз мафосфамида является тяжелая цепь (р75) рецептора для ИЛ-2, тогда как циклоспорин-А (ЦсА) оказывает тормозящее действие на легкую (р55) цепь этого рецептора. Этот механизм является ведущим в определении мекди-нейных различий чувствительности лимфоцитов к антипролифера-

- 52 -

тивному действие м^фос^/ида.

Другой группой препаратов- исключительно часто лрпменле1.:ых у больных с a;<*T0i:i.ü.5"iH0;': патологией лалякгея глкчс-чорт^кс гормоны. Попытки разбить популяции гдср^зь.:-: л::ц к?, группы чувствительности к акгпярслпфэре'лгзному дейстзлк 1\гечзчортк.-ю-идов давали неодиоэначь^е результаты (Becker et al. . Ю?б; Ericicocn et 2.1. , 1S>.'5). Вт:., по-пкдпмому, чс з псследнг'О очередь связано с что улдэаь-ные иее до дог?, гели не г во внимание наличия корреляции мгжду зысостоа пролиферлтгг-игого 0Г2«та и степенью появления zz.oco ответа г^р»"1"*'«. Нп-e до кие этого параметра з систему анализа позвслплг разбить посл-дуе-мых лиц на группы чувствительности: чувствительную, промежуточную Ii резистентную. Сравнение доноров, принздлэжагцпх к огт-поэитным по степени чувствительности группам, показзле. чго такое разделение носит неслучайный характер. Оно связано как с эффективностью рецепции глакокортикоидов специфическим; клеточными рецепторами, так и со способностью клеток данного до-кора продуцировать ИЛ-2 на том глп ином уровне. ГЬсле.-яге обстоятельство прячэ связан; с- мк-гг-лкемз!;»: и!Г.:?прсч\.:>- «-riorc действт т;.ч как о;; сч<.-т ^нлл ироду ku.wi Т-кл = ткэ! 7:Л-2 гт^опеход!:? nr-^i'r!;^. o."r>:-ri :::•.>.• Jo-цлтов на митог'-ны.

Чрезвычайно важным, с ?очки зрения -б? яскенлл бг.о-лгчч^-кого емче; л?. неодинаково;: "уест^тельностп кл^йл; к

антипролйф^р.чтивног:/.у деСс7ш:о г-г>оког.Т1';:ч:-,~г:: г-; ' яв-

ляется, на нап взгляд, обкэру.чэние асссцьг.;:,:.»! тельности с энг.-тгенамн стоге!-: !*!.А. Наличие одинаковых ассоциаций с антигеном Ь".А- "7 f. с глг-;:члх регистрнтростк .члет • к к ан-типролиферативному действия дексаметазона и а случаях йылзкого содержания кортиэола б плазме и, наоборот, ассоциаций с антигеном HLA-B1S еысокой чувствительности клеток и нлэкон содор-ганил кг;рт:.ьола сйпд-.-тел^гсвугг в пользу тегг,, чгг> !'.: г.:кем дело с неким приспособительным ь.ехаяи?мом, фигиодзгичтокзл регуляции иммуно¡/.одул,«рую!цего действия глакокертккпидных гормонов.

Dto регулируйте действие проявляется не только £ споссй-яоети глакокортикоидов тормозить прол:;феративный ответ лимфоцитов еа счет угнетения продукции ИЛ-2, но и з их способности а малых дозах стимулировать продукцию данного лимфокпна. Сам

по себе факт иммуностимулирующего действия глюкокортикоидов хорошо известен, однако, заинтересованность в этих процессах Ш1-2 ранее не описывалась.

Возможности разработанных нами экспериментиальных моделей были исследованы не только применительно к глюкокортикоидным гормона, циклоспорину А и алкилиругацим агентам. Былим проведены успешные иссдежования таких препаратов как орозомукоид, колхицин и винкристин.

Вопрос о механизмах сочетанного действия различных имму-нотропных препаратов представляет существенный интерес, так как на практике иммуномодулируюшая терапия, как правило, состоит из комплекса нескольких лекарственных веществ. При этом можно предполагать, что препараты, воздействующие на разные звенья одной и той же цепи (например, продукция-акцепция ИЛ-2), будут обладать выраженным синергическим эффектом. Это предположение подтверждают приведенные в настоящем докладе данные о действии на прорлифератявный ответ лимфоидных клеток сочетания дексаметазока с мафосфамидом или ЦсА. Не. исключено, что нечто подобное может иметь место и при использовании только одного препарата, например, ЦсА. Как уже говорилось выше, этот препарат в относительно низких дозах не влияет на продукцию ИЛ-2, но подавляет синтез легкой цепи (р55) рецептора для ИЛ-2. В более высоких дозах происходит угнетение синтеза и самого лимфоккна. В результате, увеличение дозы ЦсА должно приводить к двойному блокированию сигнала, передаваемого с помирю ИЛ-2.

Таким образом, результаты представленных исследований демонстрирует возможности генетического подхода для решения вопросов иммукофармакологгаг. Этот подход представляется весьма продуктивным, так как сравнительное изучение отрезков цепи взаимодействия препарат-иммунная система у равных генотипов позволяет эффективно проанализировать структуру отдельных ее эвеньев.

- 154 -шаода

1. Чувстлигельносте in vivo мыпей рэзькх геногтгттоз к им-мунодепресеиБному действию циклофосфам/.да (Цф) определяется вкл-.дом таких факторов как:

а) чувствительности лимфоидных клеток к зигипролиф^ратиг-Ho>iy дейстзи:с ал:\"Ш!рто™.х метаболитов Цф;

&) содержание алкилиру-щях метаболитов б кроап, которое может быть выражено з виде плоа»»дй гюд фармгкокпяети»?сглй кривой;

в) особенности яммуняого статута, и»ракгэрнрэ для данного генотипа.

2. Предложено уравнение, удовлетворительно описывающее крквул накопления з крогп и вьгаеденкя из крови злк;:л;:рув:цпх метаболитов Цф. Отличительной особенностью этого ура5-!>-н::я является его способность учитывать нелинейны? фзризкокилгтичес-гате процессы. Ранее существовавшее уравнение Я. Брсча, представляется частным случаем предложенной к?ни формулы.

3. ллпкеичч? различил в су'.р-зрном колич^я т-'-'лг.руто-шкх кетАбслкигое ЦФ Kjv-'ВИ л;гль Г!;т. р .-.\vh¡:j'. нативкого пргпагьта а олр&детеннзч дпг..~ззонг д^а 50 мг/кг). full различия ыо^ут определяться различия«.;:: ф:-рмс-фармакгга:я<?7«ч»ской кривой к нивелируется при увеличении пли* ум"-нь№нии дозы.

4. С поющь» рг.ярзботакяого количественного мгтеда вьла-лены генетически Кинтр^т:;*.* л:.нг.п к ч:»г.:: ; ti::-нему дейетрттп плкшшртдих препаратов и циклоспорина А. Тип 4yej гйлтольь'ости к ЙНТРПроTi4 ?рТГИРНОМУ дс^стб*"? Я-И "ЛИ?"г-тттх агентов не зависит от гаплот.та Ч-£.

5. Данные, полученные в ходе гибридологического анализа, укладывайте?, в гипотезу о наличии одного гена, контролируемого у мьйьгй пр-.*?.члк ;¡h: -кспзг-сстп продукции ИЛ-2, не сцепленного с генам;! глакюго ¡«¡..пл^'^л гист> обмести..:ос/к.

6. Получены данные, сйидбтельстаукцие в пользу того, что шшэньи действуя мафосфэ;.эда (синтгткчзский а::алог тощего метаболита Цф) при испстьсон-'нги его in v,tro г относительно низких, ко достаточных для подавления пролифэратианого ответа, догах в первую- очередь оказывается тяжелая цепь (р75) рецептора для интэрлейккрна-2. St от механизм является ведув&гм

- Б5 -

в определении межлинейных различий чувствительнроети лимфоцитов к антипролиферативному действию мафосфамида. •

7. Изучено распределение типов чувствительности к антип-ролкферативномсу действию алкшшрующшс препаратов хлорбутина и мафосфамида•среди здоровых лиц, а также среди больных ревматоидным артритом и гломерулонефритом. Показано, что по характеру распределения здоровые лица и больные указанными заболеваниями не имеют существенных различий.

8. Установлена высокая степень соответствия (Х^ - 0,1849) между эффективностью лечения хлорСутнном различных форм гломе-рулонефрита у детей и чувствительностью in vitro лимфоидных клеток больных к антипролиферативному действию этого препарата.

9. Предложен метод оценки индивидуальной чувствительности лимфоидных клеток здоровых доноров к антипролиферативному действию де}{саметазока. Показано наличие корреляции между высотой пролиферативного ответа и степенью подавления этого ответа дексаметазоном, при этом удалось выявить 3 типа чувствительности: чувствительный, промежуточный и резистентный.

10. Показано, что разделение доноров на группы чувствительности (см. вывод 9) носит неслучайный характер. Это разделение связано с механизмами антипролиферативного действия глюкокортикоидов - эффективностью их рецепции и интенсивностью продукции кнтерлейкина-2.

11. Еылвлэны ассоциации типов чувствительности с антигенами системы HLA: резистентсность к антипролиферативному действию дексаметазона ассоциирована с антигенами HLA-B7, В12 и DR2, а чувствительность - с антигеном HLA-B18.

12. Тип чувствительности лимфоидных клеток к антипролиферативному действию глюкокортикоидов генетически детерминирован и, по-видимому, связан с нормальным уровнем продукции кортизо-ла, характерным для данного индивидуума,

13. Впервые обнаружен феномен стимуляции прдукции ИЛ-2 малыми дозами глюкокортикоидов. Высокие дозы гормона,подавляют продукцию ЙЛ-2, а низкие (10 Э- 10*^0 ее стимулируют. Как правило, пе-реход от стимуляции к угнетению продукции ИЛ-2 происходит в диапазоне доз 104- 10"*М.

14. Сочетанное воздействие на лимфоидные клетки дексаме-тазона и мафосфамида (циклоспорина А) может приводить к резко-

му угнетению пролифератквного ответа, которое имеет ьесто даже в тех случаях, когда указанные препараты., примененные по отдельности оказывают очдкь слабый эффект или не сказывают его вовсе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш) TKMS ДКС^ЛТ/^ИИ

V 1. Аллилуев А. П. , -Ърньгпс-на Т. О., Кс тельников а О В. , Пу-

хальский А. Л. Иммунологические характеристики лиофн.глз;:рсвая-ной полисахарпдной ченингококковой вакцины (группы Л) ЮССйУ -в кн.: Сборник научных работ МНЛНЭМ5 т. 22, с. 45-Ш1, К. , 1979.

/ 2. Пухальский А. Л., Писарев В. М., Аллилуев А. П. , Когель-

никова >0. В. Иммунный ответ мышей разных линий на менпнгококко-вый полисахаридный антиген группы А. - Бюлл. экспер. биол, 1983, N 6, с. 88-90.

' 3. Писарев В. Ы. , Пухальский А. Л., Аллилуев А. ¡1 , Котель-

никопа О. Б. Аллогенная стимуляция иммунного ответа .ча микг.нго-кокковый полисахзрдцкый а«тиген группы А. - Бюлл. экепер. биол. , 1983, !'о 6, с. ОГ-93.

4. Пухальокпй А. А. , К5ежкевг А. 11, №ар1тцки> Л Д. Vyisifci:-тельпость клеток селезенки мышей разных л:'.чий к =л:т;*:фо.г».фэрз-ткпному дэйствиэт алшппруших соединений. - Bau. araivp. Опал. , 1983. N2, с. 190-198.

5. Калагаикэва К. ',. , Пухал;- иклй А. Л. , Перн-иу-ий i.A. Вариабельность й«гтрит»»,льн»>:ти лгла'лцитоз ,v. и» ри? к антипродиферэтинному действию д*ксаметааона и :»чтнг<--к:-> онст^ми HLA. - Бшл. экепер. биол. , 1988,. N 9, с.-. 334-3S6.

о. Пухальс-кпй А. JL , Топгыгш-а А. 11 В.чгсХ'Та пролпфератиако-го ответа на конканавалкн А .'«леток селезенки мстей разных линий и продукция интерлейкина-2. - Билл, з ко пер, биол. . 1G.-3, N 8 с. 238-240.

7. Пухзлъпки* А. Я. , Топтыгина А. П. Иэуч®нв-5 генетического контроля продукции кнтерлейккна 2 у мкшей икбрэдкых лои*. Билл, зтеиер. биол. , 1989. N 9. с. 311-213.

v 8. Капашни:<овэ Е. А. , Пухзльсклй А. Т.. , Ляпг.о В. Н. Чувстви-

тельность лимфоцитов человека к ангипролифератьвному ¿ойствию глюкокортккоидов и эффективность рецепции. - Бюлл. экспер. Си-ОД. , 1989, Т. 108, N И, й. Б83-Б84.

9. Pukhalsky А. L., Toptygina А. Р., Viktorcv V. V.

Pharmacokinetics of alkilating metabolites in different strains of mice. Int. J. Immunopharmacol., 1990, Vol. 12, No 2, p. 217-223.

10. Pukhalsky A. L. , Elena A. Kalashnikova, V. N. Lyashko & L. A. Fevnitsky. Inhibition of phytohemagglutinin-induced lymphocyte proliferation by dexamethasone: mechanisms of individual susceptibility. - Int. J. Immunopharmao., 1990, Vol. 12, No 6, p. 657-653.

11. Fukhalsky A.L. & Toptygina A. P. Do mafosfamide and oyclosporine A really effect on different chain of receptor to interleukin 2 ? - Int. J. Immunopharmao., 1991, Vol. 13 No 6/ p. 787.

12. Пухальский A. JL , Топтыгина А. П. , Доломанова 0. E,, Наумова В. И. , Торубзрова H. А. Антипролифератинноэ действие хдор-бутина и чувствительность больных гломерулонефритом к терапии этим препаратом. - Педиатрия, 1991, N 4, с. 39-43.

13. Пухальский А. Л. , Писарев В. Ш Использование лошадиной сыворотки для выявления межлинейных различий в продукции:.« фактора роста Т-клеток. II Всесоюзно» совещание "культивирование клеток животных и человека (26-28 ноября 1985 г. , Пущино). Тезисы докладов, Пущино, 19Е5, с. 49.

14. Писарев В. М., Пухальский А. Л , Шжнеза A. R , Певниц-кий Л. А. Генетические различия в лекарственно индуцированной продукции фактора роста Т-клеток и его акцепции. Республиканская конференция "Механизмы иммуностимуляции" Тезисы сообщений. Киев, 1985 г. , с. 185-166.

15. Пухальский А. Л., Калашникова Е. А. , Липко а Н. , Пэвниц-ккй Л А. Кэханизмы индивидуальных различий чувствительнооти-лимфоидных клеток человека к антипролиферативному действию глюкокортикоидой. - Бсесоюэн. конф. по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 12-1Б окт. 1989г.). Тезисы докладов. - М. , 1989г., с. 74.

v 16. Пухальский A. JL , Топтыгина A. IL Регулирующее действие

интерлейкика 2 на пролиферативный ответ лимфоидных клеток мышей и генетические различия в продукции этого медиатора. Всесоюзн. конф. по генетикэ соматических клеток в культуре (Звенигород, 12-16 окт. 1389г.). Тезисы докладов. - &, 1989г., с. 75.

17. Пухальский А. Л., Калашникова Е. А., Ляшко Е Е Анти- ,

пролиферативное действие глюкокортикоидов на лимфоциты человека, механизмы индивидуальной чувствительности. - Тезисы I Всесоюзного съезда иммунологов. - М. , 1989г. , с. 359.

18. Пухальски!"! А .Л., Топтыгина A. IL , Калашникова Е. А., Певницкий Л. А. Интенсивность продукции кнтерлейклна-?. как показатель экспрессии retina, "участвующих в контроле пммуисроактивности. - Яеесоюе.ный симпозиум "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной .-экспрессии". Тезисы докладов. - М. , 1989г, с. 51. • '

19. Elena A. Kaiashnikova. & A.L. P\:khalsky. Int^rleukin 2 release by human peripheral blood lymphocytes treated •.•nth low doses of dexamethasone. - In.: Standartization of the immunopharmacology of natural and synthetic immunomodulatory. Symposium of the International Association of Biological Standartization. - Annecy - France, 15-17 May, 1991, p. 148.

20. Пухлльский Л. Л , Калашникова E. A. , Топтыгина A. IL Механизмы синерпического действия некоторых иммунодепресеиктоп. I съезд иммунологов России. Тезисы докладов. Новосибирск, 1992, с. 390.

21. Lutov A. G. , Aleshkin V. А., Novikova L. I. , PuK^ai sky A. L. The influence of different forms of orosomucoid or, мчмиг.е reaction. - In: "Biological function of acute phase proteins and regulation of their synthesis". Abstr. of Papsrs. KraJ<ov, 1992, p. 62.

- Б9 -

СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ

АЫЦФ - активные метаболиты цикдофосфамида

АОК - антителообразующие клетки

ГН - гломерулонефриг

Дм - дексаметазон

Е050 - срединная активная доза

ИЛ-2 - интерлейкмн-2

ИЛ-2р - рецептор для ИЛ-2

КонА - конканавалин А

КС - клетки селезенки

ЛПК - лимфоциты периферической крови

Мф - мафосфамид

МЕР - 4-(4-нитрэбенэил)-пиридин

ПСА - полисахаридный антиген менингококков

серогрупп А

РА - ревматоидный артрит

ТИК - щ - т^б5Лр-ин?ерсткциалъЕкж\ко5Понёнт

ОГА - фитогемагглютияья

Ж) - хлорбутин

ЦсА - циклоспорин А Цф . - циклофосфамид

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

ОТ - цктотоксичеасая клеточная линия

ЭБ - эритроциты Сарана

- 60 -ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение............................................ 1

Общая характеристика работы......................... 2

Содержание работы

1. Материалы и методы............................... 7

2. Результаты исследований.......................... 9

2.1. Еклад различных факторов в определение типа чувствительности мышей различных линий к иммунодэ-прессивному действию циклофосфамида (Цф)............ 9

2.2. Антипролиферативное действие хлорбутина и чувствительность больных гломерулонефритсм к терапии этим препаратом.................................31

2.3. Чувствительность лимфоцитов к антипролифер-

ативному действию глюкокортикоидных гормонов в за-

висмости от генотипа................................36 >'«

¡71

)

■¿. о. илияние дм на пролиферативныя ответ на ^

КонА клеток селезенки мышей разных линий............46 *,

2. 6. Синергическое0 действие на пролиферацию лим- > фоидных клеток иммунодепрессантов, имеющих разные точки приложения.................................47

Заключение..........................................49

Выводы..............................................54

Список работ, опубликованных по теме диссертаций.... 66 Список сокращений...................................69

АО "Экспостроймаш". Заказ №46. Тираж 100 экз.