Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ферментативных гидролизатов молочных белков и липидных композиций с различным соотношением полиненасыщенных жирных кислот семейств омега 6 и омега 3 на резистентность лабораторных животных к аллергизирующим воздействиям пищевого генеза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние ферментативных гидролизатов молочных белков и липидных композиций с различным соотношением полиненасыщенных жирных кислот семейств омега 6 и омега 3 на резистентность лабораторных животных к аллергизирующим воздействиям пищевого генеза"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи УДК 612.353 577. 158 616-05.3

Маликовл Наталья Анатольевна

ВЛИЯНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ МОЛОЧНЫХ БЕЛКОВ И ЛИПИДНЫХ КОМПОЗИЦИЙ С РАЗЛИЧНЫМ СООТНОШЕНИЕМ ПОЛИНЕНАСЩЕННЫХ ЖИРНЫХ • КИСЛОТ СЕМЕЙСТВ «и б И о> 3 НА РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ К АЛЛЕРГИЗИРУОДШ ВОЗДЕЙСТВИЯМ ГЩЕВОГО ГЕНЕЗА

03.00.04-Еиохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кавдидата биологических наук

Москва-1992

^ /

Работа выполнена в Институте питания Российской Академия медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.К.МАЗО

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, професоор В.А.КОБЛЯКОВ доктор медицинских наук, К.А.КОРОВНИКОВ

Ведущая организация - Российский Государственный Медицинский

Университет

Защита состоится 1992 года в * " часов

на заседании специализированного совета Д 001.02.01 при Институте питания РАМН (109240, Москва, Устьинский проезд, 2/14) '

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН

Автореферат разослан » itt&lJL, 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета кавдидат медицинских наук

ЖМЙИЧЕНК0 В.М.

J';":/ • <■•>•. ■ I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальность настоящей работы определяется значительным ростом и распространенностью аллергических заболеваний, в том числе и пищевого генеза. Наиболее распространенным методом диетического лечения и профилактики пищевой аллергии, особенно у детей, является элиминация из рахдаона причикно-энг.чи-мых аллергенов (Барнетсон Р.С., Лессоф Т.Х. 1936). На принципе алиминационной терапии больных, страдающих аллергией к коровьему молоку, основано проведение разработок специализированных продуктов с использованием белковых изолятов сои (Бахна С.Л., ХеЯнер Д.К. 1985) и ферментативных гидролизатов белков коровьего молока ( Battin J. , 1985). Другим возможным направлением диетической коррекции аллергических состояний может быть' целенаправленное изменение аллергической реактивности организма за счет подбора определе'шых сочетаний компонентов пиши. В этом отношении заслуживает внимания изучение липидного компонента района, так как имеются многочисленные данные клинических и экспериментальных исследований о влиянии полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) на проявления аллергической реактивности ( j0gino s.,E ilia Е.1989). Так, известны факты повышенной потребности больных аллергическим! заболеваниями в незаменимых жирных КИСЛОтаХ СемеЙСТВа СО б И М 3 ( Gross R. at al, 1980, мапки ш. et al 1982). В литературе широко обсувдакя ся возможные механизмы, посредством которых поступающие в организм ПНЖК влияют на его чувствительность к аллергизирутоим воздействиям ( Ericaon к. at al., 1983). Одним из путей влияния на протекание аллергического процесса является образование из ПННК простаглацди-нов и лейкотриенов (огоэо к. et al., 1980). Наряду с этим имеются данные о влиянии липидов на функцию коры надпочечников' и, соответственно, на синтез глюкокортикоидных гормонов, обладающих противо-

аллергенным действием ( hnshwan 3. , c.t alJ988). Однако влияние компонентов пищи на метаболические процессы, обеспечивающие адаптацию организма к аллергизирушим факторам внешней среды, исследовано недостаточно. Отмеченные факты свидетельствуют о необходимости экспериментальной оценки влияния пищевых компонентов специализированных продуктов на состояние систем, обеспечивающих резистентность организма к аллергизиругощим воздействиям. В связи с вышеизложенным особый интерес представляет изучение состояния системы цитохрома Р-450 печени, характера метаболизма 17-оксикор-тикостероидов (17 ОКС) и барьерной функции желудочно-кишечного тракта (ЖКГ), поскольку функциональная предназначенность каждой из этих систем связана с обеспечением иымуно-химического гомео-стаза (Поскровский A.A. 1979, Ковалев И.Е., Полевая О.Г. 1985, Ковалев И.Е., Шипулина H.B. 1988, Шатерников В.Н. 1980).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось • изучение влияния ферментативных гидролизатов молочных белков и жировых композита с различным соотношением ПНЖ семейств со 6 и со 3 в рационе на выраженность проявлений экспериментальной пищевой анафилаксии (ПА) и на системы, обеспечивающие устойчивость организма к аллергизирушим воздействиям. Достижение указанной цели предусматривало решение следующих задач: исследовать потенциальную аллергенность белковых компонентов рациона с различной степеньв ферментативного гидролиза; изучить состояние неспецифической резистентности животных к пищевой сенсибилизации под влиянием ферментативных белковых гидролизатов и жировых компонентов ращона с различным соотношением ПНЖК семейств со 6 и со 3; исследовать барьерную функцию ШСГ и соотношение основных изоформ щато-хрома Р-450 при использовании белковых ферментативных гидролизатов; изучить основные особенности метаболизма экскретируеыых 17-

ОКС разной полярности под влиянием рационов, содержащих 'ферментативные белковые гидролизаты или жировые компоненты с разным соотношением ПНЖК семейств ^ 6 и «-> 3; определить взаимосвязь ыелзду гипоаллергенным действием опытных рационов, показателями функционального состояния ШСГ, цитохрома Р-450 печени и основной закономерностью биотрансформации зкекретируемых 17-ОКС.

Научная новизна. Показано, что под влиянием низкомолекулярной фракции ИЛ 20/80, полученной в результате ферментативного гидролиза белков коровьего молока и жировой композиции с высоким соотношением ПНЖК и 6 и 3 изменяется интенсивность реакции ПА, активности протеаз ЖКТ и состояние системы цитохрома Р-450 печени. Установлено, что НМ 20/80, включаемая в состав рациона обладает гипоаллергешшми свойствами и оказывает неследафическое антианафилактическое действие. Впервые обнаружено, что снижение антианафилактической чувствительности животных под влиянием НМ 20/80, сопровождается повышением общего содержания цитохрома р~ 450 печени, увеличением соотношения цитохромов Р-4503/Р—450Л и снижением относительного содержания полярных форм 17-ОКС в свободной фракции и в суммарном количестве зкекретируемых гормонов. Под влиянием жирового компонента рациона, с высоким соотношением ПНЖК семейств ^ 6 в ^ 3, выявлено, что ослабление тяжести реакций ПА коррелирует с увеличением соотношения цитохрома в^/Р-450, цитохромов Р^-450В/Р—450Л и уменьшением относительного содержания полярных форм зкекретируемых 17-ОКС в свобсдной фракции.

! Практическая значимость. Данные настоящей работы использованы для выбора (и обоснования) критерия оценки качества новых специализированных продуктов, предназначенных для диетической коррекции пищевой аллергии. К числу таких критериев можно отнести: собственную потен1?1альную аллергенно сть белкового компонента рацио-

на, неспецифическое воздействие исследуемых факторов на сенсибилизирующие свойства модельных пищевых аллергенов, состояние барьерной функции ЙКГ, особенности организации и функционирования системы цитохрома Р-450 печени. Разработанные критерии оценки качества пищевого рациона использованы в Институте питания РАМН при создании отечественных продуктов таких, как "Фиталакт" и "Укипит • -3", предназначенных для лиц с непереносимостью коровьего молока и нарушенной функцией пищеварения, соответственно.

Апробация диссертационного материала. Основные положения диссертации обсуждались на научных конференциях молодых ученых, проводимых в Институте питания АМН СССР в 1988, 1989гг. Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Цитохрои Р-450 и'модификация макромолекул", Ялта, 1989г., на конференция молодых ученых-биологов "Вопросы природойспользования", Рига, 1990г., на конференции "Питание: здоровье и болезнь", Москва, 1990г., на ХУ Всесоюзной конференции "Физиология пищеварения и всасывания", Краснодар, 1990г. •

Публикация результатов исследований. По" теме диссертация опубликовано 10 печатных работ.

Объем работы. Диссертация изложена га страницах папино пи сного текста, включая 26 таблиц и 13 рисунков. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, ешзодов и списка литература, включающего наименований, из них - инострашшх авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на беспородных морских свншсах-самщх с походной массой '250-300г. Животные содержались в шюарщ Института

питания РАМН. Стандартный рацион вивария для морских свинок состоял из овса, сена и овощей (Козляков Н.В., 1968).

При составлении опытных рационов, которые животные получали в течение 30 дней, часть белкового компонента, а таюхе часть жирового или весь жировой компонент стандартного рациона заменяли соответствующими испытуемыми нутриентами. В экспериментах, связанных с изучением анафилактической чувствительности животных при длительном воздействии концентрата белков коровьего молока, с соотношением сывороточных белков и казеина, равным 20 к 80-ЕКМ 20/80, его ферментативного гидролизата-Г 20/80 и низкомолекулярной фракции-НМ20/80, полученной в результате ферментативного -гидролиза БКМ20/80 с последующей ультрафильтрацией, 5СЙ белка стандартного рациона замещали исследуемым белком и его гидролизатами.

При составлении опытных рационов с различными жировыми комо

позициями 50$ или весь жир в стандартном рационе замешали жировыми композициями, представленными разными сочетаниями топленого, кукурузного, кокосового, соевого, подсолнечного и ихтиенового масел, что обеспечивало в опытных рационах разные соотношения 1кшК семейств со 6 и <-о 3 (см. стр. 18 )..

Пищевую сенсибилизацию животных осуществляли по методу, разработанному в Институте питания РАМН (Шатерников В.А. и др.,1982). 3 качестве антигенов для сенсибилизации использовали модельный пищевой аллерген куриный овальбумин-ОВА и цельное пастеризованное коровье молоко (ЦПКМ) ГОСТ 13277-67МЭ. Для определения собственной ;потенциальной аллергенности в качестве антигенов использовали исследуемые белковые компоненты. Сенсибилизацию проводили в течение 3 дней ежедневно путем внутрижелудочного введения через зонд дозы препарата, эквивалентной 100 иг белка в 3 мл физиологического раствора. Состояние сенсибилизации выявляли через 14 днеЛ

путем воспроизведения активного анафилактического шока. Для это» го внутривенно вводили раствор пищевых антигенов в дозе эквивалентной 7 мг белка в 0,5 мл 0,15М УаСI. Количественную характеристику ПА. оценивали по уровню летальности, по числу судорожных проявлений и по величине анафилактического ивдекса (Weigle ff. , I960).

Оценку чувствительности животных к основному медиатору анафилаксии у морских свинок - гистамину С Wahn v. ,1985) осуществляли, используя введение среднесмертельной дозы гистамина (ЛД^), Экспериментальное определение ЛДэд гистамина определяли по формуле Першина Г.Н. (Кудрин Н.В.,1977).

Методы исследования системы датохроыа Р-450. Фракицп микро-сом из печени животных выделяли с помощью дифференпрального центрифугирования по двухступенчатой схеме (Арчаков А.И.,1975) из го-могената ткани органа, приготовленного по общепринятой методике в среде 0,15М KCl на ТРИС-НС1 буфере, pH 7,4. Содержание цитохро-ыа Р-450 в гомогенате печени определяли с.помощью дифференциальной спектрофотометрии по методу McLean А. и др. (1974)} содержание цитохромов Р-450 и в§ во фракции микросоы определяли по методу Спиre and .Sato R. (1964). Для количественного определения двух групп цитохромов Р-450: цитохромов Р-450В и P-450JI, различающихся ориентацией активных центров в водную фазу я липидный бислой микросомальной мембраны, соответственно, использовали метод Изотова М.В. и др. (1989).

Активность микросомальных ыонооксигеназ оценивали по скороо-ти //-деыетияированяя аминопирина, р-гвдроксялирования анилина: субстратов 1»-го и П-го тяпа (Карузина И.И.,1977) и по длительности гексепалойого сна ftaneva-SV 1978, лваиуыов В.Н. и др.,1980),

зависящего от скорости метаболизма гексенала-субстрата Г типа для монооксигеназной системы печени, вводимого животным внутри-бршинно в дозе 30 мг/кг массы тела.

Исследование функционального состояния коры надпочечников и характеристики основных путей метаболизма 17-ОКС осуществляли путем определения в суточной порции мочи свободных и конъюгиро-ванных стероидов разной полярности по методу когпе1 (1965).

Жирногсислотный состав липидов микросом печени и исследуемых жировых композиций изучали с помощью газожидкостной хроматографии (ГНХ). ГЕХ-анализ метиловых зфиров жирных кислот, полученных с помощью кислотного метанолиза общих липидов исследуемых образцов, проводили на хроматографе "11ПегзпкгЬ 11 (Франция), на набивной колонке с фазой 105? . ЮС на хромосорбе * /т 80-120 меш. (Левачев Ы.М. и др., 1983)?

о

Общую протеолитическую активность в слизистой желудка у морских ыинок определяли флуориметрическим методом с использованием в качестве субстрата - гемоглобина (Гмошинский И.В., Мазо В.К., 1982). Активность трипсина определяли по методу Эрлангера в модификации Иатерникова В.А. (Шатерников В.А., 1969). 'В качестве

I

субстрата использовали ЕАПНА, при расщеплении которого высвобождается р-нитроанилин, имеющий максимум поглощения при ^ =405 нм. Активность химотрипсина в тонком кишечнике морских свинок определяли по способности </ -химотрипсина расщеплять п -сукцинил-1-фенилаланин-р-нитроанилин (СФАПНА) с выделением окрашенного продукта р~нптроанилина (Шатерников В.А., 1969).

■■ г

я Определение состава жирных кислот проведено с.и.с. Института питания РАМН С.Н.Кулаковой

Результаты экспериментальных исследований обработаны методами параметрической (по критерию Стыодента) и непараметрической статистики (критерий Манна-Уитни, парный критерий Вилкоксона, метод углового преобразования Фишера-1/-критерий) (Гублер Е.В., 1978, Лакин Г.Ф., 1990).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ '2.1. Влияние пищевых ращонов, содержащих белки коровьего молока ■ и их ферментативные гидролизаты, на выраженность реакций пищевой анафилаксии, состояние желудочно-кишечного тракта, содержание цитохроыа Р-450 печени и метаболизм 17-оксикортико-стероидов у морских свинок. 1

Для оценки собственной потенциальной аллергенности ЕКЫ20/80, Г20/80 и НМ20/80 была использована модель ПА. Результаты исследований свидетельствуют о том, что собственная потенциальная аллергенно сть НМ20/80 достоверно ниже, чем у исходного белка БКМ20/80, а также у ЦПКМ (рис.1). В группе животных, сенсибилизированных • Г20/80, наблвдали усиление тяжести ПА по всем исследуемым параметрам, что свидетельствует о наличии выраженных сенсибилизирую- . цих свойств данного ферментативного гидролизата.

Исследование состояния гогаевой сенсибилизации у морских свинок к ОВД, оцениваемой по тяжести проявлений реакций ПА показало, что под влиянием рациона с НМ20/80 достоверно снижалась тяжесть • ПЛ к ОВЛ (рис.2). В то же время опытные рационы с НШ20/80 и Г20/80 не вызывали ослабления тякести ПА к модельному пищевому аллергену ОВА.

Таким образом, пептидный препарат Ш20/80 характеризуется как низкой собственной потенциальной аллергенностью, так и (при достаточно дйителыюм поступлении этого препарата п организм)

т 9

80

60 40

20

% летальность

к 2,3

к 3,4

100

, 80

60 40

судороги

*к2,3

3 4

Рис. I. Потенциальная аллергенность белковых препаратов К,',20/80, ЕКМ2С/8С, ЦГПШ и Г20/8С ^

Группы жизстних, сенсибилизированных: I-№¿20/80,

2-fc:ro/oc, з-цта;, 4-гго/ео,

х показатель достоверности различий, к - Р/ 0,05: ' ** - Р/0,01; х** - РZ 0,001

30 20 -10*-

летальность

тх

60 40 20

% судороги

Рис. 2, Влияние рационов, содержащих исследуемые белковые композиции на проявления пищевой анафилаксии к ОВД. Группы животных, получавших: I - №120/80; 2 - БКМ20/80; 3 - Г20/80; 4 - рацион вивария

способностья к неспешфгаескому снижению анафилактической чувствительности к ОЗА.

Влияние белковых препаратов на активность протеолигических ферментов полостного пищеварения изучали у животных, которые получали рационы с 5СЙ заменой части белков рацио:» вивария на ЕКМ20/80 и №120/80. Включение в рацион БКМ20/80 приводило к снижению общей протеолитической активности в слизистой желуцка на 8С£ и активности трипсина как в проксимальном, так й в дисталь-

0

40 30 20

10

ном отделах тонкого кишечника в среднем на &Ж (рис.3). Под влиянием Ш20/80 имела место тенденция к повышению протеолитической активности в слизистой желедуха (по сравнению с ЕЗШ20/80), а активности трипсина и химотрипсина достоверно возрасли по всей длине тонкого кишечника в 4 и 2 раза, соответственно. Общая протеол. Активность трипсина Активность химотрип-

мкг/мл

проке.отд. ^ диет.отд.

Ь 2,0.|

акт.елкэ.жел. мк/экв/мл/мш

сина мкг/мл

юе

4-

I

4-

20

10

к*

1.5 1.0

0,5

проке, диет.отд. отд.

нь

хк.

к*

а

Рис. 3. Изменение активности протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта у морских свинок под влиянием рационов с БКМ20/80, НМ20/80

I - рацион с НМ2О/80; 2 - рацион с ЕКМ20/80; 3 - рацион вивария

и - показатель достоверности различий к» - Р/0,05;

Как следует из результатов данного исследования, снижение протеолитической активности в слизистой же ледка, обеспечивающей начальную стадию расщепления белковых макромолекул пищи, сопровождалось повышением активности трипсина и химотрипсина, ответственных за протеолиз в нижележащих отделах ЖКТ. Выявленные изменения протеолитической активности под влиянием БКМ20/80 и НМ20/80,вероятно, могут быть обусловлены заменой части растительного белка на исследуемые препараты молочных белков.

В отдельной серии экспериментов была изучена возможная взаимосвязь между метаболизирувщей способностью хдатохрома. Р-450 пе-

чени лабораторных животных по отношению к гексеналу, относительным содержанием групп цитохромов Р-4503 и Р-450Л и проявлениями ПА у.животных с различной чувствительностью к гексеналу.

При тестировании по длительности гексеналового сна животные были разделены на две группы: животные не чувствительные к гексеналу - нулевой гексеналовый сон (НГС) и животные чувствительные к действию гексенала - длительный гексеналовый сон (ДГС), продолжительность которого составляла 53^ мин. Отличительными особенностями ыонооксигеназной системы у животных с НГС, по сравнению с данной системой у морских свинок с ДГС (рис.4), явилось более низкое содержание цитохрома Р-450, и пониженная активность обеих монооксигеназ при значительном преобладании содержания групп цитохромов Р-4503 по отношению к цитохромам Р-450Л.

,2 • ,8 ,4

нмоль/мг белка

4-

—5—

гИ

I 2 1

80

60 ■ Н 40

20

I

Р-450

Р-450В

Р—450В/Р-450Л

12

84.

У-деметилдминопиркна р-гидроксилазд нмоль/мг/белка/мин нмоль/мг/белка/,

1,2 0,8 0,4

I

анилина мин

Ю? 4-

гЬ

I 2

4-

Рис. 4. Состояние монооксигеназной системы печени у животных с НГС и ДГС _

I - животные с НГС, 2 - животные с ДГС

о

Ж

При сопоставлении продолжительности гексеналового сна и содержания группы цитохромов Р-450В у животных с НГС и ДГС установлена достоверная обратная корреляционная зависимость между увеличением длительности ГС и уменьшением относительного содержания

цитохромов Р-450В (рис.5).

мин.

% Р-450В/Р-450Л

Рис. 5. Зависимость между продолжительностью гексеналового сна и относительным содержанием цитохромов Р-450В

Животные с НГС отличались толерантностью к реакциям ПА, все показатели тяжести которой были достоверно ниже, чем у особей с ДГС (рис.6). При этом установлена обратная корреляционная зависимость (рис.7) ыеэду тяжестью анафилактического шока и содержанием цитохромов Р—150В.

80

60' 40

20

а1 летальность

судороги

Анафилактический индекс

2

I

2

4 3

2

1-1

Г:; с.

Рис. 7. 3

8пт'р_и5пз

6. Чувствигелытость животных к реакциям ПА с различной продолпитоль-ностьп ГС

I - животные с'НГС, ?. - копотные с ДГС

Следовательно, свособ^знаг.:структура п-люокг/лгс/изноГ; снс-

авнсль-ость могду пролило-пи;;:.:.; III 1; относительный содержанием цчто^ромоп Р-150В гючсш

к

теш ШОГС), проявляющаяся в преимущественной ориентации активных центров цитохромов в водную фазу мембраны, то есть с преобладанием цитохромов Р-450В, сочетается у этих животных с устойчивостью к гексеналу и реакциям ПА. Полученные в настоящем разделе данные показывают, что более активный метаболизм гексенала осуществляется у животных с повышенным относительным содержанием цитохромов Р-4503 ( isotov »я. et al. , 1988). Таким образом, тест на продолжительность гексеналового сна отражает как особенность организации МОГС, так и позволяет оценивать влияние специализированных продуктов питания на резистентность животных к процессу пищевой сенсибилизации.

При оценке воздействия рационов с БКМ20/80, Г20/80 и Ж20/80 на состояние системы цитохрома Р-450 печени, было установлено, что гипосенсибилизирухше свойства НМ20/80 сочетаются с повышением в микросомальной фракции печени общего содержания цитохрома Р-450 и Bg (табл.1). При этом наблвдалось увеличение соотношения цитохромов Р-450В/Р-450Л, по сравнению с данным показателем в группе животных,' получавших в рационе БКМ20/80 и Г20/80.

Таким образом, увеличение в микросомальной фракции печени содержания цитохрома Р-450 и особенно соотношения цитохромов Р-450В/Р-450Л, при включении в рацион животных HI,120/80 характеризуется повышением резистентности животных к реакциям ПА.

Поскольку I7-0KC являются эндогенными субстратами системы цитохрома Р-450 ( Conney А., 1986), то изменения организации МОГС целесообразно сопоставить с некоторыми особенностями метаболизма глюкокортикоидных гормонов, осуществляющих регуляцию аллергической реактивности.

Для изучения метаболического профиля I7-0KC, у эксперименталь-

Таблица I

Изменение состояния системы цитохрсМа Р-450 печени под влиянием БКМ20/80, Г20/80 и НМ20/80

Р-450В | Г

нмоль/мг « нмоль/мг 1 белка | белка j

\ I Р-450В ; в5/Р-450

Вид рациона

Числом Р-450 живот{нмоль/мг ных ( белка

Р-450Л

1.Вивар- . , . "ный раци- 10 0,91*0,09 0,57*0,06 0,73*0,02 1,68 он

2.Рацион , , ,

с^М 10 0,82*0,04 0,54*0,04 0,64*0,01 1,77

3. Рацион , , *1 1 . к! с Г20/80 10 0,75*0,04 0,45*0,02 0,57*0,03 1,35

4. Раиион х*1.2,3 .к1,2,3 и1»2**3 *1.2,3 с Ш20/80 10 1,52*0,61 0,82*0,62 1,64*0,01 3,11

0,8

0,78

0,76 1,01

Р/0,05 ш - Р/0,01

ных животных в суточной порции мочи определяли: общее содержание гормонов и их отдельные фракции разной полярности: глюкурониды, сульфаты и неконъюриропанные гормоны. В первой серии экспериментов животные были отобраны по тесту продолжительности гексенало-вого сна: животные с НГС и ДГС. Суммарное количество 17-ОКС у животных с НГС было на 30$ выше, чем у морских свинок с ДГС (табл. 2). Профиль метаболитов 17-ОКС у животных с НГС, резистентных к реакциям ПА, отличался повышенным содержанием гормонов в свободной фракции (на 40$) и во фракции глюкуронидов (на 48£). При рао» чехе соотношения полярных форм стероидов к неполярным у морских свинок с ДГС эта величина существенно превышала аналогичный пока«-затель у животных с.НГС: в свободной фракции в 1,8 раза, во фракции глюкуронидов в 2,3 раза, во фракции сульфатов - в 1,9 раза.

Таблица 2

Общее содержание и состав фракций разной полярности 17-ОКС у морских свинок с разной продолжительностью гексеналового сна

{Фракции 17-оксикортикостероидов Группы ¡(нмоль/сут.Ю^)

животных ;-.-1-1-1-р

Свобод}Пол ;Глюку-;Пол \Сульфа-;Пол

| • уГлгтгГп • * » • Ылпл тт • тт т • ТТлгГ?

I_ !

|ные ¡Непол|рон. } Неполны ¡Непол % \ | % | | %

Сумма !Пол фракций !Негтол 17-ОКС | %

\ ! !

НГС ' 5,38± 22,0 3,96* 64,0 2,2б± 61,0 П,60± 4,0

0,50 0,24 0,15 0,54

ДГС 3,50± 37,0 2,05- 150,0 3,33± 97,0 8,87± 75,0 ■

0,19 0,13 0|22 0131

и - Р/ 0,05; ** - Р/ 0,01; *** - Р/ 0,001

Следовательно у животных с ДГС, преобладание в микросомаль-ной фракции печени групп цитохромов Р-450Л сопряжено с повышенной экскрецией полярных форы 17-0КС. Отмеченное своеобразие метаболизма 17-ОКС, в определенной степени, обусловлено, вероятно, гибро-фобныы микроокружением цитохромов Р-150Л, ориентированных активными центрами в липиднуп фазу мембран эццоплазматического ретику-лума ( 1во1;о7 и. аЪ а1. ,1988). Аналогичная организация МОГС характеризуется высокой активностью в отношении гидрофобных стероидных гормонов и низкой скоростью метаболизма гексобарбитала ^Соппеу А. »1986)« Все вше сказанное позволяет расценивать сочетание повышенной чувствительностп к гексеналу (ДГС) с преобладанием полярных форм 17-ОКС как следствие особенности организации МОГС

печени у животных с высокой анафилактической чувствительностью.

Во второй серии экспериментов изучали изменение общего содержания и основных метаболитов 17-ОКС.у морских свинок.под влиянием БКМ20/80, Г20/80

и НМ20/80. У животных, получавших рацион с ЕКН

20/80, обнаружено снижение общего количества экскретируемых 17-ОКС, по сравнению с группой, содержавшейся на виварном рационе за счет уменьшения глюкокортикоидов в свободной фракции и во фракции глюкуронидов (в среднем на 35^) (табл.3).

Таблица 3

Влияние рационов, содержащих БКМ20/80, Г20/80 и НМ20/80 на состав фракции 17-ОКС разной полярности

Группы животных

Фракции 17-оксикортикостероидов '(нмоль/сут.Ю^)

Свободу Пол ¡Глюку-ные )Непол)рон.

¿Пол ,Сульфат-Пол |Непол|ты | Нет

I %

Сумма 'Пол ^^эакгдий! недол

! * ?

\

Рацион вивария 4,35± 0,51 15,0 2,56* 0,28 120,0 2,94* 0|37 96,0 9,85* 0) 07 52,0

Рацион с БКМ20/80 2,68* 0,28 к«» 2,3 1,35* 0^22 64,0*3,87* 0,50 К?? 252,0 6,97* 0^62 74,0

Рацион вивария 3,98£ 0|51 25,0 1,60* 0,20 214,0 3,05* 0,33 133,0 8,63* 0,65 73,0

Рацион с Г20/80 2,89* 0,27 к 41,0 2,84* 0,22 317,0 3,33* 0,45 к* 63,0 9,06* 0,69 90,0

Рацион вивария 2,50* 0,08 82,0 3,21* 0,18 291,0 3,80* 0,09 133,0 9,52* 0|20 156,0

Рацион с НМ20/80 3,97*? 0,10 к» 38,0 2,19* 0,08- 188,0 3,01* 0,22 368 Д) 9,17* 0,37 к 114,0

Относительное содержание полярных стероидов повышалось во фракции сульфатов в 2,6 раза, а в свободной фракции и во фракции глюкуронидов уменьшалось в 7 п 9 раз, соответственно. Влияние рациона с Г20/80 проявилось в увеличении суммарного количества 17-ОКС в 1,2 раза, за счет повышения доли глюкуронидов, так как со-

держание данных гормонов в свободной фракции уменьшилось на 30$. Относительное содержание полярных стероидов в общем количестве экскретируемых гормонов и в свободной фракции под влиянием Г20/80, возросло по сравнению с данным показателем в контрольной группе. При скармливании животным опытного района с НМ20/80 экскреция суммарного количества 17-0КС не изменилась. При этом содержание стероидов в свободной фракции возросло в 1,6 раза, во фракции глюкуронидов - уменьшилось на 32%, а во фракции сульфитов но изменилось. При расчете соотношения полярных форм стероидов к неполярным выявлено снижение величины данного показателя в суммарном количестве экскретируемых 17-ОКС на 35%. В то же время, в свободной фракции эта величина уменьшилась на 44$, во фракции глюкуронидов - на 103$, а во фракции сульфатов - возросла в 2,7 раза.

Таким образом, установлено, что рационы с БКМ20/80 и Г20/80 приводя™ к апроши) содержания стероидов в 'Свободной фракция п повыпониго относительного содержания полярных форм гормонов в сум-?гарном количестве п в свободной фракции окснрзтируемых 17-ОКС. Рацтон с ПМ20/80,напротив, повышал содержание глюкокортнкоидов в свободной фракции л приводил к достоверному уменьшению относительного содержания полярных фор:.! стероидов как в суммарном количестве, так п в свободной фракции. Аналогичный метаболический про-глль мсдретируияяс 17-ОКС отмечен у цивотиых с ПГС, характе-].;'з;г-г'Т"см попь'пзшгай устойчивостью к реапцчям ПА. Достозорпоо сттт«Г!р полпртхт форм 17-ОКС, обрязугзпхея прч гндрокеялпропа-....„ С-Г.'^о-Д!^ гсолскул П ггдго^сбпо ЛОГЛЛПЗОПШПЛОС аЯКЮПЦХ Ц31ГГ-г<?:т у -нгот!^, получпкятх рлцчоп с 12Л20/60, согласуется с гг-м пглобл?>дл!г?л у отпх особсП ц^тскгроиоа Р-45СВ (Изотоз 1.1.В., 1906). :

3.2. Влияние экспериментальных рационов с различным соотношением 1ШШК семейства со 6 и со 3 на интенсивность проявлений пищевой анафилаксии, состояние ыонооксигеназной системы печени и характер метаболизма 17юксикортико-стероидов

Исходя.из многочисленных данных литературы о влиянии ШЖК ка реакции гиперчувствитвльности немедленного и замедленного типа, в работе изучали влияние пищевых рационов, отличающихся соотношением ПНЖК семейств со 6 и и> 3, на системы, обеспечивающие резистентность организма к аллергиэирувдим воздействиям.

В опытных рационах № I, 2, 3, 4 50$ от общего количества «сира замещали исследуемыми жировыми композициями, в которых соотношение ПНЖК со б июЗ составило: 6,37; 24,20; 7,64 и 5,53, соответственно. При сенсибилизации животных ОВА жировая композиция , > 2, .с самым высоким соотношением и) б/и) 3 (рис.8), вызывала значительное ослабление тяжести ПА но всем показателям.'Наиболее высокие показатели интенсивности анафилактического шока зафиксированы при использовании жировой композиции №4.

80 . % летальность

60 хх2,3

40 к2

20 • I 2 3 4

80 60

40

20

% судороги

х2

нн1,2

Рис. 8. Влияние жировых композиций с разным соотношением ПНЖК "и5б/и> 3 на устойчивость животных к реакциям ПА. Жировые композиции с соотношением ПНЖК 6/ со 3 равным: I -6,37; 2-24,20; 3 - 7,62; 4 - 5,53

I

2

4

Изменение состояния системы цитохрома Р-450 печени под влиянием композиции № 2, по сравнению с влиянием жировой композиции * 4, характеризовалось увеличением процентного отношения цитохрома в§ к Р-450 на 2055, повышением активности V-деметилазы амино-пирина на 4455 и снижением активности р-гидроксилазы анилина. Кроме того у животных, получавших жировую композицию № 2, в микросо-мальной фракции печени выявлено увеличение отношения арахидоновой кислоты (20:4, из 6) к эйкозопентаеновой (20:5, со 3), по сравнению с данным соотношением при использовании жировых композиций № I; 3, 4 в 1,7; 2, 3 и 1,7 раза, соответственно.

Во второй серии экспериментов использованы составы жировых композиций № 2 и 4, но при этом замещалось не 5055 липидов, а весь жир опытных рационов. Данные рационы обозначены № 5 и б, соответственно. Под влиянием искусственного рациона с жировой композицией № 5 (ПНЖК со 6/со 3=24,20) отмечали достоверное снижение тяжести ПА к ЦПКМ, по сравнению с группой животных, получавших раиион № 6. Влияние жировой композиции № 5 на систему микросомальных мо-нооксигеназ (табл.4) проявилось путем увеличения процентного отношения цитохрома в§ к Р-450 на 42,8$ и повышением соотношения групп цитохрома Р-450В к Р-450Л в 3,5 раза, по сравнению с данными показателями в группе, получавшей рацион № б. Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют, что жировые композиции 9 2 и 5, составленные со значительным преобладанием ПНЖК ¿о б над 3 оказывают защитное действие в отношении реакций ПА-к модельному пищевому алЯергену ОВА и к ЦПКМ. Отмеченное явление сопро* вождается сходным характером влияния этих композиций на систему микросомальнах/темопротеидов, проявляющимся в увеличении относительного содержания цитохрома в^. Полученные результаты, по-види-

Таблица 4

Изменение содержания цитохрома Р-450 и в микросомальной фракции печени под влиянием искусственных рационов, содержавших жировые компоненты с различным соотношением ПНЖК семейств си 6 и со 3

Вид

рациона ¡живот-'нмоль

!Кол-во; Р-450 ! Р-4503

!ных !

! нмоль

!мг 0елка ! ыг белка I »

Р-450В ; Вс

1>-Л К) 11Г ' о

Т=ШЛ

лГ Г

!в5/Р~

!нмоль

!мг Оелка | %

} -450

I.Контрольный рацион

Гб

2.Ра^он 1б

3.Рацион та № б 1Ь

0,77*0,03 0,43*0,01 126,0 0,65*0,01 84,4

1,01*0,04 0,51*0,01 152,0 1,20*0,03

*1

к!

«9(1

ш2

«I

га«1

. *1 ?*ж1,2 . »2

ЗТЛ ПО АО г, т клтл пл

1,97*0,05 0,59*0,02 43,0 1,50*0,04 76,1

/в

к1- показатель достоверности различий Р I 0.05 - н

«и --Р Л0.01

ют - ? I 0,001

мому, отражают ускорение реакций монооксигеназного цикла, связанных, как известно, с транспортом электронов от НДЦФН-специфичес-кого флавопротеина к микросомальной десатуразе «лрных кислот или щтохрому Р-450 ( Сштапе зг.,1988). Активация ШГС печени у животных, получавших жировую композицию № 5, сочеталась с увеличением относительного содержания форы цитохроыа Р—150, ориентированных активными центрами в" водную фазу мембраны эвдоплазыатичес-кого ретикулуыа. Подобная организация ШГС свойственная животным устойчивым к реакциям ПА.

Следовательно, обнаруженные изменения организации и активации микросомальшх донооксигеназ, возникающие под влиянием Кировых композиций опытных рационов с высоким соотношением ПНЖК <-о 6/

cj 3, отражают существенные биохимические изменения в системе цитохрома Р-450, связанные с адаптацией животных к пищевой сенсибилизации.

В третьей серии экспериментов в качестве жирового компонента искусственных рационов применяли ихтиеновое масло, подсолнечное масло и смесь ихтиенового и подсолнечного масел в соотношении 1:1. Соотношение ПНЖК со б к со 3 в опытных районах, обозначаемых № 7, 8, 9, составляло 0,13; 64,0; 2,64, соответственно. Ихтиеновое масло отличается высоким содержанием ПНЖК со 3 за счет вйкозопентаеновой (20:5,со 3) и докозогексаеновой (22:6,"^3) кислот. Подсолнечное же масло характеризуется высоким содержанием ПНЖКtu 6, представленной линолевой кислотой (18:2, и> 6).

Рационы $ 8 и 9, содержащие подсолнечное масло, вызывали (pie.9) достоверное снижение проявлений тяжести ПА к ОВА, nó сравнению с действием рациона 1? 7. Под влиянием опытных рационов $ 8 и 9 иаблвдали значительное повышение относительного содержания групп цитохромов Р-450В, по сравнению с данным показателем у животных, потреблявших рацион I? 7, липидныЛ компонент которого был представлен пхтиеновым маслом. В этих яз группах наблодали увеличение соотношения содержания цитохрома в^ к Р-450 в 2,2 и 2,8 раза, соответственно, при сопоставлении с аналогичным показателем для особой, получаппих опытны!! рацион L" 7. Отмеченные изменения в организации МОГС'в группах i? 8 и 9 сопровождались укорочением продол-иитолыюсти гепсопалового сна,' что свидетельствует об ускорении ?тотабол!ю.м1 гоксоплла - субстрата 1-го типа гшкросональшп i:oho-оксигоназ.

У в сох яипотных, получавплх опытпыо ращоны с'тшровтш коц-позицппги 7, 8, 9 (табл.5), выявлена повгаощшл вдеароцип сук-

60 45

30

15

% летальность х*

- 22 -

60 . 45

30

15

~Т|

х*

судороги

х*7,8

2,0 1,5 1,0

0,5

к*7,8 1-

8

200 150

100

50-]

/о к7 100

50

7 8 9

Р-450

Р-450В/Р-450Л

**7,8

э^/Р-450

Рис. 9. Влияние жировых композиций с ихтиеновым, подсолнечным и смесью масел на устойчивость животных к реакциям ПА и состояние монооксигеназной системы К - виварный рацион, 7 - рацион с ихтиеновым маслом, 8 - рацион с подсолнечным маслом, 9 - рацион с ихтиеновым и подсолнечным маслами 1:1. * - Р± 0,05; к* - РI 0,01; к** - ?1 0,001

марного количества 17-0КС, по сравнению с консольной группой. Достоверное увеличение суммарного количества эктретируемых 17-0КС, под влиянием рациона, содержавшего ихтиеновое масло, происходило за счет повышения полярных форм стероидов в свободной фракции и во фракции глюкуронидов. Метаболический профиль экск-ретируемых 17-ОКС у животных, потреблявших опытные рационы с подсолнечным маслом и смесью подсолнечного и ихтиекового масел (18 и 9), отличался уменьшением относительного содержания поляр-ных гормонов в свободной фракции и значительным возрастанием (в 1,8 и 2,4 раза, соответственно) относительного содержания полярных форм сульфатов, посравнению с аналогичными показателями состава

фракций 17-ОКС, наблвдаемыми у животных под влиянием рациона * 7 с ихтиеновыы маслом.

Таблица 5

Влияние жировых компонентов рационов, содержавших ихтие-новое и подсолнечное масла на общее содержание и состав фракций 17-ОКС разной полярности у морских свинок

Липидный ! компонент I

Фракщи 17-оксикортико стероидов (нмоль/сут.10^)

раинона {Свобод}Пол ¡Глюку- ¿Пол {СульДа Пол ,ные ¿нецол^рон. ¿неполны

!

|Иепол^рон.

I % I

%

!

1.Вивар- 3,47± 36,0 1,16* 404 1,13* 20

иый рацион 0,10 0,08- 0,07

»«I 3,15-

2.Ихтиено~ 5,363 61 158 1,55* 82

вое масло 0,19 0,22- 0,10

3.Подсолнечное масло 4,540,20- 28 . 5:1- 176 2,34* 0,21 152

4.Ихтиен. Подсолн. масла 1:1 5,85= 0,20 13 к*2 1,435 0 06 257 ЯЯ1СО 1,035 0,05- 202

55

5,76± 0,19

кя*1 10,065 86 0,36

»1.2

8,261 68 0,33

8,32£ 0,22

40

и - достоверность различий по Т-критерию

• я - Р2 0,05; я» - 0,01; ш* - РI 0,001

Таким образом, гипосенсибилизирующей эффект рационов № 8 и 9 сопровождался изменением организации н функционирования микро-сомальныы ыойооксигеназ, приводящих к более интенсивному метабо-ллзму гексенала и гидроксилированию сульфоконьюгатов 17-ОКС. Соотношения мевду мнкросомальными гемопротеидами изменялись в сторону увел!гчетя отпосптолыюго содержания цитохромов в§ и группы цитохромов Р-450В. Данная закономерность наблодалась также при оценке действия жировых композиций В 5 и 2, оказывающих протек*-

тивный эффект в отношении реакций ПА. Следовательно, гипосенси-билизирущее действие липвдных композиций пищевых рационов не является случайным и, с учетом известного ицдуцирутодего действия ПНЖК на систему цитохрома Р-450, может быть реализовано за счет особенностей модулирующего влияния ПНЖК на систему микросомаль-ных монооксигеназ печени, приводящего к изменению метаболизма экскретируемых глюкокортикоидов.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют'о возможности путем направленного изменения белкового или жирового компонента рациона снижать проявления аллергической реактивности, тесно связанной с состоянием пиаеварительно-транспортного конвейера и системой микросомальных монооксигеназ печени. Полученные экспериментальные данные позволяют также сделать заключение о' том, что дополнение методов экспериментальной аллергологии биохимическими методами исследования дают возможность более широко и разносторонне оценивать качество специализированных продуктов питания или составляющих их компонентов с точки зрения влияния их на системы, ответственные за устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям внешней среды. Такой подход позволяет повысить эффективность диетической коррекции и профилактики пищевой аллергии.

ВЫВОДЫ

I. Охарактеризовано влияние белкового и липидного компонентов рационов на некоторые биохимические параметры систем, обеспечивающих резистентность организма лабораторных животных (морских свинок) к сенсибилизирупдему воздействию модельных пищевых алле!>-генов.

2.. Низкомолекулярная фракция гидролизата белков коровьего молока - НМ20/80 на ряду с низкой собственной сенсибилизирующей активностью уменьшает тяжесть проявлений анафилактической реакции к

модельному пищевому аллергену - ОВЛ.

3. Снижение тяжести реакций экспериментальной пищевой анафилаксии под влиянием рационов, содержащих 1Ы20/80, сопрововдается: увеличением общего содержания цитохрома Р-450, содержанием цито-хромов Р-450В и Bg в микросомальной фракции печени, повышением активности пищеварительных протеинаэ-трипсина и химотрипсина, снижением относительного содержания полярных форм экскретируемых 17-оксикортикостероидов в свободной фракции и в сумме фракций.

4. Повышение устойчивости животных к аллергизирующим воздействиям под влиянием рационов, жировой компонент которых характеризуется высоким соотношением полиненасыщенных жирных кислот семейства uj 6 и to 3, сочетается с изменением организации и функционировании монооксигеназной системы печени: в микросомальной фракции печени увеличивается отношение арахидоновой кислоты (20:4, со 6)

к эйкозопентаеновой (20:5, <о 3); повышается относительное содержание цитохрома Bg к Р-450 и цитохромов Р-450В. При этом снижается относительное содержание полярных форм 17-оксикортикостерои-дов в свободной фракции, во фракции глюкуронидов и в сумме фракций.

5. Установленные изменения в функционировании монооксигеназной системы печени и соответственно изменения в метаболизме 17-окси-кортикостероидов могут использоваться в качестве биохимических показателей при разработке и экспериментальной оценке специализированных продуктов, предназначенных для лиц, страдающих tmnje-вой аллергией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Компоненты гуморального гомеостаза, характеризующие анафилактическую резистентность при индукции системы цитохрома Р-450 // Тез.докл.У итоговой научной сессии. Часть З.Иркутск,1987,с.151/ Соавт.Марокко И.Н., Кржечковская В.В., Пятницкий H.H./

2. Взаимосвязь организации микросомальной монооксигеназной систе-m Ьсченп, метаболизма 17-опсикортпкостероидов и выраженность зкеперииснталыгых аллергических реакций немедленного типо//У Всзс. конференция "Цптохром Р-450 п модификация макромолекул" Ялта, 1989, с.339 /Соавт. Кзрокко П.П., Крточковская В.В./

3. Комплексная оценка потенциальной .-аллергенности некоторое образцов пзолятов соевых белков //Вопроси пят'анил 1989, с.22-27

/Соавт. Мазо B.K., Саменкова Н.Ф., Гмошинский И.В., Зорин С.Н., Кржечковская В.В., Марокко И.Н., Ушаков В.И./

4. Влияние пищевого рациона - ферментативного гвдролиэата белков молока, на метаболизм 17-оксикортикостероидов. Тез.докл.8-конф. молодых ученых биологов "Ркологические вопросы природо использования" Рига,1989, с.177

5. Сравнительная экспериментальная оценка потенциальной аллерген-ности некоторых молочных белков и их ферментативных гидролизатов, полученных различными технологическими способами.//Вопросы питания,1990, с.35-39 /Соавт. Кржечковская В.В., Мазо В.К., Марокко И.Н./

6. Перспективы создания новых гипоаллергенных продуктов //Тез. конф. "Питание: здоровье и болезнь" 1990, с.129 /Соавт. Мазо В.К. Ширина Л.И./

7. Некоторые проявления аллергической реактивности у морских свинок при скармливании им белковых препаратов, полученных различными технологическими способами /Тез.докл.ХУ Всес.конф. "Физиология пищеварения и всасывания", Краснодар,1990, с.174 /Соавт. Кржечковская В.В./

8. Влияние перорального введения ферментативных гидролизатов белков молока морским свинкам на некоторые показатели систем,' обео-печиващих резистентность к аллергизирукщим воздействиям //Тез. докл.ХУ Всес.конф. "Физиология пищеварения и всасывания",Красно- . дар,1990, с.173'/Соавт. Мазо В.К., Саменкова Н.Ф., Кржечковская В.В./

9. Влияние рационов, содержащих белок коровьего молока или его ферментативный гидролизат на метаболизм 17-оксикортикостероидов и функциональное состояние желудочно-кишечного тракта у морских свинок'//Вопросы питания 1991, IM, с.37-39 /Соавт. Марокко И.Н., Саменкова H.S., Гмошинский И.В., Мазо В.К./

10. Взаимосвязь тяжести проявлений экспериментальной пищевой анафилаксии и соотношения цитохромов Р-450В и Р-450Л //бюллетень экспериментальной биологии и медицины $ 8, 1991, с.200-202 /Соавв. Марокко И.Н., Кржечковская В.В., Бенедиктова С.А., Изотов М.В., Спиридонова С.М./