Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм цинка

Мунхуу Баяржаргал

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм цинка
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм цинка"

На правах ру^тт! 003054282

МУНХУУ БАЯРЖАРГАЛ

ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ ПИЩЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ ЦИНКА

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003054282

Работа выполнена в лаборатории фишологпи м биохимии пищеварения ГУ Научно-исследовакльского Института питания Российской Академии медицинских наук (руководитель лаборатории - доктор биологических наук, профессор В.К.Мяю) н Московском Государственном университете прикладной биотехнологии

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Розанцев Эдуард Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович

доктор медицинских наук, профессор Голубев Михаил Аркадьевич

Ведущая оргашпания: Институт биохимической физики Российской Академии наук

им. Н.М.Эммануэля

Защита состоится « Совета Д 001.002.01.

109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14

адресу:

на заседании Диссертационного

С диссертшей можно ознакомился в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН

Автореферат разослан ч/и

2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета: доктор биологических наук, профессор

В.М.Коденцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма, как макро-, так и микронутриентами, в том числе и эссенциальными микроэлементами, в частности цинком. Биохимические механизмы действия цинка связаны с участием в построении и функционировании более 200 ферментов, катализирующих различные метаболические процессы, включающие синтез и распад углеводов, жиров, белков и нуклеиновых кислот. Неоптимальная обеспеченность организма данным микроэлементом приводит к задержке роста, развития, полового созревания; снижению иммунитета, репродуктивной функции; нарушениям кроветворения, вкуса и обоняния, ухудшению репарации ран и другим нарушениям.

На основании исследований, проведенных ФАО, установлено, что около 20% населения мира имеют риск неадекватной обеспеченности цинком [Wuehler S.F.. Peerson J.M, Brown К H, 2005] Согласно данным эпидемиологических исследований, проведенным в ряде регионов Российской Федерации, имеет место высокая частота встречаемости недостаточной обеспеченности цинком, особенно у детского населения [Скальный A.B., 1999; Конь И.Я , Копытько М В., Алешко-Ожевский 10,П., 2001]. В связи с этим весьма актуальной является задача профилактики и диетической коррекции недостаточной обеспеченности этим эссенциальным для организма человека микроэлементом путем использования в питании дополнительных источников цинка в составе специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище.

Обогащение пищевых продуктов микронутриентами является серьезным вмешательством в сложившуюся структуру питания человека, и, следовательно, к дополнительным источникам эссенциальных микроэлементов должны предъявляться повышенные требования, обеспечивающие как их полную безопасность, так и достаточную эффективность.

Учитывая, что в повседневной жизни человек потребляет эссенциальные микроэлементы, в том числе цинк, в составе растительных и животных продуктов и, чго наличие аминокислот и пептидов, а также белка животного происхождения способствую! лучшему усвоению организмом этого микроэлемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами цинка. Одним из возможных вариантов решения проблемы поиска новых источников органических форм эссенциальных катионных микроэлементов является комплексирование их с пептидными структурами, образующимися в результате ферментативного гидролиза пищевых белков

Целыо данной работы явились получение новых пищевых источников органических форм цинка, их комплексная физико-химическая, физиолого-биохимическая характеристика и экспериментальная оценка возможности использования этих пищевых источников для профилактики и диетической коррекции недостаточности данного микроэлемента.

Основные задачи исследования

1. Оптимизировать условия ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) для дальнейшего использования ферментолизатов при получении новых пищевых источников цинка.

2. Получить комплексы ферментативных гидролизатов вышеперечисленных пищевых белков с цинком, охарактеризовать молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе комплексов и определить в них содержание цинка.

3 В исследовании in vitro оценить антигенные свойства ферментативных гидролизатов пищевых белков и их комплексов с цинком.

4. Количественно охарактеризовать протекание реакции системной анафилаксии к модельному антигену - овальбумину у крыс, получавших с кормом комплексы цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

5. Охарактериювать всасывание и ретенцию цинка в форме комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока у лабораторных животных (крыс) в условиях недостаточного потребления этого микроэлемента

6. Дать сравнительную оценку эффективности потребления лабораторными животными (крысами), предварительно получавшими цинкдефицитный корм, органической формы цинка - комплекса ферментативного гидролизата белков коровьего молока с этим микроэлементом и сульфата цинка.

Научная новизна

Определены оптимальные условия ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) для и\ последующего комплексирования с цинком в целях получения новых пищевых источников этого микроэлемента.

Охарактеризовано молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе комплексов ферментативных гидролизатов пищевых белков с цинком и определено фракционное содержание этого микроэлемента

В опьпах in vitro установлено практически полное отсутствие в составе комплексов ферметашвных гидролизатов пищевых белков с цинком антигенных детерминант, 2

взаимодействующих с антителами к пищевым белкам в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью

В опытах ¡n vivo установлено, что длительный пероральный прием комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков не влияет па тяжесть проявлений реакций системной анафилаксии у лабораторных животных (крыс), многократно сенсибилизированных модельным антигеном (анафилактогеном) -овальбумином.

Количественно охарактеризованы всасывание и ретенция органического соединения цинка - его комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока у лабораторных животных (крыс) в условиях недостаточного потребления ими этого микроэлемента.

Дана сравнительная оценка эффективности использования нового пищевого источника органической формы цинка (его комплекса с ферментативным гидролизагом белков коровьего молока) и сульфата цинка в «восстановительном» питании крыс, предварительно получавших в течение 14 дней цинкдефицитный полу синтетический корм

Практическая значимость

Предложенные для лабораторных условий схемы проведения процессов ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровье! о молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) могу г быть использованы для разработки схем промышленного получения пищевых ферментативных гидролизатов перечисленных белков. Полученные таким способом ферментативные гидролиза™ при комплексировании с цинком представляют собой новые пищевые источники органических форм этого микронутриента.

Высокое содержание в составе полученных комплексов цинка и отсутствие сенсибилизирующих и аплергизирующих свойств свидетельствуют о возможных перспективах их использования в целях алиментарной профилактики случаев недостаточной обеспеченности этими микронутриентами детского и взрослого населения. На примере органического соединения цинка - его комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока предложен и апробирован метод оценки всасывания и ретенции микроэлемента в опытах на лабораторных животных (крысах). Метод может найти свое применение для характеристики биодосгупности различных пищевых источников микро- и макроэлементов.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на Х111 международно» конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2005 г., на 7-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро 2005», на XI Российской гастроэнтерологической неделе, Москва, 2005г.; на VIII Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации», Москва, 2005г; на 1 Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты», Москва, 2006

Публикации

По результатам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах и 5 публикаций в сборниках научных трудов

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов' введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, заключение и выводы Указатель литературы содержит 33 российских и 108 зарубежных источников Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 9 рисунков

Материалы и методы исследования

В pa6oie использовали коммерческие пищевые белки, концентрат белков коровьего молока (ЗАО «Компания Нутритек», Россия), белок куриного яйца (выделен из свежих куриных яиц), изолят соевых белков («РТ1», Китай), хлорид цинка ZnCl2 (х ч.), сульфат цинка ZnS04'7Hj0 (ч д а.). Ферментативный гидролиз указанных белков проводили с использованием коммерческих ферментных препаратов «Флавоэнзим» ("Flavourzyme'', Novo/jmes, Дания) и «Панкреатин» (Санкт-Петербургский мясокомбинат «Самсон», Россия) по одно- или двухстадийной схеме с варьированием фермент-субстратного соотношения. времени гидролиза, изменения рН реакционной среды и последовательности применения ферментных пренараюв.

Экспериментальные исследования выполнялись в ГУ НИИ питания РАМН в лаборатории физиологии и биохимии пищеварения (руководитель лаборатории -профессор В.К. Мазо)

Полученные ферментативные гидролизаты подвергали ультрафильтрации на установке «Минитан» («Millipore», США) с использованием работающих в

тангенциальном потоке мембран (диаметр пор 10 кД). Для получения комплексов с цинком использовали низкомолекулярные фракции (молекулярная масса < 10 кД) ферментативных гидролизатов пищевых белков (ФГПБ)' белков коровьего молока, белка куриных яиц, изолята соевых белков, обозначаемых в дальнейшем, соответственно, как ФГБКМ, ФГБКЯ, ФГИСБ.

Для получения комплексов цинка с ФГБКМ, ФГБКЯ, ФГИСЬ была использована схема, направленная на удаление из конечного продукта свободных ионов цинка и выделение собственно связанных с пептидными фракциями ионов этого микроэлемента (см. раздел «Результаты исследований и их обсуждение»). Полученные растворы лиофильно высушивали и затем определяли в них содержание цинка атомно-абсорбционным или инверсионно-вольтамперометрическим методом

Молекулярно-массовое распределение пептидов в составе ФГБКЯ и комплексах Zn-ФГБКЯ оценивали методом эксклюзионной хроматографии среднего давления на колонке TSK GEL 2000 SWLX (0,8x30 см) фирмы «Toyo Soda» (Япония); для ФГБКМ и ФГИСБ, а также комплексов Zn-ФГБКМ и Zn-ФГИСБ применялась колонка Superóse 12 (1,6x50 см), («Pharmacia», Швеция) Оптическую плотность элюируемого раствора регистрировали, используя проточный ультрафиолетовый детектор с длиной волны 280 нм. В качестве элюента использовали буферный раствор (рН 6,8) 0,05 М KHjPOj, содержащий 0,15 М NaCI и №N3 или раствор (рН 6,5), содержащий 0,2 М NaCI и №N3. Скорость элюирования составляла 0,2 мл/мин.

Количественное содержание пептидных фракций в анализируемых ФГПБ и комплексах Zn-ФГПБ оценивали интегрированием полученных хроматограмм весовым методом в диапазоне от свободного до полного объема хроматографической колонки. Для определения содержания цинка в отдельных фракциях проводили отбор фракций обьемом 10 мл, содержание цинка определяли инверсионно-вольтамперометрическим методом.

Хроматографические аналитические исследования получаемых препаратов проведены совместно со старшим научным сотрудником ГУ НИИ питания РАМН, кандидатом биологических наук С.Н.Зориным.

При проведении исследований in vitro по оценке антигенных свойств ФГПБ и комплексов Zn-ФГПБ использовали сыворотки крови* детей, страдающих различными формами пищевой непереносимости и демонстрирующих в большом числе случаев высокие титры циркулирующих IgG антител к различным пищевым белкам. В сыворотке крови определяли титры циркулирующих специфических IgG антител против ФГПБ и

' Сыворотки крови, полученные в ходе предписанного врачом рутинного лабораторного обследования, предоставлены КДЦ «Детское питание» при ЗАО «Компания Нутритек», г Москва (зав д м н Л Г Мамонова)

микроэлементных премиксов, содержащих в своем составе комплексы Zn-ФГПБ, методом непрямого твердофазного иммуиофермеитного анализа. Соотношение ЭМ (Zn, Cu, Mn. Cr) в составе каждого премикса соответствовало соотношениям при адекватном уровне потребления человеком всех четырех ЭМ. Компоненты премиксов представляли собой комплексы ЭМ с пептидной фракцией ферментативных гидролизатов пищевых белков (ФГПБ). очищенные методом мембранной нанофильтрации

Все иммуноноферментные определения в диссертационной работе проведены совместно с ведущим научным сотрудником ГУ НИИ питания РАМН, доктором биологических наук И.В. Гмошинским

Для оценки аллергизирующих свойств новых источников цинка в опытах in vivo использовали модель системной анафилаксии согласно [Stokes C.R. et al, 1987] с незначительными модификациями Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар. Оценивали влияние рациона, дополненного микроэлементными премиксами, содержащими комплексы Zn-ФГПБ, на тяжесть анафилактического шока и уровень циркулирующих специфических антител к овальбумину у крыс, сенсибилизированных этим белком Животные опытных групп получали с кормом в течение 29 дней дозы микрозлементных премиксов, соответствовавших 0,075 мг цинка на одну крысу в сутки. Величину анафилактического индекса рассчитывали согласно [Weigle W., I960] как среднее арифметическое балльных оценок тяжести анафилаксии по группе по данным наблюдения через 24 часа после введения разрешающей дозы. Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивали по концентрации циркулирующих специфических IgG антител (суммы фракций IgG] и IgGj) с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (ELISA) на полистироле При этом были использованы кроличьи антитела к IgG¡ крысы, конъюгированные с пероксидазой (НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН)

Для оценки биодоступпосги цинка из комплекса Zn-ФГБКМ у лабораторных животных (крысы линии Вистар) исполыовали показатели по аналогии с применяемыми в балансовых исследованиях коэффициентами усвояемости белка [Высоцкий В Г и др, 1976] 1-Г l-U-F I-U-F

DSJp%=........................RS.,,,% =......................ERS.,,,% = ..................

I I I-F

Коэффициент кажущегося Коэффициент кажущейся Коэффициент кажущейся эффективной

всасывания ретенции ретенции

где I - введенная доза цинка, F - величина суточной экскреции цинка с фекалиями после введения препарата цинка, U -величина суточной экскреции цинка с мочой после введения препарата цинка

Величину всасывания и ретенции цинка из гп-ФГБКМ, характеризующих биодоступность, рассчитывали на основании определения цинка, экскретируемого 6

животными с калом и мочой в течение суток после введенной внутрижелудочно через зонд дозы 270 мкг цинка на крысу Животные предварительно до этого в течение 11 дней потребляли полусинтетический корм с пониженным содержанием цинка (1,3 мг/кг)

Для сравнительной оценки эффективности использования Zn-ФГБКМ и сульфата цинка в «восстановительном» кормлении лабораторных животных (крыс) моделировали у них недостаточное потребление цинка с использованием полусинтетического корма, рекомендованного НИИ питания (приказ МЗ СССР, №1179 от 10 10 83), в котором белковый компонент (казеин) был заменен на эквивалентное по азоту количество концентрата сывороточных белков' молока, и исключением из рецептуры солевой смеси соли цинка Содержание цинка в базовом полусинтетическом корме составляло 1,3 мг/кг В эксперименте использовали крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 140-150 г Животные группы №1 и №2 в течение 28 дней потребляли, соответственно, базовый полусинтетический корм, дополненный 12 мг/кг цинка в форме Zn-ФГБКМ, и бе! его дополнения, животные группы №3 и №4 в течение 14 дней получали корм с пониженным содержанием цинка, а затем в течение 14 дней базовый полусинтетический корм дополняли Zn-ФГБКМ и ZnS047H20 соответственно в расчете 12 мг цинка/кг корма На 29-й день животных забивали, собирали кровь для определения активности щелочной фосфатазы, определяли массу внутренних органов (тимуса, печени, почек, селезенки, семенников), отбирали правую бедренную кость (os femoris) для определения содержания цинка Общую активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови определяли с помощью аналитического набора («Ольвекс», Россия)

Содержание цинка в комплексах и биологических образцах (моча, фекалии, кости) определяли с использованием метода атомно-абсорбционной спектрометрии совместно с научными сотрудниками лаборатории химии пищевых продуктов ГУ НИИ питания РАМН кандидатом биологических наук J1В Шевяковой и Н Н Маховой, а также методом инверсионной вольтамперометрии

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов программ MS EXCEL ХР и SPSS 11 5 для Windows Математическая обработка данных эксперимента включала расчет средних значений со стандартными ошибками, представленными как М±т Достоверность различий значений средних уровней исследуемых показателей определяли с использованием двухстороннего t-теста Стыодента Дополнительно проверяли гипотезу о различии распределений рассматриваемых подателей с помощью непараметрического рангового критерия Манна-Уитни Различия признавались за достоверные на уровне значимости Р<0,05

* Автор благодарит к т н В И Круглика, предоставившего для исследования концентрат сывороточных белков молока

Результаты исследований и их обсуждение 1. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков.

Традиционно используемые в питании белки коровьего молока, куриного яйца и изолят соевых белков были выбраны для проведения ферментативного гидролиза с целью дальнейшего использования ферментолизатов для комплектования с цинком. Проведение ферментативного гидролиза, являясь щадящим процессом по сравнению с кислотным гидролизом, позволяет перевести белковый материал в хорошо растворимые пептидно-аминокислотные смеси, что увеличивает возможности связывания микроэлемента с органическим лигандом. С целью получения гидролизата с максимальным содержанием низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать комплексы с цинком, были отработаны оптимальные условия для проведения гидролиза вышеуказанных пищевых белков.

При получении гидролизатов белков коровьего молока (БКМ) применяли схему одностадийного гидролиза при значении рН 7,5 и температуре 50°С с использованием ферментного препарата «Панкреатина» В табл I приведено изменение молекулярно-массового распределения пептидпых фракций в составе ферментолизатов в ходе гидролиза БКМ «Панкреатином» в зависимости от времени гидролиза и фермент-субстратного соотношения

Таблица 1

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе _ гидролизатов белков коровьего молока_

№ Время гидролиза, Диапазон молекулярных масс. кД Концентрация фермента (% от массы белка)

мин 1.5% 3.0% 6,0% 9,0%

1 120 более 138 5,5 1,6 1,3 0.2

138- 10,5 17,6 10,8 5,1 5,6

10,5-5,1 17,9 19,9 16,2 19,9

5,1 -2.8 18,9 18,7 18,7 17,9

2.8- 1,0 21,5 23,9 28,6 25,8

менее 1,0 18,6 25,1 30,1 30,6

2 240 более 138 1,8 2,6 2,0 0

138-10,5 13,3 7,7 4,2 4,4

10,5-5,1 20,0 19,3 16,3 19,2

5,1 -2.8 17,3 18,1 17,4 19,1

2,8- 1,0 23,9 25,3 28,0 23,3

менее 1,0 23,7 27,0 32,1 34,0

Примечание: исследование проведено с использованием колонки "Superóse 12" (1,6x50 см)

Из приведенных результатов видно, при концентрациях фермента 3, 6 и 9% уже через 2 часа практически достигается максимальное содержание низкомолекулярных структур. Увеличения времени гидролиза более 4 часов и фермент-субстратного соотношения (до 6% и 9% фермента) не приводит к заметному изменению степени гидролиза.

В отличие от ферментолиза белков коровьего молока, при получении ФГБКЯ использовали двухстадийную схему проведения гидролиза с предварительной термической денатурацией, направленной на снижение содержания ингибитора трипсина и увеличения доступности белка для протеолиза.

Таблица 2

Изменение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в ходе _двухстадийного гидролиза белков куриного яйца_

га со Содержание фракций (%)

га СО го О в диапазоне молекулярных масс, кД

Ч 0 о. 4 U 5 1 S- О о п. § =- U те 5 о О. ш БКЯ 11 О г> СХ S = о i— са х Щ >112,2 112,226.9 26,911.2 11,25,0 5,02,1 2,10.8 <0,8

5,5 3,8 48,0 18,0 8,7 6,7 6,6 8,2

нативный 6,5 10,1 42,9 17,5 7,8 9,0 5,1 7,6

3 7,5 4,7 50,5 17,8 8,1 8,5 2,7 7,7

о 2 денатурированный 5,5 6,5 0 0 0,2 1,8 1,2 3,0 8,4 8,3 24,4 19,8 28,0 23,0 37,9 44,1

го 5,5 7,5 43,8 12,3 6,7 9,4 7,3 13,0

О и нативный 6,5 8,5 48,5 15,7 6,4 9,3 3,7 7,9

п d 6 7,5 9,0 48,2 12,6 6,4 8,7 3,0 12,1

ч ГО денатурированный 5,5 6,5 0 1,2 2,6 9,3 22,1 21,9 42,9

О 5,5 3,8 22,8 6,4 8,3 21,2 12,1 25,4

g нативный 6,5 1,8 37,4 12,2 6,2 14,5 6,9 21,0

U 22 7,5 12,5 37,0 19,7 8,1 8,3 1,7 12,7

денатурированный 5,5 6,5 0 0 0 0 0,2 0,5 4,9 4,2 27,9 19,4 21,7 19,5 45.3 56.4

5,5 3,3 16,4 4,1 5,2 24,6 14,9 31,5

нативный 6,5 2,6 34,3 8,9 4,8 18,1 7,4 23,9

s 3 7,5 5,5 44,5 9,3 7,1 12,0 3,6 18,0

со ^ о X Р та денатурированный 5,5 6,5 0 0 0 0 0,3 0,6 4.4 5.5 30,4 24,9 19,3 16,2 44,5 53,9

а- Ш CL 5,5 4,1 13.6 2,9 5,9 28.2 14.5 30.8

U нативный 6,5 5,4 25,8 6,2 5,8 23,2 11,6 22,0

С 5 7,5 11,1 36,1 8,9 5,9 12,9 5,0 20,1

денатурированный 5,5 6,5 0 0 0 0 0,3 0 5,5 5,1 30,4 29,4 19,2 13,6 44,6 51,9

Примечание: исследование проведено с использованием колонки ТSK GEL 2000 SWLX (0,8x30 см)

Нами была проведема предварительная тепловая денатурация 3,3% водного раствора БКЯ при значениях рН 9,6 (рН раствора нативного БКЯ) и рН 7,6; температуре 80 и 90 °С в течение 15 и 30 минут. В образцах определяли содержание ингибитора трипсина в условных единицах, эквивалентных содержанию ИТБС. При проведении тепловой обработки при рН 9,6 в течение 30 мин отмечено наименьшее содержание ингибитора трипсина при 80 °С и 90 °С. Тепловая обработка при рН 7,6 в течение того же времени оказалась менее эффективной, так как достигнуто снижение содержания ингибитора трипсина в 5,9 раза против 26 при рН 9,6.

В дальнейших экспериментах были изучены схемы ферментативного гидролиза БКЯ как со стадией предварительной термической денатурации, так и без нее, исследована зависимость эффективности гидролиза от рП и времени проведения жсперименга В табл. 2 приведены ре!ультаты оценки молекулярно-массового распределения пептидных фракций в составе ФГБКЯ, полученных в ходе гидролиза нативного и денатурированного субстрата, с использованием на первой стадии «Флавоэнзима» при значениях рН 5,5; 6,5 и 7,5, а на второй - «Панкреатина» при рН 7,5.

Оптимальным оказалось проведение первой стадии гидролиза БКЯ при значении рН 6,5 «Флавоэнзимом» при концентрации 5% от массы белка в течение 22 часов термически денатурированного субстрата (при 80'С в течение 30 мин в водном растворе с рН 9,6). Вторая стадия гидролиза при рН 7,5 «Панкреатином» при концентрации 3% от массы белка в течение 5 часов позволяет увеличить выход гидролизата В полученном продукте доля пептидов с молекулярной массой менее 2,1 кД составила более 60%

В целях оптимизации процесса гидролиза изолята соевых белков (ИСБ) было апробировано несколько вариантов одно- и двухстадийного гидролиза В табл 3 приведен перечень использованных ферментных систем, фермент-субстратные соотношения и изменение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в составе конечных продуктов ФГИСБ.

И} данных, представленных в таблице, видно, что при проведении гидролиза в одну стадию использование «Флавоэнзима» существенно эффективнее по сравнению с «Панкреатином» Так, при одной и той же концентрации фермента (3% от массы белка) пизкомолекулярных продуктов реакции (молекулярная масса менее 1,4 кД) образуется в 2 раза больше, чем при гидролизе «Панкреатином».

Таблица 3

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе конечных продуктов _ферментативного гидролиза изолята соевых белков_

Концентрация фермента, % от массы белка Диапазон молекулярных масс, кД

Фермент >70,8 70,828,2 28,211.0 11,04,0 4.01,4 <1,4

Содержание фракций при одностадийном гидролизе, %

«Флавоэнзим» 3,0 5,0 0,4 2,5 1,9 2,0 5,6 4,6 28,2 22,8 41,4 44,0 22,5 24,1

«Панкреатин» 1,5 3,0 6,0 9,5 4,9 0,4 5,8 5,3 1,8 13,9 11,4 9,1 41,8 41,7 41,0 21,5 26,9 32,2 7,5 9,8 15,5

Содержание фракций при двухстадиГшом гидролизе, %

«Флавоэнзим» «Панкреатин» 5,0 3,0 0 0 2,0 24,6 43,6 29,8

«Панкреатин» «Флавоэнзим» 3,0 5,0 0 0,6 4,0 27,1 42,8 25,5

Примечание: исследование проведено с использованием колонки Superóse 12 (1,6*50 см)

Двухстадийный ферментативный гидролиз приводит к полной элиминации белковых структур с молекулярными массами более 28 кД. Соответственно, существенно возрастает содержание в конечном продукте низкомолекулярных пептидов. В итоговых гидролизатах ИСБ, полученных по двухстадийной схеме, доля фракции с молекулярной массой менее 4 кД составила около 70% Однако, вариант двухстадийного гидролиза с последовательным добавлением к ИСБ «Флавоэнзима», а затем «Панкреатина» оказался более эффективным: в этом случае выход конечного продукта составил более 80% 01 массы исходного белка, в то время как во втором варианте выход белка составил только 65% Общая схема получения ферментативных гидролизатов пищевых белков и комплексов цинка на их основе представлена на рис. 1.

2. Физико-химическая характеристика комплексов цинка с ферментативными гпдролизатами пищевых белков.

Для получения комплекса цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков (БКМ, БКЯ и ИСБ) была предложена схема, включавшая стадии ультрафильтрации гидролизата, инкубации фракции фильтрата с молекулярной массой менее 10 кД с 10%-ным раствором ХпС\г (х ч.) в соотношении 10 1 по массе и последующую нанофильтрацшо, направленную на удаление из конечного продукта несвязанных с

пептидами ионов цинка Полученные по данной схеме комплексы 2п-ФГПБ характеризовались высоким содержанием микроэлемента и хорошей растворимостью в

воде

Предлагаемая схема получения ФГПБ и комплексов гп-ФГПБ представлена на рис. 1.

Ультрафильтрация в тангенциальном потоке (мембрана 10 кД)

Ультрафнльтрат

Водный раствор гпС12

рН 7,1

Нанофильтрация I = 20°С

Лиофильиая сушка

Комплекс цинка с ферментативным гндролнзатом пищевого белка

Рис 1. Схема получения ферментативных гидролизатов пищевых белков и комплексов цинка на их основе

В табл. 4 представлены данные по содержанию Zn в полученных комплексах 2п-ФГПБ в пересчете на количество рекомендуемых суточных доз потребления Zn (согласно «Рекомендуемым уровням потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации МР 2.3.1.1915-04.-М.-2004.-С.20-21), удовлетворяемых 1 г каждого из полученных комплексов.

Таблица 4

Содержание цинка в комплексах цинка с ферментативными _гидролизатами пищевых белков ^п-ФГПБ)_

Комплексы Содержание Zn мг/г Количество суточных

продукта доз Zn/r продукта

Zn-ФГБКМ 72,2±7,0 6.0

Zn-ФГБКЯ 89,6±8,6 7.5

Zn-ФГИСБ 68,9±6.1 5,7

Как видно из представленных данных, концентрация цинка в составе комплексов в определенной степени зависит от вида используемого гидролизата. Так, цинк в наиболее концентрированном виде присутствует в составе комплексов с ФГБКЯ.

В табл. 5 и б сопоставлены молекулярно-массовые распределения пептидных фракций в составе исходных ФГБКМ, ФГБКЯ и ФГИСБ и комплексов цинка на их основе.

Таблица 5

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в комплексах Zn-ФГБКМ, Zn-ФГИСБ и исходных гидролизатах (ФГБКМ, ФГИСБ)

Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракций, %

ФГБКМ Zn-ФГБКМ ФГИСБ Zn-ФГИСБ

28,2-11,0 1,1 0,7 1,3 0

11,0-4,0 21,9 14,7 33,7 34,4

4,0-1,4 27,9 36,5 51,7 52,8

<1,4 49,1 48,1 13,3 12,8

Примечание: данные получены с использованием хроматографической колонки Superóse 12 (1,6*50 см)

Таблица 6

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в комплексе Zn-ФГБКЯ и исходном гидролизате (ФГБКЯ)

Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракций, %

ФГБКЯ Zn-ФГБКЯ

26,9-11,2 1,0 1,1

11.2-5,0 5,4 8,7

5,0-2,1 19,7 22,7

2,1-0,8 18,6 20,3

<0,8 55,3 47,2

Примечание: данные получены с использованием хроматографической колонки TSK GEL 2000 SWLX (0,8x30 см)

Из представленных в таблицах результатов видно, что комплексообразование ионов цинка с пептидами ФГПБ приводит к некоторым изменениям в молекулярно-массовом распределении пептидных фракций Взаимодействие Zn с ФГБКМ приводит к заметному снижению содержания фракции с молекулярной массой >4,0 кД и возрастанию фракции 1,4-4,0 кД по сравнению с ФГБКМ. При сравнении молекулярно-массового распределения пептидных фракций ФГИСБ и комплекса с цинком на его основе изменения происходят в незначительной степени. Для комплекса Zn-ФГБКЯ отмечается снижение содержания фракции с молекулярной массой <0,8 кД. Причиной изменений молекулярно-массового распределения могут быть, по-видимому, как преципитация (выпадение в осадок) части фракции относительно крупных пептидов при взаимодействии с ионами металла, так и возникновение «мостиков» или «сшивок» между молекулами коротких пептидов, координирующих центральный атом цинка.

Для характеристики связывания цинка с пептидными структурами ФГПБ было проведено хроматографическое исследование комплексов Zn-ФГПБ на колонке «Superóse 12». На рис. 2, 3 и 4 представлено распределение цинка по фракциям в составе комплекса с ФГИСБ, ФГБКЯ и ФГБКМ Из представленных данных видно, что преобладающей формой цинка в составе полученных продуктов являются его комплексы с относительно короткими пептидами. Количество ЭМ, включенного во фракцию свободных аминокислот и не связанных с белком ионов (выходящую в районе Vn01H колонки) относительно мало. Более 60% и 20% цинка, определяемого в составе комплекса, обнаруживалось в пептидных фракциях с молекулярной массой 0,5-1,4 кД и 1,4-4,5 кД соответственно.

№0

-1-П-1—I—I—---1—г-

vee 15679 4 282 11 2 45 14 05

Рис 2 Содержание цинка в хроматографических фракциях комплекса цинка с ферментативным гидролизатом изолята соевых белков

Рис 3 Содержание цинка в хроматографических фракциях комплекса цинка с ферментативным гидролизатом белка куриного яйца

Рис 4 Содержание цинка в хроматографическич фракциях комплекса цинка с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие ФГПБ с катионным микроэлементом цинком сопряжено со связыванием цинка с относительно короткими пептидами в диапазоне молекулярных масс менее 1,4 кД.

3. Оценка in vitro антигенных свойств комплексов цннка с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

В работе проведено исследование по выявлению антител к комплексам Zn-ФГПБ в сыворотках крови детей, страдающих различными формами пищевой непереносимости и демонстрирующих в большом числе случаев высокие титры циркулирующих lgG антител к различным пищевым белкам. У значительного числа больных отмечалась поливалентная сенсибилизация с высокими титрами антител к трем и более пищевым продуктам.

В ранее проведенном исследовании лаборатории физиологии и биохимии пищеварения ГУ НИИ питания РАМН по оценке антигенных и потенциально аллергенных свойств комплекса ферментативного гидролизата сывороточных белков молока с цинком (Zn-ФГСБМ) было показано, что частота выявления антител к данному органическому источнику цинка чрезвычайно низка [Мазо В.К., Зорин С.Н., Гмошинский И.В., 2004]. Поэтому при исследовании комплекса Zn-ФГПБ проводили определение IgG антител в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью преимущественно аллергической природы, к микроэлементному премиксу, содержащему дополнительно Си, Мп и Сг в форме комплексов, с соответствующими ФГПЬ. Соотношение ЭМ в составе премикса примерно соответствовало соотношениям при адекватном уровне потребления человеком всех четырех ЭМ.

В табл. 7, 8 и 9 представлены результаты исследований по оценке антигенных свойств трех микроэлементных премиксов, содержащих в своем составе комплексы Zn-

ФГБКМ, 2п-ФГБКЯ и 2п-ФГБКМ. В таблицах приведены также результаты определения титров антител к БКМ и ФГБКМ; БКЯ и ФГБКЯ; ИСБ и ФГИСБ.

Таблица 7

Титр антител к премиксу, содержащему 2п-ФГБКМ, в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью_

Показатели Антигены

БКМ ФГБКМ Премикс, содержащий Zn-ФГБКМ

Число больных 104 104 104

Антитела в титре >1:100, N(%) 97 (93%) I (1%) 0

Антитела в титре >1.1500, N (%) 34 (32%) 0 0

Средний титр М±ш, диапазон изменений 1200±120 (0-8300) 2±1 (0-130) 0±0

Таблица 8

Титр антител к премиксу, содержащему 7п-ФГБКЯ, в сыворотках крови детей.

страдающих пищевой непереносимостью

Показатели Антигены

ОВА ФГБКЯ Премикс, содержащий Zn-ФГБКЯ

Число больных 85 85 85

Антитела в титре >1.100, N (%) 52 (61%) 1 (1,2%) 0

Антитела в титре >1:1800, N (%) 7 (8%) 0 0

Средний титр М±ш, диапазон изменений 590±91 (0-4290) 3±3 (0-250) 0

Таблица 9

Титр антител к премиксу, содержащему 2п-ФГИСБ, в сыворотках крови детей.

страдающих пищевой непереносимостью

Показатели Антигены

Соя ФГИСБ Премикс, содержащий Zn- ФГИСБ

Число больных 85 85 85

Антитела в титре >1:100, N(%) 5 (5,9%) 0 0

Антитела в титре >600, N (%) 2 (2,3%) 0 0

Средний титр М±т, диапазон изменений 79±40 (0-2562) 0 0

Представленные результаты свидетельствуют о том, что антитела к комплексам Zn-ФГПБ, включенным в состав микроэлементных премиксов, в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью, практически отсутствуют у больных с пищевой

сенсибилизацией, независимо от вида исследуемого гидролизата. Поскольку в состав обычных пищевых продуктов, потребляемых больными (мясные, молочные продукты, рыба, овощи и др.) цинк входит преимущественно в виде комплексов с белками, то при наличии у таких комплексов сенсибилизирующих свойств антитела к мим должны были бы выявляться, во всяком случае, у больных с поливалентными формами пищевой сенсибилизации.

4. Влияние премиксов, содержащих комплексы иника с ферментативными гпдролизатами пищевых белков, па степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных.

Задачей данного раздела работы явилась оценка влияния корма, обогащенного микроэлементными премиксами, содержащими комплексы цинка, а также дополнительно комплексы меди, марганца, хрома с ферментативными гпдролизатами пищевых белков, на тяжесть анафилактического шока и уровень циркулирующих специфических антител к овальбумину куриного яйца у сенсибилизированных этим белком крыс. В ходе эксперимента крысы опытных группы получали на протяжении 28 дней стандартный рацион вивария (СРВ), обогащенный микроэлементными премиксами, содержащими 2п-ФГПБ. В табл. 10, 11 и 12 представлены результаты оценки тяжести активного анафилактического шока и ответа антител к овальбумину у животных, получавших микроэлементные премиксы, содержащие гп-ФГБКМ, Zn-ФГИCБ и 2п-ФГБКЯ, соответственно.

Таблица !0

Оценка тяжести активного анафилактического шока и показателей интенсивности гуморального иммунного ответа у сенсибилизированных овальбумином крыс, получавших микроэлементный премикс, содержащий 2п-ФГБКМ

Показатели Группы Достоверность различия, Р

Премикс, содержащий гп-ФГБКМ СРВ

Число животных 23 23

Анафилактический индекс 3,48 3,13 >0,05*

Тяжелые реакции % 82,6 65,2 >0,05*

Летальность % 82,6 65,2 >0,05*

Уровень антител в сыворотке крови мг/мл 5,9±0,4 5,3±0,3 >0.05** >0,05***

Десятичный логарифм уровня антител 0,740±0,034 0,705±0,031 >0,05** >0,05***

Примечания: Здесь и в табл И и 12

* Согласно двустороннему критерию и (углового преобразования Фишера)

** Согласно 1-тесту Стыодента для несвязанных величин

*** Согласно непараметрическому ранговому критерию Мана-Уитни

Таблица 11

Показатели Группы Достоверность различия, Р

Премикс, содержащий гп-ФГИСБ СРВ

Число животных 25 25

Анафилактический индекс 3,28 3,12 >0,05*

Тяжелые реакции % 80 68 >0,05*

Летальность % 80 68 >0,05*

Уровень антител в сыворотке крови мг/мл 6,3±0,5 6,8±0,6 >0,05** >0,05***

Десятичный логарифм уровня антител 0,766±0,037 0,794±0,036 >0,05** >0,05***

Таблица 12

Показатели Группы

Премикс, содержащий гп-Фгвкя СРВ Достоверность различия, Р

Число животных 22 24

Анафилактический 2,18 2,54 >0,05*

индекс

Тяжелые реакции % 31,8 37,5 >0,05*

Летальность % 31,8 37,5 >0,05*

Уровень антител в сыворотке крови мг/мл 5,6+0,7 4,6+0,4 >0,05** >0,05***

Десятичный логарифм 0,683+0,053 0,611+0,047 >0,05**

уровня антител >0,05***

У животных, получавших премиксы, содержащие гп-ФГБКМ и гп-ФГИСБ (табл. 10 и 11), отмечалось некоторое возрастание тяжести анафилаксии по сравнению с контрольными животными. Однако различия с контролем были статистически недостоверны. Средние уровни циркулирующих антител к ОВА в соответствующих контрольных и опытных группах животных практически не различались В случае премикса, содержащего ФГБКЯ, отмечалось некоторое снижение аллергической реактивности, которое, однако, не достигает уровня статистической достоверности. Ни один из тестируемых продуктов не влиял значимым образом на гуморальный иммунный ответ к модельному антигену.

Таким образом, для всех трех микроэлемеитиых премиксов, содержащих в своем составе комплексы цинка с ФГБКМ, ФГИСБ и ФГБКЯ, не выявлено достоверного усиления аллергической чувствительности у животных, сенсибилизированных «посторонним» модельным аллергеном - овальбумином куриного яйца

Совокупность результатов проведенных исследований дает основание полагать, что изучаемые премиксы, содержащие комплексы цинка с ФГПБ, безопасны с позиции возможного аллергизирующего действия, что позволяет рекомендовать их для клинической апробации в составе специализированных лечебных и диетических продуктов питания.

5. Оценка всасывания и ретенции цинка в составе комплекса цинка с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока.

В данном эксперименте проводили исследование показателей, характеризующих усвояемость цинка (коэффициенты кажущихся всасывания, ретенции и эффективной ретенции) у лабораторных животных (крыс) с пониженной обеспеченностью цинком после однократного введения им 2п-ФГБКМ. Животные получали в течение относительно большого времени (11 суток) цинкдефицитный корм, а затем им однократно перорально вводили Zn-ФГБKM. Расчеты проводили согласно формулам, представленным в разделе «Материалы и методы исследования»

Как видно из данных, представленных в табл 13, показатели, характеризующие всасывание, ретенцию и эффективную ретенцию цинка свидетельствуют о том, что биодоступность цинка в составе комплекса 2п-ФГБКМ достаточно высока Очевидно, что истинное всасывание цинка и его ретенция, определяемые с учетом эндогенной экскреции цинка с фекалиями, а также с мочой, отвечают еще более высоким значениям.

Таблица 13

Показатели, характеризующие биодоступность цинка в составе 2п-ФГБКМ у крыс, получавщих цинкдефицитный корм

Показатели М±т

Экскреция Ъл с мочой, мкг/сут 10,6±1,4

Экскреция Хп с калом, мкг/сут 65,3±23,8

Показатели усвояемости (кажущиеся) Коэффициент всасывания, О5ао 75,8±9.4

Коэффициент ретенции, RS.ii) 71,9±8,9

Коэффициент эффективной ретенции, ЕИвщ, 94,4±1,3

Таким образом, в условиях недостаточной обеспеченности цинком лабораторных животных (крыс) цинк может эффективно усваиваться в составе 2п-ФГБКМ.

6. Сравнительная оценка эффективности использования комплекса гп-ФГБКМ и сульфата цинка в «восстановительном» кормлении лабораторных животных (крыс), получавших предварительно цинк-дефинитный корм.

Предварительно оценивали ростовые показатели, массу внутренних органов, а также общее содержание цинка в ткани бедренной кости и активность щелочной фосфатазы сыворотки крови у двух групп животных, одна из которых (группа №1) в течение 28 дней получала полусинтетический корм, дополненный 12 мг цинка/кг корма в форме 2п-ФГБКМ, а вторая (группа №2) в течение также 28 дней получала цинкдефицитный полу синтетический корм Как представлено в таблицах 13 и 14, потребление животными в течение 4 недель цинкдефицитного полусинтетического корма вызывало помимо отставания животных в росте существенное снижение как содержания этого микроэлемента в ткани бедренной кости, так и активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по сравнению с соответствующими показателями, определяемыми для животных, потреблявших в течение 4 недель полусинтетический корм с добавками Ъп-ФГБКМ

Последующий эксперимент также проводился с двумя группами животных (группы №№ 3,4) Животные обеих групп вначале в течение 14 дней получали цинкдефицитный полусинтетический корм. Затем в течение последующих 14 дней животные группы №3 получали полусинтетический корм, дополненный 12 мг цинка/кг корма в форме Хп-ФГБКМ, а животные группы № 4 полу синтетический корм с добавлением 12 мг цинка/кг корма в форме сульфата цинка.

У крыс, потреблявших цинкдефицитный рацион в течение первых двух недель, и затем получавших две недели полусинтетический рацион с добавкой гп-ФГБКМ (группа 3), отмечена нормализация прироста массы тела. Крысы (группа №4) также потреблявшие цинкдефицитный рацион в течение первых 14 дней, но затем получавшие полусинтетический рацион с добавкой гиБО^НгО, прибавили в массе по сравнению с животными группы №2 (Р<0,05), но их прирост массы тела отставал от групп №№1 и 3 (Р<0,01)

Как следует из представленных в таблицах №№ 13, 14 данных, 2-х недельное «восстановительное» введение в корм 2п-ФГБКМ (группа №3) после 2-х недельного потребления животными цинкдефицитного корма приводило к тому, что ростовые показатели и содержание цинка в костной ткани значительно повышались по сравнению с животными, получавшими цинкдефицитный корм в течение 4 недель (группа №2), и достоверно не отличались от соответствующих показателей для крыс, получавших корм с добавкой 7п-ФГБКМ в течение 4 недель (группа №1).

Таблица 13

Масса тела и относительная масса внутренних органов крыс, получавших полусинтетические корма с различным содержанием цинка

№№ групп Масса тела Масса органов, % от массы тела М±тп

Тимус Печень Почки Селезенка Семенники

1 296±10 0,21 ±0,01 4,46±0,09 0,71 ±0,01 0,59±0,03 1,07±0,04

2 243±7* 0,18±0,01 4,08±0,08 0,66±0,01 0,57±0,03 1,01 ±0,06

3 283±б 0,18±0,02 4,40±0,15 0,64±0,01 0,65±0,02 0,91 ±0,05

4 264±4** 0,20±0,02 4,37±0,12 0,74±0,01 0,67±0,07 1,06±0,04

Примечание:

* Различие с группами 1, 3 и 4 достоверно, Р<0,05; ** различие с группами 1 и 3 достоверно, Р<0,05, непараметрический критерий Мана-Уитни

Таблица 14

Содержание цинка в ткани бедренной кости и активность щелочной фосфатазы сыворотки

крови крыс, получавших полусинтетические корма с различным содержанием цинка

№№ групп Содержание цинка бедренной кости, мг/кг M±ni Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови

нмоль/л/с М±ш нмоль/с на 1 г белка М±ш

1 143±7 2738±164 31,8±1,8

2 100±5* 1772±92* 21,3±1,0*

3 135±8** 2111±111** 25,6±1,4**

4 107±7 2705±173 33,2±2,3

Примечание: * Различие с группами 1, 3 и 4 достоверно, Р<0,05. **Различие с группами 1; 2 и 4 достоверно, Р<0,05; непараметрический критерий Мана-Уитни

Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс группы №3 статистически значимо превышала этот показатель для животных, получавших цинкдефицитный корм в течение 4 недель (группа №2), но не достигала уровня активности этого фермента в сыворотке крови крыс, получавших корм с добавкой 7м-ФГБКМ (группа №1). Активность щелочной фосфатазы п сыворотке крови животных, получавших в течение двухнедельного «восстановительного» кормления добавочное количество цинка в виде неорганической соли - сульфата цинка (группа №4), была значимо выше, чем в группе №3. Однако, по содержанию цинка в костях крысы, получавшие сульфат цинка в течение 14 дней, существенно и статистически достоверно

отставали от животных, получавших этот микроэлемент на протяжении тех же 14 дней в форме Zn-ФГБКМ. Более того, содержание цинка в костях (важнейшего биомаркера обеспеченности этим микроэлементом) у животных группы №4 практически не отличалось от значения этого показателя для животных, получавших в течение всех 28 дней цинкдефицитный корм Особенно важно отметить, что при использовании сульфата цинка при «восстановительном» кормлении животные отставали по ростовым показателям не только от животных группы № 1, но и животных группы № 3.

Таким образом, совокупность полученных в этом разделе работы результатов свидетельствует о большей эффективности использования в питании животных, недостаточно обеспеченных цинком (предварительно получавших в течение 2 недель цинкдефицитный корм) нового пищевого источника органической формы цинка по сравнению с сульфатом цинка.

Выводы

1. В лабораторных условиях получены новые пищевые источники органических форм эссенциального микроэлемента - цинка Схема получения включает ферментативный (одно или двухстадийный) гидролиз пищевых белков, мембранную ультрафилмрацию получаемых гидролизатов, их комплексирование с этим микроэлементом с последующей нанофильтрацией и сушкой.

2. Определение молекулярно-массового распределения пептидных фракций и содержания цинка в составе комплексов с ферментативными гидролизатами белков коровьего молока, белка куриного яйца и изолята соевых белков показало, что основная часть цинка прочно связывается с фракцией относительно коротких пептидов в диапазоне молекулярных масс 0,5-1,4 кД

3 В условиях in vitro с использованием сыворотки крови детей, страдающих различными формами пищевой непереносимости, не выявлено наличия антигенных свойств у вышеперечисленных комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

4 Показано отсутствие потенциально аллергизирующего влияния новых пищевых источников органической формы цинка - комплекса этого микроэлемента с ферментолизатами пищевых белков при использовании модели системной анафилаксии в опытах на лабораторных животных (крысах).

молока характеризуется величиной кажущейся абсорбции - 76%, ретенцией - 72% и эффективной ретенцией - 94%, что свидетельствует о высокоэффективном всасывании и усвоении этого микроэлемента.

6. При содержании лабораторных животных (крыс) на цинкдефицитном корме в течение 28 суток имеет место существенное отставание в росте массы тела животных, а также достоверное снижение содержания цинка в костной ткани и активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови на 30% и 33% соответственно. После 2-х недельного потребления крысами цинкдефицитного корма введение в их корм органически связанной формы цинка - комплекса этого микроэлемента с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока приводит к восстановлению массы тела и уровня цинка в костной ткани значительно более эффективно по сравнению с сульфатом цинка.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Зорин С.Н, Баяржаргал М, Бурдза ЕА, Мазо В К Получение и характеристика ферментативного гидролизата изолята соевых белков. //Вопр. питания. - 2006. - Т. 76. - №1. - С. 10-12.

2. Мазо В К, Зорин СН, Баяржаргач М, Гмошинский ИВ., Бурдза ЕА Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Краткое сообщение 6. Получение и физико-химическая характеристика некоторых новых пищевых источников цинка, меди, марганца, хрома и селена. //Вопр детской диетологии. -2005.-Т. 3. -№5.-С. 19-21.

3. Зорин С.Н, Баяржаргач М, Бурдза ЕА, Мазо В.К Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Сообщение 5: Комплексы цинка, меди, марганца и хрома с ферментативным гидролизатом белка куриного яйца //Вопр. детской диетологии. - 2005. - Т 3 - №4. - С. 5-7.

4. Баяржаргал М, Розан11ев ЭГ, Зорин С Н., Бурдза ЕА, Гмошинский ИВ, Мазо В К Двухстадийный ферментативный гидролиз белков куриного яйца //Хранение и переработка сельхозсырья. -2005. - №4. - С. 34-36.

5. Гмошинский И.В, Мун.хуу Б, Мазо В К Микроэлементы в питании человека: биологические индикаторы недостаточности цинка //Вопр питания - 2006 - I. 76. - №6. - С. 4-11.

6. Мунхуу Б, Зорин С.Н, Мазо В К Ферментативный гидролизат белков куриного яйца: получение и физико-химическая характеристика //Гастроэнтерология Сажа-

Петербурга. - 2005. - №1-2. Материалы 7-го Международного СлавяноБалтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро 2005», 11-13 мая 2005 года - М95.

7. Зорин СН, Баяржаргал М, Зилова ИС, Мазо В К Комплексы цинка, меди, марганца и хрома с ферментативными гидролизатами белка куриного яйца - новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов //Материалы XIII международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». -Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая - 9 июня 2005 года. - С. 167-168.

8 Зорин СН, Баяржаргал М Физико-химическая характеристика новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов: биохелатные комплексы гидролизата белков куриного яйца с цинком и медью //Материалы VIII Всероссийского конгресса «Оптимальное питание - здоровье нации» К 75-летию ГУ НИИ питания РАМН. - Москва, 26-28 октября 2005 года. - С. 102.

9. Мазо В К, Зорин СН, Баяржаргал М., Гмоишнский ИВ Комплексы ферментативных гидролизатов пищевых белков с эссенциальными микроэлементами: получение, комплексная экспериментальная оценка. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2005. -T.XV - №5 - Приложение 26. Тезисы материалов XI Российской гастроэнтерологической недели. - С. 150.

10. Баяржаргач М, Зорин СН, Гмошинский ИВ, Мазо В К Исследование биодоступности цинка, находящегося в комплексе с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока. Тезисы материалов I Всероссийского съезда диетологов и нутрициологов, - Москва, 4-6 декабря 2006 года. - С. 10-11.

Заказ № 190/12/06 Подписано в печать 26 12 2006 Тираж 110 чкз уел пл 1,5

, _ Л ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \ / '' www.cfr.ru ; с-тси1:иф)(с1)с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мунхуу Баяржаргал

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Ферментативные гидролизаты пищевых белков: получение и физико-химическая характеристика.

2.2. Новые пищевые источники органических соединений эссенциальных микроэлементов-переходных металлов.

2.3. Биологическая роль цинка, его эссенциальность для организма человека.

2.4. Оценка обеспеченности организма человека и животных цинком

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1.1. Реактивы, оборудование.

3.1.2. Лабораторные животные.

3.2. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков.

3.2.1. Ферментативный гидролизат белков коровьего молока.

3.2.2. Ферментативный гидролизат белка куриного яйца.

3.2.3. Ферментативный гидролизат изолята соевых белков.

3.3. Получение комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

3.4. Методы исследования

3.4.1. Хроматографическое определение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в составе ферментативных гидролизатов пищевых белков и их комплексов.

3.4.2. Определение содержания общего белка.

3.4.3. Определение содержания ингибитора трипсина овомукоида куриного яйца.

3.4.4. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс.

3.4.5. Определение общего белка в сыворотке крови крыс.

3.4.6. Определение содержания цинка в составе комплексов с ферментативными гидролизатами пищевых белков и биологическом материале.

3.4.7. Количественный метод оценки антигенных свойств ферментативных гидролизатов пищевых белков и их комплексов с цинком.

3.4.8. Метод оценки влияния комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных (крыс).

3.4.9. Оценка в опытах на лабораторных животных (крысах) всасывания и ретенции цинка в составе его комплекса с ферментативными гидролизатом белков коровьего молока.

3.4.10. Оценка эффективности использования комплекса Zn-ФГБКМ и сульфата цинка в «восстановительном» кормлении лабораторных животных (крыс).

3.4.11. Статистическая обработка результатов исследований.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков.

4.1.1. Ферментативный гидролизат белков коровьего молока.

4.1.2. Ферментативный гидролизат белков куриного яйца.

4.1.3. Ферментативный гидролизат изолята соевых белков.

4.2. Получение и физико-химическая характеристика комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

4.2.1. Содержание цинка в комплексах с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

4.2.2. Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков. Содержание цинка в пептидных фракциях.

4.3. Определение in vitro антигенных свойств ферментативных гидролизатов пищевых белков и микроэлементных премиксов, содержащих комплексы этих гидролизатов с цинком.

4.4. Влияние премиксов, содержащих комплексы цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков, на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных (крыс).

4.6. Оценка всасывания и ретенции цинка в составе комплекса цинка с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока.

4.5. Сравнительная оценка эффективности использования комплекса Zn-ФГБКМ и сульфата цинка в «восстановительном» кормлении лабораторных животных (крыс), получавших предварительно цинкдефицитный корм

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм цинка"

Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро, так и микронутриентами, в том числе и эссенциальными микроэлементами. При этом предполагается не только необходимое количественное содержание микроэлементов в пище, но также их соответствующие химические формы и физиологически обоснованные соотношения с другими компонентами пищи, наиболее полно удовлетворяющие потребности организма.

Цинк наряду с железом, медью, селеном, йодом, марганцем, молибденом, хромом и кобальтом относится к эссенциальным микроэлементам, массовая доля которых в организме человека составляет Биохимические механизмы действия цинка связаны с участием в построении и функционировании более 200 ферментов, катализирующих различные метаболические процессы, включающие синтез и распад углеводов, жиров, белков и нуклеиновых кислот. Неадекватная обеспеченность организма данным микроэлементом приводит к задержке роста, развития, полового созревания; снижению иммунитета, репродуктивной функции; нарушениям кроветворения, вкуса и обоняния; репарации ран и другим нарушениям [1, 66, 111, 127]. На основании балансовых исследований, проведенных специалистами ФАО в 176 странах, Международная консультативная группа по цинку в питании (International Zinc Nutrition Consultative Group) сделала заключение, что около 20% населения мира имеют риск неадекватной обеспеченности цинком [136] с учетом имеющихся сведений по усвоению цинка из наиболее употребляемых продуктов питания в данной стране. Согласно данным эпидемиологических исследований в ряде регионов Российской Федерации выявлена высокая частота встречаемости недостаточной обеспеченности цинком, особенно у детского населения [12, 26, 28].

Соответственно весьма актуальной является задача профилактики и диетической коррекции недостаточной обеспеченности этим эссенциальным для организма человека микроэлементом путем использования в питании специализированных обогащенных продуктов и биологически активных добавок (БАД) к пище - дополнительных источников цинка. При этом фактическое содержание цинка, как и других микроэлементов, в диете без учета его биологической доступности (химической формы, содержания других компонентов в пище, способствующих или препятствующих его усвоению) не является показателем объективной оценки адекватной обеспеченности пищи минеральными микронутриентами [63, 130]. В связи с тем, что обогащение пищевых продуктов микронутриентами является серьезным вмешательством в традиционно сложившуюся структуру питания человека, к дополнительным пищевым (и часто нетрадиционным) источникам эссенциальных микроэлементов должны предъявляться повышенные требования, обеспечивающие как их полную безопасность, так и достаточную эффективность.

Известно, что цинк из продуктов животного происхождения усваивается намного лучше, чем из растительных источников. Главным диетическим фактором, препятствующим усвоению цинка из растительной пищи, являются фитаты. Значение молярного отношения фитатыщинк в диете, превышающее 15, сопряжено с нарушением статуса цинка у обследуемого контингента населения [85]. Эффективным фактором, способствующим лучшему усвоению цинка организмом, является белок животного происхождения, а также аминокислоты и пептиды [1, 19, 86], с которыми цинк может образовывать растворимые и достаточно устойчивые комплексы. В повседневной жизни человек потребляет эссенциальные микроэлементы, в том числе и цинк, в составе растительных и животных продуктов, в связи с этим представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами цинка. Одним из возможных вариантов решения проблемы поиска таких новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов, к которым относится цинк, является его комплексирование с аминокислотами и пептидами в составе ферментативных гидролизатов пищевых белков.

Целью данной работы явились получение новых пищевых источников органических форм цинка, их комплексная физико-химическая, физиолого-биохимическая характеристика и экспериментальная оценка возможности использования этих пищевых источников для профилактики и диетической коррекции недостаточности данного микроэлемента.

Основные задачи исследования

3. В исследовании in vitro оценить антигенные свойства ферментативных гидролизатов пищевых белков и их комплексов с цинком.

5. Охарактеризовать всасывание и ретенцию цинка в форме комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока у лабораторных животных (крыс) в условиях недостаточного потребления этого микроэлемента.

Научная новизна

Определены оптимальные условия ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) для их последующего комплексирования с цинком в целях получения новых пищевых источников этого микроэлемента.

В опытах in vitro установлено практически полное отсутствие в составе комплексов ферментативных гидролизатов пищевых белков с цинком антигенных детерминант, взаимодействующих с антителами к пищевым белкам в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью.

В опытах in vivo установлено, что длительный пероральный прием комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков не влияет на тяжесть проявлений реакций системной анафилаксии у лабораторных животных (крыс), многократно сенсибилизированных модельным антигеном (анафилактогеном) - овальбумином.

Дана сравнительная оценка эффективности использования нового пищевого источника органической формы цинка (его комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока) и сульфата цинка в восстановительном» питании крыс, предварительно получавших в течение 14 дней цинкдефицитный полусинтетический корм.

Практическая значимость

Предложенные для лабораторных условий схемы проведения процессов ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) могут быть использованы для разработки схем промышленного получения пищевых ферментативных гидролизатов перечисленных белков. Полученные таким способом ферментативные гидролизаты при комплексировании с цинком представляют собой новые пищевые источники органических форм этого микронутриента.

Высокое содержание в составе полученных комплексов цинка и отсутствие сенсибилизирующих и аллергизирующих свойств свидетельствуют о возможных перспективах их использования в целях алиментарной профилактики случаев недостаточной обеспеченности этими микронутриентами детского и взрослого населения. На примере органического соединения цинка - его комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока предложен и апробирован метод оценки всасывания и ретенции микроэлемента в опытах на лабораторных животных (крысах). Метод может найти своё применение для характеристики биодоступности различных пищевых источников микро- и макроэлементов.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на XIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2005 г.; на 7-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро 2005»; на XI Российской гастроэнтерологической неделе, Москва, 2005г.; на VIII Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации», Москва, 2005г; на I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты», Москва, 2006.

Публикации

По результатам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах и 5 публикаций в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, заключение и выводы. Указатель литературы содержит 33 российских и 108 зарубежных источников. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 8 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мунхуу Баяржаргал

ВЫВОДЫ

1. В лабораторных условиях получены новые пищевые источники органических форм эссенциального микроэлемента - цинка. Схема получения включает ферментативный (одно или двухстадийный) гидролиз пищевых белков, мембранную ультрафильтрацию получаемых гидролизатов, их комплексирование с этим микроэлементом с последующей нанофильтрацией и сушкой.

3. В условиях in vitro с использованием сыворотки крови детей, страдающих различными формами пищевой непереносимости, не выявлено наличия антигенных свойств у вышеперечисленных комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

4. Показано отсутствие потенциально аллергизирующего влияния новых пищевых источников органической формы цинка - комплекса этого микроэлемента с ферментолизатами пищевых белков при использовании модели системной анафилаксии в опытах на лабораторных животных (крысах).

5. При 11-ти дневном потреблении крысами цинкдефицитного полусинтетического корма одноразовое пероральное введение им цинка в составе нового пищевого источника - комплекса цинка с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока характеризуется величиной кажущейся абсорбции - 76%, ретенцией -72% и эффективной ретенцией - 94%, что свидетельствует о высокоэффективном всасывании и усвоении этого микроэлемента.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное в нашей работе исследование связано с реализацией положений, выдвигаемых концепцией оптимального питания. Продолжая и одновременно развивая основные положения теории рационального питания А.А. Покровского и теории адекватного питания A.M. Уголева, концепция оптимального питания предполагает необходимость адекватного обеспечения организма человека как макро, так и микронутриентами. Не вызывает сомнений эссенциальность для организма человека и животных ряда микроэлементов. С позиций доказательной медицины соответственно установлено, что при дефиците (недостаточности) этих микроэлементов в рационе человека имеет место снижение резистентности к неблагоприятным факторам окружающей среды (феномен маладаптации), формированию иммунодефицитных состояний, нарушению функции систем антиоксидантной защиты, хронизации болезней, повышению риска развития распространенных заболеваний, снижению качества жизни эффективности лечебных мероприятий. Концепция оптимального питания констатирует, что у современного человека имеет место недостаточное поступление с пищей микронутриентов, в том числе и эссенциальных микроэлементов, вследствие снижения энерготрат и соответственно уменьшения общего количества потребляемой пищи. Негативное влияние на обеспеченность населения эссенциальными микроэлементами пищи оказывают также новые интенсивные технологии, используемые в сельском хозяйстве (как в земледелии, так и животноводстве) и современные способы переработки пищевой продукции. Положение о регулярном потреблении пищевых продуктов, обогащенных витаминами и минеральными веществами как важнейшем факторе оптимизации питания и здоровья человека является научным обоснованием разработки, широкого производства и использования в питании населения новых пищевых источников этих биологически активных веществ. Оптимальное питание предъявляет жесткие требования к форме, в которой искомое биологически активное соединение находится в составе нового пищевого источника. Правила соответствия химического состава пищи ферментным взаимоотношениям организма на всех уровнях её ассимиляции, сформулированные академиком А.А. Покровским, концепция оптимального питания детализирует по отношению к определенным микронутриентам, в первую очередь эссенциальным микроэлементам. Констатируется целесообразность использования в питании человека органических форм эссенциальных микроэлементов, так как на протяжении эволюции человека как вида, преимущественно органические соединения этих микронутриетов потреблялись им в составе растительной и животной пищи. Эффективным способом, позволяющим получать в широких масштабах пищевые источники органических соединений эссенциальных микроэлементов, является наукоёмкое биотехнологическое производство. Как уже отмечалось нами ранее, одним из возможных биотехнологических подходов к получению органических форм эссенциальных микроэлементов-переходных металлов является их комплексирование с пептидными структурами, образующимися в результате ферментативного гидролиза белков.

Данное исследование было посвящено получению в лабораторных условиях, экспериментальной физико-химической, иммунохимической характеристике, а также физиолого-биохимической и аллергологической оценке в опытах in vivo и in vitro новых пищевых источников органической формы цинка - комплексов этого микроэлемента с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

Выбор цинка в качестве объекта исследования определился, во-первых, его эссенциальностью для организма человека, во-вторых, недостаточной обеспеченностью населения, в том числе и детей этим микроэлементов в некоторых регионах РФ и зарубежных стран [12, 28, 47, 49, 92] и, в третьих, способностью к комплексообразованию с пептидами и свободными аминокислотами в составе белковых гидролизатов.

Известны разработки, согласно которым цельный и/или слабо гидролизованный белок в смеси с неорганическими соединениями микроэлементов подвергается гомогенизации Полученные по такой технологии продукты имеют плохую растворимость, низкую устойчивость и значительное количество микроэлементов в составе таких продуктов может находиться в исходной неорганической форме. Ферментативный гидролиз, проводимый в оптимальных условиях, позволяет перевести белковый материал в хорошо растворимые пептидно-аминокислотные смеси, что увеличивает возможности связывания микроэлемента с органическим лигандом. При этом возможно получать пептидные структуры с заданным профилем молекулярно-массового распределения без изменения конфигурации аминокислот.

Традиционно используемые в питании белки коровьего молока, куриного яйца и изоляты соевых белков, были выбраны нами для проведения ферментативного гидролиза с целью дальнейшего использования ферментолизатов для комплексирования с цинком. Представлялось целесообразным дать сравнительную физико-химическую и иммунохимическую характеристику получаемых комплексов цинка с пептидными фрагментами, образующимися в результате ферментолиза пищевых белков.

На первом этапе исследования в целях оптимизации ферментативного гидролиза пищевых белков нами были апробированы схемы одно- и двухстадийного гидролиза с варьированием фермент-субстратного соотношения, времени гидролиза, изменения рН реакционной среды и последовательности применения ферментных препаратов.

По результатам проведенных экспериментов для получения ферментативного гидролизата белков коровьего молока выбрана одностадийная схема гидролиза «Панкреатином» в концентрации 2% от массы белка в течение 3 часов при температуре 50 °С и рН 7,5.

Существенно более трудоёмким оказался метод эффективного гидролиза белка куриного яйца. Проведение предварительной термической денатурации белка куриного яйца при значении рН 9,6, температуре 80 °С в течение 25 минут с последующим использованием двухстадийной схемы гидролиза («Флавоэнзимом» при рН значении рН 6,5 в течение 22 часов и «Панкреатином» - рН 7,5 в течение 5 часов) позволило получить гидролизат с высоким содержанием низкомолекулярных пептидов. В полученном продукте доля пептидов молекулярной массы менее 2,1 кД составила более 60%.

Двухстадийный ферментативный гидролиз изолята соевых белков (ИСБ) с применением на первой стадии ферментного преарата «Флавоэнзим» приводил к полной элиминации белковых структур с молекулярными массами более 28 кД с переходом более 90% белка в раствор. В гидролизате ИСБ, полученном с использованием на первой стадии ферментного препарата «Флавоэнзим» (рН 6,5, температура 50 °С, 22 часа) и на второй стадии «Панкреатина» (рН 7,5, температура 50 °С, 5 часов) в концентрациях соответственно 5 и 3% от массы ИСБ, доля фракции с молекулярной массой менее 4 кД составила более 70% с минимальными потерями исходного белка.

Таким образом, применение двухстадийной схемы ферментативного гидролиза с помощью ферментных препаратов «Флавоэнзим» и «Панкреатин» позволило получить гидролизаты белков куриного яйца и изолята соевых белков, молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в которых близко к таковым гидролизата белков коровьего молока, получаемого по одностадийной схеме гидролиза «Панкреатином». Предварительная термическая денатурация белка куриного яйца перед гидролизом существенно влияла на гидролизуемость субстрата. Полученные нами ферментативные гидролизаты пищевых белков характеризовались высоким содержанием низкомолекулярных пептидных структур.

Для использования в качестве лиганда при получении комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков (Zn-ФГПБ) целесообразно использовать низкомолекулярные пептидные структуры, так как с ними комплексообразование катионов цинка должно протекать более эффективно. Мембранные технологии позволяют проводить разделение высоко- и низкомолекулярных пептидных фракций гидролизата и получать их в концентрированном виде. Поэтому в дальнейшей работе для получения образцов комплексов гидролизатов пищевых белков с цинком использовали ультрафильтраты вышеназванных белковых гидролизатов. Тем не менее в дальнейшем изложении нами, использумый при получении комплексов ультрафильтрат будет называться нами гидролизатом.

Схема получения комплексов включала инкубацию неорганической соли микроэлемента с гидролизатами (ультрафильтратами) пищевых белков в определенных массовых соотношениях в водной среде при значении рН 7,1 в течение 1 часа при комнатной температуре. Далее не связавшиеся с пептидными фрагментами катионы удаляли с использованием нанофильтрации; концентрированные растворы комплексов Zn-ФГПБ лиофильно высушивали. Полученные комплексы цинка с ферментативными гидролизатами всех трех пищевых белков характеризовались высоким содержанием этого микроэлемента: 72,2; 89,6; 68,9 мг/г сухой массы комплекса Zn-ФГБКМ, Zn-ФГБКЯ и Zn-ФГИСБ соответственно и хорошей растворимостью в воде.

Проведение хроматографического фракционирования комплексов Zn-ФГПБ на колонке «Superose 12» с использованием буфера с рН 6,5 (0,2 М NaCl, содержащий азид натрия) показало, что преобладающей формой ЭМ в составе полученных продуктов являются его комплексы с относительно короткими пептидами. Количество ЭМ, включенного во фракцию свободных аминокислот и не связанных с белком ионов (выходящую в области УПОЛн колонки) относительно мало. Значительное количество цинка в составе комплексов Zn-ФГПБ сосредоточено в области коротких пептидов в диапазоне молекулярных масс менее 1,4 кД.

Прежде, чем перейти к исследованиям in vivo на лабораторных животных для предварительного обоснования возможности безопасного использования полученных комплексов в питании человека, нами было проведено тестирование антигенных (и соответственно потенциально аллергенных) свойств комплексов Zn-ФГПБ в составе микроэлементных премиксов in vitro. Предпосылкой для такого исследования послужило положение о том, что a priori нельзя исключать сенсибилизирующую активность комплексов ЭМ с белками и пептидами. В работе проводили определение IgG-антител в сыворотках крови детей к трем микроэлементным премиксам, каждый из которых содержал в своем составе наряду с комплексом Zn-ФГПБ дополнительно три комплекса ФГПБ с Си, Мп и Сг (табл. 7). Полученные результаты свидетельствовали об очень низкой антигенности комплексов в составе премиксов (особенно по сравнению с исходными белками, которые подвергались ферментолизу). Действительно, если в сыворотках крови больных детей (104 ребенка) антитела к белку коровьего молока выявлялись в 97% случаев, при этом в сыворотках 34% больных в диагностическом титре (более 1:1500), то антитела к премиксу, содержащему Zn-ФГБКМ, не были обнаружены ни в одной из сывороток больных и лишь в одной сыворотке крови выявлены антитела в титре >1:100 к ФГБКМ.

При тестировании антител к микроэлементному премиксу, содержащему Zn-ФГБКЯ, только в сыворотке 1 больного ребенка из 85 больных детей выявлены антитела в титре >1:100 к исходному ФГБКЯ, а антитела к собственно Zn-ФГБКЯ в составе премикса отсутствовали в сыворотках всех больных детей. Антитела к белку куриного яйца (овальбумину) присутствовали более чем в половине сывороток крови больных детей, причем в диагностическом титре (более 1:1800) у 8 % обследованных.

Аналогичные данные, полученные при тестировании сывороток крови 85 больных детей, на наличие антител к ФГИСБ и микроэлементному премиксу, содержащему Zn-ФГИСБ, также свидетельствуют об отсутствии антител к гидролизату и к премиксу на его основе. При этом в сыворотках крови 6% больных детей присутствовали антитела к не гидролизованному изоляту белка сои. Поскольку в состав обычных пищевых продуктов, потребляемых больными (мясные, молочные продукты, рыба, овощи и др.) Zn входит преимущественно в виде комплексов с белками, то в случае наличия у таких комплексов сенсибилизирующих свойств антитела к ним должны были бы выявляться, во всяком случае, у больных с поливалентными формами пищевой сенсибилизации.

Следующим этапом наших исследований явилось тестирование в опытах in vivo возможных проявлений микроэлементными премиксами, содержащими в своем составе комплекс Zn-ФГПБ, иммуномодулирующих свойств, влияющих на аллергическую реактивность организма, с использованием модели системной анафилаксии на крысах. Данная модель позволила оценить влияние корма, обогащенного Zn-ФГПБ в составе микроэлементного премикса, на тяжесть анафилактического шока и уровень циркулирующих специфических антител к овальбумину куриного яйца у сенсибилизированных этим белком крыс. В результате проведенного исследования для всех трех комплексов микроэлементных премиксов, содержащих в составе Zn-ФГПБ, не выявлено достоверного усиления аллергической чувствительности (тяжесть анафилактического шока и уровень циркулирующих специфических антител к овальбумину) у животных, сенсибилизированных «посторонним» модельным аллергеном -овальбумином куриного яйца. При этом в случае использования премикса, содержащего Zn-ФГБКЯ, отмечено даже некоторое снижение аллергической реактивности, которое, однако, не достигает уровня статистической достоверности. Ни один из тестируемых продуктов не влиял значимым образом на гуморальный иммунный ответ к модельному антигену, как это видно из данных, представленных в табл. 19, 20, 21 .

Таким образом, совокупность результатов определения антител к микроэлементным премиксам, - содержащим в своем составе комплексы Zn-ФГПБ, - в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью поливалентного типа, а также проведенного исследования влияния данных микроэлементных премиксов на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных, дает основание полагать, что изучаемые премиксы безопасны с позиции возможного аллергизирующего (сенсибилизирующего) действия.

Основными показателями при оценке биодоступности нутриентов являются показатели их всасывания и ретенции в организме, а также эффективность включения в метаболические процессы [130]. Достаточно высокую эффективность всасывания и усвояемости, нового пищевого источника органической формы цинка подтверждают данные, полученные при исследовании всасывания и ретенции цинка в составе комплекса Zn-ФГБКМ крысами, получавшими предварительно в течение 11 суток базовый цинкдефицитный полусинтетический корм. При однократном пероральном приеме комплекса Zn-ФГБКМ были определены высокие кажущиеся коэффициенты всасывания, ретенции и эффективной ретенции цинка, значения которых составили в %, соответственно 75,8±9,4; 71,9±9,6 и 94,4±1,3.

Важнейшим завершающим этапом работы явились исследования в эксперименте эффективности использования Zn-ФГПБ комплексов для диетической профилактики и/или коррекции недостаточной обеспеченности цинком лабораторных животных (крыс). Животные с четырехнедельным нормальным обеспечением цинком в составе полусинтетического корма, введенного в форме Zn-ФГБКМ в течение 4 недель (табл. 23, группа №1), имели лучшие ростовые показатели по сравнению с животными, получавшими базовый цинкдефицитный корм в течение того же времени группа №2). Двухнедельное «восстановительное» введение Zn-ФГБКМ в количестве 12 мг Zn/кг корма в базовый цинкдефицитный корм нормализовало ростовые показатели у животных, получавших прежде в течение двух недель цинкдефицитный базовый корм (табл. 23, группа №3). У животных, содержавшихся предварительно в течение 2-х недель на цинкдефицитном корме, и получавших затем в последующие 2 недели добавку сульфата, прирост массы тела достоверно различался как от животных группы №1, так и группы № 3.

Качественно сходные результаты получены и по накоплению цинка в костной ткани: двухнедельное «восстановление» животных на диете с добавлением в базовый полусинтетический корм комплекса ФГБКМ приводит к практически полной нормализации содержания цинка в бедренной кости по сравнении с крысами, содержавшимися на «восстановительном» корме с добавлением сульфата цинка.

Об эффективности усвоения и включения цинка в метаболические процессы, протекающие в организме животных, получавщих этот ЭМ в составе нового пищевого источника судили также, определяя активность цинк зависимого фермента - щелочной фосфатазы сыворотки крови. Четырёхнедельное потребление крысами цинкдефицитного корма приводило к существенному снижению активности этого фермента по сравнению со значениями, отвечающими нормальной обеспеченности животных цинком. В случае двухнедельного восполнения корма Zn-ФГБКМ отмечена тенденция к повышению активности щелочной фосфатазы в сыворотке по сравнению с уровнем этого фермента у животных, получавших цинкдефицитный корм в течение 4 недель, но не достигала уровня активности щелочной фосфатазы у животных групп №№1 и 4.

Таким образом, совокупность результатов, полученных в экспериментальных условиях как in vitro, так и in vivo свидетельствует о перспективности использования для профилактики и диетической коррекции недостаточности цинка новых пищевых источников органических форм этого микроэлемента - его комплексов с ферментативными гидролизатами пищевых белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мунхуу Баяржаргал, Москва

1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова JT.C. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. - 1991. - 494с.

2. Азизов М.А. О комплексных соединениях некоторых микроэлементов с биоактивными веществами. Ташкент: Медицина, 1969. - 199с.

3. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука. - 1991. - С. 170.

4. Бек М. Химия равновесий реакций комплексообразования. М., 1973. -359 С.

5. Воробьев М.М., Левичева И.Ю., Беликов В.М. Исследование начальной кинетики гидролиза белков молока химотрипсином// Прикл. биохимия и микробиология. 1996. - Т. 32. - № 2. - С. 237-241.

6. Высоцкий В.Г., Яцышина Т.А., Рымаренко Т.В., Мамаева Е.М. О методах определения биологической ценности белков// МРЖ. 1976. -Разд. VII.-С. 24-35.

7. Георгиевский В.И. Минеральный обмен. В кн. Физиология сельскохозяйственных животных. Л., 1978. - С. 217-255.

8. Гмошинский И.В., Кржечковская В.В., Пятницкий Н.Н. Определение антител класса IgG у экспериментальных животных, сенсибилизированных перорально пищевым белком (к характеристике модели пищевой анафилаксии)// Вопр. питания. 1994. - №. 1-2. - С. 333.

9. Гмошинский И.В., Мунхуу Б., Мазо В.К. Микроэлементы в питании человека: биологические индикаторы недостаточности цинка. //Вопр, питания. 2006. - Т. 76. - №6. - С. 4-11.

10. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз// Приклад, биохимия и микробиол. 1971. - №7. - С. 225-228ю

11. Конь И.Я., Копытько М.В., Алешко-Ожевский Ю.П., Шевякова JI.B., Махова Н.Н., Шагова М.В., Батурин А.К. Изучение обеспеченности цинком, медью и селеном московских детей дошкольного возраста// Гигиена и санитария. 2001. - № 1. - С. 51-54.

12. Кудрин А.В., Скальный А.В., Жаворонков А.А., Скальная М.Г., Громова О.А. Иммунофармакология микроэлементов. М.: Изд-во КМК, 2000. - 537с.

13. Логинов Г.П. Влияние хелатов металлов с аминокислотами и гидролизатами белков на продуктивные функции и обменные процессы организма животных. Автореф. дисс. д-ра биол. наук. -Казань, 2005.-40с.

14. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Егорова Е.А., Ширина Л.И. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов// Клиническая диетология. 2004. - Т. 1. - №3. - С.3-14

15. Мазо В.К., Зорин С.Н., Гмошинский И.В., Зилова И.С., Шатров Г.Н. Новые источники эссенциальных микроэлементов. Комплекс цинка с ферментативным гидролизатом сывороточных белков коровьего молока// Вопр. детской диетологии. -2003. Т. 1. - № 6. - С. 6-8.

16. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Скальный А.В., Сысоев Ю.А. Цинк в питании человека: физиологические потребности и биодоступность// Вопр. питания. -2002. Т.71. - № 3. - С. 46-51.

17. Москалев Ю.И. Минеральный обмен. М.: Медицина, 1985. - 288 С.

18. Петров К.П., Олтаржевская Т.Н. Способ приготовления биологически активных дрожжевых автолизатов. Авт. свид. СССР № 292688. -опубл. 15.1.1971. - Бюлл. № 5.

19. Покровский А.А. Метаболические аспекты фармакологии и токсикологии пищи. -М.: Медицина, 1979. 184с.

20. Пыцкий В.И., Андрианова И.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. -М., 1999. С. 352-362.

21. Ракитин В.Ю., Прокофьева Н.В. Технология ферментативного гидролиза белкового сырья. Серия У: Получение и применение ферментов, витаминов и аминокислот. Вып. 2. М.: ОНТИТЭИмикробиопром. - 1982. -48С.

22. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. Под ред. И.М.Скурихина, В.А.Тутельяна М.: Медицина. - 1998.-С. 37-42.

23. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. Под ред. И.М.Скурихина и В.А.Тутельяна. М.: Брандес-медицина, 1998. - С. 183-185.

24. Скальная М.Г. Гигиеническая оценка влияния минеральных компонентов рациона питания и среды обитания на здоровьенаселения мегаполиса. Автореф. дисс.д-ра мед. наук. - М. 2005.-42с.

25. Скальный А.В. Микроэлементозы человека (диагностика и лечение). -М., 1999.-96 с.

26. Скальный А.В. Распространенность микроэлементозов у детей в различных регионах России// Вторая Российская школа «Геохимическая экология и биогеохимическое районирование биосферы». М., 1999. - С. 209-211.

27. Скальный А.В. Референтные значения концентрации химических элементов в волосах, полученные методом ИСП-АЭС (АНО Центрбиотической медицины)// Микроэлементы в медицине. 2003. - Т. 4. -Вып. 1.-С. 7-11.

28. Телишевская ЛЯ. Белковые гидролизаты. М.: Аграрная наука. -2000. - 295с.

29. Уголев A.M. Теория адекватного питания и трофология. С-Пб: Наука, 1991.-272с.

30. Химический состав пищевых продуктов. Кн. 2. Под ред. И.М.Скурихина, М.Н.Волгарева - М.: Пищевая промышленность, 1976.-234с.

31. Abiaka С., Olusi S., Al-Awadhi A. Reference ranges of copper and zinc and the prevalence of their deficiencies in an Arab population aged 15-80 years// Biol. Trace Elem. Res. 2003. - Vol. 91. - N 1. - P.33-43.

32. Adler-Nissen J., Olsen H.S. The influence of peptide chain length on taste and functional properties of enzymatically modified soy protein. In: Functionality and protein structure. Ed. by A.Pour-El ACSS. Series 92. Washington D.C. 1979. P.125-146

33. Aggett P.J. Zinc malabsorption in chronic renal insufficiency with or without dialysis therapy// Contr. Nephrology. 1984. - Vol. 38. - N 1. - P. 95-102.

34. Aggett P.J., Favier A. Zinc// Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1993. - Vol. 63. -N4. -P.301-307.

35. Allan A.K., Hawksworth G.M., Woodhouse L.R., Sutherland В., King J.C., Beattie J.H. Lymphocyte metallothionein mRNA responds to marginal zinc intake in human volunteers// Br. J. Nutr. 2000. Vol. 84. -N 5.- P.747-756

36. Anderson M.D., Andel-Monem M.M. Amino acid metal complexes using hydrolysed protein as the amino acid source and methods re same. U.S. Pat. No 5,698,724, Dec 16,1997. Appl. No 640322.

37. Anderson P.M., Desnick R.J. Purification and properties of delta-aminolevuhnate dehydrase from human erythrocytes// J. Biol. Chem.1979. Vol. 254. - N15. - P. 6924-6930

38. Ashmead H.H. Soluble iron proteinates. U.S. Pat. No 4,216,144. Aug 5,1980. Appl. No 843972.

39. Bales C.W., DiSilvestro R.A., Currie K.L., Plaisted C.S., Joung H., Galanos A.N., Lin P.H. Marginal zinc deficiency in older adults: responsiveness of zinc status indicators// J. Am. Coll. Nutr. 1994.- Vol. 13. -N 5. - P.455-462.

40. Barceloux D.G. Zinc// J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1999. - Vol. 37. - N 2.-P.279-292.

41. Benes B, Spevackova V, Smid J, Cejchanova M, Cerna M, Subrt P, Marecek J. The concentration levels of Cd, Pb, Hg, Cu, Zn and Se in blood of the population in the Czech Republic// Cent. Eur. J. Public Health. -2000.-Vol. 8.-N2.-P.117-119.

42. Bertram H.P. Spurelemente. Analytic, oecologische und medizinischklimsche bedeutung. Munchen, Vien, Baltimore, 1992. -207S.

43. Bhatnagar S., Natchu U.C.M. Zinc in child health and disease// Indian J. Pediatr. 2004. - Vol. 71. - Iss. 11. - P. 991-995.

44. Briefel R., Bialosky K., Kennedy-Stephenson J., McDowell M., Ervin R., Wright J. Zinc intake of the U.S. population: findings from the Third National Health and Nutrition Examination survey, 1988-1994// J. Nutr. -2000.-Vol. 130.-P. 1367S-1373S.

45. Coyle P., Niezing G., Shelton T.L., Philcox J.C., Rofe A.M. Tolerance to cadmium hepatotoxicity by metallothionein and zinc: in vivo and in vitro studies with MT-null mice// Toxicology. 2000.- Vol. 150. - N 1-3. -P.53-67.

46. Davis S.R., Cousins R.J. Metallothionein expression in animals: a physiological perspective on function// J. Nutr. 2000. - Vol. 130. - N 5. -P.1085-1088.

47. Diamond G.L., Goodrum P.E., Felter S.P., Ruoff W.L. Metal absorption//Drug Chem. Toxicol. 1998. -Vol. 21. - N 2. - P.223-251 (with erratum: Drug Chem. Toxicol. - 1997. - Vol. 20. -N 4. -P. 345-368.

48. DiSilvestro R.A. Zinc in relation to diabetes and oxidative disease// J. Nutr. -2000. Vol. 130. - 5S Suppl. - P.1509S-1511S.

49. Doumas B. Standards for total serum protein assays. A collaborative study// Clin. Chem. 1975. - Vol. 21. - P. 1159.

50. Dunn M.A., Blalock T.L., Cousins R.J. Metallothionein// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1987.- Vol. 185. - N 2.- P. 107-119.

51. Eck P., Pallauf J. Induction of metallothionein by paraquat injection in zinc-deficient rat// J. Amm. Physiol. Anim. Nutr. 1999. - Vol. 81. - P. 203-211.

52. Enzyme preparation from animal viscera. JP 82 68 789 (CI. C12N9/98), 27 Apr. 1982, Appl. 80/144,204,15, Oct 1980; 3 pp.

53. Fields R. The measurement of amino groups in proteins and peptides// Biochem. J. 1971.-Vol. 124.-P. 581-590.

54. Foley В., Johnson S.A., Hackley В., Smith J.C. Jr., Halsted J.A. Zinc content of human platelets// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968. - Vol. 128. -N 1. - P. 265-269.

55. Ge S. J., Zhang L. X. The immobilized porcine pancreatic exopeptidases and its application in casein hydrolysates debittenng// Appl. Biochem. Biotechnol. 1996. - Vol. 59. - P. 159-165.

56. Gibbs P.N., Gore M.G., Jordan P.M. Investigation of the effect of metal ions on the reactivity of thiol groups in human 5-aminolaevulinate dehydratase// Biochem. J. 1985. - Vol. 225. - N 3. - P.573-80

57. Gibson R.S., Ferguson E.L. Assessment of dietary zinc in a population// Am. J. Clin. Nutr. 1998. - Vol. 68. - P. 430S-434S.

58. Grider A., Bailey L.B., Cousins R.J. Erythrocyte metallothionein as an index of zinc status in humans// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990.-Vol. 87. - N 4,- P.1259-1262.

59. Hambidge M. Biomarkers of trace mineral intake and status// J. Nutr. -2003. Vol. 133. - Suppl 3. - P. 948S-955S.

60. Hambidge M. Human zinc deficiency// J. Nutr. 2000. - Vol. 130. - P. 1344S-1349S.

61. Hansen M., Sandstrom В., Lonnerdal B. The effect of casein phosphopeptides on zinc and calcium absorption from high phytate infant diets assessed in rat pups and Caco-2 cells// Pediatr. Res. 1996. - Vol. 40. -N4.-P. 547-552.

62. Hasizume M., Yamaguchi M. Stimulatory effect of beta-alanyl-L-histidinato zinc on cell proliferation is dependent on protein synthesis in osteoblastic MC3T3-E1 cells// Mol. Cell Biochem. 1993. - Vol. 122. - N l.-P. 59-64

63. Heather J.H., Taylor C.G., Wood Т., Mollard R., Weiler H.A. Zinc deficient rats have more limited bone recovery during repletion than diet-restricted rats// Exp. Biol. Med. 2004. - Vol. 229. - P. 303-311.

64. Helgeland K, Haider T, Jonsen J. Copper and zinc in human serum in Norway. Relationship to geography, sex and age// Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1982. - Vol. 42. - N 1. - P.35-39.

65. Hyun Т.Н., Barrett-Connor E., Milne D.B. Zinc intakes and plasma concentrations in men with osteoporosis: the Rancho Bernardo Study// Am. J. Clm. Nutr. 2004. - Vol. 80. -N 3. - P. 715-721.

66. Iwata M., Takebayashi Т., Ohta H., Alcalde R.E., Itano Y., Matsumura T. Zinc accumulation and metallothionein gene expression in the proliferating epidermis during wound healing in mouse skin// Histochem. Cell Biol. -1999.- Vol. 112. -N 4.- P.283-90.

67. Iyengar G.V., Hollmer W.E., Bowen H.J.H. The elements composition of human tissiues and body. Weinheim, NY: Verlag Chemie, 1987.

68. Johanning G.L., Browning J.D., Bobilya D.J., Veum T.L., O'Dell B.L. Effect of zinc deficiency on enzyme activities in rat and pig erythrocyte membranes// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1990.- Vol. 195. - N 2.- P.224-229.

69. Kirchgessner M., Roth H.-P. Bestimmung der Verfuegbarkeit von Zink lm Stoffwechsel sowie Ermittlung des Zinkbedarfs mittels Aktivitaetsaenderungen von Zink-Metalloenzymen// Arch. Tierernaehr. -1975.-Bd. 25.-H. l.-S. 83-92.

70. Kishi S., Yamaguchi M. Inhibitory effect of zinc compounds on osteoclast-like cell formation in mouse marrow cultures// Biochem. Pharmacol. -Vol. 48.-P. 1225-1230.

71. Klotz L.O., Kroncke K.D., Buchczyk D.P., Sies H. Role of copper, zinc, selenium and tellurium in the cellular defense against oxidative and nitrosative stress// J. Nutr. 2003. - Vol. 133. - N 5. - Suppl 1. - P.1448S-1451S.

72. Knights R.J. Processing and evaluation of the antigenicity of protein hydrolysates. In: Nutrition for special needs in infancy. Ed. by Lifshitz F. -NY etc.: Marcel Dekker, 1985.-P.105-115.

73. Kouremenou-Dona E., Dona A., Papoutsis J., Spiliopoulou C. Copper and zinc concentrations in serum of healthy Greek adults// Sci. Total Environ. -2006. Vol. 359. - N 1-3. - P.76-81.

74. Lahl W.J., Braun S.D. Enzymatic production of protein hydrolysates for food uses// Food Technol. 1994. - №10. - P.77-85.

75. Laurie S.H. Coordination complexes of amino acids: isomerism and dimorphism of the copper (II) complexes of phenylalanine and tyrosine// Aust. J. Chem. 1967. - Vol. 20. - N12. - P.2609-2621

76. Lee H.H , Prasad A S., Brewer G.J., Owyang C. Zinc absorption in human small intestine// Am. J. Physiol. 1989. - Vol. 256. -N 1. - P.G87-G91.

77. Litzman J., Dastych M., Hegar P. Analysis of zinc, iron and copper serum levels in patients with common variable immunodeficiency// Allergol. Immunopathol. (Madr). 1995. - Vol. 23. - N 3. - P. 117-120.

78. Lombeck I., Wilhelm M., Hafner D. Hair zinc in young children from rural and urban areas in North-Westphalia, Federal Republic of Germany// Eur. J. Pediatr. 1988. - Vol. 147. -N 2. - 179-183.

79. Lonnerdal B. Phytic acid-trace element interactions// Int. J. Food Sci. Technol. 2002. - Vol. 37. - P. 749-758.

80. Lukaski H.C. Low dietary zinc decreases erythrocyte carbonic anhydrase activities and impairs cardiorespiratory function in men during exercise// Am. J. Clin. Nutr. 2005. - Vol. 81. -N 5.- P.1045-1051.

81. Mahmoud M.I. Physicichemical and functional properties of protein hydrolysates in nutritional products.//Food technol. 1994. - P.89-95.

82. McMahon R.J., Cousins R.J. Regulation of the zinc transporter ZnT-1 by dietary zinc// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - Vol.95. - N 9. -P.4841-4846.

83. Murphy S.P., Beaton G.H., Calloway D.H. Estimated mineral intakes of toddlers: predicted prevalence of inadequacy in village populations in Egypt, Kenya, and Mexico// Am. J. Clin. Nutr. 1992. - Vol. 56. - P. 565572.

84. Naber Т.Н., van den Hamer C.J., Baadenhuysen H., Jansen J.B. The value of methods to determine zinc deficiency in patients with Crohn's disease// Scand. J. Gastroenterol. 1998. - Vol. 33. -N 5. - P. 514-523.

85. Nakamura R., Doi E. Egg processing. In: Food proteins. Processing. Applications. Ed. by Nakai S. and Modler H.W. Chichester etc.: Wiley-VCH-NY. - 2000. - 390 p.

86. Nassar M.F., Tierney T.T. Hydrolysed protein chelates. PCT Int. Appl. W087/02867. 21 May 1987, Appl. No 797871.

87. Nielsen F. Ultratrace Minerals.// In: Modern Nutrition in Health and Disease, 8th ed. Lea & Febiger, Phil., 1994. - P.269-286

88. Paik H.Y., Joung H., Lee J.Y., Lee H.K., King J.C., Keen C.L. Serum extracellular superoxide dismutase activity as an indicator of zinc status in humans// Biol. Trace Elem. Res. 1999. - Vol. 69. -N 1. - P.45-57.

89. Pallauf J., Kirchgessner M. Konzentration und Verteilung des Zinks im Organismus// Z. Tierphysiol., Tierernaehrg. u. Futtermittelkde. 1971. -Bd. 28.-S. 121-128.

90. Parge H.E., Hallewell R.A., Tainer J. A. Atomic structures of wild-type and thermostable mutant recombinant human Cu,Zn superoxide dismutase// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992. - Vol. 89. -N 13. - P. 6109-13.

91. Pettit L.D., Robbins R.A. Metal-peptide formation. In: Handbook of Metal-Ligand interactions in Biological Fluids. Bioinorganic chemistry. Ed. by G. Berthon. Marcel Dekker, Inc. 1995.- Vol. 1. - P.636- 647

92. Pfaffl M.W., Windisch W. Influence of zinc deficiency on the mRNA expression of zinc transporters in adult rats// J. Trace Elem. Med. Biol. -2003.-Vol. 17. -N 2.- P.97-106.

93. Pinna K., Woodhouse LR., Sutherland В., et al. Exchangeable zinc pool masses and turnover are maintained ih healthy men witn low zinc intake// J. Nutr. 2001.- Vol. 131. - N 9. - P.2288-2294.

94. Powell S.R. The antioxidant properties of zinc// J. Nutr. 2000. - Vol. 130. - N5. - 5 Suppl.-P. 1447S-1454S.

95. Prasad A.S. Clinical, biochemical and nutritional spectrum of zinc deficiency in human subjects: an update// Nutr. Rev. 1983. - Vol. 41. - N 7.-P. 197-208

96. Prasad A.S. Laboratory diagnosis of zinc deficiency// J. Am. Coll. Nutr. -1985.-Vol. 4.-N6.- P. 591-598.

97. Prasad A.S., Cossack Z.T. Neutrophil zinc: an indicator of zinc status in man// Trans. Assoc. Am. Physicians. 1982. Vol. 95. - P. 165-76.

98. Roth H-P. Development of alimentary zinc deficiency in growing rats is retarded at low dietary protein levels// J. Nutr. 2003. - Vol. 133. - 22942301.

99. Russel R.M., Сох M.E., Solomons N. Zinc and the special senses// Ann. Int. Med. 1983. - Vol. 99. - P. 227-239.

100. Ruz M., Cavan K.R., Bettger W.J., Gibson R.S. Erythrocytes, erythrocyte membranes, neutrophils and platelets as biopsy materials for the assessment of zinc status in humans// Br. J. Nutr. 1992.- Vol.68. -N2.- P. 515-527.

101. Sandoval M., Henry P. R., Ammerman С. В., Miles R. D. and Littell R. C. Relative bioavailability of supplemental inorganic zinc sources for chicks// J. Anim. Sci. 1997. - Vol 75. - Issue 12. - P. 3195-3205.

102. Sandstrom В., Daviddson L., Cederblad A., Lonnerdal B. Oral iron, dietary ligands and zinc absorption// J. Nutr. 1985. - Vol. 115. - N 3- P. 411-414.

103. Saxena I., Tayyab S. Protein proteinase inhibitors from avian egg whites// Cell. Mol. Life Sci. 1997. - Vol. 53. - P. 13-23.

104. Sian L., Mingyan Y., Miller L.V. Zinc absorption and intestinal losses of endogenous zinc in young Chinese women with marginal zinc intakes// Am. J. Clin. Nutr. -1996. Vol. 63. - N3. - P. 348-353.

105. Sigel H. Stability, structure and reactivity of mixed ligand complexes in solution// Coordination chemistry-20 (IUPAC)// Ed. by D.Banerja -Oxford Pergamon Press.- 1980. P.27-45.

106. Songchitsomboon S., Komindr S. Serum zinc and copper in healthy adults living in Bangkok and surrounding districts// J. Med. Assoc. Thai. 1996. -Vol. 79. -N 9.-P.550-557.

107. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity. Food allergy and intolerance. London e.a. - 1987. - P.286-300.

108. Sullivan V.K., Burnett F.R., Cousins R.J. Metallothionein expression is increased in monocytes and erythrocytes of young men during zinc supplementation// J. Nutr. 1998. - Vol. 128. -N 4. - P. 707-713.

109. Tan I.K., Chua K.S., Toh A.K. Serum magnesium, copper, and zinc concentrations in acute myocardial infarction// J. Clin. Lab. Anal. 1992. -Vol. 6. -N 5. -P.324-328.

110. Thakur S., Gupta N., Kakkar P. Serum copper and zinc concentrations and their relation to superoxide dismutase in severe malnutrition// Eur. J. Pediatr. 2004. - Vol. 163. - N 12.- P.742-744.

111. Thiele D.J. Metal-regulated transcription in eukaryotes// Nucleic Acids Res. 1992.-Vol. 20.-N6.-P. 1183-1191.

112. Thomas E.A., Bailey L.B., Kauwell G.A., Lee D.Y., Cousins R.J. Erythrocyte metallothionein response to dietary zinc in humans// J. Nutr. -1992.- Vol. 122. N 12.- P.2408-2414.

113. Trace elements in human nutrition and health/ World Health Organization. - Geneva. - 1996. - 343 p.

114. Utermohlen V. Diet, nutrition, and drug interactions.// In: Modern Nutrition in Health and Desease/ Eds. M.E.Shils, J.A.Olson, M.Shike, A.C.Ross: Baltimore, MD, Williams & Wilkins, 1999. - 1620P.

115. Watzke H.J. Impact of processing on bioavailability examples of minerals in foods// Trends Food Sci. Technol. 1998. - N9. - 320-327.

116. Wedekind K.J., Lewis A.J., Giesemann M.A., Miller P.S. Bioavailability of zinc from inorganic and organic sources for pigs fed corn-soybean meal diets. J. Anim. Sci. - Vol. 72. - P. 2681-2689

117. Weigle W., Cochrane G., Dixon F. J. Immunol. 1960. Vol. 86. P. 469475.

118. Wellinghausen N, Rink L. The significance of zinc for leukocyte biology// J. Leukoc. Biol. 1998.- Vol. 64. - N 5.- P. 571-577.

119. Windisch W. Development of zinc deficiency in 65Zn labeled, fully grown rats as a model for adult individuals// J. Trace Elem. Med. Biol. 2003,-Vol. 17. -N 2.- P.91-96.

120. Wood R.J. Assessment of marginal zinc status in humans// J. Nutr. -2000.- Vol. 130. 5S Suppl.- P.1350S-1354S.

121. Wuehler S.E., Peerson J.M., Brown K.H. Use of national food balance data to estimate the adequacy of zinc in national food supplies: methodology had regional estimates// Public Health Nutr. 2005. - Vol. 8. - N 7. - P. 812-819.

122. Yamaguchi M., Igarashi A., Uchiyama S. Bioavailability of zinc yeast m rat: stimulatory effect on bone calcification in vivo// J. Health Sci. 2004. -Vol. 50.-N1.-P. 75-81.

123. Zalewski P.D., Forbes I.J., Giannakis C. Physiological role for zinc in prevention of apoptosis (gene-directed death)// Biochem. Int. 1991. -Vol. 24 -N 6. - P.1093-101.

124. Zhou J.R., Canar M.M., Erdman J.W. Bone zinc is poorly released in young, growing rats fed marginally zinc-restricted diet// J. Nutr. 1993. -Vol. 123.-P. 1383-1388.

125. Zhou S., Piao J., Xu J., Yang X. Research on some enzyme activities in the assessment of zinc nutritional status of growing rats// Wei Sheng Yan Jiu. -1999.- Vol. 28. -N 5. P.283-285

126. Zimmermann M., Burgerstein L. Mikronaehrstoffe in der Medizin. Praevention und Therapie. Stuttgart: Karl F. Haug Verlag, 2003. - 304S.

Информация о работе

Мунхуу Баяржаргал
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм цинка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы