Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на прокариотические клетки

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Пронина, Елена Александровна, Волгоград

/

саратовский государственный медицинский

университет им. в.и. разумовского

(ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России»)

На правах рукописи

Ж

05201100385 Г

ПРОНИНА Елена Александровна

влияние электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на прокариотические клетки

03.02.03-микробиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Шуб Г.М.

Саратов - 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ............................................................5

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................6

Глава 1. ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ ВОЛНЫ.....................................................17

1.1. Основные характеристики электромагнитных волн...............................17

1.2. Применение электромагнитного излучения в медицине.......................27

1.3. Влияние электромагнитного излучения на микроорганизмы................61

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................69

2.1. Штаммы, использованные в работе..........................................................69

2.2. Питательные среды и реактивы................................................................69

2.3. Характеристика прибора — панорамно-спектрометрического комплекса - генератора ЭМИ..................................................................70

2.4. Методики облучения культур...................................................................89

2.5. Определение МПК антибиотиков.............................................................90

2.6. Получение антибиотикочувствительных мутантов Е. coli j 53 (RP-1), Е. colij 53 (R 100.1)...................................................................................91

2.7. Определение активности ферментов антиоксидантной активности бактерий......................................................................................................92

2.8. Определение продуктов ПОЛ: малонового диальдегида и диеновых конъюгатов.................................................................................................94

2.9. Определение гемолитической активности бактерий..............................95

2.10. Определение протеолитической активности бактерий........................96

2.11. Определение вирулентности (LD50) бактерий.......................................96

2.12. Моделирование экспериментальной раневой инфекции.....................97

2.13. Методика получения биопленок P. aeruginosa......................................99

2.14. Методы статистической обработки........................................................99

Глава 3. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЧАСТОТАХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ И ИЗЛУЧЕНИЯ ОКСИДА АЗОТА И АТМОСФЕРНОГО КИСЛОРОДА НА ДИНАМИКУ РОСТА И УРОВЕНЬ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ.............100

3.1. Влияние электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на динамику роста бактерий.........................................................100'

3.2. Влияние электромагнитного излучения«на частотах молекулярных

спектров поглощениями излучения атмосферного кислорода и<оксида азота на уровень устойчивости грамположительных и грамотрицательиых бактерий к антибиотикам с различным' механизмом действия..............................................................................111

3.2.1. Влияние электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на уровень устойчивости Е. со1гк цефотаксиму и гентамицину..........................................................116

3.2.2. Влияиие электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного5 кислорода и оксида азота на уровень устойчивости P. aeruginosa

к амикацину и цефтазидиму...........................................................116

3.2.3. Влияиие электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на уровень устойчивости S. aureus к линкомиципу и оксациллину.........................................................117

3.3. Влияние электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на экспрессию генов лекарственной устойчивости...................119

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЧАСТОТАХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ И ИЗЛУЧЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО КИСЛОРОДА И ОКСИДА АЗОТА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАИТНОЙ ЗАЩИТЫ БАКТЕРИЙ И ПРОДУКТЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ................................122

4.1. Влияние электромагнитного излучения на частоте молекулярного

спектра поглощения и излучения атмосферного кислорода на активность ферментов антиоксидантной защиты бактерий...............131

4.2. Влияние электромагнитного излучения на частоте молекулярного-спектра поглощения и излучения оксида азота на активность» ферментов антиоксидантной защиты бактерий...................................136

4.3. Влияние электромагнитного излучения на частоте молекулярного

спектра поглощения и излучения на частоте атмосферного кислорода и оксида азота на показатели перекисного окисления липидов.........141

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЧАСТОТЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ И ИЗЛУЧЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО КИСЛОРОДА И ОКСИДА АЗОТА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ.........................................................................................155

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЧАСТОТАХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ И ИЗЛУЧЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО КИСЛОРОДА И ОКСИДА АЗОТА IIA ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ

БИОПЛЕНОК Р. AERUGINOSA......................................................182

6.1. Продукция факторов вирулентности Р. aeruginosa...............................185

6.2. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий Р. aeruginosa в зависимости от их фенотипических характеристик.......188

6.3. Интенсивность образования биопленок Р. aeruginosa при воздействии электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота... 189

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................193

ВЫВОДЫ:...............................................................................................................208

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................210

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

N0 оксид азота

АФК активные формы кислорода

ГГц гигагерц

гзт гиперчувствительность замедленного типа

дк диеновые конъюгаты

ик инфракрасный

квч крайне высокие частоты

КИУ коэффициент ингибирования устойчивости

МДА малоновый диальдегид

М.К. микробные клетки

мпк минимальная подавляющая концентрация

мспи молекулярный спектр поглощения и излучения

пмп постоянное магнитное поле

пол перекисное окисление липидов

Ш1М плотность потока мощности

РФК реактивные формы кислорода

свч сверхвысокие частоты

сод супероксиддисмутаза

ТГц терагерц

УВЧ ультравысокие частоты

эмв электромагнитные волны

ЭМИ электромагнитное излучение

эмп электромагнитное поле

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Важность исследований биологического действия электромагнитного излучения (ЭМИ) в настоящее время ни у кого не вызывает сомнений. С каждым годом растет число публикаций, посвященных данной проблеме и появляются все новые и новые идеи использования элекромагнитного излучения в медицинских и биотехнологических целях (Бецкий О.В., 2000; Бецкий О.В., Яременко Ю.Г., 2002; Бецкий О.В., Лебедева H.H., 2005; Ефремов Ю.И., Кревскип М.А., 2007; Кряжев Д.В., Смирнов В.Ф., 2009).

Показано, что ЭМИ способно оказывать воздействие практически на все известные типы клеток. В течение последних лет сформулирован ряд гипотез о возможных механизмах действия ЭМИ на биологические системы (Ситько С.П., Ефимов A.C., 1993; Девятков Н.Д., Голант М.Б., Бецкий О.В., 1991; Афромеев В.И., Субботина Т.Н., Яшин A.A., 1997, 1998; Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., 1999; Хадарцев A.A., 1999; Бецкий О.В., Девятков Н.Д., Лебедева H.H., 2000; Бецкий О.В., 2004; Бецкий О.В., Лебедева H.H., Котровская Т.И., 2005; Борисенко Г.Г., Полников И.Г., Казаринов К.Д., 2007; Гапеев А.Б. и соавт., 2007; Казаринов К.Д., 2008; Fröhlich Ы, 1968; Grundler W. et al., 1992; Kaiser N., Squires G., Broadhurst Т., 1995), однако проблема изучения влияния нетеплового действия ЭМИ крайне высоких частот (КВЧ) на клетки и организм в целом остается открытой.

Одним из актуальных направлений современной

электромагнитобиологии является исследование физико-химических механизмов действия электромагнитного излучения на биологические системы различного уровня организации. Некоторые ЭМИ хорошо известны и давно используются, например ультравысокочастотное (УВЧ), сверхвысокочастотное (СВЧ), инфракрасное (ИК) и ультрафиолетовое (УФ)

излучения. ЭМИ других частотных диапазонов, например КВЧ, исследуются и применяются сравнительно недавно.

Менее всего оказался изучен диапазон частот 1011—1014 Гц (терагерцовый диапазон), иногда его называют «черной дырой».

Терагерцовые волны (ТГц-волны) лежат в диапазоне от сотен терагерц (длины волн более 3 мм) до сотен-гигагерц (с длинами волн от 3 до 10'мкм), то есть между областью СВЧ микроволн и инфракрасным диапазоном.

Освоение этой так называемой «терагерцовой щели» в спектре электромагнитных волн привлекает к себе большое внимание исследователей (Nagai M., Tanalca К., Ohtake H. et al., 2004; Carter S.G., Cerne J., Sherwin M.S., 2007; Takazato A., Kamakura M., Matsui T. et al., 2007; Dexheimer S.L., 2007; McLaughlin C.V. et al., 2008; Sartorius B. et al., 2008). Интерес к данному диапазону связан с перспективами широкого применения терагерцового излучения в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Терагерцовый диапазон частот интересен прежде всего тем, что именно в нем находятся молекулярные спектры поглощения и излучения (МСПИ) различных клеточных метаболитов (NO, СО, активные формы кислорода и др.) (Башаринов А.Е. и соавт., 1968; Мериакри В.В., 2002; Бецкий О.В., Креницкий А.П., Майбородин А.В. и соавт., 2003; Rothman L.S., Barbe А., Chris Benner D. et. al., 2003).

При электромагнитном облучении энергия излучения расходуется на переходы молекул из одного энергетического состояния в другое. Экзогенное воздействие ЭМИ приводит к изменению вращательной составляющей полной энергии молекул (Бецкий О.В., Девятков Н.Д., Кислов В.В., 1998; Бецкий О.В., Лебедева Н.Н., 2001; Бецкий О.В., Кислов В.В., Лебедева Н.Н., 2004). При совпадении частоты проводимого облучения с частотой вращения полярных молекул возможна перекачка энергии излучения молекуле, сопровождающаяся увеличением вращательной

кинетической энергии, что влияет на ее реакционную способность (Бецкий О.В., Девятков Н.Д., Кислов В.В., 1998).

Известно, что вращательные молекулярные спектры резонансного поглощения и излучения> молекул важнейших клеточных метаболитов (N0, СО, Оз, С02) находятся именно в ТГц диапазоне (Башаринов А.Е. и соавт., 1968; Креницкий А.П., Майбородин A.B., Бецкий О.В. и соавт., 2003; КиричукВ.Ф., Креницкий А.П., Майбородин A.B. и соавт., 2006; Rothman L.S., Barbe A., Chris Benner D. et al., 2003).

В настоящее время одной из актуальных задач биологии является изучение процессов, в которых участвуют активные короткоживущие молекулы, являющиеся регуляторами на различных уровнях организации живых организмов (Шумаев К.Б., Космачевская О.В., Топунов A.B., 2008). К таким соединениям в первую очередь относятся оксид азота (NO) и его1 производные (Снайдер С.Х., БредтД.С., 1992; Марков Х.М., 1996; Васильева C.B., 2007; Moneada S., Palmer R.U., Higgs E.A., 1991; Ignarro L.G., CirinoG., CasiniA., 1999; Moneada S., 1999; Hemish J. etal, 2003; Murad F., 2003 и др.). В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов (Roman L., Martasek P., 2002; Stuart-Smith К., 2002; Formoso G., Chen H., Kim J.A., 2006; Gladwin M.T., 2006). Кроме сигнальной роли NO (Глянько А.К., Митанова Н.Б., Степанов A.B., 2009; Дмитриев А.П., 2004; и др.), актуальной областью исследования являются реакции оксида азота с активными формами кислорода (АФК) (Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., 2009). Возникающие в этих реакциях активные соединения - пероксинитрит, диоксид азота и др. - важные компоненты иммунного ответа в организме человека и животных, которые также участвуют и в процессах апоптоза. С другой стороны, изменение концентрации оксида азота под действием различных свободных радикалов и других высокореакционных интермедиатов служит важнейшим фактором, влияющим на

физиологическую активность NO, в том числе на сигнальную функцию этой молекулы. Кроме того, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом (Петрович Ю.А., Гуткин Д.В., 1986; Семенов В.Л., 1989; Дубинина Е.Е., 1998; Петрович Ю.А., 2001; Заббарова И.В., 2004; Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., 2009; Меньщикова Е.Б., ЛанкинВ.З., Зенков Н. К., 2006; Richter С., 1987; Pattison D.I. et. al. 2002 и др.).

Вышеизложенное диктует необходимость изыскания неинвазивных физических регуляторов образования и секреции эндогенного оксида азота на основе естественных физиологических процессов. Перспективным с этой точки зрения является использование ЭМИ на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота (Киричук В.Ф., Антипова О.Н., Креницкий А.П., 2004; Киричук В.Ф., Иванов А.Н., Антипова О.Н. и соавт., 2005).

Важнейшим регулятором биологических процессов в клетках является также кислород в его реактивных формах (РФК). Именно РФК рассматриваются как одна из систем внутриклеточных и межклеточных мессенджеров (Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996; Khan A.U., Wilson Т., 1995 и др.).

Известно, что при облучении на частотах биологически активных молекул из кислорода образуется его реактивные формы (Майбородин A.B., Креницкий А.П., Тупикин В.Д. и соавт., 2001). Можно полагать, что при использовании частот МСПИ молекулярного кислорода (Ог) эти процессы будут активизироваться.

Число работ, посвященных исследованию воздействия электромагнитного излучения на микроорганизмы сравнительно невелико, и они в основном проводились на клетках дрожжей (Голант М.Б., Кузнецов А.Г., Божанова Т.П., 1994; ГамаюроваВ.С., Крыницкая А.Ю., Астраханцева М.Н., 2003; Вызулина В.И., 2008; Grundler W., Jentzsch U.

et al., 1988; Grundler W., Kaiser F. et al., 1992), актиномицетов, цианобактерий (Брюхова A.K., 1991; Курлаев П.П., Чернова O.JI., Киргизова С.Б., 2000; Гуляев Ю.В., Тамбиев А.Х., 2003; Иванова Ю.В., 2004, 2007; Webb S.J., Dodds D.D., 1969; Gandhi O.P., 1983; Belyaev I.Ya. et al., 1992, 1993, 1994, 2000; Belyaev I.Ya., 2005). Единичные сообщения посвящены изучению действия электромагнитного.излучения СВЧ-диапазона с частотами 2,45 ГГц и 10 ГГц на условно-патогенные бактерии (Иванова Ю.В., Гусак И.В., 2009).

В последние десятилетия в результате фундаментальных исследований в России было создано новое перспективное направление медицины -КВЧ-терапия (крайне высокочастотная терапия, микрорезонансная терапия, миллиметровая терапия). Использование этого метода в терапии ряда заболеваний человека является одним из активно развивающихся направлений современной клинической медицины.

Лечение гнойно-воспалительных заболеваний и послеоперационных осложнений остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Анализ отечественных и мировых проспективных исследований свидетельствует о том, что число этих заболеваний не имеет тенденции к снижению, особенно у лиц молодого и среднего возраста, что обуславливает социальную значимость проблемы. Рост числа больных с осложненным течением острых воспалительных заболеваний, полимикробное инфицирование, резистентность к антибактериальной терапии, быстрое развитие септического шока и полиорганной недостаточности диктует необходимость совершенствования известных и поиска новых методов лечения гнойно-воспалительных заболеваний и послеоперационных осложнений.

Немедикоментозные методы лечения ряда заболеваний не только альтернативны лекарственным, но в ряде случаев имеют значительные преимущества как методы функциональной регулирующей терапии. Предложено много средств и методов, ускоряющих репаративно-

регенераторные процессы в ранах. Однако проблема в целом остается еще далекой от своего разрешения. Новые надежды появились в связи с внедрением в гнойную хирургию физико-химических методов терапии.

В настоящее время наблюдается переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания. Накоплено достаточно данных о механизмах, посредством которых осуществляются внутрипопуляционные, межвидовые и межштаммовые контакты у микроорганизмов, а также их взаимодействие с организмом хозяина. Процесс внутрипопуляционного информационного обмена бактериальных клеток между собой получил название «кворум сенсинг» (quorum sensing) (Greenberg Е., Winans S., 1996; Bauer W.D., Robinson J.B., 2002). Одним из механизмов «кворум сенсинга» является формирование биопленок.

Открытие и изучение биопленок является важным достижением микробиологии последних 20 лет. Все представители нормальной микрофлоры в организме человека существуют в составе биопленок. С их образования также начинается развитие любой инфекции (ТецВ.В., 1998; ТецВ.В. и соавт., 2008; Tetz V.V., 1996, 2004; Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P., 1999; O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R., 2000; Costerton W., Veeh R., Shirtliff M. et al., 2003).

Существование бактерий внутри биопленок обеспечивает им много преимуществ по сравнению с изолированными клетками. Для практической медицины особенно важно, что бактерии в биопленках имеют повышенную выживаемость в присутствии агрессивных вещ�