Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ 5-БРОМДЕЗОКСИУРИДИНА НА ОБРАЗОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИИ ХРОМОСОМ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ РАЗНЫХ ЭНЕРГИЙ

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ 5-БРОМДЕЗОКСИУРИДИНА НА ОБРАЗОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИИ ХРОМОСОМ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ РАЗНЫХ ЭНЕРГИЙ"

всесоюзный научно-исследовательский институт

сельскохозяйственной радиологии__

'На правах рукописи

ЖЛОБА Анатолий Анатольевич

УДК 57.04(.02+ 576.312.36

ВЛИЯНИЕ 5-БРОМДЕЗОКСИУРИДИНА НА ОБРАЗОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИИ ХРОМОСОМ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ РАЗНЫХ ЭНЕРГИИ

03,00.01 — радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск — 1984

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте медицинской радиологии АМН СССР.

доктор биологических .наук, профессор Н. В. Лучник.

Официал ькыеонпонен ты: доктор биологических наук Л. В. Севанькаев, кандидат биологических наук Е. Я. Зяблицкая.

Ведущая организация — Институт биологической физики АН СССР (г. Пущино, Московской.обл.)..

Защита состоится 12 марта 1984 г. в 11час. на заседании специализированного Совета К 120.81.01 во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии МСХ СССР. (249020, г.. Обнинск, Калужской обл., ВНИИСХР). . - - -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института' сельскохозяйственной радиологии.

Научный руководитель:

Автореферат разослан

февраля

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Актуальность темы.

Структурные изменения хромосом являются доеных показателен степени поражения клеток мутагенами и канцерогенами. Дэ недавнего времени-исследовали почти исключительно аберрации хромосом-структурные изменения, многие из которых приводят к репродуктивной гибели клеток /Н.В.Лучник, I960; Iremp , 1981/. Появление в середине 70-х годов методики дифференциальной окраски 5-Сроыдезоксиуридин iб-ЕДУ) - замешенных сестрински* хрома-тид/Н.А.Еголзша, А.Ф.Захаров, 1972; Wolff , Тетту ,1974/ открыло возможности для выявления с большой точность«) реципрок -ных обменов между сестринскими хроыатидаыи (СХО) - структурных изменений,, не нарушавших морфологически* признаков хромосом и связанных с нелетальной реакцией клеток на действие мутагенов / Hageaawa , litti« , 1981/. Закономерности образования СХО представляет значительный интерес для радиобиологии, поскольку способствуют формировании более полной картины действия радиации на клетку с учетом летального и нелетального эффектов радиации.

В настоящее время СХО широко используются в качестве тест-системы на мутагенную активность химических вепеств /latt et »1., 1981/, в то же время способность радиации индуцировать СХО практически не изучена. В частности, не выяснен вопрос о том, насколько применение 5-БДУ влияет на получаете датаме об абсолютном и относительном изменении частоты СХО под действием радиации.

Цель и задачи исследования.

В настоящее время все исследования СХО проводят, используя методику дифференциальной окраски 5-ЕДУ замешенных сестринских хроыатид, Этому методу присуши две особенности, которые могут повлиять на точность исследования, в частности, при изучении эффекта радиации.

Во-первых, при анализе СХО, выявляемых методом дифференциальной окраски; учитывается суммарное количество обменов, сформировавшихся в двух циклах деления клеток, предшествующих фиксации, . а радиацией воздействуют имцульсно во время цикла, непосредственно предшествудаего фиксации* Таким образом, в ходе иссле- ' дования влияния радиации на выход СХО получаются искаженные < '* '/данные, поскольку индуцированный уровень сравнивается с завышенным контрольным уровнем.' Очевидно, что, получив возможность*раа-

" ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моок. еельскохоз. академии

личать СХО» сфсриировавпиеся в разних циклах деления клеток, мохно определять истинное значение относительного уровня индукции СХО радиацией. ■

Во-вторых, прп шлвлении CXD методом дифференциальной ограс-хи истояьэутэт галоген-содерхакий «налог нормального основания ДНК - Б-БДУ, который сам является ивдуктором СХО /vrolff, Perry, 1975/ к радио сен см били зато ром /Ш.0хада» 1974/. Оказывая влияние на уровень СХО в контрольных вариантах, &-ЗД7 искажает истинный спонтанный уровень СХО. Кроне того, необходимо учитывать влияние Б-ВДУ» связанное со способность» этого вевеотва модифицировать действие иокизируетей радиации на клетку* *

Поэтому цель настоящего исследования состояла в разработке адекватного метод* идентификация СХО, сфоржровавшихся в разных циклах» и изучении количественных закономерностей возникновения структурных изменений хромосом щж действия редкоионмэкрутаей ■ радиация разной енергжи на кяетхя, инкубированные при разних концентрациях Б-ЩЦУ. Для соло о там е нмя структурных изменения, формх-рупвихся по разным механизмам /latt , 1501/, следовало провести исследования не только СХО, но также исследовать влияние 5-ВДУ на образование аберраций хромосом: хроматидхых разрывов.

Поставленная цель определила главные задачи я »талы исследований:

I* Разработать пригодный для широких исследования метод выявления СХО, сформировавшихся в разных циклах,

2. Оценить спонтанный уровень СХО.

3. Исследовать СХО при воздействии радиацией разных энергий на клетки, инкубированные пря различных концентрациях б-ВДУ.

■ 4. Вменить закономерности образования хрематидных разрывов в громатидах с разным замещением тимидина на 5-ЗДУ при действии радиации разной анергии. ,

Научная новизна.

С помощь» разработанного метода выявления СХО* сфорировав-- пюсся в разных циклах деления клеток* получены ноше данные о закономерностях действия радиации на хромосош. Показано, что при низких концентрациях 5-ЦДУ <I0~7lf) в клетках китайского хомячка наблвдаются только спонтанные СХО <0,10 СХО на хромосому в течение каддого цикла репликации). Впервые показано, что способность ионизирующего излучения индуцировать СХО зависит от его энергии, причем по эффективности в порядке возрастания следует:

гамма-излучение ^Со <Е»1,2б МзВ), жесткое рентгеновское излучение (Еэф.«« 176 кэВ), кжгкое рентгеновское излучение (Еэф-бЙ гэВ). Впервые показ енэ, что редиосенсибилкзируекзд спосрбкестъ 5-ЕДУ тшв зависит от анергии излучения. Оря действии HJtretojro рентгеновского излучения (Ееф,- 62 кэВ) 5-БДУ достоверно се^сиблад-зирует генетический материал ж образованию СХО, а для четкого рентгеновского излучения (Еэф.- 176 кэВ) я гамма-излучения мСо еффект близок к аддитивному, схладываиягиуся из числа СХО, индуцированных 5-БДУ и радиацией. В исследованиях относительной радиочувствительное« сестринских хроыатид с раздам замещением тшмдкка на было обнаружено, что относительная частота хромагадных разрывов в хроматидах в разным включением 5-БДУ загноит от внергии излучения! при действии жесткого рентгеновского яадучения (Еэф. > 100 хэВ) и гамма-излучения (Е-1,26 ИэВ) частота хроматидкых pospuso в в хроиатидах с разным ввмевением тюлщина ка

приблизительно одинакова, а мягкое рентгеновское излучение (Еэф.<100 х»В) индуцирует хроматидю» разрывы в больней частотой в хрокатодах а большим включением 5-БДУ. Указанные фахты свидетельству» с том, что б-ЕДУ сенсибилизирует генетический материал к образование структурных изменений хромосом при действии мягкого рентгеновского излучения. Впервые показано, что старый я новый генетячеокхй материал распределяется неслучаКкш образом не только в эцкоредупжкцировангегх хромосомах, но и при нормальных условиях репликации*

Раучм^ц.рркчутгезская значимость.

В работе «первые систематически исследовано влияние Б-БДУ на ваход структурных изменений хромосом, индуцированных радиацией. Обнаружено, что »ффективность радиосенсибклизатора (Б-БДУ) зависит от енергин используемого излучения..В результате исследования был разработай методический подход, позволявший определять с помогав прямого наблвдения спотакный уровень СХО; были подобраны условия, в которых влияние 5-БДУ на эффект радиации сведено к минимуму и разработан метод выявления СХО, сформировавшихся в раз-ш циклах, который позволяет проводить более корректную оцэкку изменения частоты СХО при воздействии мутагенов; было обнаружено, что все исследованные виды излучения являются сильными индукторами СХО, повмшаиаими выход этих структурой изменений более, чем в два раза.

Разработанный метод учета числа CSD, сформировавшихся я последовательных митстических циклах, и выясненные закономерности действия 5-БДУ на образование СТО должны найти широкое применение при практическом использовании СХО в качестве теста на мутагенную активность» Объем кабдум.

Диссертация состоит из введения, обзора данных литература, описания материала и методов исследования, раздела экспериментальных данных и обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков» 14 таблиц, список цитированной литературы включает 202 работы, из них 19 работ отечественных и 183 иностранных авторов*

штвдод и методе* ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объект исследовании. В исследованиях использован субклон анеу-аяондных клеток отамма 237 липки b1 Ida тар 28, взятых из подкожно Я соединительной ткани самки китайского хомячка исходной линии Don с (медальное число хромосом - 16).

2. Культивирование клеток и приготовление препаратов. В настоящих исследованиях применяли два метода культивирования и фиксации клеток. Один из них - метод культивирования клеток в чашках Летри и фиксации непосредственно на ростовой поверхности Сил разработан нами для идентификации СХО, сформировавшихся в разных циклах; этот метод является оригинальной частью проведенных исследований, поэтому он изложен в разделе "Экспериментальная часть и обсуждение". Кроме того, была использована стандартная методика культивирования клеток во флаконах Карреля, которая применялась в ис- * следованиях индугррованных радиацией аберраций хромосом. Клетки кулътивирс вали во флаконах Карреля на среде Игла с 20 % сыворотки крупного рогатого скота. Выращенные в течение двух циклов в среде, содержащей 5-ВДУ, клетки суспендировали, пшотонизировали в 0,075 11 растворе KCl , фиксировали в смеси абсолютного этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), после трех смен фиксатора суспенсип концентрировали и раскапывали по предмета* стеклам.

3. Дифференциальная окраска препаратов. № использовали модификацию метода дифференциальной окраски, предложенную М.М.Антошиной

и H.A.Порядковой /1978/. Препараты смачивали раствором zxSSC (SO % 0,3 М KaCi t ЬО % 0,03 Ы цитрата натрия) и облучали в течение 20 мин. ультрафиолетовыми лучами, промывали я сушви яря ком-

наткой температуре » течение 7 шш и остатки красителя смывала струей водопроводной вода.

4» Используемые види изучения. В качестве источников излучения использовали рентгеновские аппараты Рум 7 и Рум 17 и гамма-тера-певтичесюсй аппарат "Луч-!" с радиоактивным табалътом. Параметры используемых вило в излучения пр*ведеш в таблице I.

Таблица I

Характеристики используемых видов излучения

;Наврлженяе:Слой поло-: : Сила ¡Эффективная

Вид иэлуче- ;на трубке :винного ос: Фкхьтр I тока : энергия

ни* : кВ ¡давления : мм : мА. : (кэВ) _!_• ;_I__;_

- - - 1260 40 1,07<2£ 20 23

рентгеновское

то же 150 0,52 С* Э 0£ 10-15 62

то хе 200 4,5 Си. 3,2Си. 10-15 . 176

то же 200 3,15(11 2 Си ТО * 137

ЙСШТШНТДЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСИДШИЕ Метод выявления (ЯР. сДорютовавиято^ р раз га/г сиклах. Одной кэ задач настоящего исследования явилась разработка метода выявления СХ0, сформировавшихся в разных циклах, ранее было известно два способа иденпфишфш СХ0» сформировавшихся в разшх циклах -анализ СХ0 в тетрапжмщшлс клетках Аау1ег , 1950/ к метод трехступенчатой окраски /М111«г »1. , 1976/. Однако недостатком первого из них является то, что клетки подвергается воздействие датостатика, который может влиял на количество СЗЙ Д^ои ,1901/, а второй трудно воспроизводим и не подходит для рутнниой работы. Нами был разработан новый простой метод выявления СЮ, сформировавшихся в .разных циклах, не требуший дополнительных воздействий на клетки. Идея метода состоит в том, что в монослойной культуре сестринские клетки должны располагаться в непосредственной близости друг от друга. При обычноЯ методике клетки суспендируются и их связь нарушается. Особенность нашего метода состоит в том, что орт всех манипуляциях с клетками от пита то низ ащи до окраски они остаются прикрепленными и стеклу и сестринские клетки располагаются по соседству. При этом СХО, которые возникли в первом цикле к удвоились после 2 циклов инкубирования в могут.

- б -

быть выявлены в парах сестринских клеток как'парные ("близнецовые") СХО; СХО, сформировавшиеся во втором цикле, наблюдаются как одиночные, не имешие парт. Одиночные СХО, расположенные в гомологичных лохусах, могут быть неправильно учтены как близнецовые,, т.е. оказываются ложными близнецовыми СХО. 1& провели оценку точности учета одиночных и близнецовых СХО, определив для исследованного объекта влияние степени спирализации хромосом, особенностей ка-риопша и других факторов на точность учета одиночных и близнецовых СХО, и получили следутаую оценку числа ложных близнецовых СХО на пару сестринских клеток: '

Л/-402/Л*, (I)

где п. - среднее число одиночных СХО на клетку. Кроме того, нам удалось снизить минимальную концентрацию Б-^ЕДУ» при которой возможна хорошая дифференциальная окраска. До настоящих исследований минимальная, используемая для выявления СХО» концентрация 5-ВДУ составляла 0,2 шг/ып (0,66'10~6Ы) /В.А.Еент, Ы.Г.Зеленин, 1933/. Повторяя несколько раз процедуру облучения препаратов ультрафиолетом, нам удалось добиться хорошей дифференциальной окраски при значительно меньшей концентрац ии 5-ВДУ (Ю"7Ы).

Зависимость сЦхода СХО от концентрации 5-ЕДУ и спонтанный уровень СХО. В первых исследованиях СХО с помощью дифференциальной окраски 5-ЕДУ-заиешенньос хромосом было обнаружено, что выход СХО зависит от хонцентращи используемого для дифференциации сестринских хроматид 5-БДУ, Однако при этом учитывалось суммарное число СХО, сформировавшихся в двух циклах. Воспользовавшись методикой фиксации-клеток на ростовой поверхности, ш исследовали зависимость выхода СХО, сформировавшихся в разных циклах от концентрации 5-БДУ. Клетки китайского хомячка культивировали - в течение двух цикловв среде, содержащей 5-ВДУ в концентрациях,варьировавших от Ю~7Ндо Для калдаой концентрации 5-БДУ проанализировали

СХО в 50 парах сестринских клеток, учитывая отдельно одиночные и. близнецовые СЮ, При используемом способе идентификации близнецовых СХО часть из них представляла собой случайно совпавшие одиночные СХО. Для оценки числа ложных близнецовых СХО пользовались формулой (I) и корректировали в соответствии с этой оценкой число СХО, сформировавшихся в первом и втором циклах. Для СХО, сформировавшихся в первом и втором циклах, а также для суммарного числа

СХО вычисляли коэффициент линейкой регрессии (рис.1). В опытах был использован широкий диапазон концентраций 5-БДУ! максимальная (5*10~®М) в 500 раз превышала минимальную (Ю~7Ш, поэтому при вычислении регрессии концентрацию 5-БДУ сыр ахали в логарифмическом масштабе, эа начало координат принимали точку, соответствующую минимальной концентрации 5-ЕДУ - 1(Г7И. В соответствии с этим эа независимую переменную принимали

ОС * С + 7 (2)

где С - концентрация 5-ЗДУ. В таблице 2 приведены уравнения регрессии. Лая всех трех линий регрессии коэффициент " £ " принимает положительные значения и достоверно отличается от нуля; тагам образом, с ростом концентрации 5-ЗДУ число СХО достоверно увеличивается. Вместе с тем, наклон кривой регрессии дм СХО второго цикла круче, чем для СХО первого цикла, то есть число СХО во втором цикле растет быстрее с ростом концентрации 5-БДУ, чем число СХО, сформировавшихся в первом цикле. При высоких концентрациях 5-ЦДУ во втором цикле образуется почти в два раза больше- СХО по сравнение с первым циклом. Это мою» объяснить тем, что 5-ЕДУ оказывает большее действие на генетический материал, обменивашийся во втором цикле, чем в первом цикле. С - одной сторон», во втором цикле 5-БДУ оказывает более длительное воздействие на генетический материал, с другой стороны, обмени вагонйся во втором цикле генетический материал содержит три модифицированные 5-ЕДУ полкнуклео-тадные цепи, а в первом - две. Вместе с тем, анализируя зависимости выхода СХО от концентрации 5-БДУ, отметки, что число СХО, образовавшихся в первом и втором циклах, при самой низкой концентрации 5-ВДУ совпадает. Кроме того, линии регрессии пересекаются в точке, соответствующей минимальной концентрации 5-БДУ- 10 Ы. Таким образом, при низких концентрациях 5-ЗДУ вероятности образования СЗЮ » первом и втором циклах совпадем, несмотря на разный состав обменивавшегося материала; отсюда следует вывод, что при низкой концентрации 5-БДУ это вевество не оказывает влияние на выход СХО и наблюдаемые СХО возникают спонтанно. Определений таким образом спонтанный уровень составляет 0,1 СХО на хромосому за один цикл репликации. Ранее епонтаюшй уровень СХО определяли, экстраполируя кривые зависимости частоты СХО от концентрации 5-ЕДУ до Нулевой концентрации 5-БДУ. 1Ь показали, что спонтанный уровень

— t , ■ -S -4

Рио.1. Зависимость выхода СХО от концентрации 5-БДУ: по оси абсцисс - логарифм концентрации Б-ЕДУ; по оси ординат - число СХО на клетку: ▼ -СХО первого цикла; v - СХО второго цикла; О - суммарное число СХО

Таблица 2

Уравнения регрессии у ■ а * Вас • для числа CXD, сформировавшихся в первом и втором циклах, и суммарного числа СХО

: :Статистические -

■ Вариант : Уравнение регрессии tпоказатели для

• н

*

СХО I цикла у -2,01+р,13+(0,30+р»09)эо СХО 2 цикла у -I,99+0,25+(1»00+0,10)х С^гммарное число у -4,00+р,33+(1,Э0+р,23)л:

Примечание: у - число СХО; х 7 .

центрация 5-БДУ,

* ; т t Р

3,38 4 <0,05

5,66 4 <0,01

5,59 4 <0,01

где С - кок-

можно определить более надежно, учитывая СХО при тех минимальных жонцентращях 5-ВДУ, которые не оказывают влияние на частоту СХО, формирушихся в первом я втором циклах.

Индукшя CXQ радиапией разных энергий. Исследование закономерностей индукции-СХО радиацией предполагает сравнение числа СХО, сформировавшихся в результате воздействии индукторов и в контроле. Поскольку частота СХО в контроле зависит от концентрации 5-БДУ, ш исследовали частоту СХО при действии радиащи на клетки, инкубированные при варьирушнх концентрациях 5-БДУ. Клетки китайского хомячка инкубировахи в течение двух вдклов в среде, содержащей 5-БДУ, и облучали в стадия S второго цикла (эа 8 часов до фиксации) ионизирующим излучением разных энергий: гамма-излучением Со, жестким рентгеновским излучением (Еэф,- 176 кзВ), мягким рентгеновским излучением (Еэф.» 62 кэВ). Поскольку радиация оказывала воздействие только во втором цикле, дли точной оценки уровня 'индукции из общего числа СТО, наблюдаемых в опыте и контроле, вычитали число СХО, сформировавшихся в первом цикле. Построили зависимости выхода СХО от концентрации Б-БДУ при воздействии различными видами излучения(рис.2),Параметры линий регрессии приве-* дены в таблице 3. Статистический анализ достоверности отличия коэффициентов регрессии по критерии Стьвдента показал, что для жесткого рентгеновского излучения и гамма-излучения коэффидаенты регрессии достоверно не отличаются от контроля, а*для мягкого рентгеновского излучения отличие от контроля достоверно с уровнем значимости р < 0,02. На основании этого можно сделать вывод, что Б-БДУ слабо влияет на индукции СТО гамма-излучением и жестким рентгеновским излучением, а при воздействии мягким рентгеновским излучением, то есть рентгеновским излучением с неотфильтрован-* ныы мягким компонентом (Еэф - 62 кэВ) число СХО, индуцированных радиацией, увеличивается с ростом концентрации Б-ВДУ. Вместе с тем, прямое сопоставление экспериментальных данных показывает,что для всех концентраций 5-БДУ наибольшее число СХО наблвдается при действии мягкого рентгеновского излучения, далее в порядке убывания вдут жесткое рентгеновское излучение и гамма-излучение Со; это подтверждается также статистическим сравнением соответствующих средних значений числа СХО с помощь» критерия Стьвдента. р^о^урстрительность хроматин, содержащих две или одну включившие 5-ЕДУ полинукяеотидные цепи. Дая того, чтобы сопоставить данные о влиянии 5-ВДУ на выход индуцированных радиацией СХО с дан-

Рис.2. Индукция СЗГО при облучении клеток радиацией разных энергий.

По оси абсцисс - логарифм концентрации 5-ЦДУ, по оси

ординат - число СТО на метку! ■ - в контроле,

О - после облучения у -излучением, ф. -жестким

рентгеновским излучением, О - мягким рентгеновским

. излучением

Таблица 3

Уравнения линий регрессии - для числа СХО,

наблюдаемых при воздействия ионизируетего излучения разных анергий

Вариант

Уравнение регрессии 1

Статистические . показатели для о

£ * т : Р

(Ц.1,99+0»25+(1.00+0,18)3: 5,66 у^,7^),36+(1,3€у>,25)Х 5.63

4

3 3

<0,01 ¿0,02 ¿0,05

Контроль Гамма-излучение

Рентгеновское ц«5,11+0,58+(1,26+0,39КС 3,22

изучение ЕЪф»17бкэВ 0

Рентгеновское Ц-6Д4-0,34+(1,93-0,22)Х 6,61 3 <0,01

излучение Еэф»б2 кэВ а

Примечание: у - число СТО; Х»(уС+7 , где С - концентрация 5-БДУ; контроль - число СХО, сформировавшихся во втором цикле.

Таблица 4

Частота разрызоз, вызванных в хроыатндах клеток. . китайского хомячка с составом ЛБ я ББ при действия рентгеновского излучения

Груша опытов ! Напряжение : на антикатоде • ¡Число про а-: Частота фрагментов на :нализитюван: 100 клеток в хроматинах :ншс клеток , * ЕВ

I í 2 ! 3 í 4 : 5

I 200 кВ (137 кэВ) 221 20,0+3,3 5б,4±4,7

150 кВ (62 кэВ) 261 40,4+4,4 82,2+6,7

П 200 кВ (176 кэВ) 288 167,4+7,2 196,9+8,3

40 кВ (23 кэВ) 95 284,2+17,3 429,5+21,3

Примечание: Во всех.опытах применялась доза I Гр, в скобках в графе 2 указана эффективная энергия излучения.

' Таблица 5

Относительная частота фрагментов, ицдуцированшх в хроматцдах состава 1Б и ББ

Эффективная • :0бшее число фраг- *. _ч *

энергия излуче- {ментов в хромата- : Отношение : кия (кэВ) : я ах : :

б)

ЛЕ-

ЕВ

X

176 137 62 23

482 '75 86 270

567 147 175 408

1:1,10+0,03 1:1,96+0,04 1:2,03+0,04 1:1,51+0,02

с 0,001 >0,05 <0,001

Примечание: Стандартная ошибка, вычислена в предположении биномиального распределения*

Результат проверки достоверности различия между

строками по критерии

ными о влиянии 5-БДУ на выход аберраций хроиосом.мы исследовали частоту индукции хроматвдных разрывов в хроыатидах разного соо-тава, содержащих две (ББ) или одну <ТБ) кодифицированные 5-ВДУ полинуклеотчдные цепи, при действии на клетки редяоионизируюшей радиации разных анергий. Клетки китайского хомячка культивировали на среде Игла с добавлением 20 % сыворотки крупного рогатого скота. После нескольких циклов ремик&ции без смены питательной среды продвижение по циклу блокировалось на стадии (?0 . Дня проведения опытов клетки переносили на свежую среду, содержа-шуп 5-БДУ в концентрации После 28 часов инкубирования

клетки облучали в дозе I Гр. Сразу же посла облучения добавляли колхицин (0,5 мкг/ыя) и через 2 часа проводили фиксацию. Результаты опытов приведены в таблице 4. В первой груше опытов учитывали только бесспорные фрагменты, во второй - тате пробелы. Поэтому абсолютные частоты фрагментов в обеих группах опытов несравнимы. Однако, больнее влияние энергии излучения на радиочувствительность видно в обоих группах опытов* Получены также -данные по относительной частоте фрагментов в хроиатидах состава ТБ и ББ (см.табл.5) при облучении лучами с разными эффективными энергиями. Как видно иэ таблицу, жесткие рентгеновские лучи с отфильтрованной мягкой частью спектра образуют разрывы в одно и двуэаметенных хроиатидах в равной пропорции (1:1). В то же время для рентгеновских лучей с неотфильтровагаыы мяткэш компонентом в хроиатидах состава БВ наблвдается большее число фрагментов, чем в хроматидах состава ТВ. Таким образом, 5-ЕДУ с большей эффективностью повышает чувствительность содержащих это вещество хроматид к действию рентгеновского излучения с мягким компонентом (энергии меньше 100 кэВ). Эти данные хорошо согласуются с данными по индукции СХО, согласно которым индукция СХО зависит от концентрации 5-ЦДУ только для мягкого рентгеновского излучения (см.предыдущий раздел).

Влияние 5-БДУ на относительное изменение числа СХО при оценке действия радиации. В настоящее время СХО широко используются .в качестве тест-системы не мутагенную активность. Для сравнения мутагенной активности различных мутагенов было предложено оценивать во сколько раз индуцированный уровень. СХО превышает спонтанный / be.it «Л а1. , 1981/. Такой подход вполне оправдан для оценки эффективности мутагенов, поскольку для большинства иэ них

(в той числе и для радиации) число индуцированных СТО прямо пропорционально дозе мутагена и сравнение индуцированного уровня СХО с контрольным мохет дать информацию, во сколько раз необходимо увеличить дозу того или иного мутагена* чтобы получить один и тот же эффект по тесту СТО. Отсвда следует, что относительное изменение частоты СХО может служить критерием относительной силы мутагенов. Ранее практически во всех исследованиях оценку мутагенной активности проводили, специально не оговаривая используемую концентрацию 5-ЕДУ, подразумевая, что концентрация этого вещества может быть любой, позволяющей добиваться хорошей дифференциальной окраски. Рассмотрим, каким образом концентрация 5-БДУ может оказывать влияние на относительное увеличение числа СТО: ,,

где у0 - число СЮ в опыте, уя - число СХО в контроле. Эта задача существенно облегчается тем, что наш было получено достаточно простое соотношение для числа СХО в зависимости от концентрации 5-ЕДУ:

где СС*+ У ; С- концентрация 5-ЕДУ. В соответствии с этим для относительного изменения частота СХО имеем:

<±к* бсос^ТЛ1 + Это выражение не зависит от концентрации 5-ЕДУ только в том случае, если * , что не выполняется для всех иссле-

дованных видов излучения. Таким образом, относительное изменение числа СТО может зависеть от концентрации 5-БДУ, Для то го, что бы в разных экспериментах для сравниваемых мутагенов эти характеристики были сопоставимы, необходимо проводить исследования при фиксированной концентрации 5-ВДУ. Естественно выбрать ту минимальную концентрацию 5-ЕДУ, при которой возможна дифференциация сестринских хроматид, и, в то же время, при которой влияние 5-ЕДУ сведено к минимуму* В наших условиях концентрация 5-БДУ, отвечавшая этим требованиям, составляет 10 Ы. Исследование влияния мутагенов на выход СХО при этой концентрации 5-БДУ позволяет, с одной стороны, наблюдать индуцированный

мутагенами уровень СХО, на который оказывает минимальное влияние 5-ЕДУ, с другой стороны, сопоставить индуцированный уровень СТО с истинным спонтанным. Для оценки эффективности мутагенов по тесту образования СХО Лат» и соавт. / I*« в* «1., 19Э1/ предложили относить к классу сильных мутагенов те из них, которые увеличивают выход СХО более, чем в два раза по сравнение о контролем. При облучении клеток в дозе I Гр» мягким рентгеновским излучением выход СХО увеличивается в 2,9 раза по сравнению со спонтанным уровнем, жестким рентгеновским излучением -в 2,4 раза, гамма-излучением - в 2,1 раза. Таким образок, согласно классификации« предложенной Латтом я ооавт. /тли «1. ,1981/, рассмотренные виды излучения попадают ь класс сильных индукто-. ров СХО.

ЗАКЛРШМЕ

Уже в первых исследованиях СХО отмечалось, что они сильно индуцирухтся химическими мутагенами и слабо - иониэирушей радиацией. Перри и Звано / Р»ггу , Ягапа , 1975/ установили,что относительно большая доза 4 Гр лишь удваивает число наблюдаемых ж контроле СХО. С тех пор атот вопрос практически не рассматривался. Основная трудность при оценке способности мутагенов ин- -дуцяроватъ СХО заключается в отсутствии адекватных методов выявления спонтанных СХО. Исследование эффекта радиации оуиест-венно осложняется тем, что вещество, применяемое для выявления СХО С5-ВДУ),оказывает влияние не только на спонтанный уровень. СХО, но способно таксе модифицировать выход СХО, индуцированных радиацией.

Нами был разработан новый простой метод, позволяющий снизить в пять раз те минимальные концентрации 5-БДУ, при которых получается устойчивая дифференциальная окраска, и кроме того, даяший возможность выявлять СХО, сформировавшиеся в разных циклах. С помощь» этого метода было показано* что даже по критериям, разработанным для химических мутагенов, радиация попадает в класс сильных индукторов СХО, и при подборе соответствующих условий СХО могут быть использованы в качестве тест-системы на мутагенную активность. Разработанный нами метод не только дает возможность исследовать о повышенной' точностью влияние радиации на выход СХО, но может также оказаться полезным для решения других более обкхх задач. В частности, эта методика была использована нами в исследованиях механизма репликации и структуры

хромосом. Ранее Волекоы /**а1вп , 1965/ был обнаружен феномен неслучайного распределения старого и нового генетического матерная« в андоредуплицкрованных метафаэных хромосомах, содержащих четыре хроматиды вместо двух. Однако при атом оставались сомнения, что неслучайное распределение может быть связано о процессом эвдоредупликации, Проведенный нами анализ распределения Старого и нового генетического материала в парах сестринских хромосом показал, что наблхщаемое распределение находится в хорошем соответствии о установленным ранее для зндоредуллицированных клеток.

Проведенные исследования позволили уточнить имеющиеся представления о механизмах редкосенсибилизиругшего действия

5-БДУ, Способность Б-ЕДУ ыодифищровать радиационные эффекты .начали изучать более двадцати лет назад, однако исследователи до

сих пор не пришли к единому мнению о механизмах радиосенсибилизации /Ш.Окада, 1974/. В подробном обзоре Ш.Окады, посвяаенном этому вопрооу, рассматривается несколько гипотез о механизмах радио-сенсибилнэируюоего действия 5-ЕДУ. &ти гипотезы можно разделить на две группы: радиосенсибилизиругаее действие Б-ЕДУ может быть обусловлено нарушением структуры и функционирования хроматина или увеличением поглощения энергии молекулой ДНК, включившей

6-ВДУ, В качестве наиболее правдоподобной гипотезы Ш.0када называет увеличение уязвимооти к уменьшение способности репарировать повреждения молекулы ДНК, включившей б-ЕДУ, то еоть он отдает предпочтение первой груше гипотез* В то же время отрицаетоя возможность усиления радиационного эффекта за счет увеличения поглощения энергии молекулой ДНК при включении б-ЕДУ в ее состав, и в качестве главного аргумента' приводятся данные из работы -Делихао

и соавт, / а1, 1982/. При этом Ш.Окада ошибочно цити-

рует, что замещение I % тимидиновых оснований на 5-ВДУ увеличивает анергию, адсорбируемую молекулой ДЖ, всего на 0,03 %. Однако, в указанной работе, речь шла о другом - замещение I % тикидина на 5-ЕДУ увеличивает на 0,03 % энергию, поглощенную не молекулой ДНК,а всей клеткой* В этом случае поглощение энергии молекулой ДНК, инкорпорировавшей 5-ЦДУ вместо I? тимидина, увеличивается на два процента, а при 50 % замещении тнмидина на 5-ЕДУ радиационный эффект должен возрасти в два раза. Таким образом, нельзя игнорировать возможность радиосенсибилизируппего действия 5-БДУ за счет увеличения поглощения энергии молевулой ДНК. Если эффект

редкоеенсибилиэации действительно связан о модификацией поглощения энергии молекулой ДОС, то степень редиосенсибидизации должна быть различной для ионизирующего излучения разных энергий, поскольку сечение взаимодействия гамма-квантов с веществом зависит от их энергии. Для проверки этой гипотезы в настоящей работе были использованы источники редкоконизнруипего излучения разных энергий. В результате проведенных исследований было установлено, что 5-ВДУ с больней аффективносты> сенсибилизирует генетический материал к образовании структурны* изменений хромосом (СХО и яроматвдных разрывов) при действии мягкого рентгеновского излучения, а при действии жесткого рентгеновского излучения эффект радиации и 5-ВДУ близок к аддитивному. Таким образом, редиосен-сибидиэируюшее действие 5-ВДУ наиболее сильно выражено для мягкого рентгеновского излучения. Поскольку наибольший вклад в поглощенную энергию при облучении рентгеновским излучением до 100 кэВ дает фотоэффект, то напрашивается вывод, что радиосен-сибилиэируюшее действие 5-ВДУ происходит за счет усиления фотоэффекта. Таким образом, радиосенсибилизирушее действие 5-ЕДУ может быть обусловлено не только нарушением структуры и функционирования генетического материала, содержащего 5-ВДУ, но и увеличением поглощения анергии молекулами ДНК, содержащими 5-БДУ. ,

ВЫВОДЫ

1. Разработан простой метод выявления СХО, сформировавшихся в двух последовательных циклах репликации, который может быть использован для более точной оценки спонтанного и индуцированного уровней СТО, чем ато позволяла стандартная методика.

2. Показам, что СЮ, выявляемые при низких концентрациях 5-ЦЦУ <10~7М), являются спонтанными.

3. В опытах с гамма-излучением Со, жестким (Вэф«17б кэВ) и мягким (Еэф* 62 кэВ) рентгеновским излучением установлено,что иокизирушая радиация является сильным индуктором СЮ: доза I Гр вызывает двукратное и более превышение спонтанного уровня.

4. Для обоих исследованных типов структурой изменений хромосом - 050 и аберраций {хроматидных разрывов) ОБЭ растет с увеличением ЛПЭ излучения.

5. При индукции СЮ 5-ЦЦУ оказал достоверный сенсибилизирующий эффект только при действии мягкого рентгеновского излучения (Еэф» 62 кэВ), а при действии жесткого рентгеновского излучения (Еэф. 176 кэВ) и гамма-излучения Со эффект радиации и 5-ВДУ был близок к аддитивному.

6. При индукции хроматндных разрывов Б-БДУ оказывал сенсибилизирующий эффект только» при действии мягкого рентгеновского излучения. При действии жесткого рентгеновского излучения 5-БДУ не оказывал влияние на частоту разрывов.

7. Показано, что закономерности распределения старого н нового генетического материала, обнаруженные ранее при эндоредупликацнн хромосом, наблюдаются также и в естественных условиях репликации генетического материала.-

Список работ, опубликованных по теме диссертации

]. М. М. Антощина, А. А. Жлоба, Н. В. Лучник. Частота разрывов в одно- и дву-5-бромдезоксиуриднн (5-БДУ) замещенных хромат идах тгри дейст&ил рентгеновских лучей и ультрафиолета. — I Всесоюзный биофизический съезд. Тез, докл. — М., 1982, с. 205.

2. А, А. Жлоба. Новый метод количественной оценкн числа ложных близнецовых сестрннскнх хроматндных обменов. — Генетика, 1982, т. 18, № 12, с. 1983—1986.

3. А. А. Жлоба, Н; В. Лучник. Новый метод учета сестринских хроматндных обменов, образующихся в последовательных митотических циклах. — Цитология, 1983, т. 25, № 3, с. 349—351.

Материалы диссертации доложены н обсуждены:

1. На конференции молодых ученых и специалистов НИИМР АМН СССР. Обнинск, 1982.

2. На I Всесоюзном биофизическом съезде. Москва, 1982.

3. На Всесоюзной конференции «Молекулярные механизмы репликации, репарации, рекомбинации в норме и при действии радиации у эукариот». Пущнно, 1983.

Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии в декабре 1983 г.

ТЕ-02013

Заказ &23

Тира л; 100

Малоярославец а я городская типография управление издательств. полмгр^ф;ш л к^нжгюл íopiналы Калужского облисполком