Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирусологический мониторинг природных очагов клещевого энцефалита в Прибайкалье на основании индивидуального исследования иксодовых клещей

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вирусологический мониторинг природных очагов клещевого энцефалита в Прибайкалье на основании индивидуального исследования иксодовых клещей"

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

"6 од • -

Томский ордена Трудового Красного Знамени ч ЦД^ $9И научно-исследовательский институт

ввкцин и сывороток

На правах рукописи

МЕЛЬНИКОВА Ольга Витальевна

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В ПРИБАЙКАЛЬЕ НА ОСНОВАНИИ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕИ

оз.оо.об. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание утИй степени кандидата биологических наук

Томск - 1994

' Работа выполнена в Институте эпидемиологии и микробиологии ВСНЦ СО РЙЫН

Научный руководитель:'доктор медицинских наук.р,Д.Ботвинник

Официальные оппоненты:

Федоров

Юрий Васильевич, доктор медицинских наук, профессии

Неустроева

Надеада Петровна, кандидат медицинских наук

Ведущее учреадение: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН

Защита состоится 1994 г. в часов

на заседании специализированного Совета К.098.11.01 по присувде-нии ученой степени кандидата наук при Томском ордена Трудового Красного Эиамени научно-исследовательском институте вакцин и сывороток (634050, г. Томск, пр. Ленина, 32 ).

С диссер.аци!^ моено ознакомиться в библиотеке Томского на-цчно-исследовательского института вакцин и сывороток.

Автореферат разослан "/ " ¿/й^-з^ 1994 г.

Ученый секротарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Л.Н.Полецук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клещевой энцефалит (ИЗ) продолжает оставаться одной из наиболее распространенных и опасных природно-очаговых инфекций. В результате хозяйственного освоения таенных территорий страны эпидемиология КЗ в современных условиях претерпела существенные изменения. Одной из наиболее характерных особенностей является рост заболеваемости населения крупных городов, профессионально не связанного с лесом (Amiressaai, 1988: Леонова, Сомов, 1989; Львов с соавт., 1989; Лузин с соавт., 1991: Ястребов, 1993 ).

Кроме того, произошли существенные изменения интенсивности и характера контактов- человека с природой. Антропогенная трансформация таеаных ландшафтов в ряде районов привела к увеличении численности переносчика и напряженности природных очагов (Присягина и др., 197?; Смыслова и др., 1989; Тарасов, 1990; Пу-ховская и др., 1991; Данчинова. 1990, 1992; Липин и др.. 1982, 1984, 1992). Типичный пример - Иркутская область, где заболевав-иость КЗ в течение восьмидесятых годов возросла в 10 с лишним раз, при этом более 602 заболевших приходится на жителей областного центра (Злобин,1989; Горин с соавт., 1992). 'Актуальность проблемы для Прибайкалья связана также с важным экономическим значением э.того преимущественно таённого региона, располагающего огромными запасами леса, минерального сыр^я и уникальными возможностями для развития туризма.

В этих . условиях организация систематических наблюдений за состоянием природных очагов клещевого энцефалита имеет ваяное научное и практическое, значение. Новые перыективы в данном направлении открылись благодаря разработке экономичных и эффективных методов выявления вируса в отдельных экземплярах клещей. Это -иммунорферментный анализ (Баннова и др.. 1981, 1984; 5очкива и

• - 4 -

др.-, 1990; Коренберг, 1986; Наволокин и рр., 1988). биопроба в никрокультуре клеток (Мансуров и др.. .1988), а такае молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (Добрикова и др., 1986; Пиценко. 1990; Шаманин, 1990). "

Индивидуальный скрининг клещей без объединения в стандартные пулы с помощью методов нового поколения позволил развернуть исследования по трем направлениям, которые ранее были либо очень трудоемкими, либо технически невыполнимыми. Во-первых, это исследование больших репрезентативных выборок клещей, собранных с растительности, для слеаения за активностьи природных очагов и уточнения недостаточно ясных вопросов экологии вируса ИЗ. Во-вторых, совершенствование тактики серопрофилактики на основе экспресс-исследования присосавшихся клещей. И в-третьих, выделение и последующее изучение штаммов вируса КЗ в условиях, сникающих вероятность смешения вирусных микропопуляций, которое неизбеано при исследовании пулов. Выполненные работы (Пеньевская и др., 1988; Ковалевский, Коренберг, 1990; Подоплекина и др., 1990; Баннова и др., 1991; Заводчикова, 1991; Лузин и др., 1991; Пуховская и др.. 1990, 1991) свидетельствуют о перспективности новых методических подходов, и накопление новой информации для различных частей обширного нозоареала КЗ представляется актуальной научной задачей.

Цель раЬоты^- на основе методов нового поколения и индивидуального исследования клещей дать более полную характеристику параметров природного очага КЗ - вирусофорности основного переносчика и биологических свойств вирусу в условиях усилившейся антропогенной трансформации естественных ландшафтов Прибайкалья.

Основные^адачи:

1. Определить вирусофорность иксодовых клещей с помощью иммуно-ферментного метода в различных климато-географических районах Прибайкалья.

- •З -

2. Получить дополнительные сведения,- характеризующие взаи'моотно- ' иения вируса и переносчика в Прибайкалье, включая распределение клещей по полу и концентрации вирусного антигена.

3. Изучить характер распределения инфицированных клещей на местности (по ходу учетного маршрута)', .

4. Апробировать экспресс-метод исследования клещей при проведе-. нии экстренной- серопрофилактики ИЗ применительно к природным и

социальным условен Иркутской области, дать сравнительную оценку

: !

результативности' иммуйоферментного метода при исследовании голодных и напитавшихся клещей.

5. Дать хара^е^-истику антигенных и генетических свойств штаммов вируса КЗ, выделенных от индивидуально исследованных клещей в различных очагах. . • ...

Научная новизна работы. Впервые на основе индивидуального исследования клещей получена данные по зараяенности I.рег5и1са1иБ вирусом КЗ в природных-очагах Прибайкалья, включая данные о пора-ценности самцов и самок, голодных и напитавшихся клешей, доле клещей с высоким содержанием вируса. Показано, что инфицированные клещи распределены неравномерно вдоль линейного учетного маршрута и вероятность их встреч приближается к распределении Пуассона. Обнаруяено значительное фено- и генотипическое разнообразие штаммов вируса КЗ: антигенные свойства многих из нйх выходят за пределы „арактеристик двух ранее выделявшихся серотипов - восточного и Айна/1448. '

Научно-практическая значимость работы. Усовершенствована система вирусологического мониторинга очагов КЗ в регионе, имеющем ваяное хозяйственное значение. Данные о вирусофорности клещей использованы при подготовке экологического атласа Иркутской области (совместно с Институтом географии РАН) и проектной документации

народнохозяйственных объектов в таенных районах области (место--рондения газа), Подтвервдена эпидемиологическая и экономическая эффективность экспресс-метода исследования клещей при проведении экстренной серопрофилактики в Прибайкалье. Около 1500.человек получили медицинскую помощь в пункте профилактики, .организованном при институте, с учетом данных о вирусофорности напавших на них клеыей. Данные о характере распределения инфицированных клещей на местности могут быть использованы при определении вирусофорности переносчика и в статистических расчета« при изучении природных очагов.

Апробация работы. Материалы представлены на Всесоюзном симпозиуме по КЗ (Иркутск, 1990), научно-практической конференции,, посвященной 80-летию Иркутского ИЭМ (Иркутск, 1992), Международном симпозиуме "ЮОлет вирусологии" (Ст.-Петербург, 1992), на 2-й •региональной научно-практической конференции "Вопросы медицинской профилактики и здоровье человека в Сибири" (Омск, 1993), международной конференции "Проблемы экологии Прибайкалья" (Иркутск, 1993). В окончательном виде работа обсуадена на заседании Ученого Совета ИЭМ 12.01.94 г.

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано & работ.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, пяти глав собственных исследований, обсуадения полученных результатов, выводов и списка литературы (185 отечественных и 22 иностранных источника). Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 таблицами и 10 рисунками.

- 7 -

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материал и методы. Исследовано индивидуально более 20 тысяч экземпляров икеодоенх клешей (в основном - Ixodes persulcatus), собранных во время экспйдииионннх выездов на четырех ключевых участках в природних очагах КЗ Иркутской области и Бурятии, выбранных с учетом эколого-эпидемиологических, климато-географичес-ких и хозяйственных особенностей. Клеией с растительности собирали на стандартный флаг 60x100 см, а затем переносили во влаяный бинт, который закручивали по порядку прохоядения маршрута. G полевых условиях собранных членистоногих сохраняли живыми во влая-иих бинтах в прохладном месте, в лаборатории до исследования -яивыми в холодильнике при И°С или в морозильной камере при -40"С. Исследовано более 1500 клещей, питавшихся на людях и ви-вотных. Присосавшихся клещей разделяли на 4 группы (от 0 до 111) пропорционально степени напитанности.

Весь материал исследовали на наличие антигена вируса КЗ в иммунофериентном анализе (ИФГП. который проводили по методике, разработанной для прямого обнаружения этого антигена (Субботина и др., 1986) с учетом (Bartoszeze, RozhoHSki. {979; Харитоивнкоз. Христова, 1985: Курстак и яр,, 1986; Вербов, И ), клёиз

после обработки этиловым спиртом и содееик. рздтзорои У.чикС4 с антибиотиками (пенициллин и стрептокшш по 500 ЕД/мл). помещали в пластиковую пробирку для микропроб и охларцът е гшдком азоте. Затем разбивали клеща стальным пестиком и заливали 0,5 мл раство->а Хенкса с антибиотиками. Полученную суспензии после центрифуги-ювания использовали для исследования. Реакции ставили в плоско-.онных 96-луночных панелях отечественного производства (полевой атериал) или в разборных планшетах с шк.ким дном (клеией, сня-

ых с людей). Лиофилизированкый IcrG для сенсибилизации панелей

>

ыл любезно предоставлен А.С.Каравановнм (Институт полиомиелита

И вирусных энцефалитов РАМН), конъюгат белка с пероксидазой хрена - Л.3.Матвеевым (Новосибирский институт биоорганической химии РАН). При исследовании клещей, снятых с людей, в части случаев использовали тест-систему -для обнаружения антигена Томского НИИВС. Результаты ИФА учитывали визуально и на отечественном спектрофотометре ИФКО-2 при длине волны 492 нм. Суспензии, дававшие отчетливое аелтое окрашивание параллельных лунок, брали в дальнейшее исследование, даже если соотношение экстинкции исследуемого рас- . твора к нормальному контролю (мозг здоровой мыши в разведении 1:100). было меньше 2,1, Перед началом какдого эпидсезона чувствительность тест-системы оценивали по отношению к оттитрованному на мышах и культуре клеток вируссодериащему мозговому материалу.

Около 30У. клещей исследовали на наличие вируса КЗ в культуре клеток СПЭВ микрометодом в 96-луночных панелях с плоским дном. Суточный монослой клеток заранали суспензиями клецей (по 20 мкл на лунку) и, после часового контакта в термостате (52 С02, 3?еС, влавная камера), заливали агаровым покрытием обычного состава (по 200 мкл на лунку). После 4-5 дней инкубации учитывали результаты по изменению цвета покрытия в сравнении со здоровыми клетками. При необходимости производили контроль ЦПД под микроскопом при увеличении ЮОх.

Положительные и сомнительные по данным ИФй и биопробы в микрокультуре к-еток суспензии контролировали в биопробе на 2-су-.точных сосунках белых мышей, заражая их интрацеребрально. Мозг заболевших.сосунков пассировали не менее двух раз на 6-8-граммовых мышах. Полученные штаммы сохраняли при -40°С.

Титрование штаммов производили на 6-8-граммовых мышах и в

микрокультуре СПЭВ, как описано выше. Так ке - микрометодом на /

клетках СПЭВ - ставили реакцию нейтрализации с постоянной дозой кираса (100 Б0£/мл), Сыворотки к прототипным штаммам, полученые сотрудником института И.В.Воронко путем иммунизации кроликов.

раэподили двьнр-зтно от i:iû до 1:128Û. Результаты чимтноали па

С.С.Григорян с соавт. (1988), разведения ниже 1:20 в расчет не принимали. В соответствии с универсальной системой Charles H. Calisher (1988) для отнесения штамма к тому или иному серотипу принимали во внимание не менее, чем 4-кратную разницу в титрах. Для изучения антигенных свойств использовано 35 штаммов вируса КЗ, выделенных нами из индивидуальных экземпляров иксодовнх клещей, и один штамм из мозга зайца-беляка. В качестве прототишшх и контрольных были взяты штаммы Софьин (дальневосточный вариант). Айна/1448 (восточно-сибирский). 256 (западный) и Лесопарк-!i (урало-сибирский) из коллекции отдела природноочагових инфекций Иркутского ИЭМ.

Раздел работы по гибридизации нуклеиновых ки'слот выполнен в комплексе с " лабораторией молекулярной генетики вирусов ИЭМ (В.И.Злобин) и Новосибирского И60Х (З.А.Йаманин). Постановку молекулярной гибридизации осуществляли по Е„Ю.Добриковой с соавт. (1986). РНК выделяли из мозга б-8-граммовых белых мышей, зараяен-ных интрацеребрально исследуемыми штаммами. Использован набор из 11 дезоксиолигонуклеотидных зондов, апрбированных ранее (Каманин, 1990: Дрокин и др., 1991; Злобин. 1992).

Для обработки экспериментального материала использовали общепринятые методы вариационной статистики .(Плохинский, 1970; Мер-ков. Поляков, 1974; Зайцев. 1984). Группировка результатов реакции нейтрализации и построение дендрограммы выполнены на основе кластерного анализа, Статистические расчеты проведены на персе-, нальном компьютере АТ-286 с использованием пакета прикладных про грамм "Статистика". Обработка материалов на ЗВМ проведена совместно с Н.А.Макарчик.

- 10 -

. Результаты и обсуждение.

Эколого-эп идем политическая характеристика района исследований и ключевых участков Район исследования отнесен к Восточно-Сибирско-Забайкальской группе очаговых регионов (Коренберг, Ковалевский, 1981). В соответствии с типологической характеристикой очагов И.И.Богданова и Ф.Ф.Бусыгина (1991), преобладающий видом здесь являютс.. персуль-ьатусные лесные очаги. Различные авторы оценивают степень опасности очагов в этом районе как среднюю и низкую с возрастанием в предгорьях Саян и на Лено-йнгарском плато (Байбородин с соавт., 19?4; Вертинский, 1984). Заболеваемость в последние годы составляет до 5,7 на 100 тыс. населения, летальность - 3,75% (Горин и др., 1992). Основная часть материала собрана в . йнгаро-Ленскоы плоскогорно-таемном районе, в пределах которого нами выделено три группы районов, различающихся по уровню заболеваемости и характеру антропогенной трансформации. 1. Рекреационная зона г. Иркутска (Байкальский тракт от Иркутска до п. Листвянка). В недалеком «роилои - интенсивное лосохоаяйственное освоение, в настоящей врйИй - массовая застройка дачными цчастками. домами отдыха и проч. Характеризуется наиболее высокой в Иркутской области заСолеваем'стью. 2. Лесостепные районы Оиотской возвышенности (Эхирит-Брагагский и Баандаошмй районы Иркутской области). 95'/. .стопных участков Носит антропогенный характер. Прилегающие таенные участки сильно трансформированы в результате повторных рубок, покаров и пр. Заболевания людей регистрируются екегодно, но число заболевших Невелико, 3. Северные таенные районы Иркутской области

(Вигаловсиий, Усть-Удинский и север Осииского района). На большей /

части территории сохраняются естественные таенные ландшафты. В последние годы возросли масштабы лесохозяйственного освоения. Заболевания регистрируются спорадически.

ß целом регион характеризуется континентальным климатом и умеренным количеством осадков. В качестве контрастного по климатическим условиям и антропогенным нагрузкам выбран участок 4 на юго-восточном побережье Байкала (Слидянский район Иркутской области и Кабанский район Бурятии!. В основном работа проводилась на склонах хребта Хамар-Дабан в пределах территории Байкальского заповедника, характеризующейся более мягкой зимой, обилием осадков, своеобразной флорой и фауной, ß настоящее время Кабанский район относится к наиболее неблагополучным по КЗ с Бурятии..

Вирусофорность и к с о д с в н х клещей. собранных с растительности

Антиген вируса КЗ удавалось обнаружить всюд^, где било собрано достаточно представительное'.количество клеыей и в клещах различных видов. Но поскольку клеши родов Dernacentor и Иаегаа-physalis в наших сборах по Прибайкалью представлены случайными находками (менее I'/.). мы исключили эти данные из последующего ^анализа. Все дальнейшие расчеты относятся к основному переносчики - клещу Ixodes persulcatus.

В целом на обследованной территории за !98Й-1993 гг. вкоусо-форность по данным ИФЙГ варьировала от 0,7? до 2.23'/.. Зараженность клещей сильно изменяется по годам и по территории". На Байкальском тракте уровень колебаний за годы наших исследовании составил 0,36 -1 . 257. Такой sie значительный (2-5-кратный) разк-ах колебаний наблюдался в лесостепной зоне ( 0,22-1,227.) и на Хамар-Дабане (1.323,027). Лишь по северу Иркутской области вирцсофорность I.persulcatus за годы наблюдений оставалась почти на одном уровне (0,5!-0,657).

В полом наблюдается увеличение вирусофорности переносчика, а также амплитуды колебаний этого показателя в направлении с севера на юг. Наименьшие значения вирусофорности отмечены в самих

северных районах (0,63+0,13%), несколько более высокие (0^8+0,2/2 и 0,9+0.IX) - в центральных и максимальные (2,40+0,162) - на юго-восточном побережье Байкала. При этом нот достоверной разницы ые-8Д9 тремя ключевыми участками в пределах йнгаро7Ленского плато Ср0,05). Зато с большой степенью достоверности (р<:0,01) различия по этому показателю проявляются мемду Хамар-Дабаном и каадым отдельно взятым участком Прибайкалья, так ше как и в целом по этому региону.

Сравнивая известные данные о вирусофорности переносчика, рассчитанные по результатам исследования стандартных пулов классическими методами (Васенин и др;, 1967, 1986; Наумов, Гутова, 19?7), следует отметить, что полученные нами показатели незначительно превышают их. Колебания вирусофорности по годам на отдельных ключевых участках превышают эти различия.

На основе индивидуального исследования клещей получены репрезентативные данные о зараненности переносчиков разного пола. В Лено-йнгарском регионе вирусофорность самцов и самок колеблется синхронно как друг с другом, так и с общей вирусофорностыо по региону. В то ие время на Хамар-Дабане динамика вирусофорности самцов и самок не совпадает, и заракенность самок более значительно превышает зараменность самцов в среднем за годы наблюдения (рис. 1). Если обобщить результаты по крупным регионам (Предбай-калье, Забайкалье и обследованная территория в целом), то получим достоверно большую вирусофорность самок по каждому из них (р<0,01). При этом доля самок в сборах в среднем составила 52,610,3%.

Наши и более ранние наблюдения^ за вирусофорностью таённого клеща на описываемой территории не дают оснований напрямую связывать этот показатель со степеньп антропогенного преобразования

у

ландшафта. Для оценки влияния антропогенной трансформации ландшафта на вирусофорность переносчика, ми разбили учетные маршруты на три группы; 1. Активно эксплуатируемые дороги; 2. Сезонные дороги

Вирусофорность )

3 2 Л

3

г л

Ангаро-Ленское плато

19S9 1990 1991 1992. 19»

Рис. I.

и просеки различного назначения; 3. Лесные тропы, мало посещаемые человеком. Большая часть клецей была собрана по просекам и сезонным дорогам (55,?'/.). примерно четверть (25,32) - по оживленным дорогам и лишь 19,02 - в лесу и на тропах. При этом процент зара-«енных клещей в последней группе постоянно и статистически достоверно f рс 0.01) превышает таковой в других биотопах. В то яе время вирусофорность клещей на просеках больие, чем в биотопах, наиболее часто посещаемых человеком,.

Известно, что эпидемиологическое значение имеют не все клеши, а лишь те из них, в которых количество вируса превышает определенную концентрацию (Пеньевская и др., 1988: Иипакин и др., 1989, 1990; Бочкова и др., 1990; Ковалевский. Коренберг, 1990). Клещей с высоким содержанием антигена (P/N> 3.0), было около 102. Значительно большая часть клецей содержала вирусный антиген в

низких концентрациях, давая лишь бледное Окрашивание содержимого лунок. Самое больное относительное колу'.ество клещей с низким содержанием антигена приходится на юго-восточное побережье Байкала, минимальное - на лесостепные районы Онотской возвышенности (табл. 1).

Около 6,5 тысяч клещей исследовано на содержание вируса в микрокультуре клеток СПЗВ под агаровым покрытием. В результате дополнительно выделено П штаммов вируса КЗ, что составило 152 от' всех выделенных штампов. В то же время, этот метод нельзя считать достаточно надемным из-за большого процента неспецифнческой гиое-ли клеток: подтверждение специфичности ЦПЗ составило 302. Для сопоставления эффективности диух методов, было проведено параллельное исследование 1837 клещей ИФА и биопробой в микрокультуре СПЗВ. Индекс соответствия составил 972.

Таблица 1

Распределение клещей с различным содержанием вирусного антигена по ключевым участкам

".пело и доля 12) ¡лещей с Среднее значение

Плачевые Р/Н Р/Н

участки V 3 2.1-2.99 ..... Все поло- Группа

абс. У. абс. 2 асе. 2 аительные с Р/М

клещи >2,1

1.Верхняя Лена 4( 15.4) 1 ОС 38.5 ? ! 2( 46.6) 2.10 2.95

2. Онотская г.

возвышенность ЬЧ :"т0.0 ) 2(16,7) 4(33,3) 3,29 4.22

3.Байкальский

тракт 1(3.3) 7(23,3) 22(73.4) 1,85 2,48

4,Хамар-дабан 16(?,3) 37(16,8) 167(75,9) 1.93 2,98

Какдув клещевую суспензию, вызвавшую гибель клеток в культу ре или давшую желтое окрашивание в ИФА. проверяли в биопробе ,1а сосунках белых мышей.■ В' 20,52 случаев удалось выделить и закре-

нить в пассажах штаммы вируса КЗ. Наибольшее количество штаммов выделено на юго-восточном побережье Байкала, где вирусофорность наиболее велика. & 70'/. случаев штаммы выделены от самок таежного клеща. От клещей с высоким содержание« антигена вирус выделяли несколько чаше (примерно на 102). Тем не менее, большая часть штаммов выделена ит клещей с низким содержанием антигена, составлявших, соответственно, большую часть в сборах.

Пространственное распределение „шляется важной экологической характеристикой вида. 3 большинстве случаев, живые существа неравномерно заселяют среду обитания, образуя скопления, или "пятна" (Дам, Г3?5: йеарц, СЖ'). В случае с вирусом КЗ неодинаковая опасность территории, связанная с различиями е обилии и вирусо-Форности переносчика, слуаит важным эпидемиологическим признаком. Как известно. В.Н.Беклемивее ( 1963 ). предлагая формулу для расчета индивидуальной зараженности клещей, априорно допускал их рав-иомерио-елчч.эйное распределение. Нами впервые сделана попытка опытным путем определить тип р -цределеяия инфицированных клещей по ходу учетного марьрута на основании исследования индивидуально солее 12 тыс. клещей с помощью ИФйИспользовали два способа фиксации пелояения клеща относительно маршрута: 1. Клещей закатывали в бинт в порядке отлова и исследовали в той яе последовательности, таким образом каждый клещ имел порядковый номер по отношению к началу маршрута; 2. Часть маршрутов была разбита на отрезки по 25 м, таким образом, кроме первого показателя, дополнительно получали информацию о количестве клещей, в том числе зараэенных, для каждого такого участка. Статистически обработаны вариационные ряды для следующих показателей: 1) разница меаду блияайшими порядковыми номерами зараженных клещей (условное расстояние меаду ними); 2) дополнительно, ^ля поделанных на отрезки маршрутов, -число отловленных и зараженных клещей на 25-метровом отрезке.

Статистический анализ обнаруживает значительные отклонения от нормального распределения (рис. 2). Вариационные ряды отличаются резко выраженной асимметричностью, а их характеристики наиболее близко соответствуют распределению Пуассона. Для оценки различий Фактической и расчетной вирусофорности смоделирован пересчет по В.Н.Беклемишеву (1963), для пулов, условно сформированных из кле-цей, исследованных индивидуально. Клещей объединяли в пулы строго в порядке отлова без перемешивания. Обнаружено, что партии, содержащие двух и более зараженных клещей, теоретически должны встречаться в три раза реве, чем оказалось в действительности.' Около половины всех зараженных клещей (45,22) отловлены на условном расстоянии до 10 порядковых номеров друг от друга. Таким образом, индивидуальная зараженность. рассчитанная по В.Н.Беклемишеву. ежегодно была ниже определенной непосредственно на 0,12-0.40Х, Непараметрические методы оценки (критерий Вилкоксона и др.) подтверждают систематическое превышение фактических данных над расчетными.

Между численностью и зараяенностью клещей обнаружена сильная корреляционная связь Сг = 0.80 пуи 1 = 7,78) для учетных маршрутов в целом, и лишь умеренная С г = 0.39 при 1=8,47) для 25-метровых отрезков маршрутов.

Мозаичное размещение инфицированных клещей на маршруте и характер статистического распределения их по ходу линейного учетного маршрута необходимо учитывать при изучении вирусофорности пе- . реносчика.

Результаты индивидуального исследования клещей, снятых с людей и животных

Значительный практический интерес представляют данные о ви-

20 40 60 80 100 120 440

Рис.2. Распределение зараженных вирусом клещевого энцефалита клещей

вдоль линейного учетного маршрута на основе минимального условного расстояния между двумя инфицированными особями (сглажено по трем точкам).

русофорности клещей, напавших на человека. Экстренная серопрофилактика на основе результатов экспресс-исследования клещей позволяет получить существенный экономический и эпидемиологический эффект. Эта тактика. вп<?рвне в широком масштабе апробированная сотрудниками Омского НИИПИ в г.Перми (Пеньевская и др., 1988; Лузин и др., 1991). рекомендована министерством здравоохранения РСФСР, но применяется недостаточно, и целесообразна её дап-нейшая апробация в очагах различной напрякеиносп:.

В организованный при институте пункт экстренной профилактики КЗ за два сезона его работы обратилось за помошью около 2,? тысяч человек. Примерно половина из них принесли пригодных для исследования клещей, которых мы анализировали в течение ближайших суток с помощью ИФЙ. И 9С2 случаев клеши были представлены самками I.persulcatus различной степени напитанн^сти. Геогвафия нападений клещей ограничивалась, в основном, ближайшими пригородами Иркутска: 102 нападении клещей на человека произошло непосредственно в черте города. Из числа исследованных клещей положительный результат в ИФА показали 79 ' '3.&j.0.62). Большую часть среди исследованных составляли слйбон^литавииеся клещи (72,42), затем, по мере убывания, клещи I (15.42), И ff'.b2) и 111 П.52) степеней напитанмости. Вирусофорность в этих группах соответственно составила 2.§t0,52, 7,1+3.12, 13.'м3,22 и 20.4i5,H2 и. следовательно, возрастала пропорционально степени напитанности. Большая часть клещей (61.02) содержала антиген вируса КЗ в невысокой концентрации и только 17,12 - в высокой <P/N>3.0). Доля вирусофорных клещей, по нашим наблюдением, наиоолее высока в конце апрели, к се редине июня, снижает ::-, до минимума, несколько возрастая вновь к концу июля.

Эффективность экстренной профилактики с использованием ИФ(1 подтверждается следующими фактами: среди 1371 человека, "укушенных" клещами с отрицательном ре а ультагом ИФЙ, за два Года не за-

болел ни один. Из ?8 человек, чей клеи содержал антиген вируса КЗ, и кто, соответственно, получил противоклеыевой иммуноглобулин, заболел один ребенок шести лет. В этом случае клещ поступил на исследование на 2 сутки, по истечение рекомендуемых сроков введения серопрепарата. Содернание антигена в клеще было очень высоким. Введение противоклещевого иммуноглобулина с учетом результатов ИФЙ позволило сократить расход препарата на 70-80% в сравнении с обычной практикой его применения.

При исследовании имаго, снятых с людей и животных установлено, что вирусофорность питавшихся клещей примерно на порядок превышает аналогичный показатель у голодных особей, собранных с растительности как в целом по изучаемому региону, так и по отдельным ключевым участкам. Например, вирусофорность питавшихся клещей по разным участкам Иркутского района колеблется от 4 до 102, в среднем составляя 5,482, тогда как для голодных клещей полонительный результат получен лишь в 0,97. случаев. Содержание вирусного антигена в клешах, снятых с иивотных, возрастало пропорционально степени напитанности (от 1,4 до 20.02К

Характеристика штаммов вируса КЗ, выделенных в результате индивидуального исследования клещей

Отличительной особенностью раздела работы по изучению штаммов было исследование изолятов из индивидуальных особей таёяных клещей. Все изоляты вели себя как типичные атаммы вируса ИЗ при росте на биологических системах,- вызывая гибель мышей с характерной клинической картиной на 4-? сутки и деструкцию монослоя клеток СПЭВ на 4-5 сутки. В ИФЙ суспензии давали яркое специфическое окрашивание субстрата.

При анализе результатов реакции нейтрализации двумя антиса-

воротками (Софьин и Айна/1448), 387 из исследованных полевых штаммов оказалось возможным отнести к восточно-сибирскому сероти-пу и лишь 8И - к восточному. Но более 5ОХ изученных штаммов не могли быть отнесены ни к одному из этих серотипов, отличаясь в антигенном отношении от одного и другого. Анализ результатов РН дополнительно с западным (штамм 256) и урало-сибирским (Лесопарк -11) вариантами вируса КЗ дал ещё более "пеструю" картину. При этом большая часть штаммов лучше нейтрализовалась именно последними двумя сыворотками. Для выявления закономерностей в распределении штаммов, результаты РН с четырьмя сыворотками проанализировали на ЭВМ с помощью кластерного анализа (рис. 3). Этот статистический прием позволил разделить исследуемую совокупность штаммов на группы по степени сходства. Как видно из дендрограммы. все прототипные штаммы "разошлись" по разным группам на уровне 10 кластеров. При этом штамм Айна/1448 и сходные с ним дискриминированы уне на уровне двух кластеров, штамм Лесопарк-11 и сходные с ним - на уровне четырех кластеров. В целом -результаты РН свидетельствуют о значительной антигенной вариабельности циркулирующих в регионе штаммов вируса КЗ vu неидентичности большинства из них с четырьмя наиболее известными серотипами. Вариабельность биологических свойств штаммов подтверждается также с помощью МГНК. По данным В.И.Злопина с соавт: (1992), в Прибайкалье выявлены штаммы, принадлежащие к четырем генетическим вариантам, проявляющим ту или иную степень генетического родства со штаммом Софьин - от максимально возможного (вариант I) до очень слабо выраженного (вариант IU ).Выделенные нами и исследованные в МГНК 16 штаммов принадлежат. ..только к III и IU генетическим гзриантам. Попытка сопоставить данные, полученные с помощью МГНК и РН. не выявила строгого соответствия генетических вариантов и "антигенных групп" Таким образом, обнаружено значительное фено- и генотипическое разнообразие штаммов вируса КЗ, свойства которых выхоДят за пре-

Рис. 3. Дендрограмма кластерного анализа результатов реакции нейтрализации птаммов вируса КЭ, выделенных в Прибайкалье, и прототипных штаммов.

А, А-1 - "антигенные группы" на уровне четырех и 10 кластеров п=7 - количество штаммов в группе. Отмечено положение прототипных штаммов

делы характеристик двух ранее выделявшихся серотипов - восточного и Айна/1448.

Выводи,

1. При индивидуальном исследовании более 20 тысяч иксодовых клещей в ИФА антиген вируса КЗ обнаружен в 1.5% случаев. Отмечено увеличение показателей вирусофорности переносчика в направлении с севера на юг (от 0.6 до 2,42) с максимумом на северо-западных склонах хребта Хамар-Лабан.

2. За годы наблюдений выявлены синхронные колебания вирусофорности клещей в различных районах йнгаро-Ленского плато при значительном отличии от районов, расположенных.на юго-восточном побережье Байкала. Обнаружены локальные различия в зараженности самцов и самок, степени инфицированности отдельных особей клещей,

3. По данным ИФА в целом по региону лишь от- 2.6 до 13,02 таёжных клещей содержат вирусный антиген в высокой концентрации СР/Н>3.0) и более 60"/. - в низкой. Зараженность самок (1.952+0.13) в среднем достоверно выше заракенности самцов (1,002^0,10).

4. Впервые получены экспериментальные данные о распределении зараженных вирусом КЗ клещей по ходу линейного учетного маршрута, которое наиболее близко соответствует распределению Пуассона. В то же время отмечается систематическое превышение фактических данных в сравнении с расчетными для равномерно-случайных выборок при группировке в стандартные пулы.

5. Вирусофорность клеией, с пяти/, с людей и животных, составила 6,12. Доля зараженная клеаей примерно на порядок выше среди напитавшихся имаго в сравнении с клееами, собранными с растительности

ь тех яе районах. Количество вирусного антигена, определенного в ИФА, пропорционально степени напитанное«.

6. Чувствительность ИФА при исследовании клещей, нападавших на человека в Прибайка'лье, достаточна для отбора нувдающихся в экстренной серопрофилактике. По нашим наблюдениям, среди 1371 "покусанных" отрицательными в ИФЙ клещами, ни один не заболел клещевым энцефалитом. Среди "покусанных" зарааенными кдещани заболеваемость составила 1.4Х, несмотря на введение специфического иммуноглобулина всем пострадавшим.

7.Нстановлена'значительная вариабельность антигенных свойств местных штаммов вируса КЗ. Более 50% из них отличались от серотипов Софьин и Айна/1448. Многообразие антигенных свойств подтверждается генетической вариабельностью штаммов в ЮН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. боронко И.В., Гусарова H.A., Мельникова О.В. и др. Антигенные варианты вируса клещевого энцефалита в очагах азиатской части СССР // Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита: Тез. докл. всесоюз. симпозиума. -Иркутск, 199б. - С. 3.

2. Липин С.И., Злобин В.И., Данчинова Г.А., Мельникова О.В. и др. Проблемы экологии клещевого энцефалита и пути их решения в Восточной Сибири // Там не. - С. 47.

3. Злобин В.П.. Иаманин В.А.. Плетнев А.Г., Дрокин Д.А., Дяиоев Ю.П., Воронко И.В.. Мельникова О.В. и др. Генетические варианты вируса клещевого энцефалита ц их распространение на территории азиатской и восточно-европейской частей ареала // Этиология, эпидемиология .и диагностика инфекционных заболеваний Восточной Сиби-

- 24 -

ри. - Иркутск. 192. - С. 60-69.

4. Мельникова О.В.. Лисак О.В. Результаты индивидуального исследования клещей на зараяенность вирусом клещевого энцефалита в Прибайкалье // Там яе. - С. 77-84.

5. Zlobin U.I.. Shaianln U.A.. Pletnev A.G., Dzhloev Yu.P., Dro-kln D.fl.. Uoronko I.U., Helnlkova O.U. et al. Genetic variation among strains of tick-borne encephalitis virus // International symposium "100 years of virology". Abstracts. - St.-Petersburg. Septeiber, 21-25. 1992. - Moscow. 1992.

6. Злобин В.П., Иаманин В.ft..Плетнев А.Г., Дяиоев Ю.П., Воронко' И.В.. Мельникова О.В., Гусарова Н.А. Специфическая реактивность кДНК- и дезоксиолигонуклеотидных зондов, комплементарных геному вируса клещевого энцефалита, с РНК штаммов различного географического происховдения // Вопр. вирусол.- 1992.- N 5-6. - С. 248-252.

7. Злобин В.И., Шаманин В.А.. Дрокин Д.А., Джиоев Ю.П., Воронко И.В., Мельникова О.В. и др. Географическое распространение генетических вариантов вируса кл:щевого энцефалита // Там яе. - С. 252-256.

8. Zlobin U.I., Shamanin U.А.,»Pletnev A.G., Drokin D.A.. Dzhloev Yu.P,. Uoronko I.V.. Gusarova N.A., Helnlkova O.U., Uikhoreva T.U., Kqzlova I.U. Genetic differentiation on tick-borne encephalitis

' virus strains, isolated in Asia and Eastern Europe // Medical research In 1992 (abstracts). Russian Academy of Medical Sciences. Siberian Branch. - Novosibirsk, 1993. - P. 149.

9. Мельникова O.B., Мельникова И.В., Ботвинкин А.Д. Опыт профилактики клещевого энцефалита в г. Иркутске на основе результатов индивидуальнрго исследования клещей // Иммунопрофилактика, иммунодиагностика и иммунокоррекция. - Омск, 1994. - С. 51.