Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК К Х-, S- И М-ВИРУСАМ КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК К Х-, S- И М-ВИРУСАМ КАРТОФЕЛЯ"



МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА БССР

БЕЛОРУССКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КАРТОФЕЛЕВОДСТВА И ПЛОДООВОЩЕВОДСТВА

На правах рукописи ПОГОРИЛЬКО Николай Акимович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК К Х-, 5-И Ж-ВИРУСАМ КАРТОФЕЛЯ

06. 01. 11-ФИТОПАТОЛОГИЯ И ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Минская обл., п. Самохваловнчн 1 978

.лл.

-г.

гашгакрдоо сельского хозяйства бсс.

' . ШОРУССКИЙ ОРДШ ТРУДОВОГО КРАСНОГО SHAMEh' ¡ЦУЧНО-ЙССВДОВАШЬСККЙ ШСТИТУТ ШТОФШВОДОШ И ШЩО OBOIÜEBOflCTBA

На правах рукописи ЕОГОРИДЬКО Николай Акимович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ■■ МАССОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСШ СЫВОРОТОК К Ï-. S-. И Ii-ВИР? С AM КАРТОФЕЛЯ

06.01.II- фитопатология в ващита растенна

i 15 Ï 0 ? >■■ ' Г. Р Д Î

диссертации га с oí ¡синие ученоЛ стеиек?; каадцдат? селъонохозпйствйненх

'Иинская oöb«, п. Самохвалов {газ Î 9 7 8

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. а'-

н*. К. A. ¡ ммирлээад

Инв. N

ДО 576.858.8

Работа выполнена в Украинском научао-всследовательекбм вастязуте сельскохозяйственной ммжробаологив Ишного отделения ВАСХНИ1 в 196&-1975 гг.

Научный руководитель - кандидат биологически наук

Ю.И-Швдудько

Официальные оппоненты - члбй-корресповдент АН БССР* доктор

биологических наук, профессор А.Л.Амбросов, --

- кандидат биологических наук С.И.Гребеввквова

Бедуиее предприятие - Научв о-и ссдедов атедьокий институт картофельного хозяйства

Заднта диссертации состоятся МЬ Х 197В г.

в часов на заседании специализированного совета &-Ц47 при Белорусской НИИ картофелеводства а плодооэовеводотза /223013* п. Самохвавовжчя Минской обл./ >

: С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ШЮОШО. Автореферат равослан СУУ-^ (Л 4 1978 г.

УчвныИ секретарь специализированного совета

В.Д.Матвеев

: ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

; АКТУАЛЬНОСТИ тары. в решениях Ш съезда КПСС so пятмлетнеку алану развития народного хозяйства СССР на IS7&-IS80 гг. яеред сель-опш хозяйством поставлены большие задачи но увеличению пронваодсгва картофеля в повылеш его качества. Дальнейаий рост производства картофеля буде! осуществляться главным образоыва счет повышения урожайном*'.

Картофель» как вегетативно размножаемая культура« сильно поражается вирусными болеевами» Вирусное вырождение является одним ев : осяовшафакюроа^сйихавщихсенеанывкачества я ограничивающих «го проду;««мооть. Иовтому, для улучшения семеноводства на Украине в I96&-XS71 гг. ооадано 12 закрытых районов в 4 аоны'по выращивании адорового безвируоного материала. Производство элиты сортового картофеля в aaxjuTta районах и коацу девятой штадетки будет доведено до 600 тыс. тонн, причем начиная е 1977 года будет производится 87 тыс. тонн элиты аа беавжрусвой освове /В.А,Ввенко, В.Я.Свертока,

Отбор безвирусных клонов на опорных пунктах закрытьс; районов ii ваучно-исследоватедьскях учреждениях осуществляет с помощью оо-рологвчегаюго метода, которой позволяет определять латентную вируса аул жифекцмв в является наиболее доступнда з вроизэодственнщ условиях. Возрастает роль серодиагностика в щ* проверке безвирусных клонов, полученных методом вере увечной меркегвш ыш сочетание» его .с термотерапией.

В связи с поставленной задачей - переходом яа безвврусвое семеноводство картофеля в масштабах страны резво мврооа потребность в антивирусных диагностических сыворотках, повышаются требования к вх качеству. Согласно правительственного постановлена* только в : Украинском ьаучно-исследоветедъском институте сельскохозяйственной микробиологии производство сывороток необходимо довеетв до 750 л в год, В таком больсом жолвч?стве их на производит ли одна лабора-!торвя ваеей страны. До 1571 года вкхючгтео^^таститут "производил 18-20 л таких сывороток, качество которых' было нив кое.

Анеииз данных отечественной литературы / З.П.Хачадова, 1964; д

С.Е. Ко новело», 1969; К.Ф. Герасимова, 1971; О.Г. Гордейчук, 1972;

Ковлов, 1974; Я.й. Ящеяко, Л.А. иатюшенко, 1974/ свидетельствует о ток, что эффективное технологии массового производства диагностических сывороток х растительным вирусам г стране не существует. Применяемые методы очистки вирусных антигенов вызывает божьшре потеря М- и 3-вгрусов картофеля /МВК» ЗЕК/ /О.Г. Гордейчук, 1972; . Л.П. Козлов» 1974/ а болевневные явления у шшуниаированных швот-нш /С.Е. Коновалов, 1969; К.Ф. Герасимова, 1974/. В результате неполной очистки вирусного антигена выпускаемые сыворотки к ИВК и зВК содержат больное количество антител к белкам растения - хозяина. /1.П. Козлов, 1974/. '

При массовом производстве диагностических аятнсыворбюк еще сравнительно «ало применяв? <зя адъюванты, недостаточно изучены вопросы повышения чувствительности серологических реакций путем применения различных адсорбентов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ, Сравнительное авучениа существув-еюс и разработка новше аффективных приемов очистки вирусного антигена я рациональных схем иымунивадаи животных* сбеспэчяваюадос стабильное, производство высококачественных диагностических сывороток к вирусам картофеля.

На основания полученных результатов разработать новую, прогрессивную поточную технологию массового производства диагностических сывороток к. вирусам картофеля.

Ооновные задачи работы:

I., Подобрать анткгенно-активные итаммы изучаемых вирусов картофеля и серологически неродственные растения дла их накопления я большом количестве.

2. Равработать аффективны! поточный метод очистке вирусных антигенов.

3. Изучить равлжчныо способы шыцииаации хивотщд: я изыскать пути воБИвекая мх эффективности.

■ 4. Изучить возможность вовшеши чувствительности серологической ре&кют.

ОБЪЕКТА ИССЛЕДОВАНИЯ, В качестве объектов исследования использовали I-, S- и ü-вирусы картофеля, к который требовалось производить диагностические сыворотки.

Для выполнения поставленных задач исследовали I атацц 1-всру-са картофеля ДЕК/, изолята МБП а ? иаолятов SBIC» .которые были получена из различных научно-исследовательских учреждений страны,

■МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ. Штаммовые рестення о X-, S- я й-виру-

оаии выраяивалн в тешшш помещениях в освЕне-зинкий период и в энтомологических изоляторах на опытнои участке -.г весенне-летнее яреия. Растения-накопители z растения-индикаторы варакали л утек механической 'ивакулиции do общепринятой методике.

"Разлитой" /слабовирулентный/ атаки SM накапливали аа дурмане - Satura etraaoolua L.

В качестве растеяив-накогштелей UBE я аВЕ испытывали некоторые ляды ДОШорастужях раствНКЙ: Chenopodilu» v., Ch. unaraotl color

Cost* *t ß«yn., Caturc set*l Zu И для UBS различные сор^

та томи»! Советом*» Невский, Украински» тепличный, Зарево, Бреко- ' дей.

Ижучалх способность SEK вавшшшахмя * томатах сортов Невский и Советонвй, а также в растениях Hqrealie ph.iiadnlphi.ca Lao.'

Для контроля ва чистотой иволятов изучав«** вирусов« определе-ная коаяентрадш вирусов к определения качества получаемых диагностических антионворотов использовали капельный метод серодиагностики. Ы.С. Дуиина и Н.П. Поповой ДЭЗТ/.Накоплекие и титр вирусов, а также зараженность другими вирусами устанавливали серологически з с помощью растений-индакаторов. Для идентификации вирусов по ыорфоло-гш использовали электронный ыщгроскоп ЭМБ-100.

При изучении влияния ыорфорегуяяторов на рост томатов и накопление MBH испытывала кинетин в дозе 10 и 20 кг ка I л воды,' который вносили еяенеделыш, п препарат тур з концентрации 0,01 М из расчета 20 «л на I растение. Корфорегелятора применяли как отдельно, так и совместно.

; При очистке вирусного 'антигена использовали общепринятые приемы /H.H. Щербакова, 1963; Ffankuch, Kausche, 1938; Wetter, I960; Jermoljev, 1Э60/. С цель» предотвращения агрегации и более длительного сохранения антигенной активности ДОС и ЗЕК испытывали 0,05 11 цитрат натрия /Beicbmaim, IS59/ с различными антионсидан-таыи /трилон Б, сульфит натрия/.

S

Jju разработка препаративного метода очистки вирусов испытывали следущие гели: акрилекс П-6, молселекты Г-50 и ДЭАЭ-50; /анионит/ /Венгрия, завод "Реанал"/» сефадексы Г-50 и Г-200 /Швеция, фирма "Фармация"/, Сиогель Р-300 /фирма "йерак"/, Гелъфидьт-рацио осуществляли на колонках размером 3,7 х 37 см и 4,5 х 90 си. в а. которие накосили соответственно 40-50 и 180-200 ил осветленного инфекционного сока. Вирусы элюировали рабочим буфером или 0,5 К SaCI в районе* буфере ере работе с молселектои ДЭАЗ-50, Для определения чистоты вирусных препаратов применяли серологический метод, спектро^атокетрив и электроннув микроскопию.

Вирусы концентрировали путем осаждения сульфатом алюминия, . кетодеи изозлектрическоа преципитации /Beet, 1936/ и с помощьп полиэтилеаглидоля / Albertзвоа, I960; AlbrecbtOTa, П1г, 1966/.

Для получения аятисыаороток использовали кроликов'в возрасте до 20 месяцев, весом не менее 2,5 кг. Изучали две схемы иммунизации: внугривенкуо des адьовантов и с адвювантами /С,Я, Шелудько, 1564/ и коийинированнуп /внутримшечное введение антигена с адъв-гантои + внутривенное/ /А.И. Гордейчук, О.Г. Гордейчук, 1971/. В качестве адыюаитск изучали: Li-иый гель алым нага натрия; IJf-ye смесь желатины и адьгината натрия, неполный и полный адъо-оаит Фрейнда. Изучали возмо«ность получения мояодисперсвой гмуль-сии компонентов адьпванта Фрейкда с поиоцьо ультразвука в низкочастотном дмспергаторе 7ВЛН-1.

Кровь от подопытных животных от<5«ралм по обдеприаятой методике из ушной вены на ?, 9. II день. Для изучения динамики накопления антител в организме животных кровь брали на 15. 21, 36, 40 и 42 день. Качество сывороток определяли по кетодихе В.А. ймыглж /197 (V.

Эффективность реиммуиязаики животных изучали путем 3-4-х кратного внутривенного введения возрастающих.до» антигена без адъгааята. Для каждого варианта брали минимум по 3. кролика.

Для консервирования сывороток исследовали фенол и 25% ' глицерин.

В качестве адсорбента антител к IBK изучали фирменный бентонит и 6 других природных минералов. Севсибилкзапив антмсывороткя проводили на основе методики, предложенной ВДш и соавт. /1567/ в B*rek* /1567/.

Л

На основании во-

лучежшх»wwjiniMMJbma до исполь-

зования томатов сорта Невский ддя накопления SB2 в процессе массо-мпнромведоя» да вытяги-

вания растений томатов i условиях искусственного освещения рекомендовало применениепрепарата тур. Установлено, то oí не влияет аа яавоалеямвдрусов»/

Обоснована воешшюсть применения метода гельфильгр&цжи о использованием молоелектов для препаративного выделения нирусных антигенов. разработав эффективный способ очиотки неустойчивых вирусов, включающий, не по ль го ваше рабочего буфера* кратковременного эмульгирования с охлажденным хлороформом« центрифугирования и гельфильтрации на комбинированной колонке о молселектами Г-50 и ДЭАЭ-50.

Выявлено адьювавтное действие полнэткленгликоля, используемого для концентрирования вирусов. Уоовернвнотвовяна комбинированная . схема иммунизации с адмш антами, дапщая значительный эффект при последутаях релшунтеациях.

Установлена вовмо-кооть применения природного минерала палы-горскмта в качестве адсорбента для повьшенжя чувствительности серологической реакции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ, результаты проведенных жсоле-* довани* послужили теоретическое основой для разработки технологии кассового производства диагностических сывороток к вирусам картофеля* которая обеспечивает значительное повняешие качеотва антисывороток и уиеньиает затраты на вырадйание растение-накопителей вирусов в 2 pasa.

Для повышения чувствительности серодиагностики рекомендовав способ постановки серологических реакций о использованием в качестве адсорбента природного минерала палыгорекита.

С целью повышения качеотва диагностических сывороток разработав и рекомендовав для ороиаводствасывороток способ концентрирования вирусов с помощь» полиэтыеигликодя* который в организме животные играет роль адыванта.

ÍTT9FMW РАБОТЫ проведена при производстве диагностических сывороток в Украинском НИИ сельскохозяйственной микробиологии и в Научно-исследовательском институте картофельного хозяйства.

Результаты научных исследований доложены ■ обсуждены:

2. На конференция холодах ученых по сельскохозяйственной микробиологии .и вирусологии Украинского НИИ сельскохозяйственной ми- ■ кробиологии. Чернигов, 1972 г*

2. На I Республиканской конференции колодах ученых'микробиологов и вирусологов, Киев, 1972 г. ; ■

3. На Черниговской юбилейной научной конференции, посвящеаной 50-летию образования СССР. Чернигов, 1972 г.

На 3 Всесоюзном совещании-семинаре по применению препарата ■ тур в сельском хозяйстве. Москва, 1974 г.

5. На Ученом совете Украинского НИИ сельскохозяйственной микробиологии. Чернигов, 1974 г.

6. 11а Всесоюзном совещании-семинаре 'Современные метода полу-■ чения безвирусного картофеля", Москва, 1975 г.

7. На Всесоюзном семинаре "Серодиагностика вирусов и бактерий, поражающих культурные растения"..Москва, 1977 г. V

^РЕАЛИЗАЦИЯ рВЗУД|>Т4Т0В' ИССЛЕДОВАНИЙ. На основании полученаых результатов исследований разработав "Технологический .процесс массового производства диагностических сывороток:к основным вирусам картофеля" , который утвержден Президиумом Екнбго отделения ЙАСЛШЛ и согласован с Министерством сельского хозяйства УССР. Массовое производство диагностических сывороток к вирусал картофеля для Украины в Молдавии : с 1973 г, в Украинском.КШ сельскохозяйственной мнвробяологии^ осуществляется согласно утвержденной технологии. Технологический процесс -принят за основу при составлении технического проекта специализированного цеха по производству диагностических антисывороток. ■

Разработана "Типовая технология марсового производства диагностических сывороток к вирусам картофеля", котсрая. одобрена Всесоюз-.1 ным совещанием во серодиагностике с утвергдена йинистерствоы сельского хозяйства СССР в 1977 г. в качестве стандартной для всех лабораторий страны, занимающихся производством таких сывороток.

разработан щюект стандарта на диагностические сывортоки в вирусам картофеля, который передан для рассмотрения и утверждения Отделению зашиты растений ВАСШШ ж Министерству сельского хозяйства СССР,

ПУБДИКАПИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. ■ Во теме диссертации опубликовано ¿2 научных статей л подучено Z авторских свидетельства СССР. В этих работах изложены основные положения диссертации. '

S

ОБЩ РЯВОТЯ« Диссертационная работа состоят из юежш, .ойвора литература, четврех глав экспериментальной части, обсуждения полуденных результатов, выводов и списка использованной литературы, виичащего 239 источников, в том числе ва иностранном языке.

Материал изложен ва Ш стравше мавднописвого текста,содержит У* таблицы к 10 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ;

СОзор литературы

В пйрвой главе "Получение вирусного аатигена" приводятся даяние отечественных и зарубежных исследователей о растениях-накопителях изучаемых вирусов, о методах очистки я критериях чистоты варус-пых препаратов.

Во второй главе "Иммунизация животных и отбор пред-

ставлены сведения о способах иммунизации, о путях довшения эффективности иммунизации к сроках отбора крови.

В третьей, главе "Повышение чувствительности серологических реакция" приводятся данные о возможности повышения чувствительности серологических'реакций с помощь» различных адсорбентов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В четвертой главе "Материал и методы исследования" описаны объекты, материалы и методики исследований.

В пятой главе "Разработка методов очистки антигена и их применение ори массовом производств^ диагностических сывороток к Х-, К- к 5- вирусам'картофеля" излагаются вопросы, связанные с подбором растений-накопителей МВД и 5ВК, изучением влияния морфорегуля-торов на рост томатов и накопление в них ШС и разработкой препаративного метода очистки вирусных антигенов.

Исследованиями изолятов МВК и 5ВК, полученных из различных .научных учреждений страна установлено, что по накоплении вирусов они мало отличались между собой.

Еа накопление вирусов больиое влияние оказывали условия внешней средн. При высокой температуре /лето 1972 г./ иэоляты МВХ некоторое время после цветения серологически не обнаруживались.

Ври заражении МВД некоторых сорных растений было обнаружено, ЧТО растения Верига теЪе! Ъ. можно использовать в качестве рас-

тения-индикатора,. что corjscjvvoa с-данными других авторов/Begaall я соавт., 1959/. . '

Из всех изучаемых сортов томатов наибольший серологический тктр КВК определен в сорте Советский, который на 24'день после заражения составил 1:25$. В других сортах максимальный титр вируса был 1:129. Сорта томатов Зарево и Брекодей высокорослые, «ало об-лиственнн и поэтому для массового накопления антигена КВК'не-подходят. После максимального накопления вируса, которое отмечали через 3-4 недели после искусственного заражения, концентрация вируса снижается, особенно в аииквх листьях.

Испытание томатов для накопления 5ВК показало, что в томатах сорта Советские вирус 5 не накашивается. Искусственное заражение всеми испытываемыми изолятам* ЗВ& томатов сорта Невский было усвеяншг. Пря этом било отмечено, что накопление 5В£ в томатах зависит от содеркаиия его в инфекционном соке атаимового орао- . тенмя, жсиольвуемого для заражение /табл. I/.

-tws&ml

НАКОПЛЕНИЕ 5ВЯ В ТОКАТАЯ СОРТА НЕВСКИЙ

-| ааях | 14 I И ! 26 | 35 ! kZ

1972

Лорх 1:64 1:4 1:64 1:32 - ■

Сафир 1:64 1:32 1:64 1:32

Детскосельскии 1:32 1:6 1:32 1:32 ■ -

Сеякед 165-51 1:32 1:16 1973 1:32 1:32 — .

Хорх 1:4 1:2 1:4 1:6 1:4 I 4

Пауль Вегнер 1:2 1:2 1:4 1:2 1:2 I 2

Сафир 1:6 : 1:4 • 1:4 1:6 1:6 I е

Сеянец 41956 1:в 1:6 це- 1:16 1:16 I е

Детскосельскиа 1:16 1:8 це I-.I6 1:16 I е

Сеянец 165-51 1:4 . ' ♦ * 1:2 1:2 .1 2

положительная- реакции ■.

/О

S оээзируишж растениях картофеля сорта ilpre-

Еульскяй рэлняй, кстсрыл злрг.лзл-л сиегре^ейяо с тсчатакя тгпзл^ч-ssKír? '>"' мл таи;, S Ж s год з^рз^гн^т сэрслоп'Чйскк еарглелкть к с ysaîoc'b. З-iT ззаяые с сгл s отлете я с реэулъллл^;' = = лр--

r*,ix автсрог /О .Г, Гсрделчрк, IÎ72; ¿u^ius, 1969/.

Изучаема«: исдрпаул S3Í "¡zr-nm. так.т.г ss^ïsiсгь

зфкллллг - ЕЬуsalis phiicíí.l^hicf. Lan. ■ ^.irrcr^íajrb'íCs ;-:л-коякегb;g гкрусл /татр ï:Ii/ в расгекя;^ ^зялксл усг s я ES." 5« с

лгнь л : лл s sarape;-; и с. S ecríi:T3=s;-íi-:ti>: условиях нз псяггсм v'üíí-ks б хгче.-пч-з IS"2-I57í гг. ггразлгь SS£ н; y^^icL.

СраЕкктзльноа ксл^тзназ- оч'лет:;i: Ештзгена £лК ттз тОн а лс г сорта 3 к рз;?Елий клрлсредя сорта Лерх показ^лл,

что ккфекииоаяый сск гг тowares сч^кзетсл метком гель^ильтралл:; ка колсггЕзх мояселекта Г-50 лучаз. Счвсрсгка s sSK, получения арк йнаунйзакан.крй'шкоа антвгеясм us т&язтев, мела ткт-р 1:512, црв ишуни запив знтигзном кз кзртс^еля - 1:1024.

В результате ^лслело^лн'.^ 5 ил о ^стлнлллепС, '-п л s успсза*. ЕСКуеСТёЭККОГО ОЛЬЛЛЛН Л-! I' " Г V' S í 05 s С£ яу ОСТИ ПСЯуЧСЧ ИЗ ГТрСГ"-ген;*" r^zî Î4C~OZ';:X *~i¡rr;-s'K-.!. ; ^COÍO-';

s с»:: р^гт-'Л ó "л-; г s гезг?

лрк -úc ;; -.ri- ТЛ;.^:;:; .ллл С;--tí-H

3HC рллазте;; îic-ipoc -^оляг:!^ л---л-< ^лггл;: s?.'* ля с-., глеллч-злл;;.

й=ртг4;елю лл:^::^: ■ ■■ „ Sx с ;л л? г;*«? л-:—

лл :л- ■ . ' ' ъ г:т-ч уллл-'л-

с татре« 1:512 - ..

Слгтззсно ü-i^vir,! h:íÍ;л\ • алкягг si '"С з рл/ :¿x тCj s re

гге^я пргплрат ту? р^тя.гллз^'нз растер в услов.'.тх

искусственного осэзейяйч /та5л, 2/.

Дкадйзяруя дзаные та^ли^а 2, иохао заключить, что более за-kíST^ce действие яреазрат тур сказал на взсскорослай сорт Ззрэзо, где срегаяя вусотэ растений, о5рабстачных этим препарате«, к коа-ку опыта Зала на 16 с« меньше со сравяекиг с коатралеи. По ;орту Нзгский разнига составляла 12,3 см. Кинетин несколько сяикает вк-гибируицее дейстсиг препарата тур.

//

Таблица Z

ВЛИЯНИЕ ИОМОРЕГУЛЯТОРОВ НА ВЫСОТУ РАСТЕНИЙ ТОМАТОВ

! Высота т>астений /в см/ в дни после заражения Вя_„а„_„ ! сорт невский ■■■; ■■■ ^ сорт Жарево " ' Варианты гдень ;—-\-!-ден£1-Г-Н--

!зара 1 ! 21 ! 28 «зара-! 14 I 21 1 28 Жжения! !_! 1жения! 1 }

Контроль II,3 19,0 27,3 31,0 12,2 27;б W.9 47,0 Препарат тур '

20мл/растение И,5 15,6 20Д 23,3 12,3 16Д 23,7 31,0 Препарат тур

10 ¡¡г/л - - - 12,1 IS,5 26,0 * 34,0

Таким образом, нежелательное вытягивание растеаий-накопителей при выращивании в искусственных условиях ножао устранить путем обработки их препаратом тур, который не оказывает существенного влияния на накопление вирусов.

При очистке М- н 5- вирусов методами, рекомендованными в литературе /Н.М, Щербакова, 1963; С.Е. Коновалов, 1969; Лгто1;)ет, 1960; ЯеЪЬех, * /мы столкнулись с трудностями, которые отсутствует при работе с ХВК. Возникновение их было связано с природой, этих вирусов, а именно: аизкоп концентрацией в тканях зараженных растений, лабильность», повышенной склонностью к агрегации, способность!) быстро разрушаться при действии физических и химических агентов.

Указанными методами нам не удалось подаосчгьс освободить вирусный антиген от нормальных компонентов клетки и окрашиващях пигментов. В связи с этим кролики очень болезненно переносили иммунизации.

При анализе этих методик оказалось, что в основном потеря серологической активности и икфекцкокностя МБЯ а 5ВК происходят при замораживании листьев и длительном эмульгировании сока зараженных растений с хлороформом, а также в результате агрегации ви-риоаов с компонентами растительной клетки и между собой. Только эмульгирование инфекционного соня с хлороформом в течение 20 мин.

/а

приводит к снижении концентрации КВК в 8 pas, в то время как 3-5 ика. обработка сникает концентрацию только в 2 раза. Сокращение продолжительности'эмульгирования с схлахкенкни хлороформом в производственных условиях до 3-5 мин. позволило значительно сократить потери 5Ел и ШИ.

Било такге установлено, что для уменьшения агрегации ар;; экстрагировании вирусов нэ растктелькьх тканей большое значена имеет правильный подбор рабочего буфера. Проведенные нами исследования в этом направлении показали, что лучшим является 0,05 î! цитрйт натрия с дсбавлекиен 0,007 й ?ркхона Б, сулъ£.:та нат-

рия в 0,0001 H мертколята. '.¡етодса электронной микроскопий установлено , что при его использовании вирусвые частицы находятся з аеагрегироьааной состоянии. Благодаря устранение агрегации и подавление окислительных процессов вирусы M и 5 сохраняют свои се-рологическув активность в таком буфере на протяжении 17-25 дней, г то время,как в инфекционном соке с добавлением дистиллированной води активность их сохраняется только 3 дня. Кроне того, использование рабочего буфера позволило проводить э^ективну» очистку этих-вирусов методон гельфяльтращш.

Ира сравнительно* испытании в динамических условиях' бнло отмечено, что все гели. за исклоченвех се^адёкса Г-50, заачктель-«о очшгит изучаемое вирусу от нормальных антигенов vî окрашивав-пкх инфекпионнна сох веиестк.

Результаты определен®! оптической плотности и серологический ечализ покакал, что при гел:Цкльтрации ХВК на аолояке *огсг~-■ лекта Г-50 первый' г.нк соответствует нуклеояротеиду KBit, к от ар:.'/ влвируется "значительно рзныье, чей балластные вещества /вориал*-нне клеточные компонента/, содержащиеся во второн пике элвции /рис. I/.

1 Фракции первого пика имели иаксииальный серологический титр ХВД 1:512, что на одно разведение вике от исходного титра. Наличие1 ХБК во фракциях, дающих волоиительзуо реакшш со специфичной сывороткой, подтверждалось с иоиощьв электронного кикро-скопа ЗМБ-ЮО. Аналогнчкые результаты были получены при очистке МБК H.SBX.

Сефадехс Г-50 в наших опытах практически "не работал", ts-фекивоаный сок, содержащий ХБЯ, проходил через колонку беs

' , . лЗ

ад

и

1.4

• г^ПЗ

« ■ 1 (

. ' V

' 1 > 1

М ' 'Л'

1.0 ч г

9.1 1

ае ! и

ч 1 ,/ 1 >

,/ \ V

i с

9 и '5 (1 и гч и VI $1 а 33 42 45 Номера фракции

Рзе. X Ятжвая эдвииования ХВК из колонки целее да г.тз Г-50

I - вируснЕЛ пик,и - низко*одекуляркне соединения. .

существенных иэиевеаий. Яе освобождал зирус с од ержаии е фракции о;

зеленых пигмезтов также и сефадекс Г-200.

Из испытанных гелей хорояо задерживал окрашенные соединения

акркдекс П-5 /табл. 3/. Однако, по сразнеаис с другими гелями,

Таблица 3 ч

СОРБЦИЯ СКРАШЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ и вирусов картофеля ее ИНйШШОНЯОГО СОХА НА РАЗЛИЧНЫХ ГЕШ

Гели

!вость ; мл ]сэ..% %

Акрялекс П-б ХВК 40 ГОО ТОО 100 38 .16

Молселект Г-50 ш 40- 100 100 100 50 38

Молселект ДЭАЭ-50■ хек 40 100 100 120 50 10

Поле еле кт ЗЗЛЭ-50 38К " 50 ГОО 100 по 50 8

Холселекты Г-50+ДЭАЭ-50 хвк 200 100 100 320 50 2.5

Колеелекты Г-50+ДЭАЭ-50 ЗВ1 180 100 100 260 50 4

гельфильтрация в& колоннах акра лев с а И-б црадомт очень долго /до 2 суток/. Еще болие времени занимает гельфильтрация на колонке биогеля Р-300. Поэтому предпочтение било отдано молселехтам. При этом било отмечено, что колеелекг Г-50 а основном задерживает коричневые пигаенты, а молселект ДЭАЭ-50 - вещества/ окразенные в зеленый цвет.

На сснозе этих гэхей была разработана комбнвированчая колонка, аа 0,2 объема, за полненная иолселектом 13.13-50 и на 0,8 - яод-селектом Г-50. За кокбиаироъакао?. колонке разхеро* 4,5 х 50 см гельфильтрацин проходит со скорастьс 150-300 ил/час. ¿о появления вируса 25 колонки выходит 350-365 ил'свободной иидкоста. После счистка на комбинированной ксловке фракции, содержание ьирус,почти бесцветны, слегка одалеецируезде. Окрашенные н:;гмента выходят после фракций, содержгаих Ейрус /рис. 2/.

9 И! Г

о Ю I» М 40 М « 10 № ВД) N0 И Ш Петра франции

Рис.2 кривая элвированяя 5ВЕ из комбинированной кЭдонкн, заполненной молселектмю Г-50 ж ДЭАЭ-50 (анионит}.

Абсорбция УФ- света вирусными препаратами после очистки на

комбинированной колонке типична для изучаемых вирусов. Максимум

поглощения УФ- света для ХВК находится при 262 нм, для 53К - при

260 нм, а отноиение Д260 составляет для 2В£С - 1,24 - 1,25* для 250

5ВК - 1,23 - 1,25-, '

С помолы; электронного микроскопа установлено наличке неагре-гированкнх и типичных для изучаемых вирус об по морфологии вирусных частиц. Вкрусные^ анптены ве вступаст в Серовогичес&ую реакции с сывороткой к нормальным Селкак картофеля.

Приготавливаекке сьшорегкк к Х-, 5- и К-вирусаи картер ля после очистки на кохСкннрозанной хроматографической колонке"строго специзичны и жест высокие серологические титра. Они ке реагирует с сокок едоройых растекий-накопитеггй к с ОеЕзкруснкк картофелен.

Таким образш, в очиденвых препаратах изучаемых вирусов существенных примесей сспутстгупщ« авткгенов не о Скарбе но, что указывает Еа удовлетворите дьЕгуп частоту зя руг них пргпаратов й эффективность предлагаемого препаративного метода очистки растительных вирусов.

В связи с тем, что процесс очистки инфекционного сока от ■ низкомолекулярных соединения Гна комбинированном колонке сопровождается увеличением объема »«вата, содержащего вирус, в 1,5-2 раза, перед иммунизацией необходико концентрировать эирус.-Из всех испытанных паки способов коицантрироваеия вирусов самые лучшие результаты получены при использовании пожиатилеагликоля (ПЭГ) - 15Ш0, который применен вами на конечной стадии очистки вирусного антигена. При его использовании для осаждения 53Х'получена специфичен сиворотка с тнтрок е-4,8 раза выше, чек при использование для сток цели трихдоруксусной кислоты.

ПЭГ достаточно полно осуждает вирусы из вторичного осветленного сока й поэтому оупедаег необходимость проведения диализа, который занимает много времени. Кролики очень хорошо переносят иммунизаци» антигеном, прмготовдеишдк таким способом. Благодаря стабилизирующему действию ПЭГ /П. ¿льбертсон, 197А/, вирусы в организме животного сохраняет свои антигенные свойства более даи-тельное время, что способствует повышении иммунологической реах™ тивност» организма, а это приводит к увеличен«» образования спе-цифичвъа антител к введенному вирусному антигену.

Из подученных данных можно сделать вывод, что наиболее эффективны« методом очистки вирусных антигенов при-массовой производстве диагностических садороток-является метод гельфильтрации на комбинированной колонке, заполненной молселектаил Г-50 и ДЭАЗ-50 с последующим концентрированием вирусов ПЭГ. Предлагаемый

метод позволяет выделять вирусные препарата, которые отвечают основным критериям частоты. К тому же метод гельфильтрации прост. . ' легко доступен в производственных условиях, не требует дорогосто- . яаего оборудования я больной затраты времени.

В шестоя главе "Испытание адьивантов и их применение в производственных условиях"'нами гзучена эффективность некоторых адышантов при различных схемах иммунизации животных.

Антивирусные сыворотки с высоким титром обычно получает путем многократного внутривенного введения антигена животным /В.В. Пехтерев, 1970; Герасимова, 1971/. При массовом производстве диагностических сывороток такой способ иммунизации приводи? к . травмировании ушных вен и быстрой выбраковке животных /С.Е. Коновалов, 1969, К*Ф. Герасимова, 1971/, Поэтому, в последнее время широко изучается различные схемы иммунизации животных с использованием адъввантов /О.Г. Гордейчук, 1972/. Однако в условиях массового производства диагностических сывороток адьпванты еще применяется редко, так-как не всегда удается получить высокий эгЭДект, а использование, известного адыяанта Фрейада ограничивается трудностями в получении однородной эмульсии трудкосмвшиваемых составных компонентов /Б.Г, Бйярсвий, 1966/.

.В начале работы вами било установлено, что внутривенное введение антигена'ХВК в смеси с адышантои /Й-аый раствор альги-ната натрия/ способствует незначительному повышение титра- автисн-вороток.при отборе крови на 9 день-ж более заметному - на 40 день. 'Не удалось повысить .титр автисывороток и обработкой вирусных антигенов ультразвуком.

Более аффективной оказалась,комбинированная схема иммунизации, при которой сначала вводили 2 раза антиген в смеси с адьо-ваатом внутримышечно, а затем три раза - внутривенно без адьгаан-та. Использованная нами схема иммунизации построена по принципу, предложенному А.И. Гордейчуком, О.Г. Гордейчук /1971/, Однако, мы не применяли внутрибршинное введение антигена к сократили интервалы между внутримыкечнымн введениями антигена» Модифицированная таким образом'схема иммунизации заключается в следующем; 1-й день - 2,5 мл антигена + адыванг /внутримышечное введение в мышцу задних лапок/;

7-2. дезь - 2,5 хл гкт^гг^.о. + гл^ь^ла! / 2 к у т рчн а;: эт ^ -2; ев;; до яке в

кыкзы гзднлх лапок/; ХС-л дггь - I «л актЕгек^ /внутривенное ВБгге^е/ „ 12-2 - 2 а;:тнг=я*а /ьзгтр^взкйое ''; ■

14-2 день - 3 и йнткгека

Предложенная схе'-^ г;: е "-кр^т-

БВедеЕКСЯ а^ТГГ^й;., ОййЧЕС арг.ьг'.'СГ; 1 в:; рус о до г;; и, п^-згс-ля^'Г сс-кг.й^-г^ количестве 5г:у?р п-^кетых (л^-гк-игЯ ^о 3 к умей^злть г.олячест.ео з^о^иного ¡п 5-16

Из вспыгакйых ¿.¿Ь'аъънъсъ ыгп-гЗслг? аь::-' -.г::

рсзаяной схгне и к* у и: я сгаеь .■ип.г^ата.

ряя и иелатикы /табя, V.

ТаслкЕз ч

шшнн: АЙШАЯТСЗ ЯА татги СЫВОРОТОК £ Х-, 3-и К- РШГСАК ЕА?Т«ЕЛЯ

! Титру СьЕорстсх к «йр^-са.^ Адыианты !__/ 'А,с?"""."" /__

! ' 3 > Ч

Езатрол» /азг алг«-

Альп: наг натрия ^ келатина* А ОС 5 512'

Неполный альЕваз? Срейкда 1X52

Полный адызант йрейкдз. Х"00 £1;

Адъгзанта гкзыьаат че только вазивеНЕе титра айти^гср-зтсг^, во к более продолжительное сбраэбгазае антител б сргаяизке пьат-вкх /табл. 5/. Йаксйаадьаое накопление аатгтел в сргаккзме зг/зст-ных при яомОкЕвровавной схеме кммуанзаяви с адъЕЕантахя срсгсхо-дмт на 7-Н день после последнего введении ьирусзсго антггека.

После полного цикла ¡гакуакзацие животных с кспользованкеи адьвванта оказалось возможным получать антиснворотви высокого титра путем только трехкратного внутривенного введения антигена. Также повторные циклы иммуви ?ациж /реиммунязапии/ способствовали "

Таблица 5

ДКНАМИКЛ НАКОПЛЕНИЯ АНТИТЕЖ В ОРГАНИЗМЕ Е150ТШЛ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ АНТИГЕНОМ XBít О РАЗЛИЧНЫМИ АДЫ>-ВАНТАНИ

Адъовантн

! Титри сывороток при отборе t i крови_

i 7-й день ! 9-й день 136-й день

Контроль /без адьв-

ванта/ 256 128 32

Альгиват натрия ♦ -

желатина 1096 1096 128

Неполный адышант

V ■■ ;■:■■■'■-ЙОМ 256

Полный адъпвавт

фрейнда ; ; 1024 • . 102* . 512

всачительному увеличен«) титра автисьгооротки - одного из основных показателей ее качества.Особенно эффективной была ренмнуннзацкя лето» и осень», когда даже при четвертом цикле иммунизации антигенами MBS-и SBK наблсдали увеличение титра сывороток в 8 раз, по сравнении с первоначальной иммунизацией. В весенние месяцы /март-апрель/, когда проходит линька животных, титр антисывороток снижается /табл. 6/.

Таблица 6

ВЛИЯНИЕ РЕИММУНИЗ АЦИй НА ТИТРУ СИВОРОТОК К ' 5 и К - ВИРУСАМ КАРТОФЕЛЯ

кол-во! титр L-™,, !кол-во! титр вимукваацнн . 'периодпериод !кри[и.!скв0|0т_

SBK

квк

! ков t КИ

I ков! кв

октябрь 1972 г.

Иммунизация Реиммуякэацня: I ^|каОрь

15 13 12 12

256 10» 512

гоое •

декабрь ,1972 г. 12

,февраль

апрель 1973 г. XI

октябрь 1973 г" 9

512 2046 256 1006

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что нам удалось добиться положительного -эффекта реимиувизации благодаря же-; пользование комбинированной схемы иммунизации с адъпвактами. '

Многократное использование животных позволяет повысить ка- ; чества диагностических сывороток и значительно увеличить ее коли* чество, получаемое от каждого кролика, что в конечном итоге ведет я повышенно производительности труда.

5 опытах при получении диагноотичеокой сыворотки к SBK ж НВК после 12- кратного отбора крови от каждого кролика получили Ш среднем 462-513 мл крови, или же 223-238 мл нативкой сыворотки. Это позволило от 60-70 кроликов ежегодно производить 200-240 литров сывороток. . '

. При длительном хранении нативкнх диагностических сывороток лучшим способом консервирования в наших опытах оказалось добавление 25% глицерина. В течение 9 месяцев сыворотка, законсервированная таким способом, сохраняет свой первоначальный титр. При консервировании 0,5^-ным фенолом наблюдается снижение титра в 2 раза уже через 6 месяцев хранения. Кроме того, при консервировании фенолом выпадает белый осадок,- а при использовании глицерина в сыворотке в течение 9 месяцев осадок не образуется.

Таким обравом, для яативвых и слабораэведенных (1:2) антисывороток лучшим консервантом является 25^-аый глицерин. Лдя консервирования сывороток в рабочем разведении мы яа протяжении многих лет с успехом используем фенол, добавляемый до 0,5% в стерильный физраствор.

Технология массового производства диагвости-ческих сывороток к основным вирусам картофеля

На основании проведенных исследований нами разработана усовершенствованная поточная технология массового производства диагностических сывороток к основным вирусам картофеля.

Сущность технологии замечается в следующем. Вирусы картофеля поддерживают в итамновых растениях, которые выращивает в изолированных условиях. Для их накопления используют серологически неродственные карт'офеле растения-накопители: дурман /ХВК/, томаты сорта Советский /НВЕ/.и сорта Невский /5ВК/.

Листья растений-накопителей для получения инфекционного сока собирает через 3-4 недели после заражения. Их охлаждает в

¿о

морозильной как*ре~хо в течение I часа и измельчает на мясо-

рубке, Вирус экстрагируют рабочим буфером рН 9,0 /0 05 М натрий лимовнокислыё трехзамещенный с добавлением 0,007 к трилова Б и 0,2$ сульфита натрия/ в течение Ю-15 мин. и отжимают сок черев капроновую ткань« Инфекци о в в ый.сок цен Три фу гиру от 20-25 нив. при' 3500 об/мин..К надосадочной жидкости добавляет охлажденный до 3-5°С хлороформ / 1/7 часть от объема сока/ и эмульгируют в течение -5-6 мин. Затем центрифугируют при том же реиике и кадоса-," дочвул жидкость пропускают через хроматографическую колонку, заполненную колселектами Г-50 и-ЛЗАЭ-50 /анионит/. Элшрованке вируса осуществляет-0*5 М ИаС1в рабочем буфере рН 7,0. Отбирают фракции, содержащие вирус. Вируса концентрируют 2(&-нык полиэти-хэнгликолен мол. веса 15000, который добавляет к эдоату до 15,3? /ШС и 5ВК/ к Х6 /ХВК/, Одновременно г элюат добавляют 0,5 К К&С1: до 0,25 М коннентрадии, Элюат выдерживает I час в холоди льникеи центрифугирует в течение 20-25 мин. при 4000 об/мин. Полученный осадок ресуспендирусг физраствором в объеме, составляющем 0,1 от первоначального объема инфекционного сока.

Полученным вирусным антигеном'иммувиэируст кроликов комбинированны« способом с 1^-ной смесью альгината.натрия в желатины /соотношение .1:1/. Кровь отбирает 3 раза на 7, 9 н II.день после последнего введения антигена. Реиммунизации проводят не кенее, , чем через 30-35 дней после отбора-крови путем 3-4-х кратного ■внутривенного введения возрастающих доа антигена,

-Полученную антисньоротку центрифугируют 20-25 мин, ври • 3000 об/мин., определяют ее качество,, консервируют глицерином, : стерилизуют^ помощью дискового фильтра марки и хранят в холодильнике до-рабочего разведения при температуре 1-3°С.

Л Применение этой технологии при кассовой производстве диаг-,ностяческих сывороток к основным вирусам- картофеля в институте зназдтельно повысило производительность труда и качество выпускаемой продукции /табл. 7/.

КА^СТВО ШСАПЮСТЙЧЕСКИХ CÜBOFOTQK К ВИРУСА* КАРТОФЕЛЯ, ПРИГОТОВЛЕННЫХ В 1973-1973 ГГ. >;■

' -;-:-1 №ч*с*1А !-——--'- ■

г й _ „ _ I иатявкой 1 Т » т р а :

^ v ! сыворотки, ( с ы в о р о г о *

1 ил .".■ t

• Х-вирус картофеля

24 925 512

16,1В ,20-22,25,26,28 5350 102*

17,27.29,30 ' 2685 20«

19,23 • ЕЮ 4096.

tf—вирус картофеля 17 65 С 256

13,15,21 1290; '512

16,18,19,23,26 3360 Ю24

14.22,24,25 2985 2048

20,27 1555 4096 '

S-вирус картофеля:

10,11 1210 256

9, D, 17,21-23 4960 512 -

12,18,19,20 ав« Ю24

14,15,16 2265 2046

8 седьмой главе "Повыяение чувствительности аатисыворото» путей сенсибилизации аятител бентонитом а палыгорскнтом" приведены данные по применение природного минерала палыгорскита в качестве адсорбента специфичных антител.

Для поадпеяяя чувствительности серологи ческих реакций прш-' меняет сенсибилизированные сыворотки, полученные путей пассивное адсорбции антител антивирусных сывороток на инертных частицах латек-а, бетонита или эритроцитах /О.Г. Гсрдейчук, 1972; Р.В. Гнутоза, 1974; Bozicsvlcb, Scott, Vincent, 196?;

Jermoljev, Albrectitova, 1965i Bereits, 1967; Kahn. ■ coast., 1967 Maat, 1970 ).

Среди iCOHteuKMX мм* б природных минералов наиболее устой-чивув еусяен»« > воде образует палыгсрскит. Поэтому, мм мсследовали его в сравнении с фирменным канадским бентонитом, лсбезао предоставленным нам F.6. ГнутовоЯ us Ьиолого-почвенного института /г. Владивосток/. , ,

Опыты проводили с аитясывороткамн к ИИ, которые имели титр 1:2046 к 1;512.Получекяые сенсибилизированные сыворотки испытывала 'с ХВК из листьев дурмана я молодых растений картофеля. Контролем служил сок здорового растения + адсорбированная сыворотка. -

Результаты анализа свидетельствует о том, что чувствительность адсорбированных сывороток выше по сравнении с. обычными /табл. 0/.

Таблица 8

ПОВЫШЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ ПРИ АДСОРБЦИИ ГШАГЛСШШНОВСЙФРАКЦИИ СЫВОРОТКИ НА ИНЕРТНЫХ ЧАСТИЦАХ

Сыворотка к XES

антигена' \

О^ычкая' 1:64 1:8

Адсорбированная -

бентонитом 1:1024 1:16

■г

Адсорбированная

палыгорскитом 1:1024 1:32 .

■При анализе инфекционного сока молодая растения картофеля было отмечено, что сыворотка, адсорбиро&аявая на налыгереккте, показывает лучшие результаты, чем на бентоните. Кроме того.гамма-глобулиновая фракция с палыгорскитом сохраняет серологическу» активность более длительное время;

в а во д а V £.Тстакоэлено, что в условиях массового производства аати-сывороток лучаими растенняим-кахоантелямн для М-вируса является томаты сортов Советский, Невский"и Украинские тепличный, для 3-вяруса картофеля - томаты сорта Невская. При эаракеяим сорта Невский целесообразно использовать иэоляты вируса S из мтаммовмх

■г-¿л ' л ■ '

¿сгеииЯ, содержавих наибольшее количество вируса.

2. Вирусы 3 к II достигают максимального накопления в томатах, через 3-4 недели после заражения. Устранить нежелательное вытягивание томатов в условиях искусственного освещения можно путем обработки их препаратом тур, который не влияет на накопление вирусов.

3. При массовой очистке вирусного антигена использование нитратного рабочего буфера с антиоксидантамя способствует более длительному сохранение серологической активности лабильных вирусов и получению очищенных вирусов в неагрегированком состоянии.

Для получения вирусного антигена в больяих количествах целесообразно использовать комбинированную колонку, заполневнув молселектами Г-50 и 1ЭАЭ-50. Вирусные препараты после очистки на такой колонке отвечают основным критериям чистоты.

5. На последнем этапе очистки для концентрирования вирусов хорошие результаты дает использование полиэтиленглнколя, который обладает адьювантной активностью.

6. Наиболее эффективным методом иммунизация животных является внутримышечное введение вирусного аятжгева с адьквантом в комбинация с внутривенное иммунизацией.

7. После иммунизации животных с алытантами высококачественные диагностические сыворотки можно получать путем Э-А кратного введения вирусного антигена, которое позволяет наиболее полно ' использовать иммунологическую реактивность животного.

В. Максимальное накопление антител в организме животных при комбинированной схеме иммунизации с адъютантами происходят на ' 7-11 день после последнего введения вирусного антигена.

9. Предложенная схема очистки лабильных К и 5 -вирусов кар-тойеля, вклочащая использование рабочего буфера, кратковременное амульгированна ^ охлажденным хлороформом и гельфильтрацир на комбинированной колонке, позволила получать специфичные антисыворотки высокого качества.

10. Для сенсибилизации гамм&тглобулиновой фракции'сыворотки к Х-вирусу картофеля может быть с успехом использован природный минера ч иалыгорски!который значительно повышает чувствительность серологяческой реакции.

. II. Проведенные исследования позволили разработать прогрессивную технология кассового производства диагностических сывороток к вируса* картофеля, которая биав. принята за основу ври составлении технического проекта специализированного цеха по производству антисывороток.

ПРШОЕШЯ ПРОИЗВОДСТВУ .

1. Ба- ос нога нии проведенных исследований разработана прогрессивная технология кассового производства диагностических сывороток к вирусам картофеля, которая утверждена Скьым отделением ЕДСХШ'Л, согласована с Кинистерствои сельского хозяйства УССР и занижена авторским свидетельством СССР > 519472. £а период 1972-1975 гг. по новой технологии ¿то изготовлено и реализодано около 70 тыс.

ф лаковое вне жокачестве иных дшгвостических сывороток на 17,5 млн. серологических а® газов. Технология утверждена КСХ СССР в качестве тиковой для всех »абораторяк страны, вакимагшкся производством таких сывороток. -

2. Для внедрения г практику семеноводства картофеля рекомендуется способ постановки серологических реакции сыворотками к

I* вирусу картофеля, адсорбирована»и ва природном минерале пали-горские, гаицеивыа авторским свидетельством'СССР »432193,

3. Рекомендуется с цельс повышения качества диагностических сывороток способ ковцентрйровааия растительных вирусов с помощь» яопэгилеаглхкеха, которДО яри совмести«« введении с.вирусным антигеном в организм животного обладает адьввантвой. активность о, стиму-

" жирует образовавве антител.

Предложен проект стандарта ва диагностические сыворотки к вирусам картофеля. '

ОСНОВНЫЕ'ПШОШШ ДИССЕРТАЦИИ ШШШ В СЛЕДУ П[ ЮС

. .. КЕОШ:

1-. Использование адыдаавтов при массовом производстве диагностических антвскэоротоя к некоторым вирусам картофеля. В сб.; "Отологические свойства микроорганизмов" (Материалы I Республиканской конференции молодых ученых инкробиохогов и вирусологов). • Киев. 1972, 66.,

2. Использование иоясеяектов к акрилексов дяи очистки вирусов картофеля. Микробиологический щурнах, 1573, т. 35, в. 3, 396-397 (в соавторстве). .

3. Использование тлматов для аакопгевия S-вяруса картофеля. при массовом производстве диагностической сыворотки. Вестник сельскохозяя-ственноЯ науки КСЯ УССР, 1571, № 3. 55-59 (в соавторстве).

4. Способ постановки серологических реакций Авторское свидетельство ХСР » 432193 от 18.09.72. К. кл. (Я2 kI/ÜO. "Ввллетень изобретения", 1974, ft 22 Св соавторстве). 4

5. Испоньзование адытнтав при массовое пройаводстве диагностических сывороток н некоторда вируса! картофеля. Сельскадозяйствеашй ■ биолсгкя, 1975,. т. IÖ, S 4, 551-554 (в соавторстве).,

6. Производство и использование диагностических сывороток для получения безвирусного картосеея на Украине. В сб.: "Современные методы . псяучения безвирусного картофеля" (Тезисы докладов к Всесоюзному семи-, нару-ссвеиаеию (6-6 октября 1975 г. Москва). Н., 1975, 84-86 <ь соавторстве). ■ ;''.-■■ "...'■■■■;'.

7. Повышение чувствительности серологической ре^кции-о аоиогоьв ; суспензии палыгорскита. ДохидЫ ВАОШИ1, 1976, Ь I.-19-20 (в соавт.).

Е. Растения-накопители $-вируса картофеля при кассовсиспроизводстве диагностических аатясыворотшс. В кн."Вируса ье. бохе&яи растений 2альнего Востока". Труды Биолого-почвеяыого EH-та, т, 25(126). Вяади-. восток, 1976, 227-232 (в соавторстве).

9. Способ приготовления диагностических сывороток к вирусам растений. Авторское свидетельство ОССР 5Г9472 от 3.03.75. Н. кв2 &2 к "Бмлетень изобретений", 1976, В 24 (ь соавторстве).

10. Влияние тура и кинетика' на рост томатов и накопление в них K-вируса картофеля. (Отдеаьное приаоженке* к яетодическек указания» по работе с препаратах тур в паодоводстве в еЬоиеводстве - по иатери-алам 3-го Всесоюзного совещания). М., 1676,. 26-С9.

XI. Производство и использование дгагвостическгх сывороток д*я получения беэвирусвого картофеля на Украине. В сб. "Sa пи та картофеия от вирусных боаезней в семеноводстве". Научные труды НИШ, вып. 30. *., IS77, 67-73. . . :

12. Применение антивирусных диагностически* сывороток в семеноводстве' карто{евя. Информационные юсток > 77-1е. Чернигсвскк? центр HTF., 1977. .. . . ''"'.''

13. Тисовая технология кассового производства.диагностических сывороток к X, 5, К, 7, R - вируса« картофеля. К CS СССР, ВАСХНИХ, X. 2977 (в соавторстве). '■: . v.;-;

14. Производство диагностических сывороток к вирусам карте?»ая пето-о* гельфильтрацп. Сеиьскохиявственная биология. XS78, т. 13, * I (в соавторстве).

Ув/в^/ОЙ , . J /GS-^. г, /ОО' яз/г