Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование иммунохимических методов лабораторной диагностики классической чумы свиней

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Шарифуллин, Альберт Ильдарович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современное представление о возбудителе классической чумы свиней (КЧС).

1.2. Распространение КЧС.

1.3. Лабораторная диагностика классической чумы свиней.

2. УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы исследований.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ (ОСНОВНАЯ) ЧАСТЬ ДИССЕРТАЦИИ.

3.1. Подбор оптимальных условий культивирования вируса

3.2. Изучение антигенного состава вируса КЧС штамма "Ши-Мынь".

3.2.1. Очистка, выделение и концентрирование антигена вируса

3.2.2. Анализ полипептидного профиля возбудителя КЧС в однородной и градиентной системах ПААГ.

3.2.3. Выявление и оценка специфических антигенных структур возбудителя КЧС методом иммуноблотинга.

3.3. Сравнительная оценка эффективности способов получения антигена вируса КЧС.

3.3.1. Оптимизация метода выделения, очистки и концентрирования специфического антигена вируса КЧС.

3.3.2. Определение серологической активности иммунодоминантного белка вируса КЧС.

3.4. Определение антигенной (иммуногенной) активности полипептида вируса КЧС на белых крысах, кроликах, овцах.

3.4.1. Подбор продуцентов, наиболее подходящих для получения иммунопреципитинов.

3.4.2. Оценка специфической активности иммунопреципитинов к вирусу КЧС для обнаружения антигена возбудителя в ИЭОФ.

3.5. Усовершенствование ИФА для индикации возбудителя

3.5.1. Сравнительная оценка методов выделения и очистки иммуноглобулина О из сыворотки крови.

3.5.2. Оптимизация способа выделения - Р(аЬ/)2 фрагментов

3.5.3. Изготовление иммунопероксидазных компонентов на основе - Р(аЬ/)2 фрагментов антител и их сравнительная характеристика.

3.6. Применение ИФА и ИЭОФ для индикации возбудителя

3.6.1. Прижизненная индикация возбудителя КЧС.

3.6.2. Индикация возбудителя КЧС в патологическом материале 88 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование иммунохимических методов лабораторной диагностики классической чумы свиней"

Актуальность темы. Несмотря на наличие достаточного количества надежных средств специфической защиты, классическая чума свиней остается в числе опасных и распространенных вирусных болезней, наносящий значительный экономический ущерб свиноводству многих стран мира. По решению МЭБ заболевание классической чумы свиней отнесено к группе особо опасных болезней, которое должно находиться под особым контролем ветеринарной службы всех стран. Наличие латентных форм, длительное вирусоносительство, сходство с другими болезнями, затруднительная диагностика осложняет своевременную индикацию возбудителя КЧС и способствует его распространению (Harknes J., 1985; Вишняков И.Ф., 1983, 1986, 1998; Юсупов Р.Х., 1981, 1983, 2000; Куриннов В.В. и др., 1992; Коломыцев А. и др., 1998, 2000).

Лабораторная диагностика КЧС основывается на выявлении вирусного антигена, специфических антител, обнаружении вирусного генома и выделении вируса (Попов В.И., 1983; Юсупов Р.Х., 1983, 1988, 2000; Вишняков И.Ф., 1988, 1998; Равилов А.З., 1990; Непоклонов Е.А. и др., 1998, 2000; Куриннов В.В., 1999). Диагностика зачастую осложняется наличием ложноположительных реакций из-за антигенного родства с другими пестивирусами, латентно инфицирующими свиней (Wensvoort G., et al., 1986, 1989). В крупных хозяйствах промышленного типа на фоне систематической вакцинации КЧС протекает в стертой форме, поражая в основном, поросят в период доращивания, что связано с их низкой иммунореактивностью (Terpstra С., Wenswoort G., 1987; Correa G. et al., 1992), а также недостаточностью иммунного ответа у части вакцинированных свиней (Depner К. et al., 1997; Непоклонов Е.А., 2000). Для регистрации наличия вируса имеются коммерческие наборы, изготовленные в Германии, Швейцарии (фирмы Bommeli, Chekit CSF-SERO). Однако при массовых исследованиях на КЧС эти средства не доступны.

Сложность возникающей ситуации по КЧС, отсутствие и недоступность эффективных иммунохимических методов и средств диагностики болезни, изготовленных на основании достижений молекулярной биологии, ставит их разработку как актуальную задачу ветеринарной науки.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось получение иммунодоминантного белка возбудителя классической чумы свиней и изготовление на его основе диагностических наборов для усовершенствования лабораторной диагностики болезни.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. подобрать оптимальные условия культивирования вируса классической чумы свиней;

2. изучить полипептидный состав и антигенную структуру вируса классической чумы свиней;

3. усовершенствовать методы получения специфических антител к вирусу КЧС на основе выделенных серологически активных его компонентов и оценить специфическую активность очищенных антител различных видов животных в качестве иммунопреципитинов для индикации возбудителя методом иммуноэлектроосмофореза (ИЭОФ);

4. оценить специфическую активность очищенных антител различных видов животных в качестве иммунопреципитинов для индикации возбудителя методом иммуноэлектроосмофореза (ИЭОФ);

5. изготовить иммуноферментные конъюгаты и оценить их пригодность для индикации возбудителя КЧС в иммуноферментном анализе (ИФА).

Научная новизна исследований.

- Впервые изыскана оптимальная система культивирования вируса КЧС на основе использования высокочувствительных гетерологичных клеток НГУК-1, подбора и количественного соотношения сыворотки крови кур вместо сыворотки КРС, что исключает попадание в вируссодержащую среду патогенных вирусов свиней, контаминацию клеток вирусом диареи и обеспечивает увеличение выхода вируссодержащей биомассы.

-Изучен полипептидный и антигенный состав вируса КЧС методами электрофореза и иммуноблотинга и на его основе разработана технология получения иммунодоминантного белка вируса КЧС с мМ 55-57 кД.

-В сравнительных исследованиях в качестве продуцентов диагностических сывороток выбраны овцы, позволяющие получать антитела с высокой специфической активностью к иммунодоминантному компоненту антигена вируса КЧС.

-Обоснована эффективность изготовленных иммуноферментных конъюгатов на основе и Р(аЬ')2-антител сыворотки крови овец для индикации возбудителя КЧС в организме больных и патологическом материале с использованием иммуноферментной тест-системы.

-Определены оптимальные условия изготовления иммунопреципитинов из сыворотки крови овец и обоснована их эффективность для индикации возбудителя КЧС в организме больных и патологическом материале с использованием иммуноэлектроосмофореза.

Практическая ценность работы. На основе проведенных исследований выделена и характеризована иммунодоминантная фракция белка вируса КЧС. Разработанный метод выделения специфического белка вируса КЧС позволяет получить очищенный компонент антигена вируса в количествах, достаточных для его практического применения с целью изготовления диагностических наборов для ИЭОФ и ИФА. Изготовленные наборы рекомендуются применять в ветеринарной практике для индикации возбудителя КЧС в различных пробах, взятых при жизни больного животного и в патологическом материале.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны и оптимизированы условия культивирования вируса в гетерологичной культуре клеток невриномы Гассерового узла крысы с добавлением в ростовую среду сыворотки крови кур, что обеспечивает получение чистого антигенспецифического белка вируса КЧС.

2. Иммунодоминантным компонентом вируса КЧС является антигеноспецифический белок возбудителя с мМ 55-57 кД.

3. Оптимизирован метод выделения белка вируса, который позволяет получать очищенный антигеноспецифичный компонент вируса КЧС с мМ 5557 кД.

4. Разработаны и рекомендованы наборы препаратов для иммуноэлектроосмофореза, иммуноферментного анализа на основе антител к специфическим белкам вируса для прижизненной индикации возбудителя КЧС и обнаружения антигена вируса в патологическом материале.

Апробация работы. Результаты выполненных исследований доложены и обсуждены на отчетных сессиях ВНИВИ (1998-2002); на конференции, посвященной 125-летию КГАВМ (г. Казань, 1998); на юбилейной конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ (г. Покров, 1998); на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998); на конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань 2001); на научно-практической конференции ВНИИВВиМ (г. Покров, 2001); на международной научно-производственной конференции (Воронеж, 2002).

Публикация результатов исследования. По материалам проведенных исследований опубликовано 10 работ, 1 работа сдана в редакцию журнала "Ветеринария".

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 15

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шарифуллин, Альберт Ильдарович

5. ВЫВОДЫ

1. Экспериментальным путем подобраны оптимальные условия культивирования вируса КЧС на культуре клеток НГУК-1 с добавлением сыворотки крови кур, исключающие возможность случайного попадания в среду патогенных вирусов свиней с клетками свиного происхождения и освобождающие от контаминации клеток вирусом диареи, возникающей при использовании сыворотки крови крупного рогатого скота.

2. Методами электрофореза и иммуноблоттинга выявлен иммунодоминантный специфический компонент белка вируса КЧС с мМ 5557 кД.

3. Разработан способ выделения и очистки иммунодоминантного белка вируса КЧС с мМ 55-57 кД на хроматографической колонке с гидроксилопатитом. Экспериментально определены его антигенные и иммуногенные свойства.

4. В качестве продуцентов диагностических сывороток выбраны овцы-доноры, позволяющие получать антитела с высокой специфической активностью к иммунодоминантному компоненту антигена вируса КЧС.

5. Отработана эффективная методика выделения иммуноглобулинов в и Р(аЬ/)2 - антител сыворотки крови овец и создана на их основе тест-система, обеспечивающая прижизненное выявление возбудителя КЧС в ИФА.

6. Установлено, что иммуноглобулины в овец обладают высокими преципитирующими свойствами по сравнению с белых крыс и кроликов и обеспечивают выявление возбудителя КЧС в ИЭОФ.

7. Созданы диагностические наборы на основе антител Р(аЬ/)2 и ^О, позволяющие обнаруживать возбудитель КЧС в 80-100% случаях с помощью ИФА и ИЭОФ в течение 3 и 1,5 часов с момента постановки реакций.

99

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны:

1. «Методические указания по применению иммунопреципитинов для индикации возбудителя КЧС методом иммуноэлектроосмофореза» утверждены директором института 19.09.2002 г.

2. «Методические рекомендации по изучению электрофоретических и антигенных свойств вируса классической чумы свиней методами электрофореза в ПААГ-8В8 и иммуноблотинга», утвержденные директором института 26.11.2002г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата ветеринарных наук, Шарифуллин, Альберт Ильдарович, Казань

1. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромылов Г.Ф., Дзаитиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров Н.М. Иммуноферментный анализ // Ветеринария. 1982. - №8. - С. 33-36.

2. Авроров A.A., Акулов A.B., Бурба Л.Г. и др. // Паталогоанатомическая диагностика болезни свиней / Под ред. Шишкова В.П. и др.-М.: Колос, 1984.-217с.

3. Авцын А.П., Кондакова Л.И., Халанский A.C., Полякова Г.П., Чудиновская Н.В. Новая клеточная линия невриномы Гассерового узла крысы НГУК-1 //Цитология. 1989.-Т. 31. -№1.-С. 97-102.

4. Агейкин В.А., Артамонов Р.Г., Чакветадзе С.С., Шевченко H.H. Влияние антибиотикотерапии на течение менингитового менингита у детей грудного возраста // Медицинский научный и учебно-методический журнал. -2002. №6.-С. 40-45.

5. Аренова Н.В., Павлович Н.В. Сравнительный анализ иммуного ответа кролика на антигена живых и убитых бактерий рода Francisella // Мол.ген.микроб. и вирусол. №2. - 2001. - С. 26-30.

6. Бакулов И.А., Буткин Е.И., Ведерников В.А., Юрков Г.Г. Эпизоотология с микробиологией. -М.: Агропромиздат, 1987. С.287-291.

7. Балышева В.И., Жестерев В.И., Вишняков И.Ф., и др. Суспензионный метод культивирования вируса КЧС // Тез. докл. Всеросс. научн. практич. конф. Вирусные болезни сельскохозяйственных животных.- Владимир, 1995 г. С.82.

8. Безбородова C.B., Дрыгин В.В., Перевозникова H.A., Толокнов A.C., Старов С.К., Гусев A.A. Использование метода полимеразной цепной реакции для выявления вируса КЧС // Материалы научн. практич. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С. 73.

9. Белоусов В.И. Конструирование тест-системы ИФА для выявления левомицитина в пищевых продуктах // Тез. докл. Всерос. научн. практ. конф., посвящ. 30-летию ин-та. Щелково, 2000. - С. 286-287.

10. Березин И.В. Состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // Бюлл. ВИЭВ. 1985. - В. 58. - С. 3-5.

11. Бибов М.Ю., Павлова Т.В. Хроматографический метод получения донорского противолептоспирозного иммуноглобулина // Материалы конференции молодых ученых северного Кавказа по физиологии и валеологии 12-13 октября 2000. Ростов-на-Дону.

12. Блинковский A.M., Чечик О.С., Попинский A.C., Ярославов A.A. Полистироловые карбоксилированные латексы как носители иммуносорбентов // ЖВХО им Д.И. Менделеева. 1989. - Т.34. - №.1. - С. 122-124.

13. Буерова C.B. Усовершенствовование средств диагностики и идентификации возбудителя сибирской язвы: Автор, дис. . канд. биол. наук.- Казань, 2002. 22с.

14. Васильев П.Г. Актуальные проблемы сибирской язвы: биология и индикация возбудителя, клиника, патоморфология и диагностика заболевания: Автореф. дисс. .докт. биол. наук. Казань, 2001. - 36 с.

15. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа. Твердофазный иммуноферментный анализ // Тр. ин-та. 1988. - Т. 64. - С. 3-27.

16. Веселов С.Ю., Синяков М.С., Хоритоненко И.Г., Гительман А.К., Васяев А.И. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественной индикации гемагглютинина вируса гриппа в биологических образцах // Вопр. вирусол. 1985. - №6. - С. 627-675.

17. Виджюкайте P.A., Кулис Ю.Ю., Пемкус Ю.К. Иммобилизация иммуноглобулинов на активированных полиэтиленимином полистирольных носителях // Инженерная энзимология: Тез. IV Всесоюзн. Сипмозиума. -Вильнюс, 1988. -4.11. С. 5-6.

18. Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я. Иммуносорбентный анализ // Ветеринария. 1983. - №9. - С. 68-70.

19. Вишняков И.Ф. Диагностика классической чумы свиней // Ветеринария. 1986. - №3. - С.27-30.

20. Власенко С.Б., Гаврилова Е.М. Научные основы и перспективы применения в иммунохимических методах анализа хеми- и биолюминесцентных реакций // ЖВКО им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т.34. -№1. - С. 24-30.

21. Галиуллин А.К., Ахмеров Ж.ш., Низамов Р.Н., и др. Авторское свидетельство № 242578, 2.10.85. М., 1985. - Фонд ВНИВИ.

22. Галиуллин А.К., Гареев Р.Д., Барабанов В.И. и др. Авторское свидетельство № 307620, 2.01.90. М., 1990. - Фонд ВНИВИ.

23. Галиуллин А.К., Коксин В.П., Буерова C.B. Разработка и внедрение в ветеринарную практику иммунохимических тест-систем для диагностики и индикации возбудителя сибирской язвы // Вет. врач. Казань, 2001.-№2(6).-С. 31-34.

24. Гизатуллин Х.Г., Юсупов Р.Х. Чума свиней и современные методы ее лабораторной диагностики. Казань, : Тат. Книжное издательство, 1973.- 120 с.

25. Гмыль JI.B., Карганова Г.Г., Смирнова С.Е., Лашкевич В.А. Вирусологические белки вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки // Вопросы вирусологии. №3. -2002. - С. 16-21.

26. Горовиц Б.М., Еремин С.А., Осипов А.П., Егоров A.M., Казанская Н.Ф. Иммуноферментный анализ тироксина на полосках бумаги с визуальной детекцией // ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. - №.1. - С. 124.

27. Горский Б.В. Проявление чумы свиней на фоне рахита // Научн. тр. Казанского вет. ин-та. 1980. - Т. 133. - С. 33-35.

28. Горский Б.В., Юсупов Р.Х. Ретроспективный анализ классической чумы свиней в крупных специализированных хозяйствах // Вет. пробл. пром. свиноводства. Киев, 1983. - С. 59-60.

29. Грязева И.В., Климович В.Б., Пашкова С.Ф. Моноклональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека и их применение в иммуноанализе // Иммунология. 1994. - №3. - С. 31-37.

30. Гулд Е., Клегг Дж. Культивирование и очистка тогавирусов // В кн.: Вирусология (методы). Под ред. Б.Мейхи.: "Мир", 1988. С.95-104.

31. Гуненков В.В., Шарабрин О.И., Коромыслов И.Г. Диагностика иммуноферментным методом короновирусной инфекции крупного рогатого скота // Вестн. с.-х. науки. 1985. - №11. - С. 112-124.

32. Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 1982. - Т. 27. - №4. - С. 442-449.

33. Дружинин В.В., Зубов C.B., Кнак Н.И. Прямой метод ИФА для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита в (Анти-Hbs) // Инженерная энзимология: Тез. IV Всесоюзн.симпозиума Вильнус, 1988. -Ч.11.-С. 12-13.

34. Дубровин В.М., Коломыцов A.A., Черятников C.JI. Ликвидация классической чумы свиней общеевропейская проблема // Вет. врач. №3. 1997.-С. 56-57.

35. Дудникова Е.К. Разработка и применение иммуноферментного анализа для выявления противоящурных антител в сыворотках крови животных: Автореф. дисс. . .канд. вет. наук. Владимир, 1997. - 25с.

36. Егерева С.А., Юсупов Р.Х., Ильясова Г.Х. Чувствительность культур клеток к вирусу чумы свиней // Мат. респупл. научн. произ. конфер. "Актуальные вопр. ветер, и зоотехн." Казань, 1992. - С.21.

37. Егоров A.M. Современный иммунохимический анализ и перспективы его развития // ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 33. -№5.-С. 494-502.

38. Екимов А.Н., Загребина О.С., Кисина В.И., Говорун В.М. Метод генотипирования клинических изолятов Ureaplasma urealyticum биовара parvo // Мол.ген.микр. и вирусол. №1. - 2001. - С. 28-32.

39. Еремин С.А., Будавари М.И., Большакова Т.Д. Синтез пероксидазного конъюгата с помощью гетеробифункциональных сшивающих реагентов для целей иммуноферментного анализа тироксина // ЖВХО им. ДИ. Менделеева. 1989. - Т. 34. - №1. - С. 117-119.

40. Жданов В.М., Букринская А.Г., Сито А.Ф. Характеристика РНК вируса сендай при исследовании их полиакриламидных гелях // Вопрос, вирусологии 1971. - №1. - С. 77-81.

41. Жердев A.B., Резчиков A.A., Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Иммуноанализ ферментов // ЖВХО им Д.И. Менделеева. 1989. - Т.34. - №1. - С. 38-46.

42. Захарова И.Б., Викторов Д.В., Замараев B.C. Клнирование и экспрессия 7.55 Т.П.Н. KPNI фрагмента плазмиды РРМ1 Burkholderia pseudomallei bescherichia coli // Мол. ген. микроб, и вирусол. - №2. - 2002. -С. 19-22.

43. Ильяненко Б.И. Выделение и функционально-структурная характеристика Bacillus polymyxa // Мол.ген.микроб. и вирусол. №2. - 2001. -С. 8-13.

44. Ильясова Г.Ф., Насыров Ш. М. К вопросу оптимизации иммуноферментного анализа для контроля поствакцинального иммунитета // Тез. докл. научно-практ. конф. мол. ученных КГМА. -Казань, 1999. С. 5758.

45. Ильясова Г.Ф., Цибулькин А.П., Сафин М.В., Угрюмова B.C., Матвеева Л.И. Фармаколгическая стимуляция продукции моноклональных антител к вирусу псевдобешенства // Тез. докл. Всеросс. научн. конф., посвящ. 30-летию института. Щелково, 2000. С. 230-231.

46. Ильясова Г.Х., Юсупов Р.Х., Бусыгин К.Ф. и др. Способ получения иммуноспецифической сыворотки к вирусу классической чумы свиней на овцах донорах // Авторское свидетельство №304710. 1 декабря 1989.

47. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Порываева В.А., Лебедев Л.Р. и др. Конструирование и исследование антигенных свойств рекомбинантного штамма сальмонеллы, продуцирующего белок TBI // Вопросы вирусологии. №2. - 2002. - С. 25-28.

48. Карулин А.Ю., Дзантиев Б.Б. Поливалентное взаимодействие антиген-антитело: теоретические модели и роль в иммуноанализе клеток // ЖВКО им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. - №1. - С. 30-38.

49. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела. Гибрид омы: новый уровень биологического анализа. Москва: Медицина, 1983. - 416с.

50. Ким Б.Б., Гаврилова Е.М. Эффект ингибирования пероксидазной активности антителами к ферменту в реакции усиленной хемолюминисценции // ЖВХО им Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. - №.1. -С. 116-117.

51. Клестова З.С. Воздействие вируса КЧС на хромосомный аппарат клеток свиней // Тез. докл. научн. практ. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. -С. 23.

52. Клейман A.M., Сенюта Н.Б., Трякин A.A., Виноградова Т.В. и др. Экспрессия эндогенных ретровирусов семейства HERV K/HTDV у больных герминогенными опухолями яичника // Вопросы вирусологии. - №6. - 2001. -С. 15-21.

53. Кнорре Д.Г. ДНК- и РНК-зонды как альтернативы и дополнение иммунохимического анализа // ЖВКО им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. -№1.-С. 52-60.

54. Коксин В.П., Алимов A.M., Ильясова Г.Х. и др. // Фонд НИВИ №81998

55. Криевиня В.Я., Елигуашвили Р.К., Калнинь М.М. Разработка твердой основы для иммуноферментного метода // Вирус, гепатиты типов А и В.-Рига, 1983.-С. 100-109.

56. Кропотов B.C. Средства и методов повышения имуногенности вакцины против болезни Тешена: Атореф. дисс. . .канд. биол. наук. Покров, 2001.-28с.

57. Купель JT.B., Лапидус A.M., Моторин Ю.А., Маркарен А.Н., Машко C.B. Выделение и свойства рекомбинантной бета-галактозызидазы // ЖВХО им Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. -№.1. - С. 120-122.

58. Куш A.A., Ворович М.Ф., Тугизов Ш.М., Тимофеева A.B. Моноклональные антитела к неструктурному белку вируса клещевого энцефалита NS 3 // Пробл. мед. иммунобиотехнол. / Матер. Всес. научн. конфер., октябрь. Л. 1988. - С. 137.

59. Лобзин Ю.В. Рахманова А.Г., Антонов B.C., Усков А.Н. и др. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов // Рекоменд. для врачей. Санкт-Питербург. -2000.-15 С.

60. Лыска В.М., Куринов В.В., Хухуров И.Ю., и др. Отработка условий получения очищенного вируса КЧС // Тез. докл. Научн. конфер. ВНИИВВиМ "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии". Покров, 1990. - С.60-62.

61. Лярски 3. Диагностика вирусных болезней животных. М.: "Колос". - 1980. - С.339-343.

62. Малярец П.В., Гусева Е.В., Анусрриева Т.А. КЧС: Обзор литературы. Владимир 1995.

63. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрун Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М."Мир". 1984. - С. 157-160.

64. Массино Ю.С., Кизин В.А., Дмитриев А.Д. Новый подход к конструированию гибридом, основанный на использовании актиномицин-Д-резистентной линии миеломы мышей // Биол. эксперим. биол. и мед. 1991. -№11. - С. 511-514.

65. Матюшичев В.Б., Потапенко Л.Б., Дементьев A.A., Соколов И.Н. оптимизация метода очистки антител для иммунофлюоресцентной диагностики гриппа // Вопр. вирусологии. 2001. - №1. - С. 44-47.

66. Мищенко Н.К. Разработка культуральной вирус вакцины для специфической профилактики КЧС. - Автореф. Дисс. на соиск. уч. степ. док. вет. наук. - 1981.-344 с.

67. Мищенко Н.К. Чума: (классическая) свиней //В кн. Инфекцион. Болезни животных. М.: "Колос", 1987.-С. 19-20.

68. Моренков О.С., Манцигин Ю.А. Выявление пролиферирующих клеток с помощью моноклональных антител к 5-брош-23-дизоксиуридину методом пероксидаза-антипероксидаза // Цитология. 1990. - Т. 32. - С. 12251228.

69. Моренков О.С. Разработка иммуноферментных методов выявления антител к гликопротеину gB вируса болезни Ауески в сыворотке свиней // Вопросы вирусологии. 2000. - №3. - С. 45-48.

70. Непоклонов Е.А. Использование иммунопероксидазного метода для индикации антигена вируса инфекционного ронотрахеита в культуре клеток ПЭК // Пробл. вирусол. молек. биологии и гистологии с.-х. жив-х. -М., 1983.-С. 14-15.

71. Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., Ленева И.А. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней // Р.Ж. Вопрос. Вирусол. 1998. - №4. - С. 152-158.

72. Непоклонов Е.А. Классическая чума свиней: разработка методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики: Автореф. дис. . биол. наук. Москва, 2000. - 46 с.

73. Непоклонова И.В. Применение метода ELISA для обнаружения антигена вируса ИРТ // Пробл. вет. иммунологии. М., 1985. - С. 152-153.

74. Николаев В.П., Царькова В.А. Твердофазный иммуноферментный экспресс-анализ для обнаружения вирусных антигенов // Вопр. вирусол. -1984. Т. 29. - №6. - С. 720-722.

75. Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований // Патолог, физиол. и экспер. терапия. -1960. -№4.-С. 76-84.

76. Осипов А.П., Арефьев A.A., Егоров А.И. Протчно-инфекционный иммуноанализ IgG человека в кинетическом режиме // ЖВХО им Д.И. Менделеева. 1989. - Т.34. - №.1. - С. 119-120.

77. Осипов А.П., Егоров A.M., Лебедев В.А., Чечик О.С., Блинковский A.M. Одностадийный безраздельный метод радиоиммулогического определения биологически активных соединений // ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1989. - №1. с. 127-129.

78. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование // М. "Наука", 1981. — С. 396.

79. Падюков Jl.H., Семенов Б.Ф. перспективы развития средств иммунохимической диагностики бактериальных инфекций // ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1989. -Т.34. №1. С. 11-18.

80. Перадзе Т.в., Халонена П.Ф. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций//М. "Медицина", 1985.-С. 193-228.

81. Полевщиков A.B. Способ определения концентрации секреторного иммуноглобулина А // Клиническая диагностика. 1994. - №3. -С. 38.

82. Попов В.И. Разработка и усовершенствование средств и способов специфической профилактики классической чумы свиней: Автреф. дисс. . докт. вет. наук. Покров. - 1981. - С. 109-110.

83. Простяков А.П., Лутошников А.Г. Фракционирование очищенных препаратов вируса ящура методами гельфильтрации и электрофореза // Ящур. Владимир, 1970. - Т. 1. - С. 40-45.

84. Равилов А.З., Киршин Б.А. и др. Отчет НИР. 1989. - №5. Фонд ВНИВИ.

85. Юб.Равилов А.З., Цибулькин А.П., Юсупов Р.Х., Макаев Х.Н., Угрюмова B.C., Ильясова Г.Ф. Методическеие рекомендации по применению ксимедона в качестве иммуностимулятора при вакцинации животных против инфекционных болезней. Казань, 1999. - С.4.

86. Саарма М.Ю., Ярвекюльг JI.B. Перспективные направления в иммунодиагностике вирусов растений // ЖВХО им. Д.И. Менделеева. 1989. -Т.З. - №1. - С.77-80.

87. Самойлович М.П., Климович В.Б., Пашкова С.Вф. Профили антигенсвязывающей активности моноклональных антител IgG человека // Иммунология. 1996. - №2. - С. 38-42.

88. Сатаева А.Р. Выявление инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных с помощью различных вариантов иммуноферментного анализа: Автореф. дисс. .канд. биол. наук. Владимир, 1999.-23с.

89. П.Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Киев, 1993. - С. 292-294.

90. Сергеев О.В. Пестивирусы // воп. Вирусологии. 1997. - №1.386 С.

91. Смирнова Н.И., Челдишова Н.Б., Заднова С.П., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызывавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 г. // Мол. ген. микроб, и вирусол. 2001. - №4 - С. 12-18.

92. Сосова Р.Ф. Эпизоотология. М.: "Колос", 1974. С.382-391.

93. Суслопаров И.М., Плясунов И.В., Сафронов П.Ф., и др. Разработка и получение рекомбинантного антигена gD вируса простогогерпеса 1-го типа (HSV-1) // Мол.ген.микроб. и вирусол. 2001. - №2. - С. 3437.

94. Пб.Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология. -М.: "Колос", 1979.-215 с.

95. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. М.: Агропромиздат., 1986. - 351с.

96. Тимофеев A.B., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г., Стефенсон Дж. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NSI вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 2001. -№1. - С. 22-24.

97. Тимофеева Т.А., Голяндо П.Б., Жирнов О.П. Адсорбция синтетических мембранах и иммуногенные свойства апротина, конъюгированного с помощью глутарового альдегида // Биорг.химия. 1999. -Т. 25.-№4.-С. 344-346.

98. Ткачев С.Е., Сигитова Е.В., Митрофанова Е.Э., Дурыманов А.Г., Шестопалов A.M. Новый изолят парвовируса норок // Вопросы вирусологии. -2002.-№2.-С. 35-39.

99. Тугарова A.B., Плотко H.A., Чумаков М.И. Образование TRA -зависимых поверхностных структур у Agrobacterium tumefaciens и их отсутствие у мутанта RI (ATRAR) // Мол. ген. микроб, и вирусол. 2001. -№3 -С. 13-14.

100. Тугизов Ш.М. Изучение экспрессии поверхностного антигена гепатита В в эукариотипических клетках с помощью моноклональных антител / Мон. Антитела в мед. и биотехнол.: сб. трудов НИИ вакцин и сывороток им. Н.И. Мечникова. -М., 1990. С. 166-170.

101. Устаров Р.Д., Жестерев В.И. Изучение условий хранения культурального вируса КЧС // Вопрос, вет. вирусол., микроб, и эпизоотол. / Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ. Покров, 1992. - 4.1. - С. 130-131.

102. Фаизов Т.Х., Ильясова Г.Х., Юсупов Р.Х., Алимов A.M., Барсков В.Г., Егерев С.А. Использование ПЦР для обнаружения вируса КЧС // Акт. вопр. вет. вирусол. / Мат. науч. практич. конференции ВНИИВВиМ. -Покров, 1995.-С. 74.

103. Фаизов Т.Х., Ильясова Г.Х., Алимов A.M., Гришкевич И.М., Шарифуллин А.И. Индикация РНК вируса КЧС при помощи ПЦР // Тез. докл. Междунар. научн. конф., посвященной 125 летию академии. - Казань, 1998. -4.1. -С. 91.

104. Федорова В.А., Девдариани 3.JI. Изучение продуктов белковой и углеводной природы, синтезируемых Yersinia pestis в условиях, имитирующих внутреннюю среду фаголизосом макрофагов млекопитающих // Мол.ген.микроб. и вирусол. 2001. - №4. - С. 22-27.

105. Федорова В.А., Самелия Ж.Г., Девдариани 3.JL, Шведун Т.П. Моноклональные антитела для изучения роли антигенов белковой природы в серотипировании бактерий Yersinia pseudotuberculosis // Мол.ген.микроб. и вирусол. №3. 2001. - С. 28-35.

106. Федорова В. А., Девдариани 3.J1. Иммунологическая характеристика фракции I штаммов Yersinia pestis, деферентных по гену CAF1M // Мол.ген.микроб. и вирусол. №1. - 2002. - С. 11-17.

107. Фомина Н.В., Белоусова Р.В., Соболев В.В., Сюрин В.Н. Вирусы животных.-М., 1991.-С. 122-138.

108. Фримель Г. Иммунологические методы // Пер. с нем. к.б.н. А.П. Тарасова / М.: "Медицина", 1987. С. 89-108.

109. Хаитов P.M., Лиознер А.Л. Биотехнические аспекты излучения приобретенных иммунодифицитов // ЖВХО им Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34.-№.1.-С. 67-77.

110. Цибулькин А.П., Угрюмова B.C., Ильясова Г.Ф., Насыров Ш.М. Методические указания по применению набора препаратов для оценки в ИФА эффективности вакцинопрофилактики и фармакологической коррекции иммунитета при псевдобешенстве. Казань, 1998. - 4с.

111. Цыбанов С.Ж., Куринов В.В., Вишняков И.Ф., Семенихин A.JI. Современные достижения в изучении пестивирусов // Ветеринария. 1995. -№3. - С. 14-18.

112. Чайка H.A. Устройство для постановки реакции иммунодиффузионной преципитации без предварительного вырезания лунок в геле // Лабор. дело. 1978. - №4. - С. 206-209.

113. Чайка H.A., Негряну Г.М. Иммуноэлектрофорез методические и диагностические аспекты // В кн.: Серологическая диагностика бактериальных инфекций. - М.: ВНИИМИ, 1981. - С. 47-122.

114. Чайка H.A., Негряну Г.М. Встречный иммуноэлектрофорез // В кн.: Современные методы иммунологической диагностики вирусных инфекций. М.: ВНИИМИ. - 1981. - С. 63-72.

115. Чепулис Г.К., Жданов В.М., Нас И., Черба И., Рожа К. Выявление клеточных антигенов у миксовирусов и парамиксовирусов методами иммунодиффузии //Вопр. вирусологии. 1971. - №1. - С. 62-70.

116. Шубина Н.Г., Луговцев В.Ю., Ющенко Ю.А., Колонцов A.A. Прокоагулятивная активность клеток крови при пестивирусных инфекциях // Вопросы вирусологии. 2002. - №2. - С. 16-18.

117. Эрнст Л.К., Коромыслов Г.Ф., Газдаров А.К. Иммуноферментная диагностика в животноводстве и ветеринарии // ЖВХО им Д.И. Менделеева. -1989. Т. 34. - №1. - С. 86-90.

118. Юсупова Г.Р., Угрюмова B.C., Ильясова Г.Х. О патогенных и иммунобиологических свойствах вируса КЧС, хранившегося в разных температурных режимах // Вирусные болезни с-х. животных / Тез. докл. -Владимир, 1995. С. 209.

119. Юсупов Р.Х. Об условиях хранения патоматериала для диагностики чумы свиней методом иммунофлуорисценции И Матер, конф. молодых ученых, посвящ. 100 летию со дня рождения В.И. Ленина. -Казань, 1970.-С. 92-93.

120. Юсупов Р.Х. Ускоренная лабораторная диагностика классической чумы свиней, болезни Ауески и гриппа в обычных условиях и при комбинированном поражении животных: Дисс. . докт. вет. наук. Казань, 1981.-374 с.

121. Юсупов Р.Х. Изучение иммуного фона при некоторых вирусных заболеваниях свиней // Вет. пробл. пром. свиноводства. Киев, 1983. С. 61-62.

122. Юсупов Р.Х. Профилактика и ликвидация классической чумы свиней // Ветеринария. 2001. - №3(7). - С. 53-55.

123. Юрков С.Г., Чермашенцев В.И., Курносов В.В. и др. Накопление вируса КЧС в культуре лейкоцитов // Тез. докл. Всеросс. научн. практич. конф. Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Владимир, 17-21 апреля 1995 г.-С. 27-30.

124. Ющук Н.Д., Климова Е.А. Острые вирусные гепатиты // Русский мед.журнал. 2000. - Т. 8. - №17. - С. 467.

125. Adly I. Elimination of host tissue reactions in immunodiffusion and immunoelectrophoretic studies of arboviruses // Proc. Soc. Exp. Boil. Med. 1969. - 130.-№3.-P. 784-787.

126. Anderson L.J., Rowe L.W. The use of on enzyme-labelled assay as an to reading micro virus-neutralization test // J. Immunol. Meth. 1982. - Y.53. N.2. -P. 183-186.

127. Anderson L.J. Use of monoclonal antibody in a blocking ELISA to detect group specific antibodies to blietongue virus // J. Immunol. Meth. 1984. -74.-N1.-P. 139-149.

128. Anderson L.J., Hierholzer J.C., Tsou C., Hendry M.R., Fernie B.F., Stone Y., Mcintosh K. Antigenic characterization of respiratory syncytial virus strains with monoclonal antibodies // Infek. Distase. 1985. - V. 151. - N4. - P. 626-633.

129. Aynaud J.M., Corthier G. Recot developments in classical swine fever vaccination // World Animal Review. 1976. - №20. - P. 16-21.

130. Bartoszeze M., Larski J. Lastoswanie methody immunoenzymatycz nej do wykrywania virusa choroby Newcastle (NDV) hodowly Komorec // Med. dosw. imikrobiol. 1981.-V. 33.-N.2.-P. 141-145.

131. Bode Liv, Beutin Lothar, Kohler Hartwich. Nitrocelluloseenzime-linked immunosorbent assay (NC- ELISA) a sensitive technique for the rapid visual detection of both viral antigens and antibodies // J. Virol. Meth. - 1984. -V. 8.-N. 1-2.- P. 111-121.

132. Bon W., Swanborn P. Immuno-osmoforese, een zeersnelte methode van immunoelektroforesse // Chemich Weekblad. 1963. - 59. - P. 72-73.

133. Bon W., Swanborn P. Electro- osmofores // Anal. Biochem. 1965. -№11.-P. 16-22.

134. Boyer J.C., Haenni A.L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA Viruses // Virology. 1994. - V. 198. - P. 415-426.

135. Brinton M.A. Non arbo togaviruses // In: The Togaviruses, Biology, Structure, Replication, Ed., R.W. Shlesinger, Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney, San Francisco. - 1980. - P. 623-666.

136. Campos J.M. Manual of Clinical Microbiology // 7th ed ASM Press: 1999.-P. 13-604.

137. Cantarero L.A., Buller J.H., Osborne J.W. The adsorptive characteristics of protein for polystyrene and there significance in solid-phase immunoassays // Anal. Biochem. 1980. - V. 105. - №2. - P. 375-382.

138. Carbrey E.A., Stewart W.S., Kresse J.T. and Snyder M.L. Persistent hog cholera infection detected during virulence typing of 135 field solates // Am. J. Vet. Res. 1980. - №41. - P. 946-949.

139. Castro Ana R. Comparacion antigenica de una cera atevada y una cepa virulenta clel virus del colere porcino // Rev. invest.pecuar. 1972. - №1. - P. 8590.

140. Catalan F., Khoury B., Ouizman E., Mimic V., Doule D., Margeray M. Nouvelles methods de diagnostic de infection a Chlamydia // Rev. fr. Gynecol et obster. 1984. - 79. -№10. - P. 617-623.

141. Coor D., Zbitnev A., Dempster G. et al. Detection of antibody to rotavirus by CIEP in human serum, colostrums, and milk // J. Pediatr. 1978. -V.93.-P. 967-970.

142. Cox J.C., Moloney M.B., Herrington R.W., Hampson A.W., Hurrell J.G.R. Enzyme immunoassay for antibodies to membrane associated antigen of varicella zoster virus // J. Virol. Meth. 1984. - V. 8. - P. 137-145.

143. Dahle J., Liess B., Frey H.R. Neutralizing antibody development following sequential inoculation of pig with strains of bovine viral diarrheae viral and hog cholera virus // J. Vet. Med. Ser. B. 1987. - V. 34. - P. 729-739.

144. Dales S. Early events in cell animal virus interactions // Bact. Rev. -1973.-V. 37.-P. 103-135.

145. Diaz A., Myers D. Determination of serum neutralization antibodies to rabies virus by a modified CIEP test // J. Microbiol. 1980. - V. 12. - P. 175-179.

146. Duca M., Colev A., Caraman D. et al. Incidenta HbsAg si anti-HBs masurata prin reactia imunoelectroforeza discontinue contracurent // Rev. Med.-Chir. 1977. - V. 81. - P. 59-63.

147. Edevay G., Gradien M., Mares J. An enzimelinked immunosorbent assay, ELISA, for SV-40 antigen detection // J. Virol. Meth. 1985. - V. 11. - №4. -P. 347-355.

148. Edwards S., Moennig V., Wensvoort G. The development of an international panel of monocljnal antibodies for the differentiation of hog cholera virus from other persiviruses // Vet. Microbiol. 1991. - Vol29. - P. 101-108.

149. Einzmann P.J., Rehbeig H. The structural components of hog cholera virus // Z. Naturforsch. 1977. - P. 456-458.

150. Enzmann PJ., Weiland F. Structural similarities of Hog virus with Togaviruses // Arch. Virol. 1978. - V.57. - P.339-348.

151. Einzmann P.J. In vivo labeling of viral proteins with selenomethionin //J. Virol Meth. 1982. - №5. - P. 243-246.

152. Enzmann P.J. Molecular biology of the virus //In: Classical swine Fever and Related viral Infection. Liess B. (Ed). Martinus Nijhoff Publishing, Boston. 1988.-P. 81-97.

153. Ericson G.A. Hog Cholera (Swine Fever) // Vet. Diagn. Virology / Eds A.E. Castro, W.P. Heushele. St Louis, 1992. - P. 228-230.

154. Gerhard W., Karpowsky H. Monoclonal Antibodies // Cone. Viral. Pathol., New York c.a. 1984. - P. 376-381.

155. European patent specification 0 051 096. FRG. 01.04.87. Method for the determination of antigens and antibodies using site-deactivating media / Stout Robert See (FRG).

156. Fleischmann J.B., Pain R.H., Porter R.R. Reduction of Globulins // Arch. Biochem. Biophisics, Suppl. 1963. - P. 174-180.

157. Forsgren M. Studies of echo virus type 6 antigens in immunodiffusion. 1. Antigen composition of native and heated virus preparations // Acta pathol. et microbial. Scand. 1968. -V. 74. - №4. - P. 591-602.

158. Grzybowski J., Trafny E.A. Immunoenzymatyc test ELISA: Klassyfikacja i nomenklatura // Post. hig. i med. Dosm. 1985. - V. 39. - №4. -P. 440-463.

159. Kamijo Y., Ohkuma S., Shimizu M. and Shimizu Y. Differenced in pfthogenucity and antigenicity among hog cholera virus strains // Nat. Inst. Anum. Hith. Quart.- 1977.-V. 17.-P. 133-140.

160. Kemeny D.M., Challacombe S.J. Advances in ELISA and other solid phase-immunoassays // Immunol. Today. 1986. - V. 7. - №3. - P. 67-68.

161. Kohler G, Milstein C. Fusion between immunoglobulin secreting and nonsecreting myeloma cell lines // Eur. J. Immunol. 1975. - V.6. - P. 292-295.

162. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.C., et.al. Color Atlas and Texbook of Diagnostic Microbiology // 5 ed Lippincott. Philadelphia; 1997. -P. 94-363.

163. Koning M., Lengsfeld T., Pauly T., Stark R., Theil H.J. Classical swine fever virus: independent induction of protective immunity by two structural glycoproteins // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 6479-6481.

164. Konishi E., Yamaoka H. Enzyme-linked immunosorbent assay detection of antibodies to Japanese encephalitis virus swine sera // Kobe J. med. Sci. 1982. - V. 28. - №1. - P. 7-17.

165. Kramer S.M., Gremer N.E. Detection of IgG antibodies to measies virus using monoclonal antibodies for antigen-capture in enzyme immunoassay // J. Virol. Meth. 1984. - 8. - №3. - P. 255-263.

166. Harkness J.W. Classical swine fever and its diagnosis: A current view // The Veter. Record. 1985. - V. 116. №11. - P. 288-293.

167. Horzinek M.C. Comparative aspects of togaviruses // J. gen. Virol. -1973.- V.20.-P. 87-103.

168. Leforban Y., Cariolet R. Characterization and pathogenicity for pigs of a hog cholera virus strain isolstion from wild boars // Ann. Reac. Vet. 1992. -V. 23.-N1.-P. 93-100.

169. Laude H. Improved method for the purification of hog cholera virus grown in tissue culture // Arch. Virol. 1977. - V.54 - №1/2. - P. 41-51.

170. Liess B. Hog cholera. In: virus Diseases of Food Animals (Ed. EPJ GibbsO. Academic Press.) London. - 1981. - P. 627-650.

171. Liess B. Description of the virus infection // In: Classical swine ferer and related viral infection. Martinus Nijhoff Publishing, Boston: 1988. part. 4. -P. 28-48.

172. Lowings P., Ibata G., Needham J and Paton D. Classical Swine Fever Virus diversity and evolution. // J.Gen. Virology 1996.-V. 77.-P. 1311-1321.

173. Mattehaeus W. Das elektrophoretische Verhalten Des Virus der Schweinepest in agargel und dessen Nachweismittels der Heic-Methode // Arch. Ges. Virusforsch. 1964. - V. 15. -№1. -P. 50-57.

174. Mattehaeus W. Proteinveranderungen und immunoelektrophoretische Untersuchungen bei der Schweinepester Krankung // Zbl. Veterinarmed. 1967. -V. 14. -№5. -P. 467-482.

175. Mattehaeus W. Isollierung eines in monomerer und dimeer for vorliegenden präzipitierenden Antigens ans Schweinepestinfiziertem Pankreas und der Nachweis enzymatisher Aktivität in den Immunopazipitaten // Zbl. Vet. Med. -1971.-V. 18.-P. 729-736.

176. Mattehaeus W., Korn G. Das verhalten von präzipitierenden Substenzen ans normalen zu den der präzipitierenden pankreasanti-gene mit Schweinepest infizierter Schweine // Zbl. Vet. Med. 1975. 3. - P. 239-253.

177. Matthews R.E. Classification and Nomenclature of Viruses. Karger. Basel: 1982.-P. 97-101.

178. Meyer H., Liess B., Hermanns W., Trautwein G. Experimentalle, diaplazentar infection vou Schweinefeteu mit duu Virus der Europaischen Schweinepest // Fortscher. Vet. Med. 1980. - V. 30. - P. 140-144.

179. Moenning V. Characteristics of Hog virus // In: Classical swine Fever and Related viral infection, Liess B. (ed) Martinus Nijhoff Publishing, Boston. -1988.-P. 66-80.

180. Moenning V. Pestiviruses: review // Vet. Microbiol. 1990. - V. 23. -P. 35-54.

181. Moenning V. The hog cholera virus // Comp. Immunol. Microbiol. Inf. Dis. 1992. - V. 15.-P. 189-201.

182. Moenning V. The hog cholera virus // Comp. Immunol. Microbiol. Inf. Dis. 1992.-V. 41.-P. 53-98.

183. Morgan C., Howe C. Structure and development of viruses as observed in the electron microscope. IX. Entry of parainfluenza (Sendai) virus // J. Virol. -1968.-V. 2.-P. 1122-1132.

184. Movrmann R.D., Warmerdam D.A., et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Breseva and mapping of the genomic region encoding envelope protein El// Virology. 1990. - V. 177. - №1. -P. 184-198.

185. Neukirch M., Moenning V., Liess B. A simple procedure for the concentration and purification of hog cholera virus (HCV) using the Lectin of Ricinus communis // Arch. Virol. 1981. - V. 69. - №3/4. - P. 287-290.

186. Paton D.J. Pestivirus diversity // J. Сотр. Path. 1995. - V. 112.-P. 215-236.

187. Pensaert M., Van Reeth K. Vaccine for swine // In: Veter. Vaccin. Ed. P.P. Pastoret, J.Blancon, P. Vaannier, Verschueren С Elsivier. 1997. - P. 372394.

188. Perrin P., Rollin P.E., Sureau P. A rapid rabies enzyme immunodiagnosis (RREID): a useful and simple technique for the routine diagnosis of rabies // J. Biol. Stand. 1996. -№14. - P. 217-222.

189. Pustowoit В., Herrmann F., Макарова H.E., Кущ A.A. Динамика иммуного ответа при первичной цитомегаловирусной инфекции и при реактивации цитомегаловируса у больных после амотрансплантации органов // Вопросы вирусологии. 2001. - №2. - С. 24-29.

190. Recttenberg E.J. Monoclonal antibodies for therapy, prevention and in vivo diagnisis of human disease // Pr. Symp. Utrecht. May 17-19, 1989. Int. Assoc. Biol. Standard., Basel ect: Rarger. 1990. - KIV. - 284 p.

191. Roehe P.M., Eduards S. Comparison of pestivirus multication in cells of different species // Research in Veter. Sci. 1994. - V. 57. - №2. - P. 210-214.

192. Rumenapf T., Stark R., Meyers G., Theil H.-J. Structural proteins of hog cholera virus expressed by vaccinia virus: further characterization and induction of protective immunity // J. Virol. 1991. -V. 65. - P. 589-597.

193. Rumenapf T., Stark R., Meyers G., Thiel H.J. Structural proteins of hog holera virus expressed by vaccinia virus: father characterization and induction of protective immunity // J.Virol. 1991. -V. 65. - P. 589-597.

194. Rumenapf T., Unger G., Strauss J.H., Theil H.-J. Processing of the envelope glycoproteins of Pestiviruses // Ibid. 1993. - V. 67. - P. 3288-3294.

195. Sam G., Galetti P. Estudio de antigenos intracellulars relacionados con la replication del colera porcino // Rev. infest. Pecuar. 1973. - V. 2. - №2. -P. 173-181.

196. Sarkar Manju, Mandal Chitra Immobilization of-antibodies on anew solid phase for use in ELISA // J. Immunol. Meth. 1985. - V. 83. - №1. - P. 5560.

197. Scott E. Nat., Muchmore Harold G. Immunoblot analysis of antibody responses to sporotrix schenckii // J. Clin. Microbiol. 1989. - V. 27. - №2. -P. 300-304.

198. Sergeev V.A., Pudnicov L., Gruzdev K., Grebennikov E. Some aspect of Hog Cholera Virus Cultivation proceedings of the Third ESW symposium on pestivirus infections, ID-Dlo, Lelystad, The Netherlands. 1996. - P. 132.

199. Shakid F. The IgG4 subclass. Basic and Clin. Aspects IgG Subclasses. -Basel, 1986.-P. 223-226.

200. Terpstra C., Wensvoort G., Natural infections of pigs with bovine viral diarrhoea virus associated with signs resembling swine fever // Res. Vet., Sc. -1988.-N2.-P. 137-142.

201. Thiel H.J., Stark R., Weiland E. et al. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus // J. Virol. 1991. - V. 65. - P. 47054712.

202. Tomanaga Susumi, Fujikura Yaschinisa, Sawada Tomoo, Kukiki Hiromichi, Ito Kazuo. Monoclonal antibodies may recognize highly evolutionary conserved molecule. An immunocytochemical study // Bull. Yamaguchi Med. Sch. 1990. - V. 37. - №3-4. - P. 89-93.

203. Tsotsos A. Identification and typing of viruses and detection of antiviral antibodies by CIEP // Pathol. Microbiol. 1974. - V. 41. - P. 297-310.

204. Van Oirschot J.T., Terpsta C. A congenital persistent swine fever infections. I. Clinical and virological observations // Veter. Microbial. 1977/ -V. 2.-№2.-P. 121-142.

205. Van Oirschot J.T. Experimental production of congenital persistent swine fever infections. II. Effect on functions of the immune system // Vet. Microbiol. 1979. - 4. - P. 133-147.

206. Van Oirschot G. Hog Cholera // Diseases of Swine. Ames, Iowa, 1994.-P. 274-285.

207. Van Rijn P.A., Bossers A., Wensvoort G., Moormann R.J.M. Classical swine fever virus (CSFV) envelope protein E2 containing one structural antigenic unit protects pigs from lethal CSFV infection // Virology. 1996. - V. 77. - P. 2737-2745.

208. Voller A., Bidwell D.E. The microenzymelinked immunosorbent assay (micro ELISA) as a new serological tool in virology // Int. Virol., Barcelona. -1975. N.3.-P. 220-227.

209. Vullo V., Mastroianni C.M., Paoletti, Falciano M. et. al. Detection of Salmonella typhi lipopolysaccharide (LPS) in typhoid sera by dot immunobinding (DIB) assay // Microbios Let. 1988. - V. 38. - №15. - P. 79-83.

210. Warford A.Z., Levy R.A., Rekrut K.A., Steiberg E. Herpes simplex virus testing of an obstetric population with an antigen enzyme-linked immunosorbent assay // Amer. J. Obstet. and Gynecol. 1986. - V. 154. - №1. -P. 21-28.

211. Wensvoort G., Terpstra C., Blocmroad M. Detection of antibodies // The Veterinary Record. 1988. - V. 122. - №2. - P. 536-539.126

212. Wensvoort G. Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus with monoclonal antibodies // J. Gen. Virol. 1989. - V. 70. - P. 2865-2876.

213. Wensvoort G., Terpspra C., De Kluijver E.P., Kregten C., Warnaar J.C. Antigenic differentiation of pestivirus stains with monoclonal antibodies againts hog cholera virus // Vet. Microbiol. 1989. - V. 21. - P. 9-20.

214. Xiao Ze Shuai, Jia Li-Li, Qu Xiag-Su, Ziag-Su, Zhang Yong-He. Применение иммуноферментного анализа на зараженных клетках (ИФА-ЗК) для выявления арбовирусов // Acta scand. 1986. - V. 34. - P. 487-495.

215. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамент ветеринарии Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт1. УТВЕРЖДАЮ

216. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ И АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПААГ-8Б8 И ИММУНОБЛОТИНГА1. Казань-2002

217. Классическая чума свиней вызывается одним из членов семейства Togaviridae большой группы РНК содержащих вирусов, имеющих липидную оболочку. Возбудитель КЧС относится к роду Pestivirus (Мищенко

218. H.К., 1987; Moenning V., 1992).

219. Электродный буфер: 30 г глицина (аминоуксусная кислота), 2 г триса, 2г ДСН и растворяют, доводя до двух литров дистиллированной водой, рН 8,3-8,5.

220. Перед окрашиванием серебром гель вымачивают в 10% глютаровом альдегиде (водном растворе), затем споласкивают 10 минут в 0,5-1 л воды с двумя сменами.

221. Если ПААГ превышает 10% то гель фиксируют: • 50% метанолом и 10% уксусной кислотой в течение 30 мин. Промывают в 7% уксусной кислоте с 5% метанолом в течение ночи.

222. После окрашивания гель проявляют: в растворе содержащей 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида (разбавляют продажный 38% формальдегид в 10%-ом метаноле). После проявления промывают водой в течение 1 часа с тремя сменами.

223. Для окраски проб готовят красящий раствор, содержащий: 10 мл глицерина, 0,1 г бромфенолового синего

224. Раствор для промывания геля: к 100 мл уксусной кислоты добавляется 100 мл изопропанола и доводят до одного литра дистиллированной водой.

225. ЛизирукУщая смесь состоит из: 0,757 г триса, 2,5 г ДСН, 2,5 мл меркаэптанола, 0,4 мл НС1 доводят водой до 50 мл, рН 6,7-6,8.

226. Перед электрофорезом в пробы досадить раствор глицерина, с бромфеноловым синим до конечной конц^нтрцщ^ 0,001%.

227. В камеру для электрофореза вставить форму с гелем и заливают электродным буфером до половины формы, затем в лунки концентрирующего геля наносят пробы и заливают электродным буфером, избегая смешивания его с пробами.

228. Окраску фиксированных в ПААГ полипептидов нитратом серебра проводится по методу описанному Остерманом JI.A. (1981) с использованием раствора формальдегида или 0,25% Кумасси R-250 в смеси метанол: уксусная кислота: вода (5:1:5 по объему).

229. Окрашенные данными методами полиакриламидный гель фотографируют, либо сразу сканируют.1. ИММУНОБЛОТИНГ

230. Оборудование: прибор для электрофоретического переноса с системой для охлаждения (Bio-Rad Labs), нитроцеллюлозная мембрана («Schleicher», Германия) с размером пор 0,45 мкм, фильтровальная бумага

231. Schuell», Германия), листы тонкого полиэтилена, ротационный встряхиватель, кюветы для отмывания и окрашивания («Bio-RAD Labs»).

232. Растворы. Буфер для переноса: 0,025 М Трис, 0,193 М глицин, 20%-ный метанол, рН 7,8-8,4. Сразу готовится 6 л такого раствора и хранить его при температуре 4°С.

233. Раствор ФСБ-твин. К фосфатно-солевому буферу (ФСБ, 0,01 М Na2HP04, 0,15 М NaCl, рН 7,2) добавляют при осторожном перемешивании 0,3%-ный твин-20 из расчета 3 мл на 1 л непосредственно перед использованием.

234. Раствор субстрата. Смешивают 50 мг 3,3 диаминобензидина (3,3; 4,4-тетрааминобифенилтетрагидрохлорида с содержанием основного вещества 97-99%, «Sigma») и 10 мкл Н202 (30%), добавляется ФСБ, рН 7,2 до 100 мл. Этот раствор готовят ежедневно.

235. В кювету заливают 300 мл буфера для переноса и помещают листок фильтровальной бумаги размером 15 на 20 см, таким образом, чтобы она находилась на дне и у края кюветы. Затем перенести гель на поверхность бумаги и аккуратно перемещают вдоль листа.

236. Лист нитроцеллюлозы (блот) промывают 4 раза по 5 минут раствором ФСБ-твин при 37°С. Объем раствора для каждой промывки составляет 250 мл.

237. После промывки блот помещают на 5-10 минут в раствор субстрата. Полосы проявляют в течение 10 минут. Реакцию останавливают, промыванием блот водой.

238. Методом электрофореза в SDS-ЛААГ достигнуто: фракционирование, а методом иммуноблота определена специфическая фракция с мМ 55-57 кД.

239. При приготовлении акриламида, бис-акриламида и при работе с самим гелем (включая окраску, фиксацию и промывку) необходимо все манипуляции проводить в резиновых перчатках, а на лице должна быть марлевая маска.61. ЛИТЕРАТУРА

240. Бакулов И.А., Буткин Е.И., Ведерников В.А., Юрков Г.Г. Эпизоотология с микробиологией. М.: Агропромиздат. - 1987. С.287-291.

241. Коксин В.П., Алимов A.M., Ильясова Г.Х. и др. // Фонд НИВИ №8 1998

242. Мищенко Н.К. Чума: (классическая) свиней //В кн. Инфекцион. болезни животных. М.: "Колос".-1987.-С. 19-20.

243. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование // М."Наука". 1981. - С. 3-96.

244. Сосова Р.Ф. Эпизоотология. М.: "Колос". 1974. С.382-391.

245. Юсупов Р.Х. Изучение иммуного фона при некоторых вирусных заболеваниях свиней // Вет. пробл. пром. свиноводства. Киев, 1983. С. 6162.

246. Moenning V. The hog cholera virus // Сотр. Immunol. Microbiol. Inf. Dis. 1992. - V.15. - P. 189-201.

247. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамент ветеринарии Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт1. УТВЕРЖДАЮ1. ВНИВИ1. РАВИЛОВ аЛ 2002 г.

248. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРООСМОФОРЕЗА1. Казань-20021. Общие положения

249. Иммуноэлектроосмофорез применяют для исследования биологического материала (лизат эритроцитов, дефибринированная кровь, пробы мочи, сыворотки крови и патологический материал) только от невакцинированных против вируса классической чумы свиней.

250. Диагноз на КЧС устанавливается на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

251. Индикация и идентификацации вирусного антигена вирусаклассической чумы свиней

252. Оборудование: камера (горизонтальная для электрофореза) из плексиглаза, пробирки, стекла обезжиренные размером 9-12 см, металлический штамп, водяная баня, источник питания УИП-1 или ПАФ-3, центрифуги.

253. Реактивы: веронал, мединал, мол очно-кислый кальций, агар Дифко.

254. Буфер. Веронал 1,66 г, мединал - 10,51 г, молочно-кислый кальций -1,536 г, дистиллированная вода - 1л. рН 8,6 (готовят на водяной бане I не более 80° С).

255. Приготовление агаровой среды. Для постановки реакции готовят 1,5%-ный гель из агара Дифко на веронал-мединаловом буфере, на водяной (кипящей) бане до полного растворения агара (приготовленный агар хранят в холодильнике при 4°С).4. Постановка реакции

256. Результаты иммуноэлектроосмофореза учитывают через 1,5-2 часа с момента включения камеры в сеть.