Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усиленный атерогенный эффект макрофагов из моноцитов крови больных ИБС, выявленный в аэробных условиях и при аноксии in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Усиленный атерогенный эффект макрофагов из моноцитов крови больных ИБС, выявленный в аэробных условиях и при аноксии in vitro"

На правах рукописи

Хильченко Алексей Валериевич

УСИЛЕННЫЙ АТЕРОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ МАКРОФАГОВ ИЗ МОНОЦИТОВ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИБС, ВЫЯВЛЕННЫЙ В АЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ И ПРИ

АНОКСИИ IN VITRO.

0031G68G3

03.00.04 -биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

д 6 М* ®®

Москва -2008

003166883

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В Н Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Биленко Марианна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ипатова Ольга Михайлова

доктор биологических наук Дудник Людмила Борисовна

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М В Ломоносова, Факультет Фундаментальной медицины

Защита диссертации состоится 24 апреля 2008 г в 14 часов на заседании диссертационног совета Д 001 010 01 при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу 119121, Москва, у Погодинская, д 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН по адрес 119121, Москва, ул Погодинская, д 10

Автореферат разослан '22' марта 2008г

Ученый секретарь Диссертационного света

Кандидат химических наук

ЕА Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

В настоящее время очевидно, что ключевым фактором возникновения атеросклеротических повреждений в сосудах является функциональная активность макрофагов (МФ), в частности, их способность распознавать, связывать и поглощать липопротеины низкой плотности (ЛНП), что ведет к накоплению в макрофагах липидов и холестерина, нарушению метаболизма макрофагов, превращению их в пенистые клетки, являющиеся ранней стадий проявления атеросклероза При этом, атеросклеротические повреждения сосудов являются основной нарушений сосудистого кровообращения, причиной развития сердечно-сосудистых заболеваний, инвалидности и смерти населения крупных городов России и других развитых стран мира

К существующим факторам «риска» развития атеросклероза, относят также гипертонию, курение, стресс, охлаждение и другие факторы [Ross R, 1986, O'Doimell CJ, Ridker PM, Glynn RJ, et al, 1997], сопровождающиеся генерализованной гипоксией, и локальной ишемией сосудистой стенки [Crawford DW and Kramsch DM, 1988, Seidel SL and Strong R, 1986] Спазмы и локальная ишемия сосудов ведут к выделению эндотелиальными клетками (ЭК), МФ, клетками соединительной ткани, гладкомышечными клетками, элементами крови, в том числе циркулирующими моноцитами, активных форм кислорода (АФК), провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и др), которые "прймируют" и "стимулируют" клетки, усиливают их способность окислять ЛНП [Клебанов ГИ, Владимеров ЮА, 1999, Ma J, 2003]

Имеются данные, согласно которым лишь активированные моноциты/макрофаги обладают способностью осуществлять свои многоплановые функции, в том числе выделять АФК, окислять и поглощать ЛНП [Ma J, et al, 2003] Однако, дозы цитокинов, сроки инкубации, необходимые для активации ими макрофагов in vitro, а также способность моноцит-производных макрофагов крови человека подвергаться активации m vivo, приобретая способность окислительно модифицировать ЛНП in vivo и in vitro, исследованы недостаточно

Особенно важным является вопрос об активации моноцит-производных макрофагов крови in vivo при различных патологиях, протекающих на фоне ишемии и воспаления Многократно показано, что в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) резко повышено содержание таких цитокинов как ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и др [Holm Т, et al, 2003, Valgimigh М, et al, 2003, Mizia-Stec К, et al, 2003, Takahashi К, et al, 2002, Hojo Y, et al,

2002, Mazzone A, et al, 2001], являющихся активными стимуляторами моноцитов/макрофагов in vitro Однако, за исключением данных об изменении генных и морфологических признаков моноцит-производных макрофагов, прямых работ, указывающих на усиление функциональной активности моноцит-производных макрофагов из крови больных ИБС (МФибс). в литературе не выявлено, что препятствует ранней диагностике и направленному лечебному воздействию на функцию моноцитов/макрофагов у больных ИБС в целях предотвращения возникновения у них атеросклероза

Несмотря на то, что проф Биленко MB с группой сотрудников ранее отчетливо показано, что частичная и тотальная ишемия различных органов ведет к усилению продукции тканями АФК, первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ, выходу эгих продуктов в кровь, усилению способности ЭК сосудов окислять ЛДЛ [Биленко М В и др 1990, Биленко М В , Вахрушева Т В ,Федосова С В ,1998, Биленко М В , Ладыгина В П, Федосова С В, 1996 и др], исследования по влиянию ишемии на способность моноцит-производных макрофагов окислять и поглощать ЛНП практически отсутствуют

Наряду с клеточными элементами сосудистой стенки и крови, существенная роль в атерогенезе принадлежит содержанию холестерина в крови больных и степени окисленности ЛНП Показано, что количество окислительно модифицированных ЛНП в крови гштерхолестеринемичных людей [Cazzolato G, et al, 1991] или животных [Hodis HN, et al, 1994, Лопухин ЮМ, Владимиров ЮА, Молоденков МН, и др, 1983] выше, чем в крови людей и животных с нормальным содержанием холестерина

Липопротеины низкой плотности, от людей с гиперхолестеринемией содержат также не только более высокое кочичество свободного холестерина и триглицеридов, но и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), низкое содержание антиоксидантов (CoQIO, Vit Е), обладают более высоким отрицательным зарядом, характеризующим модификацию апо-В белка, что обусловливает их способность быть распознанными и практически недозируемо поглощенными МФ [Steinberg D, Lewis А, 1994, Тертов ВВ, и др, 1989, Sevaman A, et al, 1996]

Однако, способность ЛНП, полученных от людей с гиперхолестеринемией (ЛНПг) подвергаться дальнейшему in vivo или in vitro окислению по сравнению с ЛНП, полученными из крови здоровых доноров (ЛНПн), изучена недостаточно, имеющиеся работы единичны, проведены, главным образом, с использование Си2+ - опосредованного окисления и не содержат анализа показателей, характеризующих окислительную

модификацию апо-В белка и тестов на сравнительную способность МФ к поглощению

ЛНПниЛНПг

Цель исследования:

Изучение способности макрофагов, полученных из моноцитв крови здоровых доноров и больных ИБС, окислять и поглощать липопротеины низкой плотности, полученные от здоровых доноров и людей с гиперхолестеринемией, при их инкубации в аэробных условиях и при аноксии m vitro

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи

1 Изучить способность макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров (МФн) окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг, в аэробных условиях и в условиях аноксии ш vitro

2 С помощью ФНО-а разработать метод предстимуляции и стимуляции макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров в условиях in vitro Сравнить способность нестимулированных и стимулированных in vitro макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров (МФн) окислять ЛНПн

3 Изучить способность макрофагов, полученных из крови больных ИБС (МФщс). окистять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и в условиях аноксии m vitro

4 Сравнить способность макрофагов, полученных из моноцитов крови больных ИБС и здоровых доноров окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и в условиях аноксии m vitro

Научная новизна работы.

Впервые доказано, что МФибс обладают более выраженной способностью окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг по сравнению с МФн

Впервые доказано, что способность МФщс обладают более выраженной способностью окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в условиях аноксии по сравнению с аэробными условиями

Впервые доказано, что МФН и МФибс более интенсивно окисляют и поглощают ЛНПг по сравнению с ЛНПн

Разработан метод и схема активации макрофагов, полученных из крови здоровых людей малыми повторными дозами ФНО-а

Практическая значимость работы.

Полученные фундаментальные данные являются предпосылкой для, разработки экспресс-метода, основанного на оценке степени активации МФщс и другими сердечнососудистыми заболеваниями, и предназначенного для выявления тяжести ишемических повреждений сердца у больных ИБС, предрасположенности больных к развитию или прогрессированию атеросклероза, индивидуального подбора лекарственных препаратов противоишемического и антиатеросклеротического действия, а также контроля за эффективностью проводимой терапии Апробация диссертационного материала.

VI Международная конференция «Биоантиоксидант», (Москва, Россия, 2002), 22nd European Section Meeting of the International Society for Heart Research, (Szeged, Hungary, 2002), НГ Съезд биохимического общества, (Санкт - Петербург Россия, 2002), Europen Atherosclerosis Society 73 rd EAS congress Supplement, (Salzdurg, Austria, 2002), Конгресс "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", (Москва, Россия, 2002), Международная конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», (Смоленск, Россия, 2003), 24 Meeting ISHR, (Dresden, Germany, 2004), XVIII World Congress of ISHR, (Brisbane, Australia, 2004), Дизрегуляционная патология органов и систем, (Москва, Россия, 2004)

Публикации.

Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях и 11 публикациях в сборниках докладов научных конференций Структура и объем работы.

Диссертация выполнена на 120 страницах, включает в себя введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводов и списка литературы Диссертация содержит 7 таблиц, 2 схемы и 17 рисунков Список литературы состоит из 200 наименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы и реактивы

ЭДТА, натрия бикарбонат, HEPES, лирувпт натрия, L-глутамин, PBS, Кумасси Синий (Sigma Chemical Со, США), среда RPMI-1640 (Flow Laboratories ,СИ1А), мембранные фильтры ( Serva, Германия), Ficoll Pack (Amersham Biosciences , США), культуральная посуда (Costar, Нидерланды), гентамицин (Pharmachim , Балгария), эмбриональная

6

сыворотка теленка (НИИ Эпидемиологии и Микробиологии РАМН, Россия), набор для определения холестерина (Boehnnger Mannheim GmbH, Германия) Получение культура макрофагов человека

Моноциты крови человека изолировали из локтевой вены 18-ти здоровых доноров (МФц) и 25 больных с ишемической болезнью сердца (МФибс) Кровь в количестве 10 мл брали в пробирку, содержащую 1 мл PBS и 50 ЕД гепарина, разводили в два раза раствором PBS, на каждые 5мл наслаивали Змл Ficoll Pack (р= 1,077 г/мл) и центрифугировали при 37°С в течение 20мин при 400g Интерфазу отсасывали и центрифугировали при 37°С в течение 15 мин при 400g Затем надосадочную жидкость сливали и к осадку добавляли 10 мл PBS, вновь центрифугировали при 37°С в течение 10 мин при 320g (процедуру повторяли дважды) К отмытому осадку добавляли 10 мл среды «роста», пипетировали Для подсчета клеток к 20 мкл суспензии клеток добавляли 20 мкл трипанового синего, полученный раствор помещали в камеру Горяева и подсчитывали число неокрашенных клеток в 25 квадратах Суспензию клеток доводили средой роста до концентрации 106 клеток/мл Затем 1 мл суспензии клеток (106 клеток/мл) разливали в чашки Петри (d=35 мм) Чашки Петри помещали в ССЬ-инкубатор (воздух 95% + С02 5%) при 37°С на 2 часа Через два часа среду меняли на свежую и продолжали инкубировать еще в течение 18 часов, до превращения моноцитов в макрофаги Выделение ЛНП

Липопротеины низкой плотности (ЛНП, d = 1,019 - 1,065 g/ml) выделяли из свежей плазмы крови 16-ти здоровых доноров (ЛНПн, общий холестерин плазмы 2,6-4,4 тМ, в среднем 3,6 ± 0,7 тМ), или из плазмы крови людей с гиперхолестеринемией (ЛНПг, общий холестерин плазмы 7,3-13,5 тМ, в среднем 9,8 ± 2,0 тМ) В последнем случае забор крови проводили до начала лечения или не ранее, чем через 4 недели после окончания, лечения и возвращения содержания холестерина в крови к уровню, наблюдавшемуся до лечения ЛНП были выделены из плазмы крови человеком методом ультрацентрифугирования в градиенте NaBr [Lindgren F, 1975], модифицированным [Tertov VV et al, 1995] в присутствии ЭДТА, используя центрифугу L 8-55 и ротор Ti-90 (Beckman, США) Центрифугировали при 111 000g два раза по 2 часа Полученные ЛНП вместе с NaBr и ЭДТА хранили при t° +2 +4'С, не более 7 дней Накануне опыта диализовали в течение 18 ч при +4°С против 6000 объемов PBS без добавления ЭДТА и без антиоксидантов Для стерилизации использовали мембранные фильтры (0,45 мкм) Белок

ЛНП определяли по Лоури Содержание холестерина в плазме крови и в ЛНП определяли на автоанализаторе АА-11 (Techmkon, США) Инкубация макрофагов с ЛНП

На период инкубации макрофагов с ЛНП среду «роста» в культурах заменяли безбелковой субстрат-дефицитной - «инкубационной», средой (RPMI-1640 + Ыа-бикарбонат+ 50 ЕД Гентамицина при отсутствии других субстратных добавок, сыворотки теленка) Аэробную инкубацию проводили в С02 - инкубаторе (воздух 95% + С02 5%, t = 37 'С), инкубацию в условиях аноксии - в камере, продуваемой в течение 15 мин 10 кратным объемом смеси газов N2 95% + С02 5% (содержание 02 < 0 001%), t = 37 °С, что, в сочетании с субстрат-дефицитной средой, близко имитировало stop-flow модель ишемии m vivo [Bilenko MV, Sevanian A, Hochstein P, 1993]

По окончании сроков инкубации среду с содержащимися в ней ЛНПн или ЛНПг отбирали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость использовали для оценки окислительной модификации ЛНП Макрофаги, оставшиеся прикрепленными ко дну чашки открепляли 1% трипсином + 0,2% ЭДТА Оценка окисчителъной модификации ЛНПн и ЛНПг

Измерение продуктов реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) проводили на спектрофотометре Beckman DU-7 (532 нм ) методом [Uchiyama М, et al, 1978] Количество TBARS выражали через эквивалентное количество малонового диальдегида (МДА), исночьзуя коэффициент мольной экстинкции, равный 156000 М-1 • см-1 Результаты представ тепы как нмоль МДА на мг белка ЛНП Оценка электрофоретической подвижности ЛНПн и ЛНПг

Электрофоретическая подвижность (ЭФП) ЛНП проводили модифицированным методом [Noble RP, 1968] с помощью горизонтального 1% агарозного гель электрофореза (барбиталовый буфере, рН 8 4) Сила тока составляла 140 мА, напряжение - 100 mV ЛНП перед нанесением на гель смешивали с бромфеноловым синим (3 1), электрофорез проводили при комнатной t" в течение Зч Содержание белка ЛНП в каждой лунке составляло 3-4 мкг/лунку Гели фиксировали 20 мин смесью 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты, просушивали, окрашивали 8-10 мин Кумасси синим Отмывку геля проводили в смеси ледяная уксусная кислота (50 мл/л), изопропанол (250 мл/л), вода (700мл) Абсолютные цифры ЭФП рассчитывали путем измерения длины пробега (Rf, см) Динамику изменений ЭФП рассчитывали по отношению длины пробега в опытных лунках

к длине пробега в контрольной лунке, принятой за 100% Контролем служили те же концентрации исходных ЛНПн и ЛНПг без инкубации Оценка способности макрофагов захватывать ЛНП

Захват макрофагами ЛНП оценивали по содержанию в них общего холестерина (холестерина и его эфиров) согласно методике [Chazov EI, et al, 1986] Макрофаги, оставшиеся прикрепленными ко дну чашки Петри после их инкубации с ЛНП заливали 96% этанолом, высушивали, и замораживали при -20"С Затем проводили экстракцию смесью гексан-изопропанола (2 3) согласно методике [Hojo Y, et al, 2002], и определяли содержания общего холестерина используя стандарнтый кит (Boehnnger Mannheim, Germany) как рекомендовано в инструкции Количество общего холестерина (ОХ) поглощенного макрофагами выражали как отношение мкг ОХ\Ю6 клеток Оценка жизнеспособности макрофагов

Жизнеспособность макрофагов определяли по количеству клеток, оставшихся прикрепленными ко дну чашек Петри по окончанию эксперимента [Morel DW, at al, 1983] Клетки подсчитывали в камере Горяева Статистический анализ

Статистическую обработку проводили, используя критерий Стьюдента для малых выборок на персональном компьютере в программе Microsoft Excel Данные представляли как mean ± SEM Достоверность различия между группами определяли по парному t-критерию Стьюдента Для всех проведенных измерений различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение способности МФн, окислять и поглощать ЛНПИ, и ЛНПГ в аэробных условиях и в условиях аноксии т vitro.

В первом разделе к МФц добавляли ЛНПн или ЛНПг в кочичестве 200мкг белка ЛНП/мл среды, инкубировали в аэробных условиях в течение 1, 3 и б часов в С02-инкубаторе (воздух 95%+С02 5%, контроль), в опытах с аноксией- в эксикаторе, продутом и наполненном смесью газов (N2 95% + СОг 5%, содержание 02 0,0012%) Инкубацию в аэробных условиях и условиях аноксии проводили параллельно

1 1 Оценка способности культуры макрофагов окислять ЛНПн и ЛНПг по накоплению в них ТБК-РП

В нашем исследовании нативные (не инкубированные) ЛНПг содержали больше ТБК-РП, чем ЛНПн (0,7±0,08 УЭ 0,45±0,07; ## - р<0,01). Присутствие ТБК-РП в ЛНПн, по-видимому, обусловлено самоокислением ЛНП в процессе их диализа, который намеренно (чтобы не препятствовать дальнейшему инициированному макрофагами окислению) проводили без добавления в диализную жидкость ЭДТА и антиоксидантов (АО). Данные исследований представлены в таблице 1.1.

Таблица 1.1. Содержание ТБК-РП в ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с МФН в аэробных

условиях и условиях аноксии, нмолъ МДА/мг белка ЛНП (М±т).

ЛНП 1 Контроль ! Аэробные условия I i з 1 [. ч : 6 .. Условия анокспх, ч "I 1 з 1-6

ЛНПн ЛН'Ш.Ч 0,45±0,07 I 0,39±0,13 ' 0,40±0,20 0,36±0,18 0,48±0,15 0,73=0М*Л: ' 1 0,43±0,19 1 0,53±0,09

Примечание:

*, ** -уровень значимости различия опытов по сравнению с контролем: * - р<0,05, ** -р<0,01

#,## -уровень значимости различия опытов с ЛНПг по сравнению с ЛНПн в контроле или

в одинаковых условиях их инкубации: # - р<0,05, ## - р<0,01 л,лл -уровень значимости различия опытов в условиях аноксии по сравнению с опытами в аэробными условиями в течение одинаковых сроков инкубации: л - р<0,05, лл - р<0,01 $,$$- уровень значимости различия опытов с МФибс по сравнению с ,МФц в одинаковых

условиях их инкубации: $ - р<0,05, SS - р<0,01 Число независимых экспериментов - 6-8

В опытах с добавлением к культуре макрофагов ЛНПн в аэробных условиях инкубации заметных изменений в окисленности ЛНПн не наблюдалось (табл. 1.1). Эти же макрофаги, инкубированные с более окисленными ЛНПг. полученными от людей с гиперхолестеринемией, уже на ранних сроках, вызывали значительное (* - р<0,05) падение окисленности ЛНПг (табл. 1.1).

Уровень ТБК-РП в ЛНПн, инкубированных с МФн в условиях аноксии, аналогично аэробным условиям, практически не менялся, а в ЛНПг значительно снижался с 3 по 6 ч инкубации.

1.2. Оценка способности МФц окислять ЛНПн и ЛНПг по изменению электрофоретической подвижности.

В нашем исследовании ЭФП нативных (не инкубированных) ЛНПг была выше ЭФП ЛНПн (137±3 vs 120±13, # - р<0,05), что соответствовало литературным данным [Steinberg D and Lewis А, 1997]. Результаты ЭФП ЛНПн и ЛНПг, после их инкубации с МФН представлены в таблице 1.2.

Таблица 1.2. Электрофоретическая подвижность ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с

условиях значительно возрастала к первому часу и продолжала расти вплоть до 6ч инкубации (* - р<0,05; ** - р<0,01). Усиление степени модификации ЛНП под воздействием МФН наблюдалось и в случае с ЛНПг, однако, в отличие от ЛНПн, оно начиналось позже - с 3 часа, но носило параллельный с ЛНПн характер.

Изменение аэробных условий инкубации на условия аноксии не приводило к изменению динамики ЭФП ЛНПн, но уменьшало рост ЭФП ЛНПг. На протяжении всех | сроков инкубации ЛНПг с МФн, ЭФП ЛНПг была ниже чем ЛНПн, а также ниже, чем степень модификации ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях.

1.3. Оценка способности МФн потреблять ЛНПн и ЛНПг по тесту аккумуляции в МФИ общего холестерина.

Оценку поглощения культурой макрофагов ЛНПн и ЛНПг мы оценивали по аккумуляции общего холестерина (ОХ, холестерина и эфиров холестерина) в МФН, оставшихся прикрепленными к дну ячейки после истечения сроков совместной инкубации с ЛНП.

Таблица 1.3. Содержание общего холестерина в МФН после инкубации с ЛНПн и ЛНПг в , аэробных условиях и условиях аноксии, нг/103 МФн (М±т).

МФн в аэробных условиях и условиях аноксии, у. е. (М±т).

120±13 157±17* [ 161±14** _

Ж ■■■Г:17Ш2' ..|:Va!SÖäF';i::;KWO*'' I Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

Как видно из таблицы 1.2, ЭФП ЛНПн при их инкубации с МФН в аэробных

Условия аноксии, ч

I з I

Контроль

ЛНПн ЗД±0,2 Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

Из табл. 1.3 видно, что аккумуляция ОХ значительно возрастала и в ЛНПн, и ЛНПг в аэробных условиях (** - р<0,01). В ЛНПг аккумуляция ОХ была еще выше, чем в ЛНПн, причем, значительные различия в способности макрофагов поглощать ЛНПг по сравнению с ЛНПн наблюдались на 3-6 часах аэробной инкубации (табл. 1.3, #-р<0,05; ##-р<0,01).

Инкубация в условиях аноксии приводила к еще более выраженному поглощению МФН ЛНПг уже на 1 часу инкубации по сравнению с аэробными условиями (табл. 1.3, л-р<0,05). Увеличение сроков аноксии до 6 часов приводило к росту содержания

11

холестерина ЛНПг в макрофагах по сравнению с 1-м часом инкубации. В отличие от ЛНПг инкубация МФН в условиях аноксии не вызывала значительных изменений в способности МФН аккумулировать ОХ, по сравнению с аэробными условиями.

1.4. Оценка жизнеспособности МФц е процессе их совместной инкубации с ЛНПн или ЛНПг.

В наших опытах выраженное накопление макрофагами продуктов ПОЛ и общего холестерина в процессе их совместной инкубации с ЛНПн и ЛНПг, как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии, сопровождалось заметной гибелью макрофагов.

Таблица 1.4. Число жизнеспособных МФц в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг аэробных условиях и условиях аноксии, 103 МФц (М±т).

ЛНПн I 355±24 I 300±18* I 252±23* I 220±17** | 282±26* ЛНПг"| 355Й4 I 233±9*',;' | 158+2"*"' | I04I4*»"" ) 104л20**4л Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

254±10** [ 242±36* I■ .80-27**"1'л j 71±24'**"

Из табл. 1.4. видно, что в аэробных условиях инкубации культуры макрофагов с ЛНПн выявлялось заметное снижение числа жизнеспособных клеток на протяжении 1-6-го , часов инкубации (*- р<0,05; ** - р<0,01). Использование ЛНПг приводило к значительно более резкому, по сравнению с ЛНПн, снижению числа жизнеспособых макрофагов (# -р<0,05; ## - р<0,01.).

Инкубация в условиях аноксии, аналогично аэробной инкубации, также приводили к уменьшению числа жизнеспособных макрофагов. Однако в опытах с ЛНПн достоверно значимых различий с аэробными условиями не наблюдалось, а в опытах с ЛНПг, начиная с 1-го часа инкубации, наблюдалось как значительно более резкое снижение числа жизнеспособных макрофагов, по сравнению с ЛНПн (# - р<0,05), так и с опытами в аэробных условиях (лл-р<0,05; л-р<0,05).

Проведенная работа позволила установить, что МФН, способны окислять и потреблять ЛНПн и ЛНПг как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии in vitro, что h не может не проявляться у больных ИБС в условиях in vivo, способствуя началу образования атеросклеротических бляшек и, как следствие, ухудшению качества жизни, потере трудоспособности и росту смертности населения.

2. Разработки метода предстимуляции и стимуляции МФН с помощью ФНО-а, и сравнение их способности окислять ЛНПн in vitro.

Для разработки метода и схемы активации макрофагов in vitro, нами был использован ФНО-а. В работе использованы МФН и ЛНПн. Проведены 2 серии исследований.

В 1-ой серии исследований к МФц добавляли ФНО-а в дозе от 0,01 до 10 нг/мл среды, содержащей 10 клеток. МФц с ФНО-а инкубировали в течение 10, 30, 60 мин и Зч. По окончании заданного срока, среду инкубации вместе с ФНО-а меняли на свежую, без ФНО-а и добавляли ЛНПн в дозе 150 мкг/мл и ячейки повторно инкубировали в аэробных условиях (С02 5% + воздух 95%) в течение Зч. После 3 часов инкубации среду совместно с [ ЛНПн отбирали в пробирку, центрифугировали, отделяли ЛНПн со средой от осадка на дне пробирки. Окисление ЛНПн определяли по величине ЭФП. Полученные результаты представлены в табл. 2.1.

Таблица 2.1. Электрофоретическая подвижность ЛНПн после ux 3-х часовой инкубации с МФц предварительно активированных различными концентрациями и временем инкубации с ФНО-а (% к нативным ЛНП, М±т).

Время -инкубации МФ с ФНО-а Нативные ЛНП. /0. Контроль . Концентрации ФНО-0,5 | 1,0 л, нг/мл. 5.0 | 11/.0

10 мин 30'ммн ■•'., ■ 60 мин ... г]80мин ../, 100*3 108±3 ! 00=2 ! 103x5 vie 100*5 | 106*8 109±6 U2±5* : .104*7 : ' . 109±7 " Й4Ь2 . 104±4 109*4* ■г-ЩбШ"-: 104*12 ! 92*5-' j 110*3** 100=7 яййяежй; 101*8

Примечание.

* ** _ уровень значимости различия опытов по сравнению с нашивными ЛНП: * -р<0,05, **-р<0,01;

Число независшшх экспериментов равно 4

Как видно из табл. 2.1 добавление ФНО-а к культуре макрофагов и их инкубация в течение 10, 30, 60 и 180 мин в большинстве использованных концентраций ФНО-а вела к умеренному (а в отдельных случаях к значительному) росту ЭФП ЛНП, по сравнению с нативными ЛНП. Однако значимых различий с макрофагами, инкубированными в те же сроки без ФНО-а (контроль), выявлено не было. Наиболее активной была доза 0,5 нг/мл, особенно при инкубации в течение 30 и 60 мин. Инкубация МФ с ФНО-а в течение Зч, независимо от концентрации ФНО-а, не оказывала стимулирующего или оказывала слабый цитотоксический эффект.

Во 2-ой серии исследований для стимуляции макрофагов, наряду с использованием наиболее эффективной концентрации (0,5 нг/мл), применяли еще более низкую концентрацию ФНО-а, а именно 0,1 нг/мл среды, а также проводили не только однократное, но и двукратное инкубирование культуры макрофагов с ФНО-а, сравнивая влияние на ЛНПн однократной инкубации с двукратной, и оценивая роль возрастающих концентраций ФНО-а. (0,1 и 0,5 или 0,5 и 5,0 нг/мл). Инкубацию после однократного | введения ФНО-а проводили в течение 10 или 30 мин, а после повторного введения - в течение 10 мин, всегда в аэробных условиях.

Критерием активации культуры макрофагов являлся рост ЭФП ЛНП и накопление в ЛНП ТБК-РП.

Из таблицы 2.2 видно, что двукратная инкубация с более высокой, чем при однократной инкубации дозой ФНО-а, ведет к усилению способности макрофагов окислять ЛНПн после их последующей 3 часовой инкубации.

Таблица 2.2. Электрофоретическая подвижность ЛНП после Зч инкубации с МФН, предварительно однократно или двукратно инкубировано, с ФНО-а (% к нативным ЛНП, М±т).

10 мин 100 117±4** 120±2** 129±3**#л П8^5»» П6±5*

Примечание:

*. ** - уровень значимости различия опытов по сравнению с нативными ЛНП: * - р<0,05, I

** -р<0,01; Г

# - уровень значимости различия опытов с контролем: # - р<0,05

л - уровень значимости различий между опытами с двукратной и однократной ]

инкубацией макрофагов с ФНО-а (схема 1): А - р<0,05. Число независимых экспериментов равно 4

Видно, что статистически значимый активирующий эффект был получен лишь после 10 мин инкубации с применением концентраций ФНО-а, равных 0,1 нг/мл -первичное введение и 0,5 нг/мл (повторное введение) (таб. 2.2, схема 1 - 0,1+0,5, # -р<0,05), т.е. при применении коротких сроков и более низких, как первичной, так и повторной концентраций ФНО-а.

Наряду с ростом ЭФП ЛНП под воздействием дважды инкубированной с ФНО-а культурой макрофагов (схема 1), также наблюдался значительный рост и ТБК-РП в ЛНП. |

Макрофаги, однократно инкубированные с ФНО-а в концентрации 0,1 нг/мл в течение 10 мин, заметного увеличение содержания ТБК-РП в ЛНП не вызывали.

Полученные данные, позволяют предпологать, что повторное воздействие низких доз ФНО-а на макрофаги не только в условиях in vitro, но и в условиях in vivo, способно предстимулировать или стимулировать клетки, которые вследствие этого, могут более' активно, чем нестимулированные макрофаги, окислять и поглощать ЛНП, способствуя началу образования атеросклеротических бляшек. Проверке данного предположения посвящен следующий раздел исследования.

3. Изучение способности МФцБс> окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.

Нами была использована культура МФибс- МФШс были инкубированы с ЛНПн или ЛНПг в количестве 200мкг/мл среды. По аналогии с ранее приведенными данными об инкубации МФН, инкубацию МФибс проводили течение 1, 3 и 6 часов в аэробных условиях (воздух 95% + С02 5%) и условиях аноксии (N2 95% + С02 5%, содержание 02 в смеси газов < 0,0012%). Исследования с (ЛНПн) и (ЛНПг) проводили параллельно.

Функциональную активность МФибс> как и МФН, исследовали по критериям содержания ТБК-РП, ЭФП ЛНП, накоплению в МФ общего холестерина и жизнеспособности МФ.

Данные исследований представлены в таблице 3.1- 3.4.

3.1. Оценка способности МФибс окислять ЛНПн и ЛНПг по накоплению в них ТБК-РП. Таблица 3.1. Содержание ТБК-РП в ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с МФибс в аэробных условиях и условиях аноксии, нмоль МДА/мг белка ЛНП (М±т).

0,34±0,1SS ] 0,78=0,17* $S

Условия аноксии, ч

I. ■

0,75±0,15»SA 0.5*0,58* ><

0,4±0,05

иг о,зАйД4** | -0,67«? н Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

Совместная инкубация МФибс с ЛНПн или ЛНПг в аэробных условиях вызывала значительное увеличение содержания ТБК-РП как в ЛНПн, так и ЛНПг, по сравнению с контролем только на первом часе их совместной инкубации (табл. 3.1, ** - р<0,01).

К третьему часу совместной инкубации уровень ТБК-РП как в ЛНПн, так и в ЛНПг значительно снижался по сравнению с первым часом; снижение продолжалось вплоть до 6 часа инкубации (особенно в ЛНПг, табл. 3.1, ** -р<0,01).

В условиях аноксии уровень ТБК-РП в ЛНПн, инкубированных с МФщс на 1-3 часах, достоверно возрастал, но снижался почти до исходного уровня к 6 часу их совместной инкубации с МФщС-

При инкубации ЛНПг с МФщс в условиях аноксии ТБК-РП существенно не менялись, за исключением снижения на 3 часах инкубации.

3.2. Оценка способности МФцбс окислять ЛНПн и ЛНПг по изменению электрофоретической подвижности.

Таблица 3.2. Электрофоретическая подвижность ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с МФибс в аэробных условиях иусловиях аноксии, у.е. (М±т).

ЛИП Контроль

Условия аноксии, ч

I з I

120413 15б±16** 160.S418 . ,37*3* ЩрШ* Щ

ЛНПн

ЛВПгЦ

Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

14б±15*

Как видно из табл. 3.2, величина ЭФП ЛНПн в процессе их совместной инкубации с МФцбс и в аэробных условиях, и в условиях аноксии значительно возрастала к первому часу и продолжала постепенно расти вплоть до 6 часов инкубации. Рост ЭФП в условиях аноксии, особенно в опытах с ЛНПг, был выражен слабее, чем в аэробных условиях, однако достоверных различий выявлено не было.

3.3. Оценка способности МФибс потреблять ЛНПн и ЛНПг по тесту аккумуляции МФИБС общего холестерина.

Таблица 3.3. Содержание общего холестерина в МФцбс после инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях иусловиях аноксии, нг/103 МФн (М±т).

ЛИП Контроль

Условия аноксии. ч

ЛНПн

23,39±2,9"S$«

Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

Из табл. 3.3. видно, что аккумуляция общего холестерина в аэробных условиях значительно возрастала и в ЛНПн, и ЛНПг (** - р<0,01). В ЛНПг в первые 1-6 часов она была значимо выше, чем в ЛНПн (табл. 3.3, ## - р<0,01).

Инкубация в условиях аноксии также приводила к значительному увеличению аккумуляции общего холестерина на всех сроках инкубации МФИБС, причем рост поглощения ОХ ЛНПн на 3-6 часах инкубации существенно превышал аккумуляцию ОХ в

аэробных условиях (табл. 3.3, Л-р<0,05). В отличие от ЛНПн, инкубация МФщс с ЛНПг в условиях аноксии значительных различий в способности МФщс накапливать ОХ, по сравнению с аэробными условиями, не выявила.

3.4. Оценка жизнеспособности МФибс в процессе их совместной инкубации с ЛНПн или ЛНПг.

Таблица 3.4. Таблица 1.4. Число жизнеспособных МФИБС в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, 103 МФН (М±т).

ЛНП . Аэробные условия, ч I з J 6 Условия аноксии, ч 1 ! з .1 ■, 6

ЛНПн I 379*42 233±7** | 192±15**S$ j 179:t2**$S | 18б±47**л j 133±35**SA j 91±17**SS/VA

.ЛНПг. . 3№4Г; : ; 155i5«#S ■ Н5±3**#$ : \ - ■ -Ci v ■ - J: " | iV3#22**■ - 145±37*- - ■■■ШВЯюН 99±23**: i 91427**.

Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

Из табл. 3.4 видно, что инкубация МФибс с ЛНПн и ЛНПг приводила к значительному снижению числа оставшихся прикрепленными ко дну ячейки (т.е. жизнеспособных) макрофагов. В аэробных условиях снижение жизнеспособных МФИБС было более выраженным при инкубации с ЛНПг, по сравнению с ЛНПн (#- р<0,05, ##-р<0,01). В условиях аноксии снижение числа жизнеспособных МФИбс> инкубированных с ЛНПн, было выражено резче, чем в аэробных условиях; при инкубации МФщс с ЛНПг различия между числом жизнеспособных клеток при аноксии и в аэробных условиях, а таюке

различия между макрофагами, инкубированными с ЛНПГ и ЛНПн, были недостоверны.

4. Сравнение способности культуры МФИБС и МФН окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии in vitro.

Сравнение МФн с МФибс в разных условиях их инкубации проводилось на основе ранее использованных критериев, а именно накопления в ЛНП ТБК-РП, аккумуляции общего холестерина в макрофагах, снижения числа жизнеспособных макрофагов. Данные представлены в таблицах 4.1 - 4.3

Таблица 4.1. Сравнение ТБК-РП в ЛНПн и ЛНПг в процессе их инкубации с МФИБС и МФН в аэробных условиях и условиях аноксии, нмолъ МДА/мг белка ЛНП (М±т).

ининв Аэробные условия, ч Условия аноксии, 4

ЯНМММ8 Контроль 3 6 i Г 3 6

ЛНПн+МФн 0,45±0,07 0,39±0,13 0,40±0,20 0,36±0,18 0,48±0,15 0,43±0,19 0,53±0,09

-i.-'i: . 'л-ЛНПн+МФ'жс ; 0,45±9,07 0;79i0,03** $ ,0.44«Ш .\7SHU7*S$ НПНМ 0,4=0,05

ЛНПгтМФц 0,70±0,08"* 0,34±0,08* 0,34±0,19* 0,38±0,18* 0,73±0,16*"л 0,33±0,06** | 0,39±0,15*

•--".-." .V-" »*■ '*•;•• * Л! !Пг+Мфивс ■ 1,18=0,05** , : .. tt# ss ' 1 ■".;0;4Ste;i2- . л - вявяшмш 0,67*0.1,-, . 0,5±0,18*# | С,69±0 23 '

Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

ЛНПг+МФ,

Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

Из табл. 4.2 видно, что аккумуляция ОХ на 3-6 часах инкубации ЛНПн как в аэробных условиях, так и при аноксии была значительно больше, чем при инкубации ЛНПн с МФН ($Р< 0,05; $$Р<0,001), а также чем при инкубации МФИБс с ЛНПГ. Последнее может быть объяснено более выраженным распадом переполненных ОХ МФщс, что и подтверждается данными, представленными в следующей таблице.

Из табл. 4.1 видно, что рост содержания ТБК-РП в ЛНПн и в ЛНПг как в аэробных условиях, а в опытах с ЛНПН и в условиях аноксии, в ранние сроки (1-2 часы инкубации,$р<0,05; $$р<0,01) наблюдался только в опытах инкубации ЛНП с МФИБС и отсутствовал в опытах с МФН.

Таблица 4.2. Сравнение содержания общего холестерина в МФибс и МФн в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, нг/1(? МФ (М±т).

ЛНПн+МФ,

0,53±0,09

Таблица 4.3. Сравнение числа жизнеспособных МФИБС и МФи в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, 1& МФ (М±т).

Аэробные условия, ч

Условия аноксии, ч

Контроль

300±18'

254±10**

80±27***лл

104±20***лл

71±24**"

ЛИЛ

ЛНПн+МФн

штш

ЛНПг+МФн

252±23* 220±17**

гг.'-г-и-.'-:" :: -г:" да?:«

158±2**м 104*4*»**

Ш±3**#$

Примечание: см. Примечание к Таблице 1.1

Из табл. 4.3 видно, что жизнеспособность МФИбс, инкубированных с ЛНПн и, особенно, с ЛНПг, снижалась во время первых 3-6 часов сильней, чем жизнеспособность МФН,($Р<0,05; $$Р<0,01).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что МФИбс обладают более сильным окислительным эффектом на ЛНПн и ЛНПг, более ранней и более сильной способностью

аккумучировать общий холестерин, поглощая ЛНПн и ЛНПг, более ранней и более выраженной потерей жизнеспособности, по сравнению с МФн

Из приведенных в данной работе результатов так же очевидно, что усилению функциональной активности в условиях аноксии больше подвергались МФибс, чем МФн, последние лишь при условии их инкубации с ЛНПг

Важно подчеркнуть, что условия аноксии, модечируемые в процессе инкубация культуры МФ+ЛНП in vitro, были близки к условиям, возникающим в сосудистой стенке в процессе сосудистого спазма, частичного тромбирования или стенозирования просвета сосуда, то есть они имитировали состояние локальной ишемии, реально возникающей в условиях ИБС и сердечной недостаточности

Выводы

1 Показано, что МФН, способны окислять и потреблять ЛНПн и ЛНПг как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии, причем способность к потреблению ЛНП и потеря жизнеспособности макрофагов в процессе инкубации значительно резче выражены в опытах с ЛНПг, чем с ЛНПн

2 Разработан метод предстимуляции и стимуляции МФН, in vitro с помощью однократного (прсдстимуляция) и двукратного (стимуляция) введений низких доз ФНО-а (0,1 и 0,5 нг/мт) в среду инкубации и доказано, что стимулированные m vitro макрофаги окисляют ЛНПн значительно сильнее, чем нестимулированные

3 Показано, что МФцБс, обладают выраженной способностью окисчять и потреб гять ЛНПн и, особенно, ЛНПг, как в аэробных условиях, так и при аноксии, а также подвергаться резкой и ранней гибели в процессе инкубации с ЛНПн и ЛНПг m vitro

4 МФН и МФибс вызывали более сильное окисление и потребление ЛНПн и ЛНПГ, причем оба процесса, а также гибель МФШ,С были резче выражены при их инкубации с ЛНПг, чем с ЛНПн и при инкубации в условиях аноксии, чем в аэробных условиях

5 Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ИБС возникает предстимуляции или стимуляции моноцитов-макрофагов в условиях in vivo, что делает больных ИБС предрасположенными к раннему возникновению или прогрессировашпо локального или генерализованного атеросклероза

6 На основе культуры МФщс разработана экспресс-модель для прогнозирования тяжести ишемических повреждений, выявления предрасположенности больного к

атеросклерозу, индивидуального подбора антиатеросклеротической терапии, скринингу и

предклиническим испытаниям новых лекарственных средств

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих

публикациях*

1 Биленко М В , Хильченко А В, Павлова А С , Анфалова И А Защитный эффект антиоксидантов на повреждение эндотелиальных клеток и окисление липопротеинов низкой плотности при их совместной инкубации в аэробных условиях, условиях ишемии или ишемии с добавление макрофагов в реперфузионном периоде // Материалы VI Международная конференция «Биоантиоксидант», (16 - 19 апреля 2002, Москва) - с 668-669,

2 Хильченко А В , Павлова А С, Биленко М В Способность макрофагов, взятых от здоровых доноров и больных ишемической болезнью сердца, окислительно модифицировать липопротеины низкой плотности и защитный эффект антиоксидантов и антигипоксантов // Материалы VI Международная конференция «Биоантиоксидант», (16 -19 апреля 2002, Москва) - с 597-599,

3 Павлова А С, Хильченко А В , Биленко М В Устойчивость макрофагов, взятых от здоровых доноров и больных ишемической болезнью сердца, к цитотоксическому действию липопротеинов низкой плотности и защитный эффект антиоксидантов и антигипоксантов // Материалы VI Международная конференция «Биоантиоксидант» », (16 - 19 апреля 2002, Москва) - с 439-440

4 Bilenko М V, Khilchenko А V Free radical inhibitors (FRI) can prevent cell-mediated LDL oxidation under ischaemia and reperfusion of vascular wall in situ // Abstract 22nd European Section Meeting of the International Society for Heart Research (3-6 July, 2002 -Szeged Hungary) J.Mol Cell Cardiol 2002 V 34,6, A10

5 Биленко M В, Хильченко А В Роль эндотелиальных клеток и макрофагов в окислительной модификации липопротеидов7 низкой плотности в условиях ишемии и реперфузии сосудистой стенки и защитный эффект антиоксидантов // Материалы 111-го Съезда биохимического общества, (26 06 - 01 07 2002, Санкт - Петербург) - с 139-140

6 Bilenko М V, Khilchenko А V Ischemia- and TNF-a-mduced pnmmg of blood macrophages increases their ability to oxidatively modify circulating LDL in aerobic and

ischemic conditions // Abstract Europen Atherosclerosis Society 73 rd EAS congress Supplement (July 7-10, Salzdurg, Austria,), 2002 049, 75

7 Биленко M В , Хильченко А В , Шмитько H А Свободно-радикальный механизм участия макрофагов (МФ) в окислении липопротеинов низкой плотности (ЛНП) в условиях ишемии (И) и реперфузии (Р) сосудистой стенки, защитный эффект антиоксидантов (АО) // Материалы 5-го Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунотогии и иммунофармакологии", (12-14 ноября 2002, Москва)

8 Биленко М В , Хильченко А В Участие неактивированных, предактивированных и активированных макрофагов (МФ) в окислении ЛНП, роль антиоксидантов (АО) в профилактике и лечение атеросклероза // Материалы международной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (2225 сентября, 2003, Смоленск) - с 55,

9 Биленко М В , Хильченко А В , Шмитько Н А Способность низких доз ФНО-а предактивировать и активировать макрофаги, повышая их способность к продукции активных форм кисчорода и окислению липопротеинов низкой плотности // Бюл Экс Биол Мед , 2003, Т 135, №4, - с 410-413

10 Биленко MB, Хильченко АВ, Коновалова ГГ, Ланкин ВЗ Влияние антиоксиданта пробукола на клеточно-опосредованное окисление липопротеидов низкой плотности in vitro и in vivo //Бюл Экс Биол Мед, 2003, Т 136, №8 - с 142145

11 М V Bilenko, А V Khilchenko The role of TNF-a - and ischaemia - induced priming and activation of macrophages in their ability to oxidatively modify LDL // Abstract 24 Meeting ISHR, (Dresden, Germany, 2004) J Mol Cell Cardiol, 2004,36(5) - p 715-716

12 Bilenko MV, Khilchenko AV, Nikitina NA The ability ofr macrophages from the blood of patients with ischemic heat diseise and healthy donors for LDL oxidation and uptake // Abstract XVIII World Congress of ISHR, (Brisbane, Australia, 2004) J Mol Cell Cardiol, 2004,37(1), B105 -p 242-243

13 Биленко MB, Хильченко АВ, Никитина НА Активация макрофагов в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и их способность более активно окислять и поглощать липопротеины низкой плотности (ЛНП), по сравнению с макрофагами из крови здоровых доноров // Материалы конференции «Дизрегуляционная патология органов и систем» (9-12 октября 2004, Москва, Россия) - с 135

Биленко М В , Хильченко А В , Павлова С А Применение антиоксидантов антигипоксантов для снижения окисления ЛНП под влиянием макрофагов эндотелиальных клеток в условиях ишемии и реперфузии сосудистой стенки Биомедицинская Химия, 2004, т 49 № 6 - с 554-565

Подписано в печать 20 03 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 186 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хильченко, Алексей Валериевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Происхождение и функции макрофагов.

1.2. Механизмы предактивации и активации МФ.

1.3. Взаимодействие МФ и окисленных ЛНП in vivo.

1.4. Метаболизм ЛНП липидов и холестерина в макрофагах.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. использованные материалы.

2.2. Растворы и среды.

2.3. Клеточная модель.

2.4 выделение ЛНП из плазмы крови человека.

2.5. Модель моноцит/макрофаг зависимого окисления ЛНП.

2.6. Оценка окислительной модификации ЛНПн и ЛНПг.

2.7. Измерение числа жизнеспособных моноцитов/макрофагов.

2.8. Захват моноцитами/макрофагами ЛНП.

2.9. Метод статистического анализа.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение способности МФн, окислять и поглощать Л НПн, и ЛНПГ в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.

3.2. Разработка метода предактивации и активации МФн с помощью ФНО-а, и сравнение их способности окислять ЛНПн in vitro.

3.3. Изучение способности МФибс, окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПГ в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.

3.4. Сравнение и обсуждение способности МФн и МФИБс окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПГ в аэробных условиях и условиях аноксии.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усиленный атерогенный эффект макрофагов из моноцитов крови больных ИБС, выявленный в аэробных условиях и при аноксии in vitro"

В последние десятилетия одной из главных причин заболеваемости и смертности населения является возникновение и/или прогрессирование атеросклероза. Хотя в течение последних десяти лет было предложено несколько гипотез развития атеросклероза, ни одна из них не может полностью объяснить процесс патогенеза атеросклероза в целом, так как развитие атеросклероза связано с многочисленными факторами «риска».

Несмотря на это, в настоящее время хорошо известно, что клеточным элементам сосудистой стенки, а также циркулирующим моноцитам/макроф&гам принадлежит существенная роль в патогенезе атеросклероза [40, 64].

Этому способствуют факторы «риска», к которым принадлежат гипертония, курение, стресс и другие факторы [123, 132]. Факторы «риска» сопровождаются генерализованной, а также локальной ишемии сосудистой стенки [57, 137], что ведет к выделению эндотелиальными клетками (ЭК), макрофагами (МФ), гладкомышечными и другими клетками активных форм кислорода (АФК), провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и др.), участвующих в стимуляции макрофагов и их способности окислять ЛНП [18].

Окислительная способность макрофагов обусловлена стимуляцией их НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной систем [6]. Имеются данные, согласно которым лишь стимулированные моноциты/макрофаги обладают способностью осуществлять свои многоплановые функции, в том числе выделять АФК, окислять и поглощать ЛНП [108].

В настоящее время установлено, что переход макрофагов из нестимулированного в стимулированное состояние проходит через стадию предстимуляции (прайминга), которая возникает при первичном воздействии стимула и заключается в повышении экспрессии и аффинности поверхностных скавенджер-рецепторов макрофагов, активизации ферментов ГМФШ, нарабатывание комплекса НАДФН-оксидазы [18].

Однако, в стимулированное состояние предстимулированные макрофаги переходят лишь после повторного стимула, при котором макрофаги уже становятся способными к продукции АФК, синтезу биологически активных веществ, проявлению атерогенных (окисление и поглощение ЛЫП) функций [19, 18, 65, 128, 154].

Однако, дозы цитокинов и сроки инкубации, необходимые для предстимуляции и стимуляции макрофагов, а также способность предстимулированных и стимулированных макрофагов крови человека окислительно модифицировать ЛНП, не исследованы.

Особенно важным является вопрос об условиях предактивации и активации моноцитов/макрофагов in vivo. Исследование этого вопроса особенно важно для профилактики возникновения и прогрессирования атеросклероза у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), количество которых достигает 30-40% численности больных индустриальных городов большинства стран мира. Это заболевание стоит на одном из первых мест по числу летальных исходов, и до настоящего времени к нему не подобрана ранняя и эффективная терапия.

Многократно показано, что в крови больных ИБС резко повышено содержание таких цитокинов как ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и др., которые, как показано in vitro, и являются активными стимуляторами моноцитов/макрофагов [79, 80, 110, 115, 146, 156].

Однако, за исключением данных об изменении генных и морфологических признаков активации лейкоцитов и моноцитов, работ, указывающих на усиление атерогенной функции макрофагов, полученных из моноцитов крови больных ИБС, в литературе не найдено, что препятствует направленному воздействию на свойства макрофагов у больных ИБС.

Наряду с клеточными элементами сосудистой стенки и крови, существенная роль в атерогенезе принадлежит уровню холестерина в крови людей и степени окисленности ЛНП*.

Показано, что количество окислительно модифицированных ЛНП в крови гиперхолестеринемичных людей [23, 54] или животных [22, 76] выше, чем в крови людей и животных с нормальным содержанием холестерина.

Липопротеины низкой плотности у больных с гиперхолестеринемией содержат более высокое количество не только свободного холестерина и триглицеридов, но и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), кроме того, они характеризуются более низким содержанием антиоксидантов (Коэнзим Qio, Вит.Е) и обладают более высоким отрицательным зарядом, характеризующим модификацию апо-В белка, что обуславливает их способность быть распознанными и практически недозируемо поглощенными макрофагами (МФ) [138, 141, 150].

Однако, спобность ЛНП, полученных от людей с гиперхолестеринемией, подвергаться дальнейшему in vivo или in vitro окислению по сравнению с ЛНП, полученными из крови здоровых доноров (ЛНПн) изучена недостаточно, имеющиеся работы единичны, проведены, главным образом, с использованием Си2+-опосредованного окисления и не содержат анализа показателей, характеризующих окислительную модификацию апо-В белка и способность МФ поглощать окисленные ЛНП.

Существенную роль в предстимуляции и стимуляции макрофагов играет гипоксия и ишемия, при которых усиливается продукция АФК, а в самих тканях и циркулирующей крови резко возрастает содеражание продуктов ПОЛ [2,-7, 9, 42, 43, 45].

Однако, влияние условий ишемии на способность МФ окислять и поглощать окисленные ЛНП, исследовано недостаточно.

В связи с этим целью настоящей работы является изучение способности макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров и больных ИБС, окислять и поглощать липопротеины низкой плотности, полученные от здоровых доноров и людей с гиперхолестеринемией, при их инкубации в аэробных условиях и при аноксии in vitro.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Изучить способность макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров (МФН), окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПГ в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.

2. С помощью ФНО-а разработать метод предстимуляции и стимуляции макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров (МФн) в условиях in vitro; сравнить способность нестимулированных и стимулированных in vitro макрофагов окислять ЛНПн.

3. Изучить способность макрофагов, полученных из моноцитов крови больных ИБС (МФибсХ окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПГ в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.

4. Сравнить способность макрофагов, полученных из моноцитов крови больных ИБС и здоровых доноров, окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПГ в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хильченко, Алексей Валериевич

Выводы

1. Показано, что МФН, способны окислять и потреблять ЛНПн и ЛНПр как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии, причем способность к потреблению ЛНП и потеря жизнеспособности МФН в процессе инкубации значительно резче выражены в опытах с ЛНПг, чем с ЛНПн.

2. Разработан метод предстимуляции и стимуляции МФН in vitro с помощью однократного (предстимуляция) и двукратного (стимуляция) введений низких доз ФНО-а (0,1 и 0,5 иг/мл) в среду инкубации и доказано, что стимулированные in vitro макрофаги окисляют ЛНПн значительно сильнее, чем нестимулированные.

3. Показано, что МФИбс> обладают более выраженной способностью окислять и потреблять ЛНПн, по сравнению с ЛНПг, как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии, а также подвергаться резкой и ранней -гибели в процессе инкубации с ЛНПн и ЛНПГ in vitro.

4. Доказано, что МФибс вызывают более сильное окисление и потребление ЛНПн и, особенно, ЛНПГ по сравнению с МФН, также раньше и резче теряют жизнеспособность, чем МФН; условия аноксии усиливают атерогенные свойства МФИбс> по сравнению с аэробными условиями.

5. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ИБС возникает предстимуляция или стимуляция моноцитов-макрофагов в условиях in vivo, что делает больных ИБС предрасположенными к раннему возникновению или прогрессированию локального или генерализованного атеросклероза.

6. Полученные данные создали предпосылку для разработки на основе культуры МФИбс и кульуры МФн экспресс-модели для выявления предрасположенности больного ИБС к атеросклерозу, индивидуального подбора антиатеросклеротической терапии, скрининга и предклинических испытанияй новых лекарственных средств.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хильченко, Алексей Валериевич, Москва

1. Айдыралиев Р.К Изменение заряда поверх-ности липопротеинов низкой плотности при перекисной модификации / Айдыралиев Р.К, Азизова О.А., Миррахимов М.М., Лопухин Ю.М. // Бюл. Экспер. Биол. Мед., 2001, Т. 132, №8, С. 164-166.

2. Алесеенко А.В. Изучение уровня перекисей и антиокислительной активности липидов в ишемизированных и консервированных почках / Алесеенко А.В., Биленко М.В., Бурлакова Е.Б. и соавт. // Вестн. АМН СССР. 1976.-N 8.-С. 61-67.

3. Архипенко Ю.В. Повреждение саркоплазматического ретикулума скелетных мышц при ишемии: роль перекисного окисления липидов / Архипенко Ю.В., Биленко М.В., Добрина С.Г. // Бюл. эксперим. биол. -1977.-N6.-С. 683-686

4. Белова Л.А. Биохимия процессов воспаления и поражения сосудов. Роль нейтрофилов. // Биохимия- 1997. Т 62.-№ 6. -С. 659 668.

5. Белова Л.А., Оглоблина О.Г., Белов А.А., Кухарчук В.В. Профцессы модификации липопротеинов, физиологическая и патогенетическая роль модифицированных липопротеинов. Вопросы медицинской химии I, 2000.

6. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов ( молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения) / Биленко М.В М.: Медицина, 1989, 386 с.

7. Биленко М.В. Роль ишемии в локальной степени в локальном, in situ, окислении липопротеинов низкой плотности / Биленко М.В. // Вопр. мед. химии. 1999 - № 5. - С. 446.

8. Приорететная публикация 23 ноября 1973г. Бюлл.открытий и изобретений 1991, №30,-С. 3.

9. Биленко М.В. Способность эндотелиальных клеток вызывать окисление липопротеинов низкой плотности / Биленко М.В., Вахрушева Т.В., Федосова С.В // Бюл. экспер. биол. 1998 - Т. 126. №6. - С. 314-317.

10. Биленко М.В. Влияние нативных и окисленных липопротеинов низкой плотности на хемилюминесценцию макрофагов / Биленко М.В., Клебанов Г.И., Долгина Е.Н., Никанкина JI.B. // Бюлл.эксп. биол. мед. -1999. -Т. 128, №11. С.514-517.

11. Биленко М.В. Свободнорадикальные механизмы участия МФ крови в патогенезе атеросклероза в условиях ишемии и реперфузии сосудистой стенки / Биленко М.В., Ладыгина В.Г., Климовицкая Л.В. // Второй Российский конгресс по патофизиологии, М., 2000. - С. 183

12. Биленко М.В. Цитотоксический эффект липопротеинов низкой плотности на неишемизированные, ишемизированные и реперфузированные эндотелиальные клегки / Биленко М.В., Ладыгина В.Г., Федосова С.В. // Бюл. Экспер. Биол. Мед., 1998, - Т. 126, №9. -С. 302-306.

13. Бухарин О.В. Неспецифический иммунитет / Бухарин О.В. // Оренбург: Труды кафедры микробиологии ОМИ, 1975. Т. 6. 112 с.

14. Владимиров.Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. / Владимиров 10. А., Арчаков А.И. // М.: Наука, 1972. - 231 с.

15. Власова И.И. Связывание катионов двухвалентных металлов с липопротеиноми низкой плотности. Исследование методом ЭПР / Власова

16. И.И., Дремина У.С., Шаров B.C., Азизова О.А. // Биофизика, 2002, № 47,- С. 641-646.

17. Карр Я. «Макрофаги». Обзор ультраструкгуры и функции / Карр Я. II М.: Медицина, 1978. 189 с.

18. Клебанов Г.И. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов / Клебанов Г.И., Владимиров Ю. А. // Успехи современной биологии, 1999, - Т. 119, № 5, - С. 462-475.

19. Климакова J1.B. Оценка устойчивости макрофагов (МФ) к аноксии, дефициту субстратов и ишемии / Климакова J1.B., Ладыгина В.Г., Биленко М.В. // VII Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2000, - С. 409.

20. Ленинджер А. Биохимия / Ленинджер А. // Пер. с англ., М.: Мир, 1974, ■.- 956 с.

21. Лопухин Ю.М., Владимиров Ю.А., Молоденков М.Н., Клебанов Г.И., , Сергиенко В.И., Торховская Т.Н., Чернокова Я.М., Наумов А.В., Максимов В.А., Шерстнев М.П. Вопрос. Мед. Химии 1983. Т. 29, № 1, -С. 116-120.

22. Лопухин Ю.М. Хемолюминесцения апо-Б липопротеинов в экспериментальной гиперхолестеринемии кроликов / Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н., Владимиров Ю.А., Сергиенко В.И., Клебанов Г.И., Шерстнев М.П. //Бюл. Эксп. Биол. Мед.1982.-Т. 93,№4.-С. 101-102.

23. Лукянова Л.Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние / Лукянова Л.Д., Балмуханов Б.С., Уголев А.Т. /1-М.: Наука, 1982.-301 с.

24. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / Маянский А.Н., Маяиский Д.IT. // Новосибирск: Наука, 1883. - 256 с.

25. Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / Осипов А.Н., Азизова А.Н., Владимиров Ю.А. // Успех биологической химии. М.: Наука, 1984. Т. 25, С. 110 - 124.

26. Осипов С.Г., Титов В.Н. Иммунные комплексы и атеросклероз. // Кардиология -1982.-N7.-C. 119-125.

27. Панасенко О.М., Сергиенко В.И. Свободно-радикальная модификация липопротеинов крови и атеросклероз. Биологические мембраны. 1993, 10, 4, 341-382.

28. Патологическая физиология / Под ред. А.Д. Адо, В.В. Новицкого. -Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1994. 468 с.

29. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М.: Медицина, 1978. 200 с.

30. Энциклопедический словарь медицинских терминов: В 3-х томах. Около 60000 терминов./ Гл. ред. Б.В. Петровский. — М.: Советская энциклопедия, Т.1.А - 1982. 464 с.

31. Akimaru К, Utsumi Т, Sato EF, Klostergaard J, Inoue M, Utsumi К. Roleof tyrosyl phosphorylation in neutrophil priming by tumor necrosis factor-alpha -fand granulocyte colony stimulating factor / Arch Biochem Biophys. 1992. -Vol. 298, № 2. - P. 703-709

32. Asmis R, Begley JG, Jelk J, Eversom WV. Lipoprotein aggregation protects human monocyte-derived macrophages from OxLDL-induced cytotoxicity. J Lipid Res. 2005; 46(6): 1124-32. Epub 2005 Mar 16.

33. Aviram M., Fuhrman B. // Mol.Cell Biochem. 1998. V.188, №1-2 -P.149-159.

34. Babiy AV, Gebicki JM Decomposition of lipid hydroperoxides enhances the uptake of low density lipoprotein by macrophages. Acta Biochim Pol 1999; 46:31-42

35. Bennett В Comparative morphology of macrophages in tissue culture. .// Adv. Exp. Med. Biol., 1967. V. 1. - P. 74.

36. Beppu M, watanade M, Sunohara M, Ohishi K, Mishima E, Kawachi H, Fujii M, Kikugawa K. Participation of arachidonic acid cascade pathway inmacrofage binding/ uptake of oxidized low density lipoprotein. Biol. Pharm Bull. 2002 Jun; 25 (6): 710-7.

37. Berk B.C. Redox signals that regulate the vascular response to injury// Thromb. Haemost. 1999 Aug.; 82 (2): P. 810-817

38. Berkov R.L. and R.W. Dodson. Tyrosine-specific protein Phosphorylation during activation of human neutrophils. // Blood. 1990. - v.75, № 12. - p. 315-321.

39. Beutler. B. and Cerami A. Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator// Ann. Rev. Biochem. 1988. - Vol.57. -P.505-518.

40. Bilenko M.V. Free Radical Mechanisms of Ischemic and Reperfusion Injuries to Varies Organs. Monographia. Nova Science Publishers, Inc., I-Iuntington, New York, 2001, 380p.

41. Bilenko M.V. Role of ishemia and reperfusion of vascular endotelial cells in pathogenesis of atherosclerosis. Abstr. 70th EAS Congress, Geneva, Switzerland, 1998, p. 123 .

42. Bilenko M.V., Bulgakov V.G. and Velikhanova D.M. Membrane injures in ischemic tissues and role of lipid peroxidation. Probleme der Hematologie, Transfusion und Transplantation, 1981, vol. 8, No. 2, pp. 53-62.

43. Bilenko M.V., Fedosova S.V., and Ladygina V.G. Ishemia- and free radical- induced injury of endotelial cells. Abstr. XVI European Congress Int. Soc. Heart Res.,Bologna ,Italy J.Moll.Cell.Cardiol., 1996, vol. 28,No.5 p/A31.

44. Bilenko, M.V.; Sevanian, A.; Hochstein,P. Effect of anoxia and anoxia plus glucose deprivation on viability and growth of endothelial cells (abstract). J. Mol. Cell. Cardiol. 1993, 25: 5,85

45. Brown A.J., Dean R.T., Jessup W. Free and esterified oxysterl: formation during copper-oxidation of low density lipoprotein and uptake by macrophages. J. Lipid Res 1996, 37, 320-335

46. Brown A.J., Jessup W. Oxysterole and atherosclerosis. Atheroslcerosis 1999, 142, 1-29.

47. Brown A.J., Leong S.L., Dean R.T., Jessup W. 7-Hydorperoxycholestrol and its prodcts in oxidized low density lipoprotein and human atherosclerotic pique. J Lipid Res 1997, 38, 1730-1745

48. Brown A.J., Mander E.L., Gelissen I.C. et al. Cholesterol and oxysterol medabolism and subcellular distribution in macrophage foam cells: accumulation of oxidized esters in lysosomes. J Lipid Res 2000, 41, 226-236

49. Cazzolato, G.; Avogaro, P.; Bittolo-Bon, G. Characterization of a more electronegatively charged ЛНП subfraction by ion exchange HPLC. Free Radic. Biol Med. 11:247-253; 1991.

50. Chao FF, Blanchette-Mackie EJ, Tertov W, et al. Hydrolysis of cholesteryl ester in low density lipoprotein converts this lipoprotein to a liposome. J Biol Chem 1992; 267:4992-4998.

51. Chazov E.I., Tertov V.V., Orekhov A.N., Lyakishev A.A., Perova N.V., Kurdanov Kh.A., Khashimov Rh.A., Novikov I.D., Smirnov V.N. Atherogenecity of blood serum from patients with coronary heart disease. Lancet, 1986; 2(8507): 595-598.

52. Crawford D.W, Kramsch D.M. // Exp. Mol. Pathol. 1988. V.49, № 2 -P.215-233

53. Dana R., Leto T.L., Malech H.L., Levy. Essential requirement of cytosolic phospholipase A2 for activation of the phagocyte NADPH oxidase. // J. Biol. Chem. 1998. - v.273.-p.441-445.

54. Edashige E., Watanable Y., Sato E.F., Takerhara Y. and Utsumi K. Reversible priming and protein-tyrosyl phosphorylation in human peripheral neutrophils under hypotonic conditions. // Arch.biochem.biophys. 1993. — v.302. -№ 2. -p.343-347.

55. English D. Phosphatidic acid: A lirid messendger involved in intracellular and extracellular signaling. // Cell. Signal. 1996.-v.8.-p.341-347.

56. Esterbauer H.,Dieber-Rotheneder M.,Waeg G., Striegl G. And Jurgens G. Biochemical, structural and functional properties of oxidized low-density lopoproteins. Chem. Pes. Toxicol., 1990,3(2),77-92.Invited Review.

57. Esterbauer H.; Jurgens, G.; Quechenberger, O; Koller, E. Antoxidation of human low density lipoproteini loss of polyunsaturated fatty acids and vitamin E and geceration of aldehydes. J. Lipid. Res. 28: 495-509; 1987.

58. Fan J, Watanabe T. Inflammatory reactions in the pathogenesis of atherosclerosis. J Atheroscler Thromb. 2003;10(2):63-71.

59. Garcia-Radriguez C., Montero M., Alvarez J., Garcia-Sancho J., Sanchez-Crespo M. // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. N 33. - P. 25751 -25757.

60. Geuze HJ, Slot JW, Strous GJ, Lodish HF. Intracellular site of asialoglycoprotein receptor-ligand uncoupling: double-lable immunoelectron microscopy during recertor-mediates endocytosis. Cell 1983; 32:277-287.

61. Haberland ME, Mottino G, Le M, Frank JS. Sequestration of aggrefated LDL by macrophages studied with freeze-etch electron microscopy. J Lipid Res 2001;42:605-619.

62. Han J, Hajjar DP, Febbraio M, Nicholson AC. Native and modified low density lipoproteins increase the functional expression of the macrophage class В scavenger receptor, CD36. J Biol Chem. 1997; 272: 21654-21659.

63. Hara A.,Radin N.S.Lipid extraction of tissue with a low-toxity solvent. Anal. Biachem., 1978, 90,420-426.

64. Hardwick SJ, Carpenter KL, Allen EA, Michinson MJ; Gluthation and the toxicity of oxidised low-density lipoprotein to human monocyte-macrofages. Free Radic. Res 1999 Jan; 30 (1): 11-19

65. Heinecke J.M., Chait. Lipoprotein modification: cellular mechanisms. // Curr. Opin. Lipidol. Oct. 1994. 5 (5). P. 365 - 370.

66. Henderson L.M. and Chappel J.T. NADPH oxidase of neutrophils. //Biochim. Biophys. Acta. 1996. - v.' 1273. -p.87-107.

67. Hodis, H.N.; Kransch, D.M.; Avogaro, P.; Bittolo-Bon, G.; Cazzolato, G.; Hwang, J.; Peterson, H.; Sevanian, A. Bioehtmieal and cytotoxic characteristics of an in vitro circulating oxidized LDL. J Lipid Res. 35:669-677; 1994.

68. Hoff HF, Cole ТВ. Macrophage uptake of low-density lipoprotein modified by 4-hydroxynonenal. An ultrastructural study. Lab invest 1991; 64:254-264.

69. Hoff HF, Zyromski N, Armstrong D, CTNeil J. Aggregation as well as chemical modification of LDL during oxydation is responsible for poor processing in macrophages. J Lipid Res 1993; 34:1919-1929.

70. Hojo Y, Ikeda U, Takahashi M, Shimada K. Increased levels of monocyte-related cytokines patients with unstable angina. Atherosclerosis 2002; 161: 403-408

71. Horkko, S., D.A.Bird, E. .Miller, et al. 1999. Monoclonal autoantibodies specific for oxidized phospholipids or oxidized phospholipid-protein adducts inhibit macrophage uptake of oxidized low-density lipoproteins. J. Clin. Invest 103: 117-128.

72. Hsu, H.Y., Nicholson, A.C., and Hajjar, D.P. 1996. J. Biol. Chem. 271, 7767-7773.

73. Hsu, H.Y., Twu Y.C. 2000. Tumor Necrosis Factor-a-mediated Protein Kinases in Regulation of Scavenger Receptor and Foam Cell Formation on Macrophage. J. Biol. Chem. 275(52), 41035-41048.

74. Huang W, Ishii I, Zhang WY, et al. PMA activation of macrophages alters macrophage metabolisn of aggregation LDL. J Lipid Res 2002; 43: 1275-1282.

75. Hulten LM, Ullstrom C, Krettek A, van Reyk D, Marklund SL, Dahlgren C, Wiklund O. Human macrophages limit oxidation products in low density lipoprotein. Lipids Health Dis. 2005; 4(1):6.

76. Jessup W, Mander EL, Dean RT. The intracellular storage and turmover of apolipoproteina В of oxidized LDL in macrophages. Biochim Biophys Acta 1992; 1126:167-177.

77. Jessup W. and Kritharides L. Metabolism of oxidized LDL by macrophages. Curr Opin Lipidol. 2000 Oct;l 1(5):473-81.

78. Jessup W., Simpson J.A., Dean R.T. Does superoxide radical have a role in macrophage-mediated oxidative modification of ЛНП. // Atherosclerosis, Feb. 1993. 99 (1).-P. 107-120.

79. Johnston R.B., Kitagawa S. Molecular basis for the enchanced respiratory burst of activated macrophages. // Fed. Proc. 1985. - v.44, № 14. - p.2927-2932.

80. Kanbara Т., Tomoda H.K., Sato E.F., Ueda W. and M. Wanabe. Lidocaine inhibits priming and protein tyrosine phosphorylation of human peripheral neutrophils. // Biochem. Pharmacol. 1993. - v. 45, № 8. - p.l593-1598.

81. Karten B, Boechzelt H, Abuja PM, Mittelbach M, Oettl K, Sattler W. Femtomole analysis of 9-oxononanoyl cholesterol by high performance liquid chromatography. J Lipid Res 1998,39(7), 1508-1519

82. Khoo JC, Miller E, McLoughlin P, Steinberg D. Enhanced macrophage uptake of low density lipoprotein after self-aggregation. Arteriosclerosis 1988; 8:348-358.

83. Kontush, A.; Reich, A.; Baum, K.; Spronger, T; Finckh, В.; Kohlschutter, A.; Beisiegel, U. Plasma ubiquinol-10 is decreased in patients with hyperlipidaemia. Aterosclerosi.sl997, 129,: 119-126.

84. Krause SW, Kreutz M, Andreesen R. Differential effects of cell adherence on LPS-stimulated cytokine production by human monocytes and macrophages. Immunobiology 1996-19997; 196: 522-534

85. Kritharides L, Jessup W, Gifford J, Dean R.T. A method for difining the stages of low-density lipoprotein oxidation by the separation of cholesterol and cholesteryl ester-oxidation products using HPLC. Anal Biochem, 1993; 213:79-89.

86. Kruth H.S. Macrophage foam cells and atherosclerosis. Front Biosci 2001; 6:D429-D455.

87. Kruth H.S. Seqeustration of aggregated low-density lipoproteins by macrophages. Current Opinion in Lipidology 2002; 13:483-488.

88. Kruth H.S. Sequestration of aggregated low-density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. 2002 Oct;13(5):483-8. Review

89. Kruth H.S., Chang J, Ifrim I, Zhang WY. Characterization of patocytosis: endocytosis into macrophage surface-connected compartments. Eur J Cell Biol 1999; 78:91-99.

90. Kuznetsov A.S., Missyul B.V. (1992) The charge and atherogenicity of low density lipoproteins. Ukr. Biochim. Zh., 64 (4), 3-19.

91. Lavy, A.; Brook, G.J.; Dankner,G.; Ben Amotz, A.; Aviraum, M. Enhanced in vitro oxidation of plasma lipoproteins derived from hyperholesterolemic patients. Metabolism.1991, 794-799.

92. Leusen J.H.W., Verhoeven A.J., Roos D. Interaction between the components of human NADPH oxidase: A review about the intrigues in the phox family. // Front.biosci. 1996. - v. 1. - p.d72-d92.

93. Lindgren, F. Analysis of Lipid and Lipoproteins. In: Perkins E.G., ed. Amsterdam: Amer. Oil Chemist's Soc. 1975: 205-224

94. Lopes-Virella MF, Griffith RL, Shunk KA, Virella GT. Enhanced uptake and impaired intracellular metabolizm of low density lipoptotein complexed with anti-low density lipoprotein antibodies. Arterioscler Thromb 1991; 11:1356-1367.

95. Lougheed M, Zhang HF, Steinbrecher UP. Oxidized low density lipoprotein is resistant to cathepsins and accumulates within macrophages. J Biol Chem 1991; 266:14519-14525.

96. Ma,J., Chen,Т., Mandelin,J.,Ceponis,A,. Miller,N.E., Ma, G.F., and Kontinen,Y.T. Reggulationof macrophage activation. Revew. Cell. Mol. Life Sci. 2003, 60,2334-2346.

97. Maly F.E., Schurer Maly C.C. How and why make superoxide: the "phagocytic" NADPH oxidase. // Sci. Am. Physiol. Soc. - 1995. -v. 153, № 12. - p.5643-5649.

98. Mazzone A, Cusa C, Mazzucchelli I, Vezzoli M, Ottini E, Pacifici R, Zuccaro P, Falcone C. Increased production of inflammatory cytokines patients with silent myocardial ischemia. J Am Cell Cardiol. 2001; 38: 1895-1901.

99. McColl S.R., Beauseigle D., Gilbert C. and P. Naccache. Priming of the human neutrophil respiratory burst by GM CSF and TNF-a involves regulation at post - cell surface receptor levels. // J. Immunol. - 1990. - v.245. - № 9. - p.3047-3054.

100. McLeish K.R., Klein J.B., Lederer E.D., Head K.Z., Ward R.A. // Azotemia, TNFalpha and LPS prime the human neutrophil oxidative burst, by distinct mechanisms. // Kidney Int. 1996 - Aug.; 50 (2) - p.407-416.

101. Mian, R., Westwood,D., Stanly,P., and Coote, J.H. Acute systemic hypoxia and the surface ultrastructure and morphological characteristics of rat leukocytes. Exp.Physiol. 1993,78. 839-842.

102. Mihara, M.; Uchiyama, M.; Fakuzawa, K. Thiobarbituric acid value in fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, cells intoxication and vitamin E deficiency. Biochem. Med. 1980; 23: 302-311

103. Morel D, DiCorleto P, Chisolm G. Endothelial and smooth muscle cells alter low-density lipoprotein in vitro by free radical oxidation. Aterosclerosis. 1984; 4: 357-364.

104. Morel D, Hessler J, Chisolm G. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid J Lipid Res. 1983; 24: 1070-1076

105. Myers D.E., Huang W.N., Larkins R.G. // Am.J.Physiol. 1996. V.271, №5,Pt.l -P. C1504-C1511.

106. Naccache PH, Gilbert C, Caon AC, Gaudry M, Huang CK, Bonak VA, Umezawa K, McColl SR. Selective inhibition of human neutrophil functional responsiveness by erbstatin, an inhibitor of tyrosine protein kinase. Blood. 1990 Nov 15;76(10):2098-104.

107. Nichols В A. Uptake and digestion of horseradish peroxidase in rabbit alveolar macrophages. Formation of a pathway connecting lysosomes to the cell surface. Lab Invest 1982; 47:235-246.

108. Noble, R.P. Electrophoretic separation of plasma lipoproteins in agarose gel. J. Lipid Res. 1968; 9: 693-700

109. O'Donnell C.J., Ridker P.M., Glynn R.J. et al. Hypertension and borderline isolated systolic hypertension increase risks of cardiovascular disease and mortality in male physicians. Circulation 1997; 95: 1132-1137.

110. Oxidativ stress / Ed. H. Sies. Kondon: Academic Press., 1985. 507 P.

111. Parthasarathy, S., L.G. Fong, D. Otero, et al. 1987. Recognition of solubilized apoproteins from delipidated, oxidized low density lipoprotein (LDL) by the acetyl-LDL receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 537-540.

112. Perianin A., Snyderman R. // J. Of Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. N 2. -P. 1005- 1009.

113. Qi X, Peng Y, Gu J, Li S, Zheng S, Zhang J, Wang T. Inflammatory cytokine release in patients with unstable angina after coronary angioplasty. Jpn Heart J. 2002; 43:103-115.

114. Rabinowitz S, Horstmann H, Gordon S, Griffiths G. Immunocytochemical characterization of the endocytic and phagolysosomal compartments in peritoneal macrophages. J Cell Biol 1992; 116:95-112.

115. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis an update. New Engl J Med 1986;314:488-500.

116. Sambrano, G.R.&D. Steinberg. 1994. Recognition of oxidatively damaged erythrocytes by a macrophage receptor with specificity for oxidized low density lipoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3265-3269.

117. Sanidas, D., Garnham,A., and Mian,R. Activation of human leukocytes by acute hypoxia. Exp. Physiol. 2000, 85(3), 2023-2026.

118. Sawer D.T., Nanni E.J. (Jr.) // Oxygen and oxiradicals in chemistry and biology/ Ed/ M. A. J. Rogers, E.L. Powers. N. Y.: Acad. Press, 1981. P. 15 40

119. Sconnell.G. Leukocyte response to hypoxic/ischemic conditions. New Horizonts. 1996,4, 179-183.

120. Seidel S.L. and Strong R. Hypertension, 1986, 8, 103—108.

121. Slatter DA, Paul RG, Vurray M, Bailey AJ. Reactions of lipid-derived malondialdehyde with collagen. J Biol Chem 1999; 274:19661-19669.

122. Steinberg D. & J.L. Witztum. 1999. Lipoproteins, lipoprotein oxidation, and artheriogenesis. In Molecular Basis of Cardiovascular Disease. K.E Chien, ed. :428-476. W.B. Sauders. Philadelphia.

123. Steinberg D., Lewis A. Conner Memorial lecture: Oxidative modification of LDL and atherogenesis. Circulation. 95: 1062-1072; 1997.

124. Steinberg D., Parthasarathy S, Carew T, Khoo J, Witztum J. Beyond cholesterol: modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity. N Engl J Med. 1989; 320: 915-324.

125. Steinberg D., Parthasarathy S., Carew Т.Е., Khoo J.C., Witztum J.L. Modification of low-density lipoprotein that increases its atherogenecity N: Engl. J. Med. 320: 915-924; 1979.

126. Stenbrecher U.P. Oxidation of Human Low Density Lipoprotein Resylts in Derivaoization of Lysine Residues of Apolipoprotein В by Lipid Perozide Decomposition Products. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. № 8. P. 3603 3608.

127. Suiits AG, Chait a, Aviram M, Heinecke JW. Phagocytisis of aggregated lipoprotein by macrophages: low density lipoprotein receptor-dependent foam-cell fprmation. ProcNatl Acad Sci U S A 1989; 86:2713-2717.

128. Takahashi К, Takeya M, Sakashita N. Multifunctional roles of macrophages in the development and progression of atherosclerosis humans and experimental animals. Med Electron Microsc. 2002; 35:179-203.

129. Takahashi R., Edadishe K., Sato E.F., Jnoue M., Matsuno T. and Utsuki K. Luminol chemiluminescense and active oxygen generation by activated neutrophils. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. - v.285, № 2. - p. 325-330.

130. Terao J. In.: All rigst reserved Flontiers of reactive oxigen species in biology and medicine, 1994 P. 329-332.

131. Tertov, V.V.;Orekhov, A.N.; Martsenyuk, O.N; Perova, O.N.; Smirnov, V.N. Low density lipoproteins isolated from the blood of patients with coronary lipids in human aortic cells. Exp. Mol. Patol. 1989, 50, 337-347.

132. Thompson J., van Furth R. The effect of glucocorticsteroids on the kinetics of mononuclear phagocytes. // J. exp. Med., 1970. V.131. P.429.

133. Turrens J.F., Freeman B.A., Levitt J.G. et al. // Arch. Biohem. 1982. -v.217. -p.401-410

134. Uchida, K. Role of Reactive aldehyde in cardiovascular diseases. Free. Rad. Bilo. Med. 28, 12: 1685-1696; 2000.

135. Uhing R.J., Adams D.O. // Agents and actions. 1989. - Vol. 26. N 1/ 2. - P.9-14.

136. Vartanyan L.S., Rashba Yu.E., Nayler L.G., et al. Membranes of subcellular organelles as a source of superoxide radicals in ischemia of the liver. Byull. Eksp. Biol. Med., 1990, vol. 55, No. 6, pp. 550-552 (English translation, pp. 731-734).

137. Virolainen M. Blast transformation in vivo and in vitro in carbmezopin hypersensitivity. //Clin. exp. Immunol., 1971. V.9.P. 429.

138. Vladimirov Yu.A., Olenev V.A., Suslova T.B., Cheremisina Z.P. // Adv. Lipid Res. 1980.V. 17. P. 173-250.

139. Warren J.S., Kinkel S.L., Cunningham T. W., Johnson K.J. Macrophagederivated cytokines amplify immune complex triggered responses by rat alveolar, macrophages. //Amer. J. Pathol. 1998. - v. 130, № 3. - p.489-495.

140. Watson A.D., Subbanagounder G, Welsbie D.S. et al. Structural identification of a novel pro-inflfmmatory epoxyisoprostne phospholipids in miLDLy oxidized low density lipoprotein exposed to oxidative stress in vitro. J Clin Invest, 1994, 93:998-1004.

141. Zhang WY, Gaynor PM, Kruth HS. Aggregated low density lipoprotein induces and enters surface-connected compartments of human monocyte-macrophages. Uptake occurs independently of the, low density lipoprotein receptor. J Biol Chem 1997; 272:31700-31706.

142. Zhang WY, Ishii I, Kruth HS. Plasmin-mediated marcophage reversal of low density lipoprotein aggregation. J Biol Chem 2000; 275:33176-33183.