Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Управляемое культивирование генно-инженерного штамма E. coli (Lux), продуцента люциферазы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Управляемое культивирование генно-инженерного штамма E. coli (Lux), продуцента люциферазы"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи МЕЛЬНИЧЕНКО Елена Григорьевна

УПРАВЛЯЕМОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ШТАММА Е. COLI (LUX), ПРОДУЦЕНТА ЛЮЦИФЕРАЗЫ

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕ Ф-Е Р А Т диссертации на соисканне^учейои степени кандидата биологических наук

"1S

МОСКВА, 1993

Работа выполнена в Московском химико-технологическом институте имени Д. И. Менделеева, в Крымском медицинском институте.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Ю. С. Кривошеин; кандидат технических наук, доцент Н. С. Марквичев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. К. Плакунов;

кандидат физико-математических наук А. К. Соколов.

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М. В)1 Ломоносова, кафедра микробишогии.

Защита состоится 1993 г. в . . . час. на заседании Специализированного Совета Д 098.09,01. в Научно-исследовательском проектно-конструктор-сгом институте прикладной биохимии по адресу: 125299, г. Москва, улица Клардо Цеткин, 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского проектно-конструкюрского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан ь 1993 г.

Отзывы на автореферат, заверенные гербовой печатью, просим направлять па имя Ученого секретаря специализированного Совета.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

И. 1К ГУСЕВА

Актуальность работы

Одним из актуальных направлений развития промышленной био-юлогии является создание.генио-инженерных 'штаммов и техноло-на их основе.' Применение новых генно-инженерных штаммов ста-леред исследователями и технологами ряд вопросов, связанных зучением физиология поведения новых объектов, их стабиль-гьо, возможностью управлений процессами, протекающими в клет-продуцентов (Karube, Susuki, 1990);

Создание генно-инжнерных яташов, несущи гены Люминесцент-системы,позволяет реализовать промышленный способ получения иферазы - фермента/необХодимого для создания высокочустви-ышх индикаторных тест систем, которые находят применение в ицияе, биотехнологии, и яявлогии (Schnitlen,1991). При этом необходимыми этапами работы являются исследование етики роста и накопления'люциферазы, оптимизаций состава пи-ельной среды и условий культивирования, разработка способов ¡ьтивирозаяия. - ■

Сравнительное изучение генно-инженерного штамма £.coli (lux) щипиентным штаммом позволяв? анализировать влияние люминес-!Тной . системы ча общие метаболические процессы, протекающие в ?тках» так как полной ясности "В механизмах функдаг жирования яшесденхной системы в клетках микроорганизмов та сегодня не десгвует (Данилов, Егоров, 1990).

Це.?&ю шстоядей работы являлась оптимизация стадии культи-ровакия генно-инавнерного штамма EL coli (lux), npoflyueHfa лю-Зеразы.

В задачи работы входило: .... 1 Исследование кинетики роста и продукции люциферазы у-ген-- инженерного штамма Е. coli ( lux) в периодических инепрерыв-х условиях. -•"'■..""'.•

2. Исследование, влияние- лимитирующей концентрации субстрата растворенного кислорода на рост и продукцию Е.coli (lux). 3 Подбор и оптимизация состава питательной среды. 4.:Вы0ор оптимального способа культивирования. Научная новизна :

Впервые изучена , кинетика роста . генно-инженерного игамма coli (lux), в сравнении с реципиентяьш штаммом Е.coli C6Q0. Усыновлено, что максимальное накопление люциферазы наблюдается в энце экспоненциальной фазы роста, при переходе культуры в ли-гйную. стадию роста. ' . -

7 4 - '

Показано, что наибольшая индукция лщиферааы наблюдаете тех случаях, когда клетки растут на.средах, содержащих в качес углеродного субстрата казаминовые кислоты и дрожжевой'aKCipat соотнодкнии 1:1.

■ Показано, что при лимитировании' роста пониженными конце рациями кислорода, - . или субстрата (хемостатное культивирова! индукция люциферазы минимальна. Присутствие в питательной cj глюкозы в" концентрациях выше . критической, полностью олоюц синтез люциферазы • .

Показано, что клетки Б.coli (lux), осуществляют синтез низкомолекулярного секретируемого ингибитора люциферавной активности. , .

Предложен -механизм регуляции лвдифэразного..комплекса.и взаимосвязь с общим метаболизмом в. клетках ггннс-инженер* штамма Е. col i (lux).

Пракзмческая значимость работы:

Изучены закономерности , роста-.генно-инженерного . шгг Е.coli (lux) в непрерывных и периодических режимах кулыивирс юга, на разных питательных средах. Показана целесообразность пользования генно-инженерного .штамма Е.coli (lux)' для биосинт люциферазы в сравнении с. природными штаммами,1 обладающими, низ скоростью роста, меньшим.выходом клеток,.для культивирования торых необходимы сложные питательные среды.

Обоснован и проверен оптимальный состав питательной ср для максимального накопления люциферазы, ,

Разработаны условия культивирования и подобран- способ ку тивирования - мембранный б юре актор в отъешю-долиеном режиме позволяющие циклично получать клетки ё. coli' (lux) с высоким держанием люциферазы. Ш-данной схеме наработана и реадизов опытная партия люциферазы-на базе м.п. "ЛЖЕЙ" (акт внедрения) Результаты экспериментов были использованы для постано биотехнологических экспериментов в условиях микрогравитации борту орбитальной станции "Шр" (акт внедрения). ,-

Апробация работы: материалы работы доложены, и обсуждены Совместном заседании кафедры, 'микробиологии, вирусологи иммунологии и проблемной лаборатории КЖ (Симферополь, 1992)

Всесоюзном совещании "Итоги работы по космической биотехнологии на орбитальном комплексе "top" в XII пятилетке и перспекг-ьы их развития до 20QO г. "(Симферополь, 1990) ,

. Еуйзгкщда: по материалам диссертации опубликовано 5 pagjy получено по^э^кгельное решение на авторское свидетельств^

Объел! и структура работа: диссертация состоит из введе-[ия,обзора литературы, описания объектов и методов исследования, сложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выво-[ов. Работа изложена на/д<£ страницах машинописного текста и шлюстрирована,_таолицпмк и

_рисунками. Библиография вклачает ^З названия работ, из

:их dS на иностранных языках.

' ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОШЭТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. В работе использовали ген-¡о-инжене'рный штамм Е.coli (lux), полученный из ИБСО РАН, Красноярск и реципиентный- штамм Е. coli С600.

Для роста микроорганизмов использовали питательную среду ледующего состава (г/л): пептон "bacto" - 10; дрожжевой экст-|акт "bacto" 5; NaCl - 10, Оптимизацию процесса культивировали проводили с Использованием сред,состав которых представлен .в абл.1. Все среды^используемые для культивирования генно-инже-;ерного штамма, содержали 1QQ кйг/мл ампицшшна. Концентрацию люкозы изменяли в зависимости от цели эксперимента от 0,001 ;о 20,0 г/л.

Периодическое культивирование проводили в колба» Эрленмейе-а на качалке при 250 об/мин, 28 С, начальной pH 6,5 • 7,2.

Непрерывное хемостатное культивирование проводили в лабора-орнсм ферментере, объемом 100 мл, pH 7,0. Температура среды 28 !, перемешивание 1000 об/мин, аэрация 1 л/мин воздуха поддержи-алась на постоянной 'уровне.

Культивирование, в мембранном биореакторе (МБР), обьемом 00 мл, с выноснш модулем , содержащем полые ультрофильтрациок-ые волокна проницаемостью. 15 кДт проводилось при -втоматическом контроле и поддержании на заданном уровне Т 23 С, 'pH 7,0, интенсивности перемешивания 1000 об/мин, зрации 0,001 - 1,0 л/час всздуха.

Культивирование в МБР отьемно-додивным.способом проводили в ёх.же условиях. Б заданные моменты времени сливали часть куль-уральной среды с клетками из реактора и добавляли свежЕй пита-ельной среды до первоначального уровня.

Скорость лоогока в хемостатном и мембранном культивировании арькрсвали от 0,2 до 0,4 ч-1..

' Концентрацию--клеток микроорганизмов определяли нефелсметрк-еским способом с последующем.пересчетом на абсолютно сухой вес.

Измерение активности фермента люциферазы осуществляли ка непосредственно на живых клетках, так и в выделенной'системе i vitro на лшинометр^ БХЛ - 06. Зля определения количества sacras ной дюциферазы. в. клетках биомассу центрифугировали (6 тис об/мин, ЙОмиН;-^ , отмывали фосфатным буфером рН 7, повторно- осади ли, подвергали ультразвуковой дезинтеграции (ЗОсек, Зраза). Кл« точные обломки осаждали на удьтщдентрифуге (5000g- ,20 мин. ). суперяагадте определяли количество активного белка, смешивая ej аликЕоту, содержащую 0,01' мл люциферазы, 0,05 ил'9,5 мкМ воцноз раствора тетродеканадя, 0,44 фосфатного' буфера. рН 7. '.Рэакщ инициировалась добавлением 0,5 мл 0,072. мМ раствора фотовосст; новленного ФМЩ в 10 мд ЭЛТ.А. КэдичестЕоЪктивного белка относи, к общему содержаний белка ^клетке, определяемому по. ; Бредфорду ( ¥BredfordД976) ; * ,

Измерение скорости .потребления кислорода проводили при мощи гальванического датчика растворенного кислорода.

Количество глюкозы определяли по'известной методике с фей дом (Герха?ДТ,1984). ' "

Эдаминирсщадие ядазмиду оценивал» путем высева клеток богатую агаризоваяную среду и подсчета клонов, 'сохранивших сп ссбность к люминесценции к устойчивость к акщдмшу - по от:-: сению.к абдаму числу колоний.". знросших на среде без антибиотик

' КИЙЗША РОСТА И (Ш01^3Шт-ПШ-ШЕШ>ШЯЬ ЩАЖ

E.CGU. ГОЖ). ■ " ■ . ' В периодически процессе культивирования, на сложйых пол синтетических средах geaa роста ошкьщадиеь классической криео (лаг-фаза, эадсскенщадакаа.й ешшотарязя фазы рост?,), S .экеп яещдеа®яой фазе развития удедьаз?« скорость роста Е,coll flu равнялась, '0,3? - 0,45 ч-i. После 4,5 - е.О.ч. от начала культ зирования наступала фаза замедленного роста, обусловленная ифовазием компонентами питания.

Яереход клеток из .• зксяокещжалбной s Oasy замедленного' рс та характеризовался ' максимальным накоплением фермента адкйврг (рис. 1). При лимитированном.росте .величина удельной щтенсишс ти свечениа ( lys) резко возрастала и достигала' своего' максимум При переходе культуры в.стационарную щазу роста Худ снова снил лась. гс-яс'авяссть 'люминесценции бактерий паралелг

увелиveHiir- л.лгачества .'лециееразн в катках, измеренной"m nt'r Во гремя м^:. ^-гльногб свечения наблщадось и макси;,йивд<э<? ç

ньк .концентрациях субстрата:- 1,4- ЭО г/л; 2,5- Юг/л; 3,5- 5r/jL

• и - •

держание лацшйеразы, затем синтез ее прекращается, однако количество активного фермента з течение 4-5 ч. Оставалась на постоянном уровне (рис.1.).

Культивирование генно-инженерного штамма Е. coli (lax) на средах, содержащих различные начальные■концентрации субстрата, показало, что в этом случае ¿ормы кривых роста и' интенсивности свечения ке изменялись (рис..2). При этом ,характерным является то, что пропорционально увеличению концентрации компонентов "литания возрастала максимальная конценграпия. • клеток и удельная скорость роста. Оптимум янгенсивяосгя сведения во всех случаях однозначно был связан с переходом культуры в сазу лимитированного роста. Количество активной лвдмеразы в клетках зависело от начальной концентрации субстрата и линейно возрастало с ее. увеличением. Следовательно, динамика накопления лщиферавы, так«?, как и рост зависит от.условий культивирования и, .в яерв'ую оче,-редь, от компонентов питания.

ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГШО-.ИНШШШ)ГО Я РЕЦИПИЕНТНОГО ШГАШЭЕ НА СРЕДЕ РАЗНОГО СОСТАВА.

Сложные среды,на которых проводились первоначальные эксперименты по культивированию Е.coli (lux.jj, характеризовались разн степенью гидролиза белков к содержим разное количество пептидов и свободных аминокислот:

Для оптимизации, проаесса культивирования и сравнения эффективности роста клеток Е. coli (lux) с реципиентным штаммом, СбСО, не ' содержащим шхазмиду lux, мы исследовали возшвдэетг культивирования на стандартных средах, отличающихся друг от друга как количеством, так и соотнесением пептидов и аминокислот.

Это дало возможность.проанализировать условия роста и биосинтеза клэтск, а также подобрать оптимальную среду для максимального получения фермента лшшферазы.

Состав сред и результаты 'экспериментов представлены j табл.1. Культивирование Е. coli (lux) на средах, где е качесть« основного источника углерода использовались казаминоЕые кисло1! при их различных концентрациях, показало, что.клетки растут с низкой удельной скоростью, что приводит к низкому выходу биомассы, однако удельная активность "лсцифераэы имеет высокие, значен® и максиму« ее накопления б клетках" совладал с переходом культуры в Фазу sue."ленного росте (рис,За).

Рис.3.' Кривые роста (1,2) и.удельной интенсивности свечения 3) Б.-coli (lux) - 1 и Е. cell С600 - 2 на средах, ■ гздержавдх:

) 1С г/л-' кзэаминовых кислот; б) 10 г/л- пептона; з) 5 г/л ка-

Рис. 4. ' Кривые роста (1) и удельной интенсивности свечения 2) Е. coli (lux) на сложной среде яри наложении лимита по кисло-олу з середине экспоненциальной фазы развития.

культивирование Е. coli. - (lux) на среда;-:, содержащих разны концентрации пептона "bacto" в качестве 'единственного источник углерадсодержадего субстрата приводило к снижению скорости реет выхода биомассы и накопления фермента, относительно,роста на ка 'заминовых кислотах (рис.26 ).

Культивирование ELcoli (lux)"на.средак, где основной угле родсодержашйй субстрат дрожжевой экстракт показало; что скоро« роста и. конечная концентрация клеток находятся в пределах значе ний-, характерных для роста на казаминовых кислотах и,'пептоне,, i этом уровень накопления лвдиферазы был значительно ниже, чем двух яредШущих случаях. Удельная активность.фермента имела ш нимальные.значения, но возрастала по мере увеличения концентре «ии субстрата (табл. 1). . ' .

Применение смеси казаминовых шелду, 'дрожжевого-экстракта пептона, в разных соотношениях,- приводило к региону увеличе: выхода биокассы и одновременному снижению накопления, фермен: (табл.1). Анализ конечной концеятрации\кл?тск,. выростах на- cut данных субстратах, - по сравнения с. количеством, вырссшш на - <ш тых субстрата:4 показал, что ■ субстраты-5ратятся с большим "'вьеф, активных клеток,в том случае, если они находятся в смеси.одно: ременно. При-этом обиее количество актизного фермента в клетк; снижается. Это свидетельствует р tom¿ что дрожжевой екстрага кагаминовые кислоты или пептон ЕЗаямодополняюгг друг'.друга- .Общ количество клеток выросших на их оиеси^угеличиваетса, и . одно ременнс. снижается количество энергии, выделяемое клетками'В ви квантов света. ' ■ ' . . •

■ Оптимальная среда, на которой увеличение удельной скорос роста ■ и конечной концентрации клеток сочеталось' с высоким уро нем накопления фермента' (-рис. Зз),- имела соотношение кагаминов кислот и дрожжевого экстракта 1:1. •

.'-Кинетика' роста реципиентнего штамма на-всех, иеследуек средах не отличалась от генно-инженерного, однако ■ выход-.юш был всегда выше у рецшшентного нгаммаДтабл. 1).- Аналив выхе биомассы при культивировании E- ccii ( lux) и col i CSOD в од® ковых условиях .показал, что разница в приросте биомассы мел реципкектным и. генно-инженерным штаммом .линейно снижается с уг личением обоего количества . актизного. фермента. Такйм обраг модно предлсложить, что у генно-инженерного. ЕТймма з определе ней фазе ;оста часть энергии расходуется не■на образование Si масса. Так кы „работа люминесцентной' системы связана с- расходе

Таблица 1.

Изменение кинетических характеристик генно-инженерного и реципиентного штаммов при росте на различных субстратах.

Тип Степень Конц. i. L' coli (lux) i Е. col i 0600 !

¡ Конц. (I) Интеграл. Р 1 Конц. f !

бтра-гидр. суб- i клеток шах вел свеч. '|клеток

а белк. страта| мв. от ¡

7, г/л |. i г/л 'MB. ед. /мг б. ч-1| 1 Г/Л ч-1 |

sam. '50 т 5 0,S 4900 20262,5 0,08 1.0 0,22 |

id 10 1,0 4000 22137,5 0,2 1,3 0,26 !

. 15 0,9 5700' 20700,0 0,1 1,4 0,26 |

стракт 15 5 ' 0,7 480 1562,5 0,06 1.2 0,16 |

ож. • 10 . 0,9 1100 3350.0 0,16 1.8 0,2 |

15 1,3 980 2137,0 0,23 2,2 С, 28 |

птон 25 - 5 0,4 2900 14262,5 0,06 0,8 0,12|

acto" - 10 0,8 .2750 16662,5 ' 0,1 1,8 0,22|

15 - 1,1 3450 12987,5 0,17 2,4 0,28|

есь: 5 . - 1,42 450 2500 0,2 . 1.8 0,2 ¡

стракт 10 1.8 750 3300 0,-36 2,8 0,4|

ож. -5 ;г/л .15 ■ 2,2 1700 4875 0,35 3,0 0.5|

птон "Ь" . - '

есь: Casam. 5 2¿2 5950 25439,0 .0,27 2,4 0,29|

id-бг/л 10 2,35 2050 3562,0 0.32 3.4 0,36|

стр. дрож. . .15 3,0 450 ' 8325,0 0,49 4,4 0,49¡

есь: Экстр. 5 2,1 5750 27800,0 0,27 3,0 0,36¡

ох -5г/л 10 3,4 ' 275D .7437,5 0,4 4,4 0,49|

sam. asid 15 , 4,0 ■зооо . 6137,5- 0,49 0,5 0,4° ]

Во зсе среды к основному субстрату добавляли 10 г/л NaCl.

нием энергии (Vlttzur,Hastir^s,1978), то ее' функционирование клетках EL coli (lux) приводи! к перераспределению части энерг с процессов роста на процессы люминесценции, что. свидетельству о влиянии люминесцентной системы на обиий клеточный метаболизь

ВЛШЕИЕ "ГЛЕОЗЫ НА РОСТ И НАКОПЛЕНИЕ ЛЮЩЕРАЗЫ У КЛЕТОК

EL coli (lux). .

Известно, что рост к свечение фотобактерий зависит от * точников углерода и энергии (Makiguchi е. а., 1980). Поэтому i дальнейшей оптимизации состава питательной среды мы иеяользовё глюкозу. В табл. 2. представлены результаты культивировал Е.coli (lux) на сложных средах, содержащих начальные концентр ция субстрата от 5 до 15 г/л.и различные начальные кондентраи глюкозы.

Было установлено, что внесение глюкозы в концентрациях 0,01 до 20 1/л приводит к увеличению выхода биомасса Накоплен люциферазы зависит от концентрации глюкозы в..среде культивиров ния.

Низкие концентрации глюкозы , в среде- культивировани не оказывали существенного влияния на накопление, фермента. П таких условиях культивирования происходит одновременная ассим ляция глюкозы и других компонентов из питательной среды. Глюко ассимилировалась клетками до того, моментаусогда они переходили фазу замедленного роста и индукция фермента уже . произои (табл.2), <

фд высоких начальных концентрациях глюкозы .она слабо асс. милируется клетками и постоянно присутствует в среде культивир^ зания. ■Зто прйзодит к тому, что накопление фермента находится . минимальном уровне или вообще не происходит.-Было установле: что для данных условий культивирования существует пороговая ко: центрация глюкозы, при которой она начинает подавлять сЕечени' Увеличение концентрации сложных компонентов питания приводит пропорциональному изменению- пороговой-кшпентраиии глюкозы. Сл< дователно, уровень начальной коншнтрашгк глюкозы, при котор происходит увеличение выхода биомассы с. зысскшд содержанием ш тиеного сбермента^ определяется соотношением количества глюкозы других компонентов питания.

Таблица 2.

Рост и люминесценция Е.coli ».lux) на сложных средах, содержит« начальную концентрацию субстрата от 5 до 15 г/л и различные начальные 'концентрации глюкозы.

донц. глюкозы

Конц. . шомасса 1уд

Редуцирующие в-ва.

г/л г/л г/л мв. отн. ед. 0 3 3

5 контр. 0,3 300 0 0' 0

20 1,12 0 1 21,4 21,3 21,3

0,5 ' 0,98 0 . 0,5 0,4 0,4

0,05 0,4- 110 '

0,01 0,4 , ,500

10 • контр. 1,22". 2500 0 0 0

20 1,68 ' 0 ' 23,6 21,0 21,0

2,5 1,04 0 2,8 2,1 0,3

0,5 1,72 . 275 . 0,6 0,2 . 0,1

" ОД 1,44 1039 0,12 0 0 '

0,05 1,32 1964

0,01 1,24- 3602

'15 контр 2,48 6000 0 0 о- '

20 2,2 ' 0 23,5 19,0 17,5

5,0 2,8 £00 5,2 3,2 0,5

0,5- . 2,0 1500- . 0,6 0,1 . 0

0,05 2,55 4000 .

0,01 2,48 4500

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ РАСТВОРЕННОГО КИСЛОРОДА

• НА' НАКОШЕНИЕ ЛЩИФЕРАЗЫ КЛЕТКАМИ Е. COL К LUX).

Одним из факторов, определяющих условия.культивирования, яв-лявгся. масообменные характеристик процесса. .'Для факультативных анаэробов кислород является.'субстратом, определяют.« развитие метаболических процессов либо по анаэробному либо по аэробному путям (Шлегель,19В?).. Одновременно, с этим-кислород язля.ется необходимым субстратом люминесцентной системы (Hast mg-s, Nelson. 19-37).

Мы исоледоЕали развитие клеток Е. coli (lux) в ферментере с датчиком растворенного кислорода, изменяя в каждом эксперименте количество воздуха, идущего на аэрацию, при постоянной интен-.. , сивности перевешивания. Изменение концентрации растворенного кислорода в пределах значениями? лимитирующих рост ¡0,1 л/мин . приводило к тому, что общие закономерности роста: форма кркйой накопления биомассы, форма кривой свечения, количество аетмвяйго фермента люциферазы,-относительно общего белка клетки,находились в , одинаковых пределах. Если в экспоненциальной фазе роста количество подаваемого в среду культивирования растворенного кислорода (0,05 ц/дфилимитировало рост, то клетки переходили в линейную шазу развития. При этом количество активного; фермента резко снижалось и в отличие от нелимитированного роста, мы не наблюдали пика люминесценции (рис.4). При увеличении интенсивности аэрации дуле 0,5 дг/жм^ультура переходила в фазу экспоненциального, роста с .последующей фазой замедленного роста,, которой соответствовал пик люминесценции (рис. 4).. Уровень накопления 'фермента был в 5 раз ниже контроля. Следовательно,, для максимального накопления 'фермента люциферазы необходимо обеспечивать такие концентрации кисло so да,- которые не. лимитируют рост клеток.

Исследование процесса культивирования генкЬткнжеяернсго зтамма Е. coli (lux) в простых периодических условиях показало, что люминесцентная система функционирует толькфри переходе клеток из' экспоненциального роста в фазу, замедленного роста. Это говорит о том, что существует специальная регулятррная система, обеспечивающая такой характер изменения люминесценш!. -

Исходя из 'Проделанных- -экспериментов, можно предположить, что при экспоненциальном/росте Е coli (lux; на сложных средах, не содержащих глюкозу, в .клетках- устанавливается определенное, .соотношение энергетических эквивалентов, .физиологически необходимое для' нормального функционирования. процессов метаболизма. ■ Это соотношение ■ поддерживается за счет того, что часть ассимилированного. субстрата тратится- на анаболические, процессы,: а часть на' кагабодические. При изменении внешних'условий роста, обусловленных снижением концентрации субстрата,в среде культивирования

происходит ('разбаланс)" катаболических и анаболических путей метаболизма, что.в свою очередь приводит к изменению соотношения энергетических эквивалентов. Уровень изменения соотношения энергетических эквивалентов в клетках Е. col i (lux) может оказывать регуляторное воздействие на функционирование люминесцентной системы. J

Наши дальнейшие работы были , направлены на интенсификацию Процесса .биосинтеза как, на стадии накопления концентрации клеток с. высоким содержанием люциферазы, так и на дальнейшее исследование процесса свечения. ...

ШШедГИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ С ПОДПИТКАМИ. : •Увеличение начальной концентрации субстрата при простом периодическом культивировании не приводило к лрямопропорциональному увеличению выхода, биомассы.. Это может быть обусловлено тем, ' что при высоких, концентрациях субстратами пассивном механизме его транспорта возможен процесс: не эффективного использования субстрата или в ходе культивирования могут, накапливаться дагибирутощие Продукты биосинтеза. . Для проверки этих предположений мы применили периодическое культивирование с подпитками. Введение подпитки в разных фазах развития популяции может -оказать влияние как на рост культуры, так и на эффективность использования субстрата.

' Проведение концентрированной подпитки в экспоненциальной фазе развития приводило к увеличению; конечной концентрации кле- . ток, аналогично увеличению, Начальной концентрации субстрата и смещало во времени, переход в;фазу замедленного'роста с одновре-. менным накоплением фермента (рис.5). Несение подпитки в фазе замедленного, роста и в ранней стационарной фазе развития, - после максимального- накопления- фермента- не приводило к повторению ' стадии накопления^ фермента. ' Внесение ■' подпитки' после - длитель-него культивирования в стационарной фазе развития приводило к повторению классической-S-кривой -накопления биомассы (рйс.6). Переход к лимитированному росту сопровождался накоплением люциферазы, однако удельная активность фермента была ниже,- чем-на пер* вой стадии культивирования. .-

■ Полученные результаты показывают, что интенсифицировать процесс" культивирования методом зкесения подпиток не целесообразно. • Однако данные результаты позволяют говорить ' о' том, что после работы . люциферазного комплекса'происходит ;ингибирование или инактивация люциферазной системы.-

сивности свечения (4,5,6) при:дробном добавлении' концентрирован

Зремя, ч

Рис.6 криййе а) роста и удельной интенсивности саеч<гни ("2) при непрерывном к/льТиви^овании в хеиос?ате (0-0.14-1

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Е. COLI (LUX) В ХЕМ0С7ATE.

При культивировании в условиях- хемостата (скорость протока 3,2 ч-1) клетки Е. coli (lux) достигали стационарного состояния за 20-25 ч. культивирования. Рост клеток при лимитировании по субстрату в условиях хемостата не сопровождался накоплением фермента. Элиминирование плазмиды на 96 ч. культивирования составляло. 50%. Отсутствие накопления фермента можно объяснить тем, что лилейный- рост клеток происходит с постоянной заданной скоростью и метаболические процессы относительно сбалансированы, поэтому игетки нуждаются, в механизме регулирования при помощи люминесцентной систстемьг и .не накапливают ее в процессе развития.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Е.COLI. (LUX) В МЕМБРАННОМ ЕИОРЕАКТОРЕ (МБР).

МБР был использован как для интенсификации роста клеток я Зиосинтеза люциферази, так и для удаления продуктов метаболизма в процессе культивирования.

Особенность культивирования в МЕР с выносным ультрафиль- . грациозным модулем, заключается в том, что яря непрерывной подаче дащанент<эй питания происходит полное задерживание клеток в объём© Фишера.» а из среды культивирования Мводигся бесклеточ-йая куж&зя?альдгаа жгягегь, содерэшая метаболиты СМаркви-

Щй ^ттшфОмама-Е. coli (lux) в МЕР со скоростью протока эт ОД. и-1 др. 0,4 кул&ада сфшсодила ряд. фаз развития: лаг &азу, , экспоненциальную и сташшвэрв^рл фазу (рас.?). Возрастание ■концентрации клеток при постоянной скорости разбавлеи® происходило до того момента, пока концентрация субстрата в ереде культивирования стала ниже.предельного уровня,- скорость роста культуры квелей питательной- средой. -Лимитирование скорости, роста гак и в предыдущих случаях определялось , углеродсодержащим субстратом, г. к. в момент лимита возрастала концентрация, растворенного в. :редё кислорода , кроме, того увеличение скорости протока, приводящее к увеличению концентрации субстрата,приводило к переходу культуры в экспоненциальный рост. Стационарная фаза роста Е.coli

" -'5 ." 10 15. 20 25 ; .30 -35. '40 45' ЕС '55 Р0 ,-

• Время, ч

Рис.7. ."Кривые- роста (1).и удельной интенсивности свечения (2) при непрерывном культивировании з МБР.' Стрелкой" показаны моменты отбора-ВНЕ.. ■' ; .'./'■..

15 20 '25 ' .?" 'Зс,-Время'отбора' 5KF . .

■Рис. 8." .-Влияние Оесклетачной кулыуральнсй -жидкости. '"полу чинной 'на разных стадиях роста культуры.зйК^на росг и удельную. интенсивность свечения клеток Е. coli (1йЮ. На рнс.7..,стре-л ками показаны моменты Отбора ВКЖ.

(lux) в МБР отличалась от стационара при периодическом и хемос-татном культивировании тем, что, несмотря на постоянный подвод компонентов питания^культура переставала растли ассимилируемый субстрат тратился клетками на поддердание.

Концентрация клеток в МБР достигала значений 10 г/л, что в 7 раз больше, чем. в периодических условиях. Максимум накопления фермента приходился на фазу замедленного роста. Удельная активность фермента, отнесенная к общему количеству белка^была соизмерима со значениями, полученными при периодическом культивировании. Следовательно^ за счет увеличения концентрации клеток в МБР общее.количество активного белка выше, чем в периодических условиях культивирования.

Недостатком этого.метода является.высокий процент элиминирования плазмиды, который к 60 ч: культивирования составил 75%.

. ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ.KV КИНЕТИКУ" РОСТА. И АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА

Е.COLI .(LUX).

Исследование кинетики роста в режиме с подпитками позволило предположить накопление в среде, культивирования веществ, оказы-вакэдх ингибирутацее действие на накопление и активность люцифера-зы При проведении процессов культивирования в МБР было проверено влияние бес клеточной кудьтуралънсй жидкости (БЩ, полученной ка 'разных стадиях роста El coli (lux),'на кинетические параметры культуры .в простых периодических условиях. Для этого BKS смешивали с концентрированными. питательными средами я засевали икоку-лятом. Было показано* что существует зависимость продукции люци-1>:-разы от тдго,уе» какой стадии развития хлетск взята' ют, ж-догьэрваннал для' приготозайняя питательной среды. П^исутстгие з питательной среде БК», веятей до момента накопления лжщк^еразнсгс комплекса, не .оказьзало зияют ни на кинетику роста, ни на активность дюцкферазы (рис.3).' Использование питательной среды, содеряйд&й БЕЯ' отобранную после накопления и работы люциферазнего комплекса приводило *к енжжншо активности фермента относительно контроля (рис. 8а,б). Учитывая та,что для получения ЕК2 .использовали ультрайиьтрйЦЕ&яныз мембраны на 15 кДт, то можно .предположить,' что клетки Е. coli (lux) вырабатывают низкоыолеку-лярный. секретируемЫй ингибитор,' блокирующий работу лвциферазясго комплекса

. Роль ингибитора физиологически целесообразна и объяснима.

После функционирования лкшфе разного комплекса, необхо-

Бреыя, ч

. Рис. 9. ; Кривые роста (1) и удельной интенсивности свечения (2) при культивировании Е. coli (lux) в МБР отьемно^доливным способом. Стрелкой указаны моменты слива части.культуральной среды из. ферментера.

димого только при переходе культуры на более трудноусвояемьй субстрат, в клетках еше содержится определенное количество ранее синтезированного фермента люцифераза и растущим клеткам необходим ;механизм зашиты от работы уже образовавшегося, люциферазного комплекса, .препятствующий," сбрасыванию вновь образующейся энергии, в виде квантов света. Такой механизм зашиты может быть обусловлен действием протеолитических ферментов или накоплением ингибиторов. В пользу ингибитора говорит тот факт, что количество. активного белка, измеренное in- vitro,остается на постоянном уровне в течение 4-5 ч. после спада люминесценции растущих клеток (рис. 1).г

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Е. COLI. (LUX) S МБР " ОТЬЕМНО-ДОЛИВШИ СПОСОБОМ.

Длительное ведение процесса культивирования в МЕР приводит к снижению уровня накопления фермента до минимальных значений и вызывает . высокий процент элиминирования плазмиды. Для оптимига-■ ции- накопления фермента мы применили культивирование в МБР с использованием отьемно - долизяого способа ведения процесса. .Это, - привело к появлению нескольких стадий роста культуры, обусловленных сливом части культуральной среды и добавлением новой.' Каждая стадия проходит ряд фаз развития, характерных для культивирования в МЕР. Накопление люциферазы наблюдалось на-каждой стадии культивирования. Максимальное количество, фермента на всех стадиях культивирования приходилось на момент перехода в фазу лимитированного роста. ( рис. 9)..

Б. целом, . выращивание генно -.инженерного" штамма Е. coli í. lus) в. МБР отьемно-доливным способом с целью получения максимального количества фермента люциферазы имеет ряд преимуществ по сравнению с другими способам!! к^тивирования: увеличение общего количества фермента sa счет повышения, концентрации клеток; полу-, чение' : цикличного накопления клеток-с высоким содержанием активного фермента;- возможность вывода ингибиторов из зоны -культивирования. '" _ '

Выводы ... . . '

1 Изучена кинетика роста и продукция люциферазы у генно-инженерного. .штамма Е. coli ( lux), показано/что лшифераза. является индуцибельным ферментом, максимальная активность люциферазы со-■ ответствует юнцу экспоненциальной фазы.,

2 - Изучено влияние состава питательней среды на продукцию люциферазы, ' показано , что уровень накопления' фермента зависит от степени гидролиза белков в сложных питательных, средах, установлено, что для максимального накопления фермента штаммом Е. coli (lux) необходима питательная среда.содержащая.казаминовые кислоты и дро зыке вой экстракт в соотношении 1:1 . .--'.'

3 Изучено влияние лимитирующих факторов на рост и продукцию люциферазы у клеток Е.coli (lux), показано, Что при , лимитировании' роста как углерЬдоодержадами.ксмяонентами■питательной среды (хемостатное культивирование), так и понижениям концентрациями растворенного кислорода (при периодическом культивировании) не происходит накопления лкцифераэы.

4 Изучена кинетика роста и накопления люциферазы клетками Е. coli (1их) ла сложных средах с глюкозой, показано, что. глюкоза выше пороговой концентрации .полностью лодавляет индукцию люци^ фераза

■5 Показано, что клетки £. col i (lux) вырабатывают ..низкомолекулярные секретируемые -продукты, оказывающие ингибирующее действие на активность люциферазы

6 Нахюнавании изучения кинетики роста Е. coli (lux) и.продукции люциферазы предложен способ ¡^льтивирования в мембранном биореакторе в отъемно-доливном режиме^ позволявг^получ&ть максимальный выход люциферазы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ферментеры — аппараты для культивирования микроорганизмов. //Обзор. — ВИНИТИ. — 277 — В88. — 1988. — с. 70. (совместно с Кривошеиным Ю. С., Харченко Г. И.).

2. Действие гетероциклических производных поликарбоновых кислот на рост и люминесценцию светящихся бактерий. // Тез. Всесоюзной конф. «Лимитирование и ингибирование роста .микроорганизмов» — Пущине. — 1989. — с. 11. (совместно с Бержан-ской Л.. Ю., Постниковой О. Н., Кабачным В. И.).

3. Иммобилизованное культивирование клеток Е. coli (lux) в условиях мпкрогравитащш. // 4-я Моск. конф. молодых ученых и студентов по химии и химической технологии. Москва — МХТИ.—

1990. — с. (совместно с Хлебниковым А. В., Марк^вичевым Н. С., Малаховым М. Н.).

4. Изучение кинетики роста и светопродукции генно-инженерного штамма Е. coli (lux). // Биотехнология. —< 1991. № 6. с. 12— 15. (совместно с Марквичевым Н. С., Бержапской Л. 10., Криво-шейным Ю. С., Манаковым М. Н.).

5. Кинетика накопления интерферона и люциферазы в генно-инженерных штаммах Е. coli // 12 Укр. Респ. Съезд микробной., эггидемлол., паразитологов. 25—27 сент. Харьков. — Киев. —

1991. — I ч. — с. 141-, (совметно с Марквичевым Н. С., Постниковой О. Н., Тышкевич Л. В.).

6. Установка для культивирования животных, растительных и микробных клеток в космосе. // А. с. — 493М41. — от 25.04. — •1991, (совместно с Арсентьевым А. В., Зеленщнковым Д. Б., Мн-тнчкиным О. В., Простовой Г. А., Манаковым М. Н., Марквичевым Н. С., Коросгвлевым В- В-. Занко М. Л., Кривошеп-ным Ю. С.).