Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Улучшение нематодоустойчивых гибридов картофеля по признаку продуктивности методами клеточной селекции

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Улучшение нематодоустойчивых гибридов картофеля по признаку продуктивности методами клеточной селекции"

п г г* л 1

И 0 и.Ч

РОСОШСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ • - НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КАРТОФЕЛЬНОГО ХОЗЯЙСТВА

На правах рукописи

КИРСАНОВА Светлана Николаевна

УЛУЧШЕНИЕ НЕМАТСДОУСТОИЧИВШС ГИБРИДОВ КАРТОФЕЛЯ ПО ПРИЗНАКУ ПРОДУКТИВНОСТИ МЕТОДАМИ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

Специальность: 06.01.06. - селекция и семеноводство

автореферат -диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскоховяйстввнпнх наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в отделе клеточной инженерии Научно-исследовательского института картофельного хозяйства Роосельхозакадемии в 1989-1993г.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник Л.М.Хромова.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных, наук,

профессор А.Н.Березкин,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.М.Яшина.

Ведущая организация: ВНИИ сельскохозяйственной

биотехнологии Россельхозакадемии.

Зшдата состоится 1994г. в 13.00 чао.

на заседании специализированного совета К.122.7.9.01. в .

Научно-исследовательском :шституте картофельного хозяйства.

* *

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИКХ. Автореферат разослан « 199Угода;

Учений секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В связи о широким распространением картофельной нематоды Globodera roatochienaia в производственном и частном секторах и высокой вредоносностью этого карантинного патогена высока необходимость создания нематодоустойчивых сортов картофеля.

Методами традиционной гибрвдизационной селекциии в НПО по картофелеводству созданы нематодоустойчивые гибриды картофеля. Однако урожайность этих гибидов невысока, поэтому существует необходимость улучшить данные гибрида по признаку урожайности, сохранив при этом основной генотип и нематодоустойчивость. В природа, на уровне целого организма процессы спонтанной изменчивости проходят с частотой примерно Ю-6. При переводе генотипа на недефференциро-ванный уровень организации (каллусшй, клеточный, протопластный) каждая клетка в течение одного клеточного цикла деления ("2-4 дня) монет явиться индивидуумом и мишенью для самостоятельной изменчивости, происходящей под действием условий культивирования, стрессовых воздействий, мутагенов и других факторов« что позволяет расширить спектр изменчивостей, увеличить частоту и накопить их в малом пространстве (колба,чашка Петри) за короткий промежуток времени.

Изучение корреляции мазду различными способами воздействия на растительную клетку и получением сомахлонов с нужным хозяйственно-ценным признаком делает селекцию In vitro более направленной, в применение системы In vitro тестирования полученных рвгенерантов значительно ускоряет процесс отбора.

Тагам образом клеточный уровень по сравнению с организмейннм гарантирует громадный объем выборки, хаотичность и случайность событий изменчивости являются основой геторогенпоотя клеточных попу-. ляций, неполнота изменчивости является базой для поиска сомаююнов о отдельными измененными признаками при сохранении основного генотипа, а свойство тотипотентиоети растительных клеток обеспечивает " реализации изменчивостей в новых раотениях-регёйерантах.

Цель й задачи исследования.

Целью настоящей работы является расширение сомаклональной вариабельности для улучшения нематодоустойчивых оелекцяонйнх гибридов картофеля по признаку урояаййооти.

Для достижения данной цели были поставлены следующий задачи:

1. Изучить влияние удьтраф.'о^отог-эго сблучения, повтавнной концентрации 2,4-Дйхлорфеноксиуксусной кислоты в питательной среде, сублвтальной температуры и различной длительности культивирова:шя суспензии на увеличение сомаклональной вариабельности.

2. Получить сомаклоны нематодоустойчивых гибридов картофеля.

3. Провести сквозную оценку сомаклонов по системе тестов II vii;го и 1п пто с целью отбора перспективных вариантов.

4. Оценить сомаклоны в полевых условиях по признакам урожайности, фитофтороустойчивооти и немэтодоустойчивости.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Получена популяция сомаклонов нематодоустойчивых гибридов картофеля, превышающих исходные генотипы по признаку урожайности, сохранившие устойчивость к нематоде и фитофторозу на уровне исходного генотипа.

Выявлено влияние абиогпеских стрессовых факторов - ультрафиолета (1,32 Вт.сек/см2), ¿,40 в концентрации Бмг/л питательной среды, повышенной температуры (+35°0) и длительного беспересадочного культивирования клеточной суспензии (9-13 недель) на вариабельность в каллусной популяции и изменение качественных характеристик каллусов нематодоустойчивых гибридов и сортов картофеля .

Показано, что длительное культивирование каллусов после стрессового воздействия не является ограничением для получеюн растений-регенерантов с положительными хозяйственно-ценными характеристиками.-

Подтверждена положительная корреляция между ¿1 ч1»го тестированием и полевыми оцонкьш: растений-регенерантов.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на Генетическо) съезда (Минет,I992), Втором Российском Симпозиуме "Новые метода биотехнологии растений" (Пущино,1993), Золотом Шыпйном Симпозиуме генетиков (Дели, 1991), Международной Конфере'щии по биотехнологии в сельском и лесном хозяйстве (Дели,1993).

Объем работы..

Дйссортацля*состоит из введения, обаора литературы, экспери-моктальюй часта, вклечечщ-.л егшеанго методов работы, анализ про-

во денных экспериментов я их обсуждение, выводов, рекомендаций для практической селекции, списка литературы и приложений.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содернит // таблиц, ¿U> рисунков и Y фотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исходный материал.

В качестве исходного материала были взяты 12 селекционных не-матодоустойчивых гибридов картофеля, любезно предоставленных отделом генетики и селекции ШЖХ и два промышленных не?латодоустой-чивых сорта: Пригожий-2 - отечественной селекции и голландский сорт Нардинал.

В таблице I приведены основные характеристики исходных генотипов.

Методы оздоровления растений картофеля от вирусов.

Оздоровление от вирусов исходных растений проводили методом апикальных меристем, при втом использовали три различных методики: 1)Стандвртнвя методика оздоровления с применением термотерапии (Л.Н.Трофимец с соавт., 1985); Z) Кодифицированная стандартная методика, в которой термотерапия при +36°0 заменяли проращиванием клубней при +20°С; 3) Методика криооздоровлеиия (Л.М.Хромова, A.B. Манйулян, 1966) - работв проводилась при участии автора методики А.В.Канаулинэ.

Размножение оздоровленных растений проводили методом черенкования In vitro.

Получение первичного каллуса, получение и культивирование гслоточней суспензии, шютированио суспензии проводили стандартным методом ( Р.Г.Бутенко с соапт.,1934)

Воздействие стрессовыми факторами на культуру клеток.

Стрессовые воздействия па культуру клеток осуществляли во время плотированпл. Было осуществлено 4 варианта стрессового воздействия : I) Суспензию высевали иа среду с повышенной концентра- , цией 2,40 - Бмг/л питательной среды; 2) Культуру клеток облучали ультрафиолетом в сублетальной дозе - 1,32 Вт.сек/см2; 3) Клеточную культуру культивировали при температуре +Я5°0; 4) Суспензию клэток культивировали без пересадки в течение 9, 10 й 13 недоль. В качестве условного контроля брали культуру клеток, плоТируемую и культивируемую без стрессов.

Характеристика селекционных гибридов, взятых

Рабочий Селекционный Происхождение

ко:лс;р ног.!зр - $ (Г

1 15зл 85.36/15 Татьянка х 593т-84

2 16вл 85.10/70 79.3/9 . х Гранола

3 26вл 85.43/7 596п-73 х Львовянка.

4 • Збня 85.43/36 596т-73 х Львовянка

5 44зл 85.15/30 79.10/60 х.Гранола 6. 91 нл 591т-56 426т-17 х Сотка

7 105вл 591т-62 426т-17 х Сотка

8 . 127зл б53т-28 504^-39 х 790-4.

9 186зл 593л1-36 535т-322 X Сотка

10 188зл 653^-47 : 504т-39 х 790-4 .

11 197вл 85.45/24 79.10/60 х Гранола

12 199вл оЭТги-За 426т-17* х Сотка

13 сорт Пригожш-2

14 сорт Кардинал

Таблица I

для улучшения по признаку продуктивности

Нематодо- Урожайность Устойчивость Крахма-устойчивооть за 3 года . к фитофторе . листость г/куст Сбалл) ■ %

устойчив . 650 7. 12,9

устойчив 650 7 16,7

уСТОЙЧйй 55С 7 . 13,1

устойчив 660 . 7 14,2

устойчив 500 3 13,4

устойчив 600 7 15,8

устойчив 600 7 13,0

устойчив 530 9 11,5

устойчив 500 7 14,7

устойчив • 630 7 15,6

устойчив 750 7 14,0

устойчив 660 7 . 14,0

устойчив . 900 3 12,0

устойчив " 900 3 14,0

о>

Оценка каллуслых популяций и получение регенерантов. Каллусы оценивали по окраске, размеру, и консистенции. Сравнивали соотношение колоний с различными признаками з зависимости от стрессового воздействия. Для характеристики морфогенетических потенций каллусов подсчитыкели процент морфогенных структур (наличие зеленых глобул, апексов, побегов).

Для получеши регенерантов каллусы переносили на среду для регенерации (Р.Г.Вутенко с соавт.,1984)

Оценка и браковка сомаглонов In vitro.

Регенеранты, не дающие корней на среде для укоренения, а такие хлоротичные и угнетенные считали незизнеспособными и браковали.

Для оценки сомвклональных вариантов перед высадкой в полевые условия были использованы тесты in vitro, разработанные в лаборатории клеточной инженерии НИИКХ (Н.О.Юрьева с соавторами,1992). Морфологический тест in vitro проводили совместно с автором метода к.б.н. Рассадиной Г.В.: сомаклоны размножали по 5 растений методом черенкования in vitro, в Еозрасте 35 дней растения оценивали по мощности развития, развитию листовой пластины и развитию корневой системы. Оценку проводили по 9-бальной шкале.

ФитофтороугтойчиЕость сомаклонов in vitro определял:! совместно с автором методики к.с.-х.н. Кукушкиной Л.Н.(Н.О.Юрьева с соавт., 1992). Оценку делали по 9- бальной шкале, адаптированной для пробирочных растений.

Получение клубневого материала и оценка сомакпональных вариантов in vivo. ' :

клубневой материал получали, высаживая пробирочные растения в теплице. Полевой питомник закладывали 20-клубневыш делянками в 4х кратной повторности. Делянки располагали рендомизированно в соответствии с методикой полевого опыта (Б.А.Дослехов, 1979). Полевые оценки проводили в баллах по стандартной методике (Шнайдер Ю.И., Яшина И.М.и др.,1980).

Устойчивость сомаклонов к нематоде определяли совместно с отделом защиты НПО по картофелеводству.

Статистическая обработка. Все данные проведенных исследований обработаны статистическими методами в изложении Доспехова (1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Схема проведения работ представлена на рисунке I.

I.Оздоровление и введение в асептическую культуру нематодо-устойчивых гибридов и сортов картофеля.

Процент оздоровления при различных модификациях оздоровления показан в таблице 2.

Таблица 2.

Эффективность оздоровления и динамика жизнеспособности меристем при различных модификациях оздоровления

Модификация Всего Количество живых (зеленых) %

оздоровления меристем оы.о?се>

тем на 3-й день на 8-й день на 40-й день ления

Термотерапия при +36СС 201 22 16 Ю 100

Криооздорозла-ние при -40'"0 114 40 16 I 100

Без стрессов при г+20гС 126 67 78 16 28

Бее мэристемные линии, полученные с применением термотерапии и криооздоровления, оказались свободными от вирусов. При вычленении без стрессов оздоровленными были лишь 262 маристемных линий.

к. Получение каллусных клонов.

Для инициирования каллусной и в дальнейшем суспензионной культуры были взяты оздоровленные гибрида: N3(85.43/7), N4(85.43/36] Н7(591ш-62), N8(65301-28), N11(85.15/24) И сорта Пригокий-2(N13) и Кардинал(N14). На их базе получали рыхлый каллус и суспензию, на которую воздействовав стрессовыми факторами.

При плотировании суспензии погибает значительное количество клеток (РЯО-40%); под действием стрессовых факторов гибель клеток увеличивалась. Итоговое количество полученных клеточных колоний представлено в таблице 3.

Уметшение количества полученных в результате стрессового воздействия колоний можно объяснить тем, что, по-видимому, в этих жестких условиях способны выжить лишь немногие клотошыа образования, наиболее устойчивые к неблагоприятным внешним факторам.

шлидши генотип

асептическое еезвирусное

растение

соишоны

с повышенной

урожайностью

ПОЛЕВЫЕ ОЦЕНКИ

-<-

тестирование

1Ы У1ТР.О

Рисунок I

ЕЕГЕНЕРАНТЫ

Таблица 3

Количество полученных клеточных колоний при разных стрессовых воздействиях на культуру клеток картофеля

Рабочий Селекционный Количество полученных каллусных колоний,шт.

номер номер е контроле при 5 мг/л после УФ при 1;+35°0

2,4Б

3 35.43/7 153 7 72 168

4 85.43/36 132 7 144 67

7 591Ш-62 1 25 26 29

8 653Ш-28 200 56 132 39

11 85.15/24 63 42 15 36

13 с.Пригожий-2 с.Кардинал 22 7 71 8

14 50 99 11 10

Доверительный интервал при

5Ж уровне значимости ¿(шт) 103+59 35+32 67+52 51+52

Для гибрида N7 (591т-62) и сорта Пригокий-2 был произведен высев суспензии с различной .'лительноотыо беспересадочного культивирования ( 9,10 и 13 недель).

Увэличение возраста сусотнзйи с 12 дней (в контроле) до 9-13 недель не только не снизило количество каллусных колоний, а, напротив, в Зх случаях из четырех привело к значительному увеличении числа колоний по сравнении с контролем (см. таблицу 4).

Таблица 4

Количество полученных клеточных колоний при различной длительности беспересадочного культивирования суспензионной культуры клеток картофеля -

Рабочий номер Селекционный номор Количество полученных каллусных колоний (шт) при длительности культивирования суспензии: 12дней 9 недель 10 недель 13 недель

7 13 591Ш-62 с.Пригожий I 856 1090 .22 - 14 123

Ошсыеэя дaiшый факт, мы склонны считать, что в результате длительного культпрования в суспензионной культуре прогзопло кло-нальноо ризмнояешо лишь наиболее пине способных клеточных колоний, способных к росту на среде с еысоким содержанием продуктов метаболизма, т.е. в строссоних условиях.

3. Расширение сомаклональной вариаОельности при помощи стрессо-

вых факторов.

Для оценки состояния колоний были взятн такие параметры, как размер, окраска, консистенция. По размэру колонии были сгруппированы следующим образок: <0,1см; 0,2-1,Осм; 1,1-2,Осм и более; по окраске: коричневая, светло-коричневая, белая; по консистенции: мягкая, средняя, глобулированная.

Подсчитывая процентное соотношение колоний с различными характеристиками выяснили, что все наблюдаемые признаки варьируют независимо и досточно специфичны для разных генотипов.

Для выявления направленного влияния стрессовых факторов на ¡изменение данных признаков рассматривали совокупные данные по всем генотипам. Эти данные представлены на рисунке 2 в виде гистограмм, о/о,

¡77

«о-6 01 Чо 2о

о/с. 100*

е.о ■

60 -

/£> -

20 ■

°1о

Iсо■ £о-»'о-</0 ■20 \

контроль 2,4Д

УФ

Т+35°С

по размеру: □ < 0,1см

Щ 0.2 - 1,0

Е|> 1,0см

9 нед.

етв

контроль 2,4Д УФ Т+35°С

10 нед. 13 нед.

по окраске:

235

Г"] белая

9 нед.

гп светлого коричневая

коричневая

10 нед. 13 нед. _ .

по консистенции:

мягк2я

среднеструк-турированная

«я! глобули-Ме рованная

контроль 2,4Д УФ Т+35 С 9 нед. 10 нед. 13 над.

Рисунок 2. Вариабельность каллуса картофеля под действием стрессовых факторов.

Хорошо еидно изменение качественных характеристик каллусных клонов под действием различных стрессов.

Из полученных данных видно, что ультрафиолет (1,32 вт-сек/см2), 2.40 (5 мг/л) и повышенная температура культивирования (+35°0) ели яют не свойства полученных колоний следующим образом:

- При облучении ультрафиолетом консистенция каллусных колоний не изменялась по сравнению с контролем (т.е. была в большинстве своем мягкая и средне-структурированная), в то время как увеличилась доля мелких коричневых колоний.

- Под действием 2,4Б колонии стали более крупными, средне-структурированными и более светлыми.

- Выращивание на повышенной температуре привело к укрупнению колоний, повышению доли средне-структурированных светлых и светло-коричневых колоний.

Различная длительность культигирования суспензии также привела к изменении характеристик полученных каллусных популяций по сравнению с контролем. Выход светлокоричпевой среднеструктурированной фракции увеличился при кулмиЕировании суспензии в течение 10 недель. Увеличение процентного содержания в популяции глобулированных колоний отмечалось после культивирования суспензии в. течение 13 недель. В любом из вариантов этого опыта размер колоний именялся в сторону уменьшения по сравнению о контролем.

Из всего вышеизложенного можно сделать вывод: Стрессовые факторы - ультрафиолет(1,32Вт.сек/см2), 2,4Б(6мг/л), повышенная .температура культивирования(+35°С) и длительное беспересадочное культивирование суспензионной культуры(9-10 недель), используемые на этапе высева клеток, изменяют качественные характеристики каллусных популяций, расширяя том самым границы сомаклональной вариабельности.

4. Получение сомаклоналышх вариантов.

4.1. Получение морфогенннх каллусов.

Для получения морфогенных структур, способных регенерировать новыэ растения, каллусы пересаживали на среду для регенерации (Г.Г.Бутекко с соавт.,Москезд984), при этом брали каллусы размером на менее С,5 см.

Для изучения влияния длительности культивирования колоний на

среде плотировяния на рост и регенерационныв потенции каллусов ресадки проводили по следующей схеме (см. рисунок 3):

пе-

П Л О

т

и р

о в л ■н и

Е

:успензи- р >нная у ¡ультура д

П Е Н 3 И

и

контроль

@2.4Д

5мг/л

УФ 1.32 Вт.сек сг?

^ Т=*350С

разный возраст суспензии

I - среда для каллусообразования II - среда для регенерации

Рисунок 3. Схема пересадки каллусов на среду для регенерации

1) Вариант пересадки "Xй - через 40 дней после плотирования аллусы, достигшие размера 0,5см и более пересаживали повторно на реду для каллусообразования, а еще через 40 дней - на среду для эгенерации;

2) Вариант пересадки "У" - через 40 дней после плотирования аллусы, размером 0,5 и более сантиметров Переносили на среду для ¡генерации;'

3) Вариант пересадки "2" - через 80 дней посла плотирования 1ллусн, достигшие 0,5 и более сантиметров пересаживали на среду 1я регенерации;

4) Вариант пересадки "О" - через 120 дней после плотирования подросшие каллусы переносили на среда для регенерации.

Путем последовательных пересадок через каждые 40 дней на свежуй среду для регенерации каллусные клоны были приведены в морфо-генное состояние. Наблюдали появление зеленых глобул, а затем апексов, из которых регенерировали сомаклоны.

Для анализа влияния различных стрессовых факторов на морфоген-ность полученных каллусных популяций был подсчитан процент морфо-генных каллусов от общего числа колоний. На рисунке 4 показаны средние значения по процентному выходу морфогеяных каллусов в зависимости от варианта стрессового воздействия.

е/оЛ

6050-цо-ъо-го 40-

контроль 2,4Й УФ г"+35-О

Рисунок 4. Влияние различных стрессовых факторов на процентный влход морфогенных каллусов в популяции нематодоустойчивых гибридов и сортов картофеля.

Хорошо видно, что процент морфогенных каллусов в вариантах ■ стрессового воздействия выш3чем в контрольной популяции. Это гоЕорит о том, что предложенные стрессовые воздействия не снижают, а в некоторых случаях повышают морфогенетический потенциал каллуса картофеля.

4.2. Получение регенерактов.

Путем последовательных пересадок морфогенных каллусов на среде для регенерации получоны сомзтшэнальные варианты нематодоустойчивых гибрздов и сортов картофеля.

Регенеранты переносили на среду для укоренения. Общее количество полученных регенэрэнтоа показано в таблице 5.

И

ш

Таблица 5

Odc.ee количество регенерантов, полученных при различных стрессовых воздейстьиях на культуру клеток картофеля.

Гэнотип Количество регенерантов (шт) по вариантам:

контроль Бмг/л 2,4В УФ 1,32 Вт.сек/см2й=+35°0

N4 (85.43/36) II I III 69

N11 (85.15/24) - - 2 26

N7 (5Э1т-62) - 128 106 171

с.Пригокий-2 23 17 18 6

с.Кардинал 38 124 120

Для характеристики регенерациотшх способностей каллусных популяций различных генотипов в условиях стрессового воздействия был Еыбран такой относительный показателе как выход регенерантов на I морфогенный каллус. Эти данные представлены на рисунке N5(и). На графике хорошо еидно. что предложенные стрессовые факторы повышают выход регенерантов на I морфогенный каллус.

5.Скрининг сомаклональных вариантов 1л т11;го.

Растения, не дающие корней на среде для укоренения,а также хлороигшые и угкетеннне, считали нежизнеспособными и отбраковывали. Нормально развитые растения размножали черенкованием 1п у11;го для дальнейших оценок.

Процентный выход жизнеспособных растений-регенерантов под действием разных стрессов предстазленн на рисунке 5(6).

Как видно из графика, стрессовые факторы - УФ, повышенная температура и длительное беспересадочное культишрование супонзии повышают жизнеспособность получаемых рогонгрантов по сравнению о контрольной популяцией, повышенная концентрация 2,4В (Емг/л) несколько сникает этот показатель.

Сравнивая графики а) и б) на рисунке 5 мсжно сделать заключение:

- под двйствиом 2,4д выход регенерэнтоз на один морфогенный каллус увеличивается, но при атом снижается их жизне способности

- при облучошсх УФ выход регенераптон ка I морфогенный кол-гуи несколько ниже,но пр:: этом их укзнеспособность поеыпочтол.

- культивирование каллусов на повышенной температуре увеличивает как регенерационную способность каллусов, так и жизнеспособность полученных регенерантов;

- при длительном беспересадочном культивировании суспензии увеличился как выход регенерантов на I морфогенный каллуо, так и отбор юганвспособных регенерантов . Причина данного явления не выяснена. Ьокно лишь предположить, что в длительно культивируемой суспензии со временем формируется стресс-устойчивая, пластичная популяция клеток с высокой жизнеспособностью. Однако, данное утверждение, вероятно, может быть справедливо лишь для генотипов толерантных к длительному культивированию недифференцированной ткани.

5.1. Оценка сомакпонов по морфотесту In vitro.

Размноженные сомаклоны были оценены по морфотесту in vitro, (Рассадина Г.В. с соавт.,1992). Данные по проценту отбора сома-клонов но основе морфотвста in vitro представлены на рисунке Б(в).

Как видно, процент отбора по морфотесту in vitro выше в вариантах с ультрафиолетом, повышенной температурой и длительно культивируемой суспензией. Под действием повышенной концентрации 2,40 в среде культивирования отбор по морфотесту in vitro значительно снижался. То,что в контрольной популяции(полученной без стрессов) ве удалось получить бездефектных регенерантов связано,по-видимому, с тем, что спонтанная вариабельнооть в каллусах контрольного опыта привела в большинстве случаев к негативным отклонениям. Это,в свою очередь,подтверждает целесообразность использования стрессовых факторов для организации направленного оелектившго действия,обеспечивающего преимущественное рааьитие определенной чвсти популяции.

«

Б.2. Оценка фитофтороугмойчивооти Сомаклонов in vitro. Устойчивость к фитофторе исходных форм представлена в таблице I в разде-ле"Материалы и метода": у гибридов N4 (B5.43/3S) и N7 (59Im-G2) по данным авторов втих форм фитофтороустойчивость оценена в 7 баллов.

В результате проведенных опытов у гибрида N4(85.43/36) все оцененные in vitro линии имели балл устойчивости 9. У гибрида N7 (Б91го-62) процент линий, имеющих балл устойчивости 7-9 был также весьма значительным - от 57* в опыте с УФ облучением до 100% в опыте с повышенной температурой.

ШГ,^ 70-

бо-so Цо-10 го

40

17771

Ш

И

Ж ш ш

контроль

2.4D

УФ

t +35°С

9 недель 10 недель

%

$о ?0 Со

Чо ъо ■ го ■ 40

а). Влияние стрессовых факторов на выход регенерантов на один морфогенный каллус

т т

Ш

контроль

2.4D

УФ

Ъ +35°С

9 недель 10 недель

б).. Процент жизнеспособных регенерантов под действием разных стрессов

%

'л

400

90 М 70 60 SO-цо-

30 .

£0

40

УЛ

1

/

г//

контроль 2,4D УФ t +35 С 9 нодэль 10 гадол". в) Процент отбора сомаклонов по морфотйсту in vitro.

Рисунок 5.

- Длительное беспересадочное культивирование суспензии не они-било этих показателей, что позволило получить соответственно 86% и 50% фитофтороустойчивых линий при 9 и IO-недельном культивировании суспензии.

Тестирование ln vltro позволило освободиться от сомаклональ-ных вариантов о негативными отклонениями и отобрать для полевых испытаний наиболее развитые, устойчивые к фитофторозу линии.

6. Оценка сомаклональных вариантов ln vivo.

6.1. Оценка урожайности и фитофтороустойчивости сомаклональных вариантов ln vivo.

Для характеристики отобранных линий взяты такие показатели, как урожвйность (г/куст), крахмалистость (й), устойчивость к фитофторе, нематодоустэйчивость (таблицы 6-8).

у отобранных сомаклонов гибрида 5Э1ш-62 (N7) (таблица 6) урожайность достоверно превышает контроль на БЖ-ном уровне значимости. Различия сохраняются в течение двух лат, что говорит о генетической стабильности данного признака. Выделена линия П-50 после воздействия ультрафиолетом о повышенным содержанием крахмала -19,6 % (по сравнению с контролем).

Устойчивость к фитофторозу по ботве - 8 баллов - на уровне исходного генотипа. Исключение составляют 2 линии - 11-37 ("9-нв-дельная" суспензия) и терморезистентная 11-74, у которых устойчивость ботвы оценена в 5 баллов, но клубни иле ют оценку 7 баллов.'

У сомаклонов гибрида 84.43/36(114) (таблица 7) в 1992-1993 годах урожайность отобранных терморбзистентных линий была примерно в 2 раза выше, чем у исходного образца,что достоверно на Б%-ном уровне значимости. Исключение составили линии И-36 и И-37, у которых в 1993 году урожейнооть бала на уровне контроля. В данной популяции 4 линии - Г.-Ю, 11-32, П-34 и И-36 превышают контроль по содержания крахмала. Устойчивость к фитофторозу в данной популяции не стабильна по годам.

Таблица б

Характеристика сомзклснов, полученных но основе селекционного гибрида 5Э1т-62 (N7) (по данным полевых испытаний 1993 г.).

Фактор Способ Номер стрессового пере- линии воздействия свдки

каллусов

Урожайность

г/куст

Крвхма-лиотость

Устойчивость к фптофторе к ви-ботвы кл^-русам

Повышенная концентрация 2,40 в питательной среде (5мг/л)

Ультрафиолет в дозе п

1,32 Вт.сек/см*

Температура культивиро-п бвния +35 О

Длительность культин'.фо-ваиия суспензии 9 недель

Длительность культивирования суспензии Ю недель

исходный 630 15,3 8,0 6,0 9,0

"Х" Й- I 860 16,7 8,0 4,3 9,0

и- 21 590 17,5 8,0 6,6 9,0

н- 30 1410 18,1 8,0 6,8 9,0

й- 34 1400 17,2 0,0 4,6 9,0

й- 65 860 17,6 8,0 4,0 3,0

й- 56 1090 18,4 8,0 5,3 9,0

й- 69 1520 17,7 В,0 4,8 9,0

"Xя 1 й-50 1200 19,0 8,0 7,0 9,0

"X" й- 74 670 16,4 5,0 6,8 9,0

-г" й- 19 830 16,5 7,0 7,3 9,0

К- 37 1100 16,1 5,0 7,0 3,0

Н- 46 1170 17,4 8,0 5,4 9,0

й- 82 . 1170 16,7 8,0 5,0 9,0

й- 92 1100 17,2 , 8,0 5,2 9,0

"Ь" й- 14 1150 •• 17,/ 8,0 Р,0 9,0

й- 16 1470 15,5 8,0 7.0 9.0

Н- 44 1200 16,6 8,0 6,0 9,С

Н- 109 1380 15,1 8,0 6,0 9,0

с.Луговской 878 15,0 7,8 7,0 5,0

с.Невский 850 14,0 6,0 5,4 7,0

с.Темп 750 18,6 7,6 7,0 6,0

КОР0,5 " 290

Таблица 7

Характеристика сомаклонов, полученных на основе селекционного гибрида 85.43/36 (N4) (по данным полевых испытаний 1993г).

Фактор Способ стрессового перевоздействия садки

каллусов

Номер линии

Урожайность

г/куст

Краша- Устойчивость листость к фитофторе к ви-

% ботвы Ц$б-Русам

исходный 270 16,6 7,0 7,2 9,0

Температура "0" Н- 5 675 13,6 8,0 9,0 9,0

культивиро-- й- 10 555 20,1 5,0 6,7 9,0

вания +35 С й- 32 516 18,9 5,0 5,0 9,0

й- 34 466 20,4 ь,а 3,4 9,0

Й- 36 283 18,5 5,0 5,4 9,0

Н- 37 274 18,1 5,0 4,0 9,0

НШ0,Б " 92 •

По результатам оценок 1992 года были отобраны 2 сомаклональных варианта го сорту Кардинал, урожайность которых существенно превышала контроль, в фитофгороустсйчивооть была на уровне контроля.

Таблица 8

Характеристика сомаклонов, полученных на основе сорта Кардинал (по данным полевых испытаний 1993г).

Фактор Споооб Номер стрессового пере- Ливия воздействия садки

каллусов

Урожайность

г/куст

Крахма- . Устойчивость листость к.фитофторе к ви-% ботвы клув- руоам

Ультрафиолет " в дозе о

1,32 Вт.сей/сиг

исходный 370

Й- б 264 й- 12 200

12,7 3,0 7.0 7#0

12,0 Т,0 6,(7 Б,О 13,3 1,0 7,5 • 6,0

НОР,

о,в - 10Б

По данным наблюдений 1993 года (таблица 8) в условиях повышенной влажности сорт Кардинал имел балл устойчивости ботвы - 3, а его сомаклональныв варианты - I. Вследствии сильного поражения

ботвы фитофторой резко снизилась урожайность сомаклонов и составила : у линии й-5 - 64 г/куст, у линии Н-12 - 200г/:уст, что значительно ниже контроля. Это говорит о том, что по сорту Кардинал не удалось получить сомаклонов, превышающих контроль по урожайности и фитофтороустойчивости.

6.2. Оценка нематодоустойчивости сомаклональннх вариантов.

По данным, полученным совместно с отделом защиты НПО по картофелеводству нематодоустойчивость урожайных линий была на уровне исходных форм. Таким образом,признак нематодоустойчивости у сомаклонов сохранился.

В таблице 9 показан процент отбора линий с положительными хозяйственными характеристиками в различных вариантах опыта.

Таблица 9

Процент отбора сомаклональннх вариантов по комплексу хозяйственно-ценных признаков

Генотип' 2,4В Процент отбора по вариантам: у* +_.осОп длительность культивирования л» • ° суспензии 9 недель 10 недель

N4 (85.43/36) - 0,0 37,5 _ _

N7 (591т-62) 32,1 6,9 0,0 11,4. - 5,7

с.Кардинал 13,3 0,0

Из таблицы видно, что влияние стрессовых факторов на выход сомаклонов с хозяйственно-ценными признаками весьма различно у разных генотипов. Так, в популяции, полученной на повышенной дозе 2,40 лишь у гибрида К7(591ш-62) удалось получить урожайные фятофтороуо-тойчивые сомаклоналыше варианты, причем процент отбора таких линий достаточно высок - 32,1Ж. Под действием ультрафиолета получены перспективные сомалоны по гибриду N7 к сорту Кардиьал. В тврморе-зистентной популяции урожайные фитофторсустой'пшне линии удалось получить по гибриду N4(85.43/36) - 37,5Х.

В популяциях сомаклонов гибрида 1.7 (Б91Ш-62), пслучешшх поел»

длительного беспересадочного культивирования суспензии в течение 9 и 10 недель отбор по комплексу хозяйственно-ценных признаков составил соответственно 11,4% и 5,4%

Сомаклонь, полученные по другим генотипам, хотя и овладели высокой фитофтороустойчивостью, имели низкую урожайность и, поэтому, были забракованы.

Таким образом, можно сделать вывод: для получения урожайных, фитофтороустойчивых сомаклонов картофеля,обладающих комплексом хозяйственно-ценных признаков, целесообразно применять такие стрессовые воздействия, как: облучение культуры клеток ультрафиолетом -в дозе 1,32 Вт.сек/см2; культивирование клеточной культуры на питательной среде, содержащей 2,4D в концентрации 5 мг/л среды¡выращивание казусных колоний прл повышенной температуре +35°С, а также варьировать длительность беспересадочного культивирования суспензии (для генотипов, хорошо растущих в суспензионной культуре).

Спссоб пересадки каллусов после плотировакия суспензии также имеет большое значение. Вариант пересадки, обозначенный нами "Xй -перенос каллусов со среды плотирования сначвла повторно на среду для каллусогенеза (ЫСКК) и лишь затем - на среду для регенерации -хорошо "работает" в вариантах с повышенной концентрацией в среде культивирования 2,4Б, ультрафиолетовым облучением и повышенной температурой. Пересадка, обозначенная как "Z" и "Q" - культивирование каллусов на среде плотирования без пересадки в течение соответственно ВО и 120 дней - особенно хорошо показали себя в случае длительно культивируемой суспензии и при культивировании каллусов при темпэратуре +35°0. Вероятно, продукты стрессового воздействия, накапливающиеся в каллусной ткани при длительном культивировании суспензии и при выращиваний каллусов на повышенной температура приводят к замедлению роста каллусных колоний на среде плотирования и к увеличению процентного выхода сомаклонов с повышенной урожайностью.

Процент отбора сомаклонов с положительными характеристиками в популяциях, полученных на основе промышленных сортов, ниже, чем в популяциях, полученных на базе селекционных гибридов. Таким образом, подтверждается мысль о целесообразности использования селекционных гибридов для работ по сортоулучшению методами клеточной селекции.

вывода

1. Показана принципиальная возможность достовэрного изменения хозяйственно-ценшх и селекционных признаков у картофеля методами клеточной инженерии.

2. Отобраны линии нематодоустойчивых гибридов картофеля, достоверно превышающие по уронвйности'в-течение 2-х лет исходные формы и сохраняющие на высоком уровне остальные хозяйственно-ценные признаки.

3. Получен полевой материал по перспективным линиям ¿ш вак-ладки высоких питомников по схеме селекционного процесса.

4. Показано, что УФ (1,32 Вт.сек/см2), 2,40 (5 мг/л) и t+350C работают как стрессовые факторы я селективные фоны, манящие состав клеточных популяций и способствующие очищению ее от неконкурентноспособных особей.

Б. Показано, что проценты положительных отборов го хозяйственно-ценным признакам среди сомаклонов, полученных и применением стрессов, значительно вше, чем в контрольных популяциях.

6. Для оздоровления картофеля наряду о методами термотерапии перспективно применение метода криотерапии.

'Л. Показано, что существует корреляция глежду оценками материала на уровне 1п т1йги и 1п т1то.

8. При коррекции селекционного обравца по признаку урожайности методами сомаклональной вариабельности обязателен контроль всех остальных показателей, т.к. изменчивость хозяйственно-ценах признаков у сомаклонов идет независимо. .

Рекокендацпи'для селекции

1. Для расширения сомаклональной вариьбельности нематодоустойчивых гибридов картофеля о целью получения высокоурожайных пиниЛ, обледапцих комплексом хозяйстЕенно-ценннх признаков речомендуетоя использовать изученные стрессовые факторы - ультрафиолет, 2,40, повышенную температуру и длительное беспересадочное культивирорз-ниб суспензии.

2. Для сокращения поленых работ по оценке а отбору пысокоуро-жайяых сомаклонов рекомендуется использование системы 1п т11;го~ тестирования, разработанной в отделе клеточной инженерии ВНЖлХ.

3. В качестве исходного материала для селекции на нематодоус-тойчивость рекомендуется 6 сомаклонов гибрида 69Im-62: R-30, H-5Q, R-14, R-1G, R-44, R-1Q9; 2 сомаклона гибрида В5.43/36: R-5, R-10, которые отличаются сочетанием нематодоустойчивости о повышенной урожайностью, фитофторо- и вирусоуотойчивостью, высоким содержанием крахмала.

Основные положения диссертации опубликованы в оледуицих работах:

1. chromova L.K., Hassadina g.y., Yuriova и.о., Krasheninniko-ya L.v., Kiraanova s.u. Cell and genetic engineering in potato cultural improvement. Abstracts of Golden Jubilee Simpoaium on Genetic research and education, v.3, 1991, New Delhi, India, p.882.

2. Kiraanova S.N., Chromova L.M., Eiraanova E.V. Cell engineering methods aa a tool to correct trait of tuber productivity in potato hybrids genomea resistant to Golden nematode. Abstraota of Golden Jubilee Simpoaium on Genetic research and education, volume 3, 1991, Hew Delhi, India, p.848.

3. Рассадила Г.В., Кирсанова O.H. Оортоулучшение картофеля методом культуры тканей с использованием неспецифического стресса., Тезисы Генетического съезда, Шнек, ноябрь 1992г.

4. Kiraanova S.N., RaSBadina G.V,, lthromova ь.ы., Kirsanovs E.V., Yourieva N.O. An attempt of applaining biotechnological methods

for increasing productivity and resistance to phytophthora infestana on nematode resistant potato hybrids, international Conference on Biotechnology in Agriculture and Poresty, New Delhi, India, 1993.

5. Юрьева И.О., Рассадина Г.В., Хромова Л.М., .Кирсанова O.H. Роль неспецифических стрессовых факторов в созданий форм картофе.1:г; о улучшенными селекционными йрианакаыи., Тезисы докладов 2-го Российского Симпозиума "Новые методы биотехнологии растений*1, Пущино, май 1993Г. : •

По;: тиевно к печати 20.12.93г. Формат бумаги 60x90 Закьз N213. Объем In.л.. Тираж 100 вкз..

On чатано на ротапринте ВНИИКХ,л/о Коренево,Московской области