Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие птеридинов в регуляции фотосинтеза растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Участие птеридинов в регуляции фотосинтеза растений"

Р Г В 0!\

На правах рукописи УДК 581.132:581.12

I 5 Ш Ша

СТАХОВ ЛЕОНТИЙ ФЕДОРОВИЧ

УЧАСТИЕ ПТЕРИДИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФОТОСИНТЕЗА РАСТЕНИЙ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1996

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

ЛАДЫГИН ВЛАДИМИР ГЕОРГИЕВИЧ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ПРОНИНА НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВН. доктор биологических наук ЛЮБИМОВ ВАЛЕРИЙ ЮРЬЕВИЧ

Ведущее учреждение: Биологический факультет Московского государственного университета

Защита диссертации состоится 1996 г. в час.

на заседании Диссертационного совета Д 200.29.01 в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН по адресу: 142292, г. Пущино, Московская обл., Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения й фотосинтеза РАН

Автореферат разослан Д-ЛНйА^Я 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

Б.Н. ИВАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Птеридины, широко распространенный класс природных гетероциклических соединений. Как простые, неконь-югированные, так и многокомпонентные коньюгированные птеридины являются физиологически активными соединениями, принимающими участие в регуляции метаболических процессов растений.

В работах Маделини, Малкина было показано, что 2-амино-4-гидрокси-6-замещенные птеридины могут активировать процесс фотосинтетического фосфоршшрования со скоростями, сопоставимыми со скоростью активации этого процесса феназкнметосульфатом (Madelini,1969; Maklean et al., 1965, 1966; Saltman, 1970). Взаимодействие птеридинов с электронтранспортной цепью (ЭТЦ) происходит, по-видимому, на восстаношггельной стороне фотосистемы-1 (ФС-1) хлоро-пластов. Известно, что птервдины принимают участие в процессах фотодыхания. Так, Элстнер установил способность птеридинов активировать поглощение кислорода хлоропластами на свету (Elstner,1976). Из сине-зеленых водорослей выделено соединение пгеридиновой природы -биоптерин, участвующее в фотосинтетической фиксации СОг с образованием биоптерин-глюкозида (Forrest et al., 1958).

Важнейшим представителем птеридинов является фолиевая кислота (ФК). Образуя ряд тетрапщюфолиевых коферментов (ТГФК), ФК способна переносить одноуглеродные радикалы, обеспечивая синтез некоторых аминокислот и нуклеотидов.

Фолиевая кислота, биоптерин и другие гтгеридгаш фотолабильны и их функции в растении связаны со с пето зависимыми метаболическими процессами. Известно, что действие УФ-радиации вызывает в ДНК два главных ттта изменений, образование циклобутан-пиримидиновых ди-меров и (6-4)-фотопродуктов. При этом птеридины, являясь антенной, поглощающей синий свет (350-450нм), переносят энергию возбужденного состояния через флавины на димеризованный тимин, осуществляя репараций. Ферментом данного процесса является фотолиаза (Sanear, 1996). Одним из первых исследователей, сопоставившим биохимические особенности неконьюгированных птеридинов и фолатов с фотосинтетическими процессами, был Фуллер (Fuller, 1971).

Несмотря на многочисленные исследования, посвященные участию птеридинов в регуляции процессов метаболизма растений, их роль во взаимодействии с ЭТЦ хлоро пластов остается совершенно неясной. Учитывая вышесказанное, нам представлялось весьма важным исследовать регуляторную роль птеридинов в процессах фотосинтеза, понимая

под этим нс только поглощение квантов света пигментами, но и другие свстозависимые метаболические процессы, протекающие в хлоропластах.

Цель я задача всслвдмаапй. Основная цель нашей работы состояла в установлении функций птеридинов в светозависимых метаболических процессах растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1) исследовать механизмы активации фотоиндуцированного электронного транспорта хлоропластов птеридинами; 2) установить места, активируемого птеридинами, фотопоглощения кислорода в ЭТЦ хлоропластов; 3) изучить процессы активации фолиевых коферментов в растениях; 4) показать протекторную роль участия фолатов в биохимической адаптации растений после воздействия жесткого УФ-излучения.

Наугаая вомша работы. 1). Показано, что 2-амино-4-гидрокси-6-замещенные гггеридины и фолаты активируют процесс фотофосфорилирования (ФФ) хлоро пластами в аэробных условиях. Анаэробные условия ингибируют процесс активации ФФ птеридинами.

2). Физиологические птеридины растений могут являться посредниками между фотосинтетическим электронным транспортом и кислородом на участке ферредоксина, а также в циклическом электронном транспорте.

3). Впервые установлена возможность активации (фотовосстановлсние до тстрагидроформы) фолиевых коферментов при их взаимодействии с ЭТЦ хлоропластов в ФС-1. 4). Показано, что ферредоксин-НДЦФ-редуктаза выполняет функции с вето зависимой фолат редуктазы. 5). Впервые показано также, что т г/ю фолиевые витамины выполняют функции протектора растений после воздействия жесткого УФ, причем фотолиз ФК приводит к образованию 6-птеринкарбоновой кислоты, соединения, флуоресцирующего с максимумом 455 нм. Образующийся при фотолизе ФК избыток глутаминовой кислоты (7 молекул на одну молекулу ФК) приводит к активации метаболических процессов в мультиферментных системах (по принципу аллостерической регуляции).

Н&учао-пфакпгасская значимость. По результатам наших исследований могут быть разработаны и созданы принципиально новые гербициды на основе селективных ингибиторов фолатредуктаз. Возможно также повышение устойчивости растений к воздействию жесткого УФ-облучения. На основе фундаментальных исследований по теме работы получены 3 авторских свидетельства на изобретения и 1 патент.

Ащюбащаа работы. Представленные в диссертации результаты докладывались в течении 1969-1996гг. на съездах, симпозиумах и конференциях, что отражено в списке опубликованных работ.

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, в том числе 17 статей в ведущих научных журналах и сборниках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы нсследомвзя. Объектами исследований служили высшие растения: горох сорта "Неистощимый" и "Превосходный", шпинат сорта "Исполинский", каллусные ткани корня руты (Ruta ginveolens), сои (Soybean), выращиваемые на модифицированной среде Мурасиге и Скуга (Muroshige et al., 1962).

Вмлеление фосфоттпксина. Фосфодоксин (ФСД) получали методом Блека и Сан-Пьетро (Black et al., 1963) in листьев двухнедельных проростков гороха, каллусных тканей сои и руты.

£шггез_2-.амино-4-гилр(жш_бгптерштншмсгилз- Данное вещество

синтезировали из коммерческой ФК по методике Хитчингса (Hutcliings et al., 1947; Waller et al., 1950).

Дигилроптеринм получали по методу Футгермана (Futterman., 1957). Синтез фосфорилировпчних птсрплинов осуществляли согласно методике Шиота (Shiota T.,et al.,1964).

Суммарное содержание Фолатов определяли по И паи (Iwai et al., 1959). Хлоропдясты выделяли га листьев гороха .следующим методом: 5 г листьев гомогенизировали в 50 мл среды (1/15 М фосфатный буфер, рН 7.8; 3 мМ MgCl2, 0.35 мМ NaCl, 0.5% альбумин, 0.2% поливинилпирролидон, 0.4 М сахароза) в течение 12 сек. Гомогенат отфильтровывали и центрифугировали 10 мин. при 3000g. Ресуспендировали осадок в 20 мл среды, содержащей 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, и неIггрифупгровали 10 мин. при 3000g. Ресуспендировали осадок в 3 мл среды, содержащей 1/15 М фосфатный буфер, рН 7.8, 3 мМ MgC^; 0.5% альбумина, 0.4 М сахарозы).

среда объемом 1.5 мл содержала: 12.5 мкМ трис-HCl буфера (рН 7.8), 2.5 мкМ МеС12, 5 мкМ IC2HPO4, 5 мкМ АДФ, суспензию хлоропластов с содержанием хлорофилла 40-60 мкг, естественные или искусственные кофакторы. Для циклического фотофосфорилирования в качестве кофактора использовали 0.1 мкМ феназинметосульфат (ФМС), для нециклического - 5 мкМ феррицианид калия + 100 мкМ КС1, 0.5 мкМ метил-виологен или 4.5 мкМ ферредоксин. Реакцию проводили при температуре 20°С в термостатируемых плоскодонных колбочках на установке, обеспечивающей равномерное освещение от 500 Вт лампы на растояшт 30 см (обычно снизу). После 3-10 мин освещения реакцию останавлива-

ли добавлением 1.5 мл 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Выпавший осадок отделяли фильтрованием либо центрифугированием на настольной центрифуге. О скорости фотофосфорилирования судили по убыли неорганического фосфата, либо непосредственно измеряли образовавшийся АТФ биолюлюминесцентным методом (Ладыгина, 1971). Фотовосстановление НАДФ* проводили по методу Акуловой и др. (1977). Реакционная смесь содержала 1/15 М фосфатный буфер, pH 7.8, 0.01 мМ KCl, 0.3 М сахарозы, хлоропласта - 70 мкг хлорофилла/мл, 0.9 мМ НАДФ+, 0.1 мг ферредоксина. Объем пробы составлял 2.5 мл. Измерение проводили спектрофотометр ически при 340 нм.

Приборы и оборудование. В работе использовали масс-спектрометр "МИ-1305"; ИК-спектрофагометр "UR-20"; спектрофотометры "СФ-4", "СФ-16", "Hitachi-356'V Specord UV-VIS", "Unicam SP-8000"; флуоресцентный спектрофотометр "Hitachi М-850"; аминокислотные -анализаторы "Biotrouic-LC-5000" и "Biotronic-LC-6000"; АТФ-метр и электроды Кларка д ля измерения кислорода, изготовленные в мастерской ИПФС РАН. Для получения УФ-света использовали лабораторный спектральный облучатель ЛОС-2 с длиной волны 260-380 нм (СКВ БП "Биоприбор", Пущино) с газоразрядной ксеноновой лампой высокогс давления ДКсЭл-1000 в качестве источника излучения. Использовал* также узкополосные интерференционные фильтры с выделяемый спектральным интервалом не более 20 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Химическая природ« кофактор» фотофосфорилирошинм •- фосфо докснва. В 1963 году Блеком и Сан-Пьетро был вьщелен из растений, i потом и из хлоропластов физиологический кофактор - фосфодоксин активирующий процесс фотофосфорилирования со скоростью, сопоста вимой с феназинметосульфатом (Black et al., 1964; 1966; Saltman et al. 1970). Нам представлялось важным установить химическую природу ко фактора. Для этой цели мы провели определение элементного состав С,Н,0 по методу Коршун и Гельман и азота по Дюма (Гельман, 1987) Были проверены предположения ряда авторов о птеридиновой природ фосфодоксина (Fuller et al., 1969; 1971; Rembold, 1970). Сопоставлени фосфодоксина с коммерческими препаратами птеридинов проводил методом ИК-спектроскопии. Расшифровка спектров осуществлялась п таблицам Массона. Как показали наши исследования, ИК-спекгры обои соединений были идентичны. Методом м асс-спсктроскопии был определена молекулярная масса ФСД и коммерческих птеридинов, также молекулярные массы их основных фрагментов (табл. 1).

Таблица 1

Определение молекулярной массы птеридинов

Наименование веществ Молекулярная масса Продукты расщепления

Фосфодоксин по Сан-Пьетро 177 163, 150, 137,' 120, 107

Фракция ФК с Яг 0.56 177 163, 150, 137, 120, 107

Фолиевая кислота 441 295, 263, 176, 149, 137, (129, 120, 107

На основе полученных данных нами установлено, что фосфодоксин имеет эмпирическую формулу СбН;0^. По каталогам таблиц масс-спектров и по результатам ИК-спекгроскопии мы определили птервдиновую природу кофактора (Макаров, Стахов; 1969; 1970; 1972).

2. Актвзацая процессов йотофоефорплЕгкгаанпя птс'гадгяамз. Мы провели комплексные исследования активации процессов фотофосфорили-рования птеридинами. В качестве активаторов использовали синтетические, коммерческие птеридины, а также природный кофактор Сан-Пьетро - фосфодоксин. Нами установлены оптимальные параметры про-текания процесса ФФ (табл. 2): 1) для протекания процесса необходимы аэробные условия; 2) анаэробные условия ингибируют ФФ; 3) оптимальный рН 7.4-7.8; 4) для максимальной активности необходим двухва-

Таблица 2

Влияние газовой фазы на активацию ФФ птеридинами

Активирующий фактор (5 мкМ) Выход АТФ (мкМ/мг хл.час) Условия ] протекания | процесса |

ФСД из хлоропластов гороха 186.4±6.3 Аэробные £

ФСД из хлоропластов гороха 39.6±0.2 Анаэробные

2-амино-4-гидрокси-6-птеринальдешд 208.1±6.8 Аэробные |

2-амино-4-гидрокси-6-птеринальдегид 45.3±0.8 Анаэробные

2-амино-4-окси-6-про-пандиол (биоптерин) 167.2±5.9 Анаэробные

Фолиевая кислота 41.Ш.7 Аэробные

Фолиевая кислота 14.0±0.1 Анаэробные

Дигидрофолат 102.4±4.1 Аэробные

Дипщрофолат 73.8±1.2 Анаэробные

летный ион (Mg2+). Для установления места функционирования птеридинов использовали ингибиторный анализ. Введение в реакционную среду для ФФ DCMU и антимицина А в концентрациях 3-Ю"7 М и 4-Ю-5 М, соответственно, ингибировало протекание процесса на 50%. Введение экзогенных доноров ДХФИФ и аскорбата снимало ингибирование. Это указывало на то, что большинство кофакторов птеридиновой природы взаимодействуют с ЭТЦ хлоропластов на восстановительной стороне ФС-1.

3. Участсз птср:дов©з d ссгяэданна ееслс^одз ds ссэту. В 1974 была опубликована работа "Молекулярные механизмы активации кислорода" (Kaufman and Fisher, 1974). В ней авторы рассмотрели процессы аэробного окисления 5,6,7,8-тетрагидрогтгеринов и установили, что процесс протекает через интермедиат 7,8(6Н)-дигадроптерин, а затем, вследствие действия дигидроптерин рсдуктазы, до 7,8(ЗН)-дигидроптершш. Спонтанное окисление тстрагндроптеринов идет через ковалентный гидрат с последующим окислением до хиноноида и далее до 7,8-дигидроксантоп-терина (Watson et al., 1979). В 1976 г. Элстнер выделил из Euglena gracilis четыре взаимотрансформируемых птеридиновьк компонента, содержащих фосфатные группы (Elstner, 1976). Один из растворимых

Таблица 3

Влияние птеридинов на поглощение кислорода хлоропластами на свету

Объект Вводимые компоненты Поглощение Ог, мкМ/мг.хл.час

гггери- ферре- DCMU о-фенан-дины доксин 2-Ю"5 М тролин, 5 мМ 5 мкМ 1 мМ

Горох 0 + - - - 156.0±6.8 + - - 4.3Ю.2 + + - - 218.0±9.3 + - + - 0 + + 163.0±7.2

Шпинат 0 + - - - 18.6М.8 + - - 3.0±0.8 + + - - 350.0±13.4 + - + 0 + - - + 12.0±0.7 + - + 0 + + - + 15.6*1.3

фосфат-содерхсащих компонентов - PN4 стимулировал ферредоксинзависимое восстановление моновалентного кислорода изолированными хлоропластами эвглены в темноте с НАДФН в качестве электронного донора. Учитывая зависимость активации ФФ от аэробных условий, мы исследовали влияние природных птерйдинов (2-амгаго-4-гидрокси-6-птеринальдегид) на поглощение кислорода хлоропластами на св4ту (Стахов и др., 1978, 1981; Яшина и др., 1979) (табл. 3). Полученные нами результаты показали, что экзогенный ферредоксин, вводимый в систему хлоропластов гороха, мало стимулировал процесс. Скорость поглощения кислорода заметно возрастала при замене ферредоксина на птеридин. Когда вводили и ферредокаш и птеридшг, скорость феггоакшвации кислорода возрастала неаддитивно. Хлоропласта шпината иначе реагировали на присутствие в системе ферредоксина и птеридина. Раздельное включение компонентов не активировало процесс. При совместном их добавлении скорость поглощения кислорода на свету достигала 350 мкМ/мг.хл.час. Вселение DCMU полностью ингибировало фото есс становление кислорода, которое возобновлялось при введении доноров элекгроноз ДХФИФ и аскорбата. Добавление фенантролина, ингибирующего электронный транспорт на уровне ферредоксина, позволило установить, что в хлоропласта;: гороха птеридиновый компонент локализуется до ферредоксина, а у шпината связан с ферредоксином. Известно, что цитохром С мо^ет являться конкурентом кислорода за электронный поток, поэтому его с успехом применяют для определения мест восстановления кислорода в ЭТЦ (Regitz et al., 1970). Мы использовали цитохром С в наших экспериментах по активации птерндинамн восстановления кислорода Было показано, что цитохром С кнгкбирует процесс фотопоглощения кислорода хлоропластами (рис.' 1). Механизм 'ингибнрования сводаггся к конкурентному использованию донируемых электронов. Таким образом, in наших данных следует, что ттридины растений могут являться посредниками между фотосинтетическим электронным потоком и кислородом на участке ферредоксина, а также в циклическом элешронном транспорте.

Л. Фотоакпшщгя фолт??:^ сефеткгзтаз.

Модевьаая есстспз. Как известно, в фотодыхании растений принимают участие тетрапщрофолаты, однако механизмы их восстановления в этом процессе мало исследованы. Известно, что восстановление ФК до гетрагидроформы (превращение ее в коферментные формы) является ЙАДФН-зависимым процессом, который катализируется дипщрофолат-эедуктазами (Ее 1.51.3, Ее 1.51.4). У бактерий Clostridium sticklandii вос-

становление фолатов до дигидроформы происходит с участием восстановленного ферредоксина (Bacher et al., 1983): Пируват + КоА + ферредоксин <=> восстановленный ферредоксин +

ацетил КоА + С02 (1)

восстановленный ферредоксин + ФК <=> ферредоксин + ФН4 (2)

Представляло

в отсутствие цитохрома С

интерес выяснить возможность фотоактивации фолиевых кофсрментов в хлоропластах в процессе фото-индуцированного электронного транспорта. В систему для моделирования процесса нециклического фотофосфори-лирования вместо НАДФ+ вводился дигидрофолат. Его фотовосстановление мы наблюдали в строго анаэробных условиях по увеличению поглощения при 264 нм. Известно, что при восстановлении пгеридинов максимум их поглощения сдвигается в длинноволновую часть спектра (рис. 2). В систему хлоро пластов гороха для моделирования ФФ мы вносили аминоптерин - селективный ингибитор фолатредукгаз (рис. 3). При концентрации аминоптерина 2-Ю"7 М мы наблюдали ингибирование скорости нециклического электронного транспорта на 60%, а при добавлении другого селективного ин-

о2,

мкмоль/мг.хл.час 25

20 15 10 5

0

О

мин

5 15 20

Рис 1. Поглощение кислорода хлоро-пластами гороха на свету

поглощение при 264 нм

1,6 -1,2-

0,8

0,4

а

1 3 5 7 9

Рис.2. Фотовосстановление дигидрофолата

гибитора фолатредукгаз - Ъ\\-фолата - на 20-25%. Введение аминоптерина в систему моделирования циклического фо-тофосфорилирования не оказывало влияния на его протекание. Аналогичные результаты были получены, когда мь наблюдали фотовосстановле ние. НАДФ+ в присутствш ингибиторов фолатредукта (рис. 4). Применение ОСМ1 и ДХФИФ с аскорбатом в мо

мкмоль

АТФ 1,60

Нц-ФФ с аминоптр. Нц-ФФ с цинкфсшат. Нц-контроль Ц-ФФ с аминоптр.

0 1 2 3 4 мин Рис. 3. Влияние ингибиторов

фолатредукгаз на процесс фотофосфорилирования

поглощение при 340 нм

130'

120 60 Н

0

1 2 3

1 - контроль

2 - в присутствии аминогперина

3 - в присутствии цинкофолата

Рис. 4. Фотовосстановление НАДФ+ в присутствии ингибиторов фолатредукгаз

поглощение при 340 нм 100 -1

80 -

60

40 20

0

Нин

и

1

мин

О 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Рис. 5. Фолатредуктазная активность ферредоксин-НАДФ-редуктазы.

дельных системах позволило нам установить, что амино-птерин ингибировал электронный перенос на восстановительной стороне ФС-1 хлоро-пластов. Для интерпретации полученных результатов целесообразно привести данные Херберта, который использовал для ингибирования электронных потоков антитела к ферре-доксину и ферредоксин-НАДФ-редукгазе. Им было установлено, что ферредоксин-НАДФ-редуктаза не принимает участия в циклическом электронном транспорте (НеЛей, 1977).

В случае, если аминопте-рин ингибировал только нециклический электронный поток, блокировалась именно ферре-доксин-НАДФ-редуктаза. Мы заключили, что этот фермент, являясь переносчиком электронов, может обладать фолатре-дукгазной активностью. Как и фолатредуктаза, ферредоксин-НАДФ-редуктаза является фла-вопротеином. Выделенную и очищенную ферредоксин-НАДФ-редуктазу из гороха мы помещали в систему с НАДФН и дигидрофолиевой кислотой. При инкубации наблюдалось снижение поглощения в области 340 нм, что указывало на окисление НАДФН или на восстановление фолата (рис. 5). На

основании полученных результатов можно сделать вывод о наличии в хлоропластах гороха светозависимого восстановления фолиевых кофер-ментов, то есть альтернативного механизма активации фолатов при их взаимодействии с ЭТЦ на уровне ферредоксин-НАДФ-редуктазы.

Светеаа ta Нр&. При наличии многих достоинств модельные системы имеют определенный недостаток, а именно, возможность получения артефактов. Использование гетеротрофной и миксотрофной каллусных тканей позволяет определить непосредственный вклад фотосинтетических процессов в синтез хлоропластами аминокислот и белков и разделить влияние на эти процессы физиологически активных соединений. С целью исследования действия света на функции фолатредукгаз in vivo в среды доя выращивания каллусных тканей Ruta gmvcoknsмы вносили 2-Ю"5 М аминоптерина, 2-Ю-6 М диурона, 2-Ю-5 М фолиевой кислоты. Учитывая различную обводненность тканей, их лиофилизировали. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Влияние физиологически активных сосдиненений на рост каллусных тканей Ruta gnareofens

Масса Масса Отношение

Вариант Ткань сырой сухой массы

ткани, г ткани, г сыоой/сухой

Контроль гетеротрофная 7.61 0.60 12.68 1

миксотрофная 13.66 0.73 18.71 1

б-Аминоптерш! гетеротрофная 3.21 0.45 7.10

миксотрофная 11.54 0.71 16.20

DCMU гетеротрофная 6.88 0.56 12.28

миксотроджая 8.40 0.45 18.66 1

ФК гетеротрофная 9.98 0.68 14.70 |

мдасогшэ&ная 9.72 0.59 16.50 1

На основании полученных нами результатов можно сделать быеод о том, что за счет процессов фотосинтеза образуется примерно 20% сухой массы ткани; активность аминопгеринзависимыХ фолатредукгаз составляет до 25% от суммарной в гетеротрофной ткани; светоакгивируемые фолатредуктазы компенсируют действие аминоптерина. Таким образом, и в митохондриях, и в хлоропластах локализованы изоформы фолатредукгазы как устойчивые к действию аминоптерина, так и ингибируемые им. Здесь можно отметить, что сейчас в высших растениях найдены две формы ферредоксин-НАДФ-редуктазы (Carrillo et al., 1980).

Нами проведено определение качественного и количественного состава свободных и общих аминокислот в каллусных тканях в зависимости от присутствия аминоптерина (табл. 5).

Таблица 5

Качественный и количественный состав общих и свободных аминокислот каллусных тканей Ruta graveolem (% содержания на едишщу сухой массы)

Миксотрофные Гетеротрсфны е

Ами- содержание содержание содержание содержание

нокис- общих амино- свободных общих свободных

лоты кислот аминокислот аминокислот аминокислот

1 2 1 2 1 2 1 2

Агр 3.92 2.44 9.08 0.10 2.24 2.23 0.27 0.35

Thr 0.42 0.38 0.09 0.08 0.32 0.48 0.06 0.07

Ser 0.45 0.75 0.12 0.11 0.50 1.13 0.14 0.09

Gla 7.05 0.32 2.70 3.20 3.33 4.46 2.28 2.90

Pro 0.11 0.15 0.02 0.04 0.08 0.12 0.07 0.07

Gly 0.44 0.34 0.07 0.05 0.50 0.39 0.05 0.05

Ala 1.20 1.18 0.82 0.79 1.88 2.27 0.75 1.14

Val 0.66 0.52 0.23 0.19 0.63 0.60 0.19 0.23

Met 0.19 0.18 0.08 0.01 0.20 0.19 0.01 0.01

lie 0.54 0.46 0.06 0.03 0.58 0.47 0.07 0.05

Leu 1.58 1.52 0.07 0.07 1.67 1.45 0.07 0.09

Tyr 1.31 0.55 0.07 0.03 0.38 0.35 0.07 0.03

Phe 0.59 0.51 0.13 0.10 0.62 0.55 0.14 0.08

His 0.64 0.52 0.45 0.41 0.52. 0.65 0.46 0.29

Lys 0.71 0.67 0.19 0.22 0.73 0.66 0.16 0.13

Агя 0.90 0.89 0.39 0.30 0.88 0.60 0.36 0.29

Сумма 20.51 19.57 5.57 5.73 15.10 16.80 5.76 5.85

ПРИМЕЧАНИЕ: 1 - контроль; 2 - в присутствии аминоптерина.

Во всех вариантах мы наблюдали существенно большее содержание аминокислот в миксотрофных тканях по отношению к гетеротрофным (на 25-30%), из чего следует, что различия являются следствием функционирования фотосинтетического аппарата. В миксотрофных тканях содержалось на 50-90% больше 01х (глутаминовая кислота + глутамин) и на 75% больше Аях (аспарапшовая кислота + аспартат). Состав незаменимых аминокислот в миксотрофных и гетеротрофных тканях мало отличался. Избыток связанных аминокислот в миксотрофных тканях, как видно из табл. 5, приходится на аминокислоты 01х и Аяс. Трудно представить соедшгения, включающие в

состав своих молекул непропорционально большое количество этих аминокислот. Мы предполагаем, что:

1) глутаминовая кислота накапливается в хлоропласта* в результате процессов, связанных с фотодыханием;

2) аспарагиновая кислота может накапливаться в результате взаимодействия:

Глутаминовая кислота + Щавелевоуксусная кислота «а» о-Кетоглутаровая кислота + Аспарагиновая кислота.

Возможно, аспарагиновая кислота накапливается в виде аспараги-на в процессах фотодыхания, аналогично глутаминовой кислоте:

ЫНз + Аспарагиновая кислота + АТФ =» Аспарагин + АДФ + Фн

Таким образом, можно заключить, что светоактивируемые фолиевые коферменты хлоропластов принимающие участие в процессах фотодыхания, существенно сдвигают баланс свободных заменимых аминокислот, регулируя тем самым активность ферментных систем.

5. Метаболия фолатег с условзяк стрссса. Известно, что многие птеридины, в том числе и фолиевые кислоты, подвержены фотолизу, особенно при воздействии УФ-радиации (Неске1 апс! РАе1с1сгег, 1982). При фотолизе образуется 6-птеринкарбоновая кислота - соединение с характерной флуоресценцией в области 455 нм. Птеридины и фолеггы -это гетероциклические соединения. Как известно, УФ-радиация интенсивно воздействует на соединения такой структуры. Нам представлялось важным установить роль птеридинов в процессах регуляции метаболизма растений при воздействии жесткой УФ-радиации. Растения гороха в фазе молочновосковой спелости семян мы подвергали воздействию хсесткого коротковолнового УФ-облучения. Затем в листьях нижних ярусов исследовали содержание 6-гггеринкарбоновой кислоты с помощью спектрофлуориметрии при 455 нм.

Из табл. 6 видно, что УФ-облучение приводит к распаду части ФК, содержащейся в листьях растений, и образованию 6-гтгеринкарбоновой кислоты. Это соединение обладает способностью трансформировать энергию УФ-света в видимый свет с максимумом флуоресценции при 455 нм.

Использование в наших экспериментах 14-дневных растений гороха показало, что скорость фотолиза при действии УФ-радиации в молодых листьях заметно снижена, а при последующем освещении солнечным светом наблюдался процесс фоторепарации фолатов. Известно, что фолиевая кислота в высших растениях обычно содержит 3,

Таблица 6

Фотолиз общих фсшатов растений после воздействия жесткого УФ-облучения

Образец Высота пика флуоресценции (в мм. шкала 1:1)

Контрольные растения 1.3

Растения, облученные УФ (10 мин) 96.5

Растения, облученные УФ (40 мин) 138.0

Растения, облученные УФ (90 мин) 172.0

Контрольные проростки 1.8

Проростки, облученные УФ (10 мин) 63.3

Проростки, облученные УФ (40 мин) 79.8

Проростки, облученные УФ (90 мин) 85.3

Проростки, облученные 10 мин УФ + 38.0

10 мин солнечный свет

5 или 7 остатков глутаминовой кислоты. Исследование аминокислотного состава опытных образцов позволило нам установить, что при действии жесткого УФ происходит распад фолатов и отщепление не только птеридинового ядра, но и глутаминовой кислоты: за % содержание 1.0-1.5 мин. ее количество о,3 возрастает в 2.5 раза при неизменном содержании остальных свободных аминокислот (рис. 6). Появление в клетках растений избытка глутаминовой кислоты приводит к повышению активности ключевых ферментов системы световой репарации ультрафиолетовых повреждений.

мин

I I I

1,5 3 4 Рис. 6. Влияние УФ-радиации на содержание свободных аминокислот.

ВЫВОДЫ

1. Нами установлено, что кофактор фотофосфорилирования фосфодоксин имеет птеридиновую природу.

2. Использование ингибиторного анализа позволило установить, что большинство кофакторов птеридиновой природы взаимодействуют с ЭТЦ на восстановительной стороне ФС1.

3. Тетрагидрофолаты и природные птеридины могут принимать участие в процессах фотодыхания и являться посредниками между фотоиндуцированным электронным потоком и кислородом на участке ферредоксина и в циклическом электронном транспорте.

4. Обнаруженное нами с вето зависимое восстановление фолиевых коферментов дает основание предполагать, что в хлоро пластах гороха существует альтернативный механизм активации фолатов при их взаимодействии с ЭТЦ на уровне ферредоксш1-НАДФ-редукгазы.

5. Ферредоксин-НАДФ-редукгаза, по-видимому, обладает активностью светозависимой фолатредукгазы.

6. При действии жесткого УФ-облучения наблюдается распад молекул фолиевой кислоты и образование 6-гггеринкарбоновой кислоты, которая трансформирует энергию жесткого УФ-излучения в видимый свет.

7. В результате фотолиза фолиевой кислоты в клетках растения накапливается избыток свободной глутаминовой аминокислоты, что приводит к активации метаболических процессов, связанных с функционированием мультиферментной системы световой репарации ультрафиолетовых повреждений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Химическая природа кофактора фотофосформирования фосфодоксина // Тез. II биологического съезда, Ташкент, 1969, секция 19, С. 15.

2. Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Химическая природа кофактора фотофосфорилирования-фосфодоксина // ДАН СССР, 1970, Т. 191, №1, С.237-239.

3. Стахов Л.Ф. О роли фосфодоксина в процессе фотофос формирования // Тез. Конф. "Биология и научно-технический прогресс", Пущино, 1971, С.123.

4. Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Химическая природа и механизм действия физиологического кофактора фотофосформирования - фосфодоксина // Тез. IV Мехсдунар. Биофиз. конгр., Москва, 1972, Секция ХХУ-Е, С.407.

5. Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Химическая природа и некоторые особенности физиологического кофактора фосфодоксина // Биофизика, 1972, Т. 17, №3, С.396-340.

6. Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. О роли фосфодоксина в процессе фосфорилирования // Биохимия, 1973, Т.38, №4, С.7,85-789.

7. Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Некоторые аспекты участия птерин-белкового комплекса в процессе фосфорилирования // Биохимия, 1974, Т.39, №3, С.499-503.

8. Макаров» А.Д., Стахов Л.Ф. Птеринбелковый комплекс в процессе переноса электронов и фотофосфорнлировании // В сб.: Итоги исследования механизма фотосинтеза. Пущино, 1974, С.80-93.

9. Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Железосодержащий птеринбелковый комплекс как предшественник ферредоксина в цепи электронного транспорта // Реф. III Всесоюз. биохим. съезда, Рига, 1974, т.2, С. 29.

10. Макаров А.Д., Иванов Б.Н., Стахов Л.Ф. Птеринбелковый комплекс и ферредоксин как возможные компоненты молекулярного комплекса в фотосистеме-1 // Биохимия, 1976, Т.41, №4, С.655-659.

Н.Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Железосодержащий птеринбелковый комплекс в восстановлении НАДФ и транспорте электронов // Биохимия, 1976, Т.41, №8, С. 1380-1386.

12. Макаров А.Д. Золотарева Е.К. Стахов Л.Ф. Об участии природных птеринов в светоиндуцированном электронном транспорте и восстановлении кислорода в хлоропластах // В сб.: Механизм фотодыхания и его особенности у растений различных типов. Пущино 1978, С.6-17.

13. Яшина С.Г., Полевая B.C., Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Особенности формирования фотосинтетического аппарата культуры руты как прояшгение определенной стадии эволюционного развития // Тез. Всесоюз. Конф. "Эволюционная биохимия и происхождение жизни", Ереван, 1978, С.57-58.

14. Яшина С.Г., Полевая B.C., Макаров А.Д., Стахов Л.Ф. Некоторые особенности электронного транспорта в культуре ткани руты // Физиология растений, 1979, Т.26, №3, С.501-505.

15. Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. Об участии птершювого компонента в световом и темновом поглощении кислорода хлоропластами // Биохимия, 1981, Т.46, №9, С. 1646-1651.

16. Стахов Л.Ф., Яшина С.Г., Макаров А.Д. О возможности световосстановления фолневых коферментов, участвующих в реакциях углеродного метаболизма //• Тез. Всесоюз. Совещ. "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе", Пущино, 1981, С. 54-55.

17. Стахов Л.Ф., Яшина С.Г., Макаров А.Д. Средство, повышающее содержание белка в зерне и зеленой массе // Авт. Свид. №1021453 от 22.01.82, бюлл. №21 от 07.06.83.

18. Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. Регуляция метаболизма аминокислот посредством направленного воздействия на фотосинтетическую ЭТЦ // Тез. Междунар. Симп. "Регуляция метаболизма первичных и вторичных продуктов фотосинтеза", Москва, 1983, С. 49.

19. Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. О влиянии некоторых ингибиторов на биосинтез аминокислот в бобовых культурах // Тез. Всесоюз. Конф. "Проблемы фотоэнергетики' растений и повышения урожайности", Львов, 1984, С.61.

20. Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. Регуляция биосинтеза белка в зерне и зеленой массе с/х культур посредством направленного воздействия на

ЭТЦ фотосинтеза // Тез. Всесоюз. Конф. "Проблемы фотоэнергетики растений и повышения урожайности", Львов, 1984, С.62.

21. Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. Средство, повышающее содержание белка в зерне злаковых культур // Авт. Свид. №1110431 от 15.02.83, бюлл. №32 от 30.08.84.

22. BiT K.Ya., Fomina I.R., Stakliov L.F. and Makarov A.D. On stimulation of protein synthesis in barley ears by linuron // Abstr. Internat.. Symp. "CO2 fixation and photosynthetical plant productivity", Sofia, 1984, P.54.

23. Б иль К.Я., Фомина И.Р., Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. Стимуляция белкового синтеза в колосьях ячменя линуроном // Физиология растений, 1985, Т.32, №5, С.969-975.

24. Bil' K.Ya., Fomina I.R., Stakliov L.F. and Makarov A.D. Effect of linuron on barley ear photosynthesis and grain yilds // Photosyuthetica, 1986, V.20, №2, P.131-138.

25. Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. Способ стимулирования роста зерновых и зернобобовых // Авт. Свид. №1354456 от 11.02.85, бюлл. №43 от

26. Стахов Л.Ф., Стахова Л.Н. Механизмы фотоакгивации фолиевой кислоты в хлоропластах // Тез. Всесоюз. конф. "Преобразования световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделирование", Пущино, 1989, С. 179.

27. Стахов Л.Ф., Лебедева А.И., Стахова Л.Н. Влияние фотосинтеза на метаболизм азота // Тез. Всесоюз. сов. "Экологические проблемы накопления нитратов в окружающей среде", Пущино, 1989, С. 112.

28. Стахов Л.Ф., Лебедева А.И., Стахова Л.Н. Влияние фотосинтеза на аминокислотный состав каллусной ткани руты // Биохимия, 1990, Т.55, №11, С.1830-1832.

29. Стахов Л.Ф., Лебедева А.И., Стахова Л.Н. Альтернативный механизм биосинтеза фолиевых коферментов // Биохимия, 1990, Т.55, №11, С. 1969-1974.

30. Стахов Л.Ф., Стахова Л.Н. Влияние фотосинтеза на утилизацию нитратов каллусной тканью // Тез. Конф. "Физиолого-генетические механизмы азотного питания растений", Киев, 1991, С.34-35.

31. Герц С.М., Биль К.Я., Фомина И.Р., Бирюков C.B., Комарова В.П., Стахов Л.Ф., Макаров А.Д. Влияние обработки низкими концентрациями линурона на накопление белка в колосьях злаковых культур // Тез. II съезда Всесоюз. общества физиологов растений, Минск-Москва, 1992, С. 51.

32. Стахов Л.Ф., Музафаров E.H., Стахова Л.Н. Средство, повышающее содержание Сахаров в томатах // Патент №5035752/04. F.01N 43/00,

33. Стахова Л.Н., Стахов Л.Ф. Тетрагидроптерины в восстановительных процессах метаболизма растений ' // Тез. Междунар. Конф. "Биоэнергетика фотосинтеза", Пущино, 1996, С. 54.

10.08.87.

1996.