Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие гамкергических механизмов рострального и каудального отделов вентральной респираторной группы в регуляции дыхания

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Участие гамкергических механизмов рострального и каудального отделов вентральной респираторной группы в регуляции дыхания"

На правах рукопис

005012863

Ковалёв Александр Михайлович

УЧАСТИЕ ГАМКЕРГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ РОСТРАЛЬНОГО И КАУДАЛЬНОГО ОТДЕЛОВ ВЕНТРАЛЬНОЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ГРУППЫ В РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 9 МАР 2012

Ульяновск - 2012

005012863

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Ведясова Ольга Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой адаптивной физической культуры ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Балыкин Михаил Васильевич

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии й физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет» Миняев Владимир Иванович

Ведущая организация:

ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН»

Защита состоится «20» апреля 2012 г. час. ^^ мин. на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, ул. Набережная реки Свияги, д. 106, корпус 1, ауд.703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом - на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru и на сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки РФ http://www.vak.ed.gov.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432017, г.. Ульяновск, ул. Л. Толстого, д. 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.

Автореферат разослан «[*■?■» марта 2012 года

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

С.В. Пантелеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эффективное решение проблемы центральных механизмов регуляции дыхания невозможно без выявления специфики нейро-медиаторной и нейромодуляторной организации взаимосвязей структур дыхательного центра (ДЦ) между собой и другими элементами контуров регуляции дыхательной системы (Сергиевский и др., 1993; Bianchi et al., 1995, 2009; Onímaru et al., 1995; Hilaire et al., 1999; Балыкин и др., 2001; Якунин и др., 2001; Попов, 2003; Feldman et al., 2003; Меркулова и др., 2007; Мирошниченко, Зин-ченко, 2008; Guyenet et al., 2009). Этот аспект нейрофизиологии дыхания в последние годы приобретает всё большую актуальность, в т.ч. в связи с необходимостью разработки методов фармакологической коррекции центральных нарушений дыхательной функции и проблемой управления дыханием в целом, и активно изучается многими исследователями (Пятин, Никитин, 1998; Zuperku et al., 2002; Миняев и др., 2004; Михайлова, 2004; Kinney et al., 2005; Инюшкин и др., 2007; Stuth et al., 2008; Сафонов, 2009; Noguésa, Benarroch, 2011). Как известно, в области ДЦ присутствуют многие нейромедиаторы, которые вовлечены в той или иной степени в регуляцию активности его нейросетей (Alheid et al., 2008; Stornetta, 2008; Ведясова и др., 2010). Показано, что особо значимыми для возникновения дыхательного ритма являются тормозные синаптические связи, при этом одна из важнейших ролей в центральной регуляции респираторного ритма в норме и патологии отводится ГАМК (Schmidt et al., 1996; Тихомирова, 2000; Bou-Flores et al., 2001; Busselberg et al., 2001; Dutschmann et al., 2002; Тараканов и др., 2005; Александрова и др., 2008).

К настоящему времени установлено, что ГАМК участвует в деятельности ритмогенных (Shao et al., 1997; Сафонов, Лебедева, 2003; Bongianni et al., 2010) и патгернформирующих структур ДЦ (Feldman et al., 2003), модулирует активность нейронных сетей, ответственных за генерацию нормального дыхания (Rybak et al., 2001) и его патологических форм (St-John et al., 1996; Тараканов, Сафонов, 2008). Показана роль ГАМК в механизмах функционирования респираторных нейронов ядра солитарного тракта (Yokota et al., 2008; Wang et al., 2010; Alheid et al., 2011), вентро-медуллярной области (Nattie, Li, 2001), комплексов Бётцингера и пре-Бётцингера (Shao, Feldman, 1997; Bongianni et al., 2010), а также выявлено, что ГАМК действует в ядрах ДЦ посредством ионо-тропных ГАМКд- и метаботропных ГАМКв-рецепторов (Yajima, Hayashi, 1999; Blackshaw et al., 2000).

Однако, в системе современных знаний о ГАМКергических механизмах респираторного контроля отсутствуют систематизированные сведения о роли ГАМК а- и ГАМКв-рецепторов в регуляции дыхания структурами вентральной респираторной группы (ВРГ). Вместе с тем, данная область ДЦ привлекает к себе внимание наличием разных классов нейронов с залповым типом активности, в том числе инспираторных, экспираторных и постинспираторных (В1апсЫ е1 а1., 1995; Ба^о е1 а1„ 2002; Ра1к, ЯекНпя, 2009;). Среди этих нейронов имеются как проприобульбарные нейроны (2ошщгапа « а1., 1997), участвующие в функциональном объединении ВРГ с другими структурами ДЦ, так и бульбоспи-нальные, непосредственно определяющие на выходе из ДЦ параметры ритма и паттерна дыхания (ЕИепЬе^ег, 1999). Понимание механизмов включения многочисленных нейронных систем ВРГ в процессы регуляции дыхания невозможно без выявления роли тормозных медиаторов и их рецепторов, в том числе мембранных рецепторов типа ГАМКа и ГАМКВ.

Цель исследования. Цель работы заключалась в изучении роли ГАМКа-и ГАМКв-рецепторов рострального и каудального отделов вентральной респираторной группы (рВРГ и кВРГ) ДЦ в центральных механизмах регуляции дыхания у взрослых крыс.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Изучить влияние микроинъекций растворов ГАМК в рВРГ и кВРГ на частотные и амплитудные параметры паттерна внешнего дыхания и абриса биоэлектрической активности инспираторных мышц.

2. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях активации ГАМКА-рецепторов рВРГ и кВРГ мусцимолом.

3. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях блокады ГАМКА-рецепторов рВРГ и кВРГ би-кукуллином.

4. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях активации ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ баклофеном.

5. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях блокады ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ 2-гидроксисаклофеном.

Научная новизна работы. В работе впервые проведён сравнительный анализ роли ГАМКцептивных механизмов в регуляции дыхания структурами функционально различных отделов ВРГ у половозрелых крыс. Продемонстрирована различная роль ГАМК в модуляции паттерна дыхания на уровне рВРГ и кВРГ, в т.ч. показано более выраженное тормозное влияние медиатора на частоту дыхания при микроинъекциях в рВРГ.

Получены новые данные о неоднозначной роли ГАМКа- и ГАМКВ-рецепторов рВРГ и кВРГ при их вовлечении в управление глубиной и частотой дыхания и регуляцию биоэлектрической активности инспираторной мускулатуры. В частности, установлено, что активация ГАМКА-рецепторов рВРГ мусци-молом способствует ускорению ритмики дыхания и сопровождается ростом его объёмных параметров, тогда как их блокада бикукуллином снижает частоту дыхательных движений и величину лёгочной вентиляции. Это указывает на участие ГАМКА-рецепторов в модуляции активности нейросетей, управляющих как ритмом, так и интенсивностью дыхания. Одновременно продемонстрирован факт выраженного увеличения глубины дыхания при микроинъекциях в кВРГ и рВРГ селективного агониста ГАМКв-рецепторов баклофена и отсутствия существенных изменений частоты дыхания при инъекциях их антагониста 2-гидроксисаклофена, что позволяет говорить о включении ГАМКв-рецепторов ВРГ в регуляцию преимущественно объёмных параметров паттерна дыхания и об их меньшей роли в модуляции респираторного ритма.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе новые сведения о характере и особенностях респираторных реакций после введения ГАМК-позитивных и ГАМК-негативных веществ в функционально специфические отделы ВРГ имеют существенное значение в плане развития и конкретизации теоретических представлений о нейрохимических механизмах регуляции дыхания. Выявленные особенности динамики внешнего дыхания и залповой активности дыхательных мышц на фоне блокады и активации ГАМКа- и ГАМКв-рецепторов кВРГ и рВРГ у половозрелых крыс позволяют рассматривать ГАМКергическую систему как важнейший вид нейротрансмиссии, вовлечённой в функционирование паттернформирующих нейронных сетей ДЦ. Установленные различия в респираторных эффектах активации и блокады ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ важны для понимания нейрохимических основ респираторного ритмогенеза и регуляции паттерна дыхания, закономерностей формирования и обработки афферентации, поступающей в различные от-

делы ДЦ. Результаты проведённого исследования расширяют современные знания о влиянии ГАМК на деятельность ДЦ, демонстрируя новые стороны дифференцированного участия отделов ВРГ в регуляции дыхания.

Результаты работы имеют также практическое значение для нейрофарма-кологии и медицины, так как способствуют пониманию механизмов формирования и разработке методов коррекции нарушений дыхания центрального генеза (в т. ч. связанных с дисфункциями нейротрансмитгерных систем), таких как синдром внезапной смерти во сне, апноэ во время сна, синдром врождённой ги-повентиляции. Полученные данные могут найти практическое применение в исследовательской работе нейрофизиологов и нейрохимиков, при создании способов управления дыханием в экспериментах, связанных с решением проблемы функционирования нейромедиаторных и нейромодуляторных систем мозга.

Внедрение результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы, включая данные о респираторных эффектах ГАМК, её агони-стов и антагонистов, а также полученные сведения о различной роли ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ в механизмах регуляции паттерна дыхания, внедрены в учебный процесс и используется в научно-исследовательской работе кафедры анатомии, физиологии и гигиены ФГБОУ ВПО «Поволжской социально-гуманитарной академии».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Микроинъекции ГАМК в рВРГ и кВРГ вызывают респираторные эффекты преимущественно тормозного типа, характер и выраженность которых зависит от действующей концентрации медиатора.

2. Реализация респираторных эффектов ГАМК в области ВРГ опосредуется ГАМКд- и ГАМКв-рецепторами, которые характеризуются неравномерным представительством и различной ролью в механизмах регуляции дыхания на уровне рВРГ и кВРГ.

3. ГАМКд-рецепторы рВРГ преимущественно участвуют в механизмах регуляции временных параметров паттерна дыхания, вызывая при своей активации модуляцию скорости респираторного ритма за счёт уменьшения длительности обеих фаз дыхательного цикла.

4. ГАМКд-рецепторы кВРГ вовлечены в регуляцию как амплитудных, так и временных параметров дыхания и играют особую роль в механизмах формирования выдоха.

5. ГАМКв-рецепторы на уровне рВРГ и, особенно, кВРГ играют первостепенную роль в модуляции активности паттернформирующих механизмов, ответственных, главным образом, за объёмные параметры паттерна внешнего дыхания и амплитуду залповой активности дыхательных мышц.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007); VI Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 50-летию открытия A.M. Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008); XI медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье. Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008); XI школе-семинаре «Экспериментальная и клиническая физиология дыхания» (Репино, 2010); XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова РАН (Калуга, 2010); I Всероссийской с международным участием научно-практической конференции «Наука, образование, медицина» (Самара, 2011); отчётных конференциях преподавателей и сотрудников Самарского государственного университета (Самара 2009, 2010, 2011); расширенном заседании кафедры физиологии человека и животных Самарского государственного университета (Самара, 2011); расширенном заседании кафедры физиологии и патофизиологии ульяновского государственного университета (Ульяновск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка использованных источников, изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 56 рисунков, 4 таблицы и 3 приложения. Список использованных источников включает 260 наименований, в том числе 203 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в острых опытах на 90 беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 250-350 г, наркотизированных уретаном (1,6 г/кг; внутрибрюшинно), у которых методами спирографии и электромиографии изучали респираторные реакции на локальное введение ГАМК, её агонистов и

антагонистов в рВРГ и кВРГ. В предэксиерименальном периоде и в процессе эксперимента соблюдали все биоэтические нормы обращения с лабораторными животными в соответствии с Правилами лабораторной практики в РФ, утверждёнными приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003.

В ходе операционной подготовки проводили трахеотомию, в трахею животного вводили пластиковую канюлю. Доступ к ДЦ осуществляли от дорсальной поверхности продолговатого мозга. Для этого делали разрез кожи на уровне большого затылочного отверстия, раздвигали мышцы и удаляли атланто-окципитальную мембрану. С целью регистрации биоэлектрической активности наружных межрёберных мышц (НММ) и диафрагмы на правом боку животного делался разрез кожи от II-III межреберья до нижнего края грудной клетки. После окончания всех хирургических процедур животное располагали в стерео-таксическом приборе СЭЖ-3 и фиксировали голову в положении вентрального сгибания.

Растворы веществ (ГАМК, 10"4 М и 10"5 М; мусцимол, 10"6 М; бикукуллин, 10"6 М; баклофен, 10"6 М; 2-гидроксисаклофен, 10"6 М; Sigma-Aldrich, Company Ltd) вводили в отделы ВРГ путём микроинъекций через стеклянную канюлю (диаметр кончика 15-20 мкм), укреплённую на игле микрошприца МШ-1 (цена деления 0,02 мкл). Растворы готовили ex tempore разведением в искусственной спинномозговой жидкости (ИСМЖ) и вводили в объёме 0,2 мкл в рВРГ и кВРГ в соответствии со стереотаксическими координатами (Chitravanshi, Sapru, 1999). Кончик канюли удерживали в мозге в течение всего времени регистрации во избежание распространения вещества вверх по треку. В контрольных опытах по той же методике вводили ИСМЖ. Место микроинъекции контролировалось гистологически на поперечных срезах продолговатого мозга.

Регистрацию паттерна внешнего дыхания проводили методом спирографии. Для этого соединяли канюлю, введённую в трахею животного, с миниатюрным спирографом, сигнал от которого подавался на аналогово-цифровой преобразователь и отображался на экране монитора компьютера. Регистрацию биоэлектрической активности (электромиограмму, ЭМГ) диафрагмы и НММ (VI—VIII межреберья) осуществляли биполярными стальными игольчатыми электродами (межэлектродное расстояние 4 мм), подсоединёнными к миографическому усилителю. ЭМГ (в виде кривых суммарной электроактивности и их интегрированных производных) и спирограммы записывали в программах «Rats» и PowerGraph 3.2 Professional (ООО "Интероптика-С") в исходном со-

стоянии, через 1, 3, 5 и далее через каждые 5 минут в течение получаса (опыты с ГАМК) и часа (опыты с агонистами и антагонистами ГАМК) после микроинъекции растворов в ВРГ.

На спирограммах определяли общую продолжительность дыхательного цикла (мс), длительность вдоха (Ti, мс) и выдоха (Те, мс) и дыхательный объём (ДО, мл), рассчитывали частоту дыхания (ЧД, мин"1) и минутный объём дыхания (МОД, мл/мин). На ЭМГ оценивали среднюю длительность залпа (мс), длительность межзалпового интервала (мс) и амплитуду залповых разрядов (отн. ед.). Поскольку в контрольных опытах с введением в ВРГ ИСМЖ достоверных реакций не отмечалось, то все изменения, наблюдаемые у опытных животных, сопоставляли с параметрами спирограмм и ЭМГ в исходном состоянии.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного пакета SigmaStat 3.5 (Jandel Scientific, USA) с использованием теста ANOVA, тестов Dunnett's, Tukey, парного t-теста Стьюдента. Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Респираторные эффекты микроинъекций ГАМК в рВРГ

Микроинъекции растворов ГАМК в рВРГ вызывали изменения параметров паттерна дыхания и ЭМГ дыхательных мышц, характер которых в определённой степени зависел от действующей концентрации медиатора. Главной особенностью действия ГАМК было уменьшение ЧД, которое доминировало при микроинъекции раствора высокой концентрации (10"* М) и составляло 20,5% (р<0,001; ANOVA) от исходного уровня. Разная выраженность тормозного действия 10"5 и КГ4 М растворов ГАМК обуславливалась отличиями в динамике фазовой структуры дыхательного цикла (рис. 1). Так, длительность вдоха в случае введения 10"5 М раствора укорачивалась на 14,0% (р<0,01; ANOVA), а инъекция 10"4 М раствора, напротив, пролонгировала инспираторную фазу на 31,8% (р<0,05; ANOVA). Длительность выдоха независимо от концентрации возрастала. Выраженность этого эффекта увеличивалась по ходу экспозиции и составляла 22,8% (р<0,01; ANOVA) и 28,6% (р<0,01; ANOVA) соответственно при инъекции 10'5 и 10"4 М растворов.

и на следующих рисунках * - р<0,05, **-р<0,01, ***-р<0,001

Вероятно, повышение содержания ГАМК в области рВРГ вызывает угнетение механизмов регуляции длительности не только выдоха, но и вдоха, что может быть связано с вовлечением в развивающееся торможение обширных групп инспираторных и экспираторных проприобульбарных и премоторных нейронов других областей ДЦ. сходные респираторные эффекты при активации ГАМКергической системы отдельных областей ДЦ отмечали в своих работах другие исследователи (Тараканов и др., 1999; Тихомирова, 2000; Тарасова, 2005; Moreira et al., 2011).

Одновременно обнаружено, что 10"5 и 10"4 М растворы ГАМК вызывали различные по направленности изменения объёмов внешнего дыхания и амплитудных параметров ЭМГ инспираторных мышц. В частности, большая концентрация медиатора уменьшала ДО и МОД на 11,1% и 26,3% (р<0,01; Tukey test), а меньшая - увеличивала их на 28,7% и 25,0% соответственно (рис. 1). Необходимо подчеркнуть, что изменение МОД при действии 10"4 М раствора происходило за счёт уменьшения ЧД и ДО, а при введении 10"5 М раствора - за счёт увеличения ДО.

Незначительное снижение ДО, свидетельствующее об уменьшении силы сокращений дыхательных мышц, в случае введения 10"4 М раствора ГАМК, на наш взгляд, объясняется разнонаправленностью отклонений амплитуды ЭМГ диафрагмы (уменьшение) и НММ (увеличение). В свою очередь, рост ДО, отмечаемый при действии на рВРГ Ю-5 М раствора ГАМК, коррелировал с ростом амплитуды разрядов обоих видов инспираторных мышц в среднем на 45,7%

(р<0,05; парный t-test). Наблюдаемые реакции дают основание считать, что при действии ГАМК на рВРГ имеет место тормозная модуляция активности премо-торных инспираторных нейронов амбигуального ядра которая может быть опосредована ГАМКА-рецепторами (Yajima, Hayashi, 1999). Однако усиление тормозного эффекта при воздействии высокой концентрации ГАМК свидетельствует, что в этих условиях могут активироваться все классы ГАМК-рецепторов, присутствующих в изучаемой области ДЦ и участвующих в пре- и постсинап-тическом торможении респираторных нейронов. Ранее установлено, что многие проприобульбарные ранние и поздние инспираторные, постинспираторные нейроны ДЦ, включая ВРГ, являются ГАМКергическими и, в свою очередь получают ГАМКергические входы, например, из комплексов Бётцингера и преБёт-цингера (Ezure et al., 2003). За счет этих реципрокных ГАМКергических тормозных связей (Yajima, Hayashi, 1999; Okazaki et al., 2001; Zimmer, Goshgarian, 2007) может подавляться активность инспираторных нейронов рВРГ, в т.ч. про-приобульбарных, регулирующих ритмогенез, и бульбоспинальных, контролирующих залповую активность мотонейронов диафрагмы и интеркостальных мышц и силу их сокращений, о чём можно судить по уменьшению лёгочной вентиляции.

2. Респираторные эффекты микроинъекций ГАМК в кВРГ

Отличительной особенностью воздействия ГАМК на кВРГ являлось закономерное увеличение объёмных показателей внешнего дыхания в прямой зависимости от действующей концентрации медиатора (рис. 2). Причём, наибольшие изменения ДО формировались в поздние сроки экспозиции (на 20-25-й мин), что, предположительно, может быть связано с более широким представительством в кВРГ метаботропных ГАМКв-рецепторов, и по своей интенсивности практически не различались при действии большой и малой концентраций -19,3% и 21,3% (р<0,05; парный t-test) соответственно. Отмеченная тенденция совпадала с динамикой изменений амплитуды разрядов дыхательных мышц, которые отличались большей закономерностью на ЭМГ диафрагмы и проявлялись увеличением на 39,6% (р<0,01; парный t-test) при инъекциях 10"4 М и 31,4% (р<0,05; парный t-test) при инъекциях 10"5 М растворов. Эффект увеличения амплитудных показателей ЭМГ НММ достоверно проявлялся только под влиянием 10"4 М раствора ГАМК (27,2%; р<0,05; парный t-test).

[□Те ИЧД ИДО |рТе ИЧД ИДО

Рис. 2. Изменения (в % от исходного уровня) параметров паттерна дыхания при микроинъекциях 10"4 М (А) и 10"5 М (Б) растворов ГАМК в кВРГ

Характерно, что инъекции ГАМК в кВРГ не приводили к заметным изменениям длительности вдоха, тогда как выдох достоверно менялся в зависимости от концентрации медиатора. Так, 10"4 М раствор ГАМК сокращал длительность экспирации в среднем на 13,5% (р<0,05; ANOVA). Действуя в концентрации 10"5 М, ГАМК вызывала тенденцию роста длительности выдоха, приобретавшего наиболее закономерный характер к концу экспозиции, когда было зарегистрировано максимальное увеличение (24,3%; р<0,05; парный t-test). Наблюдаемые особенности преобразования фазовой структуры дыхательного цикла, вероятно, являются следствием того, что в кВРГ численность инспираторных нейронов невелика и доминируют экспираторные нейроны (Hilaire, Duron, 1999; Ezure, Tanaka, 2003).

Изменения ЧД зависели от изменений длительности выдоха. При этом раствор медиатора в концентрации 10 М увеличивал ЧД на 10,3% (р<0,05; ANO VA), тогда как при введении раствора 10"5 М изменения носили колебательный и недостоверный характер (рис. 2, Б). Вышеотмеченное увеличение ДО на этом фоне может быть отражением компенсаторной реакции в ответ на снижение ЧД при активации ГАМКцептивных элементов кВРГ. Наблюдаемые эффекты свидетельствуют о том, что усиление ГАМКергической передачи в области ВРГ угнетает не только ритмогенные, но и паттернформирующие механизмы ДЦ. Это в известной мере совпадает с мнением исследователей, отмечавших, что активация ГАМКергической системы в ДЦ может нарушать эйпно-этический паттерн дыхания и приводить к формированию его патологических

типов (Kaczynska, Szereda-Przestaszewska, 2002; Тараканов, Сафонов, 2008; Кс, Martin, 2010).

3. Респираторные эффекты активации и блокады ГАМКд-рецепторов рВРГ

Для конкретизации роли ГАМКА-рецепторов в опосредовании респираторных реакций, вызываемых ГАМК, были поставлены эксперименты с введением в рВРГ и кВРГ 10"ЛМ растворов агониста и антагониста данного класса рецепторов мусцимола и баклофена соответственно.

1 5 10 20 30 40 50 60 1 5 10 20 30 40 50 60

¡□Ti Ш Те идо! !□ Ti ЕЗТе ИДО [

Рис. 3. Изменения (в % от исходного уровня) параметров паттерна дыхания после микроинъекций 10"6М растворов мусцимола (А) и бикукуллина (Б) в рВРГ

Характерный эффект активации ГАМКА-рецепторов рВРГ мусцимолом заключался в уменьшении длительности обеих фаз дыхания (рис. 3, А). К 20-й мин экспозиции вдох укорачивался с 226,7±12,71 мс до 180,7±10,73 мс (20,3%; р<0,05; парный t-test), что свидетельствует о том, что селективная активация ГАМКд-рецепторов рВРГ меняет интенсивность центральной инспираторной активности, возможно, за счёт торможения синаптической передачи возбуждения к инспираторным нейронам амбигуального ядра и параамбигуальной области продолговатого мозга, входящим в состав рВРГ. Фаза выдоха уменьшалась от 554,7±3,71 мс до 438,0±16,04 мс (21,0%; р<0,01; ANOVA), причём этот эффект имел более пролонгированный характер. ЧД на этом фоне увеличивалась на 19,5% (р<0,05; ANO VA) в диапазоне от 78,9±2,02 до 94,3±3,22 циклов/мин, что по времени и степени отклонений совпадало с ростом ДО и МОД.

Изменениям спирограмм соответствовали реакции дыхательных мышц. В частности, действие мусцимола уменьшало межзалповые интервалы на ЭМГ

НММ (на 33,5%; р<0,05; парный Мев^ и диафрагмы (на 20,2%; р<0,05; парный Мее!), а также длительность самих инспираторных залпов, что особенно было характерно для НММ (11,5%; р<0,05; парный Мее!) (рис. 4).

А Б В Г

Рис. 4. Суммарные и интегрированные ЭМГ НММ до и в разные сроки после микроинъекции 10"6 М растворов мусцимола (А) и бикукуллина (Б) в рВРГ. На гистограммах: изменение (мс) длительности залпов (В) и межзалповых интервалов (Г) биоэлектрической активности НММ после микроинъекций раствора бикукуллина в рВРГ

На основании характера респираторных реакций при введении мусцимола и их сравнительного анализа с эффектами микроинъекций ГАМК, можно говорить, что при активации ГАМКА-рецепторов рВРГ включаются механизмы торможения вдоха и, хотя и в меньшей степени, выдоха, что проявляется в ускорении смены фаз дыхания.

Воздействие на область рВРГ ГАМКд-блокатора бикукуллина меняло большинство параметров ЭМГ инспираторных мышц (рис. 4, Б-Г) и паттерна дыхания противоположно эффектам введения мусцимола (рис. 3, Б). В частности, бикукуллин вызвал увеличение длительности выдоха на 22,4% (р<0,001; А?ГОУА) и практически не влиял на фазу вдоха. ЧД при этом закономерно уменьшалась на 15,1% (р<0,001; АЫОУА). Также в отличие от мусцимола, бикукуллин не менял глубины дыхания. С учётом этого можно считать, что наблюдаемое на фоне блокады ГАМКА-рецепторов рВРГ уменьшение МОД (на 16,2%; р<0,05; парный Мее!), в первую очередь, было обусловлено ослаблением активности нейросетей, контролирующих частоту дыхания.

Оценивая реакции дыхательных мышц, следует указать, что более выражено на блокаду ГАМКА-сайтов рВРГ реагировали НММ. Длительность залпов активности НММ увеличивалась на 11,0% (р<0,05; парный Мее!), а межзалповых интервалов - на 31,9% (р<0,05; парный Иеэ!) (гистограммы В и Г, рис. 4).

Эти реакции сопровождались ростом амплитуды осцилляций НММ, в то время как амплитуда осцилляций диафрагмы уменьшалась.

Полученные данные свидетельствуют, что ГАМКА-рецепторы рВРГ у крыс преимущественно участвуют в функционировании респираторных нейро-сетей, регулирующих частотные параметры паттерна дыхания. При этом, допустимо считать, что стимуляция ГАМКА-рецепторов рВРГ мусцимолом вызывает торможение, в первую очередь, ранних инспираторных нейронов, обладающих способностью ингибировать активность экспираторных премоторных клеток кВРГ и поздних инспираторных нейронов дорсальной респираторной группы (В1апсЫ е! а1., 1995; ОиШп, 2004), и гораздо в меньшей степени влияет на состояние экспираторных нейронов рВРГ (Сафонов, 2004).

4. Респираторные эффекты активации и блокады ГАМКд-рецепторов кВРГ

Микроинъекции мусцимола и бику-куллина в область кВРГ вызывали менее значительные изменения паттерна внешнего дыхания и абриса биоэлектрической активности дыхательных мышц, по сравнению с воздействием на рВРГ.

Установлено, что мусцимол существенно не влиял на длительность вдоха, тогда как выдох на протяжении всего периода наблюдений достоверно укорачивался на 16,3% (р<0,05; парный Нее!), что обусловливало увеличение ЧД на 13,0% (р<0,05, парный МевО (рис. 5). ДО при действии мусцимола на кВРГ неравномерно уменьшался в среднем 10,7%, а МОД, наоборот, увеличивался на 17,6% (р<0,01; парный Мее!), что объясняется направленностью отклонений ЧД. Биоэлектрическая активность НММ и диафрагмы после введения мусцимола в кВРГ менялась с различной выраженностью. Длительность залповых разрядов обеих инспираторных мышц уменьшалась, однако этот эффект доминировал на ЭМГ диафрагмы. Определённые различия между реакциями НММ и диафрагмы наблюдались также в изменениях амплитудных параметров ЭМГ.

*

ид

^ И^П мин

%

30 20 10 0 -101 -20-

Те ЧД ДО

□ мусцимол Ибикукуллин

Рис. 5. Максимальные отклонения (в % от исх. уровня) параметров паттерна внешнего дыхания после микроинъекции 10"6 М растворов мусцимола и бикукуллина в кВРГ

Респираторные эффекты, вызываемые блокадой ГАМКА-рецепторов кВРГ бикукуллином, проявились умеренными по выраженности изменениями временных и более заметными отклонениями амплитудных показателей внешнего дыхания (рис. 5). Типичное для воздействия бикукуллина на кВРГ небольшое пролонгирование вдоха сочеталось с существенным увеличением ДО, который нарастал максимально на 40-й мин регистрации (на 20,3%; р<0,05; парный X-

Длительность выдоха также увеличивалась, достигая наибольших значений на 25-й мин после инъекции (15,3%; р<0,05, парный Мее!). Динамика фазовой структуры дыхательного цикла приводила к уменьшению ЧД, в среднем на 10,2%, однако, несмотря на это, МОД увеличивался на 19,0%, что обусловливалось ростом значений ДО. Следует отметить, что данная реакция по своей направленности имела характер, прямо противоположный эффекту, наблюдаемому при блокаде ГАМКА-рецепторов рВРГ, что отражает различный вклад ГАМКергических механизмов в регуляцию частоты и глубины дыхания нейро-сетями функционально специфических областей ДЦ.

Блокада ГАМКА-рецепторов кВРГ увеличивала межзалповые интервалы на ЭМГ НММ и диафрагмы, что соответствовало пролонгированию экспираторной фазы. Изменения залповых разрядов на этом фоне отличались нестабильностью, что могло служить причиной отмеченных выше незначительных изменений фазы вдоха. Амплитуда разрядов, напротив, равномерно возрастала в течение всей экспозиции, а максимум её изменений во времени соответствовал максимальному увеличению ДО. Это указывает на увеличение силы сокращений инспираторных мышц, обусловленное, вероятно, устранением тормозных влияний эндогенной ГАМК на бульбоспинальные респираторные нейроны кВРГ (в силу блокады ГАМКА-рецепторов бикукуллином) с последующим рекрутированием спинальных мотонейронов дыхательных мышц. Считаем, что именно этот механизм определял прирост дыхательного объёма и обеспечивал увеличение вентиляции лёгких, несмотря на снижение частоты дыхания.

Полученные экспериментальные данные демонстрируют, что ГАМКа-цептивные механизмы, представленные в районах рВРГ и кВРГ, принимают участие в респираторном контроле, при этом различным образом включаясь в процессы регуляции частотных и амплитудных параметров электроактивности дыхательных мышц и, как результат этого, в управление ритмом и интенсивностью внешнего дыхания.

5. Респираторные эффекты активации и блокады ГАМКв-рецепторов рВРГ

С целью изучения вовлечённости ГАМКв-рецепторов в регуляцию дыхания на уровне ВРГ были поставлены опыты с микроинъекциями их селективного агониста баклофена и конкурентного антагониста 2-гидроксисаклофена. А Б

/\J\^J\J\J\J\J\У чех '/t/iAA/vAAW^ исх

ЛЛЛЛЛЛЛЛУ\.15мин A-/v/w\yv/vy\yvyv/ 15мин

АЛЛЛЛЛЛЛЛЛ 30 MUH AAAAAATW^ 30 MUH

кЛЛЛЛЛЛААЛА45 мин лу\А/\^\АУ\АУ\А. 45 мин 1 мл [VvUvlAAAAAAy во мин 1 мл \ ЛЛЛАЛЛЛЛЛЛ 60 мин

1 С 1 С

Рис. 6. Изменения внешнего дыхания после микроинъекции 10'6 М растворов баклофена (А) и 2-гидроксисаклофена (Б) в рВРГ

Микроинъекции баклофена в рВРГ вызывали респираторные эффекты, которые по направленности отклонений в целом совпадали с реакциями на активацию ГАМКА-рецепторов, но по некоторым показателям имели заметно большую выраженность. Так, действуя на уровне рВРГ, баклофен в большей степени влиял на амплитудные параметры паттерна дыхания (рис. 6, А). Величина ДО нарастала весьма существенно, к концу экспозиции эффект достигал 54,0% (р<0,001; Tukey test) от исходного уровня. Величина МОД увеличивалась на 89,5% (р<0,001; ANO VA). Столь значительному росту вентиляции лёгких способствовал также эффект учащения дыхания (на 27,7%; р<0,05; парный t-test). Что касается фазовой структуры дыхательного цикла, то введение баклофена в рВРГ укорачивало обе фазы, однако, длительность экспирации уменьшалась в 2 раза сильнее (27,2%; р<0,05; парный t-test), чем инспирации (12,2%; р<0,05; парный t-test).

Характерно, что эти реакции развивались постепенно, достигая максимума к концу экспозиции, что может быть связано с тем, что ГАМКв-рецепторы являются метаботропными, т.е. более «медленными», чем ионотропные ГАМКд-рецепторы. Возможным механизмом развития такой реакции является усиление тонического ГАМКергического торможения, опосредованного активацией ГАМКв-рецепторов (Семьянов, 2002; Scanziani, 2000).

Укорочение фаз дыхательного цикла у животных сочеталось с уменьшением временных параметров ЭМГ дыхательных мышц. В частности, межзалповые интервалы на ЭМГ НММ и диафрагмы достоверно сокращались в среднем на 28,7%, а инспираторные залпы - на 18,8% (р<0,001; парный Мее!). Достоверные отклонения амплитудных параметров были зарегистрированы только на ЭМГ диафрагмы (увеличение на 17,5%; р<0,05; АМОУА).

Действие 2-гидроксисаклофена на рВРГ, в первую очередь, приводило к сокращению длительности вдоха (13,4%; р<0,05; парный МеэО. Выдох менялся бифазично: на первых минутах регистрации увеличивался в среднем на 9,0%, а к концу - укорачивался на 15,2% (р<0,05; парный Мее!). Последний эффект приводил к увеличению ЧД на 13,7% (р<0,05; парный Мез^. В то же время инъекции 2-гидроксисаклофена практически не влияли на изменение объёмных параметров паттерна дыхания, а наблюдаемое к концу экспозиции увеличение ДО и МОД (рис. 6, Б) не имело достоверного характера.

Блокада ГАМКв-рецепторов рВРГ 2-гидроксисаклофеном также не отражалась существенно на длительности залпов активности инспираторных мышц, тогда как межзалповые интервалы на ЭМГ, напротив, менялись в значительных пределах. Их значения у НММ и диафрагмы в первые 5 минут после инъекции увеличивались на 8,3% и 15,3% соответственно, а к концу экспозиции одинаково уменьшались в среднем на 31,2%, но эти изменения не носили достоверного характера.

С учётом особенностей изменений отдельных параметров паттерна дыхания и ЭМГ дыхательных мышц при инъекциях ГАМКд и ГАМКВ агонистов и антагонистов в рВРГ, допустимо считать, что ГАМКв-рецепторы этой области ДЦ менее широко, чем ГАМКд-сайты, включены в механизмы ГАМКергической регуляции дыхания.

6. Респираторные эффекты активации и блокады ГАМКв-рецепторов кВРГ

Наиболее характерной реакцией со стороны внешнего дыхания при локальных введениях баклофена в кВРГ было увеличение амплитудных параметров спирограммы, однако, менее выраженное, чем при воздействии на рВРГ. Так, ДО максимально увеличивался в данной серии экспериментов на 58,9% (р<0,01; парный МевО, а ЧД возрастала не более, чем на 11,9%. МОД увеличивался на 76,0% (р<0,01; парный Мее!). Следует отметить, что эти изменения почти в 4 раза превышали эффекты, вызываемые активацией ГАМКд-

рецепторов мусцимолом. Типичным эффектом на введение баклофена в кВРГ было укорочение времени выдоха (на 15,8%; р<0,05; парный МеБО, тогда как длительность вдоха практически не изменялась (рис. 7, А).

1 5 10 20 30 40 50 60 1 5 10 20 30 40 50 60

|DTi И Те идо] [oTi И Те ■ ДО [

Рис. 7. Изменения (в % от исходного уровня) параметров паттерна дыхания после микроинъекций баклофена (А) и 2-гидроксисаклофена (Б) в кВРГ

Фазовой перестройке дыхательного цикла при активации ГАМКв-рецепторов кВРГ баклофеном соответствовали изменения межзалповых интервалов на ЭМГ обеих инспираторных мышц, которые синхронно укорачивались на 18,6% (р<0,05; парный t-test) в случае НММ и на 25,4% (р<0,05; парный t-test) в случае диафрагмы. Амплитуда инспираторных разрядов закономерно j увеличивалась на ЭМГ НММ в течение всей экспозиции, с максимальным приростом на 18,1% (р<0,05; парный t-test), что свидетельствует об активации мотонейронов именно НММ. Возможно, это связано с усилением активности инспираторных премоторных нейронов рВРГ при стимуляции ГАМКв-рецепторов данного отдела ДЦ.

Стимулирующее влияние баклофена на глубину дыхания при его инъекциях в кВРГ может объясняться преимущественной активацией пресинаптиче-ских ГАМКв-рецепторов, которые при своём возбуждении подавляют высвобождение ГАМК в тормозных синапсах за счёт ингибирования аденилатциклазы и уменьшения входа ионов Са++ в пресинаптическое окончание (Семьянов, 2002; Bettler et al., 2004; Калуев, 2006). Следует также учитывать, что ГАМКВ-рецепторы на уровне ВРГ могут быть представлены двумя подклассами, образованными различными формами субъединицы R1 (ГАМКви и ГАМКВ1ь), что может отражаться на их фармакологических характеристиках (Vigot et al., 2006) и проявляться специфическими респираторными эффектами при их активации и блокаде.

В частности, как видно из рис. 7 (Б), при действии на кВРГ ГАМКВ-антагониста 2-гидроксисаклофена (в отличие от агониста) длительность вдоха уменьшалась (максимально на 16,6% в интервале от 207,6± 12,09 мс до 173,2±16,50 мс; р<0,05; парный Меэ!), тогда как выдох и ДО практически не менялись. При этом особый интерес вызывает отсутствие изменений ДО, позволяющее считать, что при блокаде ГАМКв-рецепторов кВРГ устраняются определённые центрогенные влияния, модулирующие активность механизмов регуляции глубины дыхания. С учётом специфики респираторных реакций на блокаду ГАМКв-рецепторов кВРГ и доминирования изменений амплитудных параметров внешнего дыхания и ЭМГ инспираторных мышц при активации этих рецепторов, допустимо считать, что в реальных условиях жизнедеятельности ГАМКв-рецепторы в области ВРГ обеспечивает модуляцию активности, главным образом, бульбоспинальных инспираторных и экспираторных нейронов, контролирующих силу сокращений дыхательной мускулатуры и, таким образом, глубину дыхания.

ВЫВОДЫ

1. Микроинъекции ГАМК в рВРГ вызывают дозозависимое уменьшение частоты дыхания, обусловленное пролонгированием экспираторной и инспира-торной фаз в полном соответствии с динамикой временных параметров электроактивности дыхательных мышц. Этот эффект в сочетании с разнонаправленными отклонениями дыхательного объёма при действии разных концентраций ГАМК свидетельствует о преимущественном её участии на уровне рВРГ в тормозной модуляции респираторного ритма.

2. Локальное введение ГАМК в кВРГ с большей закономерностью меняет объёмные показатели паттерна внешнего дыхания, на что указывает увеличение дыхательного объёма и амплитуды залповых разрядов диафрагмы и интеркостальных мышц, заметно превышающее отклонения временных параметров спи-рограмм и электроактивности дыхательных мышц.

3. Микроинъекции мусцимола в рВРГ приводят к увеличению частоты дыхания за счёт укорочения времени вдоха и выдоха, тогда как введение бику-куллина вызывает прямо противоположные реакции, что указывает на важную роль ГАМКд-рецепторов рВРГ в модуляции активности механизмов, контролирующих продолжительность обеих фаз дыхательного цикла.

4. Введение агониста и антагониста ГАМКд-рецепторов в кВРГ изменяет как частотные, так и амплитудные параметры дыхания, при этом мусцимол вызывает уменьшение дыхательного объёма и увеличение частоты дыхания, а би-кукуллин увеличивает дыхательный объём и снижает его частоту. Изменения последней в обоих случаях обусловлены преимущественными отклонениями длительности фазы выдоха, что свидетельствует о вовлечении ГАМКд-рецепторов кВРГ в функционирование экспираторных нейросетей.

5. Агонист ГАМКв-рецепторов баклофен при микроинъекциях в рВРГ и кВРГ вызывает сходные реакции в виде укорочения фаз дыхательного цикла и увеличения частоты дыхания в сочетании с существенным ростом его глубины. ГАМКв-антагонист 2-гидроксисаклофен вызывает менее выраженные изменения частотных показателей паттерна дыхания, за исключением фазы выдоха, и практически не влияет на его объёмные параметры. Наблюдаемые реакции могут быть связаны с преимущественным участием ГАМКв-рецепторов ВРГ, особенно её каудального отдела, в регуляции амплитудных характеристик паттерна дыхания.

6. Характер респираторных реакций, вызываемых введением в разные отделы ВРГ активаторов и блокаторов ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов, свидетельствует об их неравномерном представительстве и различной роли в механизмах регуляции дыхания на уровне рВРГ и кВРГ.

Список публикаций по теме диссертации

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Ведясова O.A., Романова И.Д., Ковалёв A.M. Пути включения миндалины и поясной извилины в центральные механизмы регуляции дыхания // Известия Самарского научного центра РАН. 2009. Т. 11. № 1 (14). С. 765-768.

2. Ведясова O.A., Ковалёв A.M. Реакции дыхания на микроинъекции гам-ма-аминомасляной кислоты в ядра вентральной респираторной группы // Вестник Тверского государственного университета. Серия Биология и Экология. 2009. № 13(25). С. 17-24.

3. Ковалёв A.M., Ведясова O.A., Сафонов В.А., Тараканов И.А. Роль ГАМКв-рецепторов в регуляции паттерна дыхания структурами вентральной респираторной группы // Вестник Удмуртского государственного университета. Серия Биология. Науки о земле. 2011. № 2. С. 110-115.

4. Ведясова O.A., Ковалёв A.M. Реакции дыхания на микроинъекции ГАМК и пенициллина в различные отделы вентральной респираторной группы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т. 153. № 2. С. 137-140.

Монографии

5. Ведясова O.A., Романова И.Д., Ковалёв A.M. Механизмы регуляции дыхания структурами лимбической системы. Самара: Изд-во «Самарский университет», 2010. 170 с.

Публикации в других изданиях

6. Ведясова O.A., A.M. Ковалев Респираторные эффекты при микроинъекциях гамма-аминомасляной кислоты и бикукуллина в область вентральной респираторной группы у крыс // Вестник Самарского государственного университета. 2007. № 8 (58). С. 294-303.

7. Ведясова O.A., Ковалев A.M. Участие ГАМКергических механизмов в регуляции дыхания на уровне дорсальной и вентральной респираторных групп // Механизмы функционирования висцеральных систем: материалы V Всероссийской конференции с международным участием. С.-Пб, 2007. С. 64-65.

8. Ковалев A.M. Участие ГАМК в регуляции дыхания на уровне каудально-го и рострального отделов вентральной респираторной группы // Механизмы функционирования висцеральных систем: материалы VI Всероссийской конференции с международным участием, поев. 50-летию открытия A.M. Уголевым мембранного пищеварения. С.-Пб, 2008. С. 88-89.

9. Ковалёв A.M., Ведясова O.A. Участие ГАМКергических механизмов области вентральной респираторной группы в регуляции дыхания у крыс // VI Сибирский физиологический съезд: тезисы докладов. Барнаул, 2008. Т. 1. С. 14-15.

10. Ковалёв, A.M. Респираторные реакции при микроинъекциях ГАМК в область обоюдного ядра у крыс // Фундаментальная наука и клиническая медицина: материалы одиннадцатой медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». С-Пб.: Изд-во СПбГУ, 2008. С. 152— 153.

11. Ковалев A.M. Изменение паттерна дыхания при микроинъекциях ГАМК и бикукулина в ростральный и каудальный отделы вентральной респираторной группы у крыс // Тридцать девятая научная конференция СамГУ: тезисы докладов. Самара: Изд-во «Самарский университет», 2008. С. 82.

12. Ковалёв A.M., Маньшина Н.Г. Реакции дыхания при блокаде ГАМКцептивных структур функционально различных ядер дыхательного цен-

тра у крыс // Механизмы функционирования висцеральных систем: материалы VII Всероссийской конференции с международным участием. С.-Пб, 2009. С. 202-203.

13. Ковалёв A.M., Ведясова O.A., Маньшина Н.Г. Роль ГАМКцептивных структур вентральной респираторной группы в регуляции паттерна дыхания // XXI съезд физиологического общества имени И.П. Павлова: материалы. М. -Калуга, 2010. С. 278.

14. Ковалёв A.M., Маньшина Н.Г. Роль ГАМКергической системы в регуляции дыхания // Наука, образование, медицина: материалы ежегодной Российской научно-практической конференции. Самара: «Инсома-пресс», 2011. С. 168-171.

Список сокращений

ВРГ - вентральная респираторная группа ГАМК - гамма-аминомасляная кислота ДО - дыхательный объём (глубина дыхания) ДЦ - дыхательный центр

кВРГ - каудальный отдел вентральной респираторной группы

МОД - минутный объём дыхания (лёгочная вентиляция)

НММ - наружные межрёберные мышцы

рВРГ - ростральный отдел вентральной респираторной группы

ЧД - частота дыхания

ЭМГ - электромиограмма

Л - длительность инспирации (вдоха)

Те - длительность экспирации (выдоха)

Печатный салон «ОгеепСаЬ

Тираж 100 экз. Бумага офсетная 80 грамм. Печать цифровая. Подписано в печать 14.03.2012г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалев, Александр Михайлович, Самара

61 12-3/956

Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Ковалёв Александр Михайлович

УЧАСТИЕ ГАМКЕРГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ РОСТРАЛЬНОГО И КАУДАЛЬНОГО ОТДЕЛОВ ВЕНТРАЛЬНОЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ГРУППЫ В РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ

03.03.01. - физиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ведясова Ольга Александровна

Самара 2012

Список сокращений

ВРГ - вентральная респираторная группа ГАМК - гамма-аминомасляная кислота ДЦ - дыхательный центр

кВРГ - каудальный отдел вентральной респираторной группы НММ - наружные межрёберные мышцы

рВРГ - ростральный отдел вентральной респираторной группы

РНС - респираторная нейронная сеть

ЭМГ - электромиограмма

{- частота дыхания

Т - длительность дыхательного цикла

Т1 - длительность вдоха (инспирации)

Те - длительность выдоха (экспирации)

V - минутный объём дыхания

"УЧ - дыхательный объём

Содержание

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................12

1.1. Структурно-функциональная организация дыхательного центра................12

1.1.1. Нейронный состав дыхательного центра.............................................12

1.1.2. Отделы дыхательного центра и их роль в регуляции дыхания...........17

1.2. Общая характеристика ГАМКергической системы мозга............................24

1.2.1. Физиологическое значение ГАМК.......................................................24

1.2.2. Нейрофизиология и нейрохимия ГАМК-рецепторов..........................26

1.3. Роль ГАМКергической системы в регуляции дыхания................................32

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................42

2.1. Экспериментальные животные.......................................................................42

2.2. Операционная подготовка животных.............................................................42

2.3. Микроинъекции биологически активных веществ в структуры дыхательного центра..............................................................................................43

2.4. Регистрация паттерна внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц................................................................................................45

2.5. Вещества, использованные в работе..............................................................45

2.6. Обработка и анализ экспериментальных данных..........................................46

ГЛАВА 3. РЕСПИРАТОРНЫЕ РЕАКЦИИ НА МИКРОИНЪЕКЦИИ РАСТВОРОВ ГАМК В ФУНКЦИОНАЛЬНО РАЗЛИЧНЫЕ ОТДЕЛЫ ВЕНТРАЛЬНОЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ГРУППЫ..................................................48

3.1. Респираторные эффекты микроинъекций ГАМК в ростральный отдел вентральной респираторной группы.....................................................................48

3.2. Респираторные эффекты микроинъекций ГАМК в каудальный отдел

вентральной респираторной группы.....................................................................55

ГЛАВА 4. РЕСПИРАТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ АКТИВАЦИИ И БЛОКАДЫ ГАМКа-РЕЦЕПТОРОВ В ФУНКЦИОНАЛЬНО РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛАХ ВЕНТРАЛЬНОЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ГРУППЫ..................................................62

4.1. Респираторные реакции на введение мусцимола в ростральный отдел вентральной респираторной группы.....................................................................62

4.2. Респираторные реакции на введение бикукуллина в ростральный отдел вентральной респираторной группы.....................................................................68

4.3. Респираторные реакции на введение мусцимола в каудальный отдел вентральной респираторной группы.....................................................................73

4.4. Респираторные реакции на введение бикукуллина в каудальный отдел

вентральной респираторной группы.....................................................................78

ГЛАВА 5. РЕСПИРАТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ АКТИВАЦИИ И БЛОКАДЫ ГАМКв-РЕЦЕПТОРОВ В ФУНКЦИОНАЛЬНО РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛАХ ВЕНТРАЛЬНОЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ГРУППЫ..................................................84

5.1. Респираторные реакции на микроинъекции баклофена в ростральный отдел вентральной респираторной группы.....................................................................84

5.2. Респираторные реакции на микроинъекции 2-гидроксисаклофена в ростральный отдел вентральной респираторной группы....................................89

5.3. Респираторные реакции на микроинъекции баклофена в каудальный отдел вентральной респираторной группы.....................................................................94

5.4. Респираторные реакции на микроинъекции 2-гидроксисаклофена в

каудальный отдел вентральной респираторной группы......................................99

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................................104

ВЫВОДЫ...............................................................................................................121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................123

ПРИЛОЖЕНИЕ....................................................................................................150

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной физиологии являются центральные механизмы регуляции дыхания. Для эффективного решения данной проблемы необходимо не только определять характер взаимосвязей структур дыхательного центра (ДЦ) между собой и другими элементами контуров регуляции дыхательной системы (Fedorko et al., 1989; Сергиевский и др., 1993; Балыкин и др., 2001; Якунин и др., 2001; Ezure et al., 2002; Попов, 2003; Меркулова и др., 2004; Романова, 2005; Мирошниченко, Зинчен-ко, 2008), но и выявить специфику нейромедиаторной и нейромодуляторной организации этих взаимосвязей (Bianchi et al, 1995, 2009; Onimaru et al., 1995; Hilaire et al., 1999; Feldman et al., 2003; Инюшкин, 2005; Guyenet et al., 2009; Bongianni et al., 2010). Этот аспект проблемы в последние годы приобретает всё большую актуальность, поскольку непосредственно связан с разработкой методов фармакологической коррекции центральных нарушений дыхательной функции и с проблемой управления дыханием в целом, и активно изучается многими исследователями (Пятин, Никитин, 1998; Ballanyi et al., 1999; Zuperku et al., 2002; Миняев и др., 2004; Михайлова, 2004; Kinney et al., 2005; Инюшкин и др., 2007; Меркулова и др., 2007; Stuth et al., 2008; Сафонов, 2009; Ведясова и др., 2010; Cifra et al., 2011; Noguesa, Benarroch, 2011). На данный момент установлено, что на уровне ДЦ присутствуют практически все известные нейроме-диаторы, которые вовлечены в той или иной степени в регуляцию активности его нейросетей (Alheid et al., 2008; Stornetta, 2008), в том числе в механизмы респираторного ритмогенеза (Tryba et al., 2008). Особо значимыми для возникновения дыхательного ритма считаются тормозные синаптические связи, при этом из двух медиаторов тормозной природы - ГАМК и глицина - первой отводится одна из важнейших ролей в центральной регуляции респираторного ритма в норме и патологии (Schmidt et al., 1996; St-John et al, 1996; Bou-Flores et al., 2001; Busselberg et al., 2001; Zhang, Ashwell, 2001; Dutschmann et al., 2002; Kaczynska, Szereda-Przestaszewska, 2002; Liu et al., 2002; Сафонов, 2009; Александрова и др., 2008; Тараканов, Сафонов, 2008).

5

К настоящему времени установлено, что ГАМК участвует в деятельности ритмогенных (Shao et al., 1997; Сафонов, Лебедева, 2003; Bongianni et al., 2010) и паттернформирующих структур ДЦ (Feldman et al., 2003), модулирует активность нейронных сетей, ответственных за генерацию нормального дыхания (Rybak et al., 2001), а также таких его патологических форм как гаспинг и ап-нейзис (St-John et al, 1996; Тараканов и др., 2008). Наиболее вероятными акцепторами ГАМК в ядрах ДЦ являются ионотропные ГАМКа- и метаботропные ГАМКв-рецепторы. Показан их вклад в деятельность нейронов ядра солитарно-го тракта (Тихомирова, 2000; Yokota et al., 2008; Wang et al., 2010; Alheid et al., 2011), амбигуального ядра (Филатова, Еськов, 1997), вентро-медуллярной области (Nattie, Li, 2001), комплексов Бётцингера и пре-Бётцингера (Shao, Feldman, 1997; Bongianni et al., 2010). Установлено, что ГАМКергические волокна могут оказывать тормозящие влияния на нейроны рострального отдела вентральной респираторной группы и ядра Кёликера-Фьюза, а также включаются в механизмы модуляции рефлекса Геринга-Брейера (Seifert, Trippenbach, 1998; Ezure, Tanaka, 2004).

Как правило, при выявлении значения ГАМК в регуляции дыхания рассматривается роль ГАМКд-рецепторов (Schmidt et al., 1996; Nattie et al., 2001; Fregosi et al., 2004), которые более изучены в структурно-функциональном плане (Семьянов, 2002; Калуев, 2006) и широко представлены в головном мозге. Что касается ГАМКв-рецепторов, то их роль в центральных механизмах управления дыханием на уровне различных ядер бульбарного ДЦ изучена гораздо в меньшей степени, причём в отдельных работах оспаривается их участие в механизмах формирования базального эйпноэтического паттерна дыхания (Bongianni et al., 2010). То есть, в целом, в вопросе о роли ГАМКд- и ГАМКвергических структур в центральных механизмах регуляции дыхания многое остаётся неясным. При этом обращает внимание тот факт, что в системе современных знаний о ГАМКергических механизмах респираторного контроля практически отсутствуют систематизированные сведения о роли ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов в регуляции дыхания структурами вентральной респира-

торной группы. Вместе с тем, данная структура мозга привлекает к себе внимание наличием в её пределах разных классов нейронов с залповым типом активности, в том числе инспираторных, экспираторных и постсинспираторных (Saito et al, 2002; Falk, Rekimg, 2009; Bianchi et al., 1995). Среди этих нейронов имеются как проприобульбарные клетки (Zoungrana et al., 1997), участвующие в функциональном объединении вентральной респираторной группы с другими структурами ДЦ, так и бульбоспинальные клетки, непосредственно определяющие на выходе из ДЦ параметры ритма и паттерна дыхания (Ellenberger, 1999). Понимание механизмов включения многочисленных нейронных систем вентральной респираторной группы в процессы регуляции дыхания невозможно без выявления роли различных тормозных медиаторов и их рецепторов, в том числе мембранных рецепторов типа ГАМКд и ГАМКВ.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении роли ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов рострального и каудального отделов вентральной респираторной группы (рВРГ и кВРГ) ДЦ в центральных механизмах регуляции дыхания у взрослых крыс.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Изучить влияние микроинъекций растворов ГАМК в рВРГ и кВРГ на частотные и амплитудные параметры паттерна внешнего дыхания и абриса биоэлектрической активности инспираторных мышц.

2. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях активации ГАМКА-рецепторов рВРГ и кВРГ мусцимолом.

3. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях блокады ГАМКА-рецепторов рВРГ и кВРГ би-кукуллином.

4. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях активации ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ баклофеном.

5. Изучить изменения внешнего дыхания и реакции диафрагмы и наружных межрёберных мышц в условиях блокады ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ 2-гидроксисаклофеном.

Научная новизна работы. В работе впервые проведён сравнительный анализ роли ГАМКергических механизмов в регуляции дыхания структурами функционально различных отделов ВРГ у половозрелых крыс. Продемонстрирована различная роль ГАМК в модуляции паттерна дыхания на уровне рВРГ и кВРГ, в т.ч. показано более выраженное тормозное влияние медиатора на частоту дыхания при микроинъекциях в рВРГ.

Впервые проведено сравнительное исследование респираторных реакций, формирующихся при микроинъекциях агонистов и антагонистов ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов в рВРГ и кВРГ. Получены новые данные о неоднозначной роли ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ при их вовлечении в управление глубиной и частотой дыхания и регуляцию биоэлектрической активности инспираторной мускулатуры. В частности, установлено, что активация ГАМКд-рецепторов рВРГ мусцимолом способствует ускорению ритмики дыхания и сопровождается ростом его объёмных параметров, тогда как их блокада бикукул-лином снижает частоту дыхательных движений и величину легочной вентиляции. Это указывает на участие ГАМКд-рецепторов в модуляции активности нейросетей, управляющих как ритмом, так и интенсивностью дыхания.

Одновременно продемонстрирован факт выраженного увеличения глубины дыхания при микроинъекциях в кВРГ и рВРГ селективного агониста ГАМКв-рецепторов баклофена и отсутствия существенных изменений частоты дыхания при инъекциях их антагониста 2-гидроксисаклофена, что позволяет говорить о включении ГАМКв-рецепторов ВРГ в регуляцию преимущественно объёмных параметров паттерна дыхания и об их меньшей роли в модуляции респираторного ритма.

Результаты проведённой работы развивают существующие представления о влиянии ГАМК на функционирование ДЦ, демонстрируя новые стороны дифференцированного участия отделов ВРГ в регуляции дыхания. Выявленные

в работе особенности влияния изучаемых ядер на респираторный паттерн иллюстрируют сложные, многообразные функции данных структур ЦНС.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные сведения о характере и особенностях респираторных реакций после введения ГАМК-позитивных и ГАМК-негативных веществ в структуры вентральной респираторной группы имеют существенное значение в плане развития и конкретизации теоретических представлений о нейрохимических механизмах регуляции дыхания. Полученные данные о динамике внешнего дыхания и залповой активности дыхательных мышц на фоне блокады и активации ГАМКа- и ГАМКВ-рецепторов кВРГ и рВРГ позволяют рассматривать ГАМКергическую систему как важнейший вид нейротрансмиссии, вовлечённой в функционирование пат-тернформирующих нейронных сетей ДЦ и респираторных мотонейронных пулов на уровне спинного мозга. Результаты проведённого исследования также важны для понимания нейрохимических закономерностей респираторного рит-могенеза и регуляции паттерна дыхания, особенностей формирования и обработки афферентации, поступающей в функционально различные отделы ДЦ.

Результаты работы имеют также практическое значение для нейрофарма-кологии и медицины, так как способствуют пониманию механизмов формирования и поиску способов коррекции нарушений дыхания центрального генеза (в т. ч. связанных с дисфункциями нейротрансмиттерных систем), таких как синдром внезапной смерти во сне, апноэ во время сна, синдром врождённой гипо-вентиляции. В известной степени материалы исследования могут служить теоретической базой, позволяющей прогнозировать характер дыхания при нарушении структуры и функций продолговатого мозга, и тем самым, предупреждать или компенсировать возможные последствия данных нарушений.

Полученные данные также могут найти практическое применение в исследовательской работе нейрофизиологов и нейрохимиков, при разработке методов управления дыхательной функцией в экспериментах, связанных с решением проблемы развития, функционирования и дисфункции нейромедиаторных и нейромодуляторных систем мозга.

Внедрение результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы, включая данные о респираторных эффектах ГАМК, её агони-стов и антагонистов, а также полученные сведения о различной роли ГАМКд- и ГАМКв-рецепторов рВРГ и кВРГ в механизмах регуляции паттерна дыхания внедрены в учебный процесс и используется в научно-исследовательской работе кафедры анатомии, физиологии и гигиены ФГБОУ ВПО «Поволжская государственная социально-гуманитарная академия».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Микроинъекции ГАМК в рВРГ и кВРГ вызывают респираторные эффекты преимущественно тормозного типа, характер и выраженность которых зависит от действующей концентрации медиатора.

2. Реализация респираторных эффектов ГАМК в области ВРГ опосредуется ГАМКд- и ГАМКв-рецепторами, которые характеризуются неравномерным представительством и различной ролью в механизмах регуляции дыхания на уровне рВРГ и кВРГ.

3. ГАМКд-рецепторы рВРГ преимущественно участвуют в механизмах регуляции временных параметров паттерна дыхания, вызывая при своей активации модуляцию скорости респираторного ритма за счёт уменьшения длительности обеих фаз дыхательного цикла.

4. ГАМКд-рецепторы кВРГ вовлечены в регуляцию как амплитудных, так и временных параметров дыхания и играют особую роль в механизмах формирования выдоха.

5. ГАМКв-рецепторы на уровне рВРГ и, особенно, кВРГ играют первостепенную роль в модуляции активности паттернформирующих механизмов, ответственных, главным образом, за объёмные параметры паттерна внешнего дыхания и амплитуду залповой активности дыхательных мышц.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены:

на V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвящённой 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007);

на VI Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 50-летию открытия А. М. Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008);

на XI медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье. Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Сан